JPH04501801A - トランスジェニック植物による経口的免疫化 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 トランスジェニック植物による経口的免疫化光五■丘景 組み換えＤＮＡ技術における進歩は、植物の形質転換および再生における利点と 組み合わさって、新しい遺伝子物質を植物の細胞、植物および植物組織に導入す ることを可能とし、こうして植物または植物の組織の価値を増大する新しい特性 、例えば、表現型の導入を可能とした。本発明は、動物種の粘膜表面上でコロニ ナイゼイションするか、あるいはそれを通して侵入する病原体のコロニナイゼイ ション抗原またはビルレンス抗原またはそれらの部分をコードする遺伝子を植物 の中に導入することに関する。本発明は、また、このようなコロニナイゼイショ ン抗原またはビルレンス抗原またはそれらの部分を植物により産生ずることに関 する。本発明は、さらに、ヒトまたは他の動物の経口的免疫化のために、このよ うなコロニナイゼイシヲン抗原またはビルレンス抗原および他の動物を含有する 植物物質を使用して、病原体により動物またはヒトの感染を抑制することに関す る。

Ａ、感仇　、串および　の−　・ 感染症は、動物およびヒトの両者の健康のための増加する問題となるようになっ た。ギレスピー（Ｇｉｌｌｅｓｐｉｅ）　Ｊ、ら、家畜の感染症（Ｉｎｆｅｃｔ ｉｏｕｓ　Ｄｉｓｅａｓｅｓ　ｏｆ　Ｄｏｍｅｓｔｉｃ　Ａｎｉ＋ＩＩａｌｓ） 、コムストック・プレス（Ｃｏｍｓｔｏｃｋ　Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク州イ タカ（１９８１）　；マンデル（Ｍａｎｄｅｌｌ）Ｇ、Ｌ、ら、感染症の原理お よびプラクティス（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　Ｐｒａｃｔｉｃｅｓ　ｏｆ 　ＩｎｆｅｃｔｉｏｕｓＤｉｓｅａｓｅｓ）　、第２版、シコン・ウィリー・ア ンド・サンズ（Ｊｏｈｎ　Ｗｉｌｅｙ　ａｎｄ　５ｏｎｓ）　、二ｓ−ヨーク（ １９８５）　、バクテリアの病原体により引き起こされる病気は、とくに抗生物 質耐性病原体の増加のために面倒である。大部分の病原体は、昆虫により伝播す る病原体または傷を通して体に入るものを除外して、粘膜表面上にまたはそれを 通して入る。前者の病原体はは次のものを包含するが、これらに限定されない： バクテリアのアクチノミセス属（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）　、アエロモナス属 （Ａｅｒｏａ＋ｏｎａｓ）　、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、バタテリオデ ス属（Ｂａｃｔｅｒｉｏｄｅｓ）　、ボルデテラ属（Ｂｏｒｄａｔｅｌｌａ）、 プルセラ属（Ｂｒｕｃｅ　Ｉ　Ｉａ）、カンピロバクチル属（Ｃａ＋ｎｐｙｌｏ ｂａｃｔｅｒ）　、カブノイシトファガ属（Ｃａｐｎｏｃｙ　ｔｏｐｈａｇａ） 、クラミジア属（Ｃｌａｍｙｄｉａ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄ ｉｕｇ＋）コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｋｕｔｅｒｉｕｍ）、エイケ ネラ属（Ｅｉｋｅｎｅｌｌａ）　、エリジペロスリックス属（Ｅｒｙｓｉｐｅｌ ｏｔｈｒｉｘ）、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉ−ｃｈｉａ）　、フサバクテ リウム（Ｆｕｓａｂａｃｔｅｒｉｕｍ）　、ヘモフィルス属（Ｈｅｍｏｐｈｉｌ ｕｓ）、タレプシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、レジュネラ属（Ｌｅｇｉｏ ｎｅｌ　Ｉａ）、レプトスピラ属（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）、リステリア（Ｌｉ ｓｔｅｒｉａ）、マイコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）　、マ イコプラズマ属（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、ネイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ）　、ノカルジア属（Ｎｏｃａｒｄｉａ）、パスツレラ属（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌ ｌａ）　、プロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ）　、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄ ｏｍｏｎａｓ）　、リケッチア属（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）、サルモネラ属（Ｓ ａｌｍｏｎｅｌｌａ）、セレノモナス属（Ｓｅｌｅｎｏｏ＋ｏｎａｓ）　、赤痢 菌属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、ブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、 連鎖法菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）　、トレポネーマ属（Ｔｒｅｐｎｏ ｎｅｍａ）、ビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ）、およびエルジニア属（Ｙｅｒｓ　ｉ ｎ　ｉａ）における病原体の種、アデノウィルス、コロナウィルス、ヘルペスウ ィルス、オルソミクソウィルス、ピコルナウィルス、ポックスウィルス、レオウ ィルス、レトロウィルス、ロタウィルスの群からの病原性ウィルスの株、アスペ ルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）　、プラストミセス属（Ｂｌａｓｔ−ｏ ｍｙｃｅｓ）　、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）　、コクシジオイデス属（Ｃｏ ｃ−ｃ　ｉｄ　ｔｏ　１ｄｅｓ）、クリプトコツカス属（Ｃｒｙｐ　ｔｏｃｏｃ ｃｕｓ）、ヒストプラズマ属（旧ｓｔｏｐｌａｓｍａ）およびフィコミセス属（ Ｐｈｙｃｏｍｙｃｅｓ）からの病原性菌・かび類、アイメリア属（Ｅｉｌｌｅｒ ｉａ）　、アメーバ属（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ）　、シアルシア属（Ｇｉａｒｄｉ ａ）　、およびトリコモナス属（Ｔｒ　ｉｃｏｍｏｎａｓ）における病原性寄生 体。感染症の予防は、感染症がいったん起こってから感染を処理する試みより、 非常にコスト的に有効であることは一般に認識されている。

こうして、増加した感染はヒトまたは他の動物の有効な免疫化のためのワクチン の開発に関係づけられている。ゲルマニール（Ｇｅｒｎ＋ａｎｉｅｒ）　、Ｒ， 、バクテリアのワクチン（ＢａｃｔｅｒｉａｌＶａｃｃｉｎｅｓ）、アカデミツ ク・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ）、ロンドン（１９８４）　；ブラ ウン（Ｂｒｏｗｎ）　、Ｆ、アナルス・オブ・リビュード・マイクロバイオロジ ー（Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ）３８．２２１（１９８４）。

病原体により感染した動物およびヒトの宿主は、病原体を克服するための試みに おいて免疫応答を獲得する。免疫系の３つのブランチが存在する二粘膜、体液お よび細胞。フード（Ｈｏｏｄ）、Ｌ、Ｅ、ら、イムノロジー（１＋ｕ＋ｕｎｏｌ ｏｇｙ）、第２版、ベンジャミン・パブリジング・カンパニー（Ｂｅｎｊａ＋ｉ ｉｎ　ＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＣｏ、）　、カリフォルニア州メンロバーク（１９ ８４）。

粘膜の免疫性は、気道、胃腸管および尿生殖器管のすべての粘膜表面をうるおす 分泌およびすべての分泌腺からの分泌における、分泌１ｇＡ（ｓｌｇＡ）抗体の 産生から生ずる。マクゲー（ＭｃＧｈｅｅ）、Ｊ、Ｒ，ら、アナルス・オン・ニ ューヨーク・アカデミ−・オン・サイエンス（Ａｎｎａｌｓ　ＮＹ　Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、）　、（１９８３）にれらのｓ１ｇＡ抗体は、粘膜表面上の病原体のコ ロニナイゼイシゴンを防止する作用をし〔ウィリアムス（Ｗｉｌｌｉａｍｓ）、 Ｒ，Ｃ。

ら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）１７７、６９７（１９７２）；ワクチン（？ １ｃＮａｂｂ）、ｐ、ｃ、ら、アナルス・オン・リビュード・マイクロバイオロ ジー　（Ａｎｎ、Ｒｅｖ、Ｍｔｃｒｏｂｉｏ！、）３５．４７７（１９８１）　 ）こうして粘膜表面を通してのコロニナイゼ・イションおよび侵入を防止する。

ｓＩｇＡの産生は、分泌の腺および組織の局所的免疫化によるか、あるいは腸に 関連するリンパ系組織（ＧＡＬＴまたはバイアー環）または気管支に関連するリ ンパ系組織（ＨＡＬＴ）への抗原の提示によって刺激することができる。ゲブラ （Ｇｅｂｒａ）　、Ｊ、、１．ら、コールド・スプリング・ハーバ−・シンポジ ウム・オン・コンティテイティブ・バイオロジー（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈ ａｒｂｏｒ　Ｓｙｍｐ。

Ｑｕａｎｔ、Ｂｉｏｌ、）４１．２１０　（１９７６）　；ビーオンストック（ Ｂｉｅｎｅｎｓ　ｔａｃｋ）、Ｊ、Ｍ、、アドバンシズ・イン・メディカル・バ イオロジー（Ａｄｖ。

Ｅｘｐ、Ｍｅｄ、Ｂｉｏｌ、）１０７．５３（１９７８）；　ワイスズーカリン グトン（Ｗｅｉｓｚ−Ｃａｒｒｉｎｇｔｏｎ）、Ｐ、ら、ジャーナル・オン・イ ムノロジー　（Ｊ、　Ｉｍ＋ｍｕｎｏ１）、１２３．１７０５（１９７９）　ｉ マクコーガン（ＭｃＣａｕｇｈａｎ）、Ｇ、ら、インターナショナル・リビュー ・オン・フィジオロジ−（Ｉｎｔｅｒｎａｉ、Ｒｅｖ、Ｐｙｓｉｏｌ、）２８． １３１．（１９Ｂ３）　、膜のマイクロフォルト（ｍｉｃｒｏｆｏｌｄ）細胞は 、Ｍ細胞として知られている以外、ＧＡＬＴおよびＢＡＬＴの表面を覆い、そし て他の分泌粘膜表面に関連づけることができる。Ｍ細胞は粘膜表面に隣接する管 腔の空間からの試料の抗原に作用し、そしてこのような抗原を抗原提示細胞（樹 状細胞およびマクロファージ）へ移し、次いで後者は抗原をＴリンパ球（Ｔ依存 性抗原の場合において）提示し、これはコミッテット（ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ）　 Ｂ細胞への提示のために抗原をプロセスする。次いで、Ｂ細胞は刺激されて増殖 し、移動し、そして究極的に提示された抗原に対するＩｇＡを産生ずる抗体分泌 血漿細胞に形質転換される。抗原がＧＡＬＴおよびＢＡＬＴの上に横たわるＭ細 胞により取り上げられるとき、一般化された粘膜免疫性は生じ、抗原に対するｓ ＴｇＡは体中のずべての分泌組織により産生される。セブラ（Ｃｅｂｒａ）ら、 前掲；ビーオンストック（Ｂｉｅｎｅｎｓｔｏｃｋ）ら、前掲；ワイスズーカリ ングトン（Ｗｅｉｓｚ　Ｃａｒｒｉｎｇｔｏｎ）　ら、前掲；マクコーガン（Ｍ ｃＣａｕｇｈａｎ）ら、前掲。したがって、経口的免疫化は一般化粘膜免疫応答 を刺激しそして、さらに、口腔および胃腸管における分泌免疫応答の局所的刺激 に導く。

体液の免疫性は血清中のＩｇＧおよびＩｇＭの産生物から生じ、そして病原体の 食作用、ウィルスの中和１．または病原体の補体仲介細胞障害性を増強する〔フ ード（Ｈｏｏｄ）ら、前掲〕、病原体に対する免疫性は、鳥類および哺乳動物に おいて、卵または初乳における分泌の抗体の放出によるか、あるいは哺乳動物の 場合において血清の抗体の胎盤の転移により、母から子孫に伝達されることがで きる。マクギー（ＭｃＧｅｅ）　ら、前掲、ワクチン（ＭｃＮａｂｂ）ら、前掲 ；メステラキー（Ｍｅｓ　ｔｅｃｋい、Ｊｌ、ジャーナル・オン・クリニカル・ イムノロジー（Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｉｍｍｕ−ｎｏｌ、）　７．２６５（１９８７） 　。

細胞の免疫性は２つの型をもつ：１つは遅延型過敏反応であり、これはＴリンパ 球がマクロファージを刺激してバクテリア、寄生体および真菌の病原体を殺させ るようにする。他方の型において、細胞障害性Ｔリンパ球はウィルスで感染した 宿主細胞を殺すように指令される。フード（Ｈｏｏｄ）ら、前掲。

分ｔｇＩｇＡ抗体は、粘膜の上皮細胞および宿主の歯への微生物の付着を直接阻 止する。エイブラハム（Ａｂｒａｈａｍ）　、Ｓ、Ｎ、ら、宿主防′４Ｂ機構に おける進歩（Ａｄｖａｎｃｅｓ　Ｉｎ　Ｄｅｆｅｎｓｅ　Ｍｅｃｈａｎｉｓｎ＋ ｓ）、レイブン・プレス（Ｒａｖｅｎ　Ｐｒｅｓｓ）　、ニューヨーク、Ａ−１ ６３（１９８５）。リルジェマーク（Ｌｉｌｊｅｍａｒｋ）　、Ｗ、Ｆ、ら、イ ンフエクション・アンド・イミュニイー＜Ｉｎｆｅｃｔ、１ｍｍｕｎ、＞　２６ ．１１０４（ｉ９７９）。レイホルト（Ｒｅｉｈｏｌｄｔ）、Ｊ、ら、ジャーナ ル・オン・デンタル・リサーチ（Ｊ、Ｄｅｎｔ、Ｒｅｓ、）　６６．４９２（１ ９８７）　、これは微生物の凝集、疎水性の減少、マグヌッソン（Ｍｕｇｎｕｓ ｓｏｎ）、Ｋ、Ｅ、ら、イムノロジー（Ｉｍｏ＋ｕｎｏ１ｏｇｙ）３６．４３９ （１９７９）　、または陰電荷および微生物の付着のブロッキングにより実施す ることができる。これらの抗付着作用は、他の因子、例えば、分泌塘タンパク質 、表面上皮の連続的落屑およびフローラの上皮により増幅される。アイブラハム （Ａｂｒａｈａｍ）　、Ｓ、Ｎ、ら・前掲。シェドロフスキー（Ｓｈｅｄｌｏｆ ｓｋｙ）、Ｓ、ら、ジャーナル・オン・インフェクシャス・ディジージス（Ｊ、 Ｉｎｆｅｃ、Ｄｉｓ、）１２９．２９６　（１９７４）。例えば、不活性化ビブ リオ・コレラエ（Ｖｉｂｒｉ。

Ｃｈｏｌｅｒａｅ）に対して経口的免疫化して分泌免疫応答を誘発すると、腸価 （ｉｎｔ、ｅｓｔｉｎａｌ　ｎｕｍｂｅｒ）が１０〜３０倍減少する。

ヒトの経口的ポリオウィルスワクチンおよび獣医学において適用されるいくつか の経口的または鼻内のウィルスのワクチンを使用する臨床的経験は、ｓＩｇＡが 気道および腸のウィルスの感染に対する粘膜の免疫系により保護作用において決 定的なある割合を演することを示す。ルーセルージゴンズ（１？ｕｓｅＪ−Ｊｏ ｎｅｓ）、Ｇ、Ｊ、ら、インターナショナル・アーチージス・オン・アレルギー ・アンド・イムノロジーＣＩｎｔ、Ａｒｃｂ、Ａ１１ｅｒｇｙＡｐｐ１．　Ｉｍ ｍｕｎｏｌ、）６６．３１６（１９８１）　、オグラ（Ｏｇｒａ）、Ｐ、Ｌ、ら 、肺および上部の気道の免疫学的（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｌｕ ｎｇ　ａｎｄＵｐｐｅｒ　Ｒｅ５ｐｉｒａｔｏｒｙ　Ｒｅ５ｐｉｒａｔｏｒｙ　 Ｔｒａｃｔ）、ビーオンストック（Ｂｉｅｎｅｒ＋５ｔａｃｋ）　（［）　、マ クグロー−ヒル（ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ）　、ニューヨーク、２４２　（１９ ８４）。ｓｌｇＡの作用は、付着の防止よりむしろ宿主細胞中のウィルスの進入 を阻害するという作用であるように思われる。タイラー（Ｔａｙｌｏｒ）、Ｈ， Ｐ、ら、ジャーナル・オン・イクスペリメンタル・メディシン（Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍ ｅｄ、）　１６１．１９Ｂ（１，９８５）　、キリアン（Ｋｉｌｉａｎ）、門、 ら、マイクロバイオロジカル・リビューズ（Ｍｉｃｒｏｂｉｐｌ、Ｒｅｖ、）５ ２．２９６　（１９８Ｂ）。

Ｂ、　のノ　−の−・ 植物および植物組織の遺伝子の形質転換（すなわち、外来ＤＮＡの植物中の安定 な導入）の種々の方法が、この分野において知られている。これらは、アグロバ クテリウム（Ａｇｒｏ−ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属による形質転換および直接の遺 伝子の転移による形質転換を包含する。

１、アグロバクテリウム（Ａ　ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）　のノ　−アグロバク テリウム・ツメファシェンス（Ａ、ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）は、広い範囲の双 子葉植物および裸子植物の病気である、ブラウンコールの病因学的因子であり、 デクリーン（ＤｅＣｌｅｅｎｅ）、ｈ、ら、ボタニカル・リビュー　（Ｂｏｔ、 Ｒｅｖ、）４２．３８９（１９７６）　、感染の部位において植物組織における 腫瘍またはゴールを形成する。アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ ■）は、通常植物を傷付いた部位において感染し、Ｔｉ（腫瘍誘発）プラスミド と呼ぶ大きい染色体外要素を有する。

Ｔｉプラスミドは腫瘍発生に要求される２つの領域を含有する。１つの領域はＴ −ＤＮＡ　（転移ＤＮＡ）であり、これは植物のゲノムＤＮＡに安定に転移され ることが究極的に発見されるＤＮＡ配列である。腫瘍発生に要求される他方の領 域は、転移機構に関係づけられたｖｉｒ　（ビルレンス）領域である。ｖｉｒ領 域は安定な転移に絶対的に要求されるが、ｖｉｒＤＮＡは感染した植物に実際に 転移されない。チルトン（Ｃｈｉｌｔｏ、ｎ）、Ｍ−Ｄ、ら、細胞（Ｃｅｌｌ） ■、２６３　（１９７７）、トマショウ（Ｔｈｏｍａｓｈｏｗ）　、Ｍ、Ｆ、ら 、細胞（Ｃｅｌｌ）１９．７２９（１９８０）　、アグロバクテリウム・ツメフ ァシェンス（＾、　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）で感染することにより仲介される 植物細胞の形質転換および引き続＜Ｔ−ＤＮＡ単独の転移は、文献によく記載さ れてきている。参照、例えば、ベバン（Ｂｅｖａ）、門、岨ら、インターナショ ナル・リビュー・オン・ジエネティックス（Ｉｎｔ、Ｒｅｖ、Ｇｅｎｅｔ、）■ 、３５７　（１９８２）。

多数の研究所における数年の徹底的な研究後、種々の植物組織の日常の形質転換 を可能とするアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）系が開発され た。参照、例えば、シェル（Ｓｃｈｅｌｌ）、Ｊ、ら、バイオ／テクノロジー（ Ｂｉｏ／　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）上、１．７５（１９８３）　；チルトン（Ｃ ｈｉｌｔｏｎ）　、Ｍ−Ｄ、サイアンティフィック・アメリカン（Ｓｃｉ、Ａｍ ｅｒｃａｎ）　２４Ｂ、５０（１９８３）。この方法において形質転換された代 表的な組織は、次のものを包含する：タバコ、バートン（Ｂａｒｔｏｎ）、Ｋ、 Ａ、ら、細胞（Ｃｅｌｌ）皿、１０３３（１９８３）　；　トマト、ファラッチ （ｆｉｌ、１ａｔｔｉ）、Ｊ、ら、バイオ／テクノロジー（Ｂｔｏ／　Ｔｅｃｈ ｎｏｌｏｇｙ）　５．７２６（１９８７）　；ヒマワリ、エベレ７ット（ＩＥｖ ｗｒｅｔｔ、）　、Ｎ、Ｐ、ら、バイオ／テクノロジー（Ｂｔｏ／Ｔｅｃｈｎｏ ｌｏｇｙ）　５．１２０１　（１，９８７）　；ワタ、ランベック（（１ｍｂｅ ｃｋ）、Ｐ、ら、バイオ／テクノロジー（Ｂｉｏ／　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）５ 、２６３（１９８７）　；菜種、プア（Ｐｕａ）　、Ｅ、Ｃ，ら、バイオ／テク ノロジー（Ｂｉｏ／　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）　５．８１５（１９８７）　；ジ ャガイモ、ファシオッチ（Ｆａｃｅｉｏｔｔｉ）　、Ｄ、ら、バイオ／テクノロ ジーＣＢｔｏ／　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）　３．２４１（１９８５）　；ポプラ 、ピトウド（Ｐｙｔｈｏｕｄ）　、Ｆ、ら、バイオ／テクノロジー（Ｂｉｏ／　 Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）主、１３２３（１９Ｂ？）　；およびダイス、ヒンチェ ー、Ｍ、Ａ、ら、バイオ／テクノロジー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）　６ ．９１５（１９８８）。

アグロバクテリウム・リゾゲネ（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｎ＋　ｒｈｉｚｏｇ ｅｎｅｓ）は、また、植物の形質転換のためにベクターとして使用されてきてい る。このバクテリアは、多数の双子葉植物種において根毛の形成を刺激し、Ｒｉ （根の誘発）プラスミドと呼ぶ大きい染色体外の要素を有し、このプラスミドは アグロバクテリウム・・ツメファシェンス（Ａ、　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）の Ｔｉプラスミドに類似する方法で機能する。アグロバクテリウム・リゾゲネス（ Ａ、ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）を使用する形質転換は、アグロバクテリウム・ツメ ファシェンス（Ａ、　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のそれと同様に開発され、そし て、例えば、アルファルファ、スカピンダ（Ｓｕｋｈａｐｉｎｄａ）、Ｋ、ら、 プラント・モレキュラー・バイオロジ（Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、）　８ ．２０９（１９８７）　？ソラヌム・ニグルム（Ｓｏｌａｎｕｍ　ｎｉｇｒｕｍ ）Ｌ、、ウェイ（Ｗｅｔ）、Ｚ−Ｈら、プラント・セル・リボーツ（Ｐｌａｎｔ 　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｐｏｒｔｓ）　５．９３（１９８６）　ｉおよびポプラ、ビト ウド（Ｐｙｔｈｏｕｄ）　ら、５ｕｐｒａ　、を形質転換するために首尾よく利 用されてきている。

２、宵の−〇Ｉ　− 植物および植物の組織を形質転換するために、いくつかのいわゆる直接の遺伝子 の形質転換が開発された。原形質体の直接形質転換において、原形質体中の外因 性遺伝子物質の取込みは、化学因子または電場の使用により増強することができ る。次いで、外因性物質は核のゲノムの中に組み込むことができる。初期の研究 は双子葉植物のニコチアナ・タバクム（Ｎｉｃｏｔｉｎａ　ｔａｂａｃｕｍ）　 （タバコ）において実施され、ここで外来ＤＮＡは子孫の植物の中に組み込まれ および転移されることが示された。パスズコウスキー（Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉ） 、Ｊ、ら、ＥＭＢＯジャーナル（Ｊ、）　３．２７１７（１９８４）　；および ポトリクス（Ｐｏｔｒｙｋｕｓ）、■、ら、モレキュラー・アンド・ジェネラル ・ジエネテイックス（Ｍｏｌｅｃ、Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、）１９９．１６９　（ １９８５）。

単子葉植物の原形質体は、また、この手順により形質転換されてきている：例え ば、トリチクム・モノコクム（Ｔｒｉｔｉｃｕｍｍｏｎｏｃｏｃｃｕｍ）、ロル ズ（Ｌｏｒｚ）、Ｈｌら、モレキュラー・アンド・ジェネラル・ジエネティック ス（Ｍｏ１ｅｃ、Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、）１９９．１７８（１９８５）　；　ロ リウム・ムルチフロルム（Ｌｏｌｉｕｎ＋　ｍｕＨｉｆｌｏｒｕｍ）（イタリア のライグラス）、ポトリクス（ｐｏｔｒｙｋｕｓ）、■、ら、モレキュラー・ア ンド・ジェネラル・ジェネティックス（Ｍｏ１ｅｃ、Ｇｅｎ、Ｇｅｎｅｔ、）１ ９９．１８３（１９８５）　；　）ウモロコシ、ロウデス（Ｒｈｏｄｅｓ）、Ｃ ８ら、バイオ／テクノロジー（Ｂｉｏ／　Ｔｅｃｈｎｏｌｏ−ｇｙ）　５．５６ （１９８８）　；およびブラック・メキシカン・スウィート３コーン（Ｂｌａｃ ｋ　Ｍｅｘｉｃａｎ　ｓｗｅｅｔ　ｃｏｒｎ）、フロム（Ｆｒｏ＋＋ｖ＋）、Ｈ ｏら、ネイチャー　（Ｎａ　ｔｕｒｅ）　３１９．７９１（１９８６）。

ニコチアナ・タバクム（Ｎ、　ｔａｂａｃｕｎ＋）の原形質体中のＤＮＡの導入 は、原形質体を電気パルスで適当なりＮＡの存在下にエレクトロポレイションと 呼ぶ方法において処理することによって実施する。フロム（ＦｒｏＩｌｌｌｌ） 　、Ｍ、Ｅ、、メソフズ・イン・エンジモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎ ｚｙｍｏｌｏｇｙ）　、つ（向）、Ｒ１およびグロスマン（Ｇｒｏｓｓｍａｎ） 、Ｌ９編、アカデミツク・プレス（八ｃａ〜ｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ）、フロリ ダ州オーランド、Ｖｏｌ、１５３．３０７（１９８７）およびシリト（Ｓｈｉｌ ｉｔｏ）　、Ｒ，Ｄ、およびボトリクス（Ｐｏｔｒｙｋｕｓ）、１０、メソッズ ・イン・エンジモロジ−（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏ−ｇｙ）　 、つ（向）、Ｒ６およびグロスマン（Ｇｒｏｓｓｍａｎ）、Ｌ２編、アカデミツ ク・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ）、フロリダ州オーランド、Ｖｏｌ 、１５３．２８３（１９８７）。原形質体を分離し、そしてマンニト−ル溶液中 に懸濁する。スーパーコロイド化したまたは円形のプラスミドＤＮＡを添加する 。この溶液を混合し、そして室温において約４００Ｖ／ＣＩのパルスに１０〜１ ００μｓｅｃ間暴露する。膜の可逆的物理学的破壊はＤＮＡを原形質体の中に取 込ませる。

ＤＮＡのウィルスは遺伝子のベクターとして使用されてきている。修飾されたバ クテリアのメトトレキセート抵抗性遺伝子を有するカリフラワーのモザイクウィ ルスは、植物の感染に使用された。外来遺伝子は植物の中において組織的に広が った。ブリッソン（Ｂｒｉｓｓｏｎ）　、Ｎ、ら、ネイチ＋　−（Ｎａｔｕｒｅ ）３１０．５１０１９８４）。この系の利点は、感染の容易さ、植物内の組織的 法がり、および細胞当たりの遺伝子の多数のコピーである。

リポソームの融合は、また、植物細胞の形質転換の方法であることが示された。

膜が没入するとき、外来遺伝子は原形質体に転移される。デバイス（Ｄｅｈａｙ ｅｓ）　、Ａ、ら、ＥＭＢＯジャーナル（Ｊ、）土、２７３１　（１９８５）。

ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）仲介形質転換は、ニコチアナ・タバクム（Ｎ 、　ｔａｂａｃｕａ＋）双子葉植物およびロリウム・ムルチフロルム（Ｌｏｌｉ ｕａ＋　ａ＋ｕｌｔｉｆｌｏｒｕｍ）単子葉植物において実施された。それはＭ ｇ”、ＰＥＧ、および多分Ｃ％＋の相互作用に基づく直接の遺伝子の転移の化学 的手順である。ネグルチウ（Ｎｅｇｒｕ−ｔｉｕ）、Ｒｏら、プラント・モレキ ュラー・バイオロジー（ＰｌａｎｔＭｏｌ、Ｂｉｏｌ、）−８，３６３（１９８ ７）。

あるいは、外因性ＤＮＡはマイクロインジェクションにより細胞または原形質体 の中に導入することができる。プラスミドのＤＮＡの溶液は、微細に引かれるガ ラス針で細胞の中に直接注入される。この方法において、アルファルファの原形 質体は種々のプラスミドにより形質転換された、レイチ（Ｒｅｉｃｈ）　、Ｔ、 Ｊ、ら、バイオ／テクノロジー（Ｂｉｏ　／　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）土、１０ ０１　（１９８６）。

直接遺伝子転移のより最近開発された手順は、ＤＮＡを有する微細な投射体によ る細胞の衝突を包含する。フレイン（Ｋｌｅｔｎ）　、Ｔ、Ｍ、ら、ネイチ＋　 （Ｎａｔｕｒｅ）３２７．７０（１９８７）、粒子の加速と呼ぶこの手順におい て、外因性ＤＮＡで被覆したタングステンまたは金の粒子を標的細胞に向かって 加速される。少なくとも一時的発現はタマネギにおいて達成される。

この手順は、懸濁培養におけるブカック・メキシカン・スウィート・コーンの細 胞およびトウモロコシ未成熟の胚の中およびケイプの原形質体の中にＤＮＡを導 入するために利用された。フレイン（Ｋｌｅｉｎ）　、Ｔ、Ｍ、ら、バイオ／テ クノロジー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）　６．５５９（１９８８）　、マ クケイプ（ＭｃＣａｂｅ）、Ｄ、Ｅ、ら、バイオ／テクノロジー（Ｂｉｏ／　Ｔ ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）　６．９２３（１９８８）。トウモロコシおよびタバコの 安定に形質転換された培養物は、微細な投射体の衝突により得られた。フレイン （に１ｅｉｎ）　、Ｔ、Ｍ、ら（１９８８）、５ｕｐｒａ　、安定に形質転換さ れたケイプの植物は、この手順により得られた。マクケイプ（ＭｃＣａｂｅ）、 Ｄ、Ｅ、ら、前掲。

Ｃ０亘１９」ｌＪと１釦狂ル観 ちょうど上のように、植物組織の形質転換の種々の方法が存在し１．植物組織か ら植物を再生する種々の方法が存在する。

再生の特定の方法は、出発植物組織および再生すべき特定の植物種に依存する。

近年において、植物の移植片から誘導されたカルスの組織からの多数の種の植物 を再生することができるようになった。カルスから再生することができる植物は 、次のものを包含する：単子葉植物、例えば、トウモロコシ、イネ、オオムギ、 コムギおよびライムギ、および双子葉植物、例えば、ヒマワリ、ケイプ、ワタ、 菜種およびタバコ。

アグロバクテリウム・ツメファシェンス（Ａ、　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）で形 質転換した組織から植物の再生は、いくつかの種の植物について実証された。こ れらは次のものを包含する：ヒマワリ、エベレット（Ｅｖｅｒｅｔｔ）　、Ｍ、 Ｐ、ら、前掲ニドマド、ライラッチ（Ｆｉｌｌａｔｔ、ｉ）、Ｊ、Ｊ、ら、前掲 ；ホワイトクローバ−（Ｗｈｉｔｅｃｌｏｖｅｒ）、ホワイト（Ｗｈｉｔｅ）　 、ＤＪ、Ｒ，ら、プラント・モレキュラー・バイオロジー（Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１ ．Ｂｉｏｌ、）　８．４６Ｎ１９８７）　ｉ菜種、シア（Ｐｕａ）　、Ｅ　ｃ、 ら、前掲；ワタ、ランベック（Ｌｌｍｂｅｃｋ）ら、前掲；タバコ、ホルン、： Ｌ　（Ｈｏｒｓｃｈ）、Ｒ，Ｂ、ら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）　２２５． １２９９　（１９８５）およびヘレラーエストレラ（Ｈｅｒｅｒｒａ−Ｅｓｔｒ ｅｌｌａ）、Ｌ、ら、ネイチャー　（Ｎａ　Ｌｕｒｅ）　３０３．２０９　（１ ９８３）　；およびポプラ、ブトウド（Ｐｙｔｈｏｕｄ）ら、前掲。

アグロバクテリウム・リゾゲネス（Ａ、ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓ）で形質転換した 組織からのアルファルファの再生は、スクハピンダ（Ｓｕｋ−ｈａｎｐｉｎｄａ ）　、Ｋ、ら、前掲。

原形質体からの植物の再生はとくに有用な技術である。参照、エバンス（Ｅｖａ ｎｓ）　、Ｄ、Ａ、ら、植物細胞培養のハンドブック（Ｈａｎｄｂｏｏｋ　ｏｆ 　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ）土、１２４（１９８３）　、植物種 を原形質体から再生することができるとき、直接遺伝子転移手順を利用すること ができ、そして形質転換はアグロバクテリウム・ツメファシェンス（Ａ、ｔｕｍ ｅｆａｃｉｅｎｓ）の使用に依存しない。原形質体からの植物の再生は、次の植 物について実証された：イネ、アブダラ（Ａｂｄｕｌｌａｈ）、Ｒｏら、バイオ ／チク２ノロジー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）　４．１０８７（１９８７ ）　；タバコ、ボトリクス（Ｐｏｔｒｙｋｕｓ）、■、ら、前掲；菜種、カンシ ャ（Ｋａｎｓｈａ）ら、プラント・セル・リポーツ（Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｒ ｅｐｏｒｔｓ）　５．１０１（１９８６）　；ジャガイモ、タバッザ（Ｔａｖａ ｚｚａ）　、Ｒ，ら、プラント・セル・リボーツ（Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅ ｐｏｒｔｓ）　５．２４３（１９８６）　；ナス、シハチャキ（Ｓｉｈａｃｈａ ｋｉ）　、Ｄ、ら、植物細胞、組織、器官培養（Ｐｌａｎｔ、Ｃｅ１ｌ、Ｔｉ５ ｓｕｅ、Ｏｒｇａｎ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ）　１１％　１７９（１９８７）　；キュ ウリ、シア（Ｊｔａ）　、Ｓ−Ｒ，ら、ジャーナル・オン・プラント・フィジオ ロジ−（Ｊ、Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌ、）１２４．３９３　（１９８６）　 ；ポプラ、ラッセル（Ｒｕｓｓｅｌ）、Ｊ、Ａ、ら、プラント・サイエンス（Ｐ ｌａｎｔ　Ｓｃｉ、）４６．１３３（１９８６）　ｉ　）ウモロコシ、オウデス （Ｒｈｏ−ｄｅｓ）、Ｃ０ら、前掲；およびケイプ、マクケイプ（ＭｃＣａｂｅ ）、Ｄ。

腸に関連するリンパ系組織（ＧＡＬＴ）のバイアー環の上に横たわるＭ細胞は、 種々の抗原物質および粒子を取り上げることができる〔スネラー（Ｓｎｅｌｌａ ｒ）　、パ、Ｃ０およびストロウバー（Ｓｔｒｏｂｅｒ）　、Ｗ、、ジャーナル ・オン・インジェクション・デよびポリスチレンの球、木炭、マイクロカプセル および他の可溶性および粒状物質を取り上げる能力をもつために、種々の物質を 放出すべき物質の任意の特異的付着型の性質に対して独立に放出することができ る。この場合において、ＧＡＬＴへの抗原の放出は粘膜表面上の抗原に対するｓ ｌｇＡの産生およびすべての分泌腺により、一般化した粘膜の免疫応答に導く。

また、粘膜表面へまたは分泌腺へ抗原を放出することによって、局所的分泌免疫 応答を刺激することができる。このような局在化分泌免疫応答を発生する機構は それほど理解されていない、最近の証拠、ブラック（Ｂｌａｃｋ）　、Ｒ，Ｅ、 ら、インフェクション・アンド・イミュニイー（Ｉｎｆｅｃｔ、Ｉｍｍｕｎ、） 　５５．１１１６（１９８７）　；エルシン（Ｂｉｓｏｎ）　、Ｃ，０，、カレ ント・トピックス・オン・マイクロバイオロジカル・イムノロジー（Ｃｕｒｒ、 Ｔｏｐ。

Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、Ｉｍｍｎｏｌ、）１４６．２９（１９８９）は、コレラの 毒素のＢサブユニットを抗原とともに経口的に投与したとき、アジュバントとし て保護の免疫応答を増強する働くことを示す。したがって、コレラの毒素ならび にＥ、ｃｏｌｔＯ熱不安定性エンテロトキシンのＢサブユニットは腸の上皮の（ １，Ｍ−１ガングリオシドへ付着しそして上皮の膜を横切って転位することがで きるので、このようなパイロットタンパク質またはターゲティングタンパク質は 局所的分泌免疫応答の引き出しにおいて重要でありうるといえる。

もちろん、次のことを考えることができる：所定のコロニナイゼイション抗原お よび／またはビルレンス抗原をコレラの毒素のＢサブユニット、熱不安定性エン テロトキシンを特定する゛Ｎ末端またはＣ末端の配列に融合すること、ヤマモト 、Ｔ、ら、ジャーナル・オン・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ、Ｂｉｏｌ、 Ｃｈｅｍ、）２５９．５０３７　（１９８４）、ｔｘ−Ｄ−ガラクトピラノシル −（１，４）−β−Ｄ−ガラクトピラノシドに特異的に結合するＰａｐＧタンパ ク質の付着、ランド（Ｌｕｎｄ）、Ｂ、ら、プロシーディンゲス・オン・ナショ ナル・アカデミ−・オン・ザイエンシズ（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃ ｉ、）ＵＳＡ、、８４．５８９８　（１９８７）、あｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓ ｉｓ）　、イスバーブ（Ｉｓｂｅｒｇ）、Ｒ，Ｒ，ら、細胞（Ｃｅｌｉ）利、７ ６９（１９８７）　、赤痢菌属（Ｓｈ　ｉ　ｇｅ　Ｉ　Ｉａ）およびサルモネラ 属（Ｓａｌ＋ｍｏｎｅｌｌａ）、ガラン（Ｇａｔａｎ）１、Ｊ、ら、プロシーデ ィンゲス・オン・ナショナル・アカデミ−・オン・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｆ、）ＵＳＡ、　８６．６３８３（１９８９）　；カ ーチス（Ｃｕｒｔｉｓｓ）、Ｒ，ＩＩＩ　ら、カレント・トピックス・オン・マ イクロバイオロジカル・イムノロジー（Ｃｕｒｒ、Ｔｏｐ、河ｆｃｒｏｂｉｏ１ ．Ｉａ＋ｍｎｏ１．）１４６．３５（１９８９）の中で固定されかつそれからク ローニングされた、上皮細胞膜を通してバクテリアを浸透させる侵入。各場合に おいて、遺伝子の融合の産生物は、腸粘膜の細胞の中により容易に移送され、そ して局所的分泌免疫応答を増強することを予測することができる。また、この形 態の遺伝子の融合は、ＧＡＬＴへの抗原の取込みおよび提示を促進することがあ りうる。

特定の抗原に対するｓＩｇＡの産生は、さらに、経口的に投与したアジュバント 、例えば、微生物の細胞壁の構成成分の添加により増強することができる、ミカ レク（Ｍｉｃｈａｌｅｋ）ら、カレント・トビックス・オン・マイクロバイオロ ジカル・イムノロジー（Ｃｕｒｒ、Ｔｏｐ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　Ｉｍｍｎｏ ｌ、）１４６．５１　（１９８９）。

したがって、局所的および一般化された性質の両者の特異的ｓＩｇＡの応答の刺 激は、精製したタンパク質、タウブマン（Ｔａｕｂｍａｎ）　、Ｍ、Ａ、および り、Ｊ、スミス（Ｓｗｉｔｈ）　、カレント・トピックス・オン・マイクロバイ オロジカル・イムノロジー（Ｃｕｒｒ、Ｔｏｐ、Ｍｉｃｒｏｂｏｌ、Ｉｍｍｎｏ ｌ、）　１４６．１８７　（１９８９）、マイクロカプセル化した微生物の産生 物およびウィルス、エルドリッジ（Ｅｌｄｒｔｇｅ）　、Ｊ、Ｈ，ら、カレント ・トピックス・オン・マイクロバイオロジカル・イムノロジー（Ｃｕｒｒ、Ｔｏ ｐ、Ｍｉｃｒｏｂｏｌ、　Ｉｍｍｎｏ−１、）　１４６．５９　（１９８９）、 殺した全バクテリア、ミカレク（河１ｃｈａ−１ｅｋ）ら、サイエンス（Ｓｃｉ ｅｎｃｅ）　１９１．１２３Ｂ　（１９７６）の経口的投与により、および生き ている弱毒化したウィルス、セブラ（Ｃｅｂｒａ）　ら、前掲、およびバクテリ ア、カーチス（Ｃｕｒｔｉｓｓ）、Ｒ，ＩＩＩ　ら、プロシーディング・オン・ ザ・テンス・インターナショナル・コンポケイジョン・オン・イムノロジー（Ｐ ｒｏｃｅ−ｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｔｅｎｔｈ　Ｉｎｔｅｒｎａｔｆｏｎ ａｌ　Ｃｏｎｖｏｃａｔｉｏｎ　ｏｎ　Ｉ＋ａｍｕｎ−ｏｌｏｇｙ）、２６１　 、Ｈ，コーラ−（Ｋｏｈｌｅｒ）ら編、ラングマン・サイアンティフィック・ア ンド・テクニカル（Ｌｏｎｇｍａｎ　５ｃｉｅｎｔｔｆｉｃａｎｄ　Ｔｅｃｈｎ ｉｃａｌ）、バーロン、エセックス、英国（１９８７）の摂取することによって 達成することができる。体中の抗体分泌細胞の８０％がｓｌｇＡを産生ずること 、およびＩｇＧより２倍程度に覆いｓＩｇＡが毎日産生された循環系に入ること を認識すると、分泌免疫系の相対的重要性は明らかとなる。ブランドラアブ（Ｂ ｒａｎｄｔｚａｅｇ）、Ｐｌ、カレント・トピックス・オン・マイクロバイオロ ジカル・イムノロジー（Ｃｕｒｒ、　Ｔｏｐ、　Ｍｉｃｒｏｂｏｌ、　Ｉｍｍｎ ｏｌ、）ｋ匝、１３（１９８９）。

微生物のストレプトコッカス・ムタンス（Ｓ　ｔｒｅｐ　ｔｏｃｏｃｃｕｓｍｕ ｔａｎｓ）群は、むしばの主な病因学的因子を構成する。ギボンス（ｇｊｂｂｏ ｎｓ）　、Ｓ、ら、アナルス・オン・リビュード・マイクロバイオロジー（Ａｎ ｎ、Ｒｅｖ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、）２６．１２１（１９７５）　；ハマダ、Ｓ 、ら、マイクロバイオロジカル・リビューズ（Ｍｉｃｒｏｂｉｐｌ。

Ｒｅｖ、）　４４．３３１　（１９８０）。それらは歯の表面でコロニナイゼイ ションし、そしてそのに寿命を通して止まる。殺したストレプトコッカス・ムタ ンスに、Ｈｕｔａｎｓ）の経口的摂取は、唾液中のストレプトコッカス・ムタン ス（Ｓ、ｔｔｒｕｔａｎｓ）の抗原に対するｓＩｇＡの産生に導き、ミカレク（ Ｍｉｃｈａｌｅｋ）、Ｓ、Ｍ、ら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）　１９１１２ ３８（１９７６）　；マステラキイ（Ｍａｓ　ｔｅｃｋｅｙ）、Ｊ、ら、ジャー ナル・オン・クリニカル・イベスティゲイション（Ｊ、Ｃｌ１ｎ、　Ｉｎｖｅｓ ｔ、）６１．７３１　（１９７８）そしてこれは蓋歯類およびＮ長類の歯上のス トレプトコッカス・ムタンス（Ｓ、ｍｕｔａｎｓ）のコロニナイゼイションの防 止において有効であり、したがって虫歯の誘発を防止することが示された。ミカ レク（Ｍｉｃｈａ〜１ｅｋ）ら、５ｕｐｒａ　；チャラコンベ（Ｃｈａｌｌａｃ ｏｓ＋ｂ）、Ｓ、Ｊ、ら、アーチーゲス・オン・オーラル・バイオロジー（Ａｒ ｃｈ、０ｒａｌ　Ｂｉｏｌ、）」、９１７（１９８０）。ｓｌｇＡはコロニナイ ゼイションが有効となる前に存在しな（ではならないので、コロニナイゼイシゴ ンが起こった後、ストレプトコッカス・ムタンス（Ｓ、ｍｕｔａｎｓ）のコロニ ナイゼイション抗原に対するｓＩｇＡを産生ずるように免疫化された個体は、バ クテリアが歯科の予防の間に機械的に除去されないかぎり、ストレプトコッカス ・ムタンス（Ｓ、ｍｕｔａｎｓ）で連続的にコロニナイゼイションされるであろ う。カーチス（Ｃｕｒｔｉｓｓ）　、Ｒ，ＩＩＩら、カレント・トピックス・オ ン・マイクロバイオロジカル・イムノロジー（Ｃｕｒｒ、Ｔｏｐ、Ｍｉｃｒｏｂ ｏｌ、Ｉ＋ｕａ−ｎｏｌ、）月１．２５３（１９８５）　、多数の技術を使用し て、病原体の表面のどの構成成分がその病原体によるコロニナイゼイションおよ びビルレンスの発現に対して重要であるかを決定することができる。こうして、 突然変異体を分離し、そしてコロニナイゼイシタンするか、あるいは病気を引き 起こす能力について試験することができる。遺伝子のクローニングを使用して、 異種微生物において遺伝子産生物を産生ずることができる０発現された遺伝子産 生物を使用して、動物を免疫化して、病原体によるコロニナイゼイションおよび ／またはビルレンスが開始されるかどうかを決定することができる。このような 研究に基づいて、科学者は種々のコロニナイゼイション抗原およびビルレンス抗 原に対する相対的重要性を推定し、これによりワクチン組成物における使用に適 当なものを選択して、ヒトまたは他の動物の宿主を免疫化し、そして病原体によ るコロニナイゼイションおよび感染を予防することができる。このような研究は 、微生物のストレプトコッカス・ムタンス（Ｓ、ｏ＋ｕｔａｎｓ）群を使用して 実施して、表面タンパク質抗いる）、グリコジルトランスフェラーゼ、デキスト ラーゼおよびグルカン結合タンパク質の決定的な重要性を実証した。

カーチス（Ｃｕｒｔｉｓｓ）　、１９８５、前掲。

表面タンパク質抗原Ａ（ＳｐａＡ）は、ストレプトコッカス・ムタンス（Ｓ、＋ ａｕｔａｎｓ）の表面上の主要なタンパク質抗原を構成する。カーチス（Ｃｕｒ ｔｉｓｓ）　、Ｒ，ＩＩＩ　ら、連鎖法菌属の遺伝学（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃ ａｌ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、フエレッチ（Ｆｅｒｒｅｔｔｉ）、Ｊ、　Ｊ、ら編 、アメリカン・ソサイアティ・フォー・マイクロバイオロジー（Ａｍｅｒｉｃａ ｎ　５ｏｃｉｅｔｙ　ｆｏｒ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｇｙ）、ワシントンＤ、Ｃ。

ｐｐ、２１２−２１６　（１９８７）。５ｐａＡ増殖培地はクローニングされ、 ホル）　（）Ｉｏｌｔ）、Ｒ，Ｇ、ら、インフェクション・アンド・イミュニイ −（ｒｎｆｅｃｔＪｍｍｕｎ、）　３Ｂ、１４７（１９８２）　、部分的に配列 決定されそして主要な抗原決定基はマツピングされた。ストレプトコッカス・ム タンス（Ｓ、＋＋＋ｕｔａｎｓ）の経口的摂取により意図的にまたは自然に免疫 化されたマウスおよびヒトは唾液中で５ｐａＡタンパク質に対するｓＩｇＡを産 生ずることは知られている。さらに、抗原１／ＩＩ（本質的に５ｐａＡに免疫学 的に同一である、ボルト（Ｈｏｌｔ）ら、前掲〕によるサルの免疫化は、ストレ プトコッカス・ムタンス（５，Ｈｔａｎｓ）のコロニナイゼイションおよびスト レプトコッカス・ムタンス（Ｓ、ｍｕｔａｎｓ）誘発むしばに対する保護的免疫 性を生ずることは知られている、ラッセル（Ｒｕｓ−ｓｅｌ）Ｍ、Ｗ、ら、イム ノロジー（Ｉａ＋ａｕｎｏｌｏｇｙ）４０．９７　（１９８０）。

侵入性サルモネラ属（Ｓａｌｓ＋ｏｎｅｌｌａ）、例えば、ネズミチフス菌（Ｓ 、　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）およびチフス菌（Ｓ、　ｔｙｐｈｉ）は、それぞ れ、マウスおよびヒトにおける腸チフスの病因学的因子を構成する。それらは、 経口的摂取後、ＧＡＬＴへの付着、侵入および増殖により、深い組織へのアクセ スを獲得する。カーター（Ｃａｒ−ｔｅｒ）およびコリンズ（Ｃｏｌｌｉｎｓ） 　、ジャーナル・オン・イクスペリメンタル・メディシン（Ｊ、Ｅｘｐ、Ｍｅｄ 、）１３９．１１８９（１９７４）。

サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）は、既知の遺伝子の中に突然変異を導入 することによって、無毒性として病気を誘発しないようにすることができる。ジ ャーニール（Ｇｅｒ＋５ａｎｉｅｒ）　、Ｒ，ら１インフエクシヨン・アンド・ イミュニイー（Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｉｍａ＋ｕｎ、）土、６６３（１９７１）　； ジャーニール（Ｇｅｒｍａｎｉｅｒ）　、　Ｒ，らジャーナル・オン・インフェ クシャス・ディジージス（Ｊ、Ｉｎｆｅｃ、Ｄｉｓ、）１３１．５５３　（１９ ７５）　；ホイセト（Ｈｏｉｓｅｔｈ）　、およびストッカー（Ｓｔｏｃｋｅｒ ）、ネイチ−？　−（Ｎａ　ｔｕｒｅ）　２９１．２３Ｂ（１９８１）　；カー チス（Ｃｕｒｔｉｓｓ）ら、インフヱクション・アンド・イミュニイー（Ｉｎｆ ｅｃｔ、　Ｉｍｍｕｎ、　）公、３０３５　（１９８７）。このような突然変異 は、経口的に投与したとき、免疫原性であり、そしてＧＡＬＴに対するそれらの 組織の属性を保持する。カーチス（Ｃｕｒｔｉｓｓ）　、Ｒ，ＩＩＩ　ら、プロ シーディング・オン・ザ・テンス・インターナショナル・コンポケイジョン・オ ン・イムノロジー（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ＴｅｎｔｈＩｎｔ ｅｒｎａｔｉｎａｌ　Ｃｏｎｖｏｃａｔｉｏｎ　ｏｎ　Ｉｍｔａｕｎｏｌｏｇｙ ）　、２６１　、Ｈ＋コーラ−（Ｋｏｈｌｅｒ）ら績、ラングマン・サイアンテ ィフィック・アンド・テクニカル（Ｌｏｎｇｍａｎ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　ａ ｎｄ　Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ）、バーロン、エセックス、英国（１９８７）　；カ ーチス（Ｃｕｒｔｔｓｓ）　、Ｒ。

ＩＩＩ　ら、インフェクション・イミュニイー（Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｉｍｍｕｎ、 ）公、３０３５　（１９８７）。

それらを無毒性とする種々の欠失突然変異を有する、ある数のネズミチフス菌（ Ｓ、　ｔｙｐｈｉａ＋ｕｒｉｕａ＋）およびチフス菌（Ｓ、　ｔｙｐ−ｈｉ）の 菌株は、いくつかの病原体からコロニナイゼイション抗原および／またはビルレ ンス抗原を産生する能力を使用して構成された。経口的免疫化は、発現された抗 原に対するｓｌｇＡおよびＩｇＧの応答の生成に導く。フォーマル（Ｆｏｒｍａ ｌ）、Ｓ、Ｂ、ら、インフェクション・アンド・イミエニイー（Ｉｎｆｅｃｔ。

Ｉｍｍｕｎ、）３４．７４６（１９８１））　；ステベンソン（Ｓｔｅｖｅｎｓ ｏｎ）　、Ｇ、ら−ＦＢ？ｌＳマイクロバイオロジカル・レターズ（Ｍｉｃｒｏ ｂｉｏｌ、Ｌｅｔｔ、）訃、３１７（１９８５）　；クレンッ（Ｃ１ｅａ＋ｅｎ ｔｓ）、Ｊ、Ｄ、Ｊ、Ｄ、ら、インフェクション・アンド・イミュニイー（Ｉｎ ｆｅｃｔ、　Ｉｍｍｕｎ、）５３．６８５（１９８６）　；マスケル（Ｍａｓｋ ｅｌｌ）　、Ｄ、ら、ワクチン（Ｖａｃｃｉｎｅ）銭、ゴールド・スプリング・ ハーバ−・ラボラトリ−、コールド・ハーバ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｊｎｇ　Ｈａ ｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）　、コールド・スプリング・／”ｔ−バー（ Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ）、ニューヨーク、ｐｐ、２１３−２１ ７　（１９８６）。ストレプトコッカス・ムタンス（Ｓ、ｍｕｔａｎｓ）Ｓｐａ Ａおよびグルコシルトランスフェラーゼタンパク質を発現する組み換え無毒性サ ルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）は構成された。カーチス（Ｃｕｒｔｉｓｓ ）ら、分泌免疫系（Ｔｈｅ　５ｅｃｒｅ−ｔｏｒｙ　Ｉｍｍｕｎｉｔｙ　５ｙｓ ｔｅａ＋）　、Ｊ、Ｒ，マクゲー（ＭｃＧｈｅｅ）およびＪ、メステラキー（Ｍ ｅｓｔｅｃｋｙ）ＩＪＡ、アナレス・ニューヨーク・アカデミ−・ソサイアティ −（Ａｎｎ、Ｎ、Ｙ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）４０９．６８８（１９８３）　。

カーチス（Ｃｕｒｔｉｓｓ）前掲（１９８６）　、カーチス（Ｃｕｒｔｉｓｓ） ら、前掲（１９８７）　；カーチス（Ｃｕｒｔｉｓｓ）　ら、ワクチン（Ｖａｃ ｃｉｎｅ）　６．１５５（１９８８）　。５ｐａＡに対する分泌抗原（ｓｌｇＡ ）は、ストレプトコッカス・ムタンス（Ｓ、ｍｕｔａｎｓ）ＳｐａＡタンパク質 を発現する無毒性サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）菌株で経口的免疫化後 、唾液の中に産生された、カーチス（Ｃｕｒｔｉｓｓ）　、Ｒ，ＩＩＩ　ら、ス トレプトコッカス・ムタンスの分子微生物学的免疫学（Ｍｏ１．Ｍｉｃｒｏｂｉ −ｏｌ、Ｉｍｍｕｎｏｌ　ｏｆ　５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｍｕｔａｎｓ） 　、ハマダ（Ｈａｍａｄａ）、Ｓ、ら編、エルシビーア、ニューヨーク、ｐｐ、 　１７３−１８０（１９８６）　；カッツ（Ｋａｔｚ）、Ｊ、ら、粘膜の免疫学 的における最近の進歩（Ｒｅｃｅｎｔ　Ａｄｖａｎｃｅｓ　Ｉｎ　Ｍｕｃｏｓａ ｌ　Ｉｓｍｕｎｏｌｏｇｙ）　、部Ｂ５メステッキイ（Ｍｅｓ　ｔｅｃｋｙ）、 Ｊ、ら編、ブレナム・パブリッシング・コーポレーション（Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｕ ｂｌｔｓｈｔｎｇ　Ｃｏｒｐ、＞ｐｐ、１７４１−１７４７（１９８７）　；カ ーチス（Ｃｕｒｔｉｓｓ）　ら、１９８７、前掲。

主皿二要り 本発明は病原性微生物のコロニナイゼイシゴン抗原、とルレンス抗原、その抗原 決定基またはその融合タンパク質の遺伝情報を指定するＤＮＡ配列を含有するト ランスジェニック植物に関する。本発明は、さらに、ヒトおよび動物における分 泌免疫性の刺激に有用な組成物に関する０本発明は、また、組成物をつくる方法 およびトランスジェニック植物を産生ずる方法および分泌免疫性を刺激する方法 に関する。

さらに詳しくは、本発明は、病原性微生物のコロニナイゼイション抗原、ビルレ ンス抗原またはそれらの抗原決定基を発現することができるトランスジェニック 植物に関する。トランスジェニック植物は、ヒトおよび動物を経口的免疫化して 、ヒトまたは動物において分泌免疫応答を引き出して、前記病原性微生物による 粘膜表面を通るコロニナイゼイションおよび／または侵入を阻止するために有用 である。

トランスジェニック植物は、病原性微生物の抗原の遺伝情報を指定する少なくと も１つのＤＮＡ配列を含有する植物形質転換ベクターで、植物を形質転換するこ とによって産生される。抗原はコロニナイゼイション抗原、ビルレンス抗原、い ずれかの抗原の抗原決定基、あるいは抗原または決定基を含有する融合タンパク 質であることができる。抗原または抗原決定基に加えて、融合タンパク質は抗原 の活性を安定化および／または増強するポリペプチドを含有することができる。

融合タンパク質は、また、１または２以上の抗原であることができる。

植物形質転換ベクターは、問題の抗原の遺伝情報を指定する１または２以上のＤ ＮＡ配列を植物の形質転換に通するベクターの中に挿入することによって調製さ れる。ベクターは、直接遺伝子転移のために、あるいはＤＮＡ配列を所望の植物 の中に挿入するためのアグロインフェクシゴン（ａｇｒｏｔｎｆｅｃｔｉ−ｏｎ ）のために使用することができる。ＤＮＡ配列は、自然または合成であることが でき、そして抗原の遺伝情報を指定する遺伝子全体または遺伝子の断片からなる ことができる。

分泌免疫応答を引き出すために有用な組成物は、トランスジェニック植物それ自 体またはその植物から誘導された物質であることができる。例えば、トランスジ ェニック植物はヒトまたは動物が直接摂取することができるか、あるいは処理し てヒトまたは動物により摂取される食物産生物をつくることができる。組成物は ヒトまたは動物を、抗原が対応する病原性微生物に対して免疫化するために有用 である。

凹皿■皿員星説ユ 第１図は、プラスミドｐＳＵＮ４５０の構成を図解する。

第２図は、プラスミドｐｓＵＮ４７０の構成を図解する。

第３図は、プラスミドｐｓＵＮ２２１の構成を図解する。

第４図は、プラスミドｐｓＵＮ４７３の構成を図解する。

第５図は、プラスミドｐｓＵＮ４７５の構成を図解する。

第６図は、プラスミドｐｓＵＮ３３９．　ｐｓＵＮ３４０．　ｐｓＵＮ３４１　 、　ｐｓＵＮ３４２゜ｐＳＵＮ３４３の構成を図解する。

第７図は、プラスミドｐｓＵＮ３８７．　ｐｓＵＮ３９０．　ｐｓｔｌＮ３９１ 　、　ｐＳＵＮ３９２゜ｐｓｔｌＮ３９３およびｐＳＵＮ３９４の構成を図解す る。

第８図は、ｐｓｕＮ３８７の全体の４，６４３塩基対のヌクレオチドを描写する 。

第９図は、Ｅ、ｃｏｌ　ｉ　ＤＨ５ｃｘ　（レーン２）およびプラスミドｐｓＵ Ｎ３４１　（レーン３　）　、ｐｓＵＮ３４２（レーン４　）　、ｐｓＵＮ３４ ３（レーン５　）　、ｐｓＵＮ３４４ｃｐｓＵＮ３４３に類似するか、あるいは それと同一である；レーン６　）　、ｐＳＵＮ３４５（ｐｓｌＪＮ３４３に類似 するが、あるいはそれと同一である；レーン７）およびｐＳＵＮ３４６　（ｐｓ ＵＮ３４１に類似するか、あるいはそれと同一である；レーン８）を含有するＥ 、ｃｏｌｉ　ＤＨ５αにおいて、ウサギ抗５ｐａＡ血清により検出された、５ｐ ａＡタンパク質の合成のウェスタン・プロット分析の結果を示す。前以て染色し た分子量マーカーをレーン１に含める。

第１０図は、ｐＹＡ１７７、　ｐＹＡ１７８．　ｐＹＡ１７９およびｐＹＡ１８ ０を含有するＥ、ｃｏｌｉ　Ｘ２９９１およびｐｓｌＩＮ３９０．　ｐｓＵＮ３ ９１　、　ｐＳＵＮ３９２．　ｐＳＵＮ３９３およびｐＳＵＮ３９４を含有する Ｅ、ｃｏｌｉ　ＤＨ５αにおいて、ウサギ抗５ｐａＡ血清との反応により明らか にされた、５ｐａＡタンパク質の合成のウェスタン・プロット分析の結果を示す 。レーン１は前以て染色した分子量標準を含有する。

第１１図は、トランスジェニックタバコ植物により合成された５ｐａＡタンパク 質の量のデンシトメーターの定量を示す。

第１２図はＳＤＳポリアクリルアミドゲルのウェスタン・プロット分析の結果を 示し、この結果は５ｐａＡタンパク質を産生ずるタバコの試料を５ｐａＡタンパ ク質を産生じないタバコの試料と比較しそして、また新鮮な試料、凍結乾燥しそ して一２０゛Ｃにおいて貯蔵した試料、室温において貯蔵した試料、および商業 的マウスの飼料と混合した試料を比較する。

レーン１は、前以て染色した分子量の標準を含有する。

レーン２は、５ｐａＡを産生じないタバコの細胞抽出物からの１５０躍のタンパ ク質を含有する。

レーン３は、５ｐａＡを産生するタバコの細胞抽出物からの１５０１！ｇのタン パク質を含有する。

レーン４は、凍結乾燥し、そして−２０°Ｃにおいて１３日間貯蔵した５ｐａＡ を産生じないタバコの細胞抽出物からの１５０ＩＩｇのタンパク質を含有する。

レーン５は、凍結乾燥し、そして−２０’Ｃにおいて１３日間貯蔵した５ｐａＡ を産生ずるタバコの細胞抽出物からの１５０ｔｔｇのタンパク質を含有する。

レーン６は、凍結乾燥し、そして室温において１３日間貯蔵した５ｐａＡを産生 じないタバコの細胞抽出物からの１５０１１ｇのタンパク質を含有する。

レーン７は、凍結乾燥し、そして室温において１３日間貯蔵した５ｐａＡを産生 ずるタバコの細胞抽出物からの１５０１！ｇのタンバク質を含有する。

レーン８は、マウスの飼料と凍結乾燥した５ｐａＡを産生じないタバコとの１： １混合物の３０Ｏｎのタンパク質抽出物を含有する。タバコは室温において１３ 日間貯蔵した。

レーン９は５マウスの飼料と凍結乾燥した５ｐａＡを産生ずるタバコとの１＝１ 混合物の３００ｉＩｇのタンパク質抽出物を含有する。タバコは室温において１ ３日間貯蔵した。

レーン１０は、マウスの飼料の１５０可のタンパク質抽出物を含有するゆ 発−肌ｑ昆縦至Ｒ所 本発明は、（ａ）病原体のコロニナイゼイション抗原および／またはビルレンス 抗原、および／またはそれらの抗原決定基および／または抗原または抗原決定基 の融合タンパク質を発現することができる植物、種子、および植物組織；　（ｂ ）ヒトまたは他の動物における分泌免疫応答の刺激に有用な組成物；　（Ｃ）ヒ トおよび他の動物において分泌免疫応答を刺激して、病原体による粘膜表面を通 るコロニナイゼイションおよび／または侵入を阻止する方法；　（ｄ）コロニナ イゼイション抗原またはビルレンス抗原の遺伝情報を指定するＤＮ−Ａ配列を含 有する独特ベクター；および（ｅ）植物において病原性微生物のコロニナイゼイ ション抗原またはビルレンス抗原を産生ずる方法を包含する。

明細書および請求の範囲の明瞭なかつ首尾一貫した理解、用語に与えた範囲を包 含する、を提供するために、次の定義を与える： ■：ヒトまたは他の動物の中に導入したとき、抗体の産生を刺激することができ る高分子物質。ここで使用するとき、抗原は抗原それ自体、前記抗原の抗原決定 基、または前記抗原または抗原決定基を含有する融合タンパク質を意味する。

折原次足蒼；抗原−抗体の反応の特異性を決定する、小さい化学的複合体。病原 体のコロニナイゼイシゴン抗原および／またはビルレンス抗原は、ｌまたは２以 上の抗原決定基を主をコロニナイゼイションまたは侵入する微生物の能力に関連 する、病原性微生物の表面上の抗原。説明および請求の範囲は、コロニナイゼイ ション抗原またはビルレンス抗原またはそれらの抗原決定基を言及するであろう 、病原体はコロニナイゼイションまたはビルレンスまたは両者の抗原を含有する ことができ、そして各々または両者のための１または２以上のＤＮＡ配列はベク ターに転移し、そして植物が１または２以上の抗原を発現するように植物を形質 転換するために使用することができる。

斗、仁プｐ１１列’Ｅｌ凱見止猛王：少なくとも２つの異種部分、例えば、それ らの先在する状態に関連しない先在するＤＮＡ配列から誘導されるか、あるいは それに対して実質的な配列の相同性を有する部分、を含有するＤＮＡ配列。先在 するＤＮＡ配列は、自然または合成の由来であることができる。

ユニ上旦■へｙ列：ペプチド分子、ｍＲＮＡまたはｔＲＮＡを作る情報がそれか ら転写されるＤＮＡ配列。ＤＮＡ配列は遺伝子、遺伝子の組み合わせまたは遺伝 子断片であることができる。

文籾：食物または飼料、植物またはヒトおよび他の動物が摂取する植物から得ら れる物質である。この用語は、ヒトおよび他の動物に直接供給することができる 生の植物物質、あるいはヒトおよび他の動物に供給される処理した植物物質を包 含する。植物から得られる物質は、ヒトまたは他の動物により究極的に摂取され る植物の任意の成分を包含することを意図する。

ｆｉ−、？ｕ下込、：形質転換すべき微生物または植物に対して外因性であるか 、あるいはそれらの中に天然に存在しないＤＮＡ、、二のよ・うな外来ＤＮＡは 、ウィルス、原核生物および真核生物のｌ）　Ｎ　Ａを包含し、そして天然に産 出するＤ　Ｎ　Ａ、化学的に合成されたＤＮＡ、ｃＤＮＡ、突然変異したＤＮＡ またはそれらの組み合わせであることができる。本発明の外来ＤＮＡは、病原性 微生物およびウィルスのＤＮＡから誘導されるか、あるいはそれに対して実質的 な配列の相同性を有することができる。

！伝イ肝明確な細胞産生物の原因となる明確な染色体の９Ｍ域。

ｊ影生拠二次のクラスの１つの構成員：バクテリア、菌・かび、原生物またはウ ィルス。

殖勺−組檄：植物または培養物における植物の組織。この用語は、は次のものを 包含するが、これらに限定されない：全植物、植物の細胞、植物の器官、植物の 種子、原形質体、カルス、細胞の培養物、および構造的単位および／または機能 的に有機化される植物細胞の群。上に列挙したか、あるいはそうでなければこの 定義により包含される、植物組織と関連するか、あるいはその不存在で、この用 語の使用は、植物組織の他の型を排除することを意図しない。

植１９１１五狽歪ｌり二二植物組織が植物組織の中に先在しないＤＮＡを含有し かフそれを発現するように、植物組織を形質転換することができるプラスミドま たはウィルスのベクタ・−０ ３Ｊ′ｔ、ｔ３　ＤΣ込β」Ｌ本発明による産生物または方法においで、使用の 前に、全体であるいは一部分で、存在するＤＮＡ配列。このような存在は典型的 には自然の由来を反映するが、先夜配列は合成または他の由来であることができ る。

分ＭＡ免慶庭答：ヒトおよび他の動物の粘膜表面のうるおす分泌における、およ び分泌腺からの分泌における分泌１ｇＡ抗体の形成および産生。このような抗体 の形成および産生を引き起こす因子は、分泌の免疫性を刺激するか、あるいは分 泌免疫応答を引き出すと考えられる。分泌の免疫性は、また、待には粘膜の免疫 性と呼ぶ。

Ｉｆ　Ｉ￥Ｊ　ｆＬ−配列−■ｍ＝ヌクレオチドまたはアミノ酸の配列の間の実 質的な機能的および／または構造的同等性。実質的な配列の相同性を有する機能 的および／または構造的な差は、非常に小さいであろう。

上々！スジェとム久様立：植物の中へのＤＮＡの導入の前に、植物の中に先在し なかったＤＮＡを含有しかつそれを発現する植物。

ｊ５Ｊｉｌ　（Ｅｓｃｈｅｒｔｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）のコロニ　イゼイション　 、および　たはビルレンス ブタ、仔ウシおよびヒトにコロニナイゼイションする工、ンテロトキシンＥ、ｃ ｏｌｉに対して有効な免疫性は、ブタの飼料のためのに８８線毛コロニナイゼイ シデン抗原、仔ウシの飼料のためのに９９線毛コロニナイゼイション抗原、およ びヒトのためのＣＦＡ線毛コロニナイゼイション抗原を発現する植物物質を含め ることによって達成することができる。Ｂ、ｃｏｌｔエンテロトキシンのＢサブ ユニットを含有する植物物質は、ヒト、仔ウシおよびブタのための食料の中に添 加して、線毛のコロニナイゼイシゴン抗原に対する免疫応答を増強するアジュバ ントとして働かせることができるばかりでなく、かつまたブタ、仔ウシおよびヒ トを感染するＥ、ｃｏｌｉのほとんどの腸毒性の菌株により産生されるエンテロ トキシンに対する保護的免疫性を誘発することができる。種々の配合物を調製す ることができるので、多数の病原体に対して同時に免疫化することができるであ ろう。適当な時間に食物を連続的に供給して、若い動物において保護的免疫性を 誘発することができるばかりでなく、かつまた種々の成体の雌を免疫化して、有 効な免疫性を卵を通して、胎盤の転移、または初乳および乳において子孫に伝達 することができる。

Ｘ″ＢＢサブユニト Ｅ、ｃｏｌｉの熱不安定性エンテロトキシンのための遺伝子のヌクレオチド配列 は決定された。ヤマモト、Ｔ、およびヨコタ、Ｔｏ、ジャーナル・オン・バタテ リオロジー（Ｊ、Ｂａｃｔｒｉｏｌ、）３５５．７２８　（１９８３）。全体の Ｂサブユニット遺伝子を含有するＥｃｏＲＩ−Ｂｉｎｄ　ＩＩＩのＤＮＡ断片は 、この分野において標準の方法により、植物の形質転換ベクターｐＳＵＮ３８７ 　（参照、第７図）の中に挿入し、そしてさらにオリゴヌクレオチド合成または 制限酵素Ｎ５ｐｂＩＩまたはＭａｅ４を使用して修飾することができ、ここで制 限酵素Ｎｐ５ｂＩＩまたはＭａｅｌはヌクレオチド配列をＣ末端から７アミノ酸 またはＯアミノ酸を切断して、多数のクローニング部位の挿入を可能として、非 常に多数の融合遺伝子産生物の産生を促進して、Ｎ末端配列としで熱不安定性毒 素のＢサブユニット（ＬＴ−Ｂ）をもつ融合タンパク質の産生に導く。

こうして、ＬＴ−Ｂ配列を植物の形質転換ベクターの中に挿入することができ、 そしてそれを適当な植物種の中で発現させることができる。ＬＴ−Ｈに対するｓ ｌｇＡの誘発は、完全なＬＴ毒素の取込みをブロッキングし、これによりエンテ ロトキシン発生のＢ、ｃｏｌｔの感染に関連する下痢の苛酷さを減少するであろ う、植物が、また、Ｋ９９またはに８８または他の綿毛の付着性抗原を産生ずる 場合、ｓＩｇＡ応答の誘発は、また、エンテロトキシン発生のＩＩ！、ｃｏｌｉ によるコロニナイゼイションを阻害し、こうして下痢を太き（減少するであろう 。

Ｅ、ｃｏｌｉｑ迫り痰豆遣仮ソ 綿毛の付着のための遺伝子を包含する尿路病原性Ｅ、ｃｏｌｉはクローニングさ れ、ランド（Ｌｕｎｄ）、Ｂ、ら、ジャーナル・オン・バクテリオロジ−（Ｊ、 Ｂａｃｔｒｉｏｌ、）　１６２．１２９３　（１９８５）、引き続いて配列決定 された。尿路病原性Ｅ、ｃｏｌｉはいくつかの異なる綿毛付着を発現することが でき、そしていくつかの異なる綿毛の型を発現するクローニングされた遺伝子は 入手可能である、フレラグ（Ｃｌｅｇｇ）　、Ｓ、、インフェクション・アンド ・イミュニイー（ｒｎｆｅｃｔ、ＩＩＩｍｕｎ、）　３Ｂ、７３９（１９８２） 　；パン・ダイ（ＶａｎＤｉｅ）　、１．ら、ＦＥＭＳマイクロバイロジカル・ レターズ（Ｍｉｃｒｏ−ｂｉｏｌ、Ｌｅｔｔ、）　１９．７７　（１９８３）　 ；　ノーマーク（Ｎｏｒｍａｒｋ）　、Ｓ、ら、インフエクション・アンド・イ ミュニイー（Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｉｍｍｕｎ、）虹、９４２　（１９８３）。

Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｋ９９の　の に９９の綿毛抗原は、仔ウシにおける下痢を引き起こすエンテロトキシン発生Ｅ 、ｃｏｌｉ菌株により発現される。Ｋ９９９９線原のための遺伝子はクローニン グされ、そして発現され、パン・エンブデン（ｖａｎ　Ｅｍｂｄｅｎ）、Ｊ、Ｄ 、Ａ、ら、インフェクション・アンド・イミュニイー（Ｉｎｆｅｃｔ、Ｉｒｓｍ ｕｎ、＞　２９．５０８（１９８４）そして配列決定された、ルーゼンダール（ Ｒｏｏｓｅｎｄｈａｌ）、Ｅ、ら、Ｆｉｌ：ＭＳマイクロバイロジカル・レター ズ（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、Ｌｅｔｔ、）　２２．２５３　（１９８４）。したが って、それを植物の形質転換ベクターの中に挿入することは簡単である。Ｋ９９ ９９線対するｓＩｇＡの誘発は、仔ウシの腸中のコロニナイゼイシゴンをブロッ キングし、これにより下痢を防止する。

Ｅ、ｃｏｌｉＫ８８の　− に８８線毛抗原は、ブタにおける重い下痢の病気を引き起こすエンテロトキシン 発生Ｅ、ｃｏｌｉ菌株により発現される。腸のコロニナイゼイションに必要なに ８８線毛抗原のための遺伝子はクローニングされ、ムーイ（Ｍｏｏｉ）、Ｆ、Ｒ ，、ＥＬら、核酸の研究（Ｎｕｃ、Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、）　６−１８４９（１ ９７９）　、ケホエ（Ｋｅｈｏｅ）　、Ｍ、ら、ら、ジャーナル・オン・バタテ リオロジ−（Ｊ、Ｂａｃｔｒｉｏｌ、）　１５５．１０７１　（１９８３）そし て配列決定された、ガストラ（Ｇａｓｔｒａ）、−９ら、ＦＥＭＳマイクロバイ ロジカル・レターズ（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、ＬｅｔＬ、）兵、４１　（１９８１ ）。したがって、この配列を植物の形質転換ベクターの中に挿入し、こうしてそ れを植物中で合成することができる。

ヒトおよび他の動物の宿主においてエンテロトキシン発生および腸病原性Ｅ、ｃ ｏｉｉのコロニナイゼイションを可能とする他の綿毛付着体のための遺伝子は同 定され、そしである場合においてクローニングおよび配列決定された、参照、Ｆ 、Ｒ，およびデグラーフ（ｄｅＧｒａａｆ）　、Ｆ、に、、カレント・トピック ス・オン・マイクロバイオロジカル・イムノロジー（Ｃｕｒｒ、　Ｔｏｐ。

ＭｉｃｒｏｂｉｏＪ、　Ｉｍｍｎｏｌ、）月１．１１９（１９８５）；ケイバー （Ｋａｐｅｒ）、Ｊ、Ｂ。

およびＭ、Ｍ、レビン（Ｌｅｖｉｎｅ）、ワクチン（Ｖａｃｃｊｎｅ）　６．１ ９７ストレブトコソカス・ムタンス（Ｓ、ｍｕｔａｎｓ）の表面に関連するタン パク質は、次のものを包含する二表面タンパク質抗原Ａ（ＳｐａＡ）、グルコシ ルトランスフェラーゼＢ　（ＧｔｆＢ）、デキストラナーゼ（ＧｔｆＣ）、およ びプルカン結合タンパク質。

ストレプトコッカス・ムタンス（Ｓ、ｍｕｔａｎｓ）血清型抗原Ａ（ＳｐａＡ） ストレプトコッカス・ムタンス（Ｓ、ｍｕｔａｎｓ）血清型ｇ菌株ｔｌＡＢ９０ からの５ｐａＡ遺伝子は、Ｅ、ｃｏｌｉ中のコスミドベクター上でクローニング された、ホルト（ｆ（ｏｆｔ）ら、１９８３、前掲。このタンパク質は、歯の表 面の初期のコロニナイゼイシヲンに必須であり、そしてその不存在は胚芽不合ラ ットのコロニナイゼイションを排除する〔カーチス（Ｃｕｒｔｉｓｓ）　ら、１ ９８７ａ　５ｕｐｒａ；１９８７ｂ前掲］。５ｐａＡ遺伝子はサブクローニング され、このタンパク質の主要な抗原決定基は決定され、そして遺伝子のこれらの 領域は配列決定された。

ストレプトコッカス・ムタンス（Ｓ、ｍｕｔａｎｓ）のグルコシルトランスフェ ラーゼＢ ストレプトコッカス・ムタンス（Ｓ、ａ＋ｕｔａｎｓ）のグルコシルトランスフ ェラーゼＢは、ｇ　ｔｇＢ遺伝子によりエンコードされ、そして水不溶性グルカ ンポリマーおよび遊離のフルクトースをスクロースから合成する。遺伝子はクロ ーニングされ、そして配列決定された、シロザ（Ｓｈｉｒｏｚａ）　、Ｔ、ら、 ジャーナル・オン・バクテリオロジ−（Ｊ、Ｂａｃｔｒｉｏｌ、）　１６９．４ ２６３　（１９８７）。

プラスミドＵＳ２０　（９，３ｋｂ）　は、１６５．８００キロダルトン（ｋＤ ａ）のＧｔｆＢタンパク質をエンコードする６、５ｋｂのＰｓｔＩ断片を含有す る。既知のヌクレオチド配列およびＡＴＧ開始コドンの位置に基づいて、解読配 列は普通の技術を使用し５て植物の形質転換ベクターの中に挿入される。

ストレプトコッカス・ソブリヌス（Ｓ、５ｏｂｒｉｎｕｓ）　（ストレプトコッ カス・ムタンス（Ｓ、ｍｕｔａｎｓ）血清型ｇ〕のデキストラナーゼ遺伝子 ｐＹＡ９０２コスミドのクローンは、ストレプトコッカス・ソブリヌス（Ｓ、５ ｏｂｒｉｎｕｓ）デキストラナーゼを発現する。Ｊ、Ｆ、ら、インジェクション ・アンド・イミュニイー（Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｉｍ＊ｕｎ、）並、７９２−８０２ （１９８７）　、およびジャコブス（Ｊａｃｏｂｓ）、−８Ｒ０ら、インジェク ション・アンド・イミュニイー（Ｉｎｆｅｃｔ、　Ｉ＋ｎｍｕｎ、　）皿、１０ ０１９８６）　、　ｐＹＡ９０２のＤＮＡの部分的ＰｖｕｌＩ消化物は、デキス トラナーゼ遺伝子のすべてまたは一部分をもっｌ系列のプラスミドを発生した。

　ｐＹＡ９９３は、１１０ｋＤａのわずかに切頭のデキストラナーゼを発現する ５、４５ｋｂのプラスミドである。

ｐ、ＹＡ９９３中のデキストラナーゼ解読配列のすべてを含有する２、６ｋｂの ＰｖｕＩＩ断片は、正しい向きでｐＵｃ８の５ｔａａ　Ｉ部位の中に平滑末端の 結合によりクローニングされた。この断片はデキストラナーゼＡＴＧ開始コドン であるが、デキストラナーゼのプロモーターを欠く。こうして、それは容易に植 物の形質転換ベクターの中に挿入して、植物のプロモーターの制御下に直接発現 されるか、あるいは、例えば、５ｐａＡ解読配列のＣ末端に融合した直列の融合 構成体として発現されることがある。

のノ　−　ベク二 本発明のベクターは、コロニナイゼイション抗原および／またはビルレンス抗原 の遺伝情報を指定するＤＮＡを含有し、そして植物を形質転換することができる ベクターである。外来ＤＮＡは、形質転換すべき有機体に対して外因性であるか 、あるいはその中に自然に存在しないＤＮＡである。それはクローニングベクタ ーの中に挿入して植物を形質転換することができる。本発明の外来ＤＮＡは、病 原性の微生物およびウィルスのＤＮＡから誘導されるか、あるいはそれに対する 実質的な配列の相同性を有する。本発明のベクターは標準の技術により産生され る。しかしながら、産生されるベクターは、どのタイプの形質転換であるかおよ び形質転換される植物がどの種であるかに依存するであろう。例えば、植物の原 形質体が形質転換されるとき、ベクターはＴｉプラスミド誘導ベクターであるか 、あるいは直接的遺伝子転移手段により原形質体の中に導入することができるベ クターであることができる。植物または植物の器官またはその一部分が形質転換 される場合、ベクターはこのタイプの組織を形質転換することができなくてはな らない。この場合において、新規な植物の形質転換ベクターはＴｉプラスミド誘 導ベクターに基づくようでであるが、微小投射体の形質転換に有用なベクターは 、また、使用することができる。出発物質として利用することができる適当なベ クターは、この分野において知られている。

植物組織の形質転換に適当なベクターは記載され、デフラモンド（ｄｅＦｒａｍ ｏｎｄ）　、Ａ、ら、バイオ／テクノロジー（Ｂｉｏ／　Ｔｅｃｈ−ティン（Ｒ ｏｔｈｓｔｅｉｎ）Ｓ、Ｊ、　ら、遺伝子（Ｇｅｎｅ）５３．１５３（１９Ｂ？ ）、ならびに他のベクターは前述の参考文献に記載されている。

これらのベクターに加えて、本発明における使用に適当な多数の他のベクターは この分野において産生されてきている。

ベクターの構成は適当な宿主、例えば、Ｅ、ｃｏｌｉ中で実施することができる 。適当なＥ、ｃｏｌｉ菌株は次のものを包含するが、これらに限定されない？　 ＨＢｌｏｌ、ＪＭ８３．Ｄ）１１．０Ｈ５α、　ＬＨ３９２など。

ベクターを直接の遺伝子転移またはマイクロインジェクション技術において使用 する場合、それらは直接使用することができる。ある場合において、ベクターは 使用前に直線化することが好ましい。ベクターをアグロバクテリウム・ツメファ シェンス（Ａ、　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）宿主中で使用するとき、ベクターを まず適当な菌株に転移しなくてはならない。この転移は普通の技術、例えば、バ イベアレンタル・メイティング（ｂｉｐａｒ−ｅｎｔａｌ　ｍａｔｉｎｇ）、シ モン（Ｓｉｍｏｎ）　、Ｒ，ら、バイオ／テクノロジー（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏ １ｏｇｙ）上、７４（１９８３）、トリペアレンタル（ｔｒｉｐａｒｅｎｔａｌ ）メイティング、ディツタ（Ｄｉｔｔａ）　、Ｇ、ら、ブロシーデインダス・オ ン・ナショナル・アカデミ−・オン・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃ ａｄ、Ｓｃｉ、）ＵＳＡ、　７７、７３４７（１９８０）または形質転換；ホル スターズ（Ｈｏｌｓｔｅｒｓ）、門、ら、モレキュラ・−・アンド・ジェネラル ・ジェネティックス（Ｍｏｌｅｃ、Ｇｅｎ、Ｇｅｎ−ｅｔ、）１６３．１８ｉ（ １９７８）　／アグロバクテリウム・ツメファシェンス（Ａ、　ｔｕｍｅｆａｃ ｉｅｎｓ）の適当な菌株は、は次のものを包含するが、これらに限定されない： 　ＬＢＡ４４０４゜本発明のベクターは、ヒトおよび他の動物における病気を引 き起こすことが知られている種々の病原体からのコロニナイゼイション抗原また はビルレンス抗原をコードするＤＮＡ配列を含有する。次の説明および実施例の 多くは病原性バクテリアの中に自然に存在するＤＮＡ配列に向けられるが、この 説明はウィルス、菌・かび類および寄生体の病原体中に存在しかつそれらからク ローニングすることができる、このような配列に等しく適用される。もちろん、 コロニナイゼイション抗原および／またはビルレンス抗原またはそれらの一部分 をコードするように合成により誘導されたＤＮＡ配列は、同様に、包含される。

病原体のコロニナイゼイション抗原および／またはビルレンス抗原またはそれら の一部分の遺伝情報を指定するＤＮＡ配列は、普通の手段により得られ、そして 植物の形質転換のために適当なベクターの中に挿入される。例えば、ＤＮＡ配列 はゲノムのクローンの遺伝子バンクから分離することができる。あるいは、ＤＮ Ａ配列は逆転写により調製することができる。次いで、ベクターは、形質転換さ れた細胞、ｉｌｌ織および植物を生じさせる、種々の既知の技術により植物細胞 の中に導入される。

コロニナイゼイション抗原および／またはビルレンス抗原またはそれらの一部分 のアミノ酸配列が既知である場合、ＤＮＡ配列は化学的に合成することができる 。いくつかの先行技術の方法を利用して、コロニナイゼイション抗原またはビル レンス抗原のアミノ酸配列を決定することができる。アミノ酸配列の一部分を決 定し、そして逆転写のためのプローブを調製することができる。

ＤＮＡ配列はコロニナイゼイション抗原またはビルレンス抗原の特定のアミノ酸 配列のための、あるいはその抗原決定基の１または２以上のための解読配列を含 有することができる。ＤＮＡ配列は、また、コロニナイゼイション抗原またはビ ルレンス抗原を含有するタンパク質のすべてまたは一部分の遺伝情報を指定する 、追加の解読配列を含有することができる。

病原性微生物のコロニナイゼイション抗原またはビルレンス抗原またはその一部 分をコードするＤＮＡ配列を、コロニナイゼイション抗原またはビルレンス抗原 が正しく発現されるような方法で、適当なベクターの中に挿入される。換言する と、ＤＮＡ配列は、正しいアミノ酸配列が植物組織中でＤＮＡ配列されるときに 産生されるように、適切な向きおよびリーディングフレームで位置する。普通の 技術に従い、植物組織中で操作可能なプロモーターおよびコロニナイゼイション 抗原またはビルレンス抗原の遺伝情報を指定するＤＮＡ配列を含有する、キメラ ＤＮＡ配列が一般に構成される。キメラＤＮＡ配列は、さらに、植物組織中で操 作可能な３′非解読配列を含有することができる。キメラＤＮＡ配列は、さらに 、融合タンパク質タンパク質が発現のときに産生されるように、コロニナイゼイ ション抗原またはビルレンス抗原を含有するタンパク質以外のポリペプチドのた めの解読配列を含有することができる。キメラＤＮＡ配列は、適当なベクター内 で、コロニナイゼイション抗原またはビルレンス抗原の遺伝情報を指定するＤＮ Ａ配列を既知の植物の形質転換ベクターの制限部位の中に挿入することによって 調製することができる。あるいは、キメラ遺伝子を、まず、構成し、そしてベク ターの中に挿入して、植物の形質転換ベクターを産生ずることができる。

コロニナイゼイシゴン抗原またはビルレンス抗原またはその一部分を修飾して、 タンパク質分解分解に対する抵抗性を増加することができる。これを実施するた めに、コロニナイゼイション抗原またはビルレンス抗原と、腸のプロテアーゼに 対して完全に抵抗性でありかつ経口的に投与した抗原のアジュバントとして作用 するペプチドとの間の融合構成体を遺伝子操作することができる。ＬＴ−Ｂはこ れらの特性の両者を有する。他のペプチドは、前述のコレラトキシンのＢサブニ ー’−７ト（ＣＴ−８）　、ＰａｏＧタンパク質のアトへシン（ａｄｈｅｓｉｎ ）などを包含する。融合構成体は普通の技術により調製される。

植立■旭ｉ転換 植物の細胞を前述のベクターでこの分野において知られている技術、例えば、前 述の参考文献に記載されている技術、および下の実施例に詳細にに記載されてい る技術により形質転換する。これらの技術は、は次のものを包含するが、これら に限定されない：植物または植物組織のアグロバクテリウム・ツメファシェンス （Ａ、　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）による直接感染または同時培養。非常に適当 な技術は、葉のディスクの形質転換である、ホーシュ（Ｈｏｒｓｃｈ）、Ｒ，Ｂ 、ら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）擾臣、１２２９（１９８５）。

あるいは、ベクターは直接、例えば、エレクトロポレイション、マイクロインジ ェクション、微小投射体、あるいはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）　、塩化 カルシウムの存在下または電場中の原形質体の形質転換により転移することがで きる。

形質転換後、形質転換された細胞または植物組織を普通の技術により選択または スクリーニングする。次いで、前述のキメラＤＮＡ配列を含有する形質転換され た植物または植物組織を既知の手順、例えば、前述の参考文献および下の実施例 において単子葉植物および双子葉植物の両者についてに記載されている技術によ り再生する。これらの技術により再生することができる種は、は次のものを包含 するが、これらに限定されない：トウモロコシ、ヒマワリ、菜種、クローバ−、 タバコ、アルファルファ、イネ、ジャガイモ、ナス、キュウリおよびケイズ。再 生された植物を標準の方法により形質転換についてスクリーニングｒる。再生さ れた植物の子孫を組み込まれたＤＮＡ配列の連続的存在についてスクリーニング および選択して、改良された植物および種子の系統を発育させる。ＤＮＡ配列は 他の遺伝子系統の中に種々の技術、例えば、古典的育成、原形質体の融合、核の 転移および染色体の転移により動かすことができる。

免段牲盗１１Ｊｊα３復榎１露宜 抗原の発現のレベルは、しばしば、ベクター中の挿入の部位により影響を受ける ことがある。トランスジェニック植物中で発現されたコロニナイゼイション抗原 またはビルレンス抗原の量は、また、適当なベクターで形質転換してコロニナイ ゼイシ９ン抗原および／またはビルレンス抗原のコピーの数を増加することによ って最適化することができる。５ｐａＡタンパク質の産生は、少なくとも３つの 異なる方法で再形質転換することによって最大にすることができる。前述のベク ター、増強したプロモーターの効率をもつベクターの構成体、あるいは５ｐａＡ 遺伝子配列または５ｐａＡ抗原決定基の配列の多数のコピーを有するベクターは 、既に５ｐａＡ遺伝子物質を有する植物の中に挿入することができる。

多数の再生した植物は、コロニナイゼイション抗原またはビルレンス抗原につい て検査すべきである。最高のレベルのコロニナイゼイシゴン抗原またはビルレン ス抗原の安定な産生を生ずる植物を選択する。コロニナイゼイション抗原または ビルレンス抗原のターンオバー速度は許容されえないほど高い場合、タンパク質 は種々の手順により修飾して植物中の植物の安定性を高めることができる（すな わち、抗原をエンコードするＤＮＡ配列の部位特異的突然変異によるプロテアー ゼ切断部位の除去または変更）。タンパク質を特定する遺伝子は操作して、タン パク質を種子の中に貯蔵タンパク質として導入し、これにより高いレベルの安定 な産生を確実にすることができる。これは、例えば、ケイズおよび穀粒において 最も実際的である。

有効な免疫原であるために、植物により発現されたコロニナイゼイション抗原ま たはビルレンス抗原は食物処理および消化に耐えることができるために十分な安 定性をもたなくてはならない。

植物物質はヒトまたは他の動物に直接供給することができるか、あるいはタンパ ク質を変性しない手段により食物に処理することができる。例えば、所望のコロ ニナイゼイション抗原またはビルレンス抗原を含有するトランスジェニック植物 、例えば、アルファルファまたはトウモロコシは、ヒトまたは他の動物、例えば 、畜生に直接供給することができるであろう。コロニナイゼイション抗原または ビルレンス抗原が腸病原性またはエンテロトキシン発生性Ｅ、ｃｏｌｉからのも のであった場合、下痢に対する分泌免疫性を畜生において産生ずることができる 。同様に、病原性微生物のコロニナイゼイション因子またはビルレンス因子を発 現する種々のトランスジェニック植物の種子を直接ヒトは摂取して、それに対す る分泌免疫応答を引き出すことができるであろう。

あるいは、トランスジェニック植物は普通の技術により処理してヒトおよび他の 動物のための食物を産生ずることができる。例えば、トランスジェニックトウモ ロコシを処理して、動物に供給するか、あるいはヒトのための食物の調製に使用 することができるコーンミールを産生ずることができる。

ある場合において、コロニナイゼイション抗原またはビルレンス抗原は容易に変 性することができず、したがって、ある場合において、食物の料理は免疫原性を 破壊しないことがあることが考えられる。これは、沸騰またはイオン性洗浄剤を 使用する処理による変性後、その免疫活性を保持する５ｐａＡタンパク質に関し て真実である。他方において、他のコロニナイゼイション抗原またはビルレンス 抗原は変性に対してそのように抵抗性でないことがある。ある場合において、変 性に対するコロニナイゼイション抗原またはビルレンス抗原の増加した安定性は 、変性を阻止するか、あるいは自発的再生を促進するポリペプチドに抗原を適当 な条件下に融合することによって達成することができる。

コロニナイゼイション　ｂ、ｈａ：ｅ；レレンス　、の６形質転換された植物中 の病原性微生物の主要なコロニナイゼイション抗原および／またはビルレンス抗 原の量、安定性および免疫原性は、よく知られている手段、とくに免疫学的手段 により評価することができる。これらの変数は形質転換された原形質体およびカ ルスにおいて、および成熟した植物の根、茎、葉および種子において測定するこ とができる。

植物ベクター中でストレプトコッカス・ムタンス（Ｓ、ｍｕｔａｎｓ）またはＥ 、ｃｏｌｉのＤＮＡにより特定されそして組み換えＥ、ｃｏｌｉおよび他の適当 な微生物中で発現されたコロニナイゼイション抗原および／またはビルレンス抗 原は、摂取後、安定性について試験することができる。既知のコロニナイゼイシ ョン抗原および／またはビルレンス抗原を発現する微生物の培養物は、既知の方 法、例えば、熱または放射能により殺す。次いで、それを既知の動物の食物、例 えば、商業的に入手可能なマウスの飼料に添加し、そして食物の処理にかける。

増強しそして処理したマウスの飼料からのタンパク質は、摂取の前におよび摂取 の後の消化の種々の段階において、コロニナイゼイション抗原および／またはビ ルレンス抗原の量について分析することができる。分析は種々の既知の方法によ り実施することができ、このような方法は次のものを包含するが、これらに限定 されないニドデシル硫酸ナトリウム（ＳＯＳ）のポリアクリルアミドゲルの電気 泳動に従うウェスタン・プロット分析、免疫沈澱および酵素結合免疫吸収アッセ イ（ＥＬＩＳＡ）　。

消化の種々の段階における抗原の量は、摂取前の量と比較することができる。

コロニナイゼイション　およびビルレンス　の　・主役叫免及廠釡 抗原の免疫原性は同様によく分析される。ビルレンス抗原は摂取のとき分泌免疫 応答を引き出すそれらの能力について評価し、そして分泌免疫応答はコロニナイ ゼイション抗原およびビルレンス抗原が腸の酵素によりそれらの免疫原性を破壊 しないで胃腸管を通して生き残る能力に依存する。熱または放射能により殺され たストレプトコッカス・ムタンス（Ｓ、　ｏ＋ｕｔａｎｓ）、組み換えＥ、ｃｏ ｌｆまたは他の適当な微生物で増強された植物物質を食物処理にかける。次いで 、それを乾燥または凍結して貯蔵することができる。トランスジェニック植物は 、また、処理し、そして動物に供給するか、あるいは動物飼料と混合し、そして 酵素結合免疫吸収アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を使用して、唾液または腸洗浄液中の コロニナイゼイション抗原またはビルレンス抗原に対するｓｌｇＡを定量するこ とによって、免疫原性決定する。

裏血斑 工■叉１貫装、扛±どぐ侠ＩＬし１１々遺えＤＮＡおよび　法ＤＮＡの操作は、 特記しない限り、製造業者が推奨する手順に従い酵素を使用して実施した。すべ ての酵素は二ニー・イングランド・バイオラプス（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂ ｉｏｌａｂｓ）またはベセスダ・リサーチ・ラボラトリーズ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ 　Ｒｅ５ａｃｈ　Ｌａｂ−ｏｒａｔｏｒｉｅｓ）　（ＢＲＬ）から入手した。す べてのベクター構成は、特記しない限り、Ｅ、ｃｏｌｉ　ＤＨｌ、　ＪＭ８３ま たはＤＨ５ｔｘ中で実施した。ベクターは、普通の技術を使用して、構成の菌株 と異なるＥ、ｃｏｌｉの菌株の中に導入した。ＤＮＡの分離およびＥ、ｃｏｌｉ の形質転換は、ハナハン（Ｈａｎａｈａｎ）ら、ジャーナル・オン・モレキュラ ー・バイオロジー（Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、）　１６６．５５７　（１９８３） に従い実施した。１５％のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）中の平滑末端の結 合は、リバック（Ｌｉｖａｋ）　、アナリティカル・バイオケミストリー（Ａｎ ａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｓ＋、）　１５２．６６（１９８６）に従い実施した。追加 の技術は、次の参考文献に記載されている：マニアチス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）、 ｒ、ら、分子クローニング：実験室のマニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏ ｎｉｎｇ：Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ）　、コールド・スプリン グ・ハーバ−・ラボラトリ−、コールド・ハーバ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　 Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）　、コールド・スプリング・ハーバ−（ Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ）、第２版、−ｓ−ヨーク（１９８８） 、メソッズ・イン・エンジモロジ−（Ｍｅｔｈｏｄｓ　１ｎＥｎｚｙａ＋ｏ１ｏ ｇｙ）Ｖｏｌ、６Ｂ（１９７９）、Ｖｏｌ、１００（１９８３）、Ｖｏｌ　、　 １０１（１９８３）、Ｖｏｌ、１１８（１９８６）およびＶｏｌ、１５２−１５ ４（１９８７）　；およびプラント・モレキュラー・バイオロジー（Ｐｌａｎｔ 　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ）：マニュアル、ゲルビン（Ｇｅｌｖｉ ｎ）、ＳＢおよびシルロールド（Ｓｃｈ　ｆ　１−ｐｅｒｏｏｒｔ）、ＲＡ編、 クルワー・アカデミツク・パブリッシャーズ（Ｋｌｕｗｅｒ　Ａｃａｄｅｍｉｃ 　Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）、ドドレヒト（Ｄｏｄｒｅｃｈｔ）（１９８８）。

実１ｆＬＬ ■−ごｊｊ≧≦旧ｌ底 コロニナイゼイション抗原またはビルレンス抗原をエンコードするＤＮＡ配列で 植物を表現的に形質転換するために有用なベクターは、ｐｓＵＮ３４１およびｐ ＳＵＮ３４３である。広範な情報を実施例１に含めて、広く知られそして一般に 入手可能である出発物質から、これらのベクターを構成できるようにした。ここ で入手可能である広範な情報は、他の出発物質からの同様なベクターの構成を可 能とするであろう。

プラスミドｐｓＵＮ２１４（ＡＴＣＣ６７４７０）をＰｓｔＩおよびＨｉｎｄＩ ＩＩで消化した。真核生物の遺伝子の発現に要求されるＰｏ１ｙＡ付加のための 部位を提供するために、クロランフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（Ｃ ＡＴ）の遺伝子および３’−ＮＯＰＳ（ンパリンシンターゼ）を含有する、１． ６ｋｂの断片を分離した。プラスミドｐＵｃ１８をＰｓｔｌおよびＨｉｎｄＩＩ Ｉで消化し、そして分離した断片で結合した。生ずるプラスミドｐｓＵＮ２１Ｂ を分離した。

プラスミドｐｓＵＮ２１８をＳ＋＋＋ａＩで消化し、そして仔つシ腸のアルカリ 性ホスファターゼで処理した。プラスミドｐｃＨ１０１、グイレイ（Ｇｕｉｌｌ ｅｙ）　、Ｈ，ら、細胞（Ｃｅｌｌ）３０．７６３（１９８２）　、をＫ。

リチャーズ（Ｒｉｃｈａｒｄｓ）から入手し、そしてＨｐｈ　Ｉで消化した。

カリフラファーのモザイクウィルスの３５３１０モークーを含有する断片、植物 細胞中の転写を可能とする配列を分離し、そしてＴ４　ＤＮＡポリメラーゼで処 理した。この断片は１５％のＰＥＧ中で処理したｐｓＩＩＮ２１８に平滑末端結 合してプラスミドｐｓＵＮ４４４を産生した。

プラスミドｐｓＵＮ２０４（ＡＴＣＣ６７４６９）を旧ｎｄＩＩＩで消化し、次 いで部分的にＰｓｔＩで消化した。より大きい１．６　ｋｇのＡＰＴＩＩ−３’ −ＮＯＰＳを含有する断片を分離した。ＡＰＴＩＩ遺伝子は抗生物質のカナマイ シン、ネオマイシンおよびＧ４１８に対する抵抗性を与え、そしてそれ自体植物 における有用な形質転換、選択決定基を提供する。プラスミドｐＵｃ１８をＰｓ ｔｌおよび旧ｎｄＩＩＩで消化し、そしてＡＰＴＩＩ−３’−ＮＯＰＳ断片に結 合した。生ずるプラスミドをｐｓＵＮ２１９と識別した。

ｐｓＵＮ２１９を５ａｉｌで消化し、そしてＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断 片で処理した。次いで、ＤＮＡを旧ｎ（ＩＩＩＩで消化し、そしてＡＰＴ　ｌｌ −３’−ＮＯＰＳ配列を含有する断片を分離した。

プラスミドｐＳＵＮ４４４をＢａｍＨＩで消化し、そしてＤＮＡポリメラーゼ■ のクレノー断片で処理した。次いで、処理したベクターを旧ｎｄｒＩＩで消化し た。３．５ｋｂのより大きい断片をｐｓＵＮ２１９からのＡＰＴ　Ｉｆ−３’− ＮＯＰＳを含有する断片に結合した。生ずるプラスミドをｐｓ［ＪＮ４５０と表 示した。ｐｓＵＮ４５０の構成および部分的地図を第１図に示す。

２、匹叩［虹叫標威 プラスミドｐｓＵＮ４５０を旧ｎｄｌｌｌで消化し、そしてＤＮＡポリメラーゼ ■のクレノー断片で処理した。次いで、処理したベクターをＫｐｎＩで消化し、 そして３５Ｓプロモーター、ＡＰＴ　ＩＩおよび３７−ＮＯＰＳ配列を含有する ２、５ｋｂの断片を分離した。プラスミドｐｓＵＮ４７０　（Ｇ、　Ａｎから入 手した）を５ａｉｌおよびＥｃｏＲＩで消化した。左の境界（Ｂ、）を含有する ５００ｂｐの断片を分離し、そしてｐＵｃ１８のＥｃｏＲＩ部位中に結合した。

ｐｓＵＮ４０２をＥＣ０ＲＩで消化し、そしてＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー 断片で処理した。次いで、処理したベクターをＫｐｎＩで消化し、そしてｐｓＵ Ｎ４５０から分離した断片に結合した。

プラスミドｐｓＵＮ４７０が同定される。ｐｓＵＮ３４０の構成および部分的地 図を第２図に示す。ｐｓＵＮ４７０はＫｐｎＩ＝ｌ（ｉｎｄＩＩＩからの制限部 位を包含するｐｓＵＮ２１８の多数のクローニング部位（ＭＣＳ）を含有する。

３、匹印２２１■構戒 Ｅ、ｃｏｌｉ中の増幅可能な複製のためのプラスミドｐＢＩ？３２２の複製の由 来（ｏｒｉ）およびアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃ　ｔｅｒｉｕｍ）中の 複製を可能とする広い宿主範囲のプラスミドｐＳａ７２７の由来〔タイト（Ｔａ ｉｔ）、Ｒ，Ｃ，ら、バイオテクノロジー（Ｂｉｏｔｅｃｈ）土、２６９（１９ ８２）　）ならびにバタテリオファージラムの粘着末端（ＣＯ５）からなる配列 をＨ３ｎｄＩＩＩで消化し、そして仔つシ腸のアルカリ性ホスファターゼで処理 した。Ｔ−ＤＮＡの右の境界およびアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒ ｉｕ…）プラスミドｐＴｉ３３７からのツバリンシンターゼ遺伝子を含有するＨ ｉｎｄｌｌｌ断片Ｎａ２３（）１２３）　、ベバン（Ｂｅｖａｎ）　、Ｍ、ら、 ５ｕｐｔｌｒａ％を？ｌＷＢ２３４１：Ｈ２３［Ｗ、バルネス（Ｂａｒｎｅｓ） から入手した〕の旧ｎｄｌｌｌの消化後分離した。Ｈ２３断片をＨｉｎｄＩＩＩ 消化プラスミドｐｓｔｌＮ２２０に結合してプラスミドｐｓＵＮ２２１を産生じ た。ｐｓＵＮ２２１の構成を第３図に示す。

４、　鄭史はり］戊 プラスミドｐｓＵＮ２２１をＰｓｔＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、そしてヤエナ リヌクレアーゼで処理した。プラスミドｐｓｕＮ４７０をＰｖｕ　Ｉで消化し、 そしてヤエナリヌクレアーゼで処理した。

３５３プロモーター、ＡＰＴ　！１．　３　’　Ｎ０ＰＳおよびＢＬ配列を含有 する３、ｉｋｂのＰＶＩＪＩ断片を分離し、そして１５％のＰＥＧ中で処理した ｐｓＵＮ２２１に平滑末端結合した。ｐｓＵＮ２２１のアンピシリン抵抗性決定 ！（Ａｍｐ”　）はこの方法において破壊された。生ずるプラスミドをｐｓＵＮ ４７３と識別した。ｐＳＵＮ４７３の構成および部分的地図を第４図に示す。ｐ ｓＵＮ４７３は、複製のｐＳａ由来のために、アグロバクテリウム・ツメファシ ェンス（Ａ、ｔｕｎ＋ｅ−ｆａｃｆｅｎｓ）中で維持することができ、そして遺 伝子操作したＴ−ＤＮＡ配列の植物への転移のためのバイナリ−ベクターとして 使用するために適する。

５６　匹叩虹［■１底 植物中の形質転換選択決定基として有用な抗生物質のハグロマイシン（ｈｐｈ） に対する抵抗性を与える遺伝子の源として、プラスミドｐＳＶ２−ｈｐｈをＣ， カド（ｋａｄｏ）、カリフォルニア大学、カリフォルニア州ディビス、から入手 した。ｐｓｖ２−ｈｐｈは旧ｎｄＩＩＩおよびＢｇｌ　ＩＩで消化し、そしてｈ ｐｈ遺伝子を含有する１、４ｋｂの断片を分離し、そして精製した。

プラスミドｐＢＳＭをベクター・クローニング・システム（Ｖｅｃ−ｔｏｒ　Ｃ ｌｏｎｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍ）　、現在ストラテジーン・クローニング・システ ム（Ｓｔｒａｔｇｅｎｅ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｓｙｓｔｅｍ）として知られている 、カリフォルニア州うジョラ、から入手し、そして旧ｎｄｒＩＩおよびＢａｍＨ で消化し、次いで仔つシ腸のアルカリ性ホスファターゼで処理した。次いで、ｐ ＳＶ２−ｈｐｈからの１４　ｋｂのｈｐｈ断片を消化したｐＢＳＨに結合してｐ ｓＵＮ４７４を産生した。

６・　鄭ｙ吐互」引１戊 プラスミドｐｓＵＮ４７４をＨｉｎｄＩＩＩおよびＡｖａＩで消化し、そしてこ の消化により産生したＤＮＡ断片の「粘着末端」をｄＮＴＰの存在下にＥ、ｃｏ ｌｔ　ＤＮＡ　Ｐｏ１Ｉのクレノー断片で処理することによって平滑末端とした 。ｈｐｈ遺伝子を含有する１、　３　ｋｂの断片を分離し、そして精製した。

プラスミドｐｓＵＮ４７３をＥｃｏＲＩで消化し、ｃｔＮＴＰの存在下にＥ、ｃ ｏｌｔ　ＤＮＡ　Ｐｏ１ｌ　ｎｏのクレノー断片で処理し、次いで仔つシ腸のア ルカリ性ホスファターゼで処理した。はぼ１３ｋｂの断片を分離し、そして精製 した。この１３ｋｂの断片および１．３ｋｂのｈｐｈ断片を１５％のＰＥＧ中で 平滑末端結合してｐｓＵＮ４７５を産生した。　ｈｐｈ断片のフィル−インした ＡｖａＩ末端に結合したとき、ｐｓＵＮ４７３のフィル−インしたＥｃｏＲＩ末 端はＥｃｏＲＩ部位を再生した。ｐＳＵＮ４７５の構成および部分的地図を第５ 図に示す。

７、関堕Ｕ虹■盪底 プラスミドｐｓＵＮ２１４（ＡＴＣＣ６７４０）　（参照、第１図）をＢａｍＨ Ｉで消化し、次いでｄＮＴＰの存在下にＥ、ｃｏｌｉ　ＤＮＡ　Ｐｏ１ｌのクレ ノー断片で処理して末端をフィルインした。さらにＥｃｏＲＩで消化し、次いで 仔つシ腸のアルカリ性ホスファターゼで処理すると、３　’　Ｎ０ＰＳ配列およ びｐｓＵＮ２１４の中に存在する複製およびアンピシリン抵抗性決定基の配列の ｐＵＣ由来を含有する３、４ｋｂの断片の分離および精製が可能となった。

ｐＳＵＮ４７５をＸｂａｌ　（これは多数のクローニング部位ＭＣＳにおいて切 断する）で消化し、次いでｄＮＴＰの存在下にＥ、ｃｏｌｉ　ＤＮＡＰｏ１ｌの クレノー断片で処理して末端をフィルインした。次いで、生ずる直線化したｐＳ ＵＮ４１５をＥｃｏＲＩで部分的に消化し、そしてＣａＭＶ、３５Ｓプロモータ ーおよびｈｐｈ解読配列を含有する２、１５ｋｇの断片を分離し、そして精製し た。この断片をｐＳＵＮ２１４からの３．４ｋｂの断片に結合し、そして生ずる プラスミドｐ　Ｓ　Ｕ　Ｎ　４８０であり、これを第６図に示す。

８、ぴｙ俣踵」ムじｂ艮す弛」１雇 ｐｓＵＮ２０８　（参照、第６図）をＣｆｏｒで消化し、そしてｄＮＴＰの存在 下にＴ４ポリメラーゼで処理して平滑末端を発生させた。

５ｐａＡ配列への発現可能なＩａｃ融合を含有する約２２８０塩基対の断片を分 離した。プラスミドｐＹＡ２０８は、５ｐａＡ遺伝子を正しい向きで含有するＢ ａｍＨＩ断片を含有する。ベクターｐｓＵＮ４８０をＰｓｔｌおよびＥｃｏＲＩ で消化して、ハイグロマイシン抵抗性を除去し、そしてＴ４ポリメラーゼおよび ｄＮＴＰで処理して、平滑末端を発生した。より大きい４１７０塩基対の断片を 分離した。

Ｉａｃ−ｓｐａＡ断片を、ｈｐｈ断片の代わりに正しい向きで３５３および３　 ’　Ｎ０ＰＳ配列の間に結合してプラスミドｐｓＵＮ３３９を産生した。ベクタ ー配列に関して反対の向きに１ａｃＺ−ｓｐａＡインサートを有するｐｓＵＮ３ ４０を、また、分離した。（参照、第６図）。

９、　５ＵＮ３４１，５ＵＮ３４２および５ＵＮ３４３のプラスミドｐＳＵＮ３ ３９をＳｃａ　ＩおよびＡｓｕｌｌで消化し、そして約３２６３塩基対の３５５ −１ａｃＺ−ｓｐａＡ−３’　Ｎ０ＰＳ断片を分離した。断片のＡｓｕＩ　Ｉ末 端をＥ、ｃｏｌｉ　ＤＮＡ　Ｐｏ１Ｉのクレノー断片を使用してｄＮＴＰでをフ ィルインした。

プラスミドｐｓＵＮ４７３　（第４図）をＸｂａＩで消化しくこれは多数の切断 部位の配列の中に単一の部位を有する）そして５′末端をＥ、ｃｏｌｉのＤＮＡ ポリメラーゼ■のクレノー断片を使用してｄＮＴＰで処理した。ｐＳＵＮ３３９ からの３５５−１ａｃＺ−３’　ＮｏＰＳ発現カセットを、ベクターの３５Ｓ− ＡＰＴＩＩ−３’　Ｎ０ＰＳ配列に関して異なる向きにおいて、消化したプラス ミドｐｓＵＮ４７３に結合した。プラスミドｐｓＵＮ３４１はこれらの配列の組 を頭対頭の向きで含有する。プラスミドｐｓＵＮ３４３はこれらの配列の組を頭 尾の向きで含有する。プラスミドｐｓＵＮ３４２は、５ｃａＩ−ＡｓｕＩＩ消化 のための出発物質としてｐｓＵＮ３４０を使用して同様に方法で構成した。

プラスミドｐＳＵＮ３４４およびｐｓＵＮ３４５はｐＳＵＮ３４３と同一の独立 の分離物である。プラスミドｐｓＵＮ３４６はｐｓＵＮ３４１　と同一の独立の 分離物である。ｐｓＵＮ３４１．、　ｐＳＵＮ３４２およびｐｓＵＮ３４３の構 成は第６図に示す。ｐｓＵＮ３４１およびｐＳＵＮ３４３はベクターに関してイ ンサートの反対の向きを有するが、Ｃａ、ＭＶ　３５Ｓおよびｌａｃプロモータ ーを同一の向きでもち、Ｅ、ｃｏｌｉおよび植物の両者における５ｐａＡの発現 を可能とする。Ｂ、ｃｏｌｉ　ＤＨ５α中のｐｓＵＮ３４１およびＥ、ｃｏｌｉ 　ＤＨ５α中のｐＳＵＮ３４３は、ブダペスト条約に基き１９８８年８月３１日 にＡＴＣＣに受託されそして、それぞれ、番号６７．７８７および６７．７８５ を付された。ｐｓＵＮ３４２は、Ｘｂａｌ切断ｐＳＵＮ４７３中のｐｓＵＮ３４ ０の５ｃａｒ−ＡｓｕＩＩ断片を使用して対照として構成した。この構成におい て、５ｐａＡは植物中ではなく　ｌａｃプロモーターの制御下にＥ、ｃｏｌｉ中 で合成すべきである。なぜなら、ＣａＭＶ　３５Ｓプロモーターは誤った向きに あるからである（参照、第６図）。

Ｂ０匹勘影工」１底 プラスミドｐｓＵＮ３８７は、プラスミドｐＵｃ１Ｂ、　ｐｓＬＩＮ３３５およ びｐｓＵＮ４９１の成分を含有する。ｐｓＵＮ４９１（ＡＴＣＣＮｏ、６７７８ ６）はブダペスト条約の規定に従い受託された。ｐｔｌｃの成分は、多数のクロ ーニング領域のＥｃｏＲＩおよび旧ｎｄ１１１部位より外側のすべての配列を包 含する。これは複製の由来およびアンピシリン抵抗性の遺伝子を含有する。ｐｓ ＵＮ４９１からの配列ば、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターを含み、３２７ｂｐの旧 ｎｃｌｌ−ＥｃｏＲＶ断片の直列の重複をもち、この断片は３５Ｓプロモーター および植物系中の他の異種プロモーターに転写増強を与えることが示された配列 を含有する。カイ（Ｋａｙ）　ら、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ＞　２並、１９ ９（１９８７）　、また、Ｎｃｏｌ、ＢａｍＨＩ、Ｘｂａｌ、５ａ１１．Ｐｓｔ ｌおよびＥｃｏＲＩののための部位および引き続く約６８１塩基対の３　’　Ｎ ０ＰＳ配列を含有する多数のクローニング領域は、３５３プロモーターより下流 に含められている。ｐｓＵＮ３３５は、３５Ｓプロモーター・と３　’　Ｎ０Ｐ Ｓとの間に挿入されたとき、バクテリア中の遺伝子の発現を可能とする２つの配 列を提供する。これらは合成の１７ｂｐのＫｐｎＩ−Ｎｃｏｌ断片を包含し、こ の断片は、タンパク質の合成の開始のために要求されるＮｃｏＩ部位内に含有さ れたＡＴＧから最適に間隔を置いて位置する、完全なシャインーダルガルノ配列 を含有する。シャイン（Ｓｈ　１ｎｅ）およびダルガルノ（Ｄａｌｇｒｎｏ）　 、プロシーディンゲス・オン・ナショナル・アカデミ−・オン・サイエンシズ（ Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、）ＬＩＳＡ、　７１．１３４２　（１ ９８７）。また、３５３プロモーターより上流に、Ｅ、ｃｏｌｉ中の転写の強い プロモーターであることが示されたストレプトコッカス・ムタンス（Ｓｔｒｅｐ ｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｍｕｔａｎｓ）のａｓｄ遺伝子からのプロモーターを含む。

カルジネウ（Ｃａｅｄｉｎｅａｕ）およびカーチス（Ｃｕｒｔｉｓｓ）　、ジャ ーナル・オン・バイオロジカル・ゲミストリー（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｏ＋、） ２６ｇ、　３３４４（１９８７）。

ｐＳＵＮ３８７の地図は第７図に示されている。プラスミドの配列は、また、第 ８図に与えられている。ｐｓＵＮ３８７はブダペスト条約に基き受託されそして 番号　を付された、Ｃ９匹堕皿り鄭国迎り関堕競り酌ハ裂漏９Ｊｎ鋒照８少株威 プラスミドｐＹＡ１７７゜ｐＹＡ１７８．　ｐＹＡ１７９およびｐＹＡ１８０　 （カーチス（Ｃｕｒｔｉｓｓ）ら、ワクチン（Ｖａｃｃｉｎｅ）　、１９８８． ５ｕｐｒａ　）は、それぞれ、５ｐａＡの主要な抗原決定基／免疫原性決定基、 および引き続くほぼ１２０４塩基対により特定された５ｐａＡタンパク質のＣ末 端の抗原決定基／免疫原性決定基を特定する、４８３塩基対の５ｓｔＩ−５ｓｔ Ｉ断片の１．２．３または４コピーを有する。

り【１−ニングは多数のクローニング部位を切断するＸ　ｂ　ａ、ＩでｐｓＵＮ ３８７を消化し、ＤＮＡポリメラーゼ■のクレノー断片を使用して平滑末端を発 生し、次いでＮｃｏ　Ｉで消化した。５ｐａＡ決定基を特定する断片をρＹＡ１ ７７、　ｐＹＡ１７Ｂ、　ｐＹＡ１７９およびｐｙＡｉｓ。

の中から、まず旧ｎｄｌｌ！で消化し、クレノーで処理し、次いでＮｃｏｌで切 断することによって切断し、次いで断片を調製したｐｓＵＮ３８７　ＤＮＡの中 に結合した。

ｐｓＵＮ３８７の完全なヌクレオチド配列（参照、第８図）の分析により明らか にされるように、Ｅ、ｃｏｌｉ中の５ｐａＡの発現はストレプトコッカス・ムタ ンス（Ｓ、ｍｕｔａｎｓ＞ａｓｄプロモーターの制御下にあり、そして植物にお いてＣａＭＶ　３５５プロモーターの制御下にある。この構成において、ｐｓＬ ＩＮ３９０．　ｐｓｌＩＮ４９１．　ｐｓＵＮ３９２、　ｐＳＵＮ３９３および ｐｓＵＮ３９４中の５ｐａＡインサートのすべてについてのリーディングフレー ムを開始するＮｃｏＩ部位において、ＡＴ（１，開始コドンの前に、ＣａＭＶ　 ３５Ｓプロモーターの後にＡＴＧ開始コドンは存在しない。Ｓｐａ＾インサート をもつＥ、ｃｏｌｉＨＢＩＯＩは、ＡＴＣＣＮｏ、３１９８５で受託された。こ の受託物は、米国特許出願第７７３．８９４号が登録されたとき、要求ににより 一般に入手可能となる。

Ｈ，５ａＡ９７ｔ＜’）　（７）　＃！ｆｆ７−咀第９図は、ｐＳＵＮ３４１． 　ｐｓＵＮ３４２．　ｐｓＩＪＮ３４３．　ｐｓＵＮ３４４．　ｐｓＵＮ３４５ およびｐｓ［１Ｎ３４６の存在のために、５ｐａＡタンパク譬を発現する、形質 転換されたＥ、ｃｏｌｉ　ＤＨ５αのウェスタン・プロット分析を示す。５ｐａ Ａは約１１６ｋＤａで起こる。　Ｅ、ｃｏｌｉ中の５ｐａＡの発現はＣａＭＶプ ロモーターの向きに対して独立であるが、ｌａｃプロモータ〜の正しい向きに依 存する。５ｐａＡ分解産生物は、主として、約６０ｋＤａ〜約１１５ｋＤａの領 域において起こる。この分析から明らかであるように、５ｐａＡに対する抗体は 自然ならびに分解産生物の、すべての形態のタンパク質を認識する。これは有利 である。なぜなら、分解産生物は植物中でならびに腸中で起こることができるで あろうからである。

第１０図は、５ｐａＡ抗原決定基／免疫原決定基を特定する組み換えプラスミド を含有するＥ、ｃｏｌｉによる５ｐａＡタンパク質の合成のウェスタン・プロッ ト分析を示す。組み換えプラスミドプラスミドｐＹＡ１７７−　ｐｓｔｌＮ４８ ０はＥ、ｃｏｌｉ　Ｘ２９９１中に含有されるが、ｐｓＵＮ３９０−ｐｓＵＮ３ ９４組み換えベクターのすべてはＥ、ｃｏｌｉＤＨ５α中に含有される。ｐｓＬ ＩＮ３９０およびｐｓｔｌＮ４９１の各々はｐＹＡ１７７により特定される２つ の主要なバンドの１つの特定する。この理由は知られていない。明らかなように 、ｐｓＵＮ３９３は５ｐａＡの産生に関して期待する方法で挙動しない。初期の 分離のとき、それは非常に高いレベルの５ｐａＡの合成を引き起こす。ｐｓＵＮ のプラスミドの構成体のすべては、ｐＹＡ構成体より少ない５ｐａＡの合成を引 き起こす。これら最も起こり得る。なぜなら、ストレプトコッカス・ムタンス（ Ｓ、ｍｕｔａｎｓ）ａｓｄプロモーターはｐ　Ｓ　［Ｉ　Ｎベクター中の５ｐａ Ａの合成のだめのＡＴＧ開始コドンから約１２５０塩基対離れているが、９ＹＡ ベクター中のｔｒｃ。

ブロモ−クーとＡＴＧ開始コドンとの間の距離はわずかに４５塩基対であルカら である。ｐＹＡ１？？、　ｐＹＡ１７８．７９ｐｙｐｓＵＮ４８０（−：より特 定される５ｐａＡのポリペプチドは、それぞれ、９４．１１６゜１４５および１ ６４ｋＤａの分子量を有する。再び、５ｐａＡの分解はＥ、ｃｏｌｉ中で起こる が、これらの分解産生物ば５ｐａＡの自然タンパク質に対する抗体により認識さ れる。

５ｐａＡを発現するＨ、ｃｏｌｉが、マウスへの経口的供給後、免疫応答を引き 出すことができるかどうかを見る研究を実施する前に、Ｅ、ｃｏｌｉ中で発現さ れたＳｐａ＾タンパク質の種々の食物の処理の方法に対する安定性を研究した。

ｐＹＡ２１０　（第６図に描写するｐＹＡ２０８に類似するが、ｐｙ＾２０８を 特定する５ｐａＡ中に２．ＯｋｂのＢａｍＨＩ断片の３つの直列の反復を、すべ て同一リーディングフレームにおいて、含有する組み換えベクター）を有するＥ 、ｃｏｌｉ　ｘ２８４６を８０°Ｃまたはぞれ以上の温度に１０分間加熱すると 、５ｐａＡは室温または低温における貯蔵の間の分解に対して完全に安定化れた 。精製した５ｐａＡまたはｐＹＡ２１０を含有するＥ、ｃｏｌｉつ２８４６の溶 菌細胞により解放された５ｐａＡの、マウスの飼料と混合したときの、安定性を 検査する試みは、マウスの飼料中の成分がＳＤＳゲル電気泳動およびウェスタン ・プロット分析を妨害するという事実により妨げられた。こうして、マウスの飼 料中の５ｐａＡの抗原性を摂取の前または後に正確に定量することは不可能であ った。それにもかかわらず、免疫原性は食物の処理および消化の間の安定性のき わめてずぐれたインジケーターである。なぜなら、抗原は生き残って小腸に到達 して、腸に関連するリンパ系組織の上に横たわるＭ細胞により取り上げられるか らである。

■、鉢妖叉ｙバク屓９−免■件 熱で殺したおよび溶菌したＥ、ｃｏｌｉ　ｘ２８４６／　ＰＹＡ２１０を含有す る植物物質を凍結乾燥し、そして粉砕して飼料にした。次いで、それを乾燥した 状態で貯蔵した。前述したように、合計のタンパク質に関する５ｐａＡタンパク 質の量の分析に基づいて、マウスの飼料を２５〜５００ナノグラムの５ｐａＡ／ ｇの飼料を有するように調製した。この規定食を雌のＢＡＬＢ／ｃマウス、９〜 １０の週齢、に任意に与えた。マウスの体重を毎週測定して、マウスの成長およ び発育を追跡した。マウスは健康な状態であることが視的に観察された。

唾液の試料を毎週集めた。唾液の産生をピロカルピンで刺激した。血清を２週毎 に眼窩の採血により集めた。

血清の抗５ｐａＡのＩｇＧおよび唾液のＩｇＡをＥＬＩＳＡにより検出した。ダ イナチク・ラボラトリーズ（Ｄｙｎａｔｅｃｋ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）イ ムノロン−１フラット−ボトムのポリスチレンのプレートを、−夜４１°Ｃにお いて、１００．ｆ　（４，２５ｌＩｇのタンパク質）の堆積製５ｐａＡ　（スト レプトコッカス・ムタンス（Ｓ、ｓ＋ｕｔａｎｓ）からの上澄み液を沈澱し、濾 過し７、次いで透析および凍結乾燥した７０％の硫酸アンモニウムから得た）ま たは組み換えＥ、ｃｏｌｉから精製した５ｐａＡの１：５希釈物（０，１モルの ＮＨ，ＨＣＯ，緩衝液、ｐＨ９，６）で被覆した。次いで、プレートを０．０５ ％のツイーン−２０を含有するリン酸塩緩衝液（ＰＢＳ　；　ｐＨ７，２）で３ 回洗浄し、次いでＰＢＳ　十〇。０５％のツイーン−２０および１％のウシ血清 アルブミンで９０分間ブロッキングした。洗浄後、血清試料（１００Ｉの各希釈 物）を添加し、そして４°Ｃにおいて一夜インキュベーションした。プレートを 再び洗浄し、そしてアルカリ性ホスファターゼと接合した親和精製したヤギ抗マ ウスＩｇＧ（鎖特異的）またはヤギ抗マウスＩｇＡ（ｒ−鎖特異的）である第２ 抗体（１：１０００の希釈物）を添加し、そして室温において４時間インキュベ ーションした。洗浄後、ジエチルアラニン緩衝液ｐＨ９，８中に溶解したニトロ フェニルホスフェートの基質を添加し、そしてプレートを室温において１．５時 間インキュベーションした。次いで、それらを４０５ｎｎ＋においてバイオ−チ ク（Ｂｉｏ−Ｔｅｋ）自動化ＨＩＡプレート・リーダーで読んだ。合計の血清の ＩｇＡおよびＩｇＧに比較した抗５ｐａＡ血清１ｇＧおよび血清１ｇＡの標準化 は、ＥＬＩＳＡにおける標準として精製したＩｇＧ骨髄腫タンパク質または精製 した骨髄腫タンパク質を使用して達成した。

唾液の抗５ｐａＡのＩｇＡは、同様な方法において、第２抗体として、アフィニ ティー精製したウサギ抗マウス（α−鎖特異的）アルカリ性ホスファターゼ接合 体を使用して定量した。

ピロカルピンの刺激は唾液の変動する希釈を引き起こすので、標準としてマウス 骨髄腫を使用して決定した合計のｓｉｇＡに比較して唾液中の抗５ｐａＡ　ｓＩ ｇＡの特異的量を定量することが必須であった。適当な陽性および陰性の対照を 使用した。血清の抗体について、組み換えＥ、ｃｏｌｉから得られた精製した５ ｐａＡタンパク質で免疫化したマウスから得られたマウスの血清を使用した。唾 液の分泌ＩｇＡについての陽性の対照について、マウスを分泌線中で直接免疫化 した（免疫化抗原に対して特異的なｓＩｇＡを高いレベルで誘発することが知ら れている免疫化のルート）。唾液中の抗体の力価の測定は、組み換えＥ、ｃｏｌ ｉから精製した５ｐａＡタンパク質を使用することにことに注意すべきである。

なぜなら、使用する普通のマウスは、リボティコ酸（ｌｉｐｏｔｅｉｃｈｏｉｃ 　ａｃｉｄ）を包含する、普通の連鎖球菌の抗原を有し、そしてこれらの汚染性 抗原はストレプトコッカス・ムタンス（Ｓ、ｍｕｔａｎｓ）培養物の上澄み液か ら得られた５ｐａＡタンパク質から分離することが困難であるからである。

表１は、５ｐａＡタンパク質を発現する微生物をマウスに長期間与えたときの実 験の結果を示す。表１は、５ｐａＡタンパク質を発現する、マウスに与えたＥ、 ｃｏｌｉの唾液中のｓＩｇＡの力価を示す。

表土 ５ｐａＡタンパク質を発現するＥ、ｃｏｌｆ　Ｘ２８４６（ｐＹＡ２１０）を与 えたＢＡＬＢ／ｃマウスの唾液中のｓＩｇＡの力価１対　照　Ｘ２８４６　（ｐ ＹＡ２１０）供与時間　全ｓ１ｇＡ　抗−５ｐａＡ−特異的　全ＩｇＡ　抗−５ ｐａＡ−特異的（週）　ｓＩｇＡ　”’　ｓｌｇＡ（χ）　ｓＩｇＡ　”’　ｓ ｌｇＡ（χ）０　２０２３　２．６　０．１３　３８５２　４゜１　０．１１２ 　４９１３　３．４　０．１７　４７Ｂ５　４．３　０．０９４　４２４９　３ ．４　０．０８　５９６９　６．９　０．１２７　５４００　３．９　０．０７ 　５３５１　５．０　０．０９９　７０４６　４．９　０．０？　５４５５　４ ９．１　０．９０１１　６９９４　６．８　０．１０　６５０２　７７．４　１ ．１９１．３　６４２８　１？、８　０．２８　４７７２　５８．１　１．２２ １６　６３５１　４．５　０．０７　８０８９　８５．７　１．０６１８　６８ ２５　５．５　０．０８　９５２６　４０．３　０．４２２１　７８９１　７． １　０．０９　７５１２　６１．０　０．８１２６．５　５８６４　４．２　０ ．０７　６７２８　４５．５　０．６８２８．５　５９０４　３．１　０．０５ 　７２３２　５３．８　０．７４（ａ）　Ｅ、ｃｏｌｉ　Ｘ２８４６（＋）ＹＡ ２１０）を熱で殺し、凍結乾燥し、そしてマウスに任意に与えたマウスの飼料の １ｇ当たり１０７のバクテリアに等しい濃度でマウスの飼料に添加した。唾液の 試料は、ピロカルピンに注射後に集めた。

（ｂ）唾液の１ｄ当たりのｎｇで表す。

スＩＬ幻 アゲロバタテ１ウム・ラメ７　シエンス（Ａ　ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅ ｆａｃｉｅｎｓ）　３　− ■、ベクターの アグロバクテリウム・ツメファシェンス（Ａ、　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）への 転移が容易であるベクター、例えばｐｓＵＮ３４１およびｐｓＵＮ３４３の構成 は、実施例１に記載されている＊　ＣａＭＶ調製−５ｐａＡ−Ｎ０ＰＳ　−ｐｏ ｌｙＡ配列、ベクター、例えばｐｓＵＮ３９０．　ＰＳ［ｌＮ３９２、およびｐ ｓＵＮ３９４からの発現カセット（参照、第７図）をこれらのベクターから切除 し、そしてアグロバクテリウム・ツメファシェンス（Ａ、　ｔｕｍｅｆａｃｊｅ ｎｓ）への転移の前に、バイナリ−ベクター、例えばｐｓｌＪＮ４７３（第４図 ）の中に導入した。各場合において、バイナリ−ベクター、例えば、ｐｓＵＮ３ ４１は、トリベアレンタル・メイティングによりディスアームド（ｄｉｓａｒｍ ｅｄ）Ｔｉプラスミドを有するアグロバクテリウム・ツメファシェンス（Ａ、　 ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）菌株に転移されるであろう、フラレイ（Ｆｒａｌｅい ら、５ｕｐｒａ　、これはディスアームドブラスミド、例えば、ｐＡＬ４４０４ またはｐＡＬ１０５０を有するアグロバクテリウム・ツメファシェンス（Ａ、　 ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）菌株、例えば、ＬＡＢ４４０４またはＬＡＢ１０５０ を使用して達成することができた。ｐｓＵＮ３４１およびｐｓ［ｌＮ３４３を含 有するアグロバクテリウム・ツメファシェンス（Ａ、　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ）菌株は、ウェスタン・プロット分析により明らかにされるように、これらのベ クターをもつＥ、ｃｏｌｉ菌株がなしたのと同程度に多い５ｐａＡタンパク質を 産生した（データは示さなれていない）。

■、ルＥＬＬ風 ニコチアナ・タバクム（Ｎ、ｔａｂａｃｕｅｉ）　、別種１ａｖａｎａおよびＸ ａｎ　ｔｈ　１−、を、ｐｓＵＮ３４１およびｐＡＬ４４０４またばｐｓＵＮ３ ４３およびｐＡＬ４４０４を含有するアグロバクテリウム・ツメファシェンス（ Ａ、ｔｕｍｅｆａｅｆｅｎｓ）により、葉のディスクの形質転換法を使用して形 質転換した〔ホーシュ（ｈｏｒｓｃｈ）ら、５ｕｐｒａ　）。簡単に述べると、 ディスクとして調製した純粋な葉の組織を約１０’細胞／ｄの濃度でアグロバク テリウム・ツメファシェンス（Ａ、　ｔｕａ＋ｅｆａｃｉｅｎｓ）の液体培養物 の中に浸漬した。十分な時間（５〜３０秒）の間感染を起こらせた後、組織を絞 って乾燥させ、そして組織再生培地上で平板培養した。２または３日後、移植の 組織を新鮮な培地に移し、この培地はアグロバクテリウム・ツメファシェンス（ Ａ、　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）を殺すための抗生物質のカルベニシリンまたは セフォタキシムおよび形質転換された植物細胞を選択するためのカナマイシンを 含有した。

タバコにおいて、発芽は容易に発生し、これは全トランスジェニック植物を形成 することができる。形質転換されたタバコの組織を選択し、そして全植物を次の 文献に記載されている手順により再生した、ロウジャーズ（Ｒｏｇｅｒｓ）ら、 メソッズ・イニ／・エンジモロジー（Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、）１１ ８．６２７　（１９８６）　。

カルスの組織を次の文献に記載されている手順に従いツバリンシンターゼ活性に ついてアッセイした、オッテン（Ｏｔ　ｔｅｎ）ら、バイオロジー・エト・バイ オロジー・アクタ（Ｂｉｏｃｈｆ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ）　５２７．４９７（１９７８）　、　３３０　ｇの カナマイシン／−を有する選択したされた上で成長するカルスの組織から再生し た５つの別々の実験から誘導された、合計６４のトランスジェニック植物を、５ ｐａＡタンパク質の産生についてドツトプロットおよびウェスタン・プロット分 析により、そしてツバリンの産生についてツバリンの標準および陰性の対照植物 を使用するベーパー電気泳動により試験した。６４の植物のわずかに１つがツバ リンを産生じたが、４６の試験した植物の３３はツバリンを産生じた。ＤＮＡを ある数の植物からサザンプロット技術により分離した、サザン（Ｓｏｕｔｈｅｒ ｎ）、ジャーナル・オン・モレキュラー・バイオロジー（Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ 、）　９８．５０３（１９７８）。２．０ｋｂの５ｐａＡプローブを使用するこ とによって、試験した６つの植物はそれらがツバリンの産生または５ｐａＡの合 成について陽性または陰性であるかどうかにかかわらず、５ｐａＡ遺伝子を含有 することが実証される。ネオマイシンホスホトランスフェラーゼのためのＤＮＡ プローブを使用して、９つの植物から制限されたＤＮＡを分析すると、それらの すべてはネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子を含有し、そしてフラン キング配列がすべての９つの場合において異なるので、すべてはタバコのゲノム の異なる領域にＤＮＡインザートを有することが実証された。５ｐａＡタンパク 質をつくる１つの植物は、ツバリン陽性であり、そしてｐｓＵＮ３４３からの５ ｐａＡ遺伝子遺伝子台有する。

１・−ト１Ｚｌｊき二七乙久植勺ｊイぴル値ｇ２−庄±麦丈互支淀−１ｐＹＡ１ ７７を含有するＥ、ｃｏｌｉにより産生される５ｐａＡタンパク質を、従来開発 された方法〔ボルト（Ｈｏ１．ｔ）ら、５ｕｐｒａ　）および最高の分子量の５ ｐａＡバンドの電気溶離によりＳＤＳポリアクリルアミドゲルの連続する分離に 従い、精製した。５ｐａＡタンパク質を産生ずるトランスジェニックタバコ植物 からの葉のディスクを、２０閣のトリスｐ’ｄ１．４．３５０ミリモルのＮａＣ １および０．１％のβ−メルカプトエタノール中で均質化した〔マイクロフーグ ・ベスル（ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ　ｐｅｓｔｌｅ）を含有するウニトン・インスト ルメンツ（Ｗｅａｔｈｏｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）のオーバーヘッドの撹拌 機を使用する〕。上澄み液を破片の遠心沈降後に回収した。タンパク質のアッセ イは精製した５ｐａＡタンパク質およびタバコの細胞抽出物について実施した。

タバコの細胞の抽出物の種々の希釈物および対照として種々の系統の変化する量 の精製した５ｐａＡタンパク質をＳＤＳポリアクリルアミドゲルで電気泳動した 。次いで、うパルをウナギ抗５ｐａＡ血清を使用してウェスタン・プロット分析 にかけた。この分析の結果を第１１図に描写する。トランスジェニックタバコに より産生された５ｐａＡタンパク質は１０５ｋＤａの分子量を有し、これはｐＹ Ａ２０８およびｐｓＵＮ３４３によりつくられた５ｐａＡタンパク質の大きさよ りわずかに小さい（第６図）、タンパク質の大きさの差は、多分、植物中のプロ セシングのためである。トランスジェニック植物により産生された５ｐａＡタン パク質は二重であり、そし”Ｃ認識することができる破壊した物質は殆どあるい はまったく存在しない。破壊は起こらなか、ったといわないが、起こった場合、 それは植物により劣化される。ウェスタン・プロットのバンドの強度は、モレキ ュラー・ダイナミクス（Ｍｏｌｅｃ−ｕｌａｒ　Ｄｙｎａｍｉｃｓ）デンシトメ ーターを使用して定量した。標準の曲線の誘導に使用したデータを表２に含める 。これに基づいて、トランスジェニックタバコ植物により合成された５ｐａＡタ ンパク質は合計の植物のタンパク質の０．０２％を表すことが計算された。

表−１ 第１１図に描写したウェスタン・プロットで示されるバンドのデンシトメーター の読み １．０　１４５４６６　２５　７５４２３２５　２６７　Ｉ５４　５０　１６９ １６８ＳｐａＡを産生するタバコ植物は種子を形成させた。種子の収集および治 癒後、Ｆ２発生を表す５０の実生が種子の発芽後に得られ、そして植物を成長さ せて５ｐａＡをエンコードする配列のへりタビリティーについて試験した。ドツ トプロットおよびウェスタン・プロット分析を使用して、５ｐａＡの産生を検出 および定量した。１８の植物は５ｐａＡタンパク質をつくらなかったが、３２は つ（った。これらのすべては、親のトランスジェニックタバコ植物により産生さ れた５ｐａＡタンパク質と同一の分子量を有する５ｐａＡタンパク質を産生じた 。、ｘ２値は３．２３であり、これは０．０５の確立のためのｘ２値より下に入 り、これは５ｐａＡ産生対非産生植物の３２　：　１８比は単一の遺伝子（Ｍｅ ｎｄｅｌｉａｎｆａｃｔｏｒ）として分離されるという特性についてヘドロ接合 の植物の期待する３：１比に適合することが実証する。

３２の５ｐａＡ陽性の植物を、さらに、ウェスタン・プロットの定量的のデンシ トメーターの測定により分析して、５ｐａＡを産生ずる能力についてホモ接合性 の植物がその特性についてヘテロ接合性である植物から分化することができるか どうかを決定した。表３のデータが明らかにするように、１２の植物はホモ接合 性を示しうる量の５ｐａＡを産生した。これらの植物のうちの６ならびにヘテロ 接合性であると判定された６つは、種子の産生のために成長させて、発芽した子 孫の分析により、デンシトメーターの定量がホモ接合性対へテロ接合性を示すこ とに幀るすることができるかどうかを決定する。

安定性および免疫原性の分析は、上の実施例１に記載するようにして 表１ ３２のＦ２５ｐａＡ産生植物における合計のタンパク質の百分率と２　、０４３ 　２５　、００８ ４　．０４９　２６　．０１６ ６　、０３８　２７　、０２６ ９　、０３２　３０　、０４９ １１　．０３５　３１　．０２３ １３　．０４４　３３　．０１．３ １．４　．００８　３４　．０１１ １５　．０１５　３５　．０１４ １７　．０２２　３７　．０２６ １８　．０１２　３８　．００９ １９　．００２　３９　．０１５ ２０　．０３１　４２　．０１４ ２１　、０３８　４３　、００９ ２２　．００３　４８　．００３ ２３　、Ｏ］、５　４９　．０１１ の読みから計算した。植物１．３，５，７，８，１０，１２゜１６　、２８　、 ２９　、３２　、３６　、４０　、４１　、４４　、４５　、４６及び４７は５ ｐａＡタンパク譬を産生じなかった。

動　の“Ｓとしてのトランスジェニック育　の几５ｐａＡを産生ずる植物からの 葉の組織を取り出し、小さい（はぼ３ｃ４）の片に切断し、そしてほぼ２日間３ ７°Ｃで乾燥した。また、５ｐａＡを産生ずる植物からの葉の組織を取り出し、 液体窒素中で急速凍結し、そしてベルチス（Ｖｅｒｔｉｓ）フリーズモービＩＩ 凍結乾燥装置で凍結乾燥した。ウェスタン・プロット分析において、両者の方法 からの、合計のタンパク質の百分率としての５ｐａＡタンパク質の量は、５ｐａ Ａタンパク質の損失がわずかであるか、あるいはまったくないことを明らかにし た。５ｐａＡを産生ずるトランスジェニックタバコ植物からの凍結乾燥した某組 織を、−２０℃および室温において１３日間貯蔵した。室温において１３日間貯 蔵した凍結乾燥した組織を、また、マウスの飼料と１１の比で混合した。すべて の試料を、マイクロフーグ・ベスルを含有するウニトン・インストルメンツのオ ーバーヘッドの撹拌機を使用して、２０ミリモルのトリスｐＨ７，４，３５０ミ リモルのＮａＣ１および０．１％のメルカプトエタノール中の均質化した。破片 の遠心沈降後、上澄み液を回収し、次いでタンパク質をアッセイした。ウェスタ ン・プロット分析は、すべての場合において５ｐａＡタンパク質の損失をほとん どあるいはまったく示さなかった（第１２図）。レーン２．４．６および８にお ける植物の試料は、５ｐａＡ配列を含有するが、５ｐａＡ抗血清との反応の不存 在により明らかなように、５ｐａＡタンパク質を発現しない、トランスジェニッ ク植物からのものであった。参照、レーン２および４゜しかしながら、室温にお いて１３日間貯蔵したとき、凍結乾燥した植物組織中のあるものは、レーン６お よび８において見られるように、５ｐａＡ抗体と弱く反応する。これは完全には 理解されない。

様立土ヱ１１↓Ｊ玉肚す５タシ江【９免班を前述したように処理したタバコ植物 物質を産生ずる５ｐａＡをマウスの飼料と異なる投与量で混合して、摂取した５ ｐａＡタンパク質に対する分泌免疫応答の引き出しを研究することができる。ミ カレク（Ｍ　１ｃｈａ　１ｅｋ）ら、１９７６．５ｕｐｒａ）により従来の結果 は、飲料水の１　ｄ当たり１０”の殺したストレプトコッカス・ムタンス（Ｓ、 ｍｕｔａｎｓ）細胞を与えたラットにおいて、有意のｓｌｇＡの産生を観測した 。ストレプトコッカス・ムタンス（Ｓ、ｍｕ　ｔａｎｓ）における５ｐａＡタン パク質は合計のタンパク質のほぼ０．２％を表し、そして各ストレプトコッカス ・ムタンス（Ｓ、　ｍｕ　ｔａｎｓ）細胞はほぼ２Ｘ１０−Ｉ０■を含有する。

こうして、１０’のストレプトコッカス・ムタンス（Ｓ、ｍｕｔａｎｓ）細胞毎 に４０ナノグラムん５ｐａＡが存在する。ヘトロ接合性の５ｐａＡを産生ずるト ランスジェニック植物の前の分析に基づいて、２ｍｇの乾燥したトランスジェニ ックタバコは４０ナノグラムの５ｐａＡタンパク質を含有する。マウスの飼料に その１ｇ当たり２００　ｔｒｇ、２■、および２０ｍｇの乾燥したタバコ飼料を 補充することができる。これらの濃縮物は、飼料の１ｇ当たり１０７．１０’お よび１０９のストレプトコッカス・ムタンス（Ｓ、ｍｕｔａｎｓ）細胞の投与に 匹敵する、経口的免疫化投与量を提供する。この実験のプロトコルのために、タ バコ飼料の最大の投与量はマウスの飼料の規定食の２％を構成するであろう。２ ％は、認め得る悪い生理学的作用なしに、マウスの連続的に消費により許容され うる、タバコ飼料の投与蓋より５倍少ない。

■、植惣斗Ｓ虜ＪはｄびｎＬ漏乙ペノｊ」弓似糺妊性Ｊ二の規定食を雌のＢＡＬ Ｂ／ｃマウス、９〜・・１０週繭重に任意に与えた６　？゛ウス体重を毎週測定 （７て、マウスの成長および発育を追跡した。マウスは健康な状態であることが 視的に観察された。

唾液の試料を毎週集めた。唾液の産８′をピロカルビンで刺激し、た。血清を２ 週毎に眼窩の採血により集めた。

血清の抗５ｐａＡのＩｇＧおよび唾液のｉｇＡをＥ１□ＩｓＡにより検出した。

ダイナチク・ラボラトリーズ（Ｄｙｎａｔｅｃｋ　Ｌ、ａｂｏｒａｔｏｒｉｐｓ ）イノ１ノロンー１ノラフトーボトムのポリスチレンのプレートを、−夜４１° Ｃにおいて、１００ｍ　（４，２５ｇのタンパク質）の堆積製５ｐａＡ　ｒスト レプトコッカス・ムタンス（Ｓ、ｍｕｔａｎｓ）からの上澄み液を沈澱し、濾過 し、次いで透析および凍結乾燥した７０％の硫酸アンモニウムから得た〕また組 み換えＨ，ｃｏｌｉから精製した５ｐａＡの１：５希釈物（０，１′！ニルのＮ ＨａＨＣＯｓ　ｍ缶液、ｐＨ９，６）で被覆する。次いで、プレートを０．０５ ％のツイーン−２０を含有するリン酸塩緩衝液（ＰＢＳ　；　ｐｆ（’７．２　 ）で３回洗浄し、次いでＰ　Ｂ　Ｓ　＋　０．０５％のツイーン−２０および１ ％のウシ血清アルブミンで９００分間ブロッキングる。洗浄後、血清試料（１０ ０ｍの各希釈物）を添加し、そして４°Ｃにおいて一夜インキニベーションした 。プレートを再び洗浄し、そして親和精製したヤギ抗マウスＩｇＡＣ７−鎖特異 的）またはアルカリ性ホスファターゼと接合した親和精製したヤギ坑マウスＩｇ Ｇ（鎖特異的）である第２抗体（１：１０００の希釈物）を添加し、そして室温 において４時間インキュベーションした。洗浄後、ジエチルアラニン緩衝液ｐＨ ９，８中に溶解したニトロフェニルホスフェートの基質を添加し、そしてプレー トを室温において１．５時間インキュベーションする。次いで、それらを４．Ｏ ５ｎｍにおいてパイオーチク（Ｂｉｏ　−Ｔｅｋ）自動化ＥＩＡプレート・リー ダーで読んだ。合計の血清のＩｇＡおよびＩｇＧに比較した抗５ｐａＡ血清Ｉｇ Ｇおよび血清１ｇＡ　ｏ）標準化は、ＥＬ　ＩＳＡにおける標準として精製し７ た■ｇＧ骨髄骨髄腫タンパ皮質は精製した骨髄腫タンパク質を使用して達成する 。

唾液の抗５ｐａＡのＩｇＡは、同様な方法において、第２抗体として、親和精製 したウサギ抗マウス（α−鎖特異的）アルカリ性ホスファターゼ接合体を使用し て定量する。ピロカルピンの刺激は唾液の変動する希釈を１１き起こすので、標 準としてマウス骨髄腫を使用して決定した合計のｓｌｇＡに比較して唾液中の抗 ５ｐａＡ　ｓｌｇＡの特異的量を定量することが必須である１、適当な陽性およ び陰性の対照を使用した。面清の抗体について、組み換えＥ、ｃｏｌｉから得ら れた精製した５ｐａＡタンパク質で免疫化したマウスから得られたマウスの血清 を使用する。

ズ→１医ノー 値惣■彫五μ狽− ■、５ス！−二（７）講玖 ５ｐａＡ配列を含有する実施例１に記載するベクターｐｓｌｊＮ３４３を使用す る。

■、工少クりロポ上イショ７．木１Ｌ蚕ＭＪ１褌膝買Ｕタバコの原形質体をエレ クｌ〜ロボレイシゴンするために使用する手順は、ディピッド・チェンジ（Ｄａ ｖｉｄ　Ｃｈｅｎｇ）および共同研究者、ヘファー・サイエンティフィック・イ ンスッルメンツ・テクニカル・ブＬノチン（Ｈｏｅｆｅｒ　５ｃｉｅｎｔｉｆｉ ｃ　Ｉｎｓｔｒｕ−ｍｅｎｔｓ　Ｔｅｃｈｎｆｆｉｃａｌ　Ｂｕｌｌｅｔｉｎ） ＄１１８に本質的に記載されている手順であるう生体外で増殖した植物から３ま たは４（１の長さのとき分離し４たタバコの養〔ニコチアナ・クバクム（Ｎ、ｔ ａｂａ、ｃ−０ｍ）ｃ、ｖ、Ｈａｖａｎａ　）の上の表皮を１、次の文献に記載 されている方法により、３２０グリツド・の酸化アルミニウム粉末でブラッシン グして、原形質体の調製に使用する細胞壁分Ｎ酵素を浸透させる、マグニエン（ ＭｇｎｉｅｎＬ、Ｅ、ら、アクタ・デネ千力・シニカ（Ａｃｔａ　Ｇｅｎｅｔｉ ｃ、ａ　５ｉｎｉｅａ）−７，２３１（１９８０）　、酵素的に解放された原形 質体を１７．５％のスクローーーーζで洗浄し、浮遊さ・叶、そして５分間３０ ０Ｘｇにおいで６０ｄのバブコックびん中で遠心により収穫する。直線化したま たはスー・バーコロイドのＤＮＡ（ｐｓｔｌＮ３４３　）を原形質体と、０．５ 雌の最終体積で、それぞれ、７０．１■／成および７Ｘ１０’細胞／Ｉｌｆ！、 の濃度Ｃおいて１６院の直径のヌンク・マルチディソッ（Ｎｕｎｃ　Ｍｕｌｔｉ ｄｉｓｌ＋）ウェル中で混合する。単一のパルスを、室温（２：３°Ｃ）におい てへファー（Ｈｏｅｆｅｒ）ＰＧｉ０１ブロゲネター（ＰｒｏＧｅｎｅｔｏｒ） 　、１　＝　７トでＰＧＩ２０−２．５電極を使用して２００ｖで１０マイクロ 秒間投与する。、、Ｉ：レクトロボレイションした原形質体を、１　ｄの培地の 添加前に、１０分間静止して保持する。引き続いて、細胞を１０５細胞／Ｉｄ。

の最終濃度に希釈した。次いで、これらの細胞を４０〜４８時間後５ｐａＡの一 時的発現についてアッセイするか、あるいは、使用するＤＮＡ構成体に依存して 、カナマイシンの選択下に平板培養してカルスの組織を発生させ、次いで全植物 に再生することができる。

■、再再 生質転換後の植物を、選択圧力としてカナマイシンを有するカルスの成長培地上 で平板培養し、そして２４°Ｃにおいて１６時間拡散の光７８時間の暗所のサイ クルで２〜３週間培養する。カルスを２〜３週毎に二次培養物して、再生で進行 するために十分な組織を産生ずる。十分な組織が得られた後、カルスを、選択圧 力の存在または不存在で、再生培地に移し、そして発芽した芽が形成するまで、 ２４°Ｃにおいて１６時間拡散の光７８時間の暗所のサイクルで３〜４週間培養 する。この時において、物質を選択圧力の存在または不存在で、植物確立培地に 移し、そして３−３枚の葉が形成するまで、２４℃において１６時間拡散の光７ ８時間の暗所のサイクルで３〜４週間培養する。

カルスの組織および再生した植物は、合計のタンパク質に関して、ＥＬＩＳＡま たはウェスタン・プロットおよび定量的デンシトメーターの分析により、５ｐａ Ａタンパク質のレベルについて評価することができる。（参照、表２および３） 。

■、　で、　したＳａＡタンパク　の６　、へり　ビリーイーおよび 形質転換された植物中の５ｐａＡタンパク質の安定性、ヘリクビリティーおよび 免疫原性を、実施例１および２の方法により分析する。

実詣聞工 実施例２を反復するが、工程■において、ｇｔｆＢを含有する適当な植物形質転 換ベクターを構成する。例えば、ｐｓ［ＩＮ３８７ｌＮ３８７（を調製し、これ は５ｐａＡ遺伝子の代わりにｐｓＵ２０　ｃシロザ（Ｓｈｉｒｏｚａ）　、Ｔ、 ら、前掲〕から分離し７たｇｔｆＢ遺伝子を含有する。ｇｔｆＢをエンコードす る配列ならびにＣａＭＶ３５５プロモーターおよびＮ０ＰＳ３　’　ｐｏｌｙＡ 配列を適当なバイナリ−ベクター、例えば、ｐｓＵＮ４７３またはｐＳＵＮ４７ ５の中に導入する。

トランスジェニックタバコ植物の発生後、ＧｔｆＢタンパク質についての安定性 、ヘリクビリティーおよび免疫原性の分析を、実施例１および２に記載するよう に実施する。

２詣１ 実施例３を反復するが、工程Ｉにおいて、５ｐａＡおよびｇｔｆＢの両者を含有 する適当な植物形質転換ベクターを構成する。

例えば、ＧｔｆＢをｐＳＵＮ３９４中の５ｐａＡ配列の次ぎに挿入する。このよ うにして、２つのコロニナイゼイション抗原を発現する構成体が形成する。

トランスジェニック植物を原形質体誘導カルスから発生させた後、５ｐａＡおよ びＧｔｆＢタンパク質の安定性、ヘリタビリティーおよび免疫原性を、実施例１ および２に記載するように分析する。

ス訓ｌ津影 実施例３を反復するが、工程Ｉにおいて、デキストラナーゼを含有する適当な植 物形質転換ベクターを構成する。例えば、ＶＹＡ９９３から分離したデキストラ ナーゼ（ｄｅｘ）遺伝子を含有するｐｓＵＮ３８７を調製する。

トランスジェニック植物を原形質体誘導カルスから発生させた後、５ｐａＡおよ びＧｔｆＢタンパク質の安定性、ヘリクビリティーおよび免疫原性を、実施例１ および２に記載するように分析する。

災施開１ 実施例３を反復するが、工程Ｉにおいて、５ｐａＡおよびｄｅｘの両者を含有す る適当な植物形質転換ベクターを構成する。

例え、ばｄｅｘをｐｓＵＮ３９４中の５ｐａＡ配列の次ぎに挿入する。このよう にして、２つのコロニナイゼイション抗原を発現する構成体が形成する。

トランスジェニック植物を原形質体誘導カルスから発生させた後、５ｐａＡおよ びデキストラナーゼタンパク質の安定性、ヘリタビリティーおよび免疫原性を、 実施例１および２に記載するように分析する。

犬上伍■ 実施例３を反復するが、工程Ｉにおいて、Ｋ８Ｂ線毛コロニナイゼイション抗原 遺伝子を含有する適当な植物の形質転換ベクターを構成する。例えば、ｐｓＵＮ ３８７を調製し、これはケヘ（Ｋｅｈｏｅ）ら、ネイチャー　（Ｎｅｔｕｒｅ） ２９１．１２２（１９８１）により開発された、プラスミドｐＭＫＯＯ５から分 離したに８８線毛コロニナイゼイション抗原を含有する。トランスジェニック植 物を原形質体誘導カルスから発生させた後、Ｋ８８抗原の安定性、ヘリクビリテ ィーおよび免疫原性の分析を、実施例１および２に記載するように実施する。

裏施■工 実施例３を反復するが、工程Ｉにおいて、Ｋ９９線毛コロニナイゼイション抗原 を含有する適当な植物形質転換ベクターを構成する。例えば、ｐｓ［ＪＮ３８７ を調製し、これはプラスミドｐＲＩ９９０６から分離したに９９線毛コロニナイ ゼイション抗原を含有する。トランスジェニック植物を原形質体誘導カルスから 発生させた後、Ｋ９９抗原の安定性、ヘリタビリティーおよび免疫原性の分析を 、実施例１および２に記載するように実施する。

去立困皿 実施例３を反復するが、植物の形質転換ベクターは、５ｐａＡタンパク質および ＬＴ−Ｂタンパク質からなる融合タンパク質の遺伝情報を指定するＤＮＡ配列を 含有する、プラスミドｐｓＵＮ３８７（ｓｐａＡ／ＬＴ−Ｂ）である。Ｌ、Ｔ− Ｂ配列は融合タンパク質のＮ末端である。ＬＴ−Ｂタンパク質の遺伝情報を指定 するＤＮＡ配列をＥ、ｃｏｌｉから分離する〔ヤマモト、Ｔおよびヨコト、Ｔ９ 、前掲〕。トランスジェニック植物を原形質体誘導カルスから発生させた後、５ ｐａＡおよびＬＴ−Ｂタンパク質の安定性、へりタビリティーおよび免疫原性の 分析を、実施例１および２に記載するように実施する。

実施■旦 実施例２を反復するが、ｐＳＵＮ４７３（ｇｔｆＢ）を使用する植物の形質転換 ベクターは、フィラッチ（Ｆｆｌｌａｔｔｉ）、Ｊ、ら、（１９８７）、前掲に 従い、トマトについて実施する。選択した移植組織から全植物が発生した後、ｇ ｔｆＢの安定性、ヘリクビリティーおよび免疫原性の分析を、実施例１および２ に記載するように実施する。

実藷貫せ 実施例２を反復するが、ｐｓＵＮ４７５　（ＬＴ−Ｂ）を使用する植物の形質転 換ベクターは、エベレット（Ｅｖｅｒｅｔｔ）　、Ｎ、Ｐ、ら（１，９８７）、 ５ｕｐｒａに従い、トマトについて実施する。選択した移植組織から全植物が発 生した後、ＬＴ−Ｂタンパク質の安定性、ヘリクビリティーおよび免疫原性の分 析を、実施例１および２に記載するように実施する。

災施貫■ 実施例２を反復するが、ｐｓＵＮ４７３　（Ｋ９９）を使用する植物の形質転換 ベクターは、ヒンチェ−（Ｈｉｎｃｈｅｅ）　、Ｍ、Ａ、ら（１９８７）、前掲 に従い、トマトについて実施する。選択した移植組織から全植物が発生した後、 Ｋ９９タンパク質の安定性、ヘリタビリティーおよび免疫原性の分析を、実施例 １および２に記載するように実施する。

尖血貫■ 実施例２を反復するが、ｐＳＵＮ４１３　（Ｋ８Ｂ）を使用する植物の形質転換 ベクターは、ファシオッチ（Ｆａｃｃｉｏｔｔｉ）　、、Ｄ、ら（１９８５）、 前掲に従い、トマトについて実施する。選択した移植組織から全植物が発生した 後、Ｋ８８タンパク質の安定性、ヘリタビリティーおよび免疫原性の分析を、実 施例１および２に記載するように実施する。

１里貫旦 植物の形質転換はアルファルファについてマイクロインジェクションにより実施 する。

植物細胞中のｐｓＵＮ３８７　（Ｋ９９）の転移は、プラスミドＤＮＡの溶液を 微細に引いたガラスの針で、分離した原形質体、培養した細胞および組織の中に 直接注入すること、レイチ（Ｒｅｉｃｈ）、Ｔ、Ｊ、ら、バイオ／テクノロジー （Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）　４．１００１（１９８６）　；カナディア ン・ジャーナル・ボタニー（Ｃａｒ＋、Ｊ、Ｂｏｔ、）旦、１２５９　（１９８ ６）および実生および植物の分裂組織中に注入すること、デ・う・ペナ（Ｄａ　 Ｌａ　Ｐｅｎａ）、Ａ、ら、ネイチ−？　−（Ｎａｔ−ｕｒｅ）　３２５．２７ ４　（１９８７）　、グレイブス（Ｇｒａｖｅｓ）、Ａ、Ｃ，ら、プラント・モ レキュラー・バイオロジー（Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、）ユ、７６３（１ ９８７）よって達成される。

Ｋ９９タンパク質の安定性、へりタビリティーおよび免疫原性の分析を、実施例 １および２に記載するように実施する。

災施拠用 植物の形質転換は、ネグルチウ（Ｎｅｇｒｕ　ｔｉ　ｕ）、Ｒ９ら（１９８７） 、前掲に従い、タバコについてポリエチレングリコールの通用により実施する。

原形質体を１５ミリモルのＭｇＣ１，を含有する０、５モル中に約２　ＸＩＯ’ 　／ｄの密度で懸濁する。原形質体の懸濁液を１０ｍ２のプラスチックの遠心管 の中に分配する。ＤＮＡを添加し、次いでＰＥＣ，溶液を添加する〔４０％（− ／Ｖ　分子１ｔ４０００．０．４モルのマンニトール、０．１モルのＣａ　（Ｎ Ｏｉ）　ｚ、（ｐＨ７，０））、この溶液をおだやかに混合し、そして室温（２ ４°Ｃ）において３０分間時々震盪しながらインキュベーションする。次いで、 洗浄液を添加し、そして管の内容物をおだやかに混合する。洗浄液を８７ナノモ ルのマンニトール、ＣａＣ１□、ＭｇＣ１ｚ、ＫＣｌ、　トリス／ＨＣＩおよび ｍ−イノシトールから成る（ｐＨ９，０）。洗浄液の４つのそれ以上のアリコー トを４分の間隔で添加し、各添加後混合する。次いで、この管を約６０ｇにおい て約１０分間遠心し、そして上澄み液を廃棄する。沈降した原形質体を培地の中 に取り、そしてｌ０ＣＩＩＩのベトリ皿に入れる。

５ｐａＡタンパク質の安定性、ヘリクビリティーおよび免疫原性の分析を、実施 例１および２に記載するように実施する。

実益側、Ｕ 実施例１６を反復するが、工程ＩＴにおいて、植物の形質転換ｐＳＵＮ３８７　 （Ｋ８８）をネグルチウ（Ｎｅｇｒｕｔｉｕ）、Ｒｏら（１９８７）、前掲に従 いロリウム・ムルチフロルム（Ｌｏｌｉｕｍ　１ｕｌｔｉｆｌｏｒｕｎ＋）につ いて実施する。Ｋ８８タンパク質の安定性、へりタビリティーおよび免疫原性の 分析を、実施例１および２に記載するように実施する。

ＤＮＡの転移および形質転換体の選択。原形質体をイネ（Ｏｒｙｚａ　５ａｔｉ ｖａ）の朽誘導細胞の懸濁液から分離し７、そしてフロム（Ｆｒｏｍｍ）　らに 従い、多少の変更を加えて、次のようにしてエレクトロボレイシヨンする。原形 質体（２Ｘ１０’）および巴形の形態のプラスミド、、　ｐｓＵＮ３９０．ｐｓ ＵＮ３９１．ｐｓｌＪＮ３９２およびｐｓｔＪＮ３９４　（各１０　ｎ　）をプ ラスチックのクベット（内部の電極の距離は０．４　Ｃｌ１１であった）中の０ ．６　ｄの０．５ミリモルの２−〔Ｎ−モルホリノ〕エタンスルホン酸（ｐＨ５ ，８）　、７ミリモルのＫＣＩ　、４ミリモルのＣａＣ１ｚ−２８ｚＯおよび６ ．５％のマンニトールから成る緩衝液の中に懸濁させる。電気パルスを５００Ｖ ／ｃｍで充電した１２５μＦのコンデンサー〔シーン−パルサー（Ｇｅｎｅ−Ｐ ｕｌｓｅｒ）　、パイオーラド（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）　、カリフォルニア州、米国 〕から放出する。抵抗−キャパシタンス（ＲＣ）時間一定数は、それぞれ、４マ イクロ秒および２０マイクロ秒である。４℃において１０分、次いで室温におい て１０分後、エレクト・ロボレイションした原形質体を２■／１の２，４−ジク ロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）および５％のマンニトールを補充した２、５ １ｄの培地を含有するベトリ皿（直径５Ｃ１）に移す、２週後、２ｍｇ／ｌの２ ．４−Ｄおよび３％のグルコースを補充したｌｄのＮＯ８培地（硫酸アンモニウ ムを含まないＢ５培地）を添加する。３週後、培地をグルコースを欠如し、２■ ／’ｄの０４１８サルフエート〔シエリング・カンパニー（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ　 Ｃｏ、）、ニュージャーシイ州〕を含有するＮｏ、培地と置換する。１月エレク トロボレイシヨンした後、生き残りのマイクロカルスを２０■のＧ４１８／ｄお よび１％のアガロース〔シグマ（Ｓｉｇｍａ）　１型〕を含有するＮＯ３培地に 移す。さらに２週後、成長するカルスを０．２■／工のインドール−３−アミノ 酸、１■／１のカイネチンおよび１％のアガロースを含有するＮ６培地（再生培 地）上に移す。カルスの組織をオッテン（Ｏｔｔｅｎ）　ら、前掲に従いツバリ ンシンターゼ活性についてアッセイする。

５ｐａＡタンパク質の安定性、ヘリクビリティーおよび免疫原性の分析を、実施 例１および２に記載するように実施する。

災施炎旦 旦　の　゛によるケイプの６　なノ　−植物細胞の中にＤＮＡ配列を導入する他 の方法は、前記ＤＮＡをタングステン粒子に付着し、次いでこれらの粒子をフレ イン（Ｋｌｅｉｎ）　、Ｔ、Ｎ、ら、前掲に記載されている発射装置によるか、 あるいはマクケイプ（ｍｃＣａｂｅ）、Ｅ、　Ｔ、ら、前掲に記載されているよ うに微細に変調した放電を使用する粒子を加速してＤＮＡで被覆した金の粒子を 加速することによって、植物細胞の中に強制的に進行させることからなる。任意 の植物組織および植物器官をこの手順のために標的として使用することができ、 このような組織および器官は次のものを包含するが、これらに限定されない：生 体内および生体外の胚、頂芽および他の分裂組織、蕾、体および性組織。トラン スジェニックの細胞およびカルスをこの分野において知られている確立された手 順に従い選択する。この分野において知られている確立された手順に従い、標的 組織を誘発して体の胚を形成するか、あるいはシュートを発生させてトランスジ ェニック植物にする。適当な手順は使用する植物の種に従い選択することができ る。

再生した植物は組み込まれた外来ＤＮＡに関してキメうであることができる。外 来ＤＮＡを含有する細胞が小／巨大胞子に発育する場合、組み込まれたＤＮＡは 性の子孫に伝達される。外来ＤＮＡを含有する細胞が植物の体細胞である場合、 非キメラのトランスジェニック植物は植物の増殖の慣用方法により、生体内で、 すなわち、芽または茎の切断物からか、あるいは生体外でこの分野において知ら れている確立された手順に従い産生される。このような手順は使用する植物の種 に従い選択することができる。

形質転換はマクケイプ（ＭｃＣａｂｅ）、Ｄ、Ｅ、ら（１９８８）、前掲に従い ケイプについて実施する。

ＤＮＡの調製。ＤＮＡで被覆した当社体を１．５〜３Ｉ！ｒａの金の球〔アルフ ァ’ケミカル・カンバー１−−（Ａｌｆａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、））をｐ ｓＬＩＮｓ８７（ｇｔｆ８）Ｉ）ＮＡの溶液と１■の金のビーズ／１眉のＤＮＡ の割合で混合することによって調製する。このスラリーをＮ２の流れ下に乾燥し 、そして乾燥したベレットを１００％のエタノール中に２■のビーズ／ｄの濃度 で再懸濁する。、１６２Ｉのこの金の懸濁液をピペットで１８Ｗ２のアルミニウ ム化プラスチックフィルム上に配置する。ここで薄い層のビーズを支持するシー トを空気乾燥する。

粒子の加速。−次の葉を除去し７で分裂組織を暴露した胚軸（ｅｍｂｒｙｏｎｉ ｃ　ａｘｅ＞を粒子の加速にさらす。ビーズを有するシートを粒子加速機上に装 填し、この機械は運動力として小さい水滴を通して高い電圧のコンデンサの放電 を使用する。

１００メツシユの保持スクリーンをシートと機械より上に懸垂した標的！ＩＩ織 との間に配置する。次いで、このアセンブリーを約５００ｍｍｌ（ｇに排気して 空気力学的抵抗を減少する。２μＦのコンデンサーからの１４ｋＶをポリ塩化ビ ニルの膨張室内でＩＩの水滴を通して放電する。シートを保持スクリーンに対し て吹き付けて、ビーズを外側に推進させて、スクリーンより上に懸垂されたｍ織 を衝撃する。標的の軸を水寒天平板上に配置布、こうして平板をスクリーンの上 に倒立させて、分裂組織の領域を加速されたビーズの通路の中に位置させる。

植物の再生。粒子の加速により処理した植物組織を、１３．３μモルのベンジル アミノプリン、０．２μモルのナフタレン酢酸、５ミリモルのチアミンおよび１ ２ミリモルのプロリンを補充した変性ＭＳ培地上に配置し、そして暗所で１〜２ 週間室温においてインキュベーションする。次いで、軸を１．７μモルのベンジ ルアミノプロリンおよび０．２μモルのインドリル−３−酢酸を補充したＭＳ培 地に移す。植物の再生を１６時間の光期間の下に軸の連続的インキュベーション により進行させる。多数のシュートを一次およびわきの分裂組織の両者から形成 する。

切除したシュートをそれ以上の成長のために植物再生培地上で平板培養すること によって根付かせる。

ＧｔｆＢタンパク質の安定性、ヘリクビリティーおよび免疫原性の分析を、実施 綿１および２に記載するように実施する。

本発明を好ましい実施態様の細部を参照して開示したが、本発明の精神および添 付した請求の範囲の範囲内で、変更は当業者とって容易であると考えられるので 、この開示は限定よりむしろ例示を意図する。

ＦＩＧ、　６−１ ＦＩＧ、　８−２ 浄Ｗ（内容に変更なし） ＦＩＧ、　８−１ 由　来　ＡＳＤプロモーターの上流のＨｅｏＲＩ　”ｒ財α４８．５　− ＦＩＧ、　９ ＦＩＧ、　１０ ４８．５　− 浄書（内容に変更なし） ＦＩＧ、１１ １８〇　− ＦＩＧ、　１２ ．４８．５　− 手続補正書く方式） １．事件の表示 ＰＣＴ／ＵＳ　８９１０３７９９ 平成１年特許願第５０９８４２号 ２、　発明の名称 トランスジェニック植物による経口的免疫化。

３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 名称　ワシントン　ユニバーシティ ４、代理人 住所　〒１０５東京都港区虎ノ門−丁目８番１０号６、補正の対象 （１）特許法第１８４条の５第１項の規定による書面の「特許出願人の代表者、 の欄 （２）明細書及び請求の範囲の翻訳文 （３）委任状 （４）図面の翻訳文 ７、補正の内容 （ＩＯ２）別紙の通り （２）明細書、請求の範囲の翻訳文の浄書（内容に変更なし） （４）図面の翻訳文の浄書（内容に変更なし）８、添付書類の目録 （１）訂正した特許法第１８４条の５第１項の規定による書面　１　通 （２）明細書及び請求の範囲の翻訳文　各　１　通（３）委任状及びその翻訳文 　各　１　通（４）図面の翻訳文　１　通 国際調査報告 １＋ｔｏ＋’＋ｔｍｏｌＩ＃ｌ＾１νｍｌｌＮ１ｍ１−シー、ＰＣＴ／υＳ８９ １０３７９９国際調査報告

Claims (49)

【特許請求の範囲】
1. １．病原性微生物の抗原の遺伝情報を指定するＤＮＡ配列からなりかつそれを発 現するトランスジェニック植物であって、前記抗原は、 ａ）コロニナイゼイション抗原、 ｂ）ピルレンス抗原、 ｃ）いずれかの抗原の抗原決定基、またはｄ）いずれかの抗原またはその抗原決 定基からなる融合タンパク質、から成る群より選択され、前記抗原またはその抗 原決定基は経口的摂取のときヒトまたは他の動物において分泌免疫応答を引き出 すことができる、トランスジェニック植物。
2. ２．ＤＮＡ配列は、前記抗原の遺伝情報を指定する遺伝子、遺伝子の組み合わせ 、遺伝子断片、または遺伝子断片の組み合わせからなる、上記第１項記載の植物 。
3. ３．ＤＮＡ配列は前記抗原の遺伝情報を指定する合成配列である、上記第１記載 の植物。
4. ４．病原性の微生物またはウイルスは、アクチノミセス属（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃ ｅｓ）、アエロモナス属（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕ ｓ）、バクテリオデス属（Ｂａｃｔｅｒｉｏｄｅｓ）、ボルデテラ属（Ｂｏｒｄ ｅｔｅｌｌａ）、ブルセラ属（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）、カンビロバクテル属（Ｃａ ｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、カブノイシトファが属（Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈａ ｇａ）、クラミジア属（Ｃｌａｍｙｄｉａ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔ ｒｉｄｉｕｍ）コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｋｕｔｅｒｉｕｍ）、エ イケネラ属（Ｅｉｋ−ｅｎｅｌｌａ）、エリジペロスリックス属（Ｅｒｙｓｉｐ ｅｌｏｔｈｒｉｘ）、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、ヘモフィル ス属（Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、レ ジュネラ属（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、レプトスピラ属（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ）、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、マイコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃ ｔｅｒｉｕｍ）、マイコプラズマ属（ＭｙｃｏｐｌａＳｍａ）、ネイセリア属（ Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、ノカルジア属（Ｎｏｃａｒｄｉａ）、パスツレラ属（Ｐ ａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）、プロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、シュードモナス属 （Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、リケッチア属（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）、サルモ ネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、赤痢菌属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、ブドウ球菌 属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、連鎖球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕ ｓ）、セレノモナス属（Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ）、トレポネーマ属（Ｔｒｅｐ ｎｏｎｅｍａ）、ビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ）、エルジニア属（Ｖｅｒｓｉｎｉ ａ）アデノウイルス、コロナウイルス、ヘルペスウイルス、オルソミクソウイル ス、ピコルナウイルス、ボックスウイルス、レオウイルス、レトロウイルス、ロ タウイルス、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、ブラストミセス属 （Ｂｌａｓｔ−ｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、コクシジオイ デス属（Ｃｏｃ−ｃｉｄｉｏｉｄｅｓ）、クリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔｏｃ ｏｃｃｕｓ）、ヒストプラズマ属（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ）、フィコミセス属 （Ｐｈｙｃｏｍｙｃｅｓ）、アイメリア属（Ｅｉｍｅｒｉａ）、アメーバ属（Ｅ ｎｔａｍｏｅｂｅ）、ジアルジア属（Ｇｉａｒｄｉａ）、およびトリコモナス属 （Ｔｒｉｃｏｍｏｎａｓ）から成る群より選択される、上記第１項記載の植物。
5. ５．前記コロニナイゼイション抗原またはビルレンス抗原はストレプトコツカス ・ムタンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｍｕｔａｎｓ）または大腸菌（Ｅｓ ｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）からのものである、上記第１項記載の植物。
6. ６．抗原はＳｐａＡ，ＧｔｆＢ，デキストラナーゼ，Ｋ８８，Ｋ９９，ＣＦＡ， ＬＴ−Ｂまたはそれらの抗原決定基から成る群より選択される、上記第１項記載 の植物。
7. ７．同一であるか、あるいは異なる２またはそれ以上の抗原の遺伝情報を指定す る２またはそれ以上のＤＮＡ配列をさらに含む、上記第１項記載の植物。
8. ８．前記融合タンパク質は２またはそれ以上の前記抗原からなる、上記第１項記 載の植物。
9. ９．前記融合タンパク質は前記抗原の安定性を増大するポリペプチドからなる、 上記第１項記載の植物。
10. １０．前記融合タンパク質は前記抗原の取込みを増大するポリペプチドからなる 、上記第１項記載の植物。
11. １１．双子葉植物である、上記第１項記載の植物。
12. １２．単子葉植物である、上記第１項記載の植物。
13. １３．トランスジェニック植物またはトランスジェニック植物から得られた物質 からなり、前記トランスジェニック植物は病原性微生物の抗原の遺伝情報を指定 するＤＮＡ配列からなりかつそれを発現し、前記抗原は、 ａ）コロニナイゼイション抗原、 ｂ）ビルレンス抗原、 ｃ）いずれかの抗原の抗原決定基、またはｄ）いずれかの抗原またはその抗原決 定基からなる融合タンパク質、から成る群より選択され、前記抗原またはその抗 原決定基は経口的摂取のときヒトまたは他の動物において分泌免疫応答を引き出 すことができる、ヒトおよび他の動物において分泌免疫応答を引き出すために適 当な組成物。
14. １４．ＤＮＡ配列は、前記抗原の遺伝情報を指定する遺伝子、遺伝子の組み合わ せ、遺伝子断片、または遺伝子断片の組み合わせからなる、上記第１３項記載の 組成物。
15. １５．ＤＮＡ配列は前記抗原の遺伝情報を指定する合成配列である、上記第１３ 項記載の組成物。
16. １６．病原性の微生物またはウイルスは、アクチノミセス属（Ａｃｔｉｎｏｍｙ ｃｅｓ）、アエロモナス属（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌ ｕｓ）、バクテリオデス属（Ｂａｃｔｅｒｉｏｄｅｓ）、ボルデテラ属（Ｂｏｒ ｄｅｔｅｌｌａ）、ブルセラ属（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）、カンビロバクテル属（Ｃ ａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、カブノイシトファが属（Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈ ａｇａ）、クラミジア属（Ｃｌａｍｙｄｉａ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓ ｔｒｉｄｉｕｍ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｋｕｔｅｒｉｕｍ） 、エイケネラ属（Ｅｉｋ−ｅｎｅｌｌａ）、エリジペロスリックス属（Ｅｒｙｓ ｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ）、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、ヘモフ ィルス属（Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ） 、レジュネラ属（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、レプトスピラ属（Ｌｅｐｔｏｓｐｉ ｒａ）、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、マイコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂ ａｃｔｅｒｉｕｍ）、マイコプラズマ属（Ｍｙｃ−ｏｐｌａｓｍａ）、ネイセリ ア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、ノカルジア属（Ｎｏｃａｒ−ｄｉａ）、パスツレ ラ属（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）、プロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、シュード モナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、リケッチア属（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ） 、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、赤痢菌属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、ブ ドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、連鎖球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃ ｏｃｃｕｓ）、セレノモナス属（Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ）、トレポネーマ属（ Ｔｒｅｐｎｏｎｅｍａ）、ビブリオ属（Ｖｂｒｉｏ）、エルジニア属（Ｙｅｒｓ ｉｎｉａ）、アデノウイルス、コロナウイルス、ヘルペスウイルス、オルソミク ソウイルス、ピコルナウイルス、ボックスウイルス、レオウイルス、レトロウイ ルス、ロタウイルス、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、ブラスト ミセス属（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、コクシ ジオイデス属（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ）、クリプトコッカス属（Ｃｒｙｐｔ ｏｃｏｃｃｕｓ）、ヒストプラズマ属（Ｈｉｓｔｏ−ｐｌａｓｍａ）、フィコミ セス属（Ｐｈｙｃｏｍｙｃｅｓ）、アイメリア属（Ｅｉｍｅｒｉａ）、アメーバ 属（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ）、ジアルジア属（Ｇｉａｒｄｉａ）、およびトリコモ ナス属（Ｔｒｉｃｏｍｏｎａｓ）から成る群より選択される、上記第１３項記載 の組成物。
17. １７．前記コロニナイゼイション抗原またはビルレンス抗原はストレプトコッカ ス・ムタンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｍｕｔａｎｓ）または大腸菌（Ｅ ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）からのものである、上記第１３項記載の組成 物。
18. １８．抗原はＳｐａＡ，ＧｔｆＢ，デキストラナーゼ，Ｋ８８，Ｋ９９，ＣＦＡ ，ＬＴ−Ｂまたはそれらの抗原決定基から成る群より選択される、上記第１３項 記載の組成物。
19. １９．同一であるか、あるいは異なる２またはそれ以上の抗原の遺伝情報を指定 する２またはそれ以上のＤＮＡ配列からなる、上記第１３項記載の組成物。
20. ２０．前記融合タンパク質は２またはそれ以上の前記抗原からなる、上記第１３ 項記載の組成物。
21. ２１．前記融合タンパク質は前記抗原の安定性を増大するポリペプチドからなる 、上記第１３項記載の組成物。
22. ２２．前記融合タンパク質は前記抗原の取込みを増大するポリペプチドの遺伝情 報を指定する第２ＤＮＡ配列からなる、上記第１３項記載の組成物。
23. ２３．トランスジェニック植物は双子葉植物である、上記第１３項記載の組成物 。
24. ２４．トランスジェニック植物は単子葉植物である、上記第１３項記載の組成物 。
25. ２５．免疫学的に許容されうるアジュバントをさらに含む、上記第１３項記載の 組成物。
26. ２６．前記トランスジェニック植物の物質を食物の物質と混合することからなる 、上記第１３項記載の組成物をつくる方法。
27. ２７．ＤＮＡ配列は、前記抗原の遺伝情報を指定する遺伝子、遺伝子の組み合わ せ、遺伝子断片、または遺伝子断片の組み合わせからなる、上記第２６項記載の 方法。
28. ２８．ＤＮＡ配列は前記抗原の遺伝情報を指定する合成配列である、上記第２６ 項記載の方法。
29. ２９．病原性の微生物またはウイルスは、アクチノミセス属（Ａｃｔｉｎｏｍｙ ｃｅｓ）、アエロモナス属（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌ ｕｓ）、バクテリオデス属（Ｂａｃｔｅｒｉｏｄｅｓ）、ボルデテラ属（Ｂｏｒ ｄｅｔｅｌｌａ）、ブルセラ属（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）、カンピロバクテル属（Ｃ ａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、カブノイシトファが属（Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈ ａｇａ）、クラミジア属（Ｃｌａｍｙｄｉａ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓ ｔｒｉｄｉｕｍ）コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｋｕｔｅｒｉｕｍ）、 エイケネラ属（Ｅｉｋ−ｅｎｅｌｌａ）、エリジペロスリックス属（Ｅｒｙｓｉ ｐｅｌｏｔｈｒｉｘ）、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、ヘモフィ ルス属（Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、 レジュネラ属（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、レプトスピラ属（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒ ａ）、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、マイコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａ ｃｔｅｒｉｕｍ）、マイコプラズマ属（Ｍｙｃ−ｏｐｌａｓｍａ）、ネイセリア 属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、ノカルジア属（Ｎｏｃａｒ−ｄｉａ）、パスツレラ 属（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）、プロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、シュードモ ナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、リケッチア属（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）、 サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、赤痢菌属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、ブド ウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、連鎖球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏ ｃｃｕｓ）、セレノモナス属（Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ）、トレポネーマ属（Ｔ ｒｅｐｎｏｎｅｍａ）、ビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ）、エルジニア属（Ｙｅｒｓ ｉｎｉａ）アデノウイルス、コロナウイルス、ヘルペスウイルス、オルソミクソ ウイルス、ピコルナウイルス、ボックスウイルス、レオウイルス、レトロウイル ス、ロタウイルス、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉ−ｌｌｕｓ）、ブラスト ミセス属（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ属（Ｃａｎ−ｄｉｄａ）、コク シジオイデス属（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ）、クリプトコッカス属（Ｃｒｙｐ ｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ヒストプラズマ属（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ）フィコミセ ス属（Ｐｈｙｃｏｍｙｃｅｓ）、アイメリア属（Ｅｉｍｅｒｉａ）、アメーバ属 （Ｅｎｔａｍｏｅｂａ）、ジアルジア属（Ｇｉａｒｄｉａ）、およびトリコモナ ス属（Ｔｒｉｃｏｍｏｎａｓ）から成る群より選択される、上記第２６項記載の 方法。
30. ３０．前記コロニナイゼイション抗原またはビルレンス抗原はストレプトコッカ ス・ムタンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｍｕｔａｎｓ）または大腸菌（Ｅ ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）からのものである、上記第２６項記載の方法 。
31. ３１．抗原はＳｐａＡ，ＧｔｆＢ，デキストラナーゼ，Ｋ８８，Ｋ９９，ＣＦＡ ，ＬＴ−Ｂまたはそれらの抗原決定基から成る群より選択される、上記第２６項 記載の方法。
32. ３２．同一であるか、あるいは異なる２またはそれ以上の抗原の遺伝情報を指定 する２またはそれ以上のＤＮＡ配列さらに含む、上記第２６項記載の方法。
33. ３３．前記融合タンパク質は２またはそれ以上の前記抗原からなる、上記第２６ 項記載の方法。
34. ３４．前記融合タンパク質は前記抗原の安定性を増大するポリペプチドからなる 、上記第２６項記載の方法。
35. ３５．前記融合タンパク質は前記抗原の取込みを増大するポリペプチドの遺伝情 報を指定する第２ＤＮＡ配列からなる、上記第２６項記載の方法。
36. ３６．トランスジェニック植物は双子葉植物である、上記第２６項記載の方法。
37. ３７．トランスジェニック植物は単子葉植物である、上記第２６項記載の方法。
38. ３８．トランスジェニック植物またはトランスジェニック植物から得られた物質 からなる組生物の有効量を経口的に投与することからなり、前記トランスジェニ ック植物は病原性微生物の抗原の遺伝情報を指定するＤＮＡ配列を含有しかつそ れを発現することができる、 前記抗原は、 ａ）コロニナイゼイション抗原、 ｂ）ビルレンス抗原、 ｃ）いずれかの抗原の抗原決定基、またはｄ）いずれかの抗原またはその抗原決 定基からなる融合タンパク質、から成る群より選択され、前記抗原またはその抗 原決定基は経口的摂取のときヒトまたは他の動物において分泌免疫応答を引き出 すことができる、ヒトおよび他の動物において分泌免疫応答を引き出す方法。
39. ３９．ＤＮＡ配列は、前記抗原の遺伝情報を指定する遺伝子、遺伝子の組み合わ せ、遺伝子断片、または遺伝子断片の組み合わせからなる、上記第３８項記載の 方法。
40. ４０．ＤＮＡ配列は前記抗原の遺伝情報を指定する合成配列である、上記第３８ 項記載の方法。
41. ４１．病原性の微生物またはウイルスは、アクチノミセス属（Ａｃｔｉｎｏｍｙ ｃｅｓ）、アエロモナス属（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌ ｕｓ）、バクテリオデス属（Ｂａｃｔｅｒｉｏｄｅｓ）、ボルデテラ属（Ｂｏｒ ｄｅｔｅｌｌａ）、ブルセラ属（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）、カンピロバクテル属（Ｃ ａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、カプノイシトファが属（Ｃａｐｎｏｃｙｔｏｐｈ ａｇａ）、クラミジア属（Ｃｌａｍｙｄｉａ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓ ｔｒｉｄｉｕｍ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｋｕｔｅｒｉｕｍ） 、エイケネラ属（Ｅｉｋｅ−ｎｅｌｌａ）、エリジペロスリックス属（Ｅｒｙｓ ｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ）、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、ヘモフ ィルス属（Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ） 、レジュネラ属（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、レプトスピラ属（Ｌｅｐｔｏｓｐｉ ｒａ）、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、マイコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂ ａｃｔｅｒｉｕｍ）、マイコプラズマ属（Ｍｙｃｏｐ−ｌａｓｍａ）、ネイセリ ア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、ノカルジア属（Ｎｏｃａｒｄｉａ）、パスツレラ 属（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）、プロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、シュードモ ナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、リケッチア属（Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａ）、 サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、赤痢菌属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、ブド ウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、連鎖球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏ ｃｃｕｓ）、セレノモナス属（Ｓｅｌｅｎｏｍｏｎａｓ）、トレポネーマ属（Ｔ ｒｅｐｎｏｎｅｍａ）、ビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ）、エルジニア属（Ｙｅｒｓ ｉｎｉａ）、アデノウイルス、コロナウイルス、ヘルペスウイルス、オルソミク ソウイルス、ピコルナウイルス、ボックスウイルス、レオウイルス、レトロウイ ルス、ロタウイルス、アスペルギルス属（Ａｓｐ−ｅｒｇｉｌｌｕｓ）、ブラス トミセス属（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ属（Ｃａｎｄｉｄａ）、コク シジオイデス属（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ）、クリプトコッカス属（Ｃｒｙｐ ｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ヒストプラズマ属（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ）、フィコミ セス属（Ｐｈｙｃｏｍｙｃｅｓ）、アイメリア属（Ｅｉｍｅｒｉａ）、アメーバ 属（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ）、ジアルジア属（Ｇｉａｒｄｉａ）、およびトリコモ ナス属（Ｔｒｉｃｏｍｏｎａｓ）から成る群より選択される、上記第３８項記載 の方法。
42. ４２．前記コロニナイゼイション抗原またはビルレンス抗原はストレプトコッカ ス・ムタンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｍｕｔａｎｓ）または大腸菌（Ｅ ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）からのものである、上記第３８項記載の方法 。
43. ４３．抗原はＳｐａＡ，ＧｔｆＢ，デキストラナーゼ，Ｋ８８，Ｋ９９，ＣＦＡ ，ＬＴ−Ｂまたはそれらの抗原決定基から成る群より選択される、上記第３８項 記載の方法。
44. ４４．同一であるか、あるいは異なる２またはそれ以上の抗原の遺伝情報を指定 する２またはそれ以上のＤＮＡ配列さらに含む、上記第３８項記載の方法。
45. ４５．前記融合タンパク質は２またはそれ以上の前記抗原からなる、上記第３８ 項記載の方法。
46. ４６．前記融合タンパク質は前記抗原の安定性を増大するポリペプチドからなる 、上記第３８項記載の方法。
47. ４７．前記融合タンパク質は前記抗原の取込みを増大するポリペプチドの遺伝情 報を指定する第２ＤＮＡ配列からなる、上記第３８項記載の方法。
48. ４８．トランスジェニック植物は双子葉植物である、上記第３８項記載の方法。
49. ４９．トランスジェニック植物は単子葉植物である、上記第３８項記載の方法。