ES2306528T3 - Antigenos de streptococcus. - Google Patents
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Abstract
Un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido que tiene al menos 95% de identidad a una cualquiera de las SEQ ID Números: 2, 8, 10, 16, 55, 64-66 ó 78 en el que el polipéptido induce una respuesta anti-estreptocócica inmune cuando se administra a un individuo.
Description
Antígenos de Streptococcus.
La presente invención se refiere a antígenos,
más particularmente a antígenos de proteínas del patógeno
Streptococcus pneumoniae que son útiles como componentes de
vacunas para la terapia y/o profilaxis.
S. pneumoniae es un agente importante de
enfermedad en hombre especialmente entre niños, ancianos y personas
inmunocomprometidas. Es una bacteria aislada frecuentemente entre
pacientes con enfermedades invasivas tales como
bacteraemia/septicemia, neumonía, meningitis con alta morbilidad y
mortalidad en todo el mundo. Incluso con la terapia apropiada de
antibióticos, las infecciones neumocócicas pueden dar como resultado
muchas muertes. Aunque la llegada de fármacos antimicrobianos ha
reducido la mortalidad global de la enfermedad de neumococos, la
presencia de organismos neumocócicos resistentes podrían tener un
impacto principal en la morbilidad y mortalidad asociada a
enfermedad de S. pneumoniae. Tales vacunas deberían ser
potencialmente útiles para evitar la otitis media en bebés y niños
jóvenes.
Los esfuerzos para desarrollar una vacuna
neumocócica se han concentrado en general en la generación de
respuestas inmunes al polisacárido capsular neumocócico. Más de 80
serotipos capsulares neumocócicas se han identificado en la base de
diferencias antigénicas. La vacuna neumocócica comercialmente
disponible, que comprenden 23 polisacáridos capsulares que lo más
frecuentemente provocan enfermedad, tiene inconvenientes
significativos relacionados principalmente con la escasa
inmunogenicidad de algunos polisacáridos capsulares, la diversidad
de los serotipos y las diferencias en la distribución de serotipos
con el tiempo, áreas geográficas y grupos de edad. En particular,
la falta de vacunas existentes y vacunas conjugadas capsulares
actualmente en desarrollo para proteger a los niños jóvenes contra
todos los serotipos estimula la evaluación de otros componentes de
S. pneumoniae. Aunque la inmunogenicidad de polisacáridos
capsulares se puede mejorar, la especificidad de serotipos
representará una limitación principal de las vacunas basadas en
polisacáridos. El uso de un antígeno de proteínas neumocócicas
inmunogénicas antigénicamente conservado, o bien por sí mismo o en
combinación con componentes adicionales, ofrece la posibilidad de
una vacuna neumocócica basada en proteína.
La Publicación PCT número WO98/18930 publicada
el 7 de mayo de 1998 titulada "Streptococcus Pneumoniae
antigens and vaccines" describe ciertos polipéptidos que se
reivindican que son antigénicos. Sin embargo, no se reseña ninguna
actividad biológica de estos polipéptidos. El documento WO 98/18931,
publicado el mismo día titulado "Streptococcus pneumoniae
polynucleotides and sequences".
Por lo tanto permanece una necesidad no
encontrada de antígenos de Streptococcus que se pueden usar como
componentes de vacuna para la profilaxis y/o terapia de infección
por Streptococcus infection.
De acuerdo con un aspecto, la presente invención
proporciona un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido
que tiene al menos un 95% de identidad a un segundo polipéptido que
comprende una secuencia elegida entre las SEQ ID números: 2, 8, 10,
16, 55, 64-66 ó 78 en la que el polipéptido induce
una respuesta inmune contra los estreptococos cuando se administra
a un individuo.
En otro aspecto, se proporcionan vectores que
comprenden polinucleótidos de la invención unido de manera operativa
a una región de control de la expresión, así como células huésped
transfectadas con dichos vectores y procedimientos de producción de
polipéptidos que comprenden el cultivo de dichas células huésped en
las condiciones adecuadas para la expresión.
Dichas células huésped no son células del tronco
embrionario humano o células germinales humanas.
Todavía en otro aspecto, se proporcionan
polipéptidos novedosos codificados por polinucleótido de la
invención.
La figura 1 es la secuencia de ADN del gen
BVH-3; SEQ ID NO: 1.
La figura 2 es la secuencia de aminoácidos de la
proteína BVH-3; SEQ ID NO: 2.
La figura 3 es la secuencia de ADN del gen de
BVH-11; SEQ ID NO: 3.
La figura 4 es la secuencia de aminoácidos de la
proteína BVH-11; SEQ ID NO: 4.
La figura 5 es la secuencia de ADN del gen
BVH-28; SEQ ID NO: 5.
La figura 6 es la secuencia de aminoácidos de la
proteína BVH-28; SEQ ID NO: 6.
La figura 7 es la secuencia de ADN del gen
BVH-3A que corresponde al extremo 5' terminal de
BVH-3; SEQ ID NO: 7.
La figura 8 es la secuencia de aminoácidos de la
proteína BVH-3A; SEQ ID NO: 8.
La figura 9 es la secuencia de ADN del gen
BVH-3B que corresponde al extremo 3' terminal de
BVH-3; SEQ ID NO: 9.
La figura 10 es la secuencia de aminoácidos de
la proteína BVH-3B; SEQ ID NO: 10.
La figura 11 muestra la comparación de las
secuencias de aminoácidos predicha de los marcos abiertos de lectura
BVH-3 de las cepas de S. pneumoniae WU2,
RX1, JNR.7/87, SP64, P4241 y A66 S usando el programa software de
análisis de secuencias de ClustalWfrom MacVector (versión 6.5). Por
debajo de la alineación, existe una línea de consenso donde los
caracteres * y . indican restos idénticos y similares de
aminoácidos, respectivamente.
La figura 12 muestra la comparación de las
secuencias de aminoácidos predichas de los marcos abiertos de
lectura de BVH-11 de las cepas de S.
pneumoniae WU2, Rx1, JNR.7/87, SP64, P4241, A66 y SP63 usando el
programa software de análisis de secuencias de Clustal W de
MacVector (versión 6.5). Por debajo de la alineación, existe una
línea de consenso donde * y los caracteres indican restos idénticos
y similares de aminoácidos, respectiva-
mente.
mente.
La figura 13 muestra la comparación de las
secuencias de aminoácidos predicha de las proteínas
BVH-11 de diversas cepas de S. pneumoniae.
Los grados de identidad (I) y similitud (S) se determinaros usando
el programa Clustal W del software de análisis de secuencia de
MacVector (versión 6.5).
La figura 14 es una secuencia de ADN que
contiene el gen completo de BVH-3 (marco abiertos de
lectura "ORF" en los nucleótidos 1777 a 4896); SEQ ID NO:
11.
La figura 15 es una secuencia de ADN que
contiene el gen completo de BVH-11 (ORF en los
nucleótidos 45 a 2567); SEQ ID NO: 12.
La figura 16 es una secuencia de ADN que
contiene el gen completo de BVH-11-2
(ORF en los nucleótidos 114 a 2630); SEQ ID NO: 13.
La figura 17 es la secuencia de aminoácidos de
la proteína BVH-11-2; SEQ ID NO:
14.
La figura 18 es la secuencia de ADN de SP63
BVH-3 gene; SEQ ID NO:15.
La figura 19 es la secuencia de aminoácidos de
la proteína SP63 BVH-3; SEQ ID NO: 16.
La figura 20 es la secuencia de aminoácidos de
la proteína BVH-3M; SEQ ID NO: 55.
La figura 21 es la secuencia de aminoácidos de
la proteína BVH-3AD; SEQ ID NO: 56.
La figura 22 es la secuencia de aminoácidos de
la proteína
L-BVH-3-AD; SEQ ID
NO: 57.
La figura 23 es la secuencia de aminoácidos de
la proteína NEW12; SEQ ID NO: 58.
La figura 24 es la secuencia de aminoácidos de
la proteína BVH-3C; SEQ ID NO: 59.
La figura 25 es la secuencia de aminoácidos de
la proteína BVH-11M; SEQ ID NO: 60.
La figura 26 es la secuencia de aminoácidos de
la proteína BVH-11A; SEQ ID NO: 61.
La figura 27 es la secuencia de aminoácidos de
la proteína BVH-11B (también llamada New13); SEQ ID
NO: 62.
La figura 28 es la secuencia de aminoácidos de
la proteína BVH-11C; SEQ ID NO: 63.
La figura 29 es la secuencia de aminoácidos de
la proteína NEW1; SEQ ID NO: 64.
La figura 30 es la secuencia de aminoácidos de
la proteína NEW2; SEQ ID NO: 65.
La figura 31 es la secuencia de aminoácidos de
la proteína NEW3; SEQ ID NO: 66.
La figura 32 es la secuencia de aminoácidos de
la proteína NEW4; SEQ ID NO: 67.
La figura 33 es la secuencia de aminoácidos de
la proteína NEW5; SEQ ID NO: 68.
La figura 34 es la secuencia de aminoácidos de
la proteína NEW6; SEQ ID NO: 69.
La figura 35 es la secuencia de aminoácidos de
la proteína NEW7; SEQ ID NO: 70.
La figura 36 es la secuencia de aminoácidos de
la proteína NEW8; SEQ ID NO: 71.
La figura 37 es la secuencia de aminoácidos de
la proteína NEW9; SEQ ID NO: 72.
La figura 38 es la secuencia de aminoácidos de
la proteína BVH-11-2M; SEQ ID NO:
73.
La figura 39 es la secuencia de aminoácidos de
la proteína NEW10; SEQ ID NO: 74.
La figura 40 es la secuencia de aminoácidos de
la proteína NEW11; SEQ ID NO: 75.
La figura 41 es la secuencia de ADN de NEW12
gene; SEQ ID NO: 76.
La figura 42 es la secuencia de aminoácidos de
la proteína NEW14; SEQ ID NO: 77.
La figura 43 es la secuencia de aminoácidos de
la proteína NEW15; SEQ ID NO: 78.
La figura 44 es la secuencia de aminoácidos de
la proteína NEW16; SEQ ID NO: 79.
La figura 45 es la secuencia de ADN del gen GBS
BVH-71; SEQ ID NO: 80.
La figura 46 es la secuencia de aminoácidos de
la proteína GBS BVH-71; SEQ ID NO: 81.
La figura 47 es la secuencia de ADN del gen GAS
BVH-71; SEQ ID NO: 82.
La figura 48 es la secuencia de aminoácidos de
la proteína GAS BVH-71; SEQ ID NO: 83.
De acuerdo con un aspecto de la presente
invención proporciona un polinucleótido aislado que codifica un
polipéptido que tiene al menos un 95% de identidad a cualquiera de
las SEQ ID Números: 2, 8, 10, 16, 55, 64-66 ó 78 en
las que el polipéptido induce una respuesta inmune contra
estreptococos cuando se administra a un individuo.
De acuerdo con un aspecto, la presente invención
se refiere a la reivindicación 9.
En una realización adicional, la presente
invención también se refiere a polipéptidos quiméricos que comprende
uno o más polipéptidos o sus fragmentos, análogos o derivados como
se ha descrito en la presente solicitud.
En una realización adicional, la presente
invención también se refiere a polipéptidos quiméricos que
comprenden uno o más polipéptidos o sus fragmentos, análogos o
derivados como se ha definido en las figuras de la presente
solicitud.
En una realización adicional, la presente
solicitud también se refiere a polipéptidos quiméricos que
comprenden dos o más polipéptidos elegidos entre las SEQ ID
números: 2, 8, 10, 16, 55, 64-66 ó 78; con la
condición de que los polipéptidos o fragmentos, análogos sus
derivados estén unidos para formar un polipéptido quimérico.
En una realización adicional, el polipéptido
quimérico comprenderá entre 2 y 5 polipéptidos.
En una realización adicional, el polipéptido
quimérico comprenderá entre 2 y 4 polipéptidos.
En una realización adicional, el polipéptido
quimérico comprenderá entre 2 y 3 polipéptidos.
En una realización adicional, el polipéptido
quimérico comprenderá 2 polipéptidos.
En una realización adicional, se proporciona un
polipéptido quimérico de fórmula (I) que induce una respuesta
inmune contra estreptococos cuando se administra a un individuo:
(I)A-(B)_{m}-(C)_{n}-D
En la que;
m es 0 ó 1,
n es 0 ó 1,
A se elige entre SEQ ID NO: 2, 8, 10, 16, 55,
64-66 ó 78;
B se elige entre las SEQ ID Números: 2, 8, 10,
16, 55, 64-66 ó 78;
C se elige entre SEQ ID Números: 2, 8, 10, 16,
55, 64-66 ó 78; y
D se elige entre SEQ ID Números: 2, 8, 10, 16,
55, 64-66 ó 78.
En una realización, los polipéptidos quiméricos
de la presente invención comprenden aquellos en los que las
siguientes realizaciones están presentes, o bien independientemente
o en combinación.
En una realización adicional, A es SEQ ID
Números: 10, 64, o sus fragmentos, análogos o derivados
En una realización adicional, A es SEQ ID NO: 10
o sus fragmentos, análogos y derivados.
En una realización adicional, A es SEQ ID NO: 64
o sus fragmentos, análogos y derivados.
En una realización adicional, B es SEQ ID NO: 10
o sus fragmentos, análogos y derivados.
En una realización adicional, C es SEQ ID
Números: 10, 64.
En una realización adicional, C es SEQ ID NO: 10
o sus fragmentos, análogos y derivados.
En una realización adicional, C es SEQ ID NO: 62
o sus fragmentos, análogos y derivados.
En una realización adicional, D es SEQ ID NO:
10, 58, 62, 64, 67, 68, 74, 77 o sus fragmentos, análogos o
derivados.
En una realización adicional, D es SEQ ID NO: 10
o sus fragmentos, análogos y derivados.
En una realización adicional, D es SEQ ID NO: 64
o sus fragmentos, análogos y derivados.
En una realización adicional, m es 0.
En una realización adicional, n es 0.
En una realización adicional, m y n son 0.
En una realización adicional, m y n son 0, A es
SEQ ID NO: 64 o sus fragmentos, análogos y derivados, B es SEQ ID
NO: 62 o sus fragmentos, análogos y derivados.
En una realización adicional, m y n son 0, A es
SEQ ID NO: 62 o sus fragmentos, análogos y derivados, B es SEQ ID
NO: 64 o sus fragmentos, análogos y derivados.
De acuerdo con la presente invención, todos los
nucleótidos que codifican polipéptidos y los polipéptidos
quiméricos están dentro del alcance de la presente invención.
En una realización adicional, los polipéptidos o
los polipéptidos quiméricos de acuerdo con la presente invención
son antigénicos.
En una realización adicional, los polipéptidos o
los polipéptidos quiméricos de acuerdo con la presente invención
pueden inducir una respuesta en un individuo.
En una realización adicional, la presente
invención también se refiere a polipéptidos que son capaces de
inducir anticuerpos que tienen especificidad de unión a los
polipéptidos o los polipéptidos quiméricos de la presente invención
como se ha definido anteriormente.
Un anticuerpo que "tiene especificidad de
unión" es un anticuerpo que reconoce y se une al polipéptido
seleccionado pero que sustancialmente no reconocen y se unen a
otras moléculas en una muestra, por ejemplo, una muestra biológica
que incluye de manera natural el péptido seleccionado. La unión
específica se puede medir usando un ensayo ELISA en el que el
polipéptido seleccionado se usa como un antígeno.
Salvo que se defina de otra manera, todos los
términos técnicos y científicos usados en el presente documento
tienen los mismos significados que entienden de manera común los
expertos en la técnica a la que la invención pertenece. Todas las
publicaciones, solicitudes de patente, patentes, y otras referencias
mencionadas en el presente documento se incorporan por referencia
en su totalidad. En el caso de conflicto, la presente memoria
descriptiva, incluyendo definiciones se controlarán. Además, los
materiales, procedimientos y ejemplos se ilustran solamente y no se
pretende que sean limitantes.
Como se usa en el presente documento,
"fragmentos", "derivados" o "análogos" de los
polipéptidos de la invención incluyen los polipéptidos en los que
uno o más de los restos de aminoácidos están sustituidos con un
resto aminoácido conservado no conservado (preferiblemente
conservado) y que puede ser de origen natural o no natural. En una
realización, los derivados y análogos de polipéptidos de la
invención tendrán aproximadamente 70% de identidad con las
secuencias mostradas en las figuras o fragmentos de los mismos. Es
decir, el 70% de los restos son los mismos. En una realización
adicional, los polipéptidos tendrán más de un 75% de homología. En
una realización adicional, los polipéptidos tendrán más de un 80% de
homología. En una realización adicional, los polipéptidos tendrán
más de un 85% de homología. En una realización adicional, los
polipéptidos tendrán más de un 90% de homología. En una realización
adicional, los polipéptidos tendrán más de un 95% de homología. En
una realización adicional, los polipéptidos tendrán más de un 99% de
homología. En una realización adicional, los derivados y análogos
de los polipéptidos de la invención tendrán menos que
aproximadamente 20 sustituciones, modificaciones o supresiones de
restos de aminoácidos, y más preferiblemente menos de 10. Las
sustituciones preferidas son las conocidas en la técnica como
conservadas, es decir los restos sustituidos comparten propiedades
físicas o químicas tales como hidrofobicidad, tamaño, carga u otros
grupos funcionales.
De acuerdo con la presente invención, los
polipéptidos de la invención incluyen tanto polipéptidos como
polipéptidos quiméricos.
También están incluidos los polipéptidos que
tienen condenados a ellos otros compuestos que alteran las
propiedades biológicas o farmacológicas de los polipéptidos es
decir, polietilen glicol (PEG) para incrementar la semivida;
secuencias guía o de aminoácidos secretoras para la facilidad de la
purificación; secuencias prepro- y pro-; y
(poli)sacáridos.
Además, en aquellas situaciones en las que las
regiones de aminoácidos se encuentra que son polimórfica, puede ser
deseable variar uno o más aminoácidos más particulares para imitar
de manera más eficaz los diferentes epítopes de las diferentes
cepas de estreptococos.
Además, los polipéptidos de la presente
invención se pueden modificar mediante la acilación -NH_{2}
terminal (por ejemplo, mediante acetilación, o amidación de ácido
tioglicólico, carboxi amidación terminal, por ejemplo, con amoníaco
o metilamina) para proporcionar estabilidad, aumento de
hidrofobicidad para el ligamiento o unión a un soporte u otra
molécula.
También se contemplan hetero y homo multímeros
de polipéptidos de los fragmentos de polipéptidos, análogos y
derivados.
Estas formas poliméricas incluyen, por ejemplo,
uno o más polipéptidos que se han reticulado con reticuladores
tales como avidina/biotina, gluteraldehído o
dimetil-superimidato. Tales formas poliméricas
también incluyen polipéptidos que contienen dos o más secuencias
contiguas en tándem o invertidas, producidas a partir de los ARNm
de múltiples cistrones generados mediante la tecnología de ADN
recombinante.
Preferiblemente, un fragmento, análogo o
derivado de un polipéptido de la invención comprenderá al menos una
región antigénica es decir, al menos un epítope.
Con el fin de lograr la formación de polímeros
antigénicas (es decir, multímeros sintéticos), polipéptidos se
pueden utilizar teniendo grupos bishaloacetilo, nitroarilhauros, o
los similares, donde los reactivos son específicos para los grupos
tio.
Por lo tanto, la unión entre los dos grupos
mercapto de los diferentes péptidos puede ser un único enlace o
puede estar compuesto de un grupo de enlace de al menos cuatro, y no
más de 16, pero usualmente no más de aproximadamente 14 átomos de
carbono.
En una realización particular, los fragmentos
de, polipéptidos, análogos y derivados de la invención no contienen
un resto de partida de metionina (Met). Preferiblemente, los
polipéptidos no incorporarán una secuencia guía o secretora
(secuencia señal). Parte de señal de un polipéptido de la invención
se puede determinar de acuerdo con las técnicas biológicas
moleculares establecidas. En general, el polipéptido de interés se
puede aislar a partir de un cultivo de estreptococos y
posteriormente secuenciarse para determinar el resto inicial de la
proteína murina y por lo tanto la secuencia del polipéptido
maduro.
De acuerdo con otro aspecto, se proporcionan
composiciones de vacunas que comprende uno o más polipéptidos de
estreptococos de la invención en mezcla con un vehículo, diluyente o
adyuvante farmacéuticamente aceptable. Los adyuvantes adecuados
incluyen aceites es decir, adyuvante completo o incompleto de
Freund; sales es decir, AlK(SO_{4})_{2},
AlNa(SO_{4})_{2}, AlNH4(SO_{4})_{2}, sílice, caolín, polinucleótido de carbono es decir, poli IC y poli AU. Los adyuvantes preferidos incluyen QuilA y Alhydrogel. Las vacunas de la invención se pueden administrar por vía parenteral mediante inyección, infusión rápida, absorción nasofaríngea, dermoabsorción, o bucal u oral.
AlNa(SO_{4})_{2}, AlNH4(SO_{4})_{2}, sílice, caolín, polinucleótido de carbono es decir, poli IC y poli AU. Los adyuvantes preferidos incluyen QuilA y Alhydrogel. Las vacunas de la invención se pueden administrar por vía parenteral mediante inyección, infusión rápida, absorción nasofaríngea, dermoabsorción, o bucal u oral.
Los vehículos farmacéuticamente aceptables
también incluyen toxoide de tétanos.
Las composiciones de las vacunas de la invención
se usan para el tratamiento o profilaxis de infección por
estreptococos y/o enfermedades y síntomas mediados por infección por
estreptococos como se describe en P.R. Murray (Ed, en jefe), E.J.
Baron, M.A. Pfaller, F.C. Tenover y R.H. Yolken. Manual of Clinical
Microbiology, ASM Press, Washington, D.C. sexta edición, 1995, 1482
p que se incorporan en el presente documento por referencia. En una
realización, las composiciones de las vacunas de la presente
invención se usan para el tratamiento o profilaxis de meningitis,
otitis media, bacteremia o neumonía. En una realización, las
composiciones de las vacunas de la invención se usan para el
tratamiento o profilaxis de infección por estreptococos y/o
enfermedades y síntomas mediadas por infección por
estreptococos, en particular S. pneumoniae, grupo A
de streptococcus (pyogenes), grupo B de streptococcus
(GBS o agalactiae), dysgalactiae, uberis, nocardia
así como Staphylococcus aureus. En una realización adicional,
la infección por estreptococos es S.pneumoniae.
En una realización particular, las vacunas se
administran a aquellos individuos en riesgo de infección por
estreptococos, tales como bebés, ancianos e individuos
inmunocomprometidos.
Como se usa en la presente solicitud, el término
"individuos" incluyen mamíferos. En una realización adicional,
el mamífero es un ser humano.
Las composiciones de las vacunas están
preferiblemente en forma de dosificación unitaria de aproximadamente
0,001 a 100 \mug/kg (antígeno/peso corporal) y más
preferiblemente 0,01 a 10 \mug/kg y lo más preferiblemente 0,1 a
1 \mug/kg 1 a 3 veces con un intervalo de aproximadamente 1 a 6
semanas de intervalos entre inmuniza-
ciones.
ciones.
De acuerdo con otro aspecto, se proporcionan
polinucleótidos que codifican polipéptidos caracterizados por la
secuencia de aminoácidos elegida entre las SEQ ID Números: 2, 8, 10,
16, 55, 64-66 ó 78.
En una realización, los polinucleótidos son los
ilustrados en las SEQ ID Números: 1, 7, 9, 15, que pueden incluir
marcos abiertos de lectura (ORF), que codifican los polipéptidos de
la invención. Se apreciará que las secuencias de polinucleótidos
ilustradas en las figuras se pueden alterar con codones degenerados
que incluso codifican los polipéptidos de la invención. De acuerdo
con lo anterior la presente invención además proporciona
polinucleótidos que se hibridan a las secuencias de polinucleótidos
descritas anteriormente en el presente documento (o sus secuencias
complementarias) que tienen 50% de identidad entre las secuencias.
En una realización, al menos un 70% de identidad entre secuencias.
En una realización, al menos 75% de identidad entre secuencias. En
una realización, al menos 80% de identidad entre secuencias. En una
realización, al menos 85% de identidad entre secuencias. En una
realización, al menos 90% de identidad entre secuencias. En una
realización adicional, los polinucleótidos se pueden hibridar en
condiciones rigurosas es decir, teniendo al menos 95% de identidad.
En una realización adicional, más de 97% de identidad.
En una realización adicional, los
polinucleótidos son los ilustrados en las SEQ ID Números: 1, 7, 9,
15, que codifican los polipéptidos de la invención.
En una realización adicional, los
polinucleótidos son los ilustrados en las SEQ ID Números: 1, 9, 15,
que pueden incluir los marcos abiertos de lectura (ORF), que
codifican los polipéptidos de la invención.
En una realización adicional, los
polinucleótidos son los ilustrados en las SEQ ID Números: 1, 9, 15,
que pueden incluir los marcos abiertos de lectura (ORF), que
codifican los polipéptidos de la invención.
En una realización adicional, los
polinucleótidos son los ilustrados en las SEQ ID Números: 1, 7, 9,
15, que pueden incluir los marcos abiertos de lectura (ORF), que
codifican los polipéptidos de la invención.
En una realización adicional, los
polinucleótidos son los ilustrados en las SEQ ID Números: 1, 7, 9,
15, que pueden incluir los marcos abiertos de lectura (ORF), que
codifican los polipéptidos de la invención.
En una realización adicional, los
polinucleótidos son los ilustrados en las SEQ ID Números: 1, 9, 15,
que pueden incluir los marcos abiertos de lectura (ORF), que
codifican los polipéptidos de la invención.
En una realización adicional, los
polinucleótidos son los ilustrados en las SEQ ID Números: 1, 7, 9,
que pueden incluir los marcos abiertos de lectura (ORF), que
codifican los polipéptidos de la invención.
En una realización adicional, los
polinucleótidos son los ilustrados en las SEQ ID NO: 1, que
codifican los polipéptidos de la invención.
En una realización adicional, los
polinucleótidos son los ilustrados en las SEQ ID NO: 7, que
codifican los polipéptidos de la invención.
En una realización adicional, los
polinucleótidos son los ilustrados en las SEQ ID NO: 9, que
codifican los polipéptidos de la invención.
\newpage
En una realización adicional, los
polinucleótidos son los ilustrados en las SEQ ID NO: 15, que
codifican los polipéptidos de la invención.
Como fácilmente apreciarán los expertos en la
técnica, los polinucleótidos incluyen tanto ADN como ARN.
La presente invención también incluyen
polinucleótidos complementarios al polinucleótido descritos en la
presente solicitud.
En un aspecto adicional, los polinucleótidos que
codifican los polipéptidos de la invención, o sus fragmentos,
análogos o derivados, se pueden usar en un procedimiento de
inmunización de ADN. Esto es, se pueden incorporar en un vector que
se puede replicar y expresar tras la inyección produciendo por lo
tanto el polipéptido antigénico in vivo. Por ejemplo los
polinucleótidos se pueden incorporar en un vector plásmido bajo el
control del promotor de CMV que es funcional en células
eucarióticas.
Preferiblemente el vector se inyecta por vía
intramuscular.
De acuerdo con otro aspecto, se proporciona un
procedimiento para producir polipéptidos de la invención mediante
técnicas recombinantes mediante la expresión de un polinucleótido
que codifica dicho polipéptido en una célula huésped y recuperando
el producto de polipéptido expresado. Como alternativa, los
polipéptidos se pueden producir de acuerdo con las técnicas
químicas sintéticas establecidas es decir, síntesis en fase en
solución o en fase sólida de oligopéptidos que se ligan para
producir el polipéptido completo (ligamiento en bloque).
Los procedimientos generales para la obtención y
evaluación de polinucleótidos y polipéptidos se describen en las
siguientes referencias: Sambrook et al, Molecular Cloning: A
Laboratory Manual, 2nd ed, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989; Current
Protocols in Molecular Biology, editado por Ausubel F.M. et
al., John Wiley y Sons, Inc. New York; PCR Cloning Protocols,
from Molecular Cloning to Genetic Engineering, editado por White
B.A., Humana Press, Totowa, New Jersey, 1997, 490 páginas; Protein
Purification, Principles y Practices, Scopes R.K.,
Springer-Verlag, New York, 3ª Edición, 1993, 380
páginas; Current Protocols in Immunology, Edited by Coligan J.E.
et al., John Wiley & Sons Inc., New York que se
incorporan en el presente documento por referencia.
Para la producción recombinante, las células
huésped se trasnfectan con vectores que codifican el polipéptido, y
después se cultivan en un medio nutriente modificado como sea
apropiado para activar promotores, selección de transformantes o
amplificación de los genes.
Los vectores adecuados son aquellos que son
viables y se pueden replicar en el huésped elegido e incluyen
secuencias cromosómicas, no cromosómicas de ADN sintético por
ejemplo, plásmidos bacterianos, ADN de fago, baculovirus, plásmidos
de levaduras, vectores derivados de combinaciones de plásmidos y ADN
de fago. La secuencia de polipéptidos se puede incorporar en el
vector en el sitio apropiado usando enzimas de restricción tal como
la que está unida de manera operativa a una región de control de
expresión que comprende un promotor, sitio de unión a ribosomas
(región de consenso o secuencia Shine-Dalgarno), y
opcionalmente un operador (elemento de control). Se pueden
seleccionar componentes individuales de la región de control de
expresión que son apropiados para un huésped y vector dado de
acuerdo con los principios de biología molecular establecidos
(Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª
ed, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989; Current Protocols in Molecular
Biology, Edited by Ausubel F.M. et al., John Wiley y Sons,
Inc. New York incorporadas en el presente documento por
referencia). Los promotores adecuados incluyen pero no se limitan a
LTR o promotor de SV40, E. coli lac, promotores tac o trp y
el promotor PL del fago lambda. Los vectores preferiblemente
incorporarán preferiblemente incorporan un origen de replicación
así como marcadores de selección es decir, gen de resistencia a
amplicilina. Los vectores bacterianos adecuados incluyen pET,
pQE70, pQE60, pQE-9, pbs, pD10 phagescript, psiX174,
pbluescript SK, pbsks, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A, ptrc99a,
pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 y
eukaryotic vectors pBlueBacIII, pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1, pSG,
pSVK3, pBPV, pMSG y pSVL. Las células huésped pueden ser bacterianas
es decir, E. coli, Bacillus subtilis, Streptomyces; hongos
es decir, Aspergillus niger, Aspergillus nidulins; levaduras
es decir, Saccharomyces o eucarióticas es decir, CHO,
COS.
Tras la expresión del polipéptido en cultivo,
las células se recogen típicamente mediante centrifugación después
se rompen mediante medios físicos o químicos (si el polipéptido
expresado no se secreta en el medio) y el extracto bruto resultante
retenido para aislar el polipéptido de interés. La purificación del
polipéptido a partir del medio de cultivo o lisado se puede lograr
mediante las técnicas establecidas dependiendo de las propiedades
del polipéptido es decir, usando sulfato de amonio o etanol,
precipitación, extracción por ácido, cromatografía de intercambio
de aniones o cationes, cromatografía de fosfocelulosa, cromatografía
de interacción hidrófoba, cromatografía de hydroxilapatita y
cromatografía de lectina. La purificación final se puede lograr
usando HPLC.
El polipéptido se puede expresar con o sin una
secuencia guía o de secreción. En el caso anterior la guía se puede
retirar usando un procedimiento después de la traducción (véanse los
documentos US 4.431.739; US 4.425.437; y US 4.338.397 incorporados
en el presente documento por referencia) o retirarse químicamente
posteriormente a la purificación del polipéptido expresado.
De acuerdo con un aspecto adicional, los
polipéptidos de estreptococos de la invención se pueden usar en un
ensayo de diagnóstico para la infección por estreptococos, en
particular infección por S. pneumoniae. Son posibles varios
procedimientos de diagnóstico, por ejemplo detección de organismos
de estreptococos en una muestra biológica, se puede seguir el
siguiente procedimiento:
a) obtener una muestra biológica de un
paciente;
b) incubar un anticuerpo o su fragmento reactivo
con un polipéptido de estreptococos de la invención con la muestra
biológica para formar una mezcla; y
c) detectar el anticuerpo unido de manera
específica en la mezcla que indica la presencia de
estreptococos.
Como alternativa, se puede realizar un
procedimiento para la detección de un anticuerpo específico para un
antígeno de estreptococos en una muestra biológica que contiene o es
sospechosa de contener dicho anticuerpo se puede realizar como
sigue:
a) obtener una muestra biológica de un
paciente;
b) incubar uno o más polipéptidos de
estreptococos de la invención o sus fragmentos con la muestra
biológica para formar una mezcla; y
c) detector el antígeno unido de manera
específica o fragmento unido en la mezcla que indica la presencia
de anticuerpo específico de.
Los expertos en la técnica reconocerán que este
ensayo de diagnóstico puede tener varias formas, incluyendo un
ensayo inmunológico tal como ensayo inmunoabsorbente ligado a
enzimas (ELISA), un radioimmunoensayo o un ensayo de aglutinación
de látex, esencialmente para determinar si los anticuerpos
específicos para la proteína están presentes en un organismo.
Las secuencias de ADN que codifican los
polipéptidos de la invención t5ambién se pueden usar para diseñar
sondas de ADN para uso en la detección de la presencia de
estreptococos en una muestra biológica sospechosa de contener tal
bacteria. El procedimiento de detección de esta invención
comprende:
a) obtener una muestra biológica de un
paciente;
b) incubar una o más sondas de ADN que tienen
una secuencia de ADN que codifica un polipéptido de la invención o
sus fragmentos con la muestra biológica para formar una mezcla;
y
c) detector la sonda de ADN unida
específicamente en la mezcla que indica la presencia de bacterias de
estreptococos.
Las sondas de ADN de esta invención también se
pueden usar para detectar estreptococos circulantes es decir,
ácidos nucleicos de S. pneumoniae en una muestra, por ejemplo
usando una reacción en cadena de la polimerasa, como un
procedimiento para la diagnosis de de infecciones por estreptococos.
La sonda se puede sintetizar usando técnicas convencionales y se
puede inmovilizar sobre una fase sólida, o se puede marcar con una
etiqueta detectable. Una sonda de ADN preferida para esta
aplicación es un ligómero que tiene una secuencia complementaria a
al menos aproximadamente 6 nucleótidos contiguos de los polipéptidos
de streptococcus pneumoniae de la invención.
Otro procedimiento de diagnóstico para la
detección de estreptococos en un paciente comprende:
a) marcar un anticuerpo reactivo con un
polipéptido de la invención o su fragmento con una etiqueta
detectable;
b) administrar el anticuerpo marcado o fragmento
marcado al paciente; y
c) detectar el anticuerpo marcado unido de
manera específica en el paciente que indica la presencia de
estreptococos.
Un aspecto adicional de la invención es el
polipéptidos de los polipéptidos de estreptococos de la invención
como inmunógenos para la producción de anticuerpos específicos para
la diagnosis y en el tratamiento de infección por estreptococos.
Los anticuerpos adecuados se pueden determinar usando procedimientos
de selección apropiados, por ejemplo midiendo la capacidad de un
anticuerpo particular para proteger de manera pasiva contra
infección por estreptococos en un modelo de ensayo. Un ejemplo de
un modelo animal es el modelo de ratón descrito en los ejemplos en
el presente documento. El anticuerpo puede ser un anticuerpo
completo o un fragmento de unión a antígeno y puede pertenecer a
cualquier clase de inmunoglobulina. El anticuerpo o fragmento puede
ser de origen animal, específicamente de origen de mamíferos y más
específicamente de murino, rata o humano. Puede ser un anticuerpo
de origen natural o su fragmento, o si se desea, un anticuerpo
recombinante o fragmento de anticuerpo. El término anticuerpo
recombinante fragmento de anticuerpo significa anticuerpo o
fragmento de anticuerpo que se produjo usando las técnicas de
biología molecular. El anticuerpo o fragmentos de anticuerpo pueden
ser policlonales, o preferiblemente monoclonales. Puede ser
específico para numerosos epítopes asociados a los polipéptidos de
streptococcus pneumoniae pero preferiblemente específicos
para uno.
Nuevos antígenos diseñados
BVH-3, BVH-11,
BVH-11-2, BVH-28 y
BVH-71, polipéptidos truncados que comprenden
fragmentos de los nuevos antígeno designados BVH-3,
BVH-11, BVH-11-2,
BVH-28 y BVH-71; y los polipéptidos
quiméricos que comprenden los antígenos designados
BVH-3, BVH-11,
BVH-11-2, BVH-28 y
HVH-71 se describen en el presente documento. Lo
siguiente es una tabla de referencia que resume la relación entre
los antígenos de la presente invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Este ejemplo ilustra la clonación de los genes
de S. pneumoniae.
La región codificante del gen de S.
pneuinoniae BVH-3 (SEQ ID NO: 1) y la región
codificante del gen de S. pneumoniae BVH-28
(SEQ ID NO: 5) se amplificaron mediante la PCR (DNA Thermal Cycler
GeneAmp PCR Sistema 2400 Perkin Elmer, San José, CA) del ADN
genómico del serogrupo 6 de la cepa SP64 de S. pneumoniae
usando los oligos que contenían extensiones de bases para la
adición de los sitios de restricción BglII (AGATCT) y XbaI (TCTAGA).
Los productos de PCR se purificaron a partir de gel de agarosa
usando un kit de extracción en gel QIAquick de QIAgen (Chatsworth,
CA), digerido por BglII-XbaI (Pharmacia Canadá Inc,
Baie d'Urfé, Canadá), se extrajo con fenol: cloroformo y se
precipitó con etanol. El vector Superlinker pSL301 (Invitrogen, San
Diego, CA) se digirió con BglII y XbaI y se purificó en gel de
agarosa usando un kit de extracción QIAquick de QIAgen (Chatsworth,
CA). Los fragmentos de ADN genómicos de BglII-XbaI
se ligaron al vector Bg1II-XbaI pSL301. Los
productos ligados se transformaron en la cepa DH5a de E. coli
[f80 lacZ DM15 endA1 recA1 hsdR17
(^{r}K-^{m}K^{+}) supE44
thi-11-gyrA96 relA1
D(lacZYA-argF)U169] (Gibco BRL, Gaithersburg,
MD) de acuerdo con el procedimiento de Simanis (Hanahan, D. DNA
Cloning, 1985, D.M. Glover (ed), p. 109-135). Los
plásmidos pSL301 recombinantes (rpSL301) que contienen o bien el gen
BVH-3 o BVH-28 se purificaron
usando el kit de QIAgen (Chatsworth, CA) y la inserciones de ADN se
confirmaron mediante análisis de secuencia de nucleótidos (kit Taq
Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing, ABI, Foster City, CA).
rpSL301 recombinante (rpSL301) se digirió con las enzimas de
restricción BglII (AGATCT) y XhoI (CTCGAG). Los fragmentos de ADN
BglII-XhoI se purificaron usando el kit de
extracción en gel QIAquick de QIAgen (Chatsworth, CA). El vector de
expresión pET-32c (+) (Novagen, Madison, WI) que
contiene la secuencia thioredoxin-His\cdotTag se
digirió con BamHI (GGATCC) y XhoI y se extrajo en gel usando el kit
de extracción en gel QIAquick de QIAgen (Chatsworth, CA). Los
fragmentos de ADN de BglIIXhoI se ligaron al vector
BamHI-XhoI pET-32c(+) para crear la
secuencia de codificación para la proteína de fusión
tioredoxin-His\cdotTag-BVH-3
o
tioredoxin-His\cdotTag-BVH-28.
Los productos ligados se transformaron en la cepa DH5a de E.
coli [f80 lacZ DM15 endA1 recA1
hsdR17 (rK-mK+) supE44
thi-11-gyrA96 relA1
D(lacZYA-argF)U169] (Gibco BRL, Gaithersburg,
MD) de acuerdo con el procedimiento de Simanis (Hanahan, D. DNA
Cloning, 1985, D.M. Glover (ed), p. 109-135). Los
plásmidos pET-32c(+) recombinantes se purificaron
usando un kit de QIAgen (Chatsworth, CA) y las secuencias de
nucleótidos en los sitios de
thioredoxin-His\cdotTag y la inserción de ADN se
verificaron mediante la secuenciación de ADN (kit Taq Dye Deoxy
Terminador Cycle Sequencing, ABI, Foster City, CA).
Este ejemplo ilustra la clonación de los genes
de proteína de S. pneumoniae en el plásmido
pCMV-GH de CMV.
La región codificante de una proteína de S.
pneumoniae se insertó en fase cadena debajo de un gen de la
hormona de crecimiento (hGH) que estaba bajo el control de
transcripción del promotor de citomegalavirus (CMV) en el vector de
plásmido pCMV-GH (Tang et al., Nature, 1992,
356 :152). El promotor de CMV es un plásmido no funcional en
células de E. coli pero activo tras la administración del
plásmido en células eucarióticas. El vector también incorporaba el
gen de resistencia a ampicilina.
La región codificante del gen
BVH-3 (SEQ ID NO: 1) y gen BVH-28
(SEQ ID NO: 5) se obtuvieron de rpSL301 (véase el ejemplo 1) usando
las enzimas de restricción BglII (AGATCT) y XbaI (TCTAGA). Los
productos digeridos se purificaron en gel de agarosa usando el kit
de extracción en gel de agarosa QIAquick de QIAgen (Chatsworth,
CA). El vector pCMV-GH (Laboratory del Dr. Stephen
A. Johnston, Departamento de Bioquímica, Universidad de Texas,
Dallas, Texas) que contiene la hormona de crecimiento humana para
crear las proteínas de fusión se digirió con BglII y XbaI y se
purificó en gel de azarosa usando el kit de extracción en gel
QIAquick de QIAgen (Chatsworth, CA). Los fragmentos de ADN de
BglII-XbaI DNA se ligaron al vector
BglII-XbaI pCMV-GH para crear la
proteína de fusión hGH-BVH-3 o
hGH-BVH-28 bajo el control del
promotor de CMV. Los productos ligados se transformaron la cepa de
E. coli DH5a[f80 lacZ DM15 endA1
recA1 hsdR17 (rK-mK+) supE44
thi-11-gyrA96 relA1
D(lacZYA-argF)U169] (Gibco BRL, Gaithersburg,
MD) de acuerdo con el procedimiento de Simanis (Hanahan, D. DNA
Cloning, 1985, D.M. Glover (ed), p. 109-135). Los
plásmidos pCMV recombinantes se purificaron usando un kit de QIAgen
(QIAgen, Chatsworth, CA).
La región codificante del gen
BVH-11 (SEQ ID NO: 3) se amplificó mediante la PCR
(DNA Thermal Cycler GeneAmp PCR sistema 2400 Perkin Elmer, San
Jose, CA) a partir del ADN genómico del serogrupo 6 de la cepa SP64
de S. pneumoniae usando los oligos que contenías extensiones
de bases para la adición de los sitios de restricción BglII
(AGATCT) y HindIII (AAGCTT). El producto de la PCR se purificó en
gel de agarosa usando el kit de extracción en gel QIAquick de
QIAgen (Chatsworth, CA), digerido con las enzimas de restricción
(Pharmacia Canadá Inc, Baie d'Urfe, Canadá), se extrajo con
fenol:cloroformo y se precipitó con etanol. El vector
pCMV-GH (Laboratorios del Dr. Stephen A. Johnston,
Departamento de Bioquímica, Universidad de Texas, Dallas, Texas) se
digirió con BglII y HindIII y se purificó en gel de azarosa usando
el kit de extracción QIAquick de QIAgen (Chatsworth, CA). El
fragmento de ADN BglII-HindIII se ligó la vector
BglII-HindIII pCMVGH para crear la proteína de
fusión hGH-BVH-11 bajo el control
del promotor de CMV. Los productos ligados se transformaron en la
cepa de E. coli DH5a[f80 lacZ DM15
endA1 recA1 hsdR17 (rK-mK+)
supE44 thi-11-gyrA96 relA1 D
(lacZYA-argF)U169] (Gibco BRL, Gaithersburg,
MD) de acuerdo con el procedimiento de Simanis (Hanahan, D. DNA
Cloning, 1985, D.M. Glover (ed), p. 109-135). El
plásmido de pCMV recombinante se purificó usando un kit de QIAgen
(Chatsworth, CA) y la secuencia de nucleótidos de la inserción de
ADN se verificó mediante secuenciación de ADN.
Este ejemplo ilustra el uso de ADN para inducir
una respuesta inmune a los antígenos de S. pneumoniae.
Un grupo de 8 hembras de ratones BALB/c (Charles
River, St-Constant, Quebec, Canadá) se inmunizaron
mediante inyección intramuscular de 50 \mul tres veces a
intervalos de dos o tres semanas con 100 \mug de
pCMV-GH recombinante que codifica el gen
BVH-3, BVH-11 o el gen
BVH-28 en presencia de 50 \mug del factor
estimulante de la colonia de
granulocitos-macrófagos (GM-CSF)-
que expresa el plásmido
pCMV-GH-GM-CSF
(Laboratory of Dr. Stephen A. Johnston, Departamento de Bioquímica,
Universidad de Texas, Dallas, Texas). Como control, se inyectó a un
grupo de ratones 100 \mug de pCMV-GH en presencia
de 50 \mug de
pCMV-GH-GM-CSF. Se
recogieron muestras de sangre del orbital antes de cada
inmunización y siete días después de la tercera inyección y se
determinaron las respuestas de anticuerpo en suero mediante ELISA
usando la proteína de fusión
tioredoxin-His\cdotTag-S. pneumoniae como
antígeno de recubrimiento. La inmunización de ADN con plásmido
recombinante pCMV-GH que codifica la proteína de
S. pneumoniae BVH-3, BVH-11 o
BVH-28 indujo un anticuerpo reactivo contra la
proteína recombinante respectiva. Los títulos de anticuerpos
recíprocos, definidos como la mayor dilución en suero a la que los
valores de absorbancia eran 0,1 por encima de los valores de fondo,
eran superiores a 4x10^{3}.
Este ejemplo ilustra la producción y
purificación de las proteínas recombinantes de S.
pneumoniae.
Los plásmidos recombinantes de pET que contienen
el gen BVH-3, BVH-11 o
BVH-28 que corresponde a la SEQ ID NO: 1, SEQ ID
NO: 3 o SEQ ID NO: 5 respectivamente se transformaron mediante
electroporación (aparato Gene Pulser II, BIO-RAD
Labs, Mississauga, Canadá) en la cepa de E. coli AD494 (DE3)
(Dara-leu7697 DlacX74 DphoA PvuII phoR
DmalF3 F'[lac+(lacIq) pro] trxB::Kan)
(Novagen, Madison, WI). En esta cepa de E. coli, el promotor
de T7 que controla la expresión de la proteína de fusión se reconoce
específicamente por la ARN polimerasa de T7 (presente en el profago
1DE3) cuyo gen está bajo el control del promotor lac que se puede
inducir por
isopropil-\beta-d-tio-galactopiranósido
(IPTG).
El AD494(DE3)/rpET transformante se
desarrolló a 37ºC con agitación a 250 rpm en caldo LB (peptona 10
g/l, extracto de levadura 5 g/l, NaCl 10 g/l) que contiene 100
\mug de ampicilina (Sigma-Aldrich Canadá Ltd.,
Oakville, Canadá) por ml hasta que A_{600} alcanzó un valor de
0,6. Con el fin de inducir la producción de la proteína de fusión
tioredoxin-His\cdotTag-BVH-3,
tioredoxin-His\cdotTag-BVH-11
o
tioredoxin-His\cdotTag-BVH-28,
las células se incubaron durante 2 horas adicionales en presencia
de IPTG a una concentración final de 1 mM. Las células inducidas de
100 ml de cultivo se sedimentaron mediante centrifugación y se
congelaron a -70ºC.
La purificación de las proteínas de fusión de la
fracción citoplásmica de AD494(DE3)/rpET Inducida por IPTG
se realizó mediante cromatografía social basándose en las
propiedades de la secuencia His\cdotTag (6 restos de histidina
consecutivos) para unirse a cationes divalentes (Ni2+) inmovilizados
sobre la resina de quelación de metales His-Bind.
En resumen, las células sedimentadas obtenidas a partir de un
cultivo de 100 ml inducido con IPTG se volvieron a suspender en
solución tamponada con fosfato (PBS):500 mM NaCl pH 7,1, se
sonicaron y se centrifugaron a 20.000 X g durante 20 min para
eliminar los desechos. Se filtró el sobrenadante (membrana de
tamaño de poro 0,22 \mum) y se depositó en 1 ml de columna
quelante empaquetada previamente lista para uso HiTrap® (Pharmacia
Biotech, Baie d'Urfé, Canadá). La proteína de fusión
tioredoxin-His\cdotTag-S. pneumoniae se
eluyó con 1 M imidazol-500 mM
NaCl-PBS pH 7,1. la eliminación de la sal e imidazol
de la muestra se realizó mediante diálisis contra PBS a 4ºC. Las
cantidades de la proteína de fusión obtenidas de la fracción soluble
de E. coli se estimó mediante MicroBCA (Pierce, Rockford,
Illinois).
Este ejemplo ilustra la protección de ratones
contra la infección neumocócica fatal mediante inmunización.
Grupos de 8 hembras de ratones BALB/c (Charles
River) se inmunizaro por vía subcutánea tres veces a intervalos de
tres semanas con o 25 \mug de proteína de fusión
thioredoxin-His\cdotTag-BVH-3
purificada por afinidad en presencia de 15 \mug de adyuvante
QuilA (Cedarlane Laboratories Ltd, Hornby, Canadá) o, como control,
con adyuvante QuilA solo en PBS. Se recogieron muestras de sangre
del seno orbital el día 1, 22 y 43 antes de cada inmunización y
siete días (día 50) después de la tercera inyección. Una semana
después los ratones se expusieron con aproximadamente 10^{6} UFC
del tipo 3 la cepa de S. pneumoniae WU2. Muestras del inóculo
de de exposición de S. pneumoniae se sembraron sobre placas
de agar de chocolate para determinar la UFC y para verificar la
dosis de exposición. Se registraron las muertes durante un período
de 14 días y el día 14 después de la exposición, los ratones
supervivientes se sacrificaron y se ensayaron las muestras de sangre
para determinar la presencia de organismos de S. pneumoniae.
Los datos de supervivencia se muestran en la tabla 1.
Se analizaron sueros antes de la exposición para
determinar la presencia de anticuerpos reactivos con S.
pneumoniae mediante inmunoensayos convencionales. Los análisis
ELISA y de inmunotransferencia indicaron que la inmunización con la
proteína recombinante de S. pneumoniae en E. coli
indujo anticuerpos reactivos con tanto la proteína recombinante
como nativa neumocócica.
Todos los ratones inmunizados con la proteína
recombinante BVH-3 sobrevivieron a la infección
mientras que ninguno de los ratones control a los que se les
proporcionó adyuvante sobrevivió. Existe una diferencia
significativa en la supervivencia entre los dos grupos de ratones
(P< 0,0001, ensayo de intervalo log para un análisis no
paramétrico de curvas de supervivencia; P = 0,0002, ensayo exacto de
Fisher'). Todos los hemocultivos de los ratones supervivientes
fueron negativos el día 14 después de la exposición.
Este ejemplo describe la clonación de los genes
BVH-3 y BVH-11 de una diversidad de
cepas de S. pneumoniae y la conservación molecular de estos
genes.
El análisis molecular de ADN cromosómico de
diversos aislamientos de S. pneumoniae con sondas de ADN que
se expanden sobre diferentes regiones de BVH-3 o
BVH-11 revelaron la presencia de una copia del gen
de BVH-3 dos copias del gen de
BVH-11. Las dos copias del gen
BVH-11 no eran idénticas y los genes se designaron
de manera arbitraria BVH-11 (SEQ ID NO: 12; ORF en
los nucleótidos 45 a 2567) y
BVH-11-2 (SEQ ID NO: 13; ORF en los
nucleótidos 114 a 2630).
Los primeros aminoácidos de las regiones que
codifican BVH-3 y BVH-11 tienen las
características de las secuencias guía también conocidas como
secuencias señal. El sitio de escisión de la peptidasa de señal de
consenso L-X-X-C se
los sitios de modificación/procesamiento estaba presente en las
secuencias. Las proteínas maduras BVH-3,
BVH-11 y BVH-11-2 de
S. pneumoniae SP64 tienen 1019, 821 y 819 aminoácidos,
respectivamente. Las regiones de los genes de S. pneumoniae
que codifican BVH-3 maduro, llamado
BVH-3M, (nucleótidos 1837-4896; SEQ.
ID. NO: 11), BVH-11M (nucleótidos
102-2567; SEQ. ID. NO: 12) y
BVH-11-2M (nucleótidos
171-2630; SEQ. ID. NO: 13), se amplificaron
mediante PCR (DNA Thermal Cycler GeneAmp PCR sistema 2400 Perkin
Elmer, San José, CA) a partir del ADN genómico de 6 ó 7 cepas de
S. pneumoniae. Los aislamientos clínicos del serogrupo 6 de
S. pneumoniae SP64 y serogrupo 9 SP63 se proporcionaron por
los laboratorios de la salud pública de3 Québec,
Sainte-Anne-de-Bellevue;
serotipo 4 cepa JNR.7/87 fue proporcionada por Andrew Camilli, Tufts
Universidad de la Escuela de Medicina, Boston; cepa Rx1, un
derivado no encapsulado de la cepa D39 de tipo 2 y las cepas de
tipo 3 A66 y WU2 se proporcionaron por David E. Briles de la
Universidad de Alabama, Birmingham y el aislamiento clínico de
P4241 3 se proporcionó por el centro de investigación de infecciones
del centro hospitalario de la universidad de Laval,
Sainte-Foy. Los conjuntos de cebadores de
OCRR479-OCRR480; HAMJ160-OCRR488 y
HAMJ160-HAMJ186, que contenían extensiones de bases
para la adición de los sitios de restricción se usaron para la
amplificación del gen BVH-3, BVH-11
y BVH-11-2, respectivamente, con la
excepción del gen BVH-11 de la cepa SP64 que se
amplificó usando el conjunto de cebadores constituidos por HAMJ487 y
OCRR488. Las secuencias de cebadores se enumeran a continuación
(Tabla 2). Los productos de la PCR se pueden purificar en gel de
azarosa usando un kit de extracción en gel QIAquick de QIAgen
(Chatsworth, CA) y se digirieron mediante BglII-XbaI
o BglII-HindIII (Pharmacia Canadá Inc, Baie d'Urfé,
Canadá). Las digestiones se limpiaron usando un kit de purificación
de PCR QIAquick de QIAgen (Chatsworth, CA). Los productos de la PCR
se ligaron al vector de pSL301 BglII-XbaI o
BglII-HindIII. Los productos ligados se
transformaron en la cepa de E. coli strain
DH5\alpha[\Phi80 lacZ \DeltaM15 endA1
recA1 hsdR17 (^{r}K^{-m}K^{+}) supE44
thi-1\lambda^{-} gyrA96 relA1 \Delta
(lacZYA-argF)U169] (Gibco BRL, Gaithersburg,
MD) de acuerdo con el procedimiento de Simanis (Hanahan, D. DNA
Cloning, 1985, D.M. Glover (ed), p. 109-135). Los
plásmidos recombinantes pSL301 (rpSL301) que contiene
BVH-3, BVH-11 o
BVH11-2 se purificaron usando un kit de QIAgen
(Chatsworth, CA) y se secuenciaron las inserciones de ADN (kit Taq
Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing, ABI, Foster City, CA). Las
figuras 11 y 12 muestran las secuencias de consenso establecidas a
partir de las secuencias de aminoácidos deducidas
BVH-3, y BVH-11, respectivamente. La
comparación de las secuencias de proteínas de BVH-3
reveló un 99 a 100% de identidad de secuencias con la excepción que
BVH-3 del serogrupo 9 de la cepa SP63 (SEQ. ID. NO:
15 y SEQ. ID. NO: 16) carecía de un tramo de 177 aminoácidos
correspondiente a los residuos 244 a 420 sobre la secuencia de
proteínas de BVH-3' de S. pneumoniae SP64. El
análisis de las secuencias de las cepas adicionales del serogrupo 9
reveló que la molécula BVH-3 tiene la misma
supresión en 3 de 4 cepas sugiriendo de esta manera que las 3 cepas
son miembros de un clon del serogrupo 9 de S. pneumoniae.
La comparación de 13 secuencias de nucleótidos
de BVH-11 obtenidas de 7 cepas de S.
pneumoniae, reveló que las secuencias de nucleótidos son muy
similares. El análisis por ordenador (MacVector, Clustal W 1.4) que
usa alineación múltiple de las secuencias de proteínas de
BVH-11 predichas reveló que estas secuencias eran
75% idénticas y 82% homólogas en una longitud de 834 aminoácidos. La
alineación de emparejamiento reveló un 80 a 100% de identidad (La
figura 13). Las secuencias mostraron gran similitud en la
organización global. La variabilidad en la secuencia principal de de
estas proteínas casi está restringida a los últimos 125 aminoácidos
en la parte C-terminal de las proteínas. Esta
región constituye un dominio. El examen estrecho de este dominio
reveló dos grupos de secuencias. Las primeras 9 secuencias de la
figura 13 pertenecen a un grupo mientras las últimas 4 secuencias
pertenecen a otro grupo. Un 39% de valor de identidad se obtiene
cuando se comparan las secuencias de dominio de las 13 proteínas
(MacVector, Clustal W 1.4). El valor de identidad aumentó a más de
92% cuando se comparan las secuencias que pertenecen al mismo
grupo.
Este ejemplo ilustra la homología de porciones
de los genes de BVH-3 y BVH-11.
El análisis molecular con sondas de ADN
derivadas de los genes BVH-3 y
BVH-11 indicó que BVH-3 y
BVH-11 estaban relacionados. En estudios de
hibridación de transferencia de puntos, la sonda de ADN que
consistía o bien, de BVH-3 o
BVH-11, la secuencia de genes BVH-3
y BVH-11 se hibridaba a tanto los genes
BVH-3 como BVH-11 indicando que los
genes BVH-3 y BVH-11 compartían
secuencias homólogas. La comparación de secuencias reveló que los
ORF y las proteínas eran 43 y 33% idénticas, respectivamente. El
examen más estrecho reveló que la región correspondiente a los
aminoácidos 1 a 225 en BVH-3 y 1 a 228 en
BVH-11 eran 73 y 75% idénticas y el nivel de
proteína, respectivamente. Por el contrario, las regiones 3'
correspondientes a los aminoácidos 226 a 1039 de
BVH-3 y aminoácidos 229-840 de
BVH-11 eran solamente 34 y 22% idénticas a nivel de
ADN y de proteína, respectivamente. De este modo los extremos 5' de
los genes BVH-3 y BVH-11 parecen
contener secuencias altamente conservadas mientras que las partes
restantes de los genes son altamente divergentes. Estos resultados
sugieren que BVH-3 y BVH-11
pudieran compartir funciones similares mediadas por las secuencias
presentes en la región conservada mientras que las funciones
específicas de BVH-3- y BVH-11-
podrían estar mediadas por las secuencias en la región
divergente.
Este ejemplo la clonación de los genes truncados
de BVH-3, BVH-11 y
BVH-11-2 mediante la reacción en
cadena de la polimerasa (PCR) y la expresión de las moléculas
truncadas de BVH-3 y BVH-11.
Se amplificaron los fragmentos génicos mediante
la PCR usando pares de oligonucleótidos modificados por ingeniaría
genética para amplificar los fragmentos que se extienden sobre el
gen BVH-3 (SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 11),
BVH-11 (SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 12) o
BVH-11-2 (SEQ ID NO: 13) de la cepa
SP64 de S. pneumoniae. Cada uno de los cebadores tenía un
sitio de endonucleasa de restricción en el extremo 5', permitiendo
por lo tanto la clonación direccional en fase del producto
amplificado en el vector del plásmido digerido (Tablas 2 y 3). Los
productos amplificados por PCR se digirieron con endonucleasas de
restricción y se ligaron a o bien el plásmido linealizado pSL301
(véase el ejemplo 1), pCMV-GH (véase el ejemplo 2) o
pET (Novagen, Madison, WI) vector de expresión digerido de la misma
manera con enzimas que producen extremos cohesivos compatibles. Los
plásmidos pSL301 recombinante y pCMV-GH recombinante
se digirieron con enzimas de restricción para la clonación en fase
en el
vector de expresión de pET. Primero los clones se estabilizaron en E. coli DH5\alpha antes de la introducción en E. coli.
vector de expresión de pET. Primero los clones se estabilizaron en E. coli DH5\alpha antes de la introducción en E. coli.
BL21(\lambdaDE3) o AD494 (\lambdaDE3)
para la expresión de las moléculas de BVH-3 o
BVH-11. Cada una de las construcciones de plásmidos
resultantes se confirmó mediante análisis de secuencias de
nucleótidos. Las proteínas recombinantes se expresaron como
fusiones N-terminal con la tioredoxin y
His-tag o como fusiones C-terminal
con una His-tag. Las proteínas recombinantes
expresados se purificaron a partir de las fracciones sobrenadantes
obtenidas a partir de centrifugación de cultivos de E. coli
inducidos por IPTG -usando una resina de quelación de metal
His-Bind (QIAgen, Chatsworth, CA). Los productos
génicos generados se enumeran en la tabla 3. Los productos génicos
correspondientes a la región N-terminal que incluye
la secuencia señal se denominan proteínas lapidadas o lipoproteínas
(L-proteínas). Los productos génicos
correspondientes a la región N-terminal que carece
de la secuencia señal se identifican como proteína sin secuencia
señal (w/o ss).
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Este ejemplo describe el aislamiento de
anticuerpos monoclonales (Mabs) y el uso de los Mabs para
caracterizar los epítopes de proteínas de BVH-3,
BVH-11 y
BVH-11-2.
Ratones hembra BALB/c (Charles River) se
inmunizaron por vía subcutánea con productos de los genes
BVH-3, BVH-11 o
BVH-11-2 de S. pneumoniae
cepa SP64 en presencia de 15 \mug de adyuvante QuilA (Laboratorios
Cedarlane Ltd, Hornby, Canadá). Un conjunto de ratones (experimento
de fusión 1) se inmunizaron el día 1 y 14 con 25 \mug de proteína
de fusión
thioredoxin-His\cdotTag-BVH-3M
purificada por afinidad. Se inmunizó un segundo grupo de ratones
(experimento de fusión 2) tres veces a intervalos de tres semanas
con 25 \mug de
thioredoxin-His\cdotTag-BVH-11M
purificada por afinidad. Un tercer grupo de ratones (experimento de
fusión 3) se inmunizó el día 1 y día 15 con 25 \mug de proteína
de fusión
thioredoxin-His\cdotTag-BVH-11-2M
purificada por afinidad. Un cuarto grupo de ratones (experimento de
fusión 4) se inmunizó el día 1 con 25 \mug de proteína de fusión
thioredoxin-His\cdotBVH-11B
purificada por afinidad y se volvieron a inmunizar mediante
inyección intravenosa el día 16 y el día 37 con
BVH-11B recombinante en PBS. Tres a cuatro días
antes de de la fusión, a los ratones se les inyectó por vía
intravenosa con 25 \mug del antígeno respectivo suspendido en PBS
soklo. Se produjeron hibridomas mediante la fusión de células de
bazo con células de mieloma SP2/0 no secretoras como se ha descrito
previamente por J. Hamel et al. [J. Med. Microbiol., 23, p
163-170 (1987)]. Los sobrenadantes de cultivo de los
hibridomas se seleccionaron inicialmente mediante inmunoensayo
ligado a enzimas de acuerdo con el procedimiento descrito por Hamel
et al. (Supra) usando placas revestidas con
preparaciones de proteínas recombinantes purificadas o suspensiones
de células de S. pneumoniae eliminadas por calor. Los
hibridomas positivos seleccionados en la base de reactividad de
ELISA con una diversidad de de antígenos se clonaron después
mediante diluciones limitantes, se expandieron y se congelaron.
Se ensayaron los hibridomas mediante ELISA o
inmunotransferencia de Western contra los productos génicos de
BVH-3 y BVH-11 con el fin de
caracterizar los epítopes reconocidos por los Mabs.
BVH-3 y BVH-11 compartían epítopes
comunes con 6 Mabs (H3-1-F9,
H3-1-D4,
H3-1-H12,
H11-1-E7,
H11-1-H10 y
H11-1.1-G11) que muestran
reactividades con ambas proteínas (Tabla 4). Las moléculas de
BVH-11 y BVH-11-2 de
S. pneumoniae SP64 compartían epítopes comunes sobre
BVH-3 con los Mabs (3A1, 13C11, 10H10, 1D8, 10G9,
10A2, 3E8, 10D7, 2H7 y 6H7) reactivos con tanto, las proteínas
recombinantes BVH-11 como
BVH-11-2, (Tabla 5).
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Los resultados obtenidos a partir de los
estudios de los Mabs (Tabla 4 y Tabla 5) están de acuerdo con las
secuencias de proteínas derivadas de las secuencias génicas
respectivas. De hecho los Mabs de reacción cruzada con las
moléculas de BVH-3 y BVH-11 proteína
de BVH-3C reconocida correspondiente a la región
conservada, y los Mabs específicos de BVH-11 y
BVH-11-2 eran reactivos con los
epítopes localizados en las partes variables de estas moléculas.
BVH-3 y BVH-11, y
BVH-11 y BVH-11-2 se
pueden distinguir de su reactividad con Mabs.
Este ejemplo ilustra la expresión simultánea de
los productos génicos de BVH-3 y
BVH-11 por S. pneumoniae.
Se usó una técnica de transferencia de Western
para investigar si los genes de BVH-3 y
BVH-11 se expresaron en S. pneumoniae. S.
pneumoniae cepa SP64 y SP63 se hicieron crecer durante toda una
noche a 37ºC en 5% de CO_{2} sobre placas de agar clorato, las
bacterias se suspendieron en PBS y se eliminaron por calor a 56ºC
durante 20 min. Para la preparación de antígenos, las suspensiones
de S. pneumoniae se trataron con tampón de muestra que
contenía SDS y 2-mercaptoetanol durante 5 min a
100ºC. Se resolvieron antígenos de proteínas neumocócicas mediante
electroforesis de SDS-PAGE de acuerdo con el
procedimiento de Laemmli [Nature, 227, p. 680-685
(1970)]. Después de SDS-PAGE, las proteínas se
transfirieron de manera electroforética a partir del gel a papel de
nitrocelulosa mediante el procedimiento de Towbin [Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 76, p. 4350-4354 (1979)] y se probó con
antisuero de ratón o anticuerpos monoclonales. La detección de
antígenos reactivos con los anticuerpos se realizó mediante
inmunoensayo de enzimas usando inmunoglobulinas
ani-ratón conjugadas y un sustrato de color. Cuando
el antisuero inducido al BVH-3 recombinante se
ensayó contra los antígenos S. pneumoniae SP64, se
detectaron dos bandas que tenían pesos moleculares aparentes de 127
kDa y 99 kDa. Las bandas que tenían los mismos pesos moleculares
aparentes también se detectaron cuando los Mabs
H3-1-F9,
H3-1-D4,
H3-1-H12,
H11-1-E7,
H11-1-H10 y
H11-1.1-G11 se usaron de manera
individual como sondas inmunológicas. Por el contrario los Mabs
específicos para la molécula detectada de BVH-3
solamente la banda de 127 kDa y los Mabs específicos para
BVH-11 detectaron la banda de 99 kDa confirmando así
solamente de esta manera la identidad de las bandas de 127 y 99 kDa
como BVH-3 y BVH-11,
respectivamente. Estos estudios proporcionaron la evidencia que las
proteínas BVH-3 y BVH-11 están
simultáneamente presentes en S. pneumoniae. Además los
resultados son consistentes con las observaciones previas de los
investigadores en que BVH-3 y BVH-11
poseen epítopes que son comunes para tanto las proteínas como los
epítopes que son exclusivos a cualquier otra proteína.
En S. pneumoniae SP64,
BVH-3, BVH-11 y
BVH-11-2 maduras son proteínas de
1019, 821 y 819 aminoácidos con peso molecular de predicho de 112,5
kDa, 92,4 kDa, y 91,7 kDa, respectivamente. Aunque existe una
discrepancia entre el peso molecular predicho de la secuencia y el
peso molecular calculado en SDS-PAGE,
BVH-3 se puede distinguir entre
BVH-11 mediante se peso molecular mayor. Además, las
moléculas BVH-3 de S. pneumoniae cepa SP63
tienen un peso molecular aparente de 112 kDa en
SDS-PAGE comparado con 127 kDa para
BVH-3 de la cepa SP64. Estos datos son consistentes
con la supresión de un tramo de 177 restos de aminoácidos en
BVH-3 de S. pneumoniae cepa SP63.
Este ejemplo describe la protección conferida en
la infección experimental de ratones vacunados con productos
génicos recombinantes de BVH-3 o
BVH-11.
Grupos de 7 u 8 ratones hembra BALB/c (Charles
River) se inmunizaron por vía subcutánea tres veces a intervalos de
tres semanas con o bien proteína de fusión
thioredoxin-His\cdotTag-BVH-3M
purificada por afinidad, proteína de fusión
thioredoxin-His\cdotTag-BVH-11M
purificada por afinidad o, como control, con adyuvante Qui1A solo
en PBS. Doce a 14 días después de la tercera inmunización, los
ratones se expusieron por vía intravenosa con la cepa WU2 de S.
pneumoniae o por vía intranasal con la cepa P4241. Las muestras
del inóculo de desafío de S. pneumoniae se sembraron sobre
placas de agar chocolate para determinar las UFC y para verificar la
dosis de desafío. La dosis de desafío era aproximadamente 10^{6}
UFC. Se registraron las muertes durante un período de 14 días y el
día 14 después de la exposición, los ratones supervivientes se
sacrificaron y se ensayaron las muestras de sangre para determinar
la presencia de organismos de S. pneumoniae. Los datos de
supervivencia se muestran en las Tablas 6 y 7.
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Todos los ratones inmunizados con proteína
BVH-3M o BVH-11M recombinante
sobrevivieron a la infección con WU2 mientras ninguno de los
ratones de control a los que se les proporcionó adyuvante solo
sobrevivieron. Todos los ratones excepto uno inmunizados con
proteína BVH-3M o BVH-11M
recombinante sobrevivieron a la infección con P4241 mientras
solamente uno de los ratones de control a los que se proporcionó
adyuvante solo sobrevivió. Todos los hemocultivos de los ratones
que sobrevivieron eran negativos el día 14 después de la exposición.
Estos resultados claramente indican que tanto
BVH-3M como BVH-11M, inducen
respuestas inmunes anti-neumocócicas protectoras en
ratones. El hecho que estas proteínas están altamente conservadas
entre aislamientos de S. pneumoniae enfatiza el potencial de
BVH-3 y BVH-11 como candidatos de
vacunas universales. De hecho, las proteínas BVH-3
y BVH-11 del serogrupo 6 de S. pneumoniae
cepa SP64 inducían protección contra infecciones neumocócicas con
cepas de diferentes serotipos capsulares.
\newpage
De manera ideal, una vacuna que podría proteger
contra enfermedad neumocócica, podría proteger contra meningitis,
otitis media, bacteremia y neumonía. BVH-3 y
BVH-11 eran protectoras contra modelos de infección
sistémicos y de neumonía letal sugiriendo de esta manera que, en
seres humanos, las vacunas basadas en proteína de
BVH-3- y BVH11- podrían reducir la incidencia de un
amplio espectro de enfermedades provocadas por virtualmente todos
los S. pneumoniae independientemente del serotipo
capsular.
Los datos de las tablas 6 y 7 demuestran
claramente que BVH-3 y BVH-11 eran,
ambas, moléculas que inducen protección de S. pneumoniae.
Sin embargo, no se conocía, si la protección se puede mediar
mediante secuencias específicas que no se compartían sobre las
moléculas de BVH-3 y BVH-11. Grupos
de ratones hembras BALB/c (Charles River) se inmunizaron por vía
subcutánea tres veces a intervalos de tres semanas con o bien
proteína de fusión
thioredoxin-His\cdotTag-BVH-3AD,
-BVH-3B-BVH-3C
purificada por afinidad en presencia de15 \mug de adyuvante QuilA
(Cedarlane Laboratories Ltd, Hornby, Canadá). Se inmunizaron ratones
de control con adyuvante QuilA solo en PBS o proteína de fusión
thioredoxin-His\cdotTag o
thioredoxin-His\cdotTagf
(His-Thio) purificada por afinidad en presencia de
Qui1A.
Para determinar la capacidad protectora de un
conjunto de proteínas truncadas, denominadas NEW4, NEW5, NEW6,
NEW7, NEW8, NEW9, NEW10, NEW11, NEW14 y BVH-11B,
grupos de ratones hembra BALB/c (Charles River) se inmunizaron por
vía subcutánea dos veces a intervalos de tres semanas con 25 \mug
de cualquier proteína de fusión
His\cdotTag-purificada por afinidad en presencia
de 15 \mug adyuvante QuilA. Diez a 14 días después de la última
inmunización, los ratones se expusieron con S. pneumoniae
virulento. Los resultados de los investigadores indican que,
BVH-3B, una molécula de BVH-3
truncada de los aminoácidos 512-1039, inducían
protección contra las cepas WU2 y P4241 virulentas para los
ratones. De manera similar, moléculas BVH-11B, NEW4
y NEW5, tres moléculas de BVH-11 truncadas que
constan de los aminoácidos 354-840, aminoácidos
286-840 y aminoácidos 286-713,
respectivamente, inducían protección contra la exposición
intravenosa experimental con WU2 y exposición intranasal con P4241.
Además, la vacunación con NEW10 y NEW14, que constan de los
aminoácidos 272-838 y aminoácidos
227-699 de la molécula de
BVH-11-2 también dio como resultado
protección contra la muerte con las cepas neumocócicas. Estos
resultados indican que la región que comprende 428 aminoácidos que
se extiende desde los aminoácidos 286-713 y
aminoácidos 272-699 sobre S. pneumoniae SP64
BVH-11 y BVH-11-2
secuencias de proteínas, respectivamente, contiene epítopes
protectores. Esta región está altamente conservada con una identidad
global del 91% y 94% de homología entre trece secuencias de
proteína de BVH-11.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
\newpage
Este ejemplo describió la clonación y expresión
de un gen quimérico que codifica un polipéptido quimérico que
corresponde con la región carboxi terminal de BVH-3
en fusión en el extremo C' de la región carboxi terminal de
BVH-11 y la protección aditiva observada después de
la vacunación con un polipéptido quimérico.
Está claro a partir de los estudios descritos
anteriormente que BVH-3 y BVH-11 son
serológicamente moléculas distintas presentes de manera simultánea
sobre S. pneumoniae. Los resultados de estudios inmunológicos
de ratones indican que ambas proteínas son buenos candidatos de
vacunas. Estas proteínas tienen el potencial de proporcionar
protección contra todos los neumococos, independientemente del
serotipo. Incluso aunque las dos proteínas comparten epítopes y
secuencias, tienen características diferentes y pueden tener
diferentes funciones biológicas. De este modo, la inmunización
contra las dos proteínas puede proporcionar un nivel de protección
mayor que la impartida por cada uno de ellos individualmente. Para
examinar esto, varias avenidas donde BVH-3 de
longitud completa o truncada y BVH-11 se administran
en combinación o conjuntamente se pueden explorar. En el presente
documento los inventores describen la modificación por ingeniería
genética de un gen de fusión
BVH-3-BVH-11 y
proteína, denominado NEW12 (SEQ ID NO:76 y SEQ ID NO:58,
respectivamente), y el uso potencial de la proteína NEW12 como una
vacuna.
Los fragmentos génicos de BVH-3
y BVH-11 que corresponden al extremo de los genes se
amplificaron mediante la PCR usando pares de oligonucleótidos
modificados por ingeniería genética para amplificar los fragmentos
que se extienden sobre los nucleótidos 1414 a 3117 (SEQ ID NO: 1) y
los nucleótidos 1060 a 2520 (SEQ ID NO: 3) de los genes de
BVH-3 y BVH-11 de S.
pneumoniae cepa SP64, respectivamente. Los cebadores usados,
HAMJ278 y HAMJ279; HAMJ282 y HAMJ283 tenían un sitio de
endonucleasa de restricción en el extremo 5', permitiendo por lo
tanto la clonación direccional en fase del producto amplificado en
el vector de plásmido pET21b(+) digerido (Tabla 2). Los productos
amplificados por la PCR se digirieron por endonucleasas de
restricción y se ligaron al vector pET21b(+) de plásmido
linealizado digerido de manera similar. Las construcciones de
plásmido resultantes se confirmaron mediante análisis de secuencia
de nucleótidos. El plásmido pET21b(+) recombinante que contiene el
producto NdeI-HindIII BVH-3 PCR se
linealizó mediante digestión con las enzimas de restricción HindIII
y NotI para la clonación en fase del fragmento de ADN
HindIII-NotI obtenido a partir del vector pET21(+)
recombinante que contiene el fragmento génico de
BVH-11. Se estabilizaron primero los clones en E.
coli DH5\alpha antes de la introducción en E. coli
BL21(\lambdaDE3) para la expresión de una molécula de
proteína neumocócica quimérica. El polipéptido quimérico
recombinante, denominado NEW 12, se expresó como fusión
C-terminal con una His-tag. La
proteína recombinante expresada NEW 12 se purificó a partir de las
fracciones sobrenadantes obtenidas a partir de la centrifugación se
cultivos de E. coli inducidos por IPTG usando una resina de
quelación de metales His-Bind (QIAgen, Chatsworth,
CA).
De acuerdo con el mismo procedimiento descrito
anteriormente, es posible construir otros polipéptidos quiméricos,
como resultado de la expresión simultánea de New 1 y New 4, New 1 y
New 5, New 1 y New 10, o New 1 y New 14. La construcción puede ser
con New 1 cadena arriba o cadena abajo de New 4, New 5, New 10,
BVH-11B o New 14. También es posible construir
otros polipéptidos quiméricos como resultado de de una expresión
simultánea de más de dos fragmentos de cualesquiera de los genes de
BVH-3, BVH-11 o
BVH-11-2.
Grupos de 8 ratones hembra BALB/c (Charles
River) se inmunizaron por vía subcutánea dos veces a intervalos de
tres semanas con 25 \mug de proteína de fusión
His\cdotTag-NEW1, BVH-11B o NEW12
purificada por afinidad en presencia de 15 \mug de adyuvante
QuilA. Diez a 14 días después de la última inmunización, los
ratones se expusieron con S. pneumoniae virulento. Como se ha
demostrado anteriormente, las moléculas de NEW1 y
BVH-11B que comprenden los aminoácidos 472 a 1039 de
la proteína de BVH-3 y los aminoácidos
354-840 de la proteína BVH-11,
respectivamente, corresponden a las partes de las proteínas capaces
de inducir una respuesta inmune protectora. Para determinar si un
polipéptido quimérico mejorarían de manera significativa la
protección comparado con los observados para los homólogos
individuales, la dosis de desafío se ajustó de una manera que la
protección no se esperaba con las moléculas de NEW1 y
BVH-11B. De manera interesante, la proteína
quimérica NEW12, indujo protección contra las cepas WU2 y P4241
virulentas para los ratones. Siete de 8 ratones inmunizados con
NEW12 estaban todavía vivos después de 10 de la exposición mientras
28 de 32 ratones inmunizados con NEW1, BVH-11B,
BVH-3M o adyuvante solo murieron 5 días después de
la exposición. De este modo, la vacunación de ratones con NEW12
proporcionó el mayor grado de protección contra la exposición con
WU2. Estos resultados indican que la inmunización con un
polipéptido quimérico y posiblemente una combinación de los
productos génicos BVH-3 y BVH-11
pueden proporcionar protección adicional a la obtenida mediante la
administración de antígenos BVH-3 o
BVH-11 solos.
Este ejemplo ilustra la identificación de
secuencias relacionadas con BVH-3 y
BVH-11 en las especies de Streptococcus diferentes
de S. pneumoniae.
Se ha mostrado previamente que
BVH-3, BVH-11 y
BVH-11-2 son una familia de las
proteínas relacionadas que comparten secuencias comunes. Las
investigaciones de homología se realizaron con la secuencia de
nucleótidos de la región conservada de estos genes y se comparan
con las secuencias del GenBank y EMBL usando FASTA. La homología
más significativa se observó con un gen de 2.469-kb
que codifica una proteína calculada de 92-kDa (SEQ
ID NO: 81) de función desconocida en S. agalactiae también
llamado grupo B de streptococcus o GBS. El gen se denominó
BVH-71. Una proteína que demuestra un 99,2% de
identidad y 99.5% de similitud con la de GBS también se identificó
en S. pyogenes también llamado grupo A de Streptococcus o GAS
(SEQ ID NO: 83). La región 5' de las secuencias
BVH-71 (SEQ ID NO: 80 y SEQ ID NO: 82), que se
extienden sobre los nucleótidos 1 a 717, demostró un 58 y 60% de
identidad con las regiones conservadas de los genes de
BVH-3 (nucleótidos 1 a 675) y
BVH-11 (nucleótidos 1 a 684) respectivamente. Los
primeros 239 aminoácidos de las secuencias traducidas de los marcos
abiertos de lectura de GBS y GAS BVH-71 son un 51 y
54% idénticos a 225 y 228 aminoácidos de BVH-3 y
BVH-11, respectivamente. Además de las similitudes
estructurales, las proteínas de estreptococos BVH-3,
BVH-11 y BVH-71 también comparten
epítopes antigénicos. Se reveló una banda de 97-kDa
en las transferencias de Western de GAS o GBS cuyas células, que
usan Mab H11-1.1-G11 reactivos con
las regiones conservadas de BVH-3 y
BVH-11. De manera similar, las proteínas
recombinantes de BVH-71 GAS y GBS se detectaron en
análisis de inmunotransferencia de Western. Estos resultados
indican que las proteínas de BVH-71,
BVH-3 y BVH-11 podrían compartir
funciones similares. Los resultados de los investigadores también
sugieren que las proteínas de BVH-71 se pueden usar
como componentes de vacunas de proteínas de vacunas
anti-GAS o anti-GBS.
Claims (24)
1. Un polinucleótido aislado que codifica un
polipéptido que tiene al menos 95% de identidad a una cualquiera de
las SEQ ID Números: 2, 8, 10, 16, 55, 64-66 ó 78 en
el que el polipéptido induce una respuesta
anti-estreptocócica inmune cuando se administra a
un individuo.
2. Un polinucleótido aislado que codifica un
polipéptido capaz de inducir la generación de anticuerpos que
tienen especificidad de unión para un polipéptido que tiene una
secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las secuencias de SEQ
ID Números: 2, 8, 10, 16, 55, 64-66 ó 78.
3. Un polinucleótido aislado que es
complementario al polinucleótido de la reivindicación 1 ó 2.
4. El polinucleótido de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho polinucleótido es ADN.
5. El polinucleótido de cualquiera de las
reivindicaciones 1 ó 3 en el que dicho polinucleótido es RNA.
6. Un vector que comprende el polinucleótido de
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicho
polisacárido está de manera operativa unido a una región de control
de expresión.
7. Una célula huésped transformada con un vector
de la reivindicación 6.
8. un procedimiento para producir un polipéptido
que comprende cultivar una célula huésped de acuerdo con la
reivindicación 7 en condiciones adecuados para la expresión de dicho
polipéptido.
9. Un polipéptido aislado que induce una
respuesta inmune anti-estreptocócica cuando se
administra a un individuo, teniendo dicho polipéptido al menos un
95% de identidad con una cualquiera de las SEQ ID Números: 2, 8, 10,
16, 55, 64-66 ó 78.
10. Un polipéptido aislado que induce una
respuesta inmune anti-estreptocócica cuando se
administra a un individuo, y que es capaz de inducir la generación
de anticuerpos que tienen especificidad de unión para un
polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos de una cualquiera
de las SEQ ID Números: 2, 8, 10, 16, 55, 64-66 ó
78.
11. Un polipéptido aislado que tiene una
secuencia de aminoácidos seleccionada entre las SEQ ID Números: 2,
8, 10, 16, 55, 64-66 ó 78.
12. Un polipéptido aislado de acuerdo con la
reivindicación 11, en el que la Met N-terminal está
suprimida.
13. Un polipéptido aislado de acuerdo con la
reivindicación 11, en el que la secuencia secretora de aminoácidos
está suprimida.
14. Un polipéptido quimérico que induce una
respuesta inmune anti-estreptocócica cuando se
administra a un individuo que comprende dos o más polipéptidos
seleccionados entre las SEQ ID Números: 2, 8,10, 16, 55,
64-66 ó 78 en el que dos o más polipéptidos están
unidas para formar un polipéptido quimérico.
15. Un polipéptido quimérico según la
reivindicación 14 que comprende los polipéptidos que tienen la
secuencia de aminoácidos de la SEQ ID Números: 10 y 64 en el que
los polipéptidos están ligados para formar un polipéptido
quimérico.
16. Un polipéptido quimérico de fórmula (I) que
induce una respuesta inmune anti-estreptocócica
cuando se administra a un individuo:
(I)A-(B)m-(C)n-D
En la que
M es 0 ó 1,
N es 0 ó 1,
A se selecciona entre las SEQ ID Números: 2, 8,
10, 16, 55, 64-66 ó 78;
B se elige entre las SEQ ID Números: 2, 8, 10,
16, 55, 64-66 ó 78;
C se elige entre las SEQ ID Números: 2, 8, 10,
16, 55, 64-66 ó 78; y
D se elige entre las SEQ ID Números: 2, 8, 10,
16, 55, 64-66 ó 78.
17. Un polipéptido quimérico de acuerdo con la
reivindicación 16, en el que el péptido quimérico tiene la fórmula
(I):
(I)A-(B)m-(C)n-D
En la que
m es 0 ó 1,
n es 0 o 1, y
cada uno de A, B, C y D son independientemente
uno del otro la SEQ ID NO: 10 ó 64.
18. Una composición de vacuna que comprende un
polipéptido de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 9
a 17 y a un vehículo, diluyente o adyuvante farmacéuticamente
aceptable.
19. Uso de una composición de vacuna de acuerdo
con la reivindicación 18 para la fabricación de un medicamento para
el tratamiento profiláctico o terapéutico de meningitis, otitis
media, bacteremia o infección de neumonía en un individuo
susceptible a meningitis, otitis media, bacteremia o infección por
neumonía en el que una cantidad terapéutica o profiláctica de dicho
medicamento se ha de administrar a dicho individuo.
20. Use de acuerdo con la reivindicación 19, en
el que dicho individuo es un mamífero.
21. Uso de acuerdo con la reivindicación 19 ó
20, en el que dicha infección bacteriana es S. pneumoiae,
grupo A de streptococcus (Pyogenes), grupo B de streptococcus (GBS
o agalactiae), dysgalactiae, uberis, nocardia o Staphylococcus
aureus.
22. Uso de acuerdo con la reivindicación 21, en
el que dicha infección bacteriana es S. pneumoniae.
23. Uso de la composición de vacunas de acuerdo
con la reivindicación 18 para la fabricación de un medicamento para
el tratamiento profiláctico o terapéutico de infección por
estreptococos en un animal susceptible a o infectado con la
infección por estreptococos que comprenden la administración a dicho
animal de una cantidad profiláctica o terapéutica de la
composición.
24. Uso de acuerdo con la reivindicación 23, en
el que dicho individuos es un ser humano.
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