ES2235227T3

ES2235227T3 - Utilizacion de vegf para la preparacion de un medicamento destinado al tratamiento o prevencion de la hiperplasia intimal y dispositivo para su administracion.

Info

Publication number: ES2235227T3
Application number: ES97910563T
Authority: ES
Inventors: John Francis The Cruciform Project MARTIN; Seppo University of Kuopio YLA-HERTTUALA; Stephen G. E. The Middlesex Hospital BARKER
Original assignee: Ark Therapeutics Ltd
Current assignee: Ark Therapeutics Ltd
Priority date: 1996-11-01
Filing date: 1997-11-03
Publication date: 2005-07-01
Anticipated expiration: 2017-11-03
Also published as: EP0941116A2; WO1998020027A3; DE69732304T2; KR100695590B1; EP1488761A1; DE69732304D1; HUP9902867A2; AU4790697A; PT941116E; NO326303B1; PL189744B1; WO1998020027A2; US20030225020A1; HK1108845A1; CA2270286C; JP2012031196A; JP4783797B2; JP2001503755A; KR20000052999A; US7320679B2

Abstract

EL FACTOR DEL CRECIMIENTO ENDOTELIAL VASCULAR (VEGF) TIENE UTILIDAD EN EL TRATAMIENTO DE LA HIPERPLASIA ENDOVENOSA, LA HIPERTENSION Y LA ARTERIOSCLEROSIS, Y DE CONDICIONES SUSCEPTIBLES DE TRATAMIENTO CON AGENTES QUE PRODUZCAN OXIDO NITRICO O PROSTACICLINA. EN VEZ DEL VEGF, PUEDE DARSE UN AGENTE EQUIVALENTE TAL COMO UN ANTAGONISTA DE LOS RECEPTORES DEL VEGF, O UN ACIDO NUCLEICO QUE CODIFIQUE EL ANTAGONISTA. EL AGENTE PUEDE ADMINISTRARSE SATISFACTORIAMENTE A TRAVES DE LA SUPERFICIE ADVENTICIAL DE UN VASO SANGUINEO, POR EJEMPLO UTILIZANDO UN DISPOSITIVO QUE DEFINA UN DEPOSITO ENTRE LA PARED DEL CUERPO Y LA SUPERFICIE ADVENTICIAL DEL VASO, EL DEPOSITO ESTA LLENO AL MENOS EN PARTE DE UNA FORMULACION FARMACEUTICA QUE CONTENGA EL AGENTE A SER ADMINISTRADO.

Description

Utilización del VEGF para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento o prevención de la hiperplasia intimal y dispositivo para su administración.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a la utilización terapéutica de un factor de crecimiento vascular endotelial y particularmente al tratamiento y prevención de la hiperplasia intimal de los vasos sanguíneos y de otras condiciones, especialmente de la hipertensión. La invención se refiere asimismo a un dispositivo que puede utilizarse para la administración del agente activo.

Antecedentes de la invención

La hiperplasia intimal es el incremento del número de células entre el endotelio y la lámina elástica interna de un vaso sanguíneo, en particular en la capa íntima de la misma, o en una arteria. La hiperplasia intimal con frecuencia está provocada por la proliferación de las células de músculo liso (SMC) en la pared del vaso sanguíneo.

Cuando tiene lugar la hiperplasia intimal, puede resultar el engrosamiento de novo de la capa íntima o de la pared del vaso, es decir, la estenosis. De esta manera, el vaso sanguíneo puede resultar ocluido.

Además, cuando se ha despejado una obstrucción en un vaso sanguíneo, la hiperplasia intimal que tiene lugar después de la cirugía puede conducir a que la arteria se ocluya nuevamente. Esto se conoce como restenosis.

La proliferación de las células de músculo liso arterial comúnmente se produce cuando un vaso sanguíneo, por ejemplo una arteria, es deformada o alterada durante la cirugía. Por ejemplo, la hiperplasia intimal puede conducir a la estenosis de novo tras los injertos de "bypass" en los que una vena se anastomosa con una arteria, y tras la anastomosis quirúrgica en general. Son dos ejemplos de procedimientos quirúrgicos que pueden dar lugar a la estenosis los injertos de "bypass" coronario y los injertos de "bypass" arterial femoro-popliteal y por encima de la rodilla.

De manera similar, la restenosis puede darse tras procedimientos de angioplastia con balón utilizados para despejar obstrucciones en vasos sanguíneos, por ejemplo procedimientos de angioplastia con balón.

La hiperplasia intimal, tanto si conduce a estenosis o a restenosis, sigue siendo un problema importante posterior a diversos procedimientos quirúrgicos.

La enfermedad cardiovascular aterosclerótica es la causa principal de muerte en Europa y Norteamérica y provoca una morbilidad altamente significativa consecuencia de la oclusión del lumen arterial, que impide o reduce el flujo sanguíneo, de trombosis sobreimpuesta a una placa, con posible embolización distal, de debilitamiento de la pared arterial, que lleva a la dilatación aneurísmica y finalmente a la ruptura. Dependiendo del sitio y distribución de la enfermedad, existen varias opciones de tratamiento, siendo la injertación de "bypass" arterial la intervención quirúrgica más común. Para la enfermedad arterial coronaria, se ha convertido en la actualidad en el procedimiento quirúrgico más común en todos los Estados Unidos, con >200.000 operaciones realizadas cada año desde 1990 y con >20.000 operaciones realizadas al año en el Reino Unido. En los vasos de la aorta, renal, mesentérico y periférico, continúa creciendo la carga de los procedimientos de "bypass" quirúrgico, con tasas de operación en los Estados Unidos y Europa de entre 35 y 70 por cada 100.000 personas. En combinación, el número de procedimientos quirúrgicos de "bypass" que se llevan a cabo al año se aproxima a un millón.

En los primeros 24 meses después de la cirugía, un número muy significativo de injertos de "bypass" arterial fracasa (se ocluye). Los valores citados se encuentran comprendidos entre el 20% y el 30%. Esto significa que para todos los procedimientos de "bypass" cardíaco y arterial periférico realizados cada año en el Reino Unido (aproximadamente entre 25.000 y 30.000), puede preverse que entre 6.000 y 7.000 fracasarán dentro de dos años. Las tasas de fracaso para los procedimientos de "retoque" son incluso más elevadas. El coste económico del fracaso es tan grande que, en los Estados Unidos, se ha calculado que incluso una reducción modesta en las tasas de fracaso tras los procedimientos coronarios, desde el 33% al 25%, podría representar un ahorro de hasta 750 millones de dólares del presupuesto de sanidad.

Existen tres causas principales del fracaso del injerto en los cinco años posteriores a la cirugía. La primera se reconoce que ocurre temprano, dentro de los 30 días de la operación (<5%) y representa el error técnico (por ejemplo, una deficiente técnica anostomótica). El fracaso posterior, después de 24 meses, generalmente se da como resultado de la progresión del proceso aterosclerótico original. Sin embargo, son aquellos injertos que se ocluyen entre un mes y 24 meses que constituyen la mayoría de los fracasos (<70%). En estos casos, es la hiperplasia intimal de las SMC la responsable del estrechamiento progresivo, es decir la estenosis del lumen arterial, resultando finalmente en la oclusión total. Típicamente, la hiperplasia intimal de las SMC está situada alrededor de la anastomosis arterial distal y alrededor de la pared del vaso nativo situada delante de la anastomosis. De esta manera, es una patología primaria en este sitio y no una restenosis del sitio de una hiperplasia intimal anterior, como podría ocurrir después de una angioplastia. La hiperplasia intimal de las SMC puede darse en la anastomosis arterial más proximal y a lo largo del injerto mismo.

La restenosis tras angioplastia puede conducir a tasas de fracaso todavía más elevadas, de entre el 20% y el 50% en los primeros 6 meses posteriores a la angioplastia. La estenosis y restenosis siguen siendo problemas importantes después de la cirugía.

Hasta el momento, se han probado numerosos procedimientos para el tratamiento o prevención de la hiperplasia intimal aunque ninguno ha resultado ser clínicamente satisfactorio.

El factor de crecimiento vascular endotelial (VEGF) es un proteína de origen natural. En el hombre, existen como mínimo cuatro formas, de 121, 165, 189 y 206 aminoácidos. El ADNc y secuencias de aminoácidos de las cuatro formas de VEGF humano se dan a conocer en Houck et al., Molecular Endocrinology (1991) vol. nº 5, nº 12, páginas 1806-1814. También se da a conocer una secuencia genómica parcial. La secuencia de ADNc del VEGF humana también se da a conocer en Leung et al., Science (1989), 246:1306-1309, junto con la secuencia bovina de ADNc del VEGF.

Estas cuatro formas se denominan en dicho documento VEGF-121, VEGF-165, VEGF-189 y VEGF-206. Debe entenderse que esta numeración se refiere al número de aminoácidos en la proteína madura en cada caso. La proteína traducida también incluye una pre-secuencia de 26 aminoácidos que, en la naturaleza, es cortada durante el procesamiento intracelular.

Es conocido que el VEGF desempeña un papel en la angiogénesis, en la que estimula la división de las células endoteliales (EC) vasculares, incrementa la permeabilidad endotelial y actúa como un "factor de supervivencia" endotelial en los vasos retinianos. Por ejemplo, el VEGF en forma de proteína recombinante o cuando se expresa a partir de un plásmido, puede inducir el desarrollo de nuevos vasos sanguíneos al inyectarlo intraarterialmente en extremidades isquémicas. Esta propiedad ha conducido a que se utilice en la reparación de arterias cuyos endotelios han sido dañados durante la cirugía. De esta manera, Asahara et al., Circulation (1995) 91:2793, administró VEGF a través de una cánula, en el interior de arterias carótidas de rata tras angioplastia que había denudado el endotelio de la arteria; se descubrió que el VEGF estimulaba la reendotelización de la arteria que, a su vez, aparentemente contribuyó a la supresión de la hiperplasia intimal.

La proteína y gen del VEGF se dan a conocer en el documento WO-A-9013649 y se propone su utilización para el tratamiento de traumas del epitelio vascular, úlceras diabéticas y heridas de los vasos sanguíneos. En el documento WO-A-9102058 se describen fragmentos del VEGF, así como su utilización en la angiogénesis y reendotelización de superficies internas vasculares, por ejemplo en el tratamiento de las úlceras.

El documento GB-A-2298577 da a conocer un stent externo no restrictivo poroso para procedimientos de injertación de "bypass" arteriovenoso. Este stent presenta efectos beneficiosos sobre el tamaño luminal y sobre el engrosamiento medial e intimal.

El documento WO-A-9423668 da a conocer un dispositivo para la administración local de un agente en un vaso sanguíneo, incluyendo un reservorio formado entre dos elementos del mismo. La utilización requiere la implantación, es decir, cortar el vaso y después fijar el dispositivo a las paredes del vaso. El dispositivo es parcialmente poroso. El reservorio se encuentra en contacto directo con el flujo sanguíneo luminal. Esto implica un riesgo de infección.

El documento US-A-3797485 da a conocer un dispositivo para la administración de un fármaco a la superficie adventicial de un vaso sanguíneo. Está dotado de paredes permanentes y tubos transcutáneos para la administración del fármaco en forma líquida. La intención es que el fármaco pueda pasar a otro sitio.

Sumario de la invención

La presente invención está destinada al tratamiento y/o prevención de todas las condiciones indicadas anteriormente, en la medida en que puedan derivar de la hiperplasia intimal. Sorprendentemente, se han identificado propiedades del VEGF que indican que puede utilizarse contra la hiperplasia intimal de maneras diferentes.

Se colocó un collar alrededor del exterior de la arteria de un conejo. Este procedimiento normalmente provoca la hiperplasia intimal en la arteria del conejo, llevando al engrosamiento de la pared arterial, que es similar a la estenosis que puede darse en las arterias humanas después de las operaciones de "bypass". Al utilizar el collar para administrar el ADN que codifica el VEGF hacia la pared arterial utilizando un vector plásmido/liposoma, el gen de VEGF se sobreexpresó en la pared arterial, incluyendo la capa endotelial. Se inhibió la hiperplasia intimal. Se ha descubierto que el collar adventicial es adecuado para la transferencia génica arterial en todos los sistemas de administración génica probados.

Lo anterior demuestra que el VEGF, además de estimular la reendotelización en casos en los que el endotelio se ha dañado, es capaz de suprimir la hiperplasia intimal en situaciones en las que aparece la hiperplasia intimal cuando el endotelio está intacto totalmente o en gran parte. Por lo tanto, es potencialmente útil no sólo para suprimir la restenosis posteriormente a la angioplastia sino también en la prevención o tratamiento de estenosis de novo en otras situaciones quirúrgicas. De esta manera, hay un contraste entre los nuevos descubrimientos y los anteriores, en los que el VEGF se encontró que estimulaba el recrecimiento o cicatrización del endotelio. Es probable que los nuevos descubrimientos surjan de un mecanismo de acción diferente del VEGF.

Además, los nuevos resultados demuestran que pueden administrarse agentes efectivos en el exterior del vaso sanguíneo, con el fin de tratar la hiperplasia intimal. Esto presenta varias ventajas. En particular, el agente terapéutico no es lavado del sitio de la hiperplasia por el flujo sanguíneo como ocurre con la administración intraluminal. Puede mantenerse un reservorio de administración alrededor del vaso sanguíneo y no hay necesidad de ninguna manipulación intraluminal que dañe el endotelio del vaso sanguíneo (y que ella misma pueda desencadenar hiperplasia intimal).

Más particularmente, la presente invención permite aplicar directamente agentes para combatir la hiperplasia intimal de las SMC a la superficie adventicial de la pared arterial (es decir, más cerca de aquellas células en el medio externo). Cualquier agente utilizado puede aplicarse específicamente en los sitios que es más probable que desarrollen una lesión hiperplástica intimal, debido a que estos sitios son fácilmente expuestos en el momento de la operación.

La VEGF media con sus efectos conocidos a través de receptores específicos tirosina quinasa de elevada afinidad flk-1(KDR y flt-1 que sólo se expresan en EC y monocitos. Sin respaldo teórico, se considera probable que los efectos del VEGF en la inhibición de la hiperplasia también están mediados por los mismos receptores. De acuerdo con lo anterior, la invención también se extiende a la utilización de otros agonistas de los receptores a los que se une VEGF u otros materiales que presentan el mismo mecanismo de acción, para tratar o prevenir la hiperplasia intimal. La localización específica de los receptores del VEGF también proporciona una ventaja del VEGF en comparación con muchos otros factores del crecimiento y citoquinas que se sugieren para el tratamiento del engrosamiento intimal; los efectos del VEGF son más específicos para las EC debido a que, en ausencia de monocitos, los receptores de VEGF de alta afinidad en la pared arterial sólo son expresados en las EC.

Por ejemplo, se ha descubierto que el mecanismo de la inhibición del VEGF de la hiperplasia intimal en situaciones en las que el endotelio está totalmente o en gran parte intacto es por lo menos parcialmente a través de la ruta del óxido nítrico (NO), ya que la administración del inhibidor de la síntesis de NO, L-NAME, contrarresta los efectos del VEGF sobre la hiperplasia intimal en el modelo de collar descrito anteriormente. De esta manera, el VEGF estimula la producción de NO.

También es posible que el VEGF presente otros efectos biológicos que contribuyen a la inhibición de la hiperplasia intimal. En particular, se ha descubierto que la sobreexpresión del VEGF estimula la producción de prostaciclina, la activación de la fosfolipasa A_{2} citosólica y la secreción del factor de von Willebrand por las EC. Puede darse el caso de que la estimulación de la producción de NO por el VEGF y la estimulación por el mismo de la producción de prostaciclina actúen en tándem suprimiendo la hiperplasia intimal.

De acuerdo con un aspecto de la presente invención, se utiliza un agente que es una proteína VEGF que presenta la capacidad de promover la proliferación de las células endoteliales in vitro y/o in vivo, que presenta la función del VEGF humano, o un ácido nucleico que codifica la proteína, para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento o prevención de la hiperplasia intimal de un vaso sanguíneo, por ejemplo, de la estenosis, en la que el endotelio está totalmente o en gran parte intacto. El agente puede proporcionarse en forma de un implante.

De acuerdo con un segundo aspecto de la invención, se adapta un implante para la utilización terapéutica para colocarse en el sitio de la hiperplasia a tratar o a prescribir, o en la proximidad del mismo, estando el endotelio totalmente o en gran parte intacto, y conteniendo un agente, tal como se ha indicado anteriormente. El implante puede comprender un cuerpo adaptado para proporcionar una junta estanca alrededor del sitio, manteniendo el agente dentro del cuerpo de manera que, durante la utilización, el agente entra en contacto con la superficie adventicial del vaso. Tales dispositivos pueden ser biodegradables y no requieren tubos de administración transcutánea permanentes.

Descripción de la invención

Tal como se ha sugerido anteriormente y se demuestra en los Ejemplos, varios agentes resultan adecuados para la utilización en la invención. El agente con frecuencia será descrito en el presente documento como la proteína o ácido nucleico VEGF y se proporcionan a título de ejemplo tales referencias y las referencias al VEGF mismo. Cualquiera de las formas de VEGF indicadas anteriormente pueden utilizarse para los fines de la presente invención.

Debe entenderse, en la presente memoria que las referencias a dichas secuencias de proteína VEGF se refieren tanto a las secuencias que comprenden la presecuencia como a las que carecen de la presecuencia. Las proteínas VEGF con o sin la presecuencia son adecuadas para poner en práctica la invención. De manera similar, las referencias a las secuencias de ácido nucleico de VEGF (ADN y ARN) se refieren a ambas secuencias que codifican la presecuencia y las secuencias que no codifican la presecuencia.

Debe indicarse que Houck et al., supra, dan a conocer la secuencia de VEGF-165 como incluyendo el aminoácido asparagina (N ó Asn) en la posición nº 141 (nº 115 en la notación de Houck et al., que corresponde a la proteína madura). Houck et al. dan a conocer este aminoácido como lisina (K ó Lys) en VEGF-121, VEGF-189 y VEGF-206, y la secuencia de ADNc (de VEGF-206) citada en Houck et al. apoya esta afirmación. Por lo tanto, en la invención el aminoácido en la posición nº 141 puede ser asparagina (N ó Asn) o lisina (Lys ó K). Cada aminoácido está codificado por el codón triplete apropiado en las secuencias de ácidos nucleicos de la invención (para el ADN, estos codones pueden ser AAA ó AAG para la lisina y AAT ó AAC para la asparagina). Esto se aplica especialmente a VEGF-165.

Las cuatro formas están codificadas por el mismo gen pero son generadas mediante empalme alternativo a nivel de ARN. De esta manera, hay una forma de longitud completa de la VEGF humana y tres formas truncadas conocidas. El VEGF-121 y el VEGF-165 son solubles y son formas secretadas. De manera similar, la presecuencia de 26 aminoácidos es hidrofóbica y se cree que reduce la solubilidad de la proteína. De esta manera, son preferidas las formas de VEGF sin la presecuencia, ya que se espera que presenten solubilidad más elevada. Todas las formas de VEGF son adecuadas para poner en práctica la invención, aunque se prefieren las formas secretadas. Las proteínas de VEGF adecuadas para poner en práctica la invención también pueden originarse en otras especies, aunque se prefiere el VEGF humano. Por ejemplo, se han clonado el VEGF de ratón, conejo y vaca y las secuencias se encuentran disponibles.

A título de referencia, debe indicarse que el VEGF-121, 165, 189 y 206 también se denominan en la técnica VEGF-120, 164, 188 y 205.

Las proteínas y ácidos nucleicos VEGF (ADN y ARN) son agentes adecuadas para poner en práctica la invención.

Cuando se utiliza proteína VEGF, se prefiere la proteína VEGF que presenta la secuencia de aminoácidos SEC ID nº 2 (VEGF-121), nº 4 (VEGF-165), nº 6 (VEGF-189) o nº 8 (VEGF-206). Se prefieren las formas de VEGF y por lo tanto son particularmente preferidas VEGF-121 y VEGF-165.

En la práctica de la invención, se prefiere utilizar el ADN de VEGF que codifica VEGF-121, VEGF-165, VEGF-189 ó VEGF-206, por ejemplo que presenta la secuencia SEC ID nº 1, nº 3, nº 5 o nº 7. Las secuencias de ADN que codifican las formas secretadas de VEGF humana son preferidas. De esta manera, son particularmente preferidas las secuencias de ADN de las SEC ID nº 1 y nº 3.

Sin embargo, el ADN y proteínas de VEGF adecuados para poner en práctica la invención no están limitados a dichas secuencias específicas. Al contrario, la invención también permite la utilización de otras secuencias de ADN y de proteína estrechamente relacionadas.

Las secuencias de ADN de la invención pueden relacionarse con las de las SEC ID nº 1, nº 3, nº 5 o nº 7 de varias maneras. Por ejemplo, la secuencias de ADN adecuadas para poner en práctica la invención pueden ser secuencias degeneradas que codifican la misma proteína, la proteína de las SEC ID nº 2, nº 4, nº 6 o nº 8.

Alternativamente, las secuencias de ADN de la invención pueden ser sustancialmente homólogas a las de las SEC ID nº 1, nº 3, nº 5 ó nº 7 y codificar una proteína que presenta una secuencia de aminoácidos diferente de la de las SEC ID nº 2, nº 4, nº 6 ó nº 8 pero codificar una proteína que presente actividad de VEGF. Típicamente, las secuencias de ADN de utilización en la invención presentan como mínimo el 70%, como mínimo el 80%, como mínimo el 90%, como mínimo el 95% o como mínimo el 99% de homología de secuencia con la secuencias SEC ID nº 1, nº 3, nº 5 ó nº 7.

De manera similar, las secuencias de ADN del VEGF de utilización en la invención pueden codificar fragmentos del VEGF que conservan actividad de VEGF. Los fragmentos de interés son, por ejemplo, de por lo menos 15 aminoácidos de longitud, por ejemplo de hasta 40 ó más aminoácidos. Los ejemplos de los fragmentos adecuados son de 20 aminoácidos de longitud, por ejemplo las secuencias 1-20, 11-30, 21-40, 31-50, 41-60, 51-70, 61-80, 71-90, 81-100, 91-110, 101-120, 111-130, 121-140, 131-150, 141-160, 151-170, 161-180, 171-190, 181-200, 191-210 y 196-215 de la proteína activa VEGF que se muestra como la SEC ID nº 6.

Las secuencias de ADN de utilización en la invención pueden ser, por ejemplo, ADNs genómicos ó ADNcs o híbridos entre ADN genómico y ADNc, o pueden ser sintéticos o semisintéticos. Pueden originarse en cualquier especie, aunque los ADNs que codifican VEGF humano son preferidos. Pueden ser de cadena simple o doble. Los ADNs genómicos que codifican las proteínas de las SEC ID nº 2, nº 4, nº 6 y nº 8 son particularmente preferidos.

Las secuencias de ADN de utilización en la invención pueden ser diferentes de la secuencia que se muestra en las SEC ID nº 1, nº 3, nº 5 ó nº 7 por deleción, inserción o sustitución de uno o más nucleótidos, con la condición de que codifiquen una proteína que presente actividad VEGF. De manera similar, pueden estar truncados con respecto a las SEC ID nº 1, nº 3, nº 5 ó nº 7 ó extendidos con uno o más nucleótidos con la condición de que codifiquen una proteína que presente actividad VEGF.

Las secuencias de ARN también son adecuadas para poner en práctica la invención. En particular, la invención permite la utilización de las secuencias de ARN que corresponden con las de las SEC ID nº 1, nº 3, nº 5 ó nº 7; éstas son las secuencias de ARN preferidas. La invención también permite la utilización de secuencias de ARN relacionadas con estas secuencias en cualquiera de las maneras indicadas anteriormente para las secuencias de ADN. Las secuencias de ARN para la invención pueden ser de cadena simple o doble. Los ARNs de la invención pueden ser de cualquier origen. Por ejemplo, pueden originarse en cualquier especie, aunque los ARNs que codifican el VEGF humano, especialmente el VEGF humano que presenta la secuencia que se muestra en las SEC ID nº 2, nº 4, nº 6 ó nº 8 son preferidos. También pueden utilizarse los ADNs sintéticos, al igual que los ARNs semi-sintéticos. Además, puede utilizarse el ADN transcrito a partir de plásmidos bacterianos in vivo o in vitro.

Los expertos en la materia apreciarán que, en las secuencias de ARN adecuadas para poner en práctica la invención, los residuos de T estarán sustituidos por U.

Las proteínas VEGF de utilización en la invención están codificados por secuencias de ADN o de ARN de la invención, tal como se ha indicado anteriormente. Las proteínas preferidas de la invención son las proteínas de las SEC ID nº 2, nº 4, nº 6 y nº 8, aunque la invención también permite la utilización de otras proteínas que presentan secuencias estrechamente relacionadas que son diferentes de las de las SEC ID nº 2, nº 4, nº 6 ó nº 8 pero que presentan actividad VEGF.

De acuerdo con la invención, en el grado en que se refiere al tratamiento o prevención de la hiperplasia intimal, la actividad VEGF es la capacidad de inhibir o prevenir total o parcialmente la hiperplasia intimal en un vaso sanguíneo, en particular una arteria. Las proteínas que difieren ligeramente en secuencia del VEGF de origen natural, tal como se ha indicado anteriormente, conservan esta propiedad, aunque no necesariamente en grado tan elevado como el VEGF. De manera similar, dichas proteínas pueden mostrar una actividad VEGF más fuerte que el VEGF de origen natural. Lo mismo es de aplicación a los agonistas de VEGF, por ejemplo péptidos, peptoides u otras moléculas pequeñas.

En el grado en que la invención se refiere a otras propiedades del VEGF, la actividad del VEGF es la capacidad de moléculas diferentes del VEGF de reproducir dichas propiedades. Por ejemplo, en el grado en que la invención se refiere a la actividad del VEGF frente a condiciones ligadas a NO para estimular la producción de NO, la actividad del VEGF incluye la capacidad de estimular la producción de NO. En el grado en que la invención se refiere a la actividad de VEGF frente a las condiciones ligadas a la prostaciclina, la actividad del VEGF incluye la capacidad de estimular la producción de prostaciclina. Las proteínas VEGF adecuadas para poner en práctica la invención típicamente también muestran una o más de las propiedades biológicas del VEGF que ya son conocidas en la técnica, tales como la capacidad de promover la proliferación de EC arteriales in vitro y/o in vivo o la capacidad de unirse a los receptores a los que se une el VEGF y activarlos como lo hace el VEGF.

Las proteínas VEGF adecuadas para poner en práctica la invención pueden ser sustancialmente homólogas al VEGF de las SEC ID nº 2, nº 4, nº 6 ó nº 8, típicamente de cómo mínimo el 70%, como mínimo el 80%, como mínimo el 90%, como mínimo el 95% o como mínimo el 99% homólogas.

Las proteínas VEGF adecuadas para poner en práctica la invención pueden diferir de la secuencia que se muestra en las SEC ID nº 2, nº 4, nº 6 ó nº 8 por la deleción, inserción o sustitución de uno o más aminoácidos, con la condición de que presenten actividad VEGF. De manera similar, pueden estar truncadas por uno o más aminoácidos con respecto a las SEC ID nº 2, nº 4, nº 6 ó nº 8 o estar extendidas con respecto a las SEC ID nº 2, nº 4, nº 6 ó nº 8 por uno o más aminoácidos, con la condición de que presenten actividad VEGF. Con respecto a las sustituciones, son preferidas las conservativas. Típicamente, las sustituciones conservativas son sustituciones en las que el aminoácido sustituido es de naturaleza similar al aminoácido presente en el VEGF de origen natural, por ejemplo en términos de carga y/o tamaño y/o polaridad y/o hidrofobicidad. De manera similar, las sustituciones conservativas típicamente presentan un efecto pequeño o nulo sobre la actividad VEGF de la proteína.

Las proteínas VEGF de utilización en la invención que difieren en secuencia del VEGF de origen natural pueden modificarse con el fin de que difieran en actividad respecto al VEGF de origen natural. Por ejemplo, pueden modificarse para presentar una actividad VEGF más fuerte. Tales manipulaciones típicamente se llevarán a cabo a nivel de ácidos nucleicos utilizando técnicas recombinantes conocidas en la técnica.

Como alternativa a la utilización de una proteína VEGF tal como se ha indicado anteriormente, es posible utilizar un agonista del VEGF. Esto se aplica a todas las aplicaciones médicas indicadas en el presente documento, especialmente al tratamiento de la aterosclerosis.

En general, un agonista del VEGF es una molécula que se une a un receptor al que se une VEGF y que presenta sustancialmente los mismos efectos, conduciendo a actividad VEGF, tal como se indica en el presente documento. En particular, un agonista puede unirse a los receptores flk-1/KDR ó flt-1. Los agonistas de la invención de esta manera se denominan agonistas del VEGF y de los receptores a los que se une el VEGF.

Un agonista del VEGF puede presentar cualquier estructura química. Por ejemplo, un agonista del VEGF puede ser un péptido o polipéptido de, por ejemplo, hasta 10, hasta 20, hasta 50 ó hasta 100 aminoácidos. Un agonista de manera similar puede ser un péptido modificado o un peptoide. Puede llevarse a cabo cualquier modificación adecuada, incluyendo la glucosilación, sulfatación, COOH-amidación y acetilación, por ejemplo, acetilación N-terminal. Adicionalmente, o alternativamente, pueden estar presentes aminoácidos modificados y/o L-aminoácidos.

Algunos agonistas preferidos son fragmentos, opcionalmente modificados tal como se indica anteriormente, del VEGF, que presentan actividad VEGF. Un fragmento de agonista particularmente preferido del VEGF consiste en los aminoácidos nº 1 a nº 20 (M...H) de la SEC ID nº 4; Ahmed et al., Lab. Invest. 76:779 (1997) dan a conocer que este péptido es un agonista del receptor Flt-1 en las células trofoblásticas humanas.

También pueden derivarse agonistas relacionados adicionales a partir de la región N-terminal del VEGF. Por ejemplo, con referencia a la SEC ID nº 4, los péptidos agonistas del VEGF pueden comprender el extremo N-terminal del VEGF (aminoácido nº 1) y presentar la secuencia de aminoácidos del VEGF hasta un aminoácido en el intervalo comprendido entre 25 y 30, entre 30 y 40, entre 40 y 50 ó entre 50 y 100. De manear similar, los agonistas preferidos pueden derivarse de la región N-terminal del VEGF pero comprender una versión truncada del extremo N-terminal. Por ejemplo, en lugar de iniciarse en el aminoácido nº 1 en la SEC ID nº 4, pueden iniciarse en el aminoácido nº 2, nº 3, nº 4, nº 5, nº 6, nº 7, nº 8, nº 9 ó nº 10 de la SEC ID nº 4 y presentar la secuencia de aminoácidos del VEGF hasta un aminoácido comprendido en el intervalo entre 25 y 30, entre 30 y 40, entre 40 y 50 ó entre 50 y 100.

Los péptidos agonistas de la invención también pueden derivarse de otras partes de la secuencia del VEGF. Por ejemplo, un péptido agonista preferido adicional es un péptido que consiste en los aminoácidos nº 145 a nº 169 (R...P) de la secuencia del VEGF-189 de SEC ID nº 6.

También pueden derivarse agonistas relacionados adicionales a partir de esta región del VEGF. Por ejemplo, con referencia a la SEC ID nº 6, los péptidos agonistas del VEGF pueden presentar la secuencia de aminoácidos del VEGF desde un aminoácido en la región entre el nº 135 y el nº 155 hasta un aminoácido en la región comprendida entre el nº 160 y el nº 180. Por ejemplo, los péptidos agonistas derivados de esta región pueden presentar la secuencia del VEGF desde un aminoácido en la región comprendida entre el nº 135 y el nº 140, entre el nº 140 y el nº 145 ó entre el nº 145 y el nº 150 hasta un aminoácido en la región comprendida entre el nº 160 y el nº 165, entre el nº 165 y el nº 170 ó entre el nº 170 y el nº 175.

Los fragmentos péptido del VEGF tal como se han indicado anteriormente preferiblemente presentan una longitud total comprendida entre 10 y 20, entre 20 y 25, entre 25 y 30, entre 30 y 40 ó entre 40 y 50 aminoácidos.

Otros agonistas preferidos son fragmentos de la proteína Tat del VIH. La proteína Tat del VIH imita las acciones agonistas del VEGF y puede estimular la angiogénesis en células endoteliales actuando a través del receptor Flk-1/KDR; ver Albini et al., Oncogene 12:289-297 (1996) y Nature Medicine 2(12):1321-1375 (1996). De esta manera, los péptidos derivados de la secuencia de Tat del VIH-1, tales como los aminoácidos nº 46 a nº 60 de la proteína Tat del VIH-1, se ha demostrado que estimulan el crecimiento y migración de las células endoteliales; ver Albini et al., Oncogene 12:289-297 (1996). El péptido que consiste en los aminoácidos nº 41 a nº 65 de la proteína Tat del VIH-1 es un péptido agonista adicionalmente preferido de la invención.

Los agonistas de la invención también pueden presentar secuencias de aminoácidos que difieren de las del VEGF de origen natural en cualquiera de las maneras indicadas anteriormente para las proteínas del VEGF, con la condición de que sus propiedades agonistas se conserven.

En el caso de que los agonistas de la invención sean péptidos, pueden generarse in vivo a partir de secuencias de ácidos nucleicos que los codifican, con el fin de llevar a cabo el tratamiento de acuerdo con la invención. De esta manera, los ácidos nucleicos que codifican agonistas pueden administrarse mediante terapia génica, tal como se indica en la presente memoria.

En la práctica de la invención, el VEGF, un ácido nucleico que codifica el VEGF o un agonista de VEGF o ácido nucleico que codifica el agonista del VEGF puede administrarse en un vaso sanguíneo, preferiblemente una arteria en cualquier forma adecuada. Los ácidos nucleicos pueden administrarse en una forma "desnuda" no asociada con un vector, o por medio de un vector de terapia génica. Es preferido que se administren mediante cualquier vector de terapia génica adecuado. En particular, pueden utilizarse los vectores virales o no virales.

Los vectores virales adecuados incluyen los adenovirus, retrovirus, retrovirus pseudotipados, herpesvirus, virus vaccinia y baculovirus. Los vectores no virales adecuados incluyen oligonucleótidos, plásmidos, liposomas, liposomas catiónicos, liposomas sensibles al pH, complejos liposoma-proteína, inmunoliposomas, derivados liposoma-proteína-polilisina, emulsiones agua-aceite, polietilén iminas y dendrímeros. Los vectores preferidos incluyen los retrovirus derivados del virus de la leucemia murina de Moloney (MMLV), los retrovirus que contienen proteína G pseudotipada del virus de la estomatitis vesicular (VSV-G), adenovirus, plásmidos y complejos plásmido-liposoma.

En su caso, pueden utilizarse juntos dos o más tipos de vector. Por ejemplo, puede utilizarse un vector plásmido conjuntamente con liposomas. Los liposomas adecuados incluyen, por ejemplo, los que comprenden dioleoil-fosfatidil-etanolamina (DOPE), 3\beta-[N-(N',N'-dimetil-aminometano)carbamoil]colesterol (DC-Chol) o el lípido de carga positiva (N-[1-(2,3-dioleiloxi)propil]-N,N,N-trietilamonio (DOTMA).

Los vectores virales de la invención preferiblemente están desactivados, por ejemplo son deficientes en replicación. Es decir, carecen de uno o más genes funcionales necesarios para la replicación, lo que previene su proliferación descontrolada in vivo y evita efectos secundarios no deseados de la infección viral. Preferiblemente, todo el genoma viral ha sido eliminado excepto por los elementos genómicos mínimos necesarios para empaquetar el genoma viral, incluyendo el ácido nucleido del VEGF, en la cubierta o cápside viral. Por ejemplo, es deseable delecionar todo el genoma viral excepto las repeticiones terminales largas (LTRs) y una señal de empaquetamiento. En el caso de los adenovirus, la deleción típicamente se lleva a cabo en la región E1 y opcionalmente en una o más de las regiones E2, E2 y/o E4.

Los virus de la invención pueden desactivarse mediante cualquier técnica adecuada. Por ejemplo, las deleciones genómicas pueden implicar la eliminación total de los genes necesarios para la replicación o sólo la eliminación parcial. La eliminación total es preferida. En general, las deleciones preferidas son de genes necesarios para la transcripción temprana de los genes virales.

También pueden utilizarse vectores virales de replicación competente autolimitados o autodestructivos.

En general, el ácido nucleico del VEGF de utilización en la invención estará comprendido dentro de un constructo de expresión que asegure la expresión in vivo después de su administración en la arteria, preferiblemente con un vector, tal como se ha indicado anteriormente. Tales constructos típicamente comprenden un promotor capaz de dirigir la expresión del ácido nucleico del VEGF (y opcionalmente un regulador del promotor), un codón de inicio traduccional y, operablemente ligado al promotor, el ácido nucleico del VEGF. Preferiblemente, estos componentes están dispuestos en una orientación 5'-3'.

El constructo también puede comprender cualquier otro componente adecuado. Por ejemplo, el constructo puede comprende un ácido nucleico que codifique una secuencia de señal, posicionada de tal manera respecto al ácido nucleico del VEGF que, cuando sea traducido, sea capaz de dirigir la proteína expresada del VEGF a un tipo celular o compartimiento celular dado. Cualquiera de tales secuencias de señal típicamente se encontrará en posición inmediatamente 3' o inmediatamente 5' respecto al ácido nucleico del VEGF, de manera que la secuencia de señal y la proteína del VEGF sean traducidos como una sola proteína de fusión junto con la secuencia de señal en el extremo C ó N-terminal.

El constructo también puede comprender un intensificador que intensifique el grado de expresión proporcionado por el promotor. Puede utilizarse cualquier intensificador que intensifique la expresión proporcionada por el promotor seleccionado. Por ejemplo, en el caso del promotor de gen temprano de las SMC, puede utilizarse el intensificador génico temprano de las SMC.

Opcionalmente, el constructo puede comprender un terminador transcripcional en posición 3' respecto al ácido nucleico del VEGF. Puede utilizarse cualquier terminador adecuado.

Opcionalmente, el constructo puede comprender una señal de poliadenilación operablemente ligada en posición 3' respecto al ácido nucleico del VEGF.

Opcionalmente, el constructo puede comprender uno o más genes marcadores seleccionables, por ejemplo de resistencia a antibióticos, con el fin de permitir la selección de células transformadas en cultivo. Por ejemplo, pueden seleccionarse en orden las células para resistencia a antibióticos.

Opcionalmente, el constructo puede comprender uno o más intrones u otras secuencias no codificantes, por ejemplo 3' ó 5' respecto al ácido nucleico del VEGF.

Puede utilizarse cualquier promotor adecuado para controlar la expresión del ácido nucleico de la invención. En general, se prefiere utilizar un promotor viral o un promotor adaptado para funcionar en la especie del sujeto a tratar. De esta manera, en el caso de un sujeto humano, se prefiere utilizar promotores virales, especialmente promotores derivados de virus que infectan al hombre o promotores derivados de genes humanos. Opcionalmente, puede utilizarse un promotor en combinación con cualquier intensificador adecuado.

Es deseable utilizar un promotor "fuerte", es decir uno que asegure niveles elevados de expresión de la proteína del VEGF de la invención. Los promotores que consiguen la sobreexpresión de la proteína del VEGF son deseables. Los promotores preferidos incluyen el promotor del citomegalovirus (CMV), opcionalmente en combinación con el intensificador del CMV; el promotor de la \beta-actina humana, el promotor de genes tempranos del virus 40 del simio (SV40), el promotor del virus del sarcoma de Rous (RSV) y el promotor retroviral de la repetición terminal larga (LTR).

Los promotores y otros componentes del constructo están operablemente ligados al ácido nucleico del VEGF. De esta manera, están posicionados con el fin de que puedan ejercer su efecto sobre la expresión del ácido nucleico del VEGF. Por ejemplo, en el caso de un promotor, el promotor está posicionado respecto al ácido nucleico del VEGF de manera que es capaz de dirigir la expresión del ácido nucleico del VEGF. Es deseable que los componentes del constructo estén posicionados para permitirles ejercer el efecto máximo sobre la expresión.

Los ácidos nucleicos o constructos utilizados en la invención pueden incorporarse en los genomas virales mediante cualquier medio adecuado conocido en la técnica. Los genomas virales pueden empaquetarse después en cubiertas o cápsides virales mediante cualquier procedimiento adecuado. En particular, puede utilizarse cualquier línea celular de empaquetamiento adecuada para generar los vectores virales de la invención. Estas líneas de empaquetamiento complementar los genomas virales deficientes en replicación de la invención, debido a que incluyen, típicamente incorporados en los genomas, los genes que habían sido delecionados del genoma deficiente en replicación. De esta manera, la utilización de líneas de empaquetamiento permite generar en cultivo los vectores virales de la invención. Las líneas de empaquetamiento adecuadas incluyen derivados de las células PA317, células \psi-2, células CRE, células CRIP, células E-86-GP, células Fly, células de línea 293 y células 293GP.

En el caso de los vectores no virales, el ácido nucleico puede incorporarse en los vectores no virales mediante cualquier medio adecuado conocido en la técnica.

Según se desee, pueden seleccionarse vectores, especialmente vectores virales, para conseguir la integración del ácido nucleico o constructo en el genoma de las células del sujeto a tratar, o para administrar el ácido nucleico o constructo en el citoplasma. Son preferidos los vectores integrativos.

Las proteínas del VEGF o ácidos nucleicos del VEGF de utilización en la invención, preferiblemente asociados con un vector viral o no viral, tal como se ha descrito anteriormente, pueden administrarse a arterias de cualquier manera adecuada con el fin de llevar a cabo el tratamiento de la hiperplasia. Por ejemplo, puede administrarse VEGF o un ácido nucleico que codifique VEGF en la pared exterior del vaso sanguíneo, por ejemplo de la arteria, o en el endotelio del vaso sanguíneo, por ejemplo en el endotelio arterial, por ejemplo a través del lumen. La transferencia local de genes es probable que resulte ventajosa sobre la administración de proteína recombinante de VEGF debido a que los compuestos infusionados son rápidamente lavados por el flujo sanguíneo y presentan una vida media corta en sangre.

Una vez administrados, los ácidos nucleicos del VEGF de la invención se expresan produciendo proteínas del VEGF, que a su vez, efectúan el tratamiento o prevención de la hiperplasia intimal. La expresión puede tener lugar en cualquier tipo o tipos celulares en el vaso sanguíneo, por ejemplo, arterial, pared.

Preferiblemente, la expresión se da en un sitio en el que el VEGF expresado es capaz de alcanzar el endotelio del vaso sanguíneo, por ejemplo de la arteria. Por ejemplo, la expresión puede darse en las células y/o en el endotelio de músculo liso. Con la mayor preferencia, la expresión tiene lugar por lo menos en el endotelio del vaso sanguíneo, por ejemplo de la arteria.

Por ejemplo, la proteína o ácido nucleico del VEGF puede administrarse en el exterior del vaso sanguíneo, por ejemplo de la arteria, mediante inyección directa alrededor del sitio de la hiperplasia a tratar o prevenir, o mediante inyección en el lumen del vaso sanguíneo, por ejemplo de la arteria.

Más preferiblemente, la proteína o ácido nucleico del VEGF se administra por medio de un implante situado externamente al vaso sanguíneo, por ejemplo externamente a una arteria, en la proximidad del sitio de la hiperplasia a tratar. Tal implante contiene la proteína o ácido nucleico del VEGF o el vector y proporciona un reservorio de agente. La proteína o ácido nucleico del VEGF (preferiblemente asociado con un vector) puede introducirse en el implante antes o después de que se introduzca el implante en el sujeto a tratar. Por ejemplo, el implante puede colocarse en la proximidad del vaso sanguíneo, introduciendo posteriormente la proteína o ácido nucleico del VEGF en el implante, por ejemplo mediante inyección.

Preferiblemente, el implante se coloca en contacto directo con el vaso sanguíneo, por ejemplo con una arteria. Esto es especialmente preferido cuando los vectores retrovirales se utilizan para administrar ácidos nucleicos del VEGF, debido a que la distorsión física del vaso sanguíneo puede inducir la proliferación de las células de músculo liso, lo que incrementa la eficiencia de la transferencia génica por los vectores retrovirales. Esta proliferación, al igual que la proliferación inducida por la hiperplasia misma, se supera, o por lo menos se mejora, mediante la administración de la proteína o ácido nucleico de VEGF. De manera similar, es preferido que el implante esté en contacto con la arteria al utilizar otros vectores que muestren una eficiencia incrementada de transferencia génica cuando las células dianas se están dividiendo. Por ejemplo, la proliferación celular también puede mejorar la eficiencia de la transferencia génica con los complejos plásmido-liposoma.

Tales implantes pueden estar en cualquier forma adecuada. Preferiblemente, el implante se encuentra en forma de un collar que rodea, parcial o totalmente, con preferencia totalmente, la arteria, en el sitio de la hiperplasia a tratar o a prevenir, o en la proximidad del mismo.

La administración génica extravascular evita procedimientos tales como la cateterización con balón o el líquido a presión elevada, que podrían comportar el daño o denudación endotelial. Los genes transfectados preferiblemente se aplican a través de un implante silástico o biodegradable, preferiblemente un collar situado adyacente al exterior del vaso sanguíneo, preferiblemente alrededor del mismo. El endotelio sufre poco o nada de daño. Esto constituye una ventaja importante de esta forma de administración.

De acuerdo con la invención, cuando se aplican los vectores directamente sobre la superficie adventicial de un vaso sanguíneo dentro de un collar, se mantiene un contacto estrecho con las superficies adventiciales. En las arterias de conejo, un collar solo típicamente conduce a la formación de una neoíntima 7 a 14 días después de la operación. El collar también mantiene una concentración elevada de vector en la superficie adventicial.

Los implantes, preferiblemente los collares, pueden realizarse en cualquier material adecuado. Los implantes silásticos, es decir, los implantes que comprenden gomas siliconas, son una alternativa preferida. Los más preferidos son los implantes biodegradables. Puede utilizarse cualquier material biodegradable adecuado.

La proteína o ácido nucleico del VEGF pueden estar contenidos de una manera cualquiera dentro del implante, por ejemplo dentro del collar. Preferiblemente, la estructura del implante, por ejemplo del collar, es tal que la proteína o ácido nucleico del VEGF se mantiene en contacto directo con la pared del vaso sanguíneo. De esta manera, en una realización, la estructura del implante deja un espacio entre la pared del vaso sanguíneo y la pared del implante. En el caso de un collar, el implante forma de esta manera un recipiente hueco alrededor del vaso sanguíneo. En este espacio pueden introducirse los ácidos nucleicos o proteínas del VEGF, de manera que estén en contacto con la pared del vaso sanguíneo. Preferiblemente los extremos del implante se encuentran en contacto con la pared del vaso sanguíneo, evitando de esta manera la fuga de los ácidos nucleicos o proteínas de VEGF. Preferiblemente, la pared externa del collar es impermeable, o sustancialmente impermeable, a los ácidos nucleicos o proteínas del VEGF, previniendo de esta manera, o por lo menos limitando, la fuga hacia el tejido circundante y asegurando la administración en el vaso sanguíneo.

Opcionalmente, el espacio que contiene el ácido nucleico o proteína del VEGF puede estar separado de la pared del vaso sanguíneo por una o más capas de material permeable o semipermeable al VEGF o a los ácidos nucleicos. Esto puede resultar deseable si se desea la administración gradual y se desea limitar la tasa a la que las proteínas o ácidos nucleicos del VEGF se administran en la pared del vaso sanguíneo.

Opcionalmente, el implante, por ejemplo el collar, puede diseñarse para actuar como una bomba osmótica.

Opcionalmente, el VEGF puede estar contenido en un medio dentro del collar, por ejemplo en un medio sólido o en un gel. Esto puede ayudar a prevenir que las proteínas o ácidos nucleicos del VEGF se escapen hacia el tejido. En este caso, es posible que no sea necesario que la pared externa del collar esté en contacto con el vaso sanguíneo en el extremo del implante.

Alternativamente, puede recubrirse la superficie del implante con los ácidos nucleicos o proteínas del VEGF que están en contacto con el vaso sanguíneo durante la utilización. Alternativamente, los ácidos nucleicos o proteínas del VEGF pueden dispersarse en toda la estructura del implante.

Algunas ventajas de utilizar los implantes de esta manera, especialmente los collares, son: (i) proporcionar un reservorio de administración, permitiendo la administración sostenida; (ii) no son necesarias las manipulaciones intraluminales y el endotelio arterial permanece intacto; y (iii) la distorsión (por ejemplo la constricción en el caso de un collar) creada por el implante puede incrementar la eficiencia de la administración génica, tal como se ha explicado anteriormente.

Un dispositivo de la invención generalmente comprende un cuerpo que incluye por lo menos una primera parte del cuerpo sustancialmente impermeable conformada para que durante su utilización se extienda longitudinalmente a lo largo, y por lo menos rodeando parcialmente, un primer vaso que transporta sangre, incluyendo la primera parte del cuerpo partes sellantes espaciadas longitudinalmente, adaptadas para sellar durante la utilización la superficie adventicial del primer vaso portador de sangre, y una parte intermedia entre las partes sellantes que está adaptada durante la utilización para contener y administrar por lo menos un agente en la superficie adventicial del primer vaso portador de sangre.

A continuación, se describen las realizaciones preferidas de dispositivos de acuerdo con la presente invención, únicamente a título de ejemplo, con referencia a los dibujos adjuntos, en los que:

la figura 1 es una vista esquemática en sección longitudinal de un dispositivo de la invención colocado alrededor de un vaso sanguíneo;

la figura 2 es una vista esquemática en sección coronal de la misma realización, a lo largo de la línea A-A que se muestra en la figura 1;

la figura 3 muestra en perspectiva una vista esquemática de una segunda realización de un dispositivo colocado alrededor de una anastomosis de extremo a extremo;

la figura 4 es una vista en sección longitudinal en el plano vertical de la realización según la figura 3;

la figura 5 es una vista similar a la de la figura 4, pero que muestra una forma modificada de dicha realización; con una construcción alternativa de las partes sellantes;

la figura 6 muestra en perspectiva una vista esquemática de una tercera realización de un dispositivo colocado alrededor de una anastomosis de extremo a extremo;

la figura 7 es una vista en sección longitudinal en el plano vertical de la realización según la figura 6;

la figura 8 muestra en perspectiva una vista esquemática de una cuarta realización de un dispositivo colocado alrededor de una anastomosis de extremo a extremo;

la figura 9 es una vista en sección longitudinal en el plano vertical de la realización según la figura 8;

la figura 10 muestra en perspectiva una vista esquemática de una quinta realización de un dispositivo colocado alrededor de una anastomosis lado-a-lado, que muestra un vaso sanguíneo parcialmente incluido; y

la figura 11 es una vista en sección longitudinal en el plano vertical de la realización según la figura 10.

A título de antecedentes, los injertos de "bypass" arterial se utilizan comúnmente para restaurar o mejorar el flujo sanguíneo hacia tejidos cuando los vasos nativos se encuentran ocluidos o significativamente estenosados, habitualmente debido a un ateroma. Sea utilizando una vena o arteria autóloga, o un material sintético, tal como Dacrón o PTFE, es común que los injertos se anastomosen con los vasos nativos de cualquiera de las tres maneras siguientes: "extremo a extremo" (figura 4); "extremo a lado" (figura 7) o "lado a lado" (figura 9). De estas técnicas, la de extremo-a-lado y la de lado-a-lado son mucho más comunes que la de extremo a extremo. La dirección del flujo sanguíneo está representada por las flechas.

Las figuras 1 y 2 muestran sangre 1 contenida en la pared del vaso 2, y un collar adventicial que incluye un espacio vacío 3 definido por una pared 4, por ejemplo de un material biodegradable. Un collar 5 toca la pared del vaso en los extremos del collar. Esta realización puede utilizarse para otras realizaciones de la misma manera que la indicada posteriormente.

La realización ilustrada en las figuras 3 y 4 se muestra aplicada a una anastomosis extremo-a-extremo. El dispositivo comprende un cuerpo generalmente tubular 12 que, durante la utilización, se extiende longitudinalmente a lo largo y rodeando el vaso portador de sangre constituido por la anastomosis extremo-a-extremo de un injerto 13 con un vaso sanguíneo nativo 14.

Tal como puede observarse con mayor claridad en la figura 4, el cuerpo 12 del dispositivo presenta partes sellantes 15 espaciadas longitudinalmente en los dos extremos. Cuando, durante la utilización, se coloca el dispositivo sobre el sitio 16 de la anastomosis extremo-a-extremo, estas partes sellantes 15 se sellan contra la superficie adventicial del injerto 13 y del vaso sanguíneo nativo 14. El espesor radial del material del cuerpo 12 es mayor en las partes sellantes 15 que en la parte intermedia 17. En consecuencia, cuando las partes sellantes 15 se sellan contra las superficies adventiciales del injerto 13 y del vaso 14, se forma un espacio entre el interior del cuerpo 12 del dispositivo y las superficies adventiciales de los extremos incluidos del injerto 13 y del vaso 14. Este espacio constituye un reservorio sellado 18 y se muestra alineado longitudinalmente con la anastomosis 16.

Este reservorio permite que una formulación farmacéutica que contiene uno o más agentes entre en contacto con la superficie adventicial del injerto y de los vasos 13, 14 en el sitio de la anastomosis 16. En el caso de que la formulación presente la forma de líquido o de gel, puede, por ejemplo, inyectarse utilizando una aguja y jeringa hipodérmicas, a través de la pared del cuerpo 12, hacia el interior del reservorio sellado 18. Los agentes contenidos en la formulación ventajosamente presentan un efecto antiproliferativo, para contrarrestar la hiperplasia intimal de las células de músculo liso en el sitio de la anastomosis 16 y en áreas contiguas a la misma.

La formulación farmacéutica no necesita estar en forma de líquido o de gel, por ejemplo puede ser una pasta líquida que presente una consistencia similar a la de la pasta dentífrica. De esta manera permanece en contacto con la superficie adventicial pulsante a la que se exponga, constriñendo el vaso.

Con el fin de colocar el dispositivo sobre el sitio de la anastomosis 16, el cuerpo cilíndrico 12 puede deslizarse axialmente sobre uno de entre el injerto 13 y el vaso sanguíneo 14 previamente a que queden anastomosadas. A continuación, el cirujano puede unir el injerto 13 y el vaso 14 en el sitio de la anastomosis 16 y el cuerpo 12 puede seguidamente deslizarse de vuelta sobre el sitio de la anastomosis 16 ocupando la posición que se muestra en la figura 4, con el fin de permitir el sellado de las partes sellantes 15 con las superficies adventiciales respectivas.

Alternativamente, el cuerpo 12 del dispositivo puede, tal como se muestra, dotarse de una hendidura longitudinal 19 a lo largo de toda su longitud. De esta manera los cirujanos pueden anastomosar el injerto 13 y el vaso 14 sin introducir el dispositivo 12 en el cuerpo del paciente. Tras completar con éxito la anastomosis, el cirujano puede seleccionar a continuación un cuerpo de tamaño apropiado 12 y aplicarlo alrededor del injerto y vaso anastomosados abriendo el cuerpo flexible 12 a lo largo de la hendidura 19, deslizándolo sobre el injerto y vaso anastomosados 13, 14 y después sellando entre sí los márgenes longitudinales opuestos del cuerpo en la hendidura 19, por ejemplo utilizando un "pegamento de tejidos" convencional, tal como el pegamento trombina que se comercializa bajo el nombre Tisseal, o un pegamento basado en cianometacrilato.

Con el fin de concentrar el efecto de la formulación farmacéutica contenida dentro del reservorio 18 y con el fin de evitar las pérdidas de los agentes hacia el tejido circundante, el cuerpo 12 es sustancialmente impermeable a la formulación. El material también es, ventajosamente, biodegradable durante un periodo de tiempo fijado, por ejemplo a lo largo de un periodo de 1 a 5 días, al cabo de los cuales los agentes activos en la formulación es probable que se hayan agotado. El material también se selecciona de manera que no promueva una reacción demasiado severa del tejido circundante. Entre los ejemplos de materiales adecuados para el cuerpo se incluyen gelatina, alginato o colágeno. Estos materiales también proporcionan flexibilidad al cuerpo y permite que el dispositivo sea fabricado mediante moldeo o extrusión.

El material de la pared del cuerpo 12 también puede ventajosamente ser auto-sellante, de manera que conserve la integridad del reservorio sellado 18 si resulta necesario pincharlo con una aguja hipodérmica. Alternativa o adicionalmente, cualquier fuga en la pared que sea revelada tras retirar la aguja puede sellarse con "pegamento de tejidos" o similar.

Puede proporcionarse un abanico de cuerpos de diferentes tamaños 12 para ajustarse sobre vasos de diferente tamaño. Los vasos de las extremidades inferiores comúnmente presentan un diámetro externo de aproximadamente 6 a 8 mm. Los vasos coronarios comúnmente presentan un diámetro externo de aproximadamente 3 a 5 mm. De acuerdo con lo anterior, puede suministrarse a los cirujanos un abanico de tamaños de cuerpo en el intervalo aproximado comprendido entre 3 y 10 mm de diámetro, disponibles en paquetes esterilizados. Además, el tamaño del cuerpo puede variarse para influir sobre el volumen del reservorio 18. Un tamaño adecuado para el reservorio 18 es de hasta 10 ml, preferiblemente de 2 a 5 ml.

Con el fin de adaptarse a la expansión del vaso portador de sangre 13, 14 causada por el flujo sanguíneo pulsátil a lo largo del mismo, por lo menos las partes sellantes 15 del cuerpo ventajosamente son capaces de estirarse de manera que se adapten a la expansión de las paredes del vaso. Es altamente deseable evitar que el dispositivo constriña las paredes del vaso, manteniendo simultáneamente intactas las juntas estancas.

La figura 5 ilustra diferentes partes sellantes. El espesor radial del material del cuerpo 12 es constante a lo largo de la longitud del cuerpo y la parte intermedia 17 se expande con balón interno respecto al diámetro interno del cuerpo 12 en las partes sellantes 15. Ambas partes sellantes 15 se forman con colas que se extienden en la dirección longitudinal, por ejemplo para que cada una entre en contacto con las superficies adventiciales respectivas del injerto 13 y del vaso 14 a lo largo de una longitud "X" en la dirección axial de aproximadamente 8 a 15 mm. Estas colas largas para las partes sellantes 15 puede hacerse que actúen como "válvulas de aleta" para ayudar a sellar el reservorio 18, aunque claramente no se desea ningún flujo a través de la "válvula de aleta". Alternativamente, las colas pueden plegarse hacia adentro (no mostrado) con el fin de doblar el grosor del cuerpo en los extremos para formar partes sellantes de mayor espesor radial del cuerpo que el grosor del cuerpo en la parte intermedia, de una manera similar a la mostrada en la figura 4.

Con el fin de formar, o ayudar a formar, juntas estancas herméticas para los líquidos, el cirujano puede adherir las partes sellantes 15 a las superficies adventiciales, por ejemplo utilizando un pegamento del tipo indicado anteriormente, por ejemplo un "pegamento de tejidos". Esto, sin embargo, puede no ser esencial. Por ejemplo, si el tamaño del cuerpo 12 en las partes sellantes 15 se selecciona para ajustarse a la circunferencia de los vasos 13, 14, podría no resultar necesaria la utilización de ningún pegamento. En su lugar, el cirujano puede utilizar la interferencia radial entre el diámetro interno del cuerpo 12 en las partes sellantes 15 y el diámetro de las superficies adventiciales. Eso es particularmente de esta manera en la realización de parte sellante de cola larga de la figura 5. Las partes sellantes no deben, sin embargo, apretar tanto el vaso que lo constriñan.

Las figuras 6 y 7 ilustran una realización del dispositivo que se utiliza en el caso de una anastomosis extremo-a-extremo. Estos dibujos muestran un cuerpo 20 que presenta una primera parte del cuerpo 21 y una segunda parte del cuerpo 22 ramificados en un ángulo inferior a 90º para formar un cuerpo generalmente en forma de Y. Se apreciará que las primeras y segundas partes del cuerpo 21, 22 pueden estar ramificadas en ángulos de ramificación diferentes, de hasta 90º inclusive, en cuyo caso el cuerpo generalmente presentará una forma de T. El cirujano puede disponer ventajosamente de una serie de cuerpos de diferentes tamaños y formas de entre los que puede seleccionar el dispositivo más apropiado a la situación y tamaño de los vasos anastomosados. La primera parte del cuerpo 21 puede, por ejemplo, ser de aproximadamente 1 a 10 cm de longitud; la segunda parte del cuerpo 22 puede ser de 1 a 5 cm de longitud.

La primera parte del cuerpo 21 es generalmente tubular y se muestra rodeando un vaso sanguíneo nativo 23. La segunda parte del cuerpo 22 también es generalmente tubular y se muestra rodeando un injerto 24 anastomosado con el vaso sanguíneo nativo 23 de una manera extremo-a-lado en el sitio de anastomosis 29. Tal como puede observarse en la figura 7, los extremos opuestos de la primera parte del cuerpo 21 están provistos de partes sellantes 25 y el extremo de la segunda parte del cuerpo 22 está dotada de una parte sellante 26. Al igual que en la realización anterior, estas partes sellantes 25, 26 pueden sellarse ventajosamente con las superficies adventiciales del vaso sanguíneo 23 y del injerto 24, respectivamente, utilizando un "pegamento de tejidos".

La figura 7 muestra un reservorio sellado 27 formado entre el interior de la primera parte del cuerpo 21 y la superficie adventicial del vaso sanguíneo 23. El reservorio 27 se extiende hacia el interior de la segunda parte del cuerpo 22. Este reservorio 27 sellado se encuentra alineado de esta manera con el sitio de la anastomosis 29. El reservorio 27 puede inyectarse ventajosamente con una formulación farmacéutica líquida que contiene agentes activos, utilizando una aguja y jeringa hipodérmicas.

Con el fin de facilitar el ajuste del dispositivo al vaso 23 e injerto 24, el cuerpo 20 del dispositivo puede proporcionarse al cirujano en un paquete esterilizado que contenga dos mitades simétricas, divididas y simétricas respecto al plano de la sección ilustrado en la figura 7. En tal caso, el cirujano debería ensamblar las dos mitades idénticas del cuerpo tras anastomosar el injerto 24 con el vaso 23 y sellar los márgenes opuestos entre sí de las mitades idénticas, por ejemplo utilizando un pegamento, tal como se ha indicado anteriormente.

Alternativamente, la primera parte del cuerpo 21 puede dotarse de una hendidura longitudinal 28, tal como se muestra en la figura 6. De esta manera el cirujano podría deslizar la segunda parte del cuerpo 22 sobre el extremo del injerto 24. A continuación, el cirujano podría anastomosar el extremo libre del injerto 24 con el vaso sanguíneo 23 y después deslizar la segunda parte del cuerpo 22 de vuelta sobre el injerto 24 de manera que cubriese el sitio de la anastomosis 29, utilizando la hendidura 28 para alimentar el vaso sanguíneo 23 hacia el interior de la primera parte del cuerpo 21 con el fin de que esté rodeada por el mismo. El cirujano podría seguidamente sellar entre sí los márgenes longitudinales opuestos de la primera parte del cuerpo 21 en la hendidura 28 con el fin de formar el reservorio sellado 27.

Se apreciará que pueden utilizarse otras configuraciones para las partes del cuerpo 21 y 22. Por ejemplo, la primera y segunda partes del cuerpo 21 y 22 podrían proporcionarse de manera separada y fijarse entre sí para formar el reservorio sellado 27 sólo in situ dentro del paciente.

Las figuras 8 y 9 ilustran una realización del dispositivo adecuada para la utilización en el caso de una anastomosis lado a lado. El cuerpo 30 del dispositivo se muestra comprendiendo una primera parte del cuerpo 31, desde la que se ramifican segunda y tercera partes del cuerpo 32, 33. Las formas que se ramifican forman un cuerpo generalmente en forma de X, tal como se muestra en la figura 8.

Las tres partes del cuerpo 31, 32, 33 generalmente presentan una forma tubular. El dispositivo es generalmente similar al ilustrado en las figuras 6 y 7, excepto por la tercera parte adicional del cuerpo 33.

La primera parte del cuerpo 31 rodea el vaso sanguíneo nativo ocluido 34 y se sella con la superficie adventicial del mismo mediante las partes sellantes 35. La segunda y tercera partes 32, 33 rodean el injerto 36 y están selladas con la superficie adventicial del injerto en las partes sellantes respectivas 37, 38. Como se muestra con la mayor claridad en la figura 9, el efecto de las partes sellantes 35, 37, 38 es formar un reservorio sellado 39 entre el interior del cuerpo 30 y las superficies adventiciales de los vasos incluidos, reservorio 39 que puede rellenarse por lo menos parcialmente con una formulación farmacéutica de la manera indicada anteriormente.

Con el fin de facilitar el ajuste del dispositivo ilustrado en las figuras 8 y 9, el dispositivo se proporciona ventajosamente al cirujano en por lo menos dos partes. Por ejemplo, la primera parte del cuerpo 31 puede proporcionarse separadamente de un segundo componente que comprende la segunda y tercera partes 32, 33. Dotando las partes del cuerpo de hendiduras longitudinales (no mostradas), las partes del cuerpo pueden ajustarse para rodear el vaso 34 y el injerto 36 y después sellarse a lo largo de dichas hendiduras longitudinales y sellarse entre sí a lo largo de una línea de contacto, proporcionando el reservorio sellado 39 alrededor del punto de anastomosis 40.

Las figuras 10 y 11 muestran una variante del dispositivo mostrado en las figuras 8 y 9 (y utilizan los mismos numerales de referencia para las partes comunes). Una utilización particularmente adecuada para el dispositivo de la presente invención es en la cirugía de injertación de "bypass" arterial coronario. En este caso, el primer vaso sanguíneo 34 puede, como se muestra, ser una arteria coronaria que está incluida en parte en la pared del corazón 50. Un dispositivo de la forma mostrada en las figuras 8 y 9 no pudo adaptarse a una arteria coronaria parcialmente incluida 34, debido a que la primera parte del cuerpo no podía extenderse totalmente alrededor de la arteria 34. De acuerdo con lo anterior, en las realizaciones de las figuras 10 y 11, la primera parte 51 del cuerpo 31 no describe un círculo completo visto en sección transversal respecto a su dimensión longitudinal; al contrario, generalmente es arqueado. En la realización ilustrada describe un arco de aproximadamente 180º. Esto permite que la primera parte del cuerpo 51 se ajuste sobre sólo la parte expuesta de la arteria coronaria parcialmente incluida 34, con el fin de rodearla sólo en parte. En esta disposición, los márgenes que se extienden longitudinalmente 41 de la primera parte del cuerpo 51 son selladas por el cirujano a la pared adventicial de la arteria coronaria 34 ó, como se muestra, a la superficie de la pared del corazón 50, por ejemplo mediante la utilización de un pegamento de tejido.

El dispositivo de las figuras 10 y 11 también es aplicable a otros procedimientos quirúrgicos en los que el primer vaso portador de sangre es una arteria parcialmente incluida en una pared del órgano suplido por dicha arteria. Tales órganos incluyen el cerebro, la vejiga y el útero.

Aunque las realizaciones ilustradas se han concentrado en la utilización del dispositivo para administrar agentes a vasos portadores de sangre en sitios de anastomosis así como a sitios contiguos a la misma, la invención no está limitada a tales usos. El dispositivo puede, por ejemplo, utilizarse más generalmente para administrar agentes a la superficie adventicial de vasos portadores de sangre no anastomosados. Por ejemplo, tras una angioplastia con balón, puede colocarse un dispositivo de la forma mostrada en las figuras 3 a 5 alrededor del exterior de una arteria en la región del sitio de la angioplastia con balón, de manera que se administre uno o más agentes en el sitio a través de la superficie adventicial de la arteria.

En la realización indicada anteriormente, los reservorios sellados se muestran como adoptando la forma de un espacio radial entre la superficie adventicial del vaso portador de sangre y el interior de por lo menos la primera parte del cuerpo, espacio que está relleno por lo menos en parte durante la utilización mediante una formulación farmacéutica. Sin embargo, dicho espacio no es esencial. Por ejemplo, en una realización alternativa, el cuerpo puede presentar una capa externa flexible generalmente impermeable y una capa interna flexible que está impregnada con la formulación y que está dispuesta para estar en contacto con la superficie adventicial durante la utilización.

La capa externa puede, por ejemplo, estar realizada en colágeno sólido y la capa interna puede estar realizada en colágeno esponjoso entrecruzado con la misma, siendo capaz la capa esponjoso de estar impregnada con la formulación farmacéutica que contiene el agente a administrar. En tal caso, el dispositivo puede proporcionarse al cirujano para la colocación con la formulación ya impregnada en el mismo, o puede humectase con la formulación después de la colocación, por ejemplo siendo inyectado, tal como se ha indicado anteriormente.

Alternativamente, puede impregnarse una superficie interna del cuerpo con el agente, superficie está justo en contacto con el vaso sanguíneo durante la utilización. Alternativamente, el agente puede dispersarse en toda la estructura del cuerpo.

Es deseable que el cuerpo del dispositivo presente suficiente fuerza para resistir las fuerzas torsionales. Con este fin, el cuerpo puede estar formado de, por ejemplo, una capa interna, por ejemplo una película de colágeno, o costillas longitudinales, transversales o helicoidales. Pueden proporcionarse costillas que subdividan el reservorio en compartimientos y que proporcionen estabilidad adicional.

Las proteínas o ácidos nucleicos pueden utilizarse para el tratamiento o prevención de la hiperplasia intimal que surge en cualquier circunstancia clínica. Por ejemplo, es posible tratar la hiperplasia que surge después de cualquier tipo de procedimiento quirúrgico, incluyendo la angioplastia, por ejemplo la angioplastia con balón; cirugía de "bypass", tal como la cirugía de "bypass" coronario en la que una vena se anastomosa con una arteria; otros procedimientos de anastomosis, por ejemplo la anastomosis en las piernas; y la endarterectomía, por ejemplo la endarterectomía de arteria carótida. También resulta posible tratar la hiperplasia intimal asociada con el daño o hipertensión arterial, por ejemplo la hipertensión arterial pulmonar. La invención proporciona tratamiento de la hiperplasia intimal en cualquier tipo de vaso sanguíneo, por ejemplo en una arteria o vena, preferiblemente en una arteria.

De acuerdo con la invención, es posible tratar o mejorar la hiperplasia intimal establecida o prevenir la aparición de la hiperplasia intimal. De manera similar, es posible reducir la probabilidad de que aparezca la hiperplasia intimal o reducir la severidad de la hiperplasia intimal establecida o de hiperplasia de probable aparición. El tratamiento de acuerdo con la invención puede tener lugar antes, durante o después de un procedimiento quirúrgico, por ejemplo con el fin de reducir la probabilidad de que la hiperplasia aparezca después del procedimiento.

Preferiblemente, el ácido nucleico o proteína del VEGF se administra con vistas a prevenir o tratar la estenosis de novo. Sin embargo, también puede utilizarse para tratar o prevenir la restenosis.

Las proteínas o ácidos nucleicos de la invención preferiblemente se administrar en forma de una formulación farmacéutica que comprende un portador farmacéuticamente aceptable. Puede utilizarse cualquier formulación farmacéutica adecuada.

Por ejemplo, las formulaciones adecuadas pueden incluir las soluciones de inyección estéril acuosas y no acuosas que pueden contener antioxidantes, tampones, bacteriostatos, antibióticos bactericidas y solutos que hacen que la formulación sea isotónica con la sangre del recipiente previsto; y suspensiones estériles acuosas y no acuosas que pueden incluir agentes de suspensión y agentes espesantes. Las formulaciones pueden presentarse en recipientes de dosis única o de dosis múltiple, por ejemplo ampollas selladas y viales y pueden almacenarse en estado congelado o secado por congelación (liofilizado) que requiera sólo la adición del portador líquido estéril, por ejemplo agua para inyección, inmediatamente antes de la utilización.

Debe entenderse que, además de los ingredientes particularmente indicados anteriormente, las formulaciones de la presente invención pueden incluir otros agentes convencionales en la técnica teniendo en cuenta el tipo de formulación en cuestión. De las posibles formulaciones, son preferidas las soluciones estériles y libres de pirógenos acuosas y no acuosas.

Las proteínas, ácidos nucleicos y vectores pueden administrar en cualquier dosis adecuada y utilizando cualquier régimen de dosificación adecuado. Los expertos en la técnica apreciarán que la cantidad y régimen de dosificación pueden ajustarse para asegurar el tratamiento óptimo de la condición particular a tratar, dependiendo de numerosos factores. Algunos de tales factores pueden ser la edad, sexo y condición clínica del sujeto a tratar.

Para la administración de ácidos nucleicos desnudos que codifican VEGF o constructos que comprenden tales ácidos nucleicos, las dosis típicos se encuentran comprendidas entre 0,1 y 5.000 \mug, por ejemplo entre 50 y 2.000 \mug, como por ejemplo entre 50 y 100 \mug, entre 100 y 500 \mug o entre 500 y 2.000 \mug por dosis. Para la administración de proteína VEGF, las dosis adecuadas incluyen dosis de entre 1 y 1.000 \mug, por ejemplo entre 1 y 10 \mug, entre 10 y
100 \mug, entre 100 y 500 \mug o entre 500 y 1.000 \mug.

La dosis utilizada para la administración de ácidos nucleicos de VEGF por medio de vectores virales o no virales dependerá de muchos factores, incluyendo la eficiencia con la que los vectores administren ácidos nucleicos de VEGF en las células y la eficiencia con la que los ácidos nucleicos del VEGF sean expresados en las células.

Por ejemplo, los vectores virales pueden administrarse en dosis comprendidas entre 10^{4} y 10^{14} cfu o pfu/ml, por ejemplo entre 10^{4} y 10^{6}, entre 10^{6} y 10^{8}, entre 10^{8} y 10^{10}, entre 10^{10} y 10^{12} o entre 10^{12} y 10^{14} cfu o pfu/ml. Las dosis en la región de 10^{5} y 10^{9} cfu o pfu/ml son preferidas. El término pfu (unidad formadora de placa) se aplica a ciertos virus, incluyendo los adenovirus y corresponde a la infectividad de una solución de virus y se determina mediante la infección de un cultivo celular apropiado y la medición, generalmente tras 48 horas, del número de placas procedentes de células infectadas. El término cfu (unidad formadora de colonia) se aplica a otros virus, incluyendo los retrovirus, y se determina por medios conocidos en la técnica, generalmente tras 14 días de incubación con un marcador seleccionable. Las técnicas para determinar el título de cfu o pfu de una solución viral son bien conocidos en la técnica.

Para los retrovirus, las dosis en la región comprendida entre 10^{5} y 10^{6} cfu/ml son particularmente preferidas. Para los retrovirus pseudotipados, las dosis en la región de 10^{7} cfu/ml son particularmente preferidas. Para los adenovirus, las dosis en la región de 10^{9} pfu/ml son particularmente preferidas.

De manera similar, tales dosis pueden incluirse dentro de implantes de la invención para la administración gradual.

Los ácidos nucleicos del VEGF asociados con vectores no virales también pueden administrarse en cualquier dosis adecuada por cualquier medio de administración, tal como se ha indicado anteriormente, o gradualmente desde un implante. Las dosis adecuadas típicamente se encuentran comprendidas entre 0,1 y 1.000 \mug de ácido nucleico, por ejemplo entre 1 y 100 \mug, entre 100 y 500 \mug o entre 500 y 1.000 \mug, entre 1.000 y 2.000 \mug, entre 2.000 y 3.000 \mug ó entre 3.000 y 5.000 \mug. Las dosis preferidas se encuentran en la región comprendida entre 5 y 50 \mug, por ejemplo entre 10 y 20 \mug.

Los programas de dosificación también varían de acuerdo con, por ejemplo, la vía de administración, la especie del recipiente y la condición del mismo. Sin embargo, se prevén dosis únicas y dosis múltiples extendidas a lo largo de periodos de días, semanas o meses. Además, tal como se ha explicado anteriormente, la administración de proteínas y ácidos nucleicos del VEGF puede llevarse a cabo mediante un implante adecuado para su adaptación alrededor de un vaso sanguíneo, preferiblemente un arteria; preferiblemente, el implante presenta la forma de un collar. Tal implante proporcionará una administración gradual. Por ejemplo, la administración puede tener lugar a lo largo de un periodo de horas, días, semanas o meses.

Las proteínas y ácidos nucleicos de la invención pueden administrarse mediante cualquier forma de administración, por ejemplo mediante administración tópica, cutánea, parenteral, intramuscular, subcutánea o transdérmica, o mediante inyección directa en el flujo sanguíneo, inyección directa en la pared arterial o alrededor de ésta o mediante aplicación directa a los tejidos mucosos. Preferiblemente, la administración se lleva a cabo mediante un implante, tal como se ha descrito anteriormente.

Las proteínas, ácidos nucleicos y vectores de la invención pueden utilizarse para tratar la hiperplasia intimal en cualquier mamífero. El tratamiento de pacientes humanos es preferente.

Los implantes de la invención, especialmente los implantes en forma de collares tal como se ha indicado anteriormente, también pueden utilizarse para la administración de agentes diferentes del VEGF en los vasos sanguíneos, por ejemplo las arterias. Puede administrarse cualquier agente adecuado de esta manera, con el fin de conseguir cualquier meta terapéutica deseada.

Se ha observado que los complejos de plásmido-liposoma, retrovirus MMLV, retrovirus VSV-G y adenovirus conducen a la expresión en arterias con collar. La eficiencia de transferencia génica fue máxima con adenovirus y los retrovirus VSV-G pseudotipados también produjeron una eficiencia de transfección relativamente elevada. La utilidad de los retrovirus VSV-G deficientes en replicación en la transferencia génica arterial no ha sido demostrada con anterioridad. Se ha observado la expresión en algunas células endoteliales de las arterias transfectadas con adenovirus. Debido a que se había dado la penetración desde las superficies adventiciales hasta la capa íntima, estos resultados plantean la posibilidad general de alterar la función endotelial en la enfermedad humana mediante la transferencia génica extraluminal utilizando genes diferentes de los del VEGF. Esto también puede resultar útil para la expresión en los medios adventiciales y externos de productos génicos difundibles o secretados que seguidamente actúan en otros sitios en la pared arterial. Preferiblemente, tal administración realiza el tratamiento de la hiperplasia intimal, tal como se ha definido anteriormente, aunque también puede llevar a cabo metas terapéuticas adicionales o alternativas.

Preferiblemente, los agentes terapéuticos estarán en forma de ácido nucleico que codifique un polipéptido o proteína farmacéuticamente activo. Más preferiblemente, este ácido nucleico estará comprendido dentro de un constructo, tal como se ha indicado anteriormente. Todavía más preferiblemente, el ácido nucleico o constructo se administrará a la arteria por medio de un vector tal como se ha indicado anteriormente, por ejemplo un vector viral o no viral tal como se ha indicado anteriormente.

De esta manera, la transferencia génica extraarterial puede utilizarse para la administración de material genético en la pared de los vasos sanguíneos, preferiblemente de las arterias. A partir de los Ejemplos puede observarse que los cambios en las SMC mediales e incluso los cambios en el endotelio pueden conseguirse desde el lado adventicial, permitiendo el desarrollo de nuevos métodos para el tratamiento de las enfermedades del vaso sanguíneo, por ejemplo arteriales.

Los Ejemplos siguientes ilustran la invención. Se utilizan las abreviaturas siguientes:

BSA	-	albúmina de suero bovina
DMEM	-	medio de Eagle modificado por Dulbecco
FCS	-	suero de feto bovino
HUVEC	-	células endoteliales de vena umbilical humana
IgG	-	inmunoglobulina G
MAP quinasa	-	proteína quinasa activada por mitógeno
mAb	-	anticuerpo monoclonal
PBS	-	solución salina tamponada con fosfato
PGI_{2}	-	prostaciclina

cPLA_{2}	-	fosfolipasa A_{2} citosólica
PlGF	-	factor de crecimiento placentario
SDS PAGE	-	electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecil sulfato sódico
VEGF	-	factor de crecimiento vascular endotelial
VWF	-	factor de von Willebrand
VSMC	-	células vasculares del músculo liso

Ejemplo 1

Se estudió el efecto de la transferencia específica de las células endoteliales (EC) de genes del VEGF sobre el engrosamiento de la capa íntima utilizando un collar de silicona insertado alrededor de las arterias carótidas y que actuaba como el agente que provocaba el crecimiento de las células intimales del músculo liso y como reservorio para el gen y para el vector. El modelo conservaba la integridad de las EC y permitía la transferencia génica extravascular directa sin ninguna manipulación intravascular.

Ejemplo 1.1

Transferencia génica: se indujo el engrosamiento intimal de las arterias carótidas de treinta y dos conejos blancos Nueva Zelanda mediante la inserción de un collar inerte de silicona alrededor de las arterias bajo anestesia general (Booth et al., Atherosclerosis 76:257-268 (1989)). La transferencia génica se llevó a cabo cinco días después de posicionar el collar, mediante la apertura suave del collar bajo anestesia e inyección de 500 \mul de complejos plásmido-liposoma en el collar (es decir, sobre la superficie adventicial de la arteria). No se realizaron manipulaciones intravasculares en ninguna de las etapas de los estudios.

Complejos plásmido-liposoma: Se acomplejaron veinticinco \mug de plásmido pCMV5-VEGF-164 (que contenía ADNc del VEGF de ratón (Breier et al., Development 114:521-532 (1992); nucleótidos 1-583) con 25 \mul de lipofectina (BRL) diluida hasta 500 \mul con solución de Ringer. Los complejos se mantuvieron a temperatura ambiente por lo menos 15 minutos antes de la transferencia génica. Se determinó previamente que a la concentración utilizada en el presente estudio, los complejos de plásmido-lipofectina no eran tóxicos a las EC aórticas de conejo in vitro. Las arterias de control se transfectaron con un complejo similar de plásmido-liposoma que contenía el plásmido de expresión ADNc lacZ de E. coli (Kalnins et al., supra) (nucleótidos 1-3100). Los plásmidos utilizados para los estudios se aislaron a partir de cultivos de E. coli (DH5á) utilizando columnas Qiagen Mega y se purificaron utilizando tres extracciones en fenol-cloroformo y una precipitación en etanol (Ausubel et al., editores, Current Protocols in Molecular Biology, Nueva York, NY; Greene Publishing Associates y John Wiley & Sons (1991) 4.2.3-4.2.4), se ajustaron a 1 \mug/\mul y se analizó si se encontraban libres de cualquier contaminación microbiológica o con endotoxinas (ensayo de Limulus, límite de detección 0,2 mg). Los animales se sacrificaron 3 (n=8), 7 (n=12) y 14 (n=12) días después de la operación de transferencia génica; las arterias se extirparon cuidadosamente y se dividieron en tres partes iguales: el tercio proximal se fijó por inmersión en paraformaldehído al 4%/PBS durante 15 minutos y se incluyó en compuesto OCT (Miles Scientific) (Ylä-Herttuala et al., J. Clin. Invest. 95:2692-2698 (1995)). El tercio intermedio se fijo tal como anteriormente durante 4 horas, se enjuagó en sacarosa al 15% durante 48 horas y se incluyó en parafina. El tercio distal se incluyó directamente en compuesto OCT y se congeló en nitrógeno líquido. En cuatro arterias, se utilizó el tercio distal para el aislamiento del ARNm y RT-PCR (ver posteriormente). Se utilizaron diez secciones seleccionadas aleatoriamente de la parte intermedia para la determinación de la proporción de grosor íntimal/medial (Ylä-Herttuala et al., Arteriosclerosis 6:230-236 (1986) por dos observadores independientes sin conocimiento del origen de las muestras. Se utilizaron los valores medios de las dos mediciones independientes para calcular los resultados (media \pm SD). Las diferencias en las proporciones de grosor intimal/medial entre los grupos se analizaron mediante ANOVA, seguido de una prueba de t modificada (*p<0,05).

RT-PCR: las partes distales del VEGF (n=2) y de las arterias transfectadas con lacZ (n=2) recogidas 7 días después de la transferencia génica se utilizaron para el aislamiento del ARNm (Micro-FastTrack, Invitrogen) y se transcribieron inversamente formando la primera hebra de ADNc utilizando transcriptasa inversa de AMLV (5U por reacción, Boehringer) utilizando cebadores hexámeros aleatorios (kit de ciclo de ADNc, Invitrogen) tal como está descrito (Hiltunen et al., Circulation 92:3297-3303 (1995)). Se llevaron a cabo treinta y cinco PCR cíclicas con polimerasa Taq (Boehringer) y cebadores específicos para el constructo pCMV5-VEGF-164 (cebador 5': SEC ID nº 9; cebador 3': SEC ID nº 10; parámetros de ciclo PCR: 1 minuto, 90ºC; 1 minuto, 60ºC; 1 minuto, 72ºC, excepto en el último ciclo, 5 minutos). En las arterias transfectadas con VEGF se observó un fragmento amplificado con la longitud esperada (547 nt). Se muestran los marcadores de tamaño del ADN (escalera de 1 kb, BRL) en ambos lados del gel.

Se tomaron micrografías, mostrando las características de las arterias carótidas de conejo 7 días después de la transferencia génica del VEGF o de lacZ. Las inmunotinciones de las arterias transfectadas demostraron que la arteria de control transfectada con plásmido lacZ/liposomas (Mab HHF-35 específico de las SMC, dilución 1:500, Enzo Diagnostics) mostraba un engrosamiento intimal típico; que las arterias transfectadas con plásmido VEGF/liposomas (Mab HHF-35 específico de SMC) mostraban únicamente un engrosamiento intimal limitado; que el endotelio estaba presente en todos los segmentos vasculares estudiados (sección seriada hasta A, Mab CD31 específico de las EC, dilución 1:50, DAKO); que no había evidencia detectable de inflamación en las arterias transfectadas con VEGF y con lacZ (Mab RAM-11 específico de macrófagos, dilución 1:500; DKO); que se observaba neovascularización en las superficies adventiciales de las arterias transfectadas con VEGF 14 días después de la transferencia génica (tinción hematoxilina-eosina).

Para las inmunotinciones se utilizó el sistema peroxidasa de rábano picante-avidina (Vector Elite, Vector Labs.) (Ylä-Herttuala et al., PNAS 87:6959-6963 (1990)). Los controles para las inmunotinciones incluyeron incubaciones con inmunoglobulinas irrelevantes ajustadas a clase y especie e incubaciones en las que se omitían los anticuerpos primarios. Las hibridaciones in situ se llevaron a cabo utilizando una ribosonda VEGF antisentido (583 nt) sintetizada con el plásmido pBluescript SK (Stratagene) tal como está descrito (Ylä-Herttuala et al. (1990), supra). En resumen, las secciones incluídas en parafina se pretrataron con proteinasa K, se acetilaron y se hibridaron utilizando ribosondas marcadas con 35-S-UTP (DuPont, NEN) (6 x 10^{6} cpm/ml) a 52ºC durante 16 horas. El lavado final tras la hibridación se llevó a cabo con 0,1 x SSC (6x10^{6} cpm/ml) a 60ºC durante 30 minutos. Se utilizó la autorradiografía para la detección de señales (Eastman-Kodak NAB-2). Las hibridaciones de control con una ribosonda sentido monohibridante (Ylä-Herttuala et al. (1990), supra) proporcionaron resultados negativos. Las secciones se contratiñeron con hematoxilina.

Ejemplo 1.2

La transferencia génica se llevó a cabo tal como se indica en el Ejemplo 1.1. Se administró L-NAME (70 mg/kg/día) a los conejos en el agua de bebida, empezando un día antes de la transferencia génica del VEGF (n=5) o del lacZ (n=5). Los animales se sacrificaron 7 días después de la transferencia génica y se analizaron para determinar la proporción de espesor intimal/medial y la histología tal como se ha indicado anteriormente (Ylä-Herttuala et al., Arteriosclerosis 6:230-236 (1986); Ylä-Herttuala et al. (1990), supra). Se eliminó la diferencia de engrosamiento intimal.

Ejemplo 1.3

Los cultivos confluyentes de HUVEC se lavaron dos veces con medio libre de suero y se incubaron en este medio en presencia de las concentraciones de VEGF recombinante humano indicadas durante 15 minutos o con 10 ng/ml de VEGF durante los tiempos que se muestran. En algunos experimentos, las células se pretrataron durante 1 hora con 100 \muM de L-NAME y posteriormente se trataron con o sin 10 ng/ml de VEGF durante 10 minutos. Se eliminó el medio y las células se lisaron rápidamente a 4ºC mediante la adición de Tris 10 mM/HCl (pH 7,6), EDTA 5 mM, NaCl 50 mM, pirofosfato sódico 30 mM, NaF 50 mM, Na_{3}VO_{4} 0,1 mM, PMSF 1 mM y Triton X-100 al 1% (tampón de lisis). Los lisados se clarificaron mediante centrifugación a 15.000 x g durante 10 minutos y las inmunoprecipitaciones se llevaron a cabo incubando los lisados clarificados con PY20 antifosfotirosina mAb durante 2 horas a 40ºC. Se recogieron los inmunoprecipitados mediante incubación de los lisados durante 1 hora adicional con proteína A-agarosa. Los inmunoprecipitados se lavaron tres veces con tampón de lisis y proteínas y después se extrajeron con tampón de muestras 2x SDS-PAGE. Tras el SDS-PAGE, las proteínas inmunoprecipitadas se transfirieron a membranas y después se inmunotransfirieron con PY20 mAb. Lo anterior demostró que el VEGF inducía la fosforilación de una proteína primaria de 205 kD que correspondía al receptor del VEGF (las proteínas con tirosina fosforilada en 100, 125, 145, 190 y 205). L-NAME eliminaba la respuesta frente al VEGF.

Se añadió VEGF recombinante a una concentración de 25 ng/ml durante tiempos de hasta 2 horas (se incrementó la producción de nitrito desde el nivel intimal de aproximadamente 16 \muM y permaneció en valores comprendidos entre 1,8 y 2 \muM) o a las concentraciones indicadas de 0, 2,5, 25 ng/ml durante 10 minutos. El efecto del pretratamiento con L-NAME (100 \muM) sobre la respuesta del VEGF se midió tras la adición de 25 ng/ml de VEGF durante 10 minutos. Se midió la producción de nitrito utilizando el procedimiento de detección capilar (Leone et al., en Methods in Nitric Oxide Research, Feelisch y Stanler, editores John Wiley & Sons, Nueva York, páginas 499-508 (1996)). El nivel se incrementó hasta niveles aproximados comprendidos entre 19 y 21 \muM en presencia del VEGF; al añadir L-NAME, se produjo una reducción hasta el nivel de control (aproximadamente 17 \muM).

Resultados: Se descubrió que, en comparación con las arterias transducidas con lacZ, la transferencia de genes VEGF reducía significativamente el engrosamiento intimal una semana después de la operación (proporción intimal/medial de 0,3 frente a 1,1, p<0,05, respectivamente). El efecto se había reducido tras dos semanas, lo que probablemente es debido al hecho de que la transferencia génica mediada por plásmido/liposoma típicamente sólo induce la expresión transitoria del gen transfectado con expresión proteica máxima entre 2 y 3 días después de la transferencia génica (Nabel et al., Ann. Rev. Physiol. 56:741-761 (1994)).

El análisis inmunohistoquímico de las arterias mostró que el engrosamiento intimal estaba compuesto casi exclusivamente de SMC. La capa endotelial estaba presente en todos los segmentos estudiados. No se detectaron efectos adversos o inflamación en las arterias transfectadas.

La expresión del VEGF transfectado se confirmó mediante RT-PCR utilizando cebadores específicos del transgén y mediante hibridación in situ. La mayor parte de la expresión del VEGF y de lacZ se produjo en la superficie adventicial y medio externo de los fibroblastos y las SMCs. Se observó la neovascularización adventicial en tres de las arterias transfectadas con VEGF 14 días después de la transferencia génica. No se detectó neovascularización en las arterias transfectadas con lacZ.

Se ha demostrado que la transferencia génica con plásmido-lacZ/liposomas utilizando el modelo de collar conduce a una transferencia génica local en el 0,05% de las células arteriales. A pesar de la baja eficiencia de la transferencia génica, la forma secretada del VEGF producida dentro del collar provoca efectos biológicos en el microambiente local de la arteria, tal como indica la presencia de neovascularización en tres arterias transfectadas con VEGF 14 días después de la transferencia génica. Al igual que en la hipoxia aguda, el VEGF secretado se cree que alcanza las EC por difusión y se une a los receptores del VEGF en las EC.

Se planteó la hipótesis de que los efectos inhibitorios del VEGF sobre el engrosamiento intimal se debían a un factor o actividad directa o indirecta inducida por el VEGF y derivada de las EC que podía, a su vez, inhibir la proliferación de las SMC. En particular, se planteó la hipótesis de que los efectos del VEGF sobre el engrosamiento intimal estaban mediados a través de la ruta del NO. Esta hipótesis se investigó en un subgrupo de conejos blancos Nueva Zelanda (n=8) administrando a los animales inhibidor de la NO sintasa (L-NAME) durante experimentos de transferencia génica. Se encontró que la L-NAME anulaba las diferencias entre el engrosamiento intimal observadas entre las arterias transfectadas con VEGF y con lacZ. Las células diana principales del VEGF en la pared arterial eran las EC. Los únicos otros tipos celulares que poseían receptores del VEGF eran monocitos aunque, según la inmunocitoquímica con anticuerpos específicos, los monocitos estaban ausentes en las arterias carótidas con collar bajo estas condiciones.

Estos resultados (la capacidad de producir diferencias en el engrosamiento intimal) eran consistentes con la inhibición inducida por el VEGF del engrosamiento intimal a través de la estimulación de la producción de NO. Por lo tanto, se examinó si el VEGF podía estimular directamente la producción de NO en cultivos de EC. El VEGF estimuló la fosforilación de las tirosinas de una proteína primaria de 205 kDa correspondiente con el receptor del VEGF en el intervalo de concentraciones comprendido entre 1 y 25 ng/ml. La adición de VEGF a células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC) en cultivo provocó un incremento dependiente del tiempo y de la concentración en la producción de NO, según el seguimiento de medición de los niveles de nitrito. El efecto del VEGF sobre la producción de NO se observó incluso 30 segundos después de la adición del VEGF, alcanzando un máximo tras 5 minutos y manteniéndose hasta las 2 horas como máximo. El efecto semi-máximo del VEGF se obtuvo a 5 ng/ml. La fosforilación y producción de NO inducidas por VEGF estaban completamente anuladas en presencia de L-NAME 100 \muM. De esta manera, es probable que la transferencia génica del VEGF estimule la producción de NO en las EC de las arterias transfectadas y que limite la proliferación de las SMC, por lo menos parcialmente, a través de un mecanismo mediado por el NO. Los resultados son compatibles con las observaciones anteriores de que la transfección de arterias con ADNc de NO sintasa endotelial reduce el engrosamiento intimal (Von der Leyon et al., PNAS 92:1137-1141 (1995)).

Callow et al. (supra) y Asahara et al. (supra) concluyeron que la administración de proteína VEGF estimulaba la proliferación de las EC en arterias denudadas, pero no se estudiaron los mecanismos actuales implicados en la inhibición del engrosamiento intimal. En la arteria carótida con collar, el engrosamiento intimal se ve estimulado en presencia de un endotelio anatómicamente intacto. Por lo tanto, es improbable que el efecto inhibitorio de la transferencia génica del VEGF sobre el engrosamiento intimal que se da a conocer en el presente documento sea debida a la reendotelización estimulada por el VEGF. De acuerdo con estos resultados, el VEGF puede inducir directamente la producción de NO en HUVEC de manera que éste es un mecanismo a través del cual el VEGF podría inhibir el engrosamiento intimal. El VEGF también estimula la producción de otros factores que pueden regular negativamente la proliferación de las SMCs, incluyendo el TGF-\beta o la prostaciclina.

Ejemplo 2

Se administraron retrovirus derivados del virus de la leucemia murina de Moloney (MMLV), retrovirus que contenían proteína G del virus de la estomatitis vesicular (VSV-G) y adenovirus, en la arteria carótida de conejos utilizando un collar silástico aplicado a la capa adventicial, utilizando complejos plásmido/liposoma de administración génica. Se utilizó el collar debido a que 1) proporcionaba un reservorio para la administración génica, 2) no implicaba la realización de manipulaciones intraluminales y el endotelio permanecía totalmente intacto anatómicamente y 3) la instalación del collar inducía la proliferación de las células de músculo liso (SMC) arterial e incrementaba la eficiencia de la transferencia de genes retrovirales en el lugar donde se requería la proliferación de las células diana.

Transferencia génica: se utilizaron conejos blanco Nueva Zelanda (1,8 a 2,5 kg). El anestésico utilizado fue fentanil-fluanisona (0,3 ml/kg)/midazolam (1 mg/kg) (Ylä-Herttuala et al., J. Clin. Invest. 95:2692-2698 (1995)). Una incisión en la línea media del cuello expuso la arteria carótida izquierda. Se colocó un collar silástico de 2 cm biológicamente inerte (MediGene Oy, Kuopio, Finlandia) alrededor de la arteria carótida de manera que estuviese en ligero contacto con la capa adventicial en los dos extremos (Booth et al., supra). Se llevó a cabo la transferencia génica 4 a 5 días después de la operación de implantación del collar. Para la transferencia génica, los animales se anestesiaron nuevamente. El collar, que había sido nuevamente expuesto quirúrgicamente, se abrió con suavidad y se rellenó con
500 \mul de solución de transferencia génica (ver posteriormente). La incisión se cerró y las arterias se analizaron después con el fin de determinar la eficiencia de transferencia génica.

Análisis histológico: se extirparon cuidadosamente arterias con collar y se dividieron en tres partes iguales: el tercio proximal se fijó por inmersión en paraformaldehído al 4%/PBS (pH 7,4) durante 15 minutos, seguido de la inclusión en compuesto OCT (Miles Scientific, USA). El tercio medial se fijó por inmersión en paraformaldehído al 4%/PBS (pH 7,4) durante 4 horas, se enjuagó en sacarosa al 15% (pH 7,4) durante 48 horas y se incluyó en parafina. El tercio distal se incluyó en compuesto OCT y se procesó para obtener secciones congeladas. Se tiñeron con X-gal diez secciones seleccionadas aleatoriamente para determinar la actividad de \beta-galactosidasa durante 12 horas y se utilizaron para la determinación de la eficiencia de la transferencia génica (Nabel et al., Science 249:1285-1288 (1990); Ylä-Herttuala et al., supra (1995)). Se calculó la eficiencia de transferencia génica como porcentaje de las células que contenían \beta-galactosidasa, como proporción del número total de núcleos en 20 campos seleccionados aleatoriamente a una magnificación de 100X. Las secciones seleccionadas aleatoriamente de cada tercio de arterias con collar se utilizaron para la inmunocitoquímica y para el análisis de tipos celulares y/o de proporciones de engrosamiento intimal/medial (Booth et al., supra).

Los tipos celulares se identificaron utilizando los anticuerpos siguientes: SMC: HHF-35 mAb (dilución 1:500, Enzo Diagnostics, USA), \alpha-actina mAb (dilución 1:1000; Sigma Chemical Co.); macrófagos: RAM-11 mAB (dilución 1:1000; Dako, USA), anti-CD68 mAb (dilución 1:250; Dako); células endoteliales: anti-CD31 mAb (dilución 1:50; Dako); leucocitos polimorfonucleares: anti-CD45 mAb (dilución 1:100; Dako) y células T anti-conejo: MCA 805 mAb (dilución 1:1000; Dako). El sistema de peroxidasa de rábano picante-avidina se utilizó para la detección de señales (laboratorios Vector) (Ylä-Herttuala et al., supra (1995)). Tras la inmunotinción, se contratiñeron secciones de tejido con hematoxilina.

Determinación del índice de proliferación: el índice de proliferación en las arterias con collar se determinó utilizando el marcaje con 5-bromo-2'-desoxiuridina (BrdU) (Soma et al., Arterioscler. Thromb. 13:571-578 (1993)). En resumen, se inyectaron conejos blanco Nueva Zelanda (n=12) con BrdU (40 mg/kg de peso corporal) 3 horas antes de sacrificarlos. Se fijaron las arterias carótidas en etanol al 70% durante la noche y se incluyeron en parafina. Se tiñeron secciones seriadas (20 secciones por animal) para detectar el BrdU utilizando IgG anti-ratón marcado con FITC (Dako), seguido de tinción de los núcleos con yoduro de propidio. El índice de marcaje se calculó como porcentaje de los núcleos positivos para la tinción con BrdU. Las arterias carótidas contralaterales se operaron simuladamente y se utilizaron como controles.

Plásmido/liposomas: se acomplejó el plásmido (Promega) de expresión pCMV-\beta-galactosidasa (lacZ) con reactivo lipofectina (BRL) de la manera siguiente: se mezclaron lentamente 25 \mug de plásmido con 25 \mul de reactivo lipofectina, diluyendo con 500 \mul de solución de Ringer. No se observaron precipitados en la solución de plásmido/lipofectina. La mezcla se dejó reposar a temperatura ambiente durante por lo menos 15 minutos y se utilizó para la transferencia génica dentro de las dos horas posteriores. Se comprobó que las preparaciones de plásmido estaban libres de contaminación con lipopolisacáridos (ensayo de Limulus, Sigma Chemical Co.).

Retrovirus: para los estudios se utilizaron retrovirus MMLV con pLZRNL que contenía lacZ (Ylä-Herttuala et al., supra (1995); Miyanohara et al., PNAS 85:6538-6542 (1988) o retrovirus VSV-G LacZ pseudotipados (Yee et al., PNAS 91:9564-9568 (1994)). En ambos, la expresión de lacZ estaba regulada por el LTR 5'. Se empaquetaron retrovirus anfotróficos LZRNL deficientes en replicación en células PA317 y se utilizaron a un título de 5x10^{5} cfu/ml, tal como describen (Ylä-Herttuala et al., supra (1995)). Se produjeron retrovirus pseudotipados VSV-G deficientes en replicación en células 293 GP mediante transfección transitoria (Yee et al., supra). Los retrovirus pseudotipados se concentraron utilizando ultracentrifugación y se utilizaron a un título de 1x10^{7} cfu/ml. Previamente a la utilización, se comprobó que las preparaciones retrovirales estaban libres de cualquier contaminante bacteriológico o de virus helper (Yee et al., supra).

Vectores adenovirales: para los estudios se utilizaron adenovirus con deleción de E1 deficientes en replicación (Gosh-Choudhury et al., Gene 50:161-171 (1986); Simari et al., J. Clin. Invest. 98:225-235 (1996)). Se clonó un ADNc de \beta-galactosidasa dirigido al núcleo bajo un promotor \beta-actina y un intensificador CMV en la región con deleción de E1 del genoma adenoviral utilizando recombinación homóloga (Gosh-Choudhury et al., supra; Simari et al., supra). Se produjeron adenovirus deficientes en replicación en 293 células y se concentraron mediante ultracentrifugación. Se utilizaron títulos de 1x10^{9} pfu/ml para los experimentos de transferencia génica. Las preparaciones adenovirales se analizaron para comprobar la ausencia de virus helper o de contaminantes bacteriológicos (Gosh-Choudhury et al., supra).

Resultados: el collar adventicial condujo a la hiperplasia neointimal 7 a 14 días después de la operación. El endotelio permaneció anatómicamente intacto durante los estudios. El marcaje con BrdU indicó un índice de proliferación máximo del 23% 3 días después de la operación. La neoíntima estaba compuesta exclusivamente de SMC. Los complejos de plásmido/liposoma condujeron a una transferencia génica detectable en la capa adventicial y medio externo, con una eficiencia inferior al 0,01%. Las arterias con collar no transfectadas o tratadas con liposomas no mostraron tinción de actividad \beta-galactosidasa.

La transferencia génica retroviral en la capa adventicial fue menos eficiente sin el collar, probablemente debido a que la transferencia génica retroviral sólo se daba en células proliferantes. La eficiencia de la transferencia génica con retrovirus MMLV deficientes en replicación fue baja (menos del 0,01%). La eficiencia de la transferencia génica con los retrovirus VSV-G pseudotipados fue del 0,1%. Mediante la utilización de los retrovirus MMLV y VSV-G, se observó tinción \beta-galactosidasa en la capa adventicial y medio externo.

Los adenovirus deficientes en replicación proporcionaron una transferencia génica eficiente, detectándose tinción \beta-galactosidasa en la capa adventicial y medio externo. De manera interesante, la tinción también se observó en algunas células endoteliales y en algunas células intimales. Debido a que el constructo adenovirus lacZ contenía una señal de localización nuclear para la \beta-galactosidasa, se localizó tinción X-gal intensa en los núcleos de las células transfectadas. La eficiencia de transferencia génica fue de aproximadamente el 10%, según estimación del número total de núcleos teñidos en las secciones analizadas. Se observaron algunas células inflamatorias en arterias transfectadas con retrovirus VSV-G y con adenovirus. No se observaron células inflamatorias en las arterias transfectadas con plásmido/liposomas.

En el presente Ejemplo, la transferencia del gen marcador \beta-galactosidasa (lacZ) a la capa adventicial y medio externo se produjo con todos los sistemas de transferencia génica. Los adenovirus también transfirieron el gen \beta-galactosidasa a algunas células endoteliales. Tras cinco días, los vectores adenovirales produjeron la eficiencia máxima de transferencia génica, mostrando hasta el 10% de las células actividad \beta-galactosidasa. Los retrovirus VSV-G pseudotipados también fueron efectivos en conseguir la transferencia génica en el 0,1% de las células en la capa adventicial y en el medio externo. Los complejos plásmido/liposoma y retrovirus MMLV infectaron <0,01% de la células. No se observaron reacciones adversas en los tejidos con ninguno de los sistemas de transferencia génica.

De esta manera, los adenovirus deficientes en replicación, los retrovirus VSV-G pseudotipados y los complejos plásmido/liposoma pueden utilizarse para la transferencia génica a la pared arterial utilizando el método del collar. Los efectos sobre las SMC mediales e incluso sobre el endotelio pueden conseguirse desde la cara adventicial.

(1) INFORMACIÓN GENERAL

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(i): SOLICITANTE:

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(A): NOMBRE: EUROGENE LIMITED

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CALLE: Marquis House, 67/68 Jermyn Street

\vskip0.500000\baselineskip

(C): POBLACIÓN: Londres

\vskip0.500000\baselineskip

(D): ESTADO: N/A

\vskip0.500000\baselineskip

(E): PAÍS: Reino Unido

\vskip0.500000\baselineskip

(F): CÓDIGO POSTAL (ZIP): SW1Y 6NY

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TÍTULO DE LA INVENCIÓN: UTILIZACIÓN TERAPÉUTICA DE FACTOR DEL CRECIMIENTO Y DISPOSITIVO DE ADMINISTRACIÓN, ESPECIALMENTE PARA EL TRATAMIENTO DE LA HIPERPLASIA INTIMAL

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): NÚMERO DE SECUENCIAS: 10

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): FORMA LEGIBLE POR EL ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): TIPO DE MEDIO: diskette

\vskip0.500000\baselineskip

(B): ORDENADOR: IBM PC compatible

\vskip0.500000\baselineskip

(C): SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D): SOFTWARE: PatentIn Release nº 1.0, versión 1.30 (EPO)

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(v): DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:

\vskip0.800000\baselineskip

: NÚMERO DE SOLICITUD: WO (desconocido todavía)

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 1

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 441 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1..441

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 1:

1

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 147 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 2:

2

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 573 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1..573

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 3:

3

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 191 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 4:

5

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 645 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1..645

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 5:

8

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 215 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 6:

10

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SEC ID nº 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 696 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1..696

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 7:

13

14

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 232 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 8:

15

16

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 9:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCGATCCATG AACTTTCTGC

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº 10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CADENA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 10:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCCGTTTAAC TCAAGCTGCC

\hfill

20

Claims

1. Utilización de un agente que es una proteína VEGF que posee la capacidad de promover la proliferación de las células endoteliales in vitro y/o in vivo, o de un ácido nucleico que codifica la proteína, para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento o prevención de la hiperplasia intimal de un vaso sanguíneo, en el que el endotelio se encuentra totalmente o en gran parte intacto.

2. Utilización según la reivindicación 1, en la que el vaso sanguíneo es una arteria.

3. Utilización según la reivindicación 1 ó 2, para el tratamiento o prevención de la estenosis inducida por un procedimiento quirúrgico o asociado con la hipertensión arterial pulmonar.

4. Utilización según la reivindicación 3, en la que el procedimiento quirúrgico es angioplastia, cirugía de "bypass" coronario, anastomosis quirúrgica o endarterectomía.

5. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, para el tratamiento o prevención de la estenosis de un vaso sanguíneo.

6. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, para el tratamiento o prevención de la restenosis de un vaso sanguíneo.

7. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la proteína presenta la secuencia de las SEC ID nº 2, nº 4, nº 6 ó nº 8, o un fragmento activo de la misma.

8. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el agente es un ácido nucleico en asociación con un vector viral o no viral.

9. Implante de utilización terapéutica, adaptado para ser colocado en el sitio de la hiperplasia intimal o en la proximidad del mismo con el fin de tratarla o prevenirla, en el que el endotelio está totalmente o en gran parte intacto, y que contiene un agente según se indica en cualquiera de las reivindicaciones anteriores.

10. Implante según la reivindicación 9, que es un implante silástico o un implante biodegradable.

11. Implante según la reivindicación 9 ó 10, que presenta la forma de un collar para ajustarse alrededor de un vaso sanguíneo en el sitio, o en la proximidad del mismo, de la hiperplasia intimal a tratar o prevenir.

12. Implante según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, que presenta una pared externa sustancialmente impermeable al agente comprendido dentro de la misma.

13. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, para su utilización en la administración del agente a un vaso sanguíneo en un paciente, en la que el agente se proporciona en un cuerpo adaptado para proporcionar una junta estanca alrededor del vaso, manteniendo el agente en el interior o asociado al dispositivo, de tal manera que, durante la utilización, el agente entra en contacto con la superficie adventicial del vaso.