ES2235176T3 - Inmunizacion oral con plantas transgenicas. - Google Patents

Abstract

LAS VACUNAS ORALES Y LOS ADYUVANTES DE VACUNAS ORALES DE LA PRESENTE INVENCION, SON PRODUCIDOS EN PLANTAS TRANSGENICAS Y, A CONTINUACION, ADMINISTRADOS A TRAVES DEL CONSUMO DE DICHA PLANTA TRANSGENICA. SE CONSTRUYEN SECUENCIAS DE ADN NATURALES Y SINTETICAS, EMPLEADAS PARA TRANSFORMAR PLANTAS, GENERANDO UNA EXPRESION ESTABLE O TRANSITORIA DE LAS MISMAS, QUE CODIFICAN PARA LA EXPRESION DE AGENTES INMUNOGENICOS CAPACES DE PRODUCIR UNA RESPUESTA INMUNE EN ANIMALES, CUANDO SE LES ALIMENTA CON DICHAS PLANTAS TRANSFORMADAS COMESTIBLES, TEJIDOS VEGETALES, O MATERIALES DERIVADOS DE DICHAS PLANTAS. LA PRESENTE INVENCION, PROPORCIONA EL PRIMER METODO FUNCIONAL CONOCIDO PARA INMUNIZAR ANIMALES A TRAVES DE PLANTAS TRANSGENICAS, EN EL QUE LAS PLANTAS EXPRESAN ANTIGENOS BACTERIANOS, QUE ACTUAN TANTO COMO INMUNOGENOS, COMO COMO ADYUVANTES, CUANDO EL MATERIAL TRANSGENICO VEGETAL QUE EXPRESA LOS ANTIGENOS, ES SUMINISTRADO A LOS ANIMALES.

Description

Inmunización oral con plantas transgénicas.

Campo de la invención

Esta invención se refiere en general a la producción de coadyuvantes de vacunas orales y de vacunas orales en plantas transgénicas comestibles y, más particularmente, a causar una respuesta inmune en animales que comen el material de planta transgénica. La presente invención se refiere más específicamente a la producción de plantas transgénicas usando los genes que codifican las subunidades de toxinas bacterianas LT-A y LT-B o CT-A y CT-B y al uso de la proteína expresada para inducir respuestas inmunes en mamíferos, sola o con otros agentes antígenos asociados.

Por consiguiente, esta invención se refiere a la introducción en plantas de genes que codifican antígenos de colonización o virulencia o porciones antígenas de los mismos de patógenos que colonizan o invaden a través de superficies mucósicas de mamíferos. Más particularmente, esta invención se refiere a la introducción en plantas de genes que codifican proteínas que contienen LT-B o CT-B, de manera que las plantas puedan producir proteína que contiene LT-B o CT-B.

Esta invención representa además una mejora significativa e inesperada sobre la técnica anterior porque permite la inmunización real de animales contra antígenos bacterianos alimentando a los animales con plantas transgénicas en las que se han expresado niveles suficientes del antígeno bacteriano con el fin de inducir inmunidad. Además, esta invención demuestra la mejora adicional e inesperada de un efecto de coadyuvante causado cuando se inmunizan animales con plantas transgénicas que contienen antígenos de toxinas bacterianas.

Fundamento de la invención

Las enfermedades infecciosas han plagado la vida en la tierra probablemente desde su comienzo. En países del mundo avanzados económicamente, las enfermedades infecciosas 1) incapacitan temporalmente; 2) incapacitan o tullen permanentemente; o 3) son fatales. En los países menos desarrollados, las enfermedades infecciosas tienden a estar en las dos últimas categorías, incapacitando o tullendo permanentemente y siendo fatales, debido a muchos factores, incluyendo una falta de inmunzación preventiva y medicina curativa.

Se reconoce generalmente que se está haciendo crecientemente difícil la utilidad de antibióticos para controlar eficazmente patógenos bacterianos, por la aparición acrecentada de patógenos resistentes a antibióticos. Así, la prevención de enfermedades infecciosas es más eficaz en coste que el tratamiento último de la enfermedad una vez que ha tenido lugar. Como resultado, se está enfocando una atención acrecentada al desarrollo de vacunas.

Las vacunas se administran a seres humanos y animales para inducir a sus sistemas inmunes a fin de producir anticuerpos contra virus, bacterias y otros tipos de organismos patógenos. En los países del mundo avanzados económicamente, las vacunas han puesto a muchas enfermedades bajo control. En particular, se previenen ahora muchas enfermedades víricas debido al desarrollo de programas de inmunización. La eliminación virtual de la viruela es un ejemplo de la eficacia de una vacuna en todo el mundo. Pero muchas vacunas para enfermedades tales como poliomielitis, sarampión, paperas, rabias, glosopeda y hepatitis B son aún demasiado caras para los países menos desarrollados a fin de proporcionarlas a sus grandes poblaciones humana y de animales. La falta de estas medidas preventivas para poblaciones de animales puede empeorar la condición humana creando escaseces de alimentos.

Debido a la simplicidad de distribución de vacunas por entrega oral, hay un gran interés actual por descubrir nueva tecnología de vacunas orales. Los inmunógenos orales distribuidos apropiadamente pueden estimular la inmunidad humoral y celular y tienen el potencial de proporcionar vacunas seguras, eficaces en coste, para su uso en países en desarrollo o ciudades interiores en los que no es práctico la inmunización parenteral a gran escala o extremadamente difícil de implementar. Tales vacunas pueden basarse en sistemas de vectores bacterianos o víricos que expresan epítopes protectores de diversos patógenos (vacunas multivalentes) o pueden basarse en antígenos purificados distribuidos singularmente o en combinación con antígenos u otros patógenos relevantes.

A. Patogénesis microbiana y vacunación oral

Los patógenos microbianos pueden infectar a un hospedante por uno entre varios mecanismos. Pueden entrar a través de una grieta en el integumento inducida por trauma, pueden introducirse por transmisión de vector o pueden interactuar con una superficie mucósica. La mayoría de los patógenos humanos inician la enfermedad por el último mecanismo, es decir, tras la interacción con superficies mucósicas. Los patógenos bacterianos y víricos que actúan a través de este mecanismo toman primero contacto con la superficie mucósica en la que pueden incorporarse y después colonizar, o absorberse por células absortivas especializadas (células M) en el epitelio que cubre placas de Peyer y otros folículos linfoides. Los organismos que entran en los tejidos linfoides pueden destruirse fácilmente dentro de los folículos linfoides, provocando por ello una respuesta inmunológica potencialmente protectora a medida que se entregan antígenos a células inmunes dentro de los folículos (por ejemplo, Vibrio cholerae). Alternativamente, organismos patógenos capaces de sobrevivir a mecanismos de defensa local pueden extenderse desde los folículos y causar a continuación enfermedad local o sistémica (por ejemplo, Salmonella spp., poliovirus en hospedantes inmunocomprometidos).

Los anticuerpos de IgA secretora (sIgA) dirigidos contra determinantes de virulencia específicos del organismo infectante juegan un papel importante en la inmunidad mucósica total. En muchos casos, es posible prevenir la infección inicial de superficies mucósicas estimulando la producción de niveles de sIgA mucósica dirigidos contra determinantes de virulencia relevantes de un organismo infectante. La IgA secretora puede prevenir la interacción inicial del patógeno con la superficie mucósica bloqueando la incorporación y/o colonización, neutralizando las toxinas que actúan en superficie o previniendo la invasión de las células hospedantes.

Las preparaciones de células completas y virus completos inactivadas administradas parenteralmente son eficaces para obtener IgG de suero protectora y reacciones de hipersensibilidad de tipo retardado contra organismos que tienen una fase de suero significativa en su patogénesis (por ejemplo, Salmonella typhi, hepatitis B). Sin embargo, las vacunas parenterales no son eficaces para obtener respuestas de sIgA mucósica y son ineficaces contra bacterias que interactúan con superficies mucósicas y no invaden (por ejemplo, Vibrio cholerae).

La inmunización oral puede ser eficaz para inducir respuestas de sIgA específicas si se presentan los antígenos a los linfocitos T y B y células accesorias contenidas dentro de las placas de Peyer en las que se inicia el desarrollo de células B de IgA preferencial. Las placas de Peyer contienen células T auxiliares (TH) que median en el cambio de isotipo de células B directamente desde células de IgM a células B de IgA y migran después a los nudos de linfa mesentérica y experimentan diferenciación, entran en el conducto torácico, después en la circulación general y siembran a continuación todos los tejidos secretores del cuerpo, incluyendo la lamina propia del intestino y el tracto respiratorio. Se produce después IgA por las células del plasma maduras, se acompleja con Componente Secretor unido a membrana, y se transporta a la superficie mucósica en la que está disponible para interactuar con patógenos invasores. La existencia de este sistema inmune mucósico común explica en parte el potencial de vacunas orales vivas e inmunización oral para protección contra organismos patógenos que inician la infección interactuando primero con superficies mucósicas.

Se ha desarrollado un cierto número de estrategias para inmunización oral, incluyendo el uso de mutantes atenuados de bacterias (por ejemplo, Salmonella spp.) como vehículos de antígenos heterólogos, encapsulación de antígenos en microesferas compuestas por poli-DL-lactida-glicolida (PGL), polímeros-proteinoides de tipo proteína, cápsulas de gelatina, diferentes formulaciones de liposomas, adsorción en nanopartículas, uso de complejos estimulantes inmunes lipófilos y adición de productos bacterianos con propiedades coadyuvantes conocidas.

Subyace al desarrollo de vacunas más actuales la capacidad de desarrollar el agente causante de la enfermedad en grandes cantidades. Actualmente, las vacunas se producen habitualmente a partir de patógenos muertos o vivos atenuados. Si el patógeno es un virus, deben desarrollarse grandes cantidades del virus en un animal hospedante o células de animales cultivadas. Si se utiliza un virus vivo atenuado, debe probarse claramente que carece de virulencia mientras mantiene la capacidad de establecer infección e inducir inmunidad humoral y celular. Si se utiliza un virus muerto, la vacuna debe demostrar la falta de capacidad de antígenos supervivientes para inducir inmunización. Adicionalmente, los antígenos superficiales, las principales partículas víricas que inducen inmunidad, pueden aislarse y administrarse para inducir inmunidad en lugar de utilizar virus atenuados vivos o muertos.

Las enfermedades bacterianas entéricas tales como cólera, disentería, diarreas relacionadas con Escherichia coli (E. Coli) y fiebre tifoidea son causas principales de morbidez y mortalidad en todo el mundo, especialmente en países en desarrollo en los que las condiciones sanitarias son a menudo menos que adecuadas. Se han desarrollado y ensayado durante años varios tipos de vacunas contra estas enteropatías, entre ellas células completas muertas, subunidades de toxinas y bacterias vivas atenuadas administradas parenteral u oralmente. La mayoría de la morbidez y mortalidad debida a enfermedad diarreica bacteriana resulta de infecciones con V. Cholerae y las enteropatías enterotóxicas relacionadas con el cólera (por ejemplo, E. coli que produce enterotoxina de tipo cólera).

E. coli causa enfermedad diarreica por una variedad de mecanismos, que incluyen producción de una o más enterotoxinas. Una de estas toxinas, a la que se hace referencia como enterotoxina lábil por calor (LT), está relacionada inmunológicamente y fisicoquímicamente con la enterotoxina del cólera. La LT se ha purificado hasta homogeneidad y se ha caracterizado extensamente. La LT-B, una proteína pentámera de 56.000 Daltons que consiste en 5 subunidades monómeras idénticas, funciona como componente de unión de la enterotoxina lábil por calor. Si se administra parenteralmente, la LT-B induce una respuesta del suero a sí misma y a haptenos enlazados covalentemente a la molécula incluso en ausencia de un coadyuvante De manera similar, se ha demostrado que la LT-B administrada oralmente en modelos de animales y en voluntarios humanos induce una IgG del suero y respuesta de IgA mucósica a sí misma y a haptenos enlazados apropiadamente.

La estructura de LT se ha caracterizado bien por cristalografía de rayos X y consiste en una proteína multímera. La holotoxina incluye una subunidad "A" (LT-A) de peso molecular 27.000 Daltons que se divide en LT-A1 y LT-A2 por las proteasas del intestino delgado. La holotoxina también contiene cinco subunidades "B" (LT-B), de peso molecular 11.600 Daltons cada una, que están enlazadas no covalentemente a una estructura de pentámero de tipo buñuelo muy estable.

La estructura de pentámero de LT-B se une a células epiteliales intestinales mediante interacciones específicas con el gangliósido GM-I (galactosil-N-acetilgalactosaminil-(sialil)-galactosilglucosil ceramida) presente en la superficie celular. Esto facilita la entrada en células de LT-A1 tóxica, que contiene la actividad de ribosil transferasa de ADP. La toxina LT de E. coli enterotoxigénico (ETEC) es similar estructural y funcionalmente a CT, la toxina del cólera de Vibrio cholera. Se ha visto que la inmunización contra una conduce a protección cruzada contra la otra. J.D. Clemens, et al., Lancet 335, 270 (1990). La subunidad B del cólera es una parte integral de la vacuna oral candidata ensayada en Bangladesh. J.D. Clemens, et al., Lancet 335, 270 (1990).

La fabricación de vacunas emplea a menudo tecnologías complejas que imponen altos costes para el desarrollo y la producción de la vacuna. Se requiere la concentración y purificación de la vacuna, tanto si se hace a partir de cultivos de células, como de bacterias completas, virus, otros organismos patógenos o subunidades de los mismos. El alto coste de purificación de una vacuna según las reglamentaciones de la Food and Drug Administration (FDA) hace a muchas vacunas orales pohibitivamente caras de producir porque requieren de diez a quince veces más de la calidad regular de vacuna por dosis que una vacuna que se administra parenteralmente.

Según las líneas de guía de la FDA, la eficacia de vacunas para seres humanos debe demostrarse en animales por desarrollo de anticuerpos y por resistencia a infección y enfermedad por prueba con el patógeno. Cuando los niveles de seguridad e inmunogenicidad son satisfactorios, se realizan después en seres humanos los estudios clínicos de la FDA. Se consigue de la población general un pequeño grupo controlado cuidadosamente de voluntarios para comenzar pruebas en seres humanos Este procedimiento de ensayo largo y caro requiere años antes de que pueda determinarse si puede darse la vacuna a la población general. Si las pruebas tienen éxito, puede producirse después en masa la vacuna y venderse al público.

Incluso después de estas precauciones, pueden aparecer y aparecen problemas. Con células, virus u otros organismos patógenos bacterianos muertos, hay siempre la posibilidad de que sobrevivan patógenos vivos y la vacunación pueda conducir a casos aislados de enfermedad. Además, las vacunas pueden contaminarse a veces con material celular del material de cultivo del que se derivan. Estos contaminantes pueden causar reacciones adversas en el receptor de la vacuna y a veces incluso la muerte. La responsabilidad legal del fabricante de la vacuna por los que son dañados por una reacción adversa a las vacunas requiere que el fabricante tenga y mantenga un seguro de responsabilidad caro que se añade además al coste final de la vacuna.

Muchos patógenos entran en o a través de una superficie mucósica, con la excepción de patógenos llevados por insectos o patógenos que entran en el cuerpo a través de heridas. Los patógenos que entran a través de superficies mucósicas incluyen, sin limitación, Actinomyces, Aeromonas, Bacillus, Bacteroides, Bordetella, Brucella, Compylobacter, Capnocylophaga, Clamydia, Clostridium, Corynebacterium, Eikenella, Erysipelothrix, Escherichia, Fusobacterium, Hemophilus, Klebsiella, Legionella, Leptospira, Listeria, Mycobacterium, Mycloplasma, Neisseria, Nocardia, Pasteurella, Proteus, Pseudomonas, Rickettsia, Salmonella, Selenomonas, Shigelia, Staphylococcus, Streptococcus, Treponema, Vibro y Yersinia, cepas víricas patógenas de los grupos Adeiiovirus, Coronavirus, Herpesvirus, Orthomyxovirus, Picornovirus, Poxvirus, Reovirus, Retrovirus y Rotavirus, hongos patógenos de los géneros Aspercillus, Blastomyces, Candida, Coccoidiodes, Cryptococcus Histoplasma y Phycomyces, y parásitos patógenos de los géneros Eimeria, Entamoeba y Trichomonas.

Los hospedantes mamíferos infectados por un patógeno montan una respuesta inmune en un intento por vencer al patógeno. El sistema inmune consiste en tres ramas: mucósica, humoral y celular. La inmunidad mucósica resulta de la producción de anticuerpos secretores (sIgA) en secreciones que bañan todas las superficies mucósicas incluyendo el tracto respiratorio, el tracto gastrointestinal y el tracto genitourinario y en secreciones de todas las glándulas secretoras. Los anticuerpos de IgA secretores previenen la colonización de patógenos en las superficies mucósicas y son una primera línea de defensa contra la colonización e invasión de un patógeno a través de las superficies mucósicas. La producción de sIgA puede estimularse por inmunización local de la glándula o tejido secretores o por presentación de un antígeno al tejido linfoide asociado al intestino (GALT o placas de Peyer) o al tejido linfoide bronquial- asociado (BALT).

Las células de micropliegues membranosas, conocidas de otro modo como células M, cubren la superficie del GALT y el BALT y pueden asociarse con otras superficies mucósicas secretoras. Las células M actúan tomando muestras de antígenos del espacio interior adyacente a la superficie mucósica y transfieren tales antígenos a células que presentan antígenos (células dendríticas y macrófagos), que a su vez presentan el antígeno a linfocitos T (en el caso de antígenos T-dependientes), que procesan el antígeno para presentación a células B comprometidas. Las células B se estimulan después para proliferar y migrar, y se transforman finalmente en células del plasma secretoras de anticuerpos que producen IgA contra el antígeno presentado.

Cuando se absorbe el antígeno por células M que cubren los GALT y BALT, resulta una inmunidad mucósica generalizada con sIgA contra el antígeno producida por todos los tejidos secretores del cuerpo. Puesto que muchos patógenos entran a través de superficies mucósicas y tales superficies forman la primera línea de defensa a la infección y facilitan la respuesta inmune del cuerpo, las vacunas que pueden administrarse oralmente representan una vía muy importante para estimular una respuesta inmune mucósica generalizada que conduce a estímulo local de una respuesta inmune secretora en la cavidad oral y en el tracto gastrointestinal.

Los anticuerpos de IgA secretora inhiben directamente la adherencia de microorganismos a células epiteliales mucósicas y a la dentadura del hospedante. Esta inhibición puede ser el resultado de aglutinación de microorganismos, reducción de hidrofobicidad o carga negativa, y bloqueo de adhesiones microbianas. Estos efectos anti-adherencia se agrandan por otros factores tales como glicoproteínas secretoras, descamación continua del epitelio superficial y competición floral.

La experiencia clínica con vacuna de poliovirus peroral humana y varias vacunas de virus perorales o intranasales aplicadas en medicina veterinaria muestra que la sIgA juega un papel decisivo en el efecto protector por el sistema inmune mucósico contra infecciones víricas respiratorias y entéricas. El efecto de sIgA parece ser el de inhibir la entrada de virus en células hospedantes más que la prevención de incorporación.

B. Ingeniería genética de plantas

Se conocen en la técnica diversos métodos para conseguir la transformación genética de plantas y tejidos de plantas de modo que se introduzca ADN extraño en el material genético de la planta de manera estable, es decir, una manera que permita que pase el ADN extraño a la progenie de la planta. Dos de tales procedimientos de transformación son transformación mediada por Agrobacterium y transferencia directa de genes.

La transformación mediada por Agrobacterium utiliza A. tumefaciens, el agente etiológico de agalla de copa, una enfermedad de un amplio intervalo de dicotiledóneas y gimnospermas que produce la formación de tumores o agallas en tejido de plantas en el lugar de la infección. El Agrobacterium, que infecta normalmente la planta en sitios de heridas, lleva un gran elemento extracromosómico denominado plásmido Ti (inductor de tumores).

Los plásmidos Ti contienen dos regiones requeridas para inducción de tumores. Una región es la T-ADN (ADN transferido), que es la secuencia de ADN que se encuentra transferida finalmente de manera estable al ADN genómico de la planta. La otra región es la región vir (virulencia) que ha sido implicada en el mecanismo de transferencia. Aunque la región vir se requiere absolutamente para una transformación estable, el ADN de vir no se transfiere realmente a la planta infectada. La transformación de células de plantas mediadas por infección con A. tumefaciens y transferencia subsiguiente del T-ADN solo ha sido bien documentada. Véase, por ejemplo, Bevan, M.W. et al., Int. Rev. Genet, 16, 357 (1982).

Después de varios años de investigación intensa en muchos laboratorios, se ha desarrollado el sistema Agrobacterium para permitir la transformación rutinaria de una variedad de tejidos de plantas. Los tejidos representativos transformados por esta técnica incluyen, aunque sin limitarse a ellos, tabaco, tomate, girasol, algodón, colza, patata, álamo y soja.

También se ha usado A. rhizogenes como vector para transformación de plantas. Esta bacteria, que incita la formación de pelos de raíces en muchas especies de plantas dicotiledóneas, lleva un gran elemento extracromosómico denominado plásmido Ri (inductor de raíces) que funciona de una manera análoga al plásmido Ti de A. tumefaciens. La transformación usando A. rhizogenes se ha desarrollado análogamente a la de A. tumefaciens y se ha utilizado con éxito para transformar plantas que incluyen, aunque sin limitarse a ellas, alfalfa y álamo.

En el caso de transferencia directa de genes, el material genético extraño se transforma en tejido de plantas sin el uso de plásmidos de agrobacterium. La transformación directa implica la absorción de material genético exógeno en células o protoplastos de plantas. Tal absorción puede aumentarse mediante el uso de agentes químicos o campos eléctricos. El material exógeno puede integrarse después en el genoma nuclear. El primer trabajo con transferencia directa se realizó en la dicotiledónea Nicotiana tobacum (tabaco), en el que se mostró que el ADN extraño se incorporaba y transmitía a plantas de progenie. Se han transformado también varios protoplastos de dicotiledóneas por este procedimiento incluyendo maíz y arroz.

También se ha demostrado que la fusión de liposomas es un método para transformar células de plantas. Los protoplastos se reunen con liposomas que llevan el gen deseado. A medida que se combinan membranas, el gen extraño se transfiere al protoplasto.

Además, la transferencia directa de genes puede conseguirse mediante transformación mediada por polietilenglicol (PEG). La transformación mediada por PEG se ha usado con éxito para transformar dicotiledóneas tales como tabaco y monocotiledóneas tales como lolium multiflorum. Este método cuenta con productos químicos para mediar en la absorción de ADN por protoplastos y se basa en interacciones sinérgicas entre Mg^{+2}, PEG y posiblemente Ca^{+2}. Véase, por ejemplo, Negrutiu, R. et al., Plant Mol. Biol., 8, 363 (1987).

Alternativamente, puede introducirse ADN exógeno en células o protoplastos por microinyección. En esta técnica, una solución del ADN o fragmento de ADN plásmido se inyecta directamente en la célula con una aguja de vidrio sacada finamente. Esta técnica se ha usado para transformar alfalfa.

Un procedimiento desarrollado más recientemente para transferencia directa de genes implica el bombardeo de células por microproyectiles que llevan ADN. En este procedimiento, denominado comúnmente bombardeo de partículas, se aceleran hacia las células objetivo partículas de wolframio u oro revestidas con el ADN exógeno. Las partículas penetran en las células llevando con ellas el ADN revestido. Se ha demostrado con éxito que la aceleración de micropartículas conduce a expresión transitoria y expresión estable en células suspendidas en cultivos, protoplastos y embriones inmaduros de plantas incluyendo, aunque sin limitarse a ellas, cebolla, maíz, soja y tabaco.

Una vez transformadas las plantas, hay una variedad de métodos para regenerar plantas. El método particular de regeneración depende del tejido de la planta de partida y de la especie de planta particular a regenerar. En los últimos años, se ha hecho posible regenerar muchas especies de plantas a partir de tejido de callo derivado de explantes de plantas. Las planta que pueden regenerarse de callo incluyen monocotiledóneas, tales como, aunque sin limitarse a ellas, maíz, arroz, cebada, trigo y centeno, y dicotiledóneas, tales como, aunque sin limitarse a ellas, girasol, soja, algodón, colza y tabaco.

Se ha demostrado la regeneración de plantas a partir de tejido transformado con A. tumefaciens para varias especies de plantas. Estas incluyen, aunque sin limitarse a ellas, girasol, tomate, trébol blanco, colza, algodón, tabaco, patata, maíz, arroz y numerosos cultivos vegetales.

La regeneración de plantas a partir de protoplastos es ocasionalmente una técnica útil. Cuando una especie de plantas puede regenerarse a partir de protoplastos, pueden utilizarse procedimientos de transferencia directa de genes, y la transformación no depende del uso de A. tumefaciens. La regeneración de plantas a partir de protoplastos se ha demostrado para plantas que incluyen, aunque sin limitarse a ellas, tabaco, patata, álamo, maíz y soja.

La tecnología desarrollada para la creación de plantas transgénicas ha conducido a muchos investigadores a estudiar la expresión de genes derivados de especies de plantas desemejantes o de genomas no de plantas. En muchos casos, ha sido deseable caracterizar la expresión de proteínas recombinantes codificadas por genes derivados de virus o bacterias. La construcción de genes quiméricos para la expresión en plantas de secuencias de codificación extrañas implica la ligación de elementos reguladores no codificantes que funcionan en plantas 5' a la secuencia de ADN que codifica la proteína deseada, y la ligación de una señal de poliadenilación que es activa en células de plantas 3' a la secuencia de ADN que codifica la proteína deseada.

Las secuencias reguladoras 5' que se usan a menudo en la creación de genes quiméricos para transformación de plantas pueden causar expresión constitutiva nominalmente en todas las células de la planta transgénica o expresión de genes regulada, en la que sólo células o tejidos específicos muestran expresión de los genes introducidos. El promotor CaMV 35-S, que se derivó del Virus del Mosaico de Coliflor, que ocasiona una enfermedad de planta, se ha usado frecuentemente para guiar expresión constitutiva nominalmente de genes extraños en plantas. Un elemento de ADN regulador que se encontró que controlaba la expresión específica para tubérculos de la proteína patatina es un ejemplo de expresión de genes específica de desarrollo; se sabe que este elemento promotor de patatina causa la expresión específica para tubérculos de al menos algunos genes extraños. Véase, por ejemplo, H.C. Wenzler, G.A. Mignery, L.M. Fisher, W.D. Park, Plant Mol. Biol., 12:41-50 (1989).

Las construcciones de genes quiméricos pueden incluir también modificaciones de la secuencia de codificación de aminoácidos del gen estructural introducido en plantas transgénicas. Por ejemplo, puede ser deseable añadir o suprimir aminoácidos de la proteína a expresar para influir en la localización celular del producto de gen extraño en las células de plantas transgénicas.

Se ha mostrado que la inclusión de secuencias de aminoácidos de KDEL y HDEL en el término carboxi de al menos una proteína mejoraba el reconocimiento para esa proteína por la maquinaria de retención del retículo endoplásmico de la planta. S. Munro y H.R.B. Pelham, Cell 48, 988-997 (1987); J. Denecke, R. DeRycke, J. Botterman, EMBO-J. 11, 2345 (1992); E.M. Herman, B.W. Tague, L.M. Hoffman, S.E. Kjemtrip, M.J. Chrispeels, Planta 182, 305 (1991); C. Wendelt et al., The Plant Journal 2, 181 (1992). Sin embargo, tales modificaciones son problemáticas en el mejor de los casos porque otros factores tales como conformación de proteínas o pliegue de proteínas en las células transformadas puede interferir con la disponibilidad de esta señal del término carboxi por la maquinaria de retención del retículo endoplásmico de la planta. S.M. Haugejorden, M. Srinivasan, M. Green, J-Biol-Chem. 266, 6015 (1991).

C. Metodologías de vacunas orales usando plantas transgénicas

Hay cuatro sistemas de transformación de expresión genética bien conocidos que pueden usarse para producir plantas transgénicas capaces de administrarse como uno de los agentes activos en vacunas orales contra un antígeno deseado. La presente invención se aprovecha de estos cuatro sistemas de expresión para la construcción de vacunas comestibles. Debe reconocerse que esta lista no pretende agotar otros métodos posibles. La lista se incluye simplemente para proporcionar un contexto apropiado para el alcance y enseñanza de la presente invención.

Primero, en plantas transgénicas, pueden usarse vectores de expresión que incluyen el promotor CaMV 35S y secuencias de codificación de antígeno para transformar constitutivamente las plantas en las que la expresión en las hojas permite un análisis rápido de la expresión de genes y caracterización bioquímica de productos de genes.

En tales plantas, tales como aunque sin limitarse a ella Brassica napus (canola), pueden usarse vectores de expresión que incluyen el promotor de albúmina 2S y las secuencias de codificación de antígeno a fin de ocasionar expresión de genes específica para la semilla para crear la producción de proteína recombinante en tejidos de semilla, usada rutinariamente como alimento de animales, proporcionando la producción de análisis de inmunogenicidad oral atractiva.

En plantas tales como, aunque sin limitarse a ella, Solanum tuberosum (patata), pueden usarse vectores de expresión que incluyen el promotor de patatina o el promotor vspB de soja y secuencias de codificación de antígeno a fin de ocasionar expresión de genes específica para el tubérculo para crear la producción específica para el tubérculo de proteína recombinante en tejidos de tubérculo, usado rutinariamente como alimento. Esto proporciona la producción de análisis de inmunogenicidad oral atractiva.

Finalmente, en plantas tales como, aunque sin limitarse a ella, Musa acuminata (banana), pueden usarse vectores de expresión que incluyen promotores específicos para maduración de frutas y secuencias de codificación de antígeno para transformar plantas que producen la proteína recombinante en fruta madura, en la que la producción de proteína recombinante se produce directamente como vacunas candidatas para estudios de ingestión en animales y seres humanos.

La retención de propiedades biológicas en las proteínas recombinantes producidas en plantas, específicamente unión de ligando y la presentación de epítopes antígenos, es de considerable importancia para la producción con éxito de vacunas comestibles en plantas transgénicas. El ensayo final del valor de proteínas de importancia farmacológica es su actividad biológica. Las vacunas son de particular interés para estudios de expresión de proteínas porque sus efectos pueden cuantificarse con precisión en modelos de animales. Además, se requieren cantidades relativamente bajas, porque sus efectos se multiplican por el sistema inmune.

El alto coste de producción y purificación de péptidos sintéticos fabricados por procedimientos de base química o fermentación puede impedir su uso a escala amplia como vacunas orales. La producción de proteínas inmunógenas en plantas transgénicas y el efecto coadyuvante de tales proteínas en plantas transgénicas ofrece una alternativa económica.

Aunque las vacunas orales pueden ser un procedimiento eficaz y económico para inducir respuestas inmunes secretoras en animales, incluyendo seres humanos, hay necesidad de técnicas probadas que produzcan plantas transgénicas o tejidos de plantas que puedan causar, por ingestión directa, una respuesta inmune deseada a un antígeno dado sin efectos secundarios significativos.

Se han hecho intentos para producir plantas transgénicas que expresan antígenos bacterianos de E.coli y de Streptococcus mutans. Curtiss e Ihnen, documento WO 90/0248, publicado el 22 de Marzo de 1990. También se han hecho plantas transgénicas que expresan el antígeno superficial de Hepatitis B (HBsAg). H.S. Mason, D. M-K. Lam, C.J. Arntzen, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:11745-749 (1992).

Sin embargo, esos estudios no han producido material de plantas inmunógeno oralmente ni han demostrado que sea posible, de hecho, inmunizar oralmente animales con antígenos producidos en plantas transgénicas. De hecho, se necesitaron las mejoras significativas e inesperadas descritas aquí para demostrar con éxito que es posible en efecto inmunizar realmente animales contra antígenos alimentando a los animales con plantas transgénicas en las que se habían expresado niveles suficientes del antígeno con el fin de inducir inmunidad. Además, se necesitaron las mejoras significativas e inesperadas de la presente invención para demostrar también el efecto coadyuvante con otros inmunógenos causado inmunizando animales con plantas transgénicas que contenían antígenos de toxinas bacterianas.

El presente descubrimiento descrito en las siguientes secciones describe cómo superar las limitaciones previas por las mejoras significativas e inesperadas de causar la producción de niveles acrecentados de la proteína de antígeno y por compartimentación en vesículas microsómicas de plantas transgénicas de una proteína de LT-B activa oralmente que es altamente inmunógena, y por la expresión aumentada de tales antígenos bacterianos transgénicos en plantas mediante i) alteraciones en los promotores de la planta para aumentar el nivel de expresión de proteínas transgénicas en las plantas, ii) alteración de mensajes 3' y señales de poliadenilación para aumentar la producción de proteínas transgénicas en las plantas y iii) producción de genes sintéticos que codifican antígenos bacterianos, en los que se ha cambiado la utilización de codón para aumentar la utilización por plantas, aumentando así el nivel de proteínas transgénicas producidas en las plantas. Además, el presente descubrimiento describe que la expresión de proteínas extrañas compartimentadas en tejidos de plantas transgénicas comestibles permite la expresión y entrega de antígenos deseados, adicionales, de valor como vacunas orales, puesto que la LT-B encapsulada en microsomas sirve como coadyuvante oral.

Sumario de la invención

Según la invención, se proporciona un material de planta transgénico que comprende o expresa una secuencia de ADN que codifica al menos un agente inmunógeno,

en el que la secuencia de ADN comprende además una secuencia de retención de retículo endoplásmico (ER) fusionada con la secuencia de ADN que codifica el agente inmunógeno y

en el que el material es capaz de inducir una respuesta inmune al agente inmunógeno expresado en animales suficiente para inmunizar a los animales contra el agente cuando se administra al animal el material de planta transgénico por ingestión oral.

La invención proporciona también:

-

el uso de material de planta transgénico de la invención en la fabricación de un medicamento para vacunar un animal por administración oral del material;

-

un método para producir material de planta transgénico de la invención que comprende:

construir al menos un vector con una secuencia de ADN que codifica al menos un agente inmunógeno, en el que la secuencia de ADN comprende además una secuencia de retención de retículo endoplásmico (ER) fusionada con la secuencia de ADN que codifica el agente inmunógeno;

transformar material de planta para crear material de planta transgénico con dicho vector; y

expresar dicho agente inmunógeno de dicho vector con dicho material de planta transgénico, en el que el nivel de expresión de dicho agente inmunógeno es suficiente para inducir una respuesta inmune en dicho animal suficiente para inmunizar al animal contra el agente inmunógeno cuando se administra dicho material de planta a dicho animal por ingestión oral.

Con el fin de proporcionar una comprensión clara y consistente de la presente invención, se proporciona la siguiente lista de términos y sus definiciones.

Un animal es cualquier vertebrado o invertebrado, incluyendo, aunque sin limitarse a ellos, seres humanos, aves y peces.

Un antígeno es una macromolécula que es capaz de estimular la producción de anticuerpos por introducción en un mamífero u otro animal, incluyendo seres humanos. Según se usa en esta solicitud, antígeno significa un antígeno per se, un determinante antígeno o el antígeno, o una proteína de fusión que contiene el antígeno o determinante antígeno a la que se hace referenca a menudo como epítopes nativos.

Un determinante antígeno es un pequeño complejo químico que determina la especificidad de una reacción antígeno-anticuerpo. Los antígenos de colonización y/o virulencia de un patógeno contienen uno o más determinantes antígenos.

Un domino de aminoácidos es una secuencia de aminoácidos dentro de una proteína que puede asociarse con una función u homología de secuencia particular.

Un antígeno de colonización o virulencia es un antígeno en la superficie de un microorganismo patógeno que está asociado con la capacidad del microorganismo para colonizar o invadir su hospedante. La discusión y reivindicaciones pueden referirse a antígenos de colonización o virulencia o determinantes antígenos de los mismos. Un patógeno puede contener antígenos de colonización o virulencia o ambos y una o más secuencias de ADN para cada uno o ambos pueden transferirse a un vector y usarse para transformar una planta de tal modo que exprese el antígeno o antígenos.

Un agente inmunógeno es cualquier antígeno que sea capaz de causar una respuesta inmune en animales tal como por ingestión oral de plantas que llevan vectores que expresan el antígeno.

Una secuencia o gen quiméricos es una secuencia de ADN que contiene al menos dos partes heterólogas, es decir, partes derivadas de, o que tienen homología de secuencia sustancial con, secuencias de ADN preexistentes que no están asociadas en sus estados preexistentes. Las secuencias de ADN preexistentes pueden ser de origen natural o sintético.

Una secuencia de ADN codificante es una secuencia de ADN de la que se transcribe la información para hacer una molécula de péptido, mARN o tARN. Una secuencia de ADN puede ser un gen, una combinación de genes o un fragmento de gen.

Un ADN extraño es un ADN que es exógeno a, o no se encuentra naturalmente, en los microorganismos o plantas a transformar. Tal ADN extraño incluye ADN vírico, procariota y eucariota, y puede tener lugar naturalmente, sintetizarse químicamente, ser cADN, mutado o cualquier combinación de tales ADNs. El ADN extraño de esta invención se deriva o tiene homología de secuencias sustancial con ADN de microorganismos y virus patógenos, o es un gen sintético que codifica una proteína que es de secuencia de aminoácidos similar a genes procariotas.

Una proteína de fusión es una proteína que contiene al menos dos secuencias de aminoácidos diferentes enlazadas en un polipéptido en la que las secuencias no se expresaban nativamente como una proteína simple. Las proteínas de fusión son frecuentemente el resultado de ingeniería genética por la que secuencias de ADN de genes diferentes se unen entre sí para codificar una proteína simple compuesta por secuencias de aminoácidos de los genes separados originalmente.

Un gen es una región cromosómica discreta que codifica un producto celular discreto.

Una proteína que contiene LT-B es cualquier proteína que sea sustancialmente homóloga en secuencia de aminoácidos a, o similar funcionalmente de modo sustancial a proteína de LT-B o proteína de CT-B derivada bacterianamente. Las proteínas que contienen LT-B incluyen, aunque sin limitarse a ellas, proteínas con al menos un dominio con al menos aproximadamente 90% de homología de secuencia de aminoácidos con proteínas de LT-B o CT-B derivadas bacterianamente, proteínas que son funcionalmente similares de modo sustancial a proteínas de LT-B o CT-B derivadas bacterianamente en la unión a gangliósidos GM I, y proteínas de fusión en las que dominios que son sustancialmente similares a LT-B o CT-B derivadas bacterianamente están fusionadas a otras secuencias de aminoácidos en los términos N o C de las otras secuencias de aminoácidos, o fusionadas dentro de las otras secuencias de aminoácidos.

Una proteína que contiene LT-A es cualquier proteína que sea sustancialmente homóloga en secuencia de aminoácidos a, o similar funcionalmente de modo sustancial a proteína de LT-A derivada bacterianamente. Las proteínas que contienen LT-A incluyen, aunque sin limitarse a ellas, proteínas con al menos un dominio con al menos aproximadamente 90% de homología de secuencia de aminoácidos con LT-A derivada bacterianamente, y proteínas que son funcionalmente similares de modo sustancial a LT-A derivada bacterianamente.

Un microorganismo es un miembro de una de las siguientes clases: bacterias, hongos, protozoos o virus.

Un tejido de planta es cualquier tejido de una planta en su estado nativo o en cultivo. Esta expresión incluye, sin limitación, plantas completas, células de plantas, órganos de plantas, semillas de plantas, protoplastos, callos, cultivos de células y cualquier grupo de células de plantas organizadas en unidades estructurales y/o funcionales. El uso de esta expresión conjuntamente con, o en ausencia de, cualquier tipo específico a tejido de planta como se ha listado antes o abarcado de otro modo por esta definición, no se pretende que sea exclusivo de cualquier otro tipo de tejido de planta. Las plantas adecuadas para transformación según los procedimientos de esta invención incluyen, sin limitación, monocotiledóneas tales como maíz, trigo, cebada, sorgo, centeno, arroz, banana y llantenes, y dicotiledóneas tales como patata, tomate, alfalfa, soja, judías en general, canola, manzana, peras, frutos en general y otros vegetales.

Un vector de transformación de planta es un plásmido o vector vírico que es capaz de transformar tejido de planta de tal modo que el tejido de planta contenga y exprese ADN no preexistente en el tejido de planta.

Una materia alimenticia o material de planta comestible es cualquier material de planta que puede ingerirse directamente por animales o seres humanos como fuente nutricional o complemento dietético.

Una secuencia de ADN preexistente es una secuencia de ADN que existe antes de su uso, en todo o en parte, en un producto del método según esta invención. Aunque tal preexistencia refleja típicamente un origen natural, las secuencias preexistentes pueden ser de origen sintético u otro.

Una respuesta inmune implica la producción de anticuerpos, que son proteínas denominadas inmunoglobulinas. Los anticuerpos circulan en la corriente sanguínea y permean a los otros fluidos corporales, en los que se unen específicamente al tipo de antígeno extraño que los induce. La unión por anticuerpo inactiva virus y toxinas bacterianas (tales como toxina del tétanos o botulinum), frecuentemente bloqueando su capacidad para unirse a receptores en células objetivo. La unión de anticuerpos marca también a microorganismos invasores para su destrucción, haciéndoles más fáciles para ingerirlos por una célula fagocítica o activando un sistema de las proteínas de la sangre, denominado colectivamente complemento, que mata a los invasores. Las respuestas inmunes mediadas por células, la segunda clase de respuestas inmunes, implica la producción de células especializadas que reaccionan con antígenos extraños en la superficie de otras células hospedantes. La célula reaccionante puede matar una célula hospedante infectada por virus que tiene proteínas víricas en su superficie, eliminando por ello a la célula infectada antes de replicarse el virus. En otros casos, la célula reaccionante segrega señales químicas que activan macrófagos para destruir a los microorganismos invasores.

Una respuesta inmune secretora (SIR) es un tipo específico de respuesta inmune. Implica la formación y producción de anticuerpos de IgA secretora en secreciones que bañan las superficies mucósicas de seres humanos y otros animales y en secreciones de glándulas secretoras. Un agente que ocasiona la formación y producción de tales anticuerpos se considera que estimula inmunidad secretora u obtiene una SIR. También se hace referencia a veces a la inmunidad secretora como inmunidad mucósica.

Una homología de secuencias sustancial es una equivalencia funcional y/o estructural entre secuencias de nucleótidos o aminoácidos. Las diferencias funcionales y/o estructurales entre secuencias que tienen homología de secuencias sustancial es frecuentemente de mínimo.

Una planta transgénica es una planta que contiene y expresa ADN que no era preexistente en la planta antes de la introducción del ADN en la planta.

Un material de planta transgénica es cualquier materia de planta, incluyendo, aunque sin limitarse a ellos, células, protoplastos, tejidos, hojas, tallos, fruta y tubérculos naturales y elaborados, que contienen y expresan ADN que no era preexistente en la planta antes de la introducción del ADN en la planta. Además, el material de planta incluye derivados elaborados de ellos incluyendo, aunque sin limitarse a ellos, productos alimenticios, materias alimenticias, suplementos alimenticios, extractos, concentrados, píldoras, grageas, composiciones mascables, polvos, fórmulas, jarabes, bombones, galletas, cápsulas y pastillas.

Un material de planta comestible incluye una planta o cualquier material obtenido de una planta que es adecuado para ingestión por un mamífero u otros animales, incluyendo seres humanos. Se pretende que esta expresión incluya materias primas de plantas que pueden alimentarse directamente a animales o cualquier material de planta elaborado que se alimenta a animales, incluyendo seres humanos. Los materiales obtenidos de una planta se pretende que incluyan cualquier componente de una planta que se ingiera eventualmente por un ser humano u otro animal.

Una secuencia de retención de retículo endoplásmico (ER) es cualquier secuencia de ADN que codifica una secuencia de aminoácidos de la que se sabe que produce la retención de una proteína dada en, o asociada con, el retículo endoplásmico, tales como secuencias de ADN que codifican los aminoácidos KDEL, HDEL, SEKDEL y SEHDEL.

Una secuencia de señal de ER es cualquier secuencia de ADN que codifica una secuencia de aminoácidos de la que se sabe que produce el reconocimiento de una proteína dada por la partícula de reconocimiento de señal en el retículo endoplásmico, produciendo la localización de la proteína dentro del ER. Los ejemplos de secuencias de señal que dirigen proteínas recién sintetizadas al retículo endoplásmico en células de plantas incluyen lectina de cebada (Dombrowski JE, Schroeder MR, Bednarek SY, Raikhel NV, 1993, Plant Cell 5:587-596), aleuraína de cebada (Holwerda BC, Padgett HS, Rogers JC, 1992, Plant Cell 4:307-318), esporamina de batata (Matsuoka K, Nakamura K, 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:834-838), patatina (Sonnewald U, Braur M, von Schaewen A, Stitt M, Willmitzer L, 1991, Plant J. 1:95-106), proteínas de almacenamiento vegetativo de soja (Mason HS, Guerrero F, Boyer J, Mullet J, 1988, Plant Mol. Biol. 11:845-846), y \beta-fructosidasa (Faye L, Chrispeels MJ, 1989, Plant Physiol. 89:845-851).

Una holotoxina de LT es un complejo de proteína producido por E. coli enterotóxico o por organismos transgénicos que contienen el gen para LT-A y LT-B, tal como la propia enterotoxina o proteínas que contienen codones de sustitución para facilitar la transcripción de la planta mediante la sustitución de codones de aminoácidos preferidos de la planta por codones de aminoácidos preferidos bacterianos.

Una holotoxina de CT es un complejo de proteína producido por V. Cholerae o por organismos transgénicos que contienen el gen para CT-A y CT-B, tal como la propia toxina del cólera o proteínas que contienen codones de sustitución para facilitar la transcripción de la planta mediante la sustitución de codones de aminoácidos preferidos de la planta por codones de aminoácidos preferidos ricos en A y T bacterianos.

Una proteína de fusión de LT es una proteína en la que porciones de la subunidad LT-A o la subunidad LT-B o ambas subunidades de la toxina LT se han modificado para incluir regiones de codificación para secuencias de aminoácidos derivadas de otras proteínas antígenas o proteínas sintéticas u otras moléculas sintéticas diseñadas mímicas de la respuesta inmunógena de otras proteínas o agentes antígenos. Una proteína de fusión de CT se define análogamente excepto que las fusiones tienen lugar en una o ambas de las subunidades CT. Las proteínas de fusión preferidas son aquellas fusiones a la subunidad LT-B o CT-B que no interfieren con la oligomerización de la subunidad LT-B o CT-B en pentámero y/o fusiones de LT-A o CT-A que preservan esa porción de la proteína de LT-A o CT-A que se asocia con la subunidad B pentámera para formar la holotoxina intacta en la forma no modificada.

La presente invención proporciona una vacuna comestible que comprende una planta transgénica que comprende o expresa al menos una secuencia de ADN que codifica una proteína que contiene LT-B o CT-B, en la que la vacuna se diseña para obtener respuestas inmunes en animales incluyendo seres humanos. Esta invención proporciona también plantas transgénicas que comprenden o expresan al menos una secuencia de ADN que codifica una proteína que contiene LT-B o CT-B, que pueden usarse para producir vacunas que aumentan respuestas inmunes en mamíferos. Las plantas transgénicas de esta invención están especialmente diseñadas como vacunas o coadyuvantes de vacunas para administración oral y estimulación de respuestas inmunes en el GALT de animales incluyendo seres humanos.

La presente invención proporciona también una planta transgénica capaz de aumentar la respuesta inmune a antígenos, en la que la planta transgénica comprende o expresa una secuencia de ADN que codifica una proteína que contiene LT-B o CT-B. Las plantas transgénicas pueden incluir también elementos genéticos que codifican otros antígenos deseados capaces de obtener una respuesta inmune secretora en animales. Tales otros antígenos, cuando se presentan con plantas transgénicas que contienen antígenos de toxinas bacterianas de carácter coadyuvante pueden aumentarse además en su inmunogenicidad mediante el efecto coadyuvante de los antígenos de toxinas bacterianas transgénicos producidos por la planta.

La presente invención proporciona también métodos para administrar las vacunas de esta invención, métodos para producir las vacunas de la presente invención y métodos para preparar las plantas transgénicas de esta invención. Esto incluye las mejoras significativas e inesperadas de ocasionar la producción de niveles acrecentados de la proteína antígena y por compartimentación en vesículas microsómicas de plantas transgénicas de una proteína de LT-B activa oralmente que es altamente inmunógena, y por la expresión aumentada de tales antígenos bacterianos transgénicos en plantas mediante i) alteraciones en los promotores de la planta para aumentar el nivel de expresión de proteínas transgénicas en las plantas, ii) alteración de mensajes 3' y señales de poliadenilación para aumentar la producción de proteínas transgénicas en las plantas y iii) producción de genes sintéticos que codifican antígenos bacterianos, en los que se ha cambiado la utilización de codón para aumentar la utilización por plantas, aumentando así el nivel de proteínas transgénicas producidas en las plantas. Además, esto incluye el descubrimiento presente e inesperado de que la expresión de proteínas extrañas compartimentadas en tejidos de plantas transgénicas comestibles permite la expresión y entrega de antígenos deseados, adicionales, de valor como vacunas orales, puesto que la LT-B encapsulada en microsomas sirve como coadyuvante oral.

El método para preparar las plantas transgénicas de esta invención incluye transformar una planta objetivo con un vector de transformación de plantas que contiene al menos una secuencia de ADN que codifica una proteína que contiene LT-B o CT-B. La secuencia de ADN puede contener también elementos de ADN que codifican uno o más antígenos de colonización, antígenos de virulencia o un determinante antígeno de antígeno de virulencia o colonización de microorganismos patógenos.

Esta invención proporciona además vectores de transformación de plantas capaces de incorporación estable de al menos un gen de proteína que contiene LT-B o CT-B y regiones de promotor en plantas objetivo. Los vectores de transformación se preparan insertando una secuencia de ADN que codifica una proteína que contiene LT-B o CT-B y, opcionalmente, una o más secuencias de ADN que codifican otros antígenos, en los que el gen de LT-B o CT-B actúa como coadyuvante oral y se diseña para aumentar respuestas inmunes al antígeno expresado opcionalmente. Las secuencias de ADN pueden ser naturales o sintéticas y pueden comprender genes completos o fragmentos de genes que codifican antígenos. Adicionalmente, las secuencias de ADN pueden contener promotores funcionales de plantas y etiquetas genéticas diseñadas para hacer más fácil la identificación y selección de las células de plantas transformadas, y secuencias para compartimentación seleccionada en tejidos de plantas o constituyentes celulares deseados.

La presente invención proporciona también plantas transgénicas utilizables como vacunas orales o coadyuvantes de vacunas orales, en las que las plantas comprenden o expresan una secuencia de ADN que codifica una proteína que contiene LT-B o CT- B, secuencias que codifican proteínas que contienen componentes de LT-A o CT-A o componentes de proteína de LT-A y CT-A, y secuencias que codifican polipétidos o proteínas de señal celular y retención, en las que las proteínas de LT-B, CT-B, LT-A y/o CT-A pueden incluir fusiones de otros agentes antígenos. Adicionalmente, la secuencia de ADN puede incluir elementos codificantes para la expresión coordinada de otros antígenos de no LT o no CT. Además, la presente invención proporciona también la coexpresión y/o coprovisión de otros antígenos, tales como antígenos víricos, junto con antígeno de LT-B de tal modo que los antígenos adicionales pueden beneficiarse del efecto coadyuvante de la LT-B transgénica. Además, la presente invención proporciona la coexpresión de las subunidades LT-A y LT-B de tal modo que la holotoxina puede reunirse en el tejido de la planta para actuar como un inmunógeno y un coadyuvante.

La presente invención proporciona también una composición alimenticia útil para obtener respuestas inmunes que comprende una planta transgénica o un material derivado de la planta. La composición alimenticia puede incluir la propia planta transgénica, productos de alimentación elaborados de la planta, nutrientes, vitaminas, colorantes y/o saporíferos.

Descripción breve de las figuras

Las Figuras IA, IB e IC representan la estructura de los vectores pLTB140, pLTKI10 y pLTB110, respectivamente;

La Figura 2 representa niveles ELISA de proteínas de LT-B y LT-B-SEKDEL recombinantes en extractos solubles de plantas de tabaco y patata transgénicas transformadas con los vectores pLTBI10 y pLTK110;

La Figura 3 representa inmunoprecipitados de LT-B y LT-B-SEKDEL marcados radioactivamente (marcados LT-B-KDEL en la figura) de extractos de hojas de tabaco transgénico transformado con los vectores pLTBI10 y pLTK110;

La Figura 4 representa un cromatograma de exclusión por tamaños de las proteínas de LT-B-SEKDEL para hojas de tabaco transgénico;

La Figura 5 representa inmunogenicidad de extractos de hoja de tabaco transgénico (marcado LT-B-KDEL en la figura) cuando se alimentan oralmente a ratones Balb/c machos;

La Figura 6 representa respuesta inmune en ratones alimentados con tubérculos de patata que expresan LT-B-SEKDEL (marcado 110-1, 110-3, 110-4 y 110-7 en la figura);

La Figura 7 representa elementos reguladores no codificantes de vectores que pueden usarse para transformar plantas y conducen a la producción de la proteína de LT-B en las plantas resultantes;

La Figura 8 representa microtubérculos de patata de plantas de patata transformadas;

La Figura 9 representa tubérculos de patata obtenidos de transformantes seleccionados que llevan los vectores pLTB110 y pLTK110;

La Figura 10 representa detección de mARN que codifica LT-A y LT-B en transformantes que llevan los pLT100 y pLT101;

La Figura 11 representa la estructura de pLTB120, LT102, LT103, LT104, LT105 y LTK140;

La Figura 12 representa los segmentos de oligonucleótidos sintéticos, A1-A4, usados para crear el gen de LT-B sintético;

La Figura 13 representa el procedimiento de creación del conjunto A de fragmentos usados para crear el gen de LT-B sintético;

La Figura 14 representa los segmentos de oligonucleótidos sintéticos, B1-B4, usados para crear el gen de LT-B sintético;

La Figura 15 representa el procedimiento de creación del conjunto B de fragmentos usados para crear el gen de LT-B sintético;

La Figura 16 representa el procedimiento de creación del gen de LT-B sintético, que incluye la ligación de los conjuntos de fragmentos A y B; y

La Figura 17 representa LT-B que codifica mARN en hojas de tabaco (LTB120 y LTB112) y microtubérculos (LT100 y LT101).

Descripción detallada de la invención

La viabilidad de proporcionar vacunas por vía oral se ha descrito para la prevención de diarrea causada por bacterias. M. Lebens, S. Johansson, J. Osek, M. Lindbald, J. Holingren, Bio/Technology, 11:1574-578 (1993). La estimulación del GALT con un antígeno puede conducir al desarrollo de respuestas de anticuerpos protectores en el intestino y otros lugares mucósicos.

En comparación con las inmunizaciones parenterales, la inmunización oral con antígenos no viables es a menudo ineficaz para estimular una respuesta inmune y requiere habitualmente grandes cantidades de antígeno (mg frente a \mug en parenteral) para producir una respuesta inmune. Así, los candidatos de vacuna subunitaria oral actual evaluados requieren fermentadores a gran escala y métodos de purificación rigurosos para obtener cantidades suficientes de proteína recombinante para administración oral. Estos factores serán una consideración importante en costes de fabricación.

El pentámero de la subunidad B de toxina del cólera (CT-B) es capaz de incorporarse al gangliósido GM-1 del epitelio intestinal y causar translocación a través de la membrana epitelial de la misma manera que la enterotoxina lábil por calor de E. coli (LT-B). Así, se espera que cuando se administre oralmente toxina CT-B o LT-B con un antígeno sirva también como coadyuvante para aumentar la respuesta inmune protectora actuando como proteína "piloto" o "desencadenante" para obtener una respuesta inmune local.

La presente invención se dirige a la perfección y a posibilitar vacunas orales usando plantas transgénicas. A diferencia de la técnica anterior, la presente invención muestra las mejoras inesperadas, que son nuevas y necesarias, con el fin de inmunizar mediante plantas transgénicas. A diferencia de la técnica anterior, los inventores han demostrado aquí por primera vez que pueden alimentarse a animales plantas trasgénicas que expresan antígenos de vacunas orales candidatas en su tejido comestible, para causar la producción de antígenos que demuestran respuesta inmune humoral y mucósica específica. Además, los inventores se han aplicado por primera vez a la cuestión del uso de antígenos bacterianos transgénicos no sólo como inmunógenos por sí mismos, sino también como coadyuvantes para inmunógenos adicionales. Los inventores creen que plantas transgénicas que expresan proteínas de antígeno constituyen un sistema de producción y distribución económico para tales antígenos a animales.

La presente invención demuestra y evalúa críticamente este concepto expresando un gen que codifica un antígeno bacteriano en plantas transgénicas. El Escherichia coli enterotoxígeno (ETEC) es un agente etiológico muy reconocido de diarrea acuosa aguda que afecta a gente de todas las edades. La patogenicidad de ETEC es por colonización del intestino delgado y síntesis de una o más enterotoxinas, una de las cuales es la enterotoxina lábil por calor (LT). La holotoxina LT consiste en un pentámero de subunidades de unión (LT-B) y una subunidad activa enzimáticamente (LT-A).

Los inventores han demostrado con éxito que ADN que codifica LT-B con una secuencia de retención de retículo endoplásmico (ER) de SEKDEL en el término C aumenta sustancialmente la cantidad de LT-B y pentámero de LT-B en las células de la planta transformada. Además, los inventores han demostrado la mejora inesperada de que la expresión de antígenos bacterianos transgénicos en plantas puede aumentarse a niveles suficientes para que ellos actúen como inmunógenos y coadyuvantes mediante i) alteraciones en los promotores de la planta para aumentar el nivel de expresión de proteínas transgénicas en plantas, ii) alteración de mensajes 3' y señales de poliadenilación para aumentar la producción de proteínas transgénicas en plantas y iii) producción de genes sintéticos que codifican antígenos bacterianos en los que se ha cambiado la utilización del codón para aumentar la utilización por plantas, aumentando así el nivel de proteínas transgénicas producidas en las plantas. Los inventores creen que los niveles aumentados de pentámero de LT-B en las propias vesículas microsómicas de células transgénicas es un método preferido para inducir una respuesta inmune secretora en animales alimentados con tales células de plantas transgénicas. De manera análoga, pueden transformarse plantas con ADN que codifica la subunidad B de toxina del cólera (CT-B) como un gen quimérico que incluye la secuencia de codificación de SEKDEL.

Los inventores han encontrado que pueden prepararse vacunas capaces de obtener respuestas inmunes secretoras en animales a partir de plantas transgénicas que comprenden y expresan al menos una secuencia de ADN que codifica una proteína que contiene LT-B, en las que la proteína que contiene LT-B se expresa en cantidades suficientes para inducir formación de pentámero en la célula. Una composición digerible derivada de plantas transgénicas que expresan una proteína que contiene LT-B cuando se ingiere por ratones ocasiona una respuesta inmune que les hace producir inmunoglobilina que neutraliza la LT.

En una realización preferida, y mejora inesperada sobre la técnica anterior, los inventores han encontrado que la inclusión de un segmento de ADN que codifica aminoácidos adicionales en el término C de la secuencia de LT-B que codifica una secuencia de retención de retículo endoplásmico (ER) produce plantas transgénicas que conservan concentraciones aumentadas de la proteína que contiene LT-B dentro de la célula en forma de pentámero en vesículas que recirculan al ER. Las secuencias de retención de ER preferidas incluyen ADN que codifica KDEL (Lys-Asp-Glu-Leu) (SEQ ID NO: 1), HDEL (His-Asp-Glu-Leu) (SEQ ID NO: 2), SEKDEL (Ser-Glu-Lys-Asp-Glu-Leu) (SEQ ID NO: 3) y SEHDEL (Ser-Glu-His-Asp-Glu-Leu) (SEQ ID NO: 4) en las que se prefieren particularmente SEKDEL y SEHDEL. Los inventores esperan totalmente el mismo comportamiento en plantas transgénicas transformadas con genes de CT-B, y realmente con cualesquiera genes que tengan las mismas modificaciones del término C.

Adicionalmente, la presente invención se refiere a plantas transgénicas que pueden producirse mediante la incorporación estable o transitoria de ADN que codifica una proteína que contiene LT-B o CT-B en las que la proteína contiene una secuencia de LT-B o CT-B, una secuencia de señal de ER en el término N y una secuencia de retención de ER en el término C. Estos transformantes muestran una producción aumentada de la proteína de LT-B o CT-B con retención concurrente de las proteínas en vesículas de la célula. Los inventores han encontrado también que los transformantes preferidos son aquellos que tienen pentámeros de LT-B que son retenidos en las membranas microsómicas celulares en un "compartimento de salvamento". Los inventores esperan totalmente que los tejidos de la planta transformada con CT-B muestren también en las células pentámeros de CT-B.

Se piensa que la retención de las proteínas recirculando a través del compartimento de salvamento y el ER es un factor en el éxito de estas nuevas plantas transgénicas en vacunas comestibles para inducir respuestas inmunes secretoras en animales, incluyendo seres humanos.

En otra realización preferida de esta invención, la holotoxina LT puede producirse en plantas transformadas por incorporación estable o transitoria de ADN que codifica una proteína que contiene LT-B o CT-B y una proteína que contiene LT-A o CT-A. Nuevamente, las proteínas que contienen LT-B o CT-B preferidas son las que tienen modificaciones en el término C para incluir una secuencia de retención de ER, siendo particularmente preferidas proteínas que contienen LT-B o CT-B que tienen secuencias de señal de ER en el término N y secuencias de retención de ER en el término C. Se piensa que la presencia y retención de holotoxina en las células de la planta puede actuar como coadyuvante incluso mejor para respuesta inmune secretora aumentada en algunas circunstancias.

Adicionalmente, proteínas de fusión de la proteína que contiene LT-B o CT-B y la proteína que contiene LT-A pueden incorporarse estable o transitoriamente a células de plantas de tal modo que el pentámero de LT-B o CT-B y/o las holotoxinas de LT o CT modificados por fusión se formen y retengan en la célula en vesículas de recirculación de ER o vesículas de salvamento de ER. Se cree que estas vesículas se forman o brotan en la superficie de ER, pero, en lugar de migrar a la maquinaria celular que dirige las vesículas a otras partes de la célula, se recirculan las vesículas de vuelta al ER. Así, la fusión de un gen para un antígeno de colonización y/o virulencia dado a una secuencia N-terminal o C-terminal que codifica las subunidades de enterotoxina LT o las subunidades de toxina CT, puede usarse para aumentar respuestas inmunes a otros antígenos, tales como antígenos víricos tales como la proteína de cápsida de virus de Norwalk o antígenos del virus de la enfermedad de NewCastle. Por supuesto, las fusiones deben ser de tal naturaleza que no destruyan la capacidad para la unidad B de LT o CT de formar pentámeros o inhibir o prevenir su capacidad para unirse a gangliósido GM-1. Adicionalmente, para marcos de codificación de LT o CT que tienen elementos de LT-A o CT-A, las fusiones de subunidades A o B deben diseñarse de manera que la subunidad A pueda aún asociarse con la B, preferiblemente que la parte A1 de la subunidad A se conserve para facilitar la asociación en el término C de la subunidad A con el pentámero de la subunidad B para formar holotoxina LT o CT fusionada.

Además de la enterotoxina LT, pueden usarse también en la presente invención la toxina del cólera, la adhesión de proteína PapG que se une específicamente a alfa-D-galactopiranosil-(1,4)-beta-D-galactopiranósido, o las invasiones que causan penetración de bacterias a través de membranas celulares epiteliales como se identifica en un clon de Yersinia pseudotuberculosis, Shigella y Salmonella. Los inventores creen que la inclusión de secuencias de ADN que codifican LT-B, CT-B, LT-B y LT-A, o CT-B y CT-A, facilitarán el transporte a células de la mucosa intestinal de la fusión del gen de otros antígenos de vacunas y conducirá a respuestas inmunes mucósica y humoral aumentadas a los otros antígenos. Así, los pentámeros de LT-B o CT-B o los componentes de holotoxina de las proteínas de fusión deben actuar como coadyuvantes para aumentar la respuesta inmune a los antígenos fusionados, especialmente cuando los pentámeros de LT-B o CT-B o la holotoxina LT o CT se retienen en el compartimento de salvamento de las plantas transformadas.

Esta invención incluye plantas, semillas y tejido de plantas capaces de expresar al menos una secuencia de ADN que codifica una proteína que contiene LT-B o CT-B y opcionalmente otro antígeno, incluyendo antígenos de colonización y/o virulencia, y/o determinantes antígenos de los mismos y/o proteínas de fusión de los antígenos o determinantes de patógenos, composiciones útiles para el estímulo de una respuesta inmune secretora en un mamífero, métodos para estimular una respuesta inmune secretora en mamíferos para inhibir la colonización y/o invasión a través de superficies mucósicas por patógenos, vectores únicos que contienen secuencias de ADN que codifican antígenos de colonización o virulencia, y un método para producir antígenos de colonización o virulencia o microorganismos patógenos en plantas. Nuevamente, la secuencia de codificación de LT-B o CT-B incluye preferiblemente una secuencia de retención de ER en el término C y/o una secuencia de señal de ER en el término N.

Los antígenos de microorganismos patógenos adecuados para fusión con las subunidades LT-B o LT-A de la enterotoxina LT o las subunidades CT-B o CT-A de la toxina CT y expresados en plantas transgénicas de la presente invención incluyen, sin limitación, antígenos de colonización, antígenos de virulencia, determinantes antígenos de antígenos de virulencia o antígeno de colonización, o una proteína de fusión que contiene el antígeno o su determinante.

Adicionalmente, la presente invención se dirige a la coexpresión de antígenos de microorganismos patógenos con al menos ADN que codifica LT-B o CT-B que contienen secuencias de retención de ER en el término C. Los determinantes antígenos adecuados para coexpresión en las plantas transgénicas de la presente invención incluyen, sin limitación, antígenos de colonización, antígenos de virulencia, determinantes antígenos de antígenos de vurulencia o antígeno de colonización, o una proteína de fusión que contiene el antígeno o su determinante.

Además, esta invención se dirige también a la transformación de plantas o tejidos de plantas con secuencias de ADN sintético que codifican LT-B y/o LT-A y/o CT-B y/o CT-A, en las que los codones de aminoácidos preferidos de la planta se han reemplazado sistemáticamente por codones de aminoácidos preferidos bacterianamente. Este reemplazamiento o sustitución de codones preferidos de la planta por el codón preferido de bacteria correspondiente aumenta además la expresión por la planta transgénica de las proteínas de LT-B y/o LT-A y/o CT-B y/o CT-A y/o facilita la expresión de la proteína en una parte particular de la planta.

La presente invención se refiere también a un sistema inmunógeno que comprende un tejido de planta transformada genéticamente y un agente antígeno, en el que el tejido comprende o expresa una secuencia de ADN que codifica uno o más agentes inmunógenos, en el que el tejido es capaz de inducir una respuesta inmune a los agentes inmunógenos expresados en animales suficiente para inmunizar a los animales contra los agentes cuando se administra al animal el material de planta por ingestión oral.

La presente invención se refiere también a un alimento que comprende al menos una porción de un material de planta transgénica que comprende o expresa una secuencia de ADN que codifica uno o más agentes inmunógenos, en el que el material es capaz de inducir una respuesta inmune a los agentes inmunógenos expresados en animales suficiente para inmunizar a los animales contra los agentes cuando se administra al animal el material de planta por ingestión oral.

La presente invención se refiere también a un vector plásmido para ocasionar transformación genética de células de plantas para producir una planta que comprende o expresa secuencias que codifican uno o más agentes inmunógenos, en el que los agentes son capaces de inducir una respuesta inmune en animales suficiente para inmunizar a los animales contra los agentes cuando se administra al animal el material de planta que lleva el vector por ingestión oral.

La presente invención se refiere también a un fragmento de ADN útil para transformación por bombardeo de micropartículas de células de plantas para producir una planta que comprende o expresa una secuencia de ADN que codifica uno o más agentes inmunógenos, en el que los agentes son capaces de inducir una respuesta inmune en animales suficiente para inmunizar a los animales contra los agentes cuando se administra al animal el material de planta que lleva el fragmento por ingestión oral.

La presente invención se refiere también a un protocolo inmunológico que comprende administrar una dosis oral suficiente de un sistema inmunógeno que comprende una planta transgénica que expresa una secuencia de ADN que codifica uno o más agentes inmunógenos, en el que el sistema es capaz de inducir una respuesta inmune a los agentes inmunógenos expresados en el animal suficiente para inmunizar a los animales contra los agentes.

La presente invención se refiere también a un método para producir una vacuna o coadyuvante de vacuna que comprende las etapas de construir un vector plásmido o un fragmento de ADN enlazando operablemente una secuencia de ADN que codifica uno o más agentes inmunógenos, en el que el material es capaz de inducir una respuesta inmune a los agentes inmunógenos expresados en animales suficiente para inmunizar a los animales contra los agentes y un promotor funcional en plantas enlazado operablemente a la secuencia de ADN capaz de dirigir la expresión de los agentes en una planta, transformar una célula de planta con el vector o fragmento de ADN para producir una planta transgénica, desarrollar la planta transgénica y preparar una dosis de efecto de la planta transgénica para alimentar a animales.

La presente invención se refiere también a un vector plásmido para transformar una planta que comprende una secuencia de ADN que codifica una proteína que contiene LT-B o CT-B sintética diseñado para sustituir codones de aminoácidos preferidos de la planta por codones de aminoácidos preferidos bacterianos en región de codificación de LT-B o CT-B y un promotor funcional en plantas enlazado operablemente a la secuencia de ADN capaz de dirigir la expresión de la proteína en la planta. Una secuencia de ADN diseñada específica para la planta de LT-B preferida se muestra en el Ejemplo 20.

A. Descripción breve de datos experimentales

Los inventores construyeron vectores de expresión de LT-B (pLTB110 y pLTB140) y vectores de expresión de LT-B-SEKDEL (pLTK110 y pLTK140) para transformación de plantas. Los vectores 110 contienen el promotor de 35 S, mientras que los vectores 140 contienen el promotor de patatina. Los vectores se construyeron ligando el gen de LT-B 5' de terminador de proteína de almacenamiento vegetativo de soja (VSP-ter) al vector plBT200. Los vectores LTB110 y pLTK110 se construyeron para contener una cassette de expresión de plantas que incluye un promotor de nopalina sintasa (Nos-pro), una región de codificación de neomicina fosfotransferasa (NPT II) para resistencia a canamicina, un lugar de poliadenilación de nopalina sintasa (Nos-ter) y un promotor de 35 S de virus del mosaico de la coliflor (CaMV) enlazado a la secuencia líder de TEV (virus de corrosión del tabaco) 5' no traducida que actúa como amplificador de traducción. Esta cassette de expresión se clonó en el vector de expresión pBI101 (disponible de Clonetech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA) para obtener el vector pLTB110 objetivo. Para la formación de un vector de expresión (pLTK110) que contenía un gen de LT-B con una secuencia de retención de retículo endoplásmico, la construcción anterior se modificó adicionalmente por un oligómero para la región de codificación del polipéptido SEKDEL ligado en el lugar SpeI del gen de LT-B.

Los experimentos de transformación de plantas se realizaron usando un sistema de disco de hoja con Agrobacterium tumefaciens como agente de transferencia del gen. Se regeneraron retoños de callos transformados en medio que contenía el antibiótico canamicina para selección. Estos retoños se arraigaron y trasplantaron a tierra para propagación.

Puesto que la transformación mediada por Agrobacterium de células de plantas produce una inserción nuclear aleatoria del ADN de transferencia (T-ADN), se esperaba que los transformantes individuales tuvieran niveles variables de expresión de genes debido a los efectos posicionales cromosómicos, pero todos inesperadamente más altos que la técnica anterior debido al diseño de expresión mejorada de la presente invención. La expresión del gen que codifica LT-B en transformantes de plantas de tabaco o patata se ensayó por manchas de Northern y se cuantificaron por ELISA los niveles de proteínas recombinantes. Se seleccionaron para estudios adicionales los transformantes que expresaban alto nivel de LT-B. Generalmente, se prefirieron en el proceso de selección niveles de expresión de LT-B entre alrededor de 1 y aproximadamente 15 \mug por gramo de proteína soluble total. Es necesario un nivel suficientemente alto de expresión de antígeno en las células de transformantes para asegurar que los niveles de antígeno están por encima del nivel umbral para obtener una respuesta inmune en animales cuando el material de planta transgénica se consume como alimento por un animal.

Con el fin de facilitar este proceso de selección, los inventores han descubierto y perfeccionado un conjunto de nuevos procedimientos para identificar los transformantes de patata raros que muestran los niveles suficientemente altos de expresión de un antígeno dado tal como LT-B para producir la respuesta inmune deseada cuando se presenta apropiadamente a un animal.

Por inspección visual de la estructura cristalina de pentámero de LT-B, los inventores razonaron que el término C de LT-B en el pentámero puede estar suficientemente expuesto a la superficie de la proteína para permitir una ingeniería genética selectiva. La ingeniería se diseñó para incorporar una secuencia de retención de ER tal como KDEL al término C del gen de LT-B con la esperanza de que la secuencia de retención de ER incorporada no interfiriera con el pliegue y oligomerización de la proteína y produjera posiblemente la formación de pentámeros de LT-B con retención de retículo endoplásmico aumentada. Los estudios de proteínas de fusión previos han demostrado una expresión con éxito de péptidos en el término C de LT-B, en los que se conservaba la conformación de la LT-B y del péptido. F. Schodel, H. Will, S. Johansson, J. Sanchez, J. Holmgren, Gene. 99, 225 (1991); T.O. Nashar, T. Amin, A. Marcello, T.R. Hirst, Vaccine. 11, 235 (1993); L. Cardenas y J.D. Clements, Infect-Immun. 61, 4629 (1993). Sin embargo, se ha mostrado que otras proteínas de fusión interfieren con formación de pentámero de LT-B o interfieren con formación de holotoxina.

Para confirmar la incorporación estable de secuencias que codifican antígeno en plantas transgénicas, los inventores usaron un vector (pLTK110) que codifica una proteína de fusión de LT-B-SEKDEL, construida generalmente ligando un oligonucleótido que codifica aminoácidos SEKDEL en el término caboxi del gen de LT-B. Las plantas transformadas con este vector mostraban niveles significativamente elevados de la proteína recombinante, en comparación con los niveles de LT-B de plantas transformadas con un vector (pLTB110) que carecía de modificación en el término C. Las plantas de tabaco que expresaban LT-B-SEKDEL acumularon de 4 a 14 \mug por gramo de proteína soluble total; un nivel sustancialmente más alto como media que las plantas que expresan LT-B. Por supuesto, la construcción del vector que incorpora estas secuencias de retención de ER alternativas incluiría la secuencia de ADN que las codifica en lugar de la secuencia de ADN que codifica SEKDEL en el término C.

Para investigar la oligomerización de LT-B y LT-B-SEKDEL, se analizaron los inmunoprecipitados de hojas radiomarcadas de plantas de tabaco transformadas. Este análisis mostró que los transformantes dieron migraciones de proteínas similares en comparación con proteína sintetizada bacterianamente.

Adicionalmente, la señal en la que migra el monómero aumentó cuando se hirvió la muestra antes de pasarse por SDS-PAGE. Este aumento de la señal del monómero indica que la proteína de fusión de LT-B-SEKDEL no se oligomeriza realmente dentro de las células transformantes y que los oligómeros de LT-B o LT-B-SEKDEL se disocian en monómeros de manera similar a la rTL-B producida por bacterias (proteína purificada de E. coli que la expresa de un plásmido recombinante).

El perfil de filtración en gel de la muestra de planta fue también el mismo que el de la proteína derivada bacterianamente. Ambas proteínas eluyeron con un peso molecular aparente de 38 kDa, como se ha mostrado previamente para el pentámero de LT-B que indica la similitud de la estructura cuaternaria de las proteínas expresadas en sistemas bacterianos o de plantas.

Para determinar la inmunogenicidad de LT-B-SEKDEL derivada de plantas cuando se alimenta oralmente, se dio por sonda a ratones Balb/c un extracto soluble de las hojas de tabaco que expresan la LT-B-SEKDEL. Se dio a otro grupo de ratones rLT-B purificada de E. coli que expresa el antígeno de un plásmido recombinante. Se administró a cada ratón por sonda una dosis equivalente de antígeno (determinada por ELISA) de 12,5 \mug. Se examinaron para anticuerpos por ELISA las respuestas de anticuerpos del suero y mucósicos. Se detectaron anticuerpos anti LT-B en extractos del suero así como mucósicos de los ratones sacrificados. Se encontraron respuestas de anticuerpos del suero y mucósicos a rLT-B en ratones a los que se dio los extractos de plantas o proteína derivada de bacterias.

Se realizaron ensayos de neutralización de toxinas para determinar la naturaleza protectora de los anticuerpos obtenidos en ratones por las muestras derivadas de plantas. Los anticuerpos del suero y mucósicos (humoral y secretor) de animales inmunizados oralmente con tejido de plantas transformadas con LT-B-SEKDEL eran capaces de neutralizar la actividad biológica de LT en la misma extensión que anticuerpos del suero y mucósicos de animales inmunizados oralmente con una dosis equivalente de antígeno de rLT-B.

El tabaco fue el sistema de ensayo inicial de los inventores porque se ha utilizado extensamente como modelo de expresión transgénica. No obstante, puesto que las hojas del tabaco son ricas en alcaloides tóxicos, era deseable trabajar con un sistema de planta del que pudiera alimentarse a los animales en forma no modificada el tejido comestible que expresa el antígeno de la vacuna.

Para evitar problemas de toxicidad con alcaloides, se transformaron patatas porque pueden obtenerse tubérculos de plantas transformadas en un período de tiempo corto y se aceptan fácilmente por los ratones como alternativas a mezclas alimenticias de laboratorio. Se transformaron explantes de hojas de la variedad de patatas desarrollada axénicamente "FL1607", H. Wenzler, G. Mignery, G. May, W. Park, Plant Science 63, 79 (1989), con A. tumefaciens que albergaba pLTB110 y pLTK110. Se seleccionaron transformantes y se analizaron los tubérculos. Los niveles de las LT-B o LT-B-SEKDEL variaban de 2 a 30 \mug por gramo y de 60 a 110 \mug por gramo de proteína soluble total respectivamente, lo que representa un nivel superior de expresión de aproximadamente el 0,01% de la proteína soluble extraña.

Cuando se alimentaron los tubérculos a ratones dieron una respuesta inmune similar a la de las hojas de tabaco transformadas, confirmando la hipótesis de los inventores de que cuando se alimenta tejido comestible que expresa antígeno en forma no modificada puede inducir una respuesta inmune.

Los ratones alimentados con los tubérculos testigo (no transformados) no desarrollaron tal respuesta. También se muestran respuestas de animales alimentados con una dosis equivalente de antígeno de LT-B expresada bacterianamente soluble. Estos datos demuestran la viabilidad de usar plantas transgénicas como sistemas de expresión y distribución de inmunógenos orales para obtener una respuesta inmune, alimentando simplemente los tejidos comestibles. Es especialmente significativo porque el inmunógeno estaba aún asociado con el otro material de planta que no estaba modificado en modo alguno.

Tomados conjuntamente, los resultados de los inventores demuestran la expresión y producción con éxito de proteína de fusión de LT-B y LT-B-SEKDEL en plantas. La rLT-B derivada de plantas muestra propiedades análogas a la LT-B bacteriana. Es antígena y se une a gangliósido G_{M-1}, su ligando natural en el epitelio intestinal. Se ha demostrado también la eficacia del tejido de plantas transgénicas como inmunógeno oral cuando se alimenta a ratones. Ésta es la primera demostración de que los antígenos expresados en plantas transgénicas conservan propiedades inmunógenas y son inmunógenos activos oralmente.

Los siguientes ejemplos sirven para ilustrar la práctica de la invención con más detalle.

Ejemplo 1

Este ejemplo ilustra la construcción de vectores plásmidos de expresión que contienen una región de codificación de LT-B.

Se obtuvieron plásmidos (pDF82 y pJC217) que contenían las regiones de codificación para las subunidades A y B de la enterotoxina lábil por calor (LT) de E. coli del Dr. John D. Clements, Tulane University School of Medicine, New Orleans, LA. El pDF82 (Clements et al. Infect. Immunity, 40, 653 (1983)) contiene las secuencias de codificación de LT-A y LT-B en una configuración superpuesta en un fragmento de PstI clonado en pBR322. El pJC217 contiene la secuencia de codificación de LT-B en un fragmento de HindIII de 777 pb de pDF82, subclonado en el lugar HindIII de pUC8.

Se modificó el término C de la región de codificación de LT-B para contener los aminoácidos Ser-Glu-Lys-Asp-Glu-Leu (SEKDEL) de la siguiente forma. Se digirió el pJC217 con SpeI, que corta en el lugar de terminación de la traducción, y se ligó con un fragmento de ADN sintético obtenido reasociando los siguientes oligonucleótidos:

5'-CTCTGAGAAAGATGAGCTATGA-3' (SEQ ID NO: 5), y

5'-CTAGTCATAGCTCATCTTTCTCAGAG-3' (SEQ ID NO: 6).

El restante término de SpeI libre se digirió con nucleasa de judía mungo a un extremo romo, y se circularizó el plásmido para formar pLTK217. El extremo 3' del término C modificado se lee así (el lugar SpeI está subrayado):

1

en las que la línea superior muestra la secuencia de nucleótidos y la línea inferior muestra la correspondiente secuencia de aminoácidos.

Las regiones de codificación de LT-B y las secuencias flanqueantes del no modificado (pJC217) y modificado con SEKDEL C-terminal (pLTK217) se subclonaron en pBluescript KS (Stratagene, La Jolla, CA) usando EcoRI y HindIII para dar pLTB10 y pLTK10, respectivamente. Los lugares EcoRI en pLTB10 y pLTK10 se destruyeron haciéndolos romos con nucleasa de judía mungo y se recircularon para dar pLTB11 y pLTK11, respectivamente. Se excindieron después las secuencias de codificación de pLTB11 y pLTK11 con BamHI y DraI, y se ligaron en pIBT200 digerido con BamHI y SmaI, para formar pLTB200 y pLTK200, respectivamente.

El pLTB200 contiene elementos reguladores necesarios para expresión en células de plantas de secuencias de codificación insertadas, y se construyó como sigue. Un fragmento de 576 pb que contenía una señal de poliadenilación de la región flanqueante 3' del gen vspB de soja (Mason et al., Plant Cell, 5, 241 (1993)) se ligó en los lugares SacI y EcoRI de pUC19 (Gibco-BRL, Bethesda, MD) para dar pUC-V. Se obtuvo un fragmento de 950 pb que contenía el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor con amplificador duplicado fusionado al virus de la corrosión del tabaco 5'-UTR (líder TEV) por digestión de pRTL2-GUS (Carrington et al., Plant Cell, 3, 953 (1991) con NcoI, haciendo romos los extremos resultantes con nucleasa de judía mungo, y digestión con HindIII. El fragmento resultante se insertó en pUC-V digerido con SmaI y HindIII para dar pIBT200, que contiene un polienlazador que lleva los lugares BamHI, SmaI, KpnI y SacI entre el promotor 35S-líder TEV y el extremo 3' vspB, para inserción de secuencias de codificación extrañas para expresión en células de plantas.

Se modificó el lugar de de iniciación de la traducción de LT-B para contener un lugar NcoI, usando una reacción en cadena de polimerasa (PCR) y cebadores mutágenos. Se obtuvo un fragmento de 68 pb que comprende el extremo 5' de la secuencia de codificación de LT-B por PCR usando como plantilla pDF82 y los siguientes cebadores:

5'-GGGGCCATGGTTAAAGTAAAATGTTATGTTTTA-3' (SEQ ID NO: 8), y

5'-AGACTGGGGAGCTCCGTATG-3' (SEQ ID NO: 9).

El lugar NcoI está subrayado.

El fragmento de PCR resultante se digirió con NcoI y SacI y se ligó en pIBT210.1 digerido de modo similar, para dar pLTB5'.

El pIBT210.1 es similar al pIBT200, excepto que su polienlazador lleva los lugares NcoI, BamHI, SmaI, KpnI y SacI. Se construyó como sigue. La fusión promotor 35S-líder TEV de pRTL2-GUS se modificó para separar el lugar EcoRI en la unión promotor-líder llenando con enzima de Klenow, y recirculando para dar pRTL4. Se digirió pRTL4 con NcoI, y los extremos resultantes se hicieron romos llenando con enzima de Klenow, y el ADN resultante se digirió con HindIII para liberar el fragmento promotor-líder. De manera similar, el pUC-V se digirió con BamHI y los extremos resultantes se hicieron romos llenando con enzima de Klenow, y el ADN resultante se digirió con HindIII. El vector pUC-V y el fragmento promotor pRTL4-líder preparado así se ligaron para formar pIBT210.1.

El extremo 5' modificado de LT-B en pLTB51 se combinó después con los extremos 3' no modificado (pLTB200) y modificado (pLTK200) de la secuencia de codificación como sigue. Se digirieron con SacI pLTB200 y pLTK200 para obtener los fragmentos de la secuencia de codificación del extremo 3', que se ligaron separadamente en pLTB5' digerido con SacI, para dar pLTB210 y pLTK210, respectivamente. Estos plásmidos contienen la secuencia de codificación de LTB con extremo 5' modificado y los extremos 3' no modificado (pLTB210) o modificado (pLTK210) entre el promotor 35S-líder TEV y la señal de poliadenilación vspB y la región flanqueante 3'.

Las cassettes de expresión en pLTB210 y pLTK210 se transfirieron al vector pBI101 de T-ADN de Agrobacterium (Clonetech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA) digiriendo con HindIII y EcoR1, y ligando con pBI101 digerido de igual modo para dar pLTB110 y pLTK110, respectivamente. Así, pLTB110 y pLTK110 contienen las secuencias de codificación de LT-B con un extremo 5' modificado y extremos 3' no modificado (pLTB110) o modificado (pLTK110), situadas entre el promotor 35S- líder TEV y la señal de poliadenilación vspB y la región flanqueante 3', todo dentro de los límites de T-ADN de pBI101, permitiendo la transferencia de las cassettes de expresión al ADN nuclear de células de plantas por transformación mediada por Agrobacterium, y selección de transformantes en medios que contienen canamicina.

Se construyó una modificación adicional de pLTB110 por sustitución del promotor 35S por promotor de patatina de patata. El promotor de patatina de pPS20 (Wenzler et al., Plant Mol. Bio., 12, 41 (1989)) se obtuvo por digestión de pPS20 con BamHI, seguido por llenado parcial con enzima de Klenow y dGTP y dATP sólo. El ADN resultante se digirió con HindIII para liberar el fragmento del promotor de 2,3 kpb. Se digirió pLTB110 con XhoI, seguido por llenado parcial de la enzima de Klenow y dCTP y TTP sólo, y se digirió finalmente con HindIII. El fragmento de vector pLTB110 se purificó libre del fragmento de promotor 35S liberado así, y el vector resultante se ligó con el fragmento de promotor de patatina preparado como se ha descrito antes, para dar pLTB140.

Se hace una construcción similar (que contenía el término C SEKDEL modificado) por sustitución de pLTB110 por pLTK110 en el párrafo precedente.

Las estructuras de pLTB140 y pLTK110 se muestran en las Figuras 1A y 1B, respectivamente, mientras que la estructura de pLTB110 se muestra en la Figura 1C.

Ejemplo 2

Este ejemplo ilustra la construcción de vectores plásmidos de expresión que contienen una región de codificación de LT-A.

Se modificó el lugar de iniciación de la traducción de LT-A para contener un lugar NcoI, usando reacción en cadena de polimerasa (PCR) y cebadores mutágenos. Se obtuvo por PCR un fragmento de 88 pb que comprende el extremo 5' de la secuencia de codificación de LT-A usando pDF82 como plantilla y los cebadores:

5'-GGGGCCATGGTTAAAAATATAACTTTCATTTTT-3' (SEQ ID NO: 10), y

5'-ATCTGGGGGTCTAGAGTC-3' (SEQ ID NO: 11).

El lugar NcoI está subrayado.

El fragmento de PCR resultante se digirió con NcoI y XbaI, y se ligó con pRTL4 del Ejemplo 1 digerido de igual modo para dar pLTA5'. Este plásmido contiene el promotor 35S-líder TEV fusionado al extremo 5' modificado de la secuencia de codificación de LT-A, cuyo fragmento se obtuvo por digestión de pLTA5' con HindIII y XbaI, y se ligó con pUC-V digerido de igual modo para dar pLTA210.5. El extremo 3' de la secuencia de codificación de LT-A se obtuvo por digestión de pDF82 con XbaI y SacI, y se ligó con pLTA210.5 digerido de igual modo para dar pLTA210. Así, pLTA210 contiene la secuencia de codificación de LT-A con un extremo 5' modificado situado entre el promotor 35S-líder TEV y la señal de poliadenilación vspB y región flanqueante 3'.

La cassette de expresión en pLTA210 se transfirió al vector pIBT100 de T-ADN de Agrobacterium, que se había construido como sigue. Se digirió pIBT200 del Ejemplo 1 con HindIII y EcoRI para dar un fragmento que contenía el polienlazador (BamHI, SmaI, KpnI, SacI) entre el promotor 35S-líder TEV y el extremo 3' de vspB, que se ligó con pBI101 digerido de igual modo para dar pIBT100. Se digirió pLTA210 con Xhol y SacI para dar un fragmento que contenía el líder TEV-secuencia de codificación de LTA, que se ligó con pIBT100 digerido de igual modo para dar pLTA110. Así, pLTA110 contiene la secuencia de codificación de LT-A con un extremo 5' modificado situado entre el promotor 35S-líder TEV y la señal de poliadenilación vspB y región flanqueante 3', todo dentro de los límites de T-ADN de pBI101, permitiendo la transferencia de la cassette de expresión al ADN nuclear de células de plantas por transformación mediada por Agrobacterium.

Ejemplo 3

Este ejemplo ilustra la construcción de vectores para expresión coordinada de LT-A y LT-B.

Se describe aquí la construcción de plásmidos que permiten la expresión coordinada de LT-A y LT-B para el montaje de la holotoxina LT en células de tubérculode patata. Puesto que las subunidades A y B de LT se combinan en la relación 1:5, es necesario modular los niveles de transcripción para estos genes en plantas transgénicas para aproximarse a una relación similar de los mARNs para LT-A y LT-B en las células transformadas. Se ha hecho esto usando promotores que tienen diferentes actividades en tubérculos de patata para conducir la transcripción de las secuencias de codificación de LT-A y LT-B.

El extremo 5' de la secuencia de codificación de LT-A en pLTA210.5 se fusionó con dos promotores diferentes como sigue. En un caso, se truncó el promotor de patatina para contener sólo las 350 pb del terminal 3'. El fragmento de promotor de patatina HindIII/BamHI de 2,3 kb de pPS20 del Ejemplo 1 se subclonó en pUC19 para formar pUC-PS. El pUC-PS se digirió con XbaI y SalI, seguido por hacer romos los extremos llenando con enzima de Klenow y recirculando para excluir las 1,95 kb del terminal 5' del promotor de patatina, para producir pPSX. El promotor de patatina truncado de 350 pb se obtuvo por digestión de pPSX con BamHI, seguido por hacer romos los extremos llenando con enzima de Klenow, y finalmente digestión con HindIII, y se ligó con pLTA210.5 preparado por digestión con NcoI, seguido por hacer romos los extremos llenando con enzima de Klenow, y finalmente digestión con HIndIII. El pLTA-PX resultante contiene el promotor de patatina de 350 pb truncado fusionado al extremo 5' modificado de la secuencia de codificación de LT-A.

En el segundo caso, la secuencia de codificación de LT-A en pLTA210.5 se fusionó con una forma truncada del promotor vspB de soja. Un fragmento de promotor vspB de 1534 pb en pKS-vspBXP (Mason et al., Plant Cell, 5, 241 (1993)) se suprimió desde el extremo 3' hasta un punto 7 pb aguas arriba del codón de iniciación para vspB usando exonucleasa III y nucleasa de judía mungo, para producir pKS-vspBX\Delta10. Se obtuvo una supresión 5' de 665 pb digiriendo primero pKS-vspBX\Delta10 con KpnI, seguido por hacer romos los extremos con polimerasa de ADN T4, y finalmente digestión con HindIII, y se purificó el fragmento de 835 pb resultante. Este fragmento de promotor truncado se ligó con pLTA210.5 preparado por digestión con NcoI, seguido por hacer romos los extremos llenando con enzima de Klenow, y finalmente digestión con HindIII, para dar pLTA-VH, que contiene el promotor vspB de 835 pb truncado fusionado al extremo 5' modificado de la secuencia de codificación de LT-A.

El extremo 3' de la secuencia de codificación de LT-A se fusionó a la señal de poliadenilación de nopalina sintasa (NOS) como sigue. El fragmento XbaI/SacI de 756 pb de pDF82 (que contenía el extremo 3' de la secuencia de codificación de LT-A) se ligó junto con el fragmento SacI/EcoRI de 250 pb de pBI101 (que contenía la señal de poliadenilación NOS) y pBluescriptKS digerido con XbaI y EcoRI para dar pLTA-3N.

Las dos fusiones promotor-secuencia de codificación 5' diferentes se combinaron separadamente con la fusión de secuencia de codificación 3'-señal de poliadenilación NOS como sigue. Se digirieron pLTA-PX y pLTA-VH con HindIII y XbaI, y se purificaron los fragmentos promotor-secuencia de codificación 5'. Se digirió pLTA-3N con XbaI y SalI, y se purificó el fragmento secuencia de codificación 3'-señal de poliadenilación NOS. El fragmento HindIII/XbaI de pLTA-PX se ligó junto con el fragmento XbaI/SalI de pLTA-3N y se digirió pLTB110 del Ejemplo 1 con HIndIII y SalI para dar pLT101. De manera similar, el fragmento HindIII/XbaI de pLTA-VH se ligó junto el fragmento XbaI/SalI de pLTA-3N y se digirió pLT'B110 con HindIII y SalI para dar pLT100. Así, pLT101 y pLT100 contienen cassettes de expresión para LT-A y LT-B, bajo el control de diferentes elementos reguladores 5' y 3', todo dentro de los límites de T-ADN, permitiendo la inserción de la construcción en el ADN nuclear de células de plantas usando transformación mediada por Agrobacterium.

Construcción de pLT102 y pLT103

Más específicamente, esto describe la construcción de dos plásmidos para la expresión coordinada de LT-A y LT-B-SEKDEL en células de tubérculo de patata, para el montaje de una holotoxina LT recombinante en la que la subunidad B está modificada para contener una señal de retención microsómica en el término carboxi (SEKDEL). Los plásmidos resultantes, pLT102 y pLT103, son idénticos a pLT100 y pLT101, respectivamente, con la única excepción de que las secuencias de codificación de LT-B están modificadas para codificar SEKDEL en los extremos 3'.

LT-B-SEKDEL es un ejemplo de una proteína que contiene LT-B. LT-B-SEKDEL contiene al menos un dominio de aminoácidos que es sustancialmente homólogo a la secuencia de aminoácidos de proteínas LT-B y CT-B derivadas bacterianamente, siendo dicha homología de secuencias de aminoácidos de al menos aproximadamente 90%, y, además, LT-B-SEKDEL es sustancialmente similar funcionalmente a las LT-B o CT-B derivadas bacterianamente en unión a gangliósidos GM I.

Para construir pLT102, se digirió pLT100 con SpeI y SalI para liberar la fusión promotor de patatina-secuencia de codificación de LT-B, y se purificó el fragmento de vector de 12 kpb que contiene la cassette de promotor vspB-secuencia de codificación de LT-A- extremo 3' NOS en el lado SalI, y el extremo 3' vspB en el lado SpeI. El 5' TEV-UTR fusionado a la secuencia de codificación de LT-B modificada para codificar SEKDEL en el término carboxilo se obtuvo de pLTK210 del Ejemplo 1 por digestión con XhoI, seguido por llenado parcial con enzima de Klenow y dCTP y TTP sólo, y finalmente digestión con SpeI. El promotor de patatina de pPS20 (Wenzler et al., Plant Mol. Bio., 12, 41 (1989)) se obtuvo por digestión de pPS20 con BamHI, seguido por llenado parcial con enzima de Klenow y dGTP y dATP sólo, y finalmente digestión con SalI para liberar el fragmento de promotor de 2,3 kpb. Los tres fragmentos se ligaron entre sí para formar pLT102, mostrado en la Figura 11.

Para formar pLT103, se digirió pLT102 (descrito antes) con HindIII y SalI para liberar la cassette de expresión de LT-A y se purificó el fragmento de vector que contenía la cassette de expresión de LT-B-SEKDEL. La cassette de LT-A se reconstruyó por digestión de pLTA-PX (véase antes) con HindIII y XbaI para obtener el fragmento de 450 pb, y digestión de pLTA-3N (véase antes) con XbaI y SalI para obtener el fragmento de 700 pb. Los tres fragmentos se ligaron entre sí para formar pLT103, mostrado en la Figura 11.

Construcción de pLTK140

Este ejemplo describe la construcción de pLTK140, que es idéntico a pLTB140 del Ejemplo 1 con la única excepción de que la secuencia de codificación de LT-B está modificada para codificar SEKDEL en el extremo 3'. El plásmido pLT103 (Figura 11) se digirió con SalI para liberar la cassette de expresión de LT-A, seguido por religación del vector, para obtener pLTK140, mostrado también en la Figura 11. PLTK140 usa el promotor de patatina para conducir la expresión específica para tubérculo de LT- B-SEKDEL en plantas de patata.

Construcción de pLT104 y pLT105

El plásmido pLT104 se creó como una cassette bicistrónica para la expresión coordinada de LT-B y LT-B-SEKDEL, y pLT105, una cassette bicistrónica para la expresión coordinada de LT-A y LT-B, para una formación más eficaz de la holotoxina LT. Puesto que la asociación del polipéptido de LT-A con el pentámero de LT-B es ineficaz después de que los polipéptidos de LT-B se han agregado en el pentámero, una proximidad mayor de los polipéptidos plegables puede permitir una formación de holotoxina más eficaz. Por tanto, la traducción de LT-A y LT-B en mARNs separados puede no permitir una gran proximidad de los polipéptidos de LT-A y LT-B durante el pliegue, que podría ser proporcionado por traducción de LT-A y LT-B de un ARN simple que contuviera ambas secuencias de codificación. La estrategia enlaza el promotor de patatina a una fusión 5' TEV-UTR/LT-B-SEKDEL (pLT104) o 5' TEV-UTR/LT-B (pl.T105), seguido por una fusión 5' TEV-UTR/LT-A y el extremo 3' vspB. El mARN generado de esta construcción en células de tubérculo de patata contiene ambas secuencias LT-B-SEKDEL y LT-A.

Primero, se creó un lugar BamHI en el extremo 3' de la secuencia de codificación de LT-B-SEKDEL subclonando el fragmento SacI/SpeI de 300 pb de pLTK210 del Ejemplo 1 en pBluescriptKS (Stratagene) para dar pLTK-SS. Se digirió después pLTK-SS con BamHI, seguido por llenado parcial con enzima de Klenow y dGTP y dATP sólo, y el ADN resultante se digirió con SacI para obtener el fragmento de 300 pb. El fragmento 5' TEV-UTR/LT-A se obtuvo por digestión de pLTA210 del Ejemplo 2 con XhoI, seguida por llenado parcial con enzima de Klenow y dCTP y TTP sólo, y finalmente digestión con SacI. Estos dos fragmentos se ligaron después entre sí con pLTK140 que se había digerido con SacI y se purificaron para obtener el fragmento de vector, para dar pLT104, mostrado en la Figura
11.

El pLT105 se creó por ligación del fragmento SpeI/SalI de 2,8 kpb de pLTB140 del Ejemplo 1 con el fragmento de vector obtenido por digestión de pLT104 (este Ejemplo) con SpeI/SalI. El pLT105 se muestra en la Figura 11.

Ejemplo 4

Este ejemplo ilustra la construcción de vectores de expresión que expresan coordinadamente LT-A y LT-B que codifican secuencias modificadas para contener la secuencia de aminoácidos SEKDEL del término C.

Se hacen construcciones para la expresión coordinada de la secuencia de codificación de LT-A y LT-B modificada para contener la secuencia de aminoácidos SEKDEL C-terminal, simplemente usando pLTK110 en lugar de pLTB110 en las etapas finales del procedimiento descrito en el Ejemplo 3.

Ejemplo 5

Este ejemplo ilustra la construcción de vectores para la expresión coordinada de LT-B y otros antígenos.

Con el fin de ensayar la capacidad de LT-B para actuar como un estimulante o coadyuvante del sistema inmune cuando se expresa en células de plantas coordinadamente con otros antígenos y se alimenta a animales, se ha construido un vector plásmido que permite la expresión coordinada de LT-B junto con la proteína cápsida de virus de Norwalk (NVCP) (Jiang et al., J. Virol., 66, 6527 (1992)). Se construyó un plásmido de expresión para NVCP de manera similar a la descrita antes para pLTB140 del Ejemplo 1, para dar pNVI40, que contiene el promotor de patatina, líder TEV, secuencia de codificación de NVCP y señal de poliadenilación NOS.

Se purificó el fragmento SalI/SacI de pNV140 de 4,2 kb que contiene el promotor de patatina, líder TEV y secuencia de codificación de NVCP. Se purificó el fragmento HindIII/SpeI de 1,3 kb de pLTK210 del Ejemplo 1, que contenía el promotor 35S, líder TEV y secuencia de codificación de LT-B. Se purificó el fragmento SpeI/EcoRI de 0,6 kb de pLTK210, que contenía el vspB (secuencia de codificación de SEKDEL y la señal de poliadenilación). Estos tres fragmentos, SalI/SacI de pNV140, HindIII/SpeI de pLTK210 y SpeI/EcoRI de pLTK210, se ligaron entre sí con pBI101 digerido con HindIII y EcoRI para dar pLTK-NV. Así, pLTK-NV contiene una cassette de expresión de LT-B con la SEKDEL C-terminal modificada, y una cassette de expresión de NVCP, todas dentro de los límites de T-ADN, permitiendo la inserción de la construcción en el ADN nuclear de células de plantas usando transformación mediada por Agrobacterium.

Ejemplo 6

Este ejemplo ilustra la transformación de hojas de tabaco con un vector que contiene ADN que codifica una proteína de LT-B que tiene una secuencia de retención de ER SEKDEL en el término C, pLTK110.

Se movilizó primero el plásmido pLTK110 en Agrobacterium tumefaciens LBA4404 (Clonetech Laboratories, Palo Alto, CA) por el método de congelación- descongelación, An G. Meth, Enzymol. 153:292-305 (1987). Se aislaron clones transformados por selección en 50 mg/l de canamicina, y se preparó plásmido a partir de cultivos líquidos por lisis alcalina. La estructura de plásmidos de Agrobacterium se verificó por digestión con endonucleasa de restricción.

La técnica de transformación in vitro de plantas por el sistema de plásmido de Agrobacterium-Ti se basa en el cocultivo de tejidos o células de plantas y el Agrobacterium transformado durante aproximadamente dos días con transferencia subsiguiente de materiales de plantas a un medio selectivo apropiado. El material puede ser protoplasto, callo o tejido de órganos, dependiendo de la especie de planta. El cocultivo de órganos con fragmentos de hojas es un método conveniente.

Se transformaron hojas de tabaco usando un sistema de discos de hojas con Agrobacterium tumefaciens como agente de transferencia de gen. La transformación de discos de hojas se realizó según el procedimiento descrito en R.B. Horsch et al. en Plant Molecular Biology Manual A5, Kluwer 5 Academic Publishers, Dordecht (1988) p. 1-9. Se desarrollaron asépticamente plántulas de tabaco en cajas de cultivo de tejidos hasta 8-10 cm de altura. Se cortaron las hojas en pequeñas tiras o cuadrados para producir un borde herido.

Se precultivaron discos de hojas durante uno a dos días invertidos en medio MS104 para permitir el crecimiento inicial y eliminar los discos que se dañaron durante la esterilización o manipulación. Sólo se usaron para inoculación subsiguiente los discos de hojas que mostraban viabilidad como se evidenciaba por hinchazón. El A. tumefaciens que contenía pLTB110 o pLTK110 que se había desarrollado en medio YEP (10 g/l de bacto-peptona, 10 g/l de extracto de levadura, 5 g/l de NaCl) se diluyó de uno a diez con MSO para los discos de tabaco. Se inocularon discos de hojas por inmersión en el cultivo de A. tumefaciens transformado diluido y se cocultivaron en medio de regeneración MS104 durante tres días. Se lavaron después los discos de hojas con agua estéril para separar las células de A. tumefaciens libres y se pusieron en medio de selección MS reciente que contenía 100 \mug/ml de canamicina para seleccionar las células de plantas transformadas y 500 \mug/ml de carbenicilina para destruir todo A. tumefaciens restante. Se transfirieron después los discos de hojas a medio de selección MS reciente a intervalos de dos semanas. A medida que se formaban retoños en el borde de los discos de hojas y crecieron lo suficientemente grandes para manipulación manual, se cortaron (usualmente a las tres a seis semanas después del cocultivo con A. tumefaciens transformado) y se transfirieron a un medio inductor de raíces, por ejemplo, medio de arraigo MS. A medida que aparecían raíces, se permitió a las plántulas continuar el crecimiento en condiciones de cultivo de tejidos estériles o se transfirieron a tierra y se las dejó crecer en una cámara de ambiente controlado.

Ejemplo 7

Este ejemplo ilustra el análisis ELISA de extractos de plantas, específicamente extractos de hojas de tabaco, para la magnitud de expresión celular de la proteína de LT-B y LT-B-SEKDEL.

ELISA para LT-B en extractos de plantas: disuelto en gangliósido GM-X (Sigma, G2375) tampón carbonato (pH 9,6) se revistió sobre placas ELISA de poliestireno. Después de una hora de incubación a temperatura ambiente, se separó el tampón por lavado con PBST y se bloqueó en los pocillos la unión no específica con 5% de leche en PBST. Las muestras a ensayar se cargaron en los pocillos PBST por duplicados. Para obtener una curva patrón de cuantificación de LT, se cargaron en la misma placa diferentes diluciones de LT-B derivada bacterianamente. Las placas se lavaron con PBST después de una hora de incubación a temperatura ambiente. Se incubó en los pocillos durante una hora a temperatura ambiente antisuero de cabra a LT-B diluido 1:1000 en PBST y 2% de BSA. Después de lavar 4 veces con PBST, éste se sondó con antisuero de conejo contra IgG de cabra conjugado con fosfatasa alcalina (Sigma A7650), y se diluyó 1:200 en PBST y 2% de BSA. Después de lavar los pocillos con PBST, se incubaron con sustrato de fosfato de nitrofenilo en tampón de dietanolamina, pH 9,8. Después de incubar durante 10 a 30 minutos, se detuvo la reacción añadiendo NaOH, y se leyó la absorbancia a 410 nm.

Ejemplo 8

Este ejemplo ilustra el análisis ELISA de transformantes de plantas de tabaco para expresión de LT-B y LT-B-SEKDEL.

La expresión del gen que codifica LT-B en transformantes de plantas de tabaco se ensayó por cuantificación de los niveles de proteínas recombinantes por ELISA como se muestra en la Figura 2. Los niveles ELISA de proteína recombinante se determinaron a partir de extractos de proteína solubles de transformantes de tabaco independientes (marcados "A" en la Figura 2) que llevan la región de codificación de LT-B nativa (barras claras) o la región de codificación de LT-B-SEKDEL (barra oscura) con una secuencia de retención de ER Ser-Glu-Lys-Asp-Glu-Leu (SEKDEL) en el término C del gen de LT-B. Los extractos de los transformantes de tabaco en PBST (solución salina tamponada con fosfato, PMSF 2 mM, ascorbato 20 mM y 0,05% de TWEEN) se centrifugaron a 12.000 x g y se ensayaron los sobrenadantes obtenidos por ELISA dependiente de gangliósido del Ejemplo 7. Los 4 transformantes que mostraban los niveles de antígeno más altos después de sustraer el fondo se muestran en la Figura 2A.

Ejemplo 9

Este ejemplo ilustra el análisis de inmunoprecipitación de anticuerpos anti-LT-B de transformantes de tabaco que contienen genes que codifican LT-B y LT-B-SEKDEL.

La Figura 3 muestra un radiograma de inmunoprecipitados usando anticuerpos contra LT-B. Se usaron inmunoprecipitados de extractos de hojas de tabaco transgénico radiomarcados que expresan LT-B (pistas 1 y 2), LT-B-SEKDEL (pistas 3 y 4) o plantas testigo negativas (pistas 5 y 6). Se cortaron hojas y se realizó absorción peciolar de Met y Cys marcados con 35S durante 2 horas a temperatura ambiente e iluminación de 5380 Lux. Se homogeneizaron las hojas en un triturador de tejidos PYREX-Ten Broeck con una holgura de 0,15 mm y se extrajo en tampón IP (Tris 50 mM, pH 7,5, NaCl 0,2 M, EDTA 2 mM, PMSF 2 mM, DTT 5 mM, 0,1% de BSA y 1% de Triton X 100). Los extractos se centrifugaron a 12.000 x g durante 10 minutos y se inmunoprecipitó el sobrenadante, (Mason et al., Plant Mol. Biol. 11, 845-856 (1988)), se eluyó en muestra de Laemmli calentada en un baño de agua hirviendo durante 5 minutos (+) y se hizo pasar en un gel de poliacrilamida del 15% de SDS. La migración de patrones de proteína de intervalo de pesos moleculares amplio precoloreados con Bio-Rad se indica a la izquierda. La migración de proteína sintetizada bacterianamente era similar a LT-B-SEKDEL.

Ejemplo 10

Este ejemplo ilustra el análisis de las proteínas de LT-B-SEKDEL en transformantes de tabaco por cromatografía de exclusión por tamaños diseñada para demostrar la oligomerización de la proteína en células transformantes.

Se prepararon extractos de células transformantes de tabaco y se analizaron por cromatografía de exclusión por tamaños. Se extrajeron hojas de plantas de tabaco transgénicas para LT-B-SEKDEL con PBS 1% de Triton X-100, PMSF 2 mM y ascorbato 20 mM. Después de centrifugar a 12.000 x g, se cargó el sobrenadante en una columna de Sephacryl® 200 y se eluyó con Tris.HCl 50 mM, pH 7,5, NaCl 200 mM, EDTA 20 mM, PMSF 2 mM, 0,05% de Triton X-100. Se recogieron fracciones y ensayaron por ELISA de LT-B dependiente de gangliósido (perfil de D.E. 405). Un cromatograma representativo se muestra en la Figura 4. Las flechas de la Figura 4 marcan las posiciones del volumen hueco (Vo), y patrones de tamaños moleculares. El pico de antígeno principal eluía a Mr 38 kDa, coincidente con la posición de rLF-B de E. coli.

Ejemplo 11

Este ejemplo ilustra la preparación de extractos de hojas de tabaco para administración a ratones a fin de inducir respuestas inmunes secretoras en ratones GALT a la proteína de LT-B que contiene una secuencia de retención de ER SEKDEL en el término C (LT-B-SEKDEL).

Se congelaron en nitrógeno líquido hojas de tabaco que expresaban LT-B o LT-B-SEKDEL y se homogeneizaron en una batidora. La proteína soluble se extrajo en PBST, ascorbato 40 mM, EDTA 20 mM y PMSF 1 mM. Los restos de células de plantas insolubles se separaron por centrifugación a 15.000 x g. Este extracto de plantas se precipitó con sulfato amónico del 40% a 4ºC. El sobrenadante obtenido después de centrifugar a 15.000 x g se precipitó adicionalmente a una concentración final de sulfato amónico del 60% a 4ºC, y el precipitado obtenido así después de centrifugar a 15.000 x g se solubilizó en PBS y se usó para estudios de inmunización oral.

Ejemplo 12

Este ejemplo ilustra la inducción de un suero anti-LT-B y respuestas inmunes mucósicas en ratones después de ser alimentados con extractos de plantas de tabaco transformadas con un vector que codifica la proteína de LT-B-SEKDEL.

Se dio a ratones Balb/c un extracto soluble de las hojas de plantas de tabaco del Ejemplo 10 que expresan la LT-B-SEKDEL. Se dio a otro grupo de ratones rLT-B purificada de E. coli que expresa el antígeno de un plásmido recombinante. Se administro a cada ratón por sonda una dosis equivalente de antígeno (determinada por ELISA) de 12,5 \mug los días 0, 4, 21 y 25. Se examinaron por ELISA las respuestas de anticuerpos del suero y mucósicas para anticuerpos de muestras recogidas los días 30-32. Se detectaron anticuerpos anti-LT-B en suero así como en extractos mucósicos de los ratones sacrificados.

El aislamiento de extractos de suero y mucósicos de ratones se hizo anestesiando primero los ratones con xilazina/cetamina. Se separa el suero por punción cardíaca y se sacrifican los ratones con dislocación cervical. Se separa el intestino delgado del duodeno al ciego y se pone en un tubo tapado de plástico que contiene EDTA/STI enfriado con hielo (EDTA 50 mM, 0,1 mg/ml de inhibidor de tripsina de soja). Se homogeniza el intestino en EDTA/STI usando homogenizador de tejidos y se centrifuga después a 32.000 x g. Se liofiliza el sobrenadante durante la noche, se resuspende y se dializa en tampón TEAN, y se ensaya por ELISA. ELISA para IgA e IgG de ratón contra LT-B: Se revistieron placas ELISA de poliestireno con gangliósido G_{MX} como se ha descrito antes. Se añaden a cada pocillo 100 \mul de LT-B (10 \mug de LT-B/pocillo) y se incuban durante 1 h a temperatura ambiente. En una placa de 96 pocillos separada (placa de dilución), se prepararon diluciones dobles de una dilución 1/16 de suero de ratones inmunizados (en primer pocillo). Se tomaron diluciones en al menos 12 pocillos (125 \mul en 125 \mul). Las placas que contenían LT-B se lavaron cuatro veces con PBST y, después del lavado final, se aplicaron 100 \mul de diluciones del suero (de la concentración más baja a la más alta) de la placa de dilución a la placa revestida de LT-B. Después de incubar durante una hora a temperatura ambiente, se lavaron las placas con PBST y se añadieron a cada pocillo 100 \mul de dilución 1:4 de antisuero de conejo conjugado con fosfatasa alcalina a IgG de ratón (Sigma A1902) en PBST. Se lavaron las placas cuatro veces con PBST y se añadió a cada pocillo 1 mg/ml de sustrato de nitrofenilo en tampón de dietanolamina. Después de incubar durante 10 a 30 minutos, se detuvo la reacción con 25 \mul de NaOH 3 N por pocillo. Se leyó la absorbancia de los pocillos a 410 nm. El ELISA para estimar IgA en material mucósico fue similar al de IgG excepto que se sondó el material con una dilución 1:500 de antisuero de cabra a IgA de ratón (Sigma M7144) que se sondó a su vez con una dilución 1:100 de antisuero de conejo conjugado con fosatasa alcalina a IgG de cabra (Sigma A7650). Los valores para IgG e IgA se determinaron a partir de una curva estándar con proteínas de mieloma de ratón purificadas (MOPC 315), gA(IgA12); MOPC 21, gGi1 Litton Bionetics, Inc., Charleston, SC). Se determinó la reactividad cruzada por reactivos de cruzamiento (es decir, IgG unida a placas para comprobar el antisuero contra IgA). Reactividad cruzada para los presentes reactivos = 2,4% para IgG y 6,7% para IgA. Se corrigieron los valores por la reactividad cruzada. Se corrigieron adicionalmente los valores de IgA mucósica por contaminación de mucosa con suero (IgA mucósica corregida = IgA mucósica - [IgA del suero x [IgG mucósica/IgG del suero]]). Debajo está la formula usada para calcular la cantidad de IgG específica para antígeno (o IgA) en las muestras desconocidas. Se dibuja una línea de regresión lineal para el estándar y se determina el valor (en ng/ml) del punto medio lineal (supuesto que es 1,0). Se evalúa después cada desconocido separadamente tomando 5 puntos de datos a lo largo de la porción lineal de cada curva de dilución, determinando la pendiente, la ordenada en el origen y, y finalmente la dilución que da el valor de absorbancia de 1,0 (es decir, el punto medio lineal). Se multiplica después esta dilución por el valor estándar en el producto y se divide por 1.000 para dar un valor en \mug/ml.

Pendiente (b) = (Sxy-[(Sx)(Sy)]/n)/(Sx^{2}-(Sx)^{2}/n)

Ordenada en el origen y (a) = (Sy/n) - (Pendiente (b)/n)

Log Stdx = [1,0 - ordenada en el origen y (a)]/pendiente (b)

Std (x) = Exp(Log Std (x))

Ejemplo 13

Este ejemplo ilustra la capacidad de anticuerpos del Ejemplo 12 de ratones alimentados con LT-B-SEKDEL derivada de plantas para neutralizar enterotoxina LT.

Como se muestra en la Tabla I, las inmunoglobulinas de suero y mucósicas de animales inmunizados oralmente con tejido de plantas transformadas con LT-B-SEKDEL fueron capaces de neutralizar la actividad biológica de LT en la misma extensión que anticuerpos del suero y mucósicos de animales inmunizados oralmente con una dosis equivalente de antígeno de rLT-B bacteriana. Estos hallazgos demuestran que los antígenos expresados de plantas conservan epítopes nativos y tienen por ello valor potencial como vacunas.

TABLA I

2

Neutralización de la actividad de células adrenales de enterotoxina de E. coli. El ensayo de células adrenales se realizó usando células adrenales Y-1 de ratón en minicultivo. Se mezcló una dosis seleccionada de toxina con diluciones en serie de muestras de sueros o mucósicas agrupadas de ratones inmunizados oralmente con extracto de planta de tabaco (LT-B-KDEL de planta) o con LT-B derivada bacterianamente (LT-B bacteriana). Tras una preincubación durante una hora a 37ºC, se aplicaron las muestras a una monocapa de células adrenales Y-1 de ratón (ATCC CCL79) y se continuó la incubación durante 18 horas. Se define el título como la inversa de la dilución del suero más alta que muestra neutralización completa de la actividad biológica de 50 picogramos (aproximadamente 10 dosis en redondeo) de toxina.

Ejemplo 14

Este ejemplo ilustra la transformación de patata con pLTK110 y selección de plantas transgénicas.

Se usó el vector plásmido de T-ADN pLTK110 del Ejemplo 1 para transformar plantas de patata usando transformación mediada por Agrobacterium. El plásmido pLTK110 se movilizó primero en Agrobacterium tumefaciens LBA4404 (Clonetech Laboratories, Palo Alto, CA) por el método de congelación-descongelación directo, An G. Meth. Enzymol. 153:292-305 (1987). Se aislaron clones transformados por selección en 50 mg/l de canamicina, y se preparó plásmido de cultivos líquidos por lisis alcalina. Se verificó la estructura de plásmidos de Agrobacterium por digestión con endonucleasa de restricción. Se usaron clones positivos para transformación de plantas de patata como se describe en Wenzler H, Mignery G, May G, Park W. Plant Science 63, 79-85 (1989).

La variedad de patata FL1607 (disponible de Frito-Lay, Inc., Rhinelander WI) se cultivó asépticamente en medios estériles que contenían medio basal (sales MS, 100 mg/l de mio-inositol, 0, mg/l de tiamina-HCl y sacarosa 60 M, solidificado con 0,8% de agar) en vasos GA-7 (Magenta Corp.), a 25ºC bajo luz fluorescente difusa de igual número de lámparas blanca fría y Grow-lux (Sylvania), flujo de energía 10 w/m^{2}, con un período de luz de 16 h alternando con 8 h de oscuridad. Se cortaron en condiciones asépticas tiras de hojas de 2-3 m de ancho de retoños cultivados de 3-4 semanas, y se pusieron abaxiales lado abajo en placas petri de 100 x 20 mm que contenían medio de fase I (medio basal suplementado con 10 mg/l de ácido gibberélico, 0,2 mg/l de ácido naftalenoacético y 2,24 mg/l de 6-bencilaminopurina), y se incubaron durante 4 días a 25ºC con 16 h de luz por día.

Se desarrollaron cultivos líquidos de Agrobacterium en 5 ml de medio YEP (10 g/l de Bacto-peptona, 10 g/l de extracto de levadura, 5 g/l de NaCl, pH 7,0) a 29ºC a partir de una colonia simple desarrollada en medio YEP solidificado con 15 g/l de agar. Las tiras de hojas se pusieron durante 10 minutos en una placa petri estéril que contenía una dilución 1:50 con agua estéril de un cultivo líquido saturado de A. tumefaciens que albergaba el plásmido a transferir. El líquido en exceso se separó secando las tiras de hojas en toallas de papel estéril, y los explantes se devolvieron al medio de la fase I y se incubaron como antes durante 3-4 días hasta que fue visible un anillo delgado de desarrollo bacteriano rodeando a los explantes de hojas. Se transfirieron después los explantes a vasos GA-7 que contenían medio de la fase I suplementado con 50 mg/l de sulfato de canamicina y 500 mg/l de carbenicileno (los antibióticos se esterilizaron por filtración antes de usar).

Para producir retoños, se incubaron los explantes como se ha descrito antes durante 12 días, y se transfirieron después a vasos GA-7 que contenían medio de la fase II (medio de la fase I carente de ácido naftalenoacético y que contenía 50 mg/l de sulfato de canamicina y 500 mg/l de carbenicileno). Cuando se hubieron formado retoños que contenían al menos 2 nudos y medían al menos 2 cm de altura, se transfirieron a medio de arraigo (medio basal que contenía 50 mg/l de sulfato de canamicina y 500 mg/l de carbenicileno). Cuando se formaron raíces (después de aproximadamente 2 semanas), podían transferirse los retoños a macetas que contenían tierra y se desarrollaron en una cámara o invernadero de crecimiento.

Con el fin de examinar transformantes para la expresión de las proteínas de LT-B y LT-B-SEKDEL en tubérculos, se generaron microtubérculos en cultivo de tejidos aséptico según Perl A, Aviv L, Willmitzer L, Galum E. Plant Science 73:87-89 (1991). Se desarrollaron retoños cultivados en medio de arraigo hasta que tuvieron 5-8 nudos, y se diseccionaron en condiciones estériles. Se cultivaron nudos individuales en placas petri que contenían medio de tuberculización (0,5 x sales MS, 8% de sacarosa, 5 mg/l de cinetina y 5 mg/l de ancimidol [nombre comercial A-rest, DowElanco, Indianapolis, IN), en la oscuridad a 18ºC. Después de 2 semanas, se formaron microtubérculos en el meristema axilar, como se muestra en la Figura 8. Se cortaron y extrajeron los microtubérculos como se ha descrito en el Ejemplo 8, y se ensayó en ellos LT-B por ELISA, como se ha descrito en el Ejemplo 7.

Ejemplo 15

Este ejemplo ilustra el análisis ELISA de microtubérculos de transformantes de plantas de patata para la expresión de LT-B y LT-B-SEKDEL.

Se ensayó la expresión del gen que codifica LT-B en microtubérculos de transformantes de plantas de patata por cuantificación de los niveles de proteínas recombinantes cuantificadas por ELISA como se muestra en la Figura 2. Los niveles ELISA de proteína recombinante se determinaron a partir de extractos de proteína solubles de transformantes de patata independientes (marcados "B" en la Figura 2) que llevan la región de codificación de LT-B nativa (barras claras) o la región de codificación de LT-B-SEKDEL (barras oscuras) en la que se modificó el gen de LT-B para codificar la secuencia de retención del retículo endoplásmico (ER) Ser-Glu-Lys-Asp-Glu-Leu (SEKDEL) en el término C del gen de LT-B. Se hicieron girar a 12.000 x g extractos de los transformantes de patata en PBST (solución salina tamponada con fosfato, PMSF 2 mM, ascorbato 20 mM y 0,05% de TWEEN) y se ensayó por ELISA el sobrenadante obtenido como se ha descrito en el Ejemplo 7. Los 4 transformantes que mostraban los niveles de antígeno más altos se muestran en la Figura 2.

Ejemplo 16

Este ejemplo ilustra el crecimiento de transformantes de plantas de patata para producción de tubérculos.

Los transformantes individuales cuyos microtubérculos mostraban los niveles más altos de acumulación de LT-B o LT-B-SEKDEL (como se ha descrito en el Ejemplo 14) se clonaron cultivando los nudos asépticamente en medio de arraigo. Los retoños arraigados se transfirieron a tierra y se desarrollaron en una cámara de crecimiento a 22ºC con 16 h de luz al día, y se regaron según fue necesario con fertilizante Peters Plant Starter 9-45-15 (Hiummert Seed Co., St. Louis, MO). Después de 4-6 semanas, las plantas se habían desarrollado hasta aproximadamente 10 cm de altura, y se transfirieron a una cámara de crecimiento de día corto (8 h de luz al día) a 18ºC y se regaron sin fertilizante. Sólo se usó agua suficiente para mantener las plantas, porque se encontró que el riego en exceso podía causar putrefacción de los tubérculos en desarrollo. Después de 4-6 semanas, se habían formado tubérculos de tamaño variable de 1 cm a 4 cm de diámetro, como se muestra en la Figura 9. Se separaron los tubérculos, se lavaron quitándoles la tierra, se secaron al aire y se guardaron en la oscuridad, cerrados en bolsas de polietileno o papel a 4ºC hasta usarse para estudios de alimentación. Se encontró que los tubérculos dejados a la luz desarrollaban un color verde, lo que indica que están presentes en la piel toxinas que podrían ser dañinas si se alimentan a animales. Después de separar los tubérculos, se cultivaron las plantas en condiciones de día corto como se ha descrito antes para un desarrollo de tubérculos adicional.

Ejemplo 17

Este ejemplo describe la producción y selección de plantas de patata transgénicas que se diseñan para producir LT-A y LT-B dentro de las mismas células de tejido de tubérculos.

Se usaron pLT100 y pLT101 del Ejemplo 3 para transformar Agrobacterium como se ha descrito en el Ejemplo 14. Después de verificar la estructura de plásmidos en Agrobacterium como se ha descrito en el Ejemplo 14, se usaron las cepas apropiadas para transformar la variedad de patata FL1607 como se ha descrito en el Ejemplo 14. Se generaron microtubérculos como se ha descrito en el Ejemplo 14 y se ensayó en ellos la expresión de genes de LT-A y LT-B por análisis de manchas de ARN.

Se extrajo el ARN total de microtubérculos moliendo 50 mg de tejido en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml con un triturador de glóbulos en 0,25 ml de tampón (Tris-HCl 0,2 M, pH 8,6; NaCl 0,2 M; EDTA 20 mM; 2% de SDS). El homogenado se mezcló a fondo durante 2 minutos con 0,25 ml de fenol (equilibrado con TE, pH 8,0) y 0,25 ml de CHCl_{3}, y se centrifugó en una microcentrífuga a 14.000 x g. Se recuperó la fase acuosa superior y se mezcló con 0,1 volúmenes de acetato potásico 3 M, pH 4,8, y 2,5 volúmenes de etanol, y se guardó durante la noche a -20ºC para precipitar ácidos nucleicos. Las muestras se centrifugaron a 14.000 x g durante 10 minutos para aglomerar ácidos nucleicos, y se lavaron los glóbulos con etanol del 70% y se secaron al aire, y se redisolvieron en 50-100 \mul de agua estéril exenta de nucleasa. Después de determinar la concentración de ARN por absorbancia espectrofotométrica a 260 nm, se prorratearon 5 \mug de ARN de cada muestra y se desnaturalizaron en un volumen total de 20 \mul que contenía 10 \mul de formamida, 3,5 \mul de formaldehído y ácido 3-(N-morfolino)propanosulfónico (MOPS) 20 mM, pH 7,0, acetato sódico 40 mM y EDTA 1 mM, y se calentaron a 65ºC durante 15 minutos. Se mezclaron después las muestras con 2 \mul de glicerol del 50%, EDTA 20 mM y 0,25% de azul de bromofenol, y se sometieron a electroforesis en un gel de agarosa del 1,5% en MOPS 20 mM, pH 7,0, acetato sódico 40 mM y EDTA 1 mM, a 80 v durante 1,5 h.

El ARN del gel de agarosa se secó después en una membrana de nylon (Zetaprobe, BioRad, Hercules, CA) por secado capilar en fosfato sódico 25 mM, pH 6,5, durante 16 horas, y se reticuló a la membrana por irradiación UV usando un Stratalinker (Stratagene, La Jolla, CA) o por cocción a 80ºC durante 1 hora. Se visualizó ARN en la mancha (con el fin de verificar la densidad de carga) coloreando con 0,25% de azul de metileno en acetato sódico 0,1 M, pH 5,0, y decolorando con agua. Se incubó después la membrana durante 1 hora en tampón de hibridación (fosfato sódico 0,25 M, pH 7,2; EDTA 1 mM; 7% de SDS) a 65ºC, tras lo que se sustituyó el tampón por tampón de hibridación reciente a 65ºC, que contenía aproximadamente 10 cpm/ml de sonda de ADN marcado con 32P cebado aleatoriamente usando secuencias de codificación de LT-A y LT-B como plantilla. Las plantillas fueron el fragmento XhoI/SacI de pLTA210 del Ejemplo 2 y el fragmento XhoI/SpeI de pLTB210 del Ejemplo 1. La membrana se incubó a 65ºC durante 16 horas, se lavó después dos veces con tampón de lavado 1 (fosfato sódico 40 mM, pH 7,2; 5% de SDS; EDTA 1 mM) a 65ºC durante 20 minutos, y dos veces con tampón de lavado 2 (fosfato sódico 40 mM, pH 7,2; 1% de SDS; EDTA 1 mM) a 65ºC durante 20 minutos, se secó al aire y se expuso a película Kodak X-Omat AR con una pantalla intensificante durante 4 días a -80ºC.

El radiograma resultante, mostrado en la Figura 10, indica que están presentes en ARN de plantas transformadas con pLT100 (muestras 0-16, 0-20) y pLT101 (1-9, 1-11) secuencias que codifican LT-A (sonda A) y LT-B (sonda B). Aunque el experimento no escuantitativo con respecto a los niveles absolutos de mARN que codifica LT-A y LT-B, muestra que las plantas transformadas con pLT100 parecen tener una relación más favorable de mARN de LT-A a LT-B.

Ejemplo 18

Este ejemplo sirve para ilustrar un método para ensayar la presencia de holotoxina LT en los tubérculos del Ejemplo 17 (anterior).

Se extrajeron tubérculos (del Ejemplo 17) de plantas transformadas con pLT100 o pLT101 del Ejemplo 16 y se precipitaron con sulfato amónico del 40% y el 60% como se ha descrito en el Ejemplo 11. El material se usa después en el ensayo de células Y-1 adrenales para LT, como se ha descrito en el Ejemplo 13.

Alternativamente, se ensaya LT-A en el extracto por ELISA dependiente de gangliósido, como se ha descrito en el Ejemplo 7, excepto que la sonda de anticuerpo es específica para LT-A en lugar de LT-B.

Ejemplo 19

Este ejemplo ilustra la preparación de patata para administración a ratones a fin de inducir respuestas inmunes secretoras en ratones GALT a la proteína de LT-B que contiene una secuencia de retención de ER SEKDEL en el término C (LT-B-SEKDEL).

Alimentación de tubérculo de patata a ratones: Se alimentaron 5 gramos de rebanadas de patata que expresa antígeno los días 0, 4, 14 y 18 a grupos de ratones Balb/c alojados individualmente. Se les quitó alimento y agua a los ratones antes de alimentarlos y hasta consumir los 5 gramos de rebanadas de patata completos. Como testigo negativo, se alimentó a un grupo de ratones con patatas no transformadas. El día 28, se sacrificaron los animales y se examinó por ELISA la presencia de anticuerpos anti-LT-B de los materiales del suero y mucósicos. La Figura 6 muestra que los ratones alimentados con tubérculos transformados desarrollaron niveles significativos de IgG del suero e IgA mucósica dirigidas contra el antígeno extraño (bacteriano) expresado en los tubérculos.

Ejemplo 20

Este ejemplo ilustra la construcción de un gen de LT-B sintético, con una secuencia de nucleótidos modificada que tiene codones optimizados para expresión en plantas, en oposición a bacterias.

Se analizó la utilización de codones en la secuencia de codificación de LT-B. Se comparó con la frecuencia de tiempo de utilización de codones en proteínas abundantes encontradas en patata y tabaco y plantas en general como se muestra en la Tabla 2.

TABLA 2

3

4

5

Los codones del gen de LT-B nativo que tienen frecuencia de uso baja o cero en plantas se modificaron para conformarse con los codones de la planta usados en los genes para las proteínas de la planta expresados abundantemente. Los segmentos de codones con secuencias de señal poli-A posibles se modificaron a otros codones para los mismos aminoácidos. El codón para aspargina, posición 90, y/o treonina, posición 92, en la señal de glicosilación se modificaron a codones de otros aminoácidos. Los aminoácidos de sustitución se determinaron observando el efecto del cambio de residuo en la estructura secundaria siguiendo la predicción de estructura de Chou y Fasman y mediante simulación por ordenador en la estructura tridimensional de LT-B. El gen diseñado se sintetizó en extensiones de \sim50 nucleóidos con secuencias complementarias y se ligaron entre sí como se describe después.

La secuencia de este gen de LT-B recién diseñado se muestra después en la Tabla 3 junto con el gen nativo y la secuencia de aminoácidos para la que codifican.

Con respecto a la clonación del gen de LT-B sintético, primero, las Figuras 12 y 13 muestran la construcción de una región del grupo A compuesta por los segmentos A1, A2, A3 y A4 (SEQ ID NOS: 12-15, respectivamente), que se prepararon como sigue.

La Figura 12 muestra los oligonucleótidos que comprenden el grupo A de fragmentos del gen sintético. Los oligonucleótidos sintetizados para construir el gen sintético diseñado para LT-B se representan reasociados a sus cadenas complementarias. Se muestran los salientes 5' y 3' para permitir el reasociación y ligación a los fragmentos adyacentes. Se muestran los lugares de enzimas de restricción útiles para permitir la clonación.

La Figura 13 muestra que se purificaron oligonucleótidos complementarios por electroforesis en un gel de determinación de secuencia de 6% de urea y 12% de poliacrilamida. Se observaron las bandas por oscurecimiento de UV, se cortaron y se trituraron en un tubo de microcentrífuga. Se eluyeron los oligonucleótidos en agua durante la noche y se centrifugaron a 12.000 x g para separar la acrilamida. Se separó el sobrenadante y se filtró a través de lana de vidrio para separar toda poliacrilamida. Los oligonucleótidos se cuantificaron y quinasaron con quinasa de polinucleótidos y ATP. Se mezclaron relaciones equimolares de los oligonucleótidos y se ligaron usando la ligasa termoestable "Ampligase", según las especificaciones del suministrador. Se ligó después el grupo A en los lugares KpnI y PstI del plásmido pKSbluescript.

Las Figuras 14 y 15 muestran la construcción de una región de fragmentos del grupo B compuesta por los segmentos B1, B2 y B3 (SEQ ID NOS: 16-18, respectivamente), que se prepararon como sigue.

La Figura 14 muestra los oligonucleótidos que comprenden el grupo B de fragmentos del gen sintético.

Los oligonucleótidos sintetizados para construir el gen sintético diseñado para LT-B se representan reasociados a sus cadenas complementarias. Se muestran los salientes 5' y 3' para permitir el reasociación y ligación a los fragmentos adyacentes. Se muestran los lugares de enzimas de restricción útiles para permitir la clonación.

La Figura 15 muestra que se purificaron los oligonucleótidos complementarios por electroforesis en un gel de determinación de secuencia de 6% de urea y 12% de poliacrilamida. Se observaron las bandas por oscurecimiento de UV, se cortaron y se trituraron en un tubo de microcentrífuga. Se eluyeron los oligonucleótidos en agua durante la noche y se centrifugaron a 12.000 x g para separar la poliacrilamida. Se separó el sobrenadante y se filtró a través de lana de vidrio para separar toda poliacrilamida. Los oligonucleótidos se cuantificaron y quinasaron con quinasa de polinucleótidos y ATP. Se mezclaron y reasociaron relaciones equimolares de los oligonucleótidos. Se ligaron entre sí segmentos adyacentes del grupo B y se multiplicó por PCR el producto de ligación apropiado. Los productos de PCR se sometieron a electroforesis en gel de agarosa del 2% y se purificó el fragmento de tamaño correcto por parada de banda. El fragmento del grupo B se clonó en un vector pUC-19 de cola T.

La Figura 16 muestra después la construcción de los vectores de expresión de LT-B p210TH1 y p110TH1 mediante el siguiente procedimiento: (1) el segmento del grupo A del gen sintético (véase después) se ligó al pBluscriptKS (Stratagene) digerido con Xho y PstI para formar pTH1-A. Se multiplicó el plásmido en una cepa de E. Coli mutante de Dam metilasa; (2) el bloque A se cortó con digestión con NcoI y ClaI y se purificó por electroforesis en un gel de agarosa del 2%; (3) el grupo B se segmentos se ligó en un vector de cola T para formar pTH1-B y se multiplicó el plásmido en una cepa de E. Coli mutante de Dam metilasa; (4) el grupo B se cortó con digestión con ClaI y PstI y se purificó por electroforesis en un gel de agarosa del 2%; (5) el grupo A y el B se ligaron al vector pIBT210.1 digerido con NcoI y PstI para formar pIBT210.1TH1; y (6) la cassette de expresión para pIBT210.1TH1 se digirió por EcoRI y HindIII y se ligó en los lugares EcoRI y HindIII de vector pIBT110.1 de T-ADN de Agrobacterium para formar pIBT110.1TH1.

La Tabla 3 muestra la secuencia del gen de LT-B recién diseñado junto con el gen nativo y la secuencia de aminoácidos para la que codifican. La tabla muestra la comparación del gen de LT-B nativo (N) y el gen de LT-B diseñado (D). Se modificaron codones para ser consecuentes con la utilización de codones en plantas para el aminoácido particular. Los cambios de bases se indican por letras en negrita. La secuencia de aminoácidos muestra debajo la secuencia de genes nativos. La secuencia subrayada (en las posiciones de nucleótidos 268 a 273) representa la secuencia de señal de poliadenilación putativa en el gen nativo. La secuencia que codifica la secuencia desestabilizante de mARN AUUUA en el gen nativo está subrayada (en las posiciones de nucleótidos 123 a 127). Las regiones ricas en AT se modificaron para separar secuencias desestabilizantes de mARN potenciales o lugares de empalme crípticos. Se muestran los genes sin la secuencia que codifica el péptido líder bacteriano.

TABLA 3

6

7

La Tabla 4 muestra una comparación del gen de LT-B nativo y el gen sintético diseñado en términos del contenido de AT, el número de dobletes CG y los dobletes TA. Nótese que "N" es la SEQ ID NO: 19, "D" es SEQ ID NO: 20 y la secuencia de aminoácidos es SEQ WO: 21

TABLA 4

8

Ejemplo 21

Este ejemplo ilustra la construcción de un vector de expresión para LT-B que carece de la secuencia de señal bacteriana para facilitar la inserción de secuencias de señal de ER preferidas por la planta flanqueadas por lugares NcoI.

Se separó la secuencia de señal bacteriana en la secuencia que codifica LT-B y se insertó un lugar NcoI en el lugar del término N elaborado maduro de LT-B por mutagénesis mediada por PCR como sigue. Se obtuvo un fragmento de PCR de 104 pb usando como plantilla pDF82 y los cebadores 5'GGGGCCATGGCTCCCCAGTCTATT-3' (SEQ ID NO: 22) (el lugar NcoI está subrayado) y 5'TGCCATCGATTCCGTATA-3' (SEQ ID NO: 23). El fragmento de PCR se digirió con NcoI y ClaI, y se ligó con pLTB210 del Ejemplo 1 digerido de igual modo y se purificó para separar la secuencia de señal bacteriana, para dar pLTB212. La cassette de expresión completa en pLTB212, incluyendo el promotor 35S, la líder TEV, la secuencia de codificación de LT-B carente de la secuencia de señal bacteriana y la señal de poliadenilación vpsB y secuencia flanqueante 3', se obtuvo por digestión con HindIII y EcoRI, y se ligó con pBI101 de igual modo y se purificó para separar la secuencia de codificación de GUS, para dar pLTB112. Así, pLTB112 es un vector de T-ADN para la transformación mediada por Agrobacterium de células de plantas, usando selección en medios que contienen canamicina.

Se hace una construcción similar con el término C de LT-B modificado para contener SEKDEL por sustitución de pLTB210 por pLTK210 del Ejemplo 1.

Ejemplo 22

Este ejemplo ilustra la construcción de un vector de expresión para LT-B o LT-B-SEKDEL que contiene una secuencia señal de ER preferida por la planta en el término N.

Un plásmido que contiene la secuencia señal de ER de proteína de almacenamiento vegetativo de soja VSPa (Mason, et al., 1988. Plant Mol. Biol, 11, 845) en un fragmento de NcoI de 66 pb, p\alphaSIG-GUS, está disponible de H. Mason, Institute of Biosciences & Technology, Texas A&M University, Houston, TX 77030. Se digiere p\alphaSIG-GUS con NcoI, y el fragmento de 66 pb se purifica y liga con pLTB212 o pLTK212 del Ejemplo 21, digerido con NcoI. Se examina la orientación apropiada del inserto en los plásmidos resultantes pLTB213 y pLTK213 por determinación de secuencia de ADN, usando cebadores derivados de las secuencias flanqueantes. Las cassettes de expresión completas en pLTB213 y pLTK213 se obtienen por digestión de los plásmidos con HindIII y EcoRI, y se ligan con pBI101 digerido de igual modo y se purifican para separar la secuencia de codificación de GUS, para dar pLTB113 y pLTK113. Así, pLTB113 y pLTK113 son vectores de T-ADN para la transformación mediada por Agrobacterium de células de plantas, usando selección en medios que contienen canamicina.

Ejemplo 23

Este ejemplo ilustra la construcción de vectores para la expresión en plantas de proteínas de fusión compuestas por la proteína de LT-B y otros determinantes antígenos, con o sin un SEKDEL C-terminal para retención de ER.

El plásmido pLTB210 (del Ejemplo 1) se digirió con SpeI y se ligó con un fragmento de ADN sintético que codifica un determinante antígeno extraño fabricado reasociando oligonucleótidos de tal modo que se forma un extremo romo en la secuencia de codificación N-terminal del inserto extraño, mientras que se forma un lugar complementario de SpeI en la secuencia de codificación C-terminal del inserto extraño (como se muestra para la adición de SEKDEL en el Ejemplo 1). Si se desea un SEKDEL C-terminal, los oligonucleótidos sintéticos usados contendrán los nucleótidos apropiados que codifican SEKDEL en el término C del inserto extraño. Los productos de ligación resultantes se digieren con nucleasa de judía mungo para convertir el lugar SpeI restante en el extremo 3' de la secuencia que codifica LT-B en un extremo romo, y se ligan de nuevo para circularizar el plásmido. Es necesario diseñar el fragmento sintético de manera que la fusión del antígeno extraño esté en el mismo marco de lectura que la secuencia que codifica LT-B. Se examina en los plásmidos resultantes la orientación del inserto, que puede ligarse en orientación hacia adelante (preferida) o inversa, y la fusión de marco de lectura correcto, por determinación de secuencia de ADN, usando cebadores que flanquean el lugar de inserto. Se multiplican después plásmidos con fusiones correctas y se usan para estudios de expresión transitoria como se ha descrito en el Ejemplo 24.

Para una expresión estable, las cassettes de expresión de la fusión de LT-B descritas en el párrafo precedente se obtienen por digestión de los plásmidos de fusión con HindIII y EcoRI, y ligación con pBI101 digerido de igual modo y purificado para separar la secuencia de codificación de GUS. Los plásmidos resultantes se usan para transformación de A. tumefaciens LBA4404 como se ha descrito en el Ejemplo 6, y las cepas de A. tumefaciens resultantes se usan para transformar tabaco como se ha descrito en el Ejemplo 6, o patata como se ha descrito en el Ejemplo
14.

Ejemplo 24

Este ejemplo ilustra la expresión transitoria en protoplastos usando los vectores de expresión del Ejemplo 23.

Las vidas medias de proteínas de fusión se determinan usando expresión transitoria de construcciones de genes y marcado de persecución de impulsos de protoplastos de hojas como se ha descrito. Se usa cultivo en suspensión de células de plantas en su fase de crecimiento exponencial u hojas para derivar protoplastos (Power y Davey, Methods in Molecular Biology, Vol. 6, Plant Cell and Tissue Culture, J.W. Pollard y J.M. Walker, reds., págs. 237-259 (1990)). Se separa epidermis de las hojas de plantas de tabaco o patata desarrolladas asépticamente (véase Ejemplo 6) y se hacen flotar los fragmentos de hojas en solución de enzima (meicelasa 1,5%, macerozima 0,05%, pectoliasa 0,1%, glucosa 0,4 M en medio de cultivo de plantas). Después de incubar, se extrujan los fragmentos de hojas y se transfiere la suspensión de protoplastos a tubos de centrífuga. Después de centrifugar a 100 x g, se separa de la superficie la suspensión de protoplastos y se utiliza para expresión transitoria de genes introducidos por electroporación. Se determina la viabilidad de protoplastos coloreando con diacetato de fluoresceína.

Se lavan los protoplastos en HBS (solución salina tamponada con HEPES: HCl 150 mM, CaCl_{2} 4 mM, HEPES 10 mM (pH 7,2) y manitol. Se mezclan volúmenes iguales de protoplastos con plásmido sobreenrrollado que lleva construcciones de fusiones de genes y se transfieren a una cámara de electroporación estéril y se aplica voltaje a través de la membrana. Los protoplastos sometidos a electroporación se resuspenden en medio de cultivo y se incuban a 28ºC.

Los protoplastos marcados con impulsos se mezclan y cultivan con un medio que contiene ^{35}S-Met/^{35}S-Cys para permitir la expresión de las proteínas marcadas. Se persiguen después los protoplastos cultivados con una mezcla Met/Cys sin marcar durante diferentes intervalos de tiempo. Se recogen después los protoplastos por centrifugación y se extraen. Las muestras de proteína se inmunoprecipitan con antisueros específicos contra la proteína expresada y/o secuencias señal. Se fraccionan después los inmunoprecipitados por electroforesis en gel de poliacrilamida. Se detectan las bandas en los geles y se cuantifican usando formador de imágenes luminiscente.

Ejemplo 25

Esta ejemplo ilustra la antigenicidad y unión de ligandos de proteínas recombinantes derivadas de los transformantes del Ejemplo 23.

La antigenicidad y capacidades de unión de ligandos de proteínas de fusión recombinantes se analizan por ensayos de unión de gangliósidos competitiva. Se mezclan diferentes diluciones de proteínas recombinantes con concentraciones constantes de LT marcada con biotina y se incuban con gangliósido (GMx) adsorbido en placas ELISA. Se lavan a continuación las placas y se incuban con estrepavidina conjugada con peroxidasa de rábano picante. Se detecta la peroxidasa usando su sustrato ABTS. Se determina espectrofotométricamente la absorbancia y se representa la absorbancia media resultante de cada dilución frente a la concentración del competidor.

Ejemplo 26

Este ejemplo ilustra la expresión de antígeno superficial de hepatitis B (HbsAg) en tubérculos de patata y alimentación a ratones de tubérculos recombinantes para ensayar respuestas inmunógenas.

Se usó el vector de expresión de HbsAg pHB102 (Mason et al., 1992. Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 89, 11745) para transformar la variedad de patata FL1607 como se describe en el Ejemplo 14. Se obtuvieron tubérculos de patata de transformantes seleccionados que mostraban aproximadamente 0,01% de la proteína del tubérculo soluble como HbsAg.

Para ensayar la inmunogenicidad oral del material de tubérculo que expresa HBsAg, se preparan los tubérculos y se alimentan a ratones como se describe en el Ejemplo 19, excepto que se añaden por dosis como coadyuvante oral 10 \mug de toxina del cólera (CT). Se ensaya la producción de inmunoglobulina del suero y mucósica de los ratones como se describe en el Ejemplo 12. Se encontró que al menos el 25% de los ratones demostraba una respuesta inmune a HBsAg en comparación con testigos estándares.

Ejemplo 27 Alimentación de pollos con tubérculos LTK110-4

Los pollos y otras aves de corral comprenden un mercado considerable para vacunas de animales para protegerles contra enfermedades bacterianas, fúngicas y víricas que limitan sustancialmente la producción. Como ensayo en aves de corral de antígenos llevados por alimentos para causar respuestas inmunes, se alimentó a pollitos con tubérculos de patata transgénica sin mezcla que expresan la subunidad B de la enterotoxina lábil por calor de Escherichia coli (LT-B), y se ensayó a continuación en el suero de estos pollitos la IgG específica para LT-B. Se dio a pollitos singénicos Leghorn B12/B12 de un día tubérculos del linaje de patata transgénica LTK110-4 (Hag. et al., 1995), que contenían aproximadamente 5 \mug de LT-B por gramo de peso de tubérculo. Se les quitó alimento a los pollos 4-6 horas antes de alimentar las patatas. Se cortaron las patatas en fragmentos de 1-2 mm y los pollitos podían comerlos muy bien. Los días 0, 4, 14 y 18, se dieron a cada pollito 5 g de tubérculo de patata transgénica, y, el día 28, se obtuvo sangre de los pollitos y se preparó suero. Se ensayó en el suero anti-LT-B por el método de Cardenas & Clements (1993, Infect. Immun. 61:4629-2636) como sigue.

ELISA para anti-LT-B Reactivos

Tampón de revestimiento: por 300 ml - 0,48 g de Na_{2}CO_{3}, 0,88 g de NaHCO_{3}, 0,6 g de NaN_{3} (pH = 9,6). Guardar a 4ºC durante no más de 2 semanas.

PBS: Concentrado 10 x, por litro - 15 g de Na_{2}HPO_{4}, 61,2 g de NaCl (pH de 1 x = 7,2)

PBS: PBS + 0,05% de Tween-20

H_{2}SO_{4} 1 N

GMx: Sigma Tipo III (G2375). Añadir 2,5 ml de H_{2}O a 25 mg para hacer 10 mg/ml. Guardar a -20ºC. Diluir 1:100 con tampón de revestimiento para hacer placas.

LT-B: Reconstituir polvo liofilizado hasta el volumen indicado con agua destilada estéril, guardar a 4ºC. El tampón final es Tris 0,05 M, EDTA 1 mM, NaN_{3} 3 mM, NaCl 0,2 M (pH 7,5).

Conjugado anti-IgG de pollo, de conejo, -HRP (Sigma A9046)

Sustrato de TMB lento Pierce 34024).

Procedimiento

1.

Revestir placas de microtitulación (poli(cloruro de vinilo)), con 75 \mul/pocillo (1,5 \mug) de Gmx diluido (20 \mug/ml) en tampón de revestimiento. Incubar 1 h a temperatura ambiente (TA).

2.

Lavar 3 x con PBST.

3.

Bloquear pocillos con 200 \mul/pocillo de leche en polvo (DM) del 5% en PBST, 37ºC durante 1 h.

4.

Lavar 3 x con PBST.

5.

Añadir LT-B diluido hasta 13,3 \mug/ml en PBST, 75 \mul (1 \mug) por pocillo. Incubar a 23ºC durante 1 h.

6.

Lavar 3 x con PBST.

7.

Añadir 75 \mul/pocillo de muestras de suero diluidas (1:25, 1:50, 1:100, 1:200, 1:400) en 2% de DM/PBST. Incubar a 4ºC durante la noche o 16 h.

8.

Lavar 4 x con PBST.

9.

Añadir 75 \mul/pocillo de conjugado anti-IgG de pollo, de conejo, -HRP diluido 1:1.000en 2% de DM/PBST. Incubar 2 h a 37ºC.

10.

Lavar 4 x con PBST.

11.

Añadir 75 \mul/pocillo de sustrato de TMB lento. Incubar a TA durante 15-30 min.

12.

Añadir 75 \mul/pocillo de H_{2}SO_{4} 1 N.

13.

Leer la absorbancia a 450 nm.

Se diluyeron las muestras de suero de cuatro pollitos diferentes como se ha descrito antes y se ensayaron por duplicado, y los resultados promediados se muestran en la Tabla 5.

TABLA 5 ELISA anti-LT-B en sueros de pollitos Absorbancia, a 450 nm para la dilución

9

Los datos muestran que dos de los cuatro pollitos que comieron los tubérculos que contenían LT-B desarrollaron una fuerte respuesta de IgG humoral contra LT-B. Este resultado muestra que pueden inmunizarse pollos contra un antígeno extraño expresado en un tejido comestible de plantas transgénicas alimentando simplemente con el tejido de plantas sin cocer.

Ejemplo 28 Expresión coordinada de LT-B-SEKDEL y proteína de cápsida de virus de Norwalk

Este ejemplo describe el análisis de plantas de patata que se formaron con pLTK-NV del Ejemplo 5. Se realizó análisis de manchas de ARN en muestras de ARN de hojas de 19 transformantes independientes, usando una sonda de región de codificación de LT-B y el método de Mason et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:11745-11749. Los 6 transformantes que mostraron los niveles más altos de ARN de LT-B se propagaron adicionalmente y se indujeron para formar microtubérculos como se ha descrito en el Ejemplo 14.

Se hicieron extractos solubles de los microtubérculos y se realizaron ensayos ELISA para proteína de cápsida de virus de Norwalk (NVCP). El ELISA de NVCP se hizo como se ha descrito antes (Jiang, X., Wang, M., Graham, D.Y., y Estes, M.J., 1992, J. Virol 66, 6527-6532), usando anti-i-rNV de conejo como anticuerpo de captura y anti-i-rNV de cobaya como anticuerpo detector. Se unió anti-suero de conejo diluido 1:10.000 en solución salina tamponada con fosfato (PBS) 0,01 M (50 \mul/pocillo) a placas de microtitulación de poli(cloruro de vinilo) de 96 pocillos durante 4 h a 23ºC, y se bloquearon después con 5% de leche desnatada en polvo en PBS (DM/PBS) durante 1 h a 37ºC. Después de lavar los pocillos 3 veces con PBS + 0,05% de Tween-20 (PBST), se añadieron muestras (50 \mul/pocillo) diluidas en PBS, y se incubaron 16 h a 4ºC. Se lavaron los pocillos y se incubaron sucesivamente con anti-suero de NVCP de cobaya y conjugado de anti-IgG de cobaya, de conejo-HRP, diluidos cada uno 1:5.000 en 2% de DM/PBS, durante 2 h a 37ºC. Se reveló la placa con sustrato de TMB lento (Pierce) durante 15-20 min a 23ºC, se terminó la reacción por adición de un volumen igual de H_{2}SO_{4} 1 N, y se leyó la absorbancia a 450 nm. Por una curva estándar, NVCP preparada en un sistema de células de insecto infectado con baculovirus (Jiang, X., Wang, M, Graham, D.Y., y Estes, M.K., 1992, J.Virol 66, 6527-6532) se diluyó con PBS a concentraciones entre 1,4 y 45 ng/ml y se trató como antes. Se ensayó también la proteína total de los extractos de microtubérculos usando el ensayo de unión de colorante de Coomassie (BioRad) con albúmina de suero de bovino como patrón, y se expresó el nivel de NVCP como \mug por mg de proteína total (Tabla 6).

TABLA 6 Niveles de NVCP en microtubérculos de transformantes de pLTK-NV

10

Se trasplantaron plantas de cada transformante a tierra y se desarrollaron en una cámara de ambiente controlado para desarrollar tubérculos como en el Ejemplo 16. Se pesaron los tubérculos obtenidos de cada transformante y se lavaron y pelaron tubérculos de tamaño similar (6 a 8 gramos), y una muestra del parénquima de almacenamiento de cada tubérculo se pesó y extrajo en 4 ml por gramo de tampón (fosfato sódico 25 mM, pH 6,6; NaCl 100 mM; ascorbato sódico 25 mM; EDTA 5 mM; 0,1% de Tween-20; 1,0 \mug/ml de leupeptina). Los extractos se diluyeron con PBST y se ensayaron LT-B y NVCP por ELISA, y la proteína total como se ha descrito antes, y los resultados se expresan como \mug de antígeno por gramo de masa de tubérculo o \mug de antígeno por gramo de proteína total
(Tabla 7).

\newpage

TABLA 7 Niveles de LT-B-SEKDEL y NVCP en tubérculos de transformantes de pLTK-NV

\mug de antígeno por gramo de tejido de tubérculo

11

\mug de antígeno por gramo de proteína de tubérculo

12

Estos datos muestran que los niveles de LT-B-SEKDEL en transformantes de pLTK-NV seleccionados para alta expresión de mARN de LT-B son mayores que los indicados previamente en el Ejemplo 15 y la Figura 2. El mayor nivel de LT-B-SEKDEL en microtubérculos de transformantes de pLTK110 fue 120 \mug por gramo de proteína de microtubérculo, mientras que los transformantes de pLTK-NV mostraban entre 205 y 625 \mug por gramo de proteína de tubérculo. Esto puede ser efecto del aumento transcripcional debido a la proximidad del promotor de patatina aguas abajo de la cassette de LT-B-SEKDEL en pLTK-NV, pero no se dispone ahora de datos para valorar esto. Además, la NVCP se acumuló en los mismos tubérculos a niveles hasta 4,18 \mug por gramo de masa de tubérculo, y 520 \mug por gramo de proteína de tubérculo total. En todos los transformantes, excepto el número 17, LT-B-SEKDEL y NVCP se acumularon a niveles similares. Así, es claro que pueden expresarse antígenos múltiples en las mismas plantas transgénicas, demostrando el uso de plantas que expresan LT-B como coadyuvantes para la inmunización de otros antígenos.

Ejemplo 29 Inmunogenicidad y carácter coadyuvante de LT-B-SEKDEL expresada en tubérculos de patata

Este ejemplo ilustra el uso de tubérculos de patata transgénica que expresan LT-B-SEKDEL como coadyuvante en pollos cuando se proporciona oralmente con un antígeno heterólogo (en este caso, un virus), e ilustra adicionalmente la inmunogenicidad en pollos de tubérculos de patata que expresan LT-B-SEKDEL.

El virus usado en este estudio fue la cepa Ulster del virus de la enfermedad de Newcastle (NDV). Fue aislado en Ulster en 1967 (McFerran et al. 1968 Vet. Rec. 82:589) y se ha usado en unos pocos estudios como un "NDV no patógeno, enterotrópico" (Cheville et al. 1972. Vet. Path 9, 38-52; Russell, P.H. 1994. Vet. Immuno and Immunopathology 42: 357-365). También se ha desarrollado recientemente como vacuna en Europa, Van Eck y Goren, 1991, Avian Pathology 20: 497-507. El NDV es un paramixovirus, ARN de cadena sencilla de sentido negativo, que infecta toda clase de aves y se distribuye más o menos por todo el mundo. Hay 3 variedades de NDV, lentógenos (patógenos débiles como el Ulster), mesógenos (patógenos intermedios) y velógenos (altamente patógenos).

Se realizó el siguiente experimento. Se pelaron y homogeneizaron por mezclado durante 30 segundos en una batidora tubérculos de patata (Ejemplos 14 y 16, transformante LTK110-4) transformada con pLTK110 del Ejemplo 1, o tubérculos de patata no transformada testigo (FK1607, Ejemplo 14). Los tubérculos LTK110-4 contenían aproximadamente 2,5 \mug de LT-B-SEKDEL por gramo de masa de tubérculo. En algunos casos, la suspensión de tubérculo se mezcló con virus de la enfermedad de Newcastle (10^{9} virus por dosis). Se administraron las mezclas por sonda usando una pipeta de plástico de 10 ml a pollos Liorna blancos, de sexo mezclado, de 4 semanas de edad el día 1. Se dieron dosis que contenían 10 ml los días 1, 2, 3, 8 y 10, y se desangraron las aves por punción en vena del ala el día 14. Los sueros obtenidos se diluyeron y usaron para medir la actividad de inhibición de hemaglutinina (Beard, C.W., S.R. Hopkins y J. Hammond. 1975. "Preparation of Newcastle disease virus hemagglutinin-inhibition test antigen". Avian Diseases 19: 692-699) y para ensayar IgG especifica para LT-B, como se ha descrito antes en el Ejemplo 27. Cada grupo contenía 5 aves individuales.

A. Respuesta inmune contra NDV

Los datos para la actividad de inhibición de hemaglutinina, que indica la respuesta de anticuerpos específica para proteína hemaglutinina de NDV, se obtuvieron como la dilución más alta de sueros que dio actividad. Se usaron los factores de dilución para todas las aves de un grupo para calcular el título medio geométrico (GMT) para ese grupo 1) obteniendo el log_{10} para cada factor de dilución, 2) determinando la media y la desviación típica para los valores log_{10}, y 3) obteniendo los antilogaritmos de la media y la desviación típica. La Tabla 8 muestra los datos para aves que recibieron 10^{9} virus con 4 g de tubérculo testigo (Grupo 1), 10^{9} virus con 1 g de tubérculo LTK110-4 (Grupo 2) y 4 g de tubérculo LTK110-4 sin virus (Grupo 3).

TABLA 8 Actividad de inhibición de hemaglutinina en sueros de pollos alimentados por sonda con NDV con o sin tubérculos de patata LTK110-4

Media geométrica de la dilución más alta que muestra actividad \pm desviación típica

	Grupo 1	Grupo 2	Grupo3
	10^{9} virus	10^{9} virus	Sin virus
	4 g de tubérculo testigo	1 g de tubérculo LTK110-4	4 g de tubérculo KTK110-4
	16,65 \pm 4,96	40 \pm 2,34	0

Estos datos indican que la adición de 1 g de tubérculo transgénico que contenía aproximadamente 2,5 \mug de LT-B-SEKDEL por dosis oral de NDV aumentó la respuesta inmune contra NDV. Así, la LT-B-SEKDEL expresada en tubérculos de patata tiene valor potencial como coadyuvante oral para vacunas comestibles en aves.

B. Respuesta inmune contra LT-B

Se midió la respuesta de anticuerpos del suero contra LT-B en el experimento descrito en la Tabla 8, con el fin de mostrar el valor de los tubérculos LTK110-4 transgénicos como vacuna potencial contra enfermedad diarreica relacionada con E. Coli. Estos datos se presentan en la Tabla 9 como valores de absorbancia para el ELISA de muestras de suero diluidas 1:100.

TABLA 9 Respuestas de IgG anti-LT-B del suero en pollos alimentados por sonda con tubérculos de patata LTK110-4

13

Estos datos muestran que tan poco como 1 g de tubérculos de patata LTK110 transgénica, que contenía aproximadamente 2,5 \mug de LT-B-SEKDEL por dosis oral, estimuló una respuesta de IgG anti-LT-B significativa en los sueros de 3 de las 5 aves del Grupo 2. Además, la presencia del NDV en dosis orales en el Grupo 2 no interfirió con la respuesta contra la LT-B-SEKDEL. En el Grupo 3, un aumento de dosis de 4 g de tubérculos de patata LTK110 transgénica, que contenían aproximadamente 10 \mug de LT-B-SEKDEL por dosis oral, causó una respuesta en las 5 aves, y aumentó la intensidad media de la respuesta. Así, la LT-B-SEKDEL expresada en tubérculos de patata tiene valor potencial como vacuna comestible oral contra enfermedad diarreica relacionada con E. coli en aves.

Ejemplo 30 Permisión de la calidad de modificaciones de vectores de expresión de plantas

Este ejemplo describe datos que muestran que modificaciones de vectores de expresión de plantas disponibles comercialmente pueden aumentar la expresión de genes extraños.

El vector plásmido inicial que se construyó para expresión de LT-B en plantas produjo poca o nula proteína de LT-B medible en plantas de tabaco transformadas establemente. Esta construcción (pLTB120) utilizaba los elementos reguladores genéticos presentes en el vector de expresión de plantas disponible comercialmente pBI121 (Clonetech, Palo Alto, CA; Jefferson et al., 1987, EMBO J. 6:3901-3907), incluyendo el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor y la señal de poliadenilación de nopalina sintasa (NOS) de Agrobacterium tumefaciens. Los vectores subsiguientes de los inventores, descritos en los Ejemplos 1-5, utilizaron modificaciones de las regiones reguladoras 5' y 3'.

Lo que sigue es una descripción de la construcción de pLTB120. Se digirió pJC217 del Ejemplo 1 con EcoRI y HindIII para dar un fragmento de 580 pb que se ligó con pBluescript KS (Stratagene) para dar pLTB10. El lugar EcoRI en pLTB10 se separó por digestión con EcoRI y nucleasa de judía mungo, y se religó después el plásmido para dar pLTB11. Se obtuvo la región de codificación de LT-B en un fragmento de 410 pb de pLTB11 por digestión con BamHI y DraI, y se ligó con pBI221 (Clonetech, Palo Alto, CA) que se había digerido con SacI, hecho de extremos romos con nucleasa de judía mungo y digerido con BamHI. El plásmido resultante, pLTB220, tiene la secuencia de codificación de GUS en pBI221 sustituida por la secuencia de codificación de LT-B. La cassette de expresión de LT-B en pLTB220 se separó por digestión con HindIII y EcoRI, y se ligó con pBI101 (Clonetech, Palo Alto, CA) digerido de igual modo, para dar pLTB120. Así, pLTB120 es un vector de T-ADN que contiene los límites izquierdo y derecho requeridos para la integración mediada por Agrobacterium en ADN nuclear de plantas, el promotor 35S y la expresión de regulación terminadora de NOS de la secuencia que codifica LT-B (Figura 11).

Se transformaron plantas de tabaco con pLTB120 como se ha descrito en el Ejemplo 6, y se analizó el ARN de hojas total por manchas de Northern como se ha descrito en el Ejemplo 17. En el mismo gel se analizó ARN de células de tabaco transformadas con pLTB112 del Ejemplo 21, y pLT100 y pLT101 del Ejemplo 3. Estas muestras representan mARN que contiene la secuencia de codificación de LT-B fusionada a la región 3'-no traducida de NOS y la señal de poliadenilación (pLTB120), o la región 3'-no traducida de vspB de soja y la señal de poliadenilación (pLTB112, pLT100, pLT101). El radiograma mostrado en la Figura 17 indica que la cassette de pLTB120 produce 2 especies diferentes de mARN, como se indica por 2 bandas distintas que se hibridan con la sonda de LT-B. Sin embargo, los mARNs de LT-B derivados de las cassettes de expresión en pLTB112, pLT100 y pLT101 muestran todos sólo una banda simple, lo que indica una especie única de mARN. Esta banda es mayor que la mayor banda de pLTB120 debido a la presencia de la región 5'-no traducida de TEV.

La aparición de 2 especies de mARN en el transformante de pLTB120 es debida probablemente a poliadenilación de los transcriptos nacientes en lugares alternativos. La secuencia de codificación nativa de LT-B contiene una señal de poliadenilación conónica, "AAUAAA", cerca de su extremo 3' que, cuando se fusiona a la región 3' de NOS en pLTB120, permite el reconocimiento y el tratamiento del extremo 3' para producir una especie de mARN que es más corta que la generada por tratamiento debido a la señal "AAUAAA" en la región 3' de NOS. Por inspección visual del radiograma, parece que se utilizan los 2 lugares alternativos con aproximadamente igual frecuencia en las células de tabaco. Un mARN truncado puede ser no funcional y conducir a una expresión más baja de proteína de LT-B. A la inversa, cuando la secuencia de codificación de LT-B está fusionada a la región 3' de vspB de soja, resulta sólo una especie de mARN de longitud completa simple, quizás en virtud de una secuencia 3'-no traducida más larga que separa la señal de poliadenilación críptica en la secuencia de codificación de LT-B de la que hay en la región 3' de vspB.

Como se muestra en la Figura 17, se prepararon muestras de ARN total de hojas de tabaco (LTB120 y LTB112) o microtubérculos (LT100 y LT101), y se desnaturalizaron 3 \mug (LTB120) o 6 \mug (LTB112, LT100, LT101) de cada muestra con formaldehído y se sometieron a electroforesis en un gel de agarosa del 1,7%. El gel se secó en una membrana de nylon y se hibridó con sonda específica para la secuencia de codificación de LT-B. Después de lavar la membrana, se expuso a película de rayos X, y se escaneó el radiograma revelado con un escaneador plano. Los números indican plantas transformadas individuales.

Ejemplo 31

Este ejemplo ilustra el aumento de la expresión de LT-B en células de plantas usando el gen sintético con secuencia de nucleótidos modificada del Ejemplo 20.

Se transformaron plantas de patata de la cepa "FL1607" por transferencia de T-ADN mediada por Agrobacterium usando pTH110 del Ejemplo 20, por el método del Ejemplo 14. Los transformantes se regeneraron en medio selectivo que contenía canamicina, y se cortaron y extrajeron para ELISA de LT-B hojas de retoños regenerantes.

Se analizaron quince transformantes de TH110 independientes junto con plantas testigo: 1) planta de patata no transformada, 2) una planta de patata transformada con pLTB110 del Ejemplo 1 y que expresa LT-B en alto nivel comparada con otros transformantes de pLTB110 y 3) una planta de patata transformada con pLTK110 del Ejemplo 1 y que expresa LT-B-SEKDEL en alto nivel comparada con otros transformantes de pLTK110. La mejor estimación del nivel de aumento de expresión de LT-B en transformantes de pTH110 se obtiene por comparación de los transformantes de pTH110 con el transformante de pLTB110, porque la secuencia de aminoácidos de estos genes de LT-B es idéntica, mientras que la cassette de pLTK110 tiene una extensión carboxi-terminal de 6 aminoácidos (SEKDEL) que permite la retención microsómica y acumulación aumentada de antígeno.

Se cortaron hojas de 4 mm de diámetro de la parte superior de las plantas y se congelaron en nitrógeno líquido. Se homogeneizó el tejido en 250 microlitros de tampón de extracción enfriado con hielo (fosfato sódico 25 mM (pH 6,6), NaCl 100 mM, EDTA 10 mM, ascorbato sódico 25 mM, 10 microgramos/ml de leupeptina y 0,1% de Tween-20). Se centrifugaron las muestras a 14.000 rpm en una microcentrífuga a 4ºC durante 2 minutos. Se separó el sobrenadante y se diluyó 1:100 con 1% de leche en polvo en PBST (tampón de fosfato sódico 10 mM (pH 7,2), NaCl 105 mM y 0,05% de Tween 20), y se determinó LT-B por el método ELISA del Ejemplo 7, modificado como sigue. Después de incubar las placas con el anticuerpo principal (anti-LT-B de cabra) y lavar, se trataron las placas con anti-IgG de cabra, de conejo, conjugado a peroxidasa de rábano picante (HRP), diluido 1:3.000 en 1% de leche en polvo/PBST durante 2 horas a 37ºC. Después de lavar, se revelaron las placas con sustrato de TMB lento para HRP (Pierce, Rockford, IL) durante 30 minutos a temperatura ambiente.

Se cuantificó la proteína total de los extractos de hojas usando el juego de ensayo de proteínas BIORAD y BSA como patrón. Se promediaron los valores y se tabulan como LT-B equivalente de ELISA en nanogramos por microgramo de proteína soluble total. Los resultados se muestran en la Tabla 10. Estos datos indican que los 6 transformantes de pTH110 que expresan LT-B en los niveles más altos mostraban acumulación de LT-B de 3 a 14 veces más elevada que el transformante de pLTB110-2, y hasta 5 veces más elevada que el transformante de pLTK110-4. Este resultado muestra claramente el valor de utilizar una secuencia de nucleótidos modificada de la región de codificación del gen de LT-B.

TABLA 10 Niveles de LT-B en hojas de plantas de patata transformadas con plásmidos de expresión de genes sintéticos o nativos

14

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

SOLICITANTE: The Texas A&M University System

\hskip4cm

310 Wisenbaker

\hskip4cm

College Station, Texas 77843-3369

\hskip4cm

The Administrators of the Tulane Educational Fund

\hskip4cm

1430 Tulane Avenue

\hskip4cm

New Orleans, Louisiana 70012-2699

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: INMUNIZACIÓN ORAL CON PLANTAS TRANSGÉNICAS

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 23

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESTINATARIO: Pravel, Hewitt, Kimball & Krieger

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: 1177 West Loop South, 10º Piso

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD: Houston

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

ESTADO: TX

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAÍS: EE.UU.

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

ZIP: 77027-9095

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

FORMA LEGIBLE EN ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TIPO DE MEDIO: Floppy disk

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

ORDENADOR: IBM PC compatible

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS, MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

SOFTWARE: PatentIn Release 1.0, Versión 1.25

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

DATOS DE SOLICITUD ACTUAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD:

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CLASIFICACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

DATOS DE SOLICITUD ANTERIOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: US 08/328.716

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 24 DE OCT. DE 1994

\vskip0.800000\baselineskip

(viii)

INFORMACIÓN DE ABOGADO, AGENTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: Jones, John W.

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

NÚMERO DE REGISTRO: 31.380

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE REFERENCIA/CERTIFICADO: 36170/3P

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TELÉFONO: 713-850-0909

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TELEFAX: 713-850-0165

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 4 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Asp Glu Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 4 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{His Asp Glu Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 6 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ser Glu Lys Asp Glu Leu}

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 6 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ser Glu His Asp Glu Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 22 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CARÁCTER DE LA CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTCTGAGAAA GATGAGCTAT GA

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

LONGITUD: 26 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

CARÁCTER DE LA CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTAGTCATAG CTCATCTTTC TCAGAG

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 38 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CARÁCTER DE LA CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGTATGGAAA ACTCTGAGAA AGATGAGCTA TGACTAGT

\hfill

38

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 33 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CARÁCTER DE LA CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGGGCCATGG TTAAAGTAAA ATGTTATGTT TTA

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CARÁCTER DE LA CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AGACTGGGGA GCTCCGTATG

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 33 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CARÁCTER DE LA CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 10:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGGGCCATGG TTAAAAATAT AACTTTCATT TTT

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 18 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CARÁCTER DE LA CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 11:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATCTGGGGGT CTAGAGTC

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 70 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CARÁCTER DE LA CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 12:

\vskip1.000000\baselineskip

100

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 70 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CARÁCTER DE LA CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 13:

\vskip1.000000\baselineskip

101

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 72 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CARÁCTER DE LA CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 14:

\vskip1.000000\baselineskip

102

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 15:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 68 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CARÁCTER DE LA CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 15:

\vskip1.000000\baselineskip

103

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 16:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 65 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CARÁCTER DE LA CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 16:

\vskip1.000000\baselineskip

104

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 17:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 65 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CARÁCTER DE LA CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 17:

\vskip1.000000\baselineskip

105

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 18:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 52 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CARÁCTER DE LA CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 18:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

AACTCCATTG CTGCCATCAG CATGGAGAAC TAAGTCTTCG GTACCTATCT AG

\hfill

52

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 19:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 312 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CARÁCTER DE LA CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 19:

\vskip1.000000\baselineskip

15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 20:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 312 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CARÁCTER DE LA CADENA: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 20:

\vskip1.000000\baselineskip

16

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 21:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 103 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 21:

17

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 22:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 24 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CARÁCTER DE LA CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 22:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGGGCCATGG CTCCCCAGTC TATT

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 23:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 18 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CARÁCTER DE LA CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 23:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TGCCATCGAT TCCGTATA

\hfill

18

Claims (12)

1. Un material de planta transgénica que comprende o expresa una secuencia de ADN que codifica al menos un agente inmunógeno,

en el que la secuencia de ADN comprende además una secuencia de retención de retículo endoplásmico (ER) fusionada con la secuencia de ADN que codifica el agente inmunógeno, y

en el que el material es capaz de inducir una respuesta inmune en animales al agente inmunógeno expresado suficiente para inmunizar a los animales contra el agente cuando se administra al animal el material de planta transgénica por ingestión oral.

2. El material de la reivindicación 1ª, en el que la secuencia de ADN comprende además una secuencia señal de ER fusionada con la secuencia de ADN que codifica el agente inmunógeno.

3. El material de las reivindicaciones 1ª o 2ª, en el que el agente inmunógeno comprende una proteína que contiene LT-B o CT-B.

4. El material de una cualquiera de las reivindicaciones 1ª a 3ª, en el que el agente inmunógeno comprende una proteína con al menos un dominio de aminoácidos con al menos aproximadamente 90% de homología de aminoácidos a LT-B o CT-B.

5. El material de las reivindicaciones 3ª o 4ª, en el que la secuencia de ADN contiene ADN que codifica una proteína que contiene LT-B y una proteína que contiene LT-A, o contiene ADN que codifica una proteína que contiene CT-B y una proteína que contiene CT-A.

6. El material de la reivindicación 5ª, en el que la LT-B se oligomeriza con la LT-A para formar una holotoxina, o la CT-B se oligomeriza con la CT-A para formar una holotoxina.

7. El material de una cualquiera de las reivindicaciones 2ª a 6ª, que comprende además un segundo agente inmunógeno, distinto de una proteína que contiene LT-B o CT-B, capaz de inducir una respuesta inmune en animales.

8. El material de la reivindicación 7ª, en el que la proteína que contiene LT-B o CT-B es capaz de obtener un efecto coadyuvante en el segundo agente inmunógeno.

9. El material de una cualquiera de las reivindicaciones 2ª a 8ª, en el que el agente inmunógeno es codificado por la secuencia de gen de LT-B sintético presentado en SEQ ID NO: 20.

10. El material de una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, de uso en un método para inmunizar un animal por administración oral del material.

11. El uso de un material de planta transgénica según una cualquiera de las reivindicaciones 1ª a 10ª en la fabricación de un medicamento para vacunar a un animal por administración oral del material.

12. Un método para producir un material de planta transgénica como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1ª a 10ª, que comprende:

construir al menos un vector con una secuencia de ADN que codifica al menos un agente inmunógeno, en el que la secuencia de ADN comprende además una secuencia de retención de retículo endoplásmico (ER) fusionada con la secuencia de ADN que codifica el agente inmunógeno;

transformar material de planta para crear material de planta transgénica con dicho vector; y

expresar dicho agente inmunógeno de dicho vector dentro de dicho material de planta transgénica, en el que el nivel de expresión de dicho agente inmunógeno es suficiente para inducir una respuesta inmune en dicho animal suficiente para inmunizar al animal contra el agente inmunógeno cuando se administra dicho material de planta a dicho animal por ingestión oral.