ES2235163T3

ES2235163T3 - Procedimiento para la produccion de proteinas pilc recombinantes.

Info

Publication number: ES2235163T3
Application number: ES94930216T
Authority: ES
Inventors: Thomas Franz Ferdinand Meyer; Thomas The Scripps Research Institute Rudel; Roland Richard Ryll; Ina Barbel; Mpi F. Infektionsbiologie Scheuerpflug
Original assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Current assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Priority date: 1993-10-26
Filing date: 1994-10-25
Publication date: 2005-07-01
Anticipated expiration: 2014-10-25
Also published as: WO1995011919A2; DE59410401D1; EP1520860A2; ATE286069T1; AU7939894A; US6268171B1; JPH09507745A; JP3742101B2; EP0725792A1; EP1520860A3; ES2402413T3; DE4336530C1; WO1995011919A3; EP1520860B1; DK1520860T3; EP0725792B1

Abstract

LA INVENCION DESCRIBE SECUENCIAS DE GENES RECOMBINANTES PARA SINTETIZAR UNA PROTEINA CON UNA ACTIVIDAD BIOLOGICA DE PROTEINA PILC. LA INVENCION TAMBIEN DESCRIBE PROCEDIMIENTOS DE RECOMBINACION DE ADN PAR AOBTENER PROTEINAS CON ACTIVIDAD BIOLOGICA DE LA PROTEINA PILC Y LAS HERRAMIENTAS BIOLOGICOMOLECULAR NECESARIAS PARA ELLO. LA INVENCION TAMBIEN DESCRIBE PROTEINAS CON LA ACTIVIDAD BIOLOGICA DE LA PROTEINA PILC Y SUS ANTICUERPOS. OTRO ASPECTO DE LA INVENCION SON LOS MEDICAMENTOS QUE LLEVAN ESTAS PROTEINAS O SUS ANTICUERPOS. ESTOS MEDICAMENTOS SE UTILIZAN PREFERENTEMENTE COMO COMPUESTOS INMUNIZADORES CONTRA BACTERIAS PATOGENAS DE LAS QUE LLEVAN 4-PILUS. LA INVENCION TAMBIEN TRATA DE LOS KITS PARA DETERCTAR BACTERIAS DEL TIPO DE LAS DE 4-PILUS O ANTICUERPOS QUE CONTIENEN DICHAS PROTEINAS O ANTICUERPOS. FINALMENTE TAMBIEN LA INVENCION TRATA DE LOS RECEPTORES CELULARES PARA BACTERIAS DE L TIPO QUE LLEVAN 4-PILUS Y ANALOGOS.

Description

Procedimiento para la producción de proteínas PilC recombinantes.

La invención se refiere a secuencias génicas recombinantes para la síntesis de una proteína con la actividad biológica de la proteína PilC. La invención se refiere, además, a procedimientos de recombinación de ADN para la producción de proteínas con la actividad biológica de la proteína PilC, así como las herramientas de biología molecular necesarias en dicha producción. La invención se refiere, además, a proteínas con la actividad biológica de la proteína PilC.

Un paso decisivo en el inicio y manifestación de una infección cualquiera es la unión del agente patógeno a determinadas estructuras moleculares (receptores) del organismo hospedante. En la presente, las estructuras del agente patógeno responsables de la unión reciben la denominación de "adhesinas". Es posible que para que se origine y/o manifieste una infección se requieran múltiples interacciones moleculares entre las adhesinas del agente patógeno y los receptores del organismo hospedante. Por otra parte, es concebible que se impida una infección ya mediante el bloqueo de una única interacción molecular entre una adhesina importante y un receptor.

El bloqueo de interacciones moleculares entre adhesinas y receptores representa una posible forma de prevención o terapia de las enfermedades infecciosas. Los enfoques preventivos incluyen, por ejemplo, la formación de anticuerpos que están específicamente orientados contra la adhesina y que bloquean la interacción con su receptor, mediante una inmunización activa (vacunación). Sin embargo, en el sentido de una medida preventiva o terapéutica es en principio también posible impedir la interacción mediante anticuerpos u otras sustancias, administradas pasivamente, por ejemplo mediante sustancias análogas a las adhesinas o a los receptores, sustancias que reciben en la presente memoria y a título colectivo la designación de "inhibidores". Entre las adhesinas importantes de numerosos agentes patógenos gram-negativos se hallan los pili (también denominados fimbrios o fibrillas). Se trata de estructuras polímeras que forman delgados apéndices filiformes en la superficie de las bacterias. Los pili inducen la unión de las bacterias en receptores específicos del organismo hospedante por intermedio de las adhesinas contenidas en los pili. En algunos casos se ha mostrado que la pérdida de los pili conduce a la pérdida del carácter infeccioso de los agentes patógenos. Esta pérdida del carácter infeccioso se explica por la pérdida de la capacidad de unirse. En consecuencia, mediante el bloqueo de la interacción molecular entre la adhesina del pilus y el receptor, es posible evitar la infección del organismo hospedante o contrarrestarla ulteriormente.

En el caso de las bacterias gram-negativas, se conocen diversos tipos de pili. La mayoría de todos los pili conocidos son estructuras heteropolímeras consistentes en varias subunidades, una subunidad principal y otras subunidades menores disponibles en tan sólo unas pocas copias. En algunos casos bien investigados, las subunidades menores representan las estructuras adhesivas (adhesinas) propiamente dichas, mientras que la unidad principal presente en una mayor cantidad de copias asume la función de estructura fundamental (Lindberg et al., Nature, 328, 84 - 87,
1987).

Numerosas especies de bacterias gram-negativas patógenas forman pili de tipo 4, que también reciben la designación de pili N-Me-Phe o de tipo IV. Entre las mismas se cuentan las especies de Neisseria patógenas N. gonorrhoea y N. meningitidis, que ocasionan la gonorrea o la meningitis bacteriana en los seres humanos. Sin embargo, hasta la fecha no existe una vacuna eficaz contra N. gonorrhoea. En cambio, se pueden obtener vacunas cápsula-específicas contra algunos serogrupos de N. meningitidis, las cuales, sin embargo, sólo ofrecen una protección limitada, y desde el punto de vista inmunológico se consideran problemáticos. Por ello, el tratamiento usual de las infecciones se efectúa con antibióticos, y la creciente propagación de la resistencia a los mismos representa un problema. Por ello, es imperioso el desarrollo de métodos de tratamiento alternativos. Otro tipo importante de agente patógeno en los seres humanos, formador de pili de tipo 4, es Pseudomonas aeruginosa (Sastry et al., FEBS Letters 151, 253-255, 1983), que representa un problema central en el caso de los pacientes con fibrosis quística, pacientes inmuno-debilitados y en asociación con infecciones sépticas. Todavía no se dispone de vacunas o inhibidores eficaces contra estos agentes patógenos; es especialmente problemática la multiplicación de la difusión de las cepas multiresistentes. También en este caso son imperiosamente necesarios métodos de tratamiento alternativos. Como otros ejemplos de importantes agentes patógenos formadores de pili de tipo 4, cabe mencionar Escherichia coli (EPEC); Giron et al., Science 254, 710- 713, 1991), Vibrio cholerae (Shaw et al., Infect. Immun. 58, 3042-3049, 1990), Bacteroides nodosus (McKern
et al., FEBS Letters 164, 149-153, 1983), Moraxella bovis (Marrs et al., J. Bacteriol. 163, 132-139, 1985) y otros agentes enteropatógenos, que ocasionan enfermedades en seres humanos y animales y contra los cuales se busca también intensamente una vacuna.

Los pili de tipo 4 se caracterizan por la estructura de su subunidad principal, que suele designarse como pilina, además, existen para las especies bacterianas individuales designaciones específicas para la subunidad principal de la pilina. Por ejemplo, PilE para N. gonorrhoeae o PilA para Pseudomonas aeruginosa. La pilina de los pili de tipo 4 se diferencia fundamentalmente en cuanto a su estructura de las subunidades principales de otros tipos de pilus, por ejemplo del grupo de las pili similares a Pap (Baga et al., J, Bacteriol. 157, 330-333, 1984). Las características de la pilina de los pili de tipo 4 son: (a) la secuencia de señales corta, de carga positiva, aminoterminal, de la proforma de la pilina (con la excepción de la pilina de tipo 4 de V. cholerae); (b) la región aminoterminal hidrófoba de la pilina madura, que presenta una fuerte homología secuencial entre las diversas pilinas de tipo 4; (c) la modificación del radical Phe aminoterminal de la pilina madura por un grupo metilo en posición N (N-Ne-Phe); (d) dos radicales Cys en la región carboxiterminal de la pilina, que forman un bucle, y (e) una propiedad que se designa "twitching motility".

Hasta ahora se había determinado que las proteínas PilC son componentes de N. gonorrhoeae y N. meningitidis. Como función de estas proteínas PilC se había supuesto hasta ahora una función de ensamble en la biogénesis del pilus (Jonsson, Dissertation, New Series No. 322. University of Umea: ISSN 0346-6612). Sin embargo, en estos trabajos no se aportaron indicios de un posible rol como adhesina importante. En otras investigaciones se logró aislar mutantes de N. gonorrhoeae, que si bien todavía formaban pili ya no mostraban ninguna adherencia a las células epiteliales (Rudel et al., Mol. Microbiol. 6, 3439-3450, 1992). Estos mutantes resultaron ser cepas de fase variante que habían desconectado la formación de una proteína PilC. De dichos experimentos no pudo deducirse una función directa de la proteína PilC de Neisseria. Sin embargo, los experimentos demostraron que el ensamble de los pili de Neisseria también puede tener lugar en ausencia de proteínas PilC. Anteriormente se había logrado clonar un único gen codificador de proteínas PilC en E. Coli. Esto se logró mediante la purificación mediante electroforesis en gel de la proteína PilC a partir de pili aislados de Neisseria (Jonsson et. Al., EMBO, J. 10, 477-488, 1991, documento WO 92 43871). Se utilizó la proteína PilC, purificada por electroforesis en gel, para la obtención de antisuero. La proteína PilC, purificada por electroforesis en gel, no poseía ninguna actividad biológica en el sentido de esta invención. Por ello el antisuero dirigido contra ello no posee la propiedad conforme a la invención de bloquear la unión de Neisseria piliadas a las células epiteliales. Con ayuda del antisuero se logró en primera instancia identificar un clon de fagos de E. coli portador de un gen parcial codificador de PilC. Con la ayuda del gen parcial codificador del PilC pudo identificarse, por medio de hibridación de ADN, un clon de E. coli con un gen codificador de PilC, intacto. (Jonsson et al., EMBO J. 10, 477- 488, 1991, documento WO 09213871). Debido a su secuencia homopolímera variable, este gen recombinante codificador de PilC era inactivo desde el punto de vista de la traducción, por lo que no tuvo lugar una síntesis de proteína PilC biológicamente activa. La secuencia de nucleótidos de este primer gen codificante de PilC (pilC1), de la cepa N. gonorrhoeae MS11 es conocida; también se conoce una secuencia parcial de un segundo gen (pilC2) de esta cepa (Jonsson et al., EMBO J. 10, 477- 488, 1991; Jonsson, Dissertation, New Series No. 322, University of Umea, ISSN; 0346-6612, documento WO 9213871). Sin embargo, hasta la fecha no ha sido posible preparar PilC con ninguno de estos genes.

Por consiguiente la invención se propone el problema técnico de poner a disposición proteínas biológicamente activas con la actividad biológica de la proteína PilC. La solución de este problema técnico se logra mediante la puesta a disposición de las formas de realización caracterizadas en las reivindicaciones.

Por consiguiente la invención se refiere a secuencias génicas recombinantes para la síntesis de una proteína con la actividad biológica de la proteína PilC, cuyo tramo de secuencias codificador de péptidos señal de fase variable, que contiene una secuencia de nucleótidos homopolímera, se caracteriza por los siguientes cambios:

(a) modificación de la secuencia de nucleótidos homopolímera en una secuencia de nucleótidos heteropolimera invariable,

de manera que se posibilita la expresión de la secuencia génica recombinante en una célula hospedante, sin experimentar la influencia de las variaciones de las fases.

Estas secuencias de ADN conformes a la invención sirven para la expresión de proteínas con la actividad biológica de la proteína PilC.

La expresión "actividad biológica de la proteína PilC" se refiere conforme a la invención, a la capacidad de la proteína codificante de respaldar el ensamble de los pili de tipo 4, inducir la unión de las bacterias portadoras de pili de tipo 4 a receptores celulares, o de bloquear la aptitud inmunológica para la inducción de anticuerpos contra las bacterias portadoras de pilis de tipo 4 que compiten con la acumulación de las bacterias en sus receptores celulares, y que preferiblemente bloquean la acumulación.

De acuerdo con la invención, el término "proteína" abarca tanto las proteínas de ocurrencia natural como las modificaciones o fragmentos de las mismas dotados de la actividad biológica mencionada.

La expresión "BACTERIAS PATÓGENAS PORTADORAS DE PILI DE TIPO 4", utilizada conforme a la invención, designa bacterias que, por una parte, se hallan relacionadas con la patogénesis de enfermedades y que, por otra parte, forman a título de elemento esencial de su propiedad patógena los pili de tipo 4, que son necesarias para la unión de las bacterias a receptores celulares en el organismo hospedante infectado.

"HOMOPOLÍMERO" son secuencias de nucleótidos que consisten en una serie consecutiva de nucleótidos idénticos (por ejemplo, 5'-CCCCCCC-3'). Conforme a la nvención las "SECUENCIAS DE NUCLEÓTIDOS HOMOPOLÍMERAS" se definen por su propiedad de incorporar uno o más nucleótidos idénticos en su secuencia de nucleótidos homopolímera, o de perderlos desde dicha secuencia, en forma espontánea o inducida. La ganancia, o pérdida, de nucleótidos idénticos de una secuencia de nucleótidos homopolímera determina una "VARIACIÓN DE FASE". Esta variación de fase se implementa mediante un proceso independiente RecA-proteína, que esencialmente discurre de manera espontánea (Robertson & Meyer, Trends Genet.; 8, 422-427, 1992). Los cambios en la secuencia de nucleótidos que son la base de la variación de fase tienen un efecto sobre el marco de lectura translacional de un gen y, por consiguiente, sobre la formación del producto gen intacto. En el sentido de esta invención la variación de fase no es deseable, ya que la variación de fase del ADN codificador de PilC bajo el control de un fuerte promotor conduce a la variación del marco de lectura y, con ello, a la pérdida de la formación de la proteína deseada con la actividad biológica de la proteína PilC. Por ello, en el sentido de la invención una "SECUENCIA DE NUCLEÓTIDOS HETEROPOLÍMERA INVARIABLE" es una secuencia de nucleótidos que procede de una secuencia de nucleótidos homopolímera que ha experimentado la inserción o intercambio de nucleótidos no idénticos (por lo tanto, en el caso de la secuencia 5'-GGGGGGGGGGGGG-3', los nucleótidos A, C y/o T), y debido a estos cambios se ha vuelto "DE FASE NO VARIABLE", es decir, no muestra variación de fase. En virtud del código genético es posible modificar la secuencia de nucleótidos homopolímera de manera tal que la secuencia codificante de aminoácidos se mantenga invariable o se modifique.

En el sentido de esta invención un "PÉPTIDO SEÑAL" representa una secuencia de aminoácidos en el extremo amino de la proforma de una proteína secretada por una bacteria gram-negativa. Un péptido señal posibilita la secreción de una proteína vía el camino general de exportación de la membrana interior de la bacteria (Pugsley, Microbiol., Rev., 57, 50-108, 1993). El tramo codificador del péptido señal, de fase variable, de la secuencia génica conforme a la invención, es por modificación de su secuencia homopolímera de nucleótidos (véase antes). El cambio (modificación) se introduce con el objeto de posibilitar la expresión de la secuencia génica en una célula hospedante sin experimentar la influencia de la variaciones de fases, a efectos de así garantizar la formación de la proteína PilC bajo condiciones estables y en grandes cantidades (sobreproducción). La hibridación de ADN cromosómico, por ejemplo de N. gonorrhoeae con un gen PilC completo como sonda, proporciona indicios acerca de la existencia de dos genes de PilC relacionados en el cromosoma de esta especie. Sin embargo, si se utilizan fragmentos subgénicos de un gen PilC como sonda, es posible visualizar de esta manera otros genes que se interhibridan, que también representan genes PilC, que sin embargo sólo están relacionados entre sí remotamente. La demostración de la existencia de estos genes PilC, remotamente relacionados entre sí, se basa en la interhibridación de regiones constantes de la secuencia de ADN entre dos o más genes PilC relacionados entre sí. Las regiones constantes de la secuencia de ADN pueden definirse mediante una comparación de las secuencias entre dos genes relacionados. En virtud de la definición de regiones constantes de la secuencia de ADN resulta una posibilidad de identificar también genes de PilC lejanamente relacionados entre sí. La comparación de secuencias, renovada, con un gen lejanamente relacionado de este tipo, proporciona nuevamente regiones constantes nuevas en la secuencia de ADN, a las que puede recurrirse nuevamente para la identificación de genes PilC, etc. De esta manera se logra detectar escalonadamente todos los miembros de la familia de genes PilC, dentro y fuera de una especie de bacteria.

Las secuencias génicas recombinantes conformes a la invención permiten la preparación en cantidades significativas de proteínas provistas de la actividad biológica de la proteína PilC. Con ello se posibilita la identificación general de subunidades menores de las pili de tipo 4 y su caracterización fiable como adhesinas. La invención permite en especial la detección de la existencia de las proteínas PilC de Neisserias patógenas (N. gonorrhoeae y N. meningitidis) en su función como adhesinas importantes. Además, la invención permite detectar la existencia de proteínas análogas a PilC de otras especies de bacterias formadoras de pili de tipo 4. La detección conforme a la invención de la función de las adhesinas de una subunidad menor de pilus de tipo 4 o de proteínas análogas a PilC, no se había descrito hasta ahora para ninguna especie de bacteria productora de pili de tipo 4. En este caso, la expresión "proteína análoga a PilC" se refiere exclusivamente al parentesco estructural (de nucleótidos y secuencia de aminoácidos) con las proteínas PilC de Neisserias patógenas y a la función análoga con las proteínas PilC de Neisseria como adhesinas que se unen a los receptores. Las proteínas análogas a PilC conformes a la invención, de otras especias de bacterias formadoras de PilC, no son necesariamente idénticas a, ni están relacionadas con las proteínas ya designadas como PilC en la bibliografía (por ejemplo, en el caso de la proteína PilC conocida de Pseudomonas aeruginosa (Nunn et al., J. Bacteriol. 172, 2911 - 2919, 1990) no se trata de una proteína análoga a PilC en el sentido de esta invención).

Equivocadamente, en algunos casos se clasifica la subunidad principal de las pili de tipo 4 como una adhesina importante (Rothbard et al., PNAS (USA), 82, 919, 1985; Paranchych, en: The Bacteria Vol. XI, Molecular Basis of Bacterial Pathogenesis, Academic Press, 61-78, 1990 y citas en las mismas). En virtud de estos hallazgos o hipótesis se han emprendido numerosas investigaciones para bloquear la adherencia de las bacterias a células humanas o animales mediante anticuerpos o inhibidores de la adherencia, o para contrarrestar una infección bacteriana mediante una vacuna con la subunidad principal de pilus de tipo 4. A pesar de algunos éxitos parciales (Paranchych, en: The Bacteria Vol XI, Molecular Basis of Bacterial Pathogenesis, Academic Press, 61-78, 1990, y citas en el mismo; Tramont, Clin. Microbiol. Rev. 2, S 74-S 77, 1989 y citas en el mismo) hasta ahora no se había podido desarrollar una vacuna de amplia eficacia ni un inhibidor de amplia eficacia sobre la base de la subunidad principal de las pili de tipo 4. Al respecto hay dos explicaciones posibles (a) la subunidad principal de un pilus de tipo 4 no contiene ninguna función importante de adherencia, por lo que la unión de las pili al receptor no se bloquea, y/o (b) debido a la variabilidad estructural de la subunidad principal de la pilina, la vacuna o el inhibidor no son efectivos, o no tienen una eficacia suficientemente amplia.

La explicación mencionada en último término se refiere a la suposición que una vacuna orientada contra la pilina podría conducir a una pérdida global de la capacidad de los pili a adherirse, independientemente de si la pilina representa una adhesina o no y a que el efecto de los anticuerpos dirigidos contra la pilina podría influir globalmente sobre la función estructural de la pilina y con ello indirectamente sobre las propiedades de adherencia de las pili. El que esta vía evidentemente no conduce al éxito (Johnson et al., J. Infect. Dis. 163, 128 - 134, 1991), se debe predominantemente a la mencionada variabilidad estructural de la pilina. Es sabido que la pilina de las especies bacterianas formadoras de pilus de tipo 4 presenta una variabilidad estructural intercepa-específica y/o intracepa-específica. Esta variabilidad estructural acarrea como consecuencia que un bloqueo indirecto de la adherencia mediante anticuerpos que están dirigidos contra la subunidad principal de pili, variable, no tiene una eficacia amplia, sino que se limita a una cepa determinada o a las variantes. Por ello hasta la fecha no ha sido posible desarrollar una vacuna de amplia eficacia sobre la base de la subunidad principal de las pili (pilina).

Las proteínas PilC ahora preparables mediante las secuencias génicas conformes a la invención, por ejemplo las de Neisseria patógenas, también poseen una variabilidad estructural, tal como muestra, por ejemplo, la comparación de las secuencias de nucleótidos codificantes (Figura 4). Sin embargo, en contraste con la variabilidad de la pilina, la variabilidad de las adhesinas-PilC es manifiestamente inferior y no tiene efecto (o si lo tiene, es en un grado no significativo) sobre la función de las proteínas PilC, a saber la interacción molecular con el receptor. Esta afirmación se confirma mediante los experimentos de competitividad con la proteína PilC biológicamente activa (Tabla 2), ya que con la misma proteína PilC fue posible expulsar bacterias que forman diversas moléculas de pilina y/o proteínas PilC. Por ello, si bien dentro de una especie se forman proteínas PilC estructuralmente variantes, se observa que estas proteínas PilC de una especie reconocen los mismos receptores, o tan sólo unos pocos diversos de ellos, en el organismo hospedante. Por ello, es posible, sobre la base de tan sólo unas pocas formas variantes de las proteínas, PilC de una especie, desarrollar una vacuna de amplia eficacia o un inhibidor de la adherencia, de amplia eficacia. La invención también permite, sobre la base de tan sólo unos pocos receptores, desarrollar análogos de receptores de amplia eficacia.

Dichas posibilidades se aplican también a aquellas adhesinas análogas a PilC formadas por bacterias formadoras de las pili de tipo 4 que no forman parte del género de las Neisseria, ya que puede aceptarse que el tropismo celular, histológico y hospedante de una especie se determina en gran medida por la interacción de las adhesinas con sus correspondientes receptores celulares. Estos tropismos son muy acusados en muchos agentes patógenos, en especial también en el caso de las bacterias formadoras de pilus de tipo 4. A partir de este hecho puede deducirse que también las adhesinas análogas a PilC conformes a la invención de una especie correspondiente con sus tropismos definidos, sólo interactúan con uno, o unos pocos, receptores celulares, histológicos y hospedantes, específicos. De esto se desprende la posibilidad, correspondiente a la utilización de las adhesinas PilC de Neisseria, y sobre la base de las adhesinas análogas a PilC de otras especies o de sus receptores, de desarrollar vacunas de amplia eficacia y otros inhibidores de una infección.

Un aspecto importante de la presente invención consistía en llevar a cabo la detección de la función de las proteínas PilC como adhesinas importantes en relación con el inicio de una infección. A tal efecto era necesario obtener proteína PilC biológicamente activa en forma pura y detectar su actividad biológica en sistemas de ensayo adecuados.

Para la preparación de una secuencia génica recombinante conforme a la invención se procedió a aislar y a clonar en E. coli el gen pilC2 completo de la cepa N. gonorrhoeae MS11 sobre la base de las informaciones conocidas sobre el PilC y su gen. A efectos de generar con este gen la proteína conforme a la invención con la actividad biológica de una proteína PilC del género Neisseria, se modificó el tramo homopolímero de fase variable, codificador del péptido señal, de la secuencia del gen pilC2, de manera tal que se posibilita la expresión de los genes recombinantes en una célula hospedante sin sufrir la influencia de la variación de fase. Esto se logró mediante la modificación del tramo homopolímero de la secuencia en una secuencia heteropolimera bajo la utilización de oligonucleótidos adecuados, mediante la reacción en cadena de polimerasa (PCR) (Ejemplo 2).

En una forma de realización preferida la secuencia génica conforme a la invención puede obtenerse mediante modificación de una secuencia de ADN procedente de una bacteria patógena portadora de pilus de tipo 4. Este grupo de bacterias ya se caracterizó anteriormente con mayor detalle. Ejemplos de dichas bacterias son Neisseria, en especial N. gonorrhoeae y N. meningitidis, Pseudomonas, en especial P. aeruginosa, Escherichia enteropatógenas, en especial E. coli (EPEC), Vibrio cholerae, Bacteroides nodosus y Moraxella bovis.

En una forma de realización especialmente preferida conforme a la invención puede obtenerse la secuencia génica por modificación de una secuencia de ADN procedente del género Neisseria, preferiblemente Neisseria gonorrhoeae o Neisseria meningitidis.

Conforme a la invención se prefieren especialmente las secuencias génicas del gen pilC2 de N. gonorrhoeae y del gen pilC A1493 de N. meningitidis, representadas en la Figura 4. Las secuencias representadas empiezan en la posición 1 con el codón ATG que codifica el primer aminoácido (Met). La región que codifica el péptido señal se extiende desde la posición 1 a la posición 99, referidas al gen pilC2. En esto se halla contenido el tramo de secuencia homopolímera de fase variable, que se extiende desde la posición 79 a la posición 91. Los nucleótidos constantes de las secuencias mostradas están marcados con asteriscos. En la Tabla 3 se han consignado por separado tramos de secuencia constante individuales de los genes pilC1 y pilC2.

Los experimentos de hibridación de ADN con el gen pilC1 completo, con fragmentos del gen pilC1 que se obtuvieron mediante endonucleasas de restricción, o con el tramo génico hasta ahora conocido del gen pilC2 de N. go- norrhoeae MS11, dieron indicios acerca de la existencia de 2 (Jonsson et al., EMBO J. 10, 477-488, 1991) o a lo sumo 3 (Bihlmaier et al., Mol. Microbiol. 5, 2529-2539, 1991) genes pilC relacionados dentro de esta cepa. La determinación de la secuencia de nucleótidos del segundo gen pilC completo conforme a la invención (pilC2) y la comparación de ambas secuencias de nucleótidos pilC (Figura 4) posibilitan, conforme a la invención, establecer regiones conservadas de los genes pilC (Tabla 3). Los fragmentos u oligonucleótidos subgénicos correspondientes conservados de un gen PilC pueden por lo tanto, a diferencia de genes completos o fragmentos génicos mayores, en virtud de sus correspondientes homologías con respecto a las secuencias de nucleótidos conservadas de genes relacionados, servir como sondas de hibridación, para identificar e aislar en su conjunto dichos genes emparentados. Con ello, en otra forma de realización es posible obtener la secuencia génica conforme a la invención mediante la modificación de una secuencia de ADN, que con una región constante híbrida la secuencia de ADN de la Figura 4 o de la Tabla 3 y que codifica una proteína con la actividad biológica de la proteína PilC.

Conforme a la invención, la longitud de la secuencia de nucleótidos homopolímera modificada en una secuencia de nucleótidos heteropolímera abarca por lo menos 5 nucleótidos. En los ejemplos de secuencias señalados en la Figura 4 se trata de 12 G (pilC1), 13 G (pilC2), 9 G (pilC A1493), véase la posición 79 a la posición 91 referidas a la secuencia génica pilC2.

En otra forma de realización preferida conforme a la invención la secuencia génica modificada codifica una proteína con la actividad biológica de la proteína PilC, que presenta una región oligo-histidina adecuada para su purificación. Es preferible que dicha región oligo-histidina contenga 6 radicales histidina (His_{6}). La presencia del péptido His_{6} permite la unión selectiva de la proteína PilC conforme a la invención en una columna de níquel-ANT (Ni-ácido nitrilotriacético)-agarosa (Hochuli et al., J. Chromat., 411; 177-184, 1987; Hochuli et al., Bio/Techno., 6, 1321-1325, 1988), caso éste en el cual la proteína eluída representa proteína PilC pura.

En una forma de realización conforme a la invención especialmente preferida la región oligo-histidina se halla en el extremo N o en el extremo C de la forma madura de la proteína codificada. Con ello se garantiza una estructura espacial de la proteína, más libre de perturbaciones.

En otra forma de realización la invención se refiere a vectores recombinantes que contienen una secuencia génica conforme a la invención. Ejemplos de dichos vectores son los vectores pBR232 y pBA, que se replican en E. coli, vectores que se basan en los bacteriófagos M13, fd o lambda, vectores Broad-Host-Range (de amplio intervalo de hospedante) o vectores lanzadera correspondientes a los vectores Hermes (Kupsch et al., presentado para su publicación), que permiten una incorporación de genes clonados en el ADN de las células Neisseria receptoras como también el plásmido ptetM25.5, que puede utilizarse para una transferencia conjugada de genes entre Neisseria (Kupsch. et al., presentado para su publicación).

En una forma de realización preferida de los vectores conformes a la invención la secuencia génica mencionada se halla bajo el control de un promotor. Ejemplos de promotores adecuados conforme a la invención son promotores que son funcionales en las bacterias gram-negativas, y en especial los promotores inducibles. En una forma de realización especialmente preferida el promotor es Ptrc, que en presencia de un gen lac1^{q} expresado puede reprimirse tanto en Neisseria y E. coli tanto como también inducirse en presencia de IPTG.

En otra forma de realización, la invención se refiere a células hospedantes que contienen uno o más vectores recombinantes conformes a la invención.

Las células hospedantes conformes a la invención sirven para la replicación, trascripción y traducción de la secuencia génica conforme a la invención para la síntesis de una proteína con la actividad biológica de la proteína PilC. Se trata preferiblemente de bacterias gram-negativas, que posibilitan secretar la proteína sintetizada a través de la membrana interior y plegarla correctamente. Ejemplos de dichas células hospedantes son E. coli K12 y otras bacterias gram-negativas, para las cuales se encuentran disponibles los vectores de clonación adecuados. Es preferible que la célula hospedante conforme a la invención sea una cepa de Neisseria no piliada que - lo mismo que N. gonorrhoeae N174 - ha perdido la formación de sus pili debido a un gen pilE defectuoso. El gen pilE codifica la subunidad principal (pilina) de las pili de Neisseria. Debido al gen pilE defectuoso no se sintetiza pilina, lo cual posibilita la obtención de la proteína PilC biológicamente activa, que está absolutamente exenta de pilina.

En otra forma de realización la invención se refiere a procedimientos para la preparación de una proteína esencialmente pura con la actividad biológica de la proteína PilC, en los cuales se cultiva una célula hospedante conforme a la invención bajo condiciones adecuadas y se purifica la proteína.

En una forma de realización preferida del procedimiento de preparación conforme a la invención la purificación de la proteína con la actividad biológica de la proteína PilC se efectúa mediante una cromatografía de afinidad, preferiblemente una cromatografía de afinidad en la cual las regiones oligo-histidina de la proteína obtenida conforme a la invención se utilizan para la unión de la proteína.

Las Figuras muestran:

Figura 1

Mapas de restricción de los plásmidos pTR27 y plS26. El plásmido pTR27 contiene el gen pilC2 natural de la cepa MS11-N133 de N gonorrhoeae. Partiendo de este plásmido se generó en varios pasos una secuencia génica conforme a la invención (Ejemplo 2; Figura 2), que se halla presente en forma clonada en el plásmido p1S26. En el caso del plásmido p1S26 se trata de una construcción Hermes (Kupsch. et al., presentada para su publicación), que posibilita tanto la replicación en E. coli como también la incorporación de la secuencia génica recombinante conforme a la invención en el plásmido ptetM25.2 conjugado en N. gonorrhoeae. Esta incorporación tiene lugar por transferencia de la secuencia génica contenida en la caja de lanzadera mediante recombinacion homóloga doble en las dos regiones punteadas de p126S con ptetM25.2

Figura 2

Esquema constructivo de la secuencia génica recombinante para la síntesis de la proteína Pilc recombinante conforme a la invención. La descripción de los trabajos realizados está contenida en el Ejemplo 2. La región de ADN representada en la Figura correspondiente a la región 5'-terminal del gen pilC2 contenida en pTR27 (véase la Figura 1). Las designaciones "TR..." se refieren a los oligonucleótidos utilizados (Ejemplo 2'). (A) Modificación del tramo de secuencia de fase variable codificador de péptidos señales, que contiene una secuencia de nucleótidos homopolímera. (B) inserción de una secuencia de nucleótidos codificadora de un péptido His_{6} (C) Aclaraciones para (A) y (B),

Figura 3

Electroforesis en gel analítica de pili purificados de la cepa de tipo salvaje N137 del N. gonorrhoeae, (1), y del mutante doble N474 de N. gonorrhoeae PilC-negativo, (2), así como de la proteína PilC2 biológicamente activa conforme a la invención, (3). El aislamiento de los pili se efectuó según Jonsson et al. (1991): la obtención de la proteína PilC2 conforme a la invención se describe en el Ejemplo 3.

Figura 4

Secuencias de nucleótidos de los genes pilC naturales. (A) Comparación de las secuencias de nucleótidos de los genes pilC1 y pilC2 de Neisseria gonorrhoeae MS11-N133; (B) comparación de las secuencias de nucleótidos del gen pilC1 de Neisseria gonorrhoeae MS11-N133 con la secuencia génica parcial de un gen pilC1 de Neisseria meningitidis A1493; (C) comparación de la secuencia de nucleótidos del gen pilC2 de Neisseria gonorrhoeae MS11-N133 con la secuencia génica parcial de un gen PilC de Neisseria meningitidis A1493. Los ejemplos de regiones conservadas conformes a la invención están marcados con asteriscos. Las modificaciones emprendidas para la construcción de la secuencia génica recombinante conforme a la invención se han representado en la Figura 3.

Los ejemplos explican la invención.

Ejemplo 1 Aislamiento del Gen pilC2 de N. gonorrhoeae

Con la ayuda de las secuencias parciales publicadas por Jonsson et al. (EMBO J., 10, 477-488, 1991) de pilC1 y pilC2, se desarrollaron sondas fr oligonucleótidos especificas (para pilC1: CG31 CGATGGCGCAAACCCATCAA, para pilC2: CG32 CGCAGGCGCAAACCCGTAAA), con cuya ayuda fue posible aislar ambos genes pilC a partir de un banco génico de plásmidos de ADN geonómico de Neisseria gonorrhoeae MS11. Para ello se marcaron ambas sondas por vía radiactiva en el extremo 5' con ADN-quinasa, y se híbridó frente a aproximadamente 30.000 clones del banco de genes. Los clones positivos fueron aíslados, hibridados nuevamente con las sondas marcadas radiactivamente, y finalmente se los caracterizó. Uno de los plásmidos obtenidos (pTR27, véase la Figura 1) contenía la totalidad del gen pilC2, al que, no obstante, le faltaba el promotor para la síntesis de la proteína pilC. El pTR27 representa la construcción de base para la determinación de la secuencia de ADN del gen pilC2 y para la modificación por tecnología genética, de la secuencia del ADN y de la proteína (véase el Ejemplo 2 y el Ejemplo 6).

Ejemplo 2 Construcción de una cepa de Neisseria gonorrhoeae sobreproductora de proteína pilC

La modificación de la secuencia de nucleótidos homopolímera, que en el caso del gen pilC2 clonado consistía en 13 nucleótidos G, fue efectuada mediante una mutagénesis dirigida con ayuda de la reacción en cadena de polimerasa (PCR), en dos etapas. El plásmido pTR27 (véase el Ejemplo 1, Figura 1) sirvió como matriz en dichas reacciones. La primera etapa (1. PCR) abarcó dos reacciones PCR separadas del gen pilC2 con los pares de cebadores TR12 (TTGGATCCGACGTCCGAAAAGGAAATACGATG) y TR28 (GCTCCACCACCTCCGCCGGTATGGGAAAAC), así como con TR27 (ACCGGCGGAGGTGGTGGAGCGCAGGCGCAAACCCGT) y TR23 (TGTGTCTCTGCATAT
GACG) (Figura 1). Las reacciones de PCR (25 ciclos de 1 min cada uno, 94ºC, 2 min, 50ºC y 1 min, 72ºC) se llevaron a cabo en un Ciclador Termico Cefus Perkin Elmer y contenían, cada uno de ellos, 100 pmol de cebador, aproximadamente 1 ng de pTR27 y 2 unidades de polimerasa VentR® (New England Biolabs) en un volumen de 100 \mul. El oligonucleótido TR28 se híbridó directamente antes, el oligonucleótido TR27 directamente después, de la región homopolímera de la secuencia de nucleótidos, lo cual tuvo como consecuencia que ni el primer, ni el segundo fragmento de PCR contuvieran la región homopolímera de la secuencia de nucleótidos. En lugar de esto los fragmentos 1 y 2, debido a las ampliaciones 5' de los oligonucleótidos TR28 y TR27, contenían una secuencia de nucleótidos invariable heteropolímera, que codifica los mismos aminoácidos que la secuencia de nucleótidos homopolímera original. Los fragmentos 1 y 2 de la primera PCR se separaron mediante electroforesis en agarosa-gel, y se extrajeron con GENECLEAN (BIO 101). Los fragmentos purificados se reunieron en la 2a reacción de PCR en un fragmento, para lo cual se amplificó ahora en una reacción con los oligonucleótidos TR12 y TR23 (Figura 2). Las condiciones de la 2a PCR se eligieron como sigue: 100 pmol de cebador, fragmento 1 y fragmento 2 en cantidades equimolares (cada uno 50 ng) y 2 unidades de la polimerasa VentR®. A diferencia de la 1a PCR, para la 2a PCR se llevaron a cabo 15 ciclos bajo las mismas condiciones. El intercambio correcto de la secuencia de nucleótidos homopolímera por una secuencia de nucleótidos heteropolimera, invariable, se verificó mediante análisis de la secuencia de ADN.

El producto obtenido de la PCR se intercambió como fragmento cortado BamHI/NdeI por el correspondiente fragmento BamHI/NdeI del vector pTR27, de lo cual resultó el plásmido pTR81. A efectos de poder purificar la proteína PilC mediante cromatografía de afinidad con níquel y quelato (Hochuli et al., Journal of Chromatography, 411, 177-184, 1987, Hochuli et al., Bio/Technology 6, 1321-1325, 1988), se insertó en el gen pilC la secuencia de ADN codificante para un péptido que abarcaba seis radicales histidina, (His_{6}). La clonación de la secuencia de ADN codificadora de His_{6} se llevó a cabo de manera análoga a la técnica antes descrita para la mutagénesis dirigida de PCR (Figura 1). El plásmido pTR81 sirvió como matriz en la primera PCR. En reacciones separadas se amplió el fragmento 1 con el par de oligonucleótidos TR12 y TR71 (GTGATGATGGTGGTGATGGGTTTGCGCCTGCGCTCCA) y el fragmento 2 con el par de oligonucleótidos TR23 y TR7G (CATCACCACCATCATCACCGTAAATACGCTATTATC). El oligonucleótido TR71 se apareó con el codón para Thr_{35} empezando con la cadena (-); el oligonucleótido TR70 se apareó con el codón para Arg_{36}, empezando en la cadena (+) (véase la Figura 2). Debido a sus ampliaciones-5' ambos oligonucleótidos codificaron la secuencia His_{6}, que se insertó durante el trascurso de la segunda PCR entre los codones Thr_{35} y Arg_{36} en pilC (véase la Figura 2). El producto de PCR cortado BamHI/NdeI de la 2a PCR se intercambió por el correspondiente fragmento BamHI/NdeI de pTR27 (véase el Ejemplo 1). La construcción resultante recibió la designación p1S25. El análisis de la secuencia de ADN confirmó la correcta inserción del péptido His_{6} entre los aminoácidos Thr_{35} y Arg_{36}.

La sobreexpresión inducible del gen pilC2 con la secuencia de nucleótidos de fase no variable y la secuencia de nucleótidos codificadora de His_{6} se logró clonando el fragmento BamHI/HindIII del p1S25 en el vector Hermes-8 (Kupsch et al., presentado para su publicación) bajo el control del promotor P_{trc} en primera instancia en E. coli K12 (p1S26, véase la Figura 1), con lo cual se logró la expresión, inducible mediante IPTG (isopropil-\beta-D-tiogalactósido), del gen pilC2 recombinante bajo el control del promotor P_{trc}. Mediante la transformación de N. gonorrhoeae N219 y el intercambio alélico se incorporó la caja de lanzadera de p1S26 con el gen PilC2 recombinante en el plásmido conjugado ptetM25.2. Con ello se logró que fuera posible transferir por conjugación el gen recombinante en la cepa N174 de N. gonorrhoeae, exenta de pilina, que no puede transformarse debido a la supresión del gen pilE codificador de la pilina. Después de inducción con IPTG, la cepa ISN19 de N. gonorrhoeae resultante sintetizó en grandes cantidades proteína PilC2 exenta de pilina.

Ejemplo 3 Aislamiento de proteína PilC exenta de pilina, biológicamente activa

Para obtener la proteína pilC conforme a la invención, biológicamente activa, se procedió a aplicar la cepa ISN19 sobre 30 placas pequeñas de GC-agar (diámetro: 9 cm), que adicionalmente contenían 5 \mug/ml de tetraciclina e ITPG 100 \muM, y se incubó durante 20 h a 37ºC, 5% de CO_{2}. Las placas de GC-agar contenían las sustancias necesarias para el crecimiento de N. gonorrhoeae, en especial 36 g de base GC-agar (Becton, Dickinson & Company) tratado en autoclave en 1 l de agua y seguidamente mezclado con 10 ml de una mezcla de vitaminas filtrada hasta esterilidad. La mezcla de vitaminas contenía en especial 0,01 g de vitamina B12, 1 g de adenina, 0,03 g de guanina, 10 g de glutamina, 0,1 g de cocarboxilasa, 0,03 g de tiamina, 25,9 g de L-cisteína, 1,1 g de L-cistina, 150 mg de arginina, 0,5 g de uracilo, 0,02 g de Fe(NO_{3})_{3}, 0,25 de difosfopiridinnucleótido, 0,013 g de ácido p-aminobenzoico y 100 g de dextrosa, disueltos en 1 l de agua. Las bacterias se resuspendieron con bastoncillos de algodón en 30 ml de Tris.Cl 50 mM, NaCl 0,15 M, pH 8,0, y se centrifugaron a 4.000 revoluciones por minuto (rpm) y a 4ºC durante 15 min en un Rotor SS34 (Sorval). El sedimento se resuspendió en 30 ml de Tris-HCl 50 mM, NaCl 0,15, pH 8,0, y se excluyeron las bacterias mediante la adición de una punta de espátula de la lisozima y ETDA (sal disódica dihidrato de ácido etilendiaminatetraacético) 5 mM mediante tratamiento por ultrasonido. Las bacterias lisadas se nodularon a 5.000 rpm durante 20 min a 4ºC en el rotor SS34. Del material sobrenadante resultante se nodularon las membranas a 20.000 rpm y a 4ºC durante 60 min en el rotor SS34, y seguidamente se recogieron en 10 ml de TRIS.Cl 50 mM, NaCl 0,15 M, glicerina al 10%, MgCl_{2} 10mM, pH 8,0, y Triton X100 al 2%. La suspensión se incubó durante 45 min a 37ºC, y se la sometió nuevamente a centrifugación a 20,000 rpm y 4ºC durante 60 min. El sedimento de la membrana, consistente predominantemente en membrana exterior, se lavó una vez con 10 ml de TRIS.Cl 50 mM, NaCl 0,15 M, pH 8,0, y se noduló nuevamente a 20,000 rpm durante 60 min. Entonces se nódulo se suspendió en 10 ml de TRIS.Cl 50 mM, NaCl 0,15 M, MgCl_{2} 10 mM, glicerina al 10%, pH 8,0, y LDAO (N-óxido de N,N-dimetildodecilamina) al 2%, y se sometió a incubación durante 60 min a 37ºC. Después de centrifugación a 20.000 rpm (4ºC) durante 60 min en el rotor SS34 se procedió a purificar mediante cromatografía de afinidad de níquel-quelato, el material sobrenadante en el que está presente la proteína pilC biologicamente activa. A tal efecto se preparó de antemano una columna de níquel - NTA (Ni-ácido nitrilotriacético)-agarosa con un volumen de columna de 300 \mul, se lavó con 5 volúmenes de agua bidestilada, y se aplicaron 10 ml del sobrenadante con la proteína PilC extraída. Mediante el lavado de la columna con 300 \mul de TRIS.Cl 50 mM, imidazol 50 mM, glicerina al 10%, pH 8,0, se separaron las proteínas no específicamente unidas a la columna de níquel-NTA-agarosa. La proteína PilC biológicamente activa se eluyó después del lavado de la columna con 5 - 10 volúmenes de Na_{x}H_{x}PO_{4} 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,5 (PBS), con un tampón citrato/fosfato (ácido cítrico 10 mM, Na_{x}H_{x}PO_{4} 1 M, pH 3,5, glicerina al 10 %, NaCl 0,15 M). El eluato se neutralizó inmediatamemnte después con una solución de Na_{2}HPO_{4} 1 M. La proteína PilC conforme a la invención contenida en forma pura en el eluato se congeló instantáneamente en nitrógeno líquido y se conservó a -70ºC.

Ejemplo 4 Detección de un receptor para PilC sobre células epiteliales humanas

Partículas MX Covashere (FMP) fluorescentes acopladas a pili, se prepararon como sigue: FMPs (Duke Scientific Corporation, Palo Alto, California, EE.UU.) poseen una superficie consistente en grupos activos, que posibilita un acoplamiento espontáneo directo de proteínas. En términos generales, se mezclaron 100 \mul de las FMPs con un diámetro de 0,5 \mum con aproximadamente 2 \mug de pili purificadas (según Jonsson et al., 1991) en 100 \mul de PBS y se mezcló durante 2 h a temperatura ambiente sobre un disco de rotación. Las partículas recubiertas con pili se sedimentaron y se lavaron en 1 ml de tampón de bloqueo (TRIS.Cl 20 mM con fetuina al 2%, pH 7,5), a efectos de bloquear los grupos de acoplamiento libres. La concentración de proteína en el sobrenadante después de la primera centrifugación se comparó con la cantidad de pili aplicada, para determinar el rendimiento del acoplamiento. Durante dicha reacción, más del 80% de las pili aplicadas se unió covalentemente a las FMPs. Las partículas se sedimentaron nuevamente y se recogieron en 100 \mul de PBS. Las FMPs se recubieron tanto con pili purificadas de una cepa salvaje adherente de
Neisseria gonorrhoeae (FMP-pilina/PilC), como también con pili purificadas de un mutante de deleción pilC1/C2 (MS11-N474: Facius et al., presentado para publicación) (FMP-pilina), y con fetuína (FMP- fetuína: controles negativos).

Para demostrar la existencia de receptores específicos para proteína PilC en células epiteliales humanas se investigó la unión de FMPs recubiertas de pili sobre las cepas de células epiteliales. Estos experimentos se llevaron a cabo de manera análoga al protocolo de infecciones estandar con gonococos. Unas células epiteliales se cultivaron en placas para cultivos celulares de 24 pocillos sobre plaquetas de vidrio estériles en medio RPMI con suero de ternero fetal (FCS) al 5% a 37ºC y bajo una gasificación con 5% de CO_{2}. Las monocapas de células epiteliales preconfluentes se lavaron con medio fresco antes de añadirse a cada pocillo 10 \mul de la suspensión de FMP cargada con pili. La duración de la adherencia fue de 1 h, durante la cual los cultivos se incubaron a 37ºC y 5% de CO_{2}. Seguidamente los FMPs no unidos se separaron mediante quíntuple lavado con PBS, y se fijaron con paraformaldehido al 2% en PBS durante 30 min. Los preparados pudieron seguidamente observarse bajo un microscopio Zeiss de fluorescencia. Los resultados de estos ensayos, resumidos en la Tabla 1, muestran que a diferencia de los pili de tipo salvaje los pili exentos de PilC no median ninguna unión en las células epiteliales. Sin embargo, la unión de los pili exentos exentos de PilC en las células epiteliales puede complementarse mediante la adición de la proteína PilC2 biológicamente activa conforme a la invención. La adición de 2 \mug de proteína PilC2 biológicamente activa en 100 \mul de PBS a 100 \mul de la FMP-pilina ya recubiertas fue seguido de una incubación durante 2 h a 20ºC bajo mezcladura a fondo constante. Las partículas se nodularon, lavaron en 1 ml de PBS y recogieron en 100 \mul de PBS. Las FM-pilina ulteriormente recubiertas con proteína PilC recibieron la designación FMP-(pilina + PilC).

TABLA 1 Unión de las partículas fluorescentes a células epiteliales humanas

1

Unión de partículas fluorescentes (FMPs) a células epiteliales humanas. FMP-fetuina, FMPs acoplados a fetuína; FMP-pilina/PilC, FMPs acopladas con pili purificadas de la cepa N137 de N. gonorrhoeae; FMP-pilina, FMPs acopladas a pili purificadas de la cepa N474 de N. gonorrhoeae; FMP-pilina + PilC, FMPs acopladas a pili purificadas de la cepa N474 de N. gonorrhoeae que ulteriormente se incubaron con la proteína PilC conforme a la invención (Ejemplo 4). Los resultados de la unión se han indicado en forma de un número medio de FMPs por célula epitelial.

Ejemplo 5 Detección directa de la unión de PilC a receptores sobre células epiteliales humanas

Para la detección de la existencia de receptores específicos para proteína PilC en células epiteliales humanas se investigó la unión de la proteína PilC biológicamente activa conforme a la invención a células ME180 (carcinoma de cerviz humana (ATCC HTB33)). Las células epiteliales se cultivaron en plaquetas Chamber® de 4 pocillos, (Nunc) en medio RPMI con suero de ternero fetal (FCS) al 5%, a 37ºC, 5% de CO_{2}. A la adición de aproximadamente
10 \mug de proteína PilC biológicamente activa en un volumen máximo de 20 \mul le siguió una incubación durante 30 min a 37ºC y 5% de CO_{2}. Cada uno de los pocillos se lavó tres veces con 1 ml de PBS, y seguidamente se fijaron las células epiteliales con proteína PilC ligada durante 30 min en paraformaldehido al 2% en PBS. Para hacer visible la proteína PilC ligada, se llevó a cabo un tinción de inmunofluorescencia con antisueros específicos contra la proteína PilC biológicamente activa conforme a la invención. Estos antisueros se obtuvieron mediante inmunización de ratones Balb/c con la proteína PilC biológicamente activa conforme a la invención. Los preparados fijados se lavaron dos veces con 1 ml de PBS y con una dilución 1:300 de los antisueros en PBS durante 1 h. Después se lavó cinco veces con PBS, Tween 20 al 0,05%, a efectos de separar los anticuerpos (AK) no específicamente unidos. Para hacer visible el complejo PilC-AK se procedió a incubar durante 60 min a 20ºC con un segundo AK, que estaba dirigido contra inmunoglobulinas de ratones y que estaba marcado con el colorante de fluorescencia FITC, en una dilución 1:2.000 en PBS con Tween 20 al 0,025%. Nuevamente se lavó con cuidado con PBS, Tween 20 al 0,05% (5 veces), antes de recubrir los preparados con una tapa y evaluarlos bajo un microscopio Zeiss de fluorescencia. Como controles negativos sirvieron (a) células epiteliales sin PilC con elemento 2º AK; (b) células epiteliales sin PilC con el 1^{er}. AK y el 2º AK, (c) células epiteliales con PilC y el 2º AK. Si bien las células epiteliales preincubadas con la proteína PilC biológicamente activa conforme a la invención adquirieron una fuerte fluorescencia después de la tinción con antisueros-PilC específicos, en todos los experimentos de control sólo pudo observarse una débil fluorescencia. Como otros controles se llevó a cabo el experimento con células MDCK, a las cuales las Neisseria piliadas no se unen; de manera correspondiente tampoco pudo comprobarse ninguna unión de la proteína PilC conforme a la invención.

Ejemplo 6 Competencia de la infección de células epiteliales humanas con Neisseria

La realización de los experimentos de infección o de inhibición, in vitro, tuvo lugar mediante células ME180 preconfluentes (carcinoma de cerviz humana (ATCC HTB33)) que se cultivaron en portaobjetos en una placa de cultivo celular de 24 pocillos. Para la inhibición de la adherencia, inducida por el pilus, de N. gonorrhoeae y N. meningitidis se incubaron las células en 500 \mul de medio RMPÍ, FCS al 5%, mediante la adición de 20 \mug de la proteína PilC biológicamente activa durante 30 min a 37ºC y 5% de CO_{2}. Para la infección se aplicaron las bacterias sobre una placa de GC durante la noche a 37ºC bajo 5% de CO_{2}, y seguidamente se las resuspendió con un bastoncillo de algodón en 1 ml de medio RPMI, FCS al 5%. La determinación de la densidad bacteriana se efectuó con el fotómetro espectral. Las aproximadamente 2x10^{5} células epiteliales preconfluentes se infestaron con 7x10^{7} bacterias y se incubaron a 37ºC, 5% de CO_{2}, durante 1 h. Se interrumpió la infección mediante quíntuple lavado con PBS precalentado y subsiguiente fijación de las células con paraformaldehido al 2% en PBS durante 30 min. Las células fijadas fueron seguidamente teñidas durante por lo menos 15 min a temperatura ambiente con violeta cristal (0,07% peso/volumen), y se determinaron las bacterias adherentes por ME-180. Tal como muestra la Tabla 2, en ausencia de la proteína PilC2 biológicamente activa se adhirieron todas las cepas de Neisseria piliadas ensayadas, mientras que la cepa de N. gonorrhoeae no piliada no se adhirió. En presencia de la proteína PilC2 biológicamente activa se redujo la unión de las cepas de Neisseria piliadas ensayadas, a un nivel fondo. Por ello, la reducción de la unión a células epiteliales tuvo lugar independientemente de la variante de la proteína PilC formada naturalmente por las bacterias (PilC en TRN289, con respecto a PilC2 en TRN290, con respecto a una proteína PilC desconocida en N. meningitidis N530). Con ello (i) se lleva a cabo la detección de la proteína PilC como adhesina bacteriana importante (es decir, esencial para el inicio de una enfermedad), (ii) se confirma la escasa variabilidad de las diversas proteínas PilC en lo que al reconocimiento de los receptores celulares se refiere, y, por lo tanto, (iii) se confirma la aptitud de los inhibidores, conformes a la invención, de la interacción entre proteínas PilC y sus receptores celulares.

TABLA 2 Competición de la unión de Neisseria a células epiteliales humanas

2

Competición de la unión de Neisseria patógenas a células epiteliales humanas. N137, cepa MS11 piliada de N. gonorrhoeae; N174, cepa no piliada derivada de N. gonorrhoeae MS 11, en la que se ha suprimido el gen pilE; TRN289, cepa MS11 piliada de N. gonorrhoeae, que forma exclusivamente PilC1; TRN290, cepa MS11 piliada de N. gonorrhoeae, que forma exclusivamente PilC2, y N330, cepa de N. meningitidis, que forma una proteína PilC desconocida. El tratamiento preliminar de las células epiteliales con 20 \mug/ml de proteína PilC2 se ha descrito en el Ejemplo 6. Los resultados de los experimentos de competencia se han consignado en forma de número medio de bacterias adherentes por célula epitelial.

Ejemplo 7 Identificación de otras secuencias de ADN codificadoras de proteína PilC

Para la determinación de la secuencia de ADN del gen pilC2 se clonó el fragmento BamHI/EcoRI del pTR27 en el vector Blueskript SK (pTR34). Mediante la exonucleasa III se generaron adecuados clones de deleción solapantes del pTR34, y se los secuenció. Al efectuarse la comparación de las secuencias de ADN codificantes para las proteínas PilC1 (A. Jonsson, Umea University, New Series No. 322, Department of Microbiology: ISSN 0346-6612) y PilC2 (Figura 4) mediante el programa de ordenador PCGENE/ALGIN se obtuvo una identidad del 84%. Las regiones de secuencias idénticas se distribuyen a modo de isla sobre ambos genes, con una concentración univoca en el extremo 3. Con la intención de identificar más secuencias codificadoras de proteína PilC, se diseñaron sondas de oligonucleótidos para las secuencias idénticas entre pilC1 y pilC2. En el diseño de las sondas de oligonucleótidos se asignó especial valor a la derivación de los oligonucleótidos alternadamente entre las cadenas (+) y (-) del ADN, a efectos de poder amplificar en caso de necesidad correspondientes fragmentos mediante PCR. De esta manera la totalidad de la secuencia de ADN de los genes pilC1 y pilC2 se subdividió en fragmentos solapantes, de aproximadamente 400 - 500 b p. Además, a cada oligonucleótido de cadena (+) se adjuntó el cebador "M13mp", y a cada oligonucleótido de cadena (-) se adjuntó el cebador "M13mp inverso" (Vieira y Messing, Gene 19, 259-268, 1982), como secuencia de hibridación, en su extremo 5', a efectos de poder determinar directamente la secuencia de ADN de los fragmentos de
PCR.

Se marcó con biotina una seleccion de sondas de oligonucleótidos según las prescripciones del kit "DIG-Oligonucleotide-Tailing" (Boehringer Mannheim), y se la aplicó para hibridación con ADN cromosómico de N. gonorrhoeae cortado con ClaI y PvuII. En la transferencia Southern, utilizando las mencionadas sondas de oligonucleótidos (Tabla 3), se obtuvieron indicios unívocos acerca de la existencia de otros genes pilC (además de pilC1 y pilC2) en la cepa MS11 de N. gonorrhoeae y en la cepa A1493 de N. meningitidis. Además de ello, mediante dichas sondas se demostró la existencia de genes para proteínas análogas a PilC en una cepa de Pseudomonas aeruginosa. Mediante técnicas estándar es ahora posible clonar los genes así identificados, caracterizarlos y someterlos a procesos ulteriores. Mediante este experimento se demostró la aptitud de los métodos descritos para la identificación de genes, hasta ahora desconocidos, para proteínas PilC o análogas a pilC.

TABLA 3 Sondas de oligonucleótidos para la identificación de otras secuencias de nucleótidas codificadoras de proteína PilC

\vskip1.000000\baselineskip

3

\newpage

Ejemplos de sondas de oligonucleótidos para la identificación de otras secuencias de nucleótidos codificadoras de proteína PilC. Los Ejemplos TR47-TR65 han sido tomados de la comparación de secuencias de los genes pilC1 y pilC2 del N. gonorrhoeae, de la Figura 4A. TR66 corresponde a una región de secuencia situada más abajo de la región codificadora de los genes pilC. Los números de las posiciones se refieren a los genes pilC1 o pilC2, respectivamente, de la Figura 4A.

Claims

1. Secuencia génica recombinante para la síntesis de una proteína con la actividad biológica de la proteína PilC, en la que la actividad consiste en que la proteína sustenta el ensamblaje de las pili de tipo 4, media la unión de bacterias portadoras de pilus de tipo 4 en los receptores celulares o presenta la aptitud inmunológica para la inducción de anticuerpos contra las bacterias portadoras de pilus de tipo 4, que compiten con la aglomeración de las bacterias en sus receptores celulares y preferiblemente bloquean la aglomeración, cuyo tramo de secuencia de fase variable codificadora de péptido señal que contiene una secuencia de nucleótidos homopolímera se caracteriza por el siguiente cambio:

de manera que se posibilita la expresión de la secuencia génica recombinante en una célula hospedante sin experimentar influencia por la variación de fase.

2. Secuencia génica de acuerdo con la reivindicación 1, obtenible por modificación de una secuencia de ADN procedente de una bacteria patógena portadora de pilus de tipo 4.

3. Secuencia génica de acuerdo con la reivindicación 2, en la que la bacteria patógena es una bacteria del genero Neisseria, preferiblemente Neisseria gonorrhoeae o Neisseria meningitidis.

4. Secuencia génica de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 3, que es la secuencia génica representada en la Figura 4, estando la secuencia de nucleótidos homopolímera de fase variable sustituida con la secuencia de nucleótidos heteropolimera de fase no variable, representada en la Figura 2.

5. Secuencia génica de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 4, obtenible por modificación de una secuencia de ADN que con una región constante híbrida una de las secuencias de ADN de la Figura 4 o de la Tabla 4 y codifica una proteína con la actividad biológica de la proteína PilC, consistiendo la actividad en que la proteína sustenta el ensamblaje de pili de tipo 4, media la unión de las bacterias portadoras de pilus de tipo 4 a los receptores celulares o presenta la aptitud inmunológica para la inducción de anticuerpos contra las bacterias portadoras de pilus de tipo 4, que compiten con la aglomeración de las bacterias a sus receptores celulares y preferiblemente bloquean la aglomeración.

6. Secuencia génica de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 5, en la que la secuencia de nucleótidos homopolímera modificada en una secuencia de nucleótidos heteropolimera contiene por lo menos 5 nucleótidos.

7. Secuencia génica de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 6, que codifica una proteína con la actividad biológica de la proteína PilC, que presenta una región oligo-histidina adecuada para su purificación, consistiendo la actividad en que la proteína sustenta el ensamblaje de las pili de tipo 4, media la unión de las bacterias portadoras de pilus de tipo 4 a los receptores celulares o presenta la aptitud inmunológica para la inducción de anticuerpos contra las bacterias portadoras de pilus de tipo 4, que compiten con la aglomeración de las bacterias a sus receptores celulares y preferiblemente bloquean la aglomeración.

8. Secuencia génica de acuerdo con la reivindicación 7, en la que la región oligo-histidina se halla en el extremo N o en el extremo C de la forma madura de la proteína codificada.

9. Vector recombinante, que contiene una secuencia génica de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 8.

10. Vector recombinante de acuerdo con la reivindicación 9, en el que la secuencia génica mencionada se halla bajo el control de un promotor.

11. Vector recombinante de acuerdo con la reivindicación 10, en el que el promotor es un promotor activo en células hospedantes de Neisseria.

12. Célula hospedante, que contiene un vector recombinante de acuerdo con una de las reivindicaciones 9 a 11.

13. Célula hospedante de acuerdo con la reivindicación 12, que es una cepa no piliada de Neisseria.

14. Procedimiento para la producción de una proteína esencialmente pura con la actividad biológica de la proteína PilC, en el que se cultiva una célula hospedante de acuerdo con la reivindicación 12 ó 13 bajo condiciones adecuadas y se purifica la proteína, consistiendo la actividad en que la proteína sustenta el ensamblaje de pili de tipo 4, media la unión de bacterias portadoras de pilus de tipo 4 a los receptores celulares o presenta la aptitud inmunológica para la inducción de anticuerpos contra las bacterias portadoras de pilus de tipo 4, que compiten con la aglomeración de las bacterias en sus receptores celulares y preferiblemente bloquean la aglomeración.

15. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 14, en el que la purificación incluye una cromatografía de afinidad.