ES2235329T3 - Procedimiento basado en el uso de bacteriofagos para la deteccion de moleculas biologicas en muestras biologicas. - Google Patents
Procedimiento basado en el uso de bacteriofagos para la deteccion de moleculas biologicas en muestras biologicas.Info
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Abstract
Un procedimiento para la detección de la presencia de moléculas de interés en muestras biológicas, comprendiendo las siguientes operaciones: a) inmovilizar las moléculas de interés sin destruir la habilidad para que estas moléculas interaccionen con las moléculas expuestas en las superficies del fago; b) hacer que una molécula de interés, inmovilizada como se ha descrito anteriormente, se enlace específicamente con al menos uno de los bacteriófagos filamentosos recombinantes, los cuales tienen internamente una molécula de ADN de cadena única cuya secuencia se conoce al menos parcialmente, y exponiendo a las superficies de la cápside al menos una molécula capaz de enlazarse específicamente con al menos una molécula de interés presente en la muestra biológica; c) separar el complejo molécula-bacteriófago obtenido de esta forma en la reacción de mezcla; d) lavar para eliminar los complejos generados por interacción no específica entre la molécula y el bacteriófago; e) añadir los reactivos parallevar la cabo la operación descrita en g) más adelante; f) lisis de proteínas formando la cápside de proteínas de los bacteriófagos seleccionados de esta forma; g) amplificación del ADN obtenido como se explica arriba por la reacción en cadena de al polimerasa (RCP); h) detección del ADN amplificado como se des-cribe anteriormente. viral de los antígenos, partes de éstos o oligopéptidos capaces de imitar los efectos de su presencia en los fluidos biológicos bajo examen.
Description
Procedimiento basado en el uso de bacteriófagos
para la detección de moléculas biológicas en muestras
biológicas.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para la detección de la presencia de moléculas de
interés en fuentes biológicas. Esto responde a la necesidad común
de muchas áreas de la investigación científica. De hecho, la
capacidad para identificar la presencia de moléculas en muestras
biológicas, asociadas, por ejemplo, con patologías clínicas,
siempre ha representado un objetivo importante de la investigación,
en particular en el campo de la medicina.
El campo de la biomedicina es sin ningún género
de dudas el principal campo (aunque no el único) en el que este
procedimiento se aplica. De hecho, las invenciones referidas a los
métodos con este propósito se han propuesto con el objeto de
investigar un continuo mayor nivel de sensibilidad en la detección,
en particular a nivel de diagnóstico.
Los anticuerpos son los instrumentos bioquímicos
más frecuentemente utilizados para detectar la presencia de
moléculas específicas en extractos de células o tejidos. Esto es
debido a su extrema sensibilidad y alta especificidad a la hora de
formar enlaces.
Cuando por estos procedimientos ocurre una
interacción con la molécula de interés, ésta se hace resaltar
utilizando marcadores enlazados a los anticuerpos, por ejemplo
sustancias fluorescentes, proteínas con actividad enzimática o
marcadores radiactivos.
Se ha descubierto que la capacidad de detección
de estos marcadores aumenta considerablemente con la utilización de
los llamados métodos de amplificación de señal. Éstos hacen posible
obtener una señal de detección mayor, por ejemplo uniendo el
marcador no al anticuerpo utilizado para el reconocimiento
específico (anticuerpo primario), sino a un segundo anticuerpo
capaz de unirse al primero (anticuerpo secundario). Se han
desarrollado varios procedimientos utilizando anticuerpos
secundarios, a los que se enlazan por enlace covalente moléculas
marcadoras, por ejemplo sustancias fluorescentes como fluoresceína o
rodamina, proteínas con actividad enzimática como la fosfatasa
alcalina o la peroxidasa del rábano, en caso de detección
utilizando ferritina o esferas doradas coloidales con el
microscopio electrónico.
Alternativamente, los sistemas de amplificación
utilizan la alta afinidad enlazante de moléculas como la biotina
(una pequeña vitamina soluble en agua) y estreptavidina (una
proteína bacteriana), u otras como las lecitinas (proteínas capaces
de reconocer y enlazarse a residuos específicos de sacáridos) y
moléculas como las glicoproteínas, glicolípidos o
proteoglicanos.
Respecto a este tema son posibles unas
extremadamente amplias series de variaciones, incluyendo las que
permiten la creación de una red de marcadores, capaces de
amplificar considerablemente la señal de detección. En cualquier
caso, todos estos procedimientos están relacionados con la
utilización de anticuerpos como moléculas capaces de identificar
específicamente una molécula objetivo, y éstos también tienen un
nivel de sensibilidad que se encuentra limitado por la
concentración de las moléculas objetivo.
La limitación anterior se ha superado por
procedimientos establecidos más recientemente, que se basan en la
aplicación de técnicas de RCP (Reacción en Cadena de la Polimerasa)
con este objetivo, utilizados aquí en lugar de la detección de
enzimas. De hecho, estos procedimientos se basan también en la
utilización de anticuerpos monoclónicos contra un ligando
específico, que en este caso no se encuentra físicamente asociado a
alguna proteína, sino a polinucleótidos con una secuencia
conocida.
Esto hace posible el llevar a cabo detecciones
subsiguientes por la amplificación de la secuencia de ADN conocida,
la cual se logra utilizando la reacción en cadena de la polimerasa
(RCP) (V. Ruzicka et al, 1993: T. Sano et al, 1992;
H. Zhou et al, 1993).
Este procedimiento, conocido como inmuno RCP,
hace virtualmente posible detectar incluso un único enlace de
anticuerpo a la molécula objetivo. A pesar de la considerable
mejora en la sensitividad, estos métodos presentan una serie de
problemas, entre ellos la asociación directa de polinucleótidos y
anticuerpos, y el historial resultante debido a la inevitable
interferencia del polinucleótido durante el enlace del anticuerpo a
la molécula de interés.
Adicionalmente, dado que la especificidad y el
rendimiento de la reacción de amplificación dependen de la
temperatura a la que los reactivos se mezclan, es posible obtener
productos de hibridación no específicos, si el ensamblaje de la RCP
ocurre a temperaturas inferiores a las consideradas óptimas para la
hibridación de los cebadores.
Actualmente, este problema se ha resuelto por
adición de la reacción de amplificación de un reactivo esencial,
sólo después de que el sistema haya alcanzado la temperatura que
permite la hibridación específica de los cebadores de "inicio
caliente". Este procedimiento se logra por la separación mecánica
de un reactivo (D.E. Birch et al, 1996) o por la utilización
de anticuerpos para bloquear la actividad enzimática del ADN
polimerasa (J. Cheng et al, 1996).
Recientemente, se ha desarrollado un
procedimiento de RCP llevado a cabo en células, conocido como una
RCP in situ (G. J. Nuevo, 1994), en el que la amplificación
sigue a una reacción de hibridación in situ. Según este
procedimiento la plantilla de ADN y los cebadores se mantienen
físicamente separados hasta el momento de la lisis celular. Esto
tiene la ventaja de que se evitan las reacciones de hibridación no
específica (EP 524808 Hoffmann La Roche Inc.).
Además, hay una serie de patentes, todas
relacionadas con nuevos métodos de diagnóstico, que se supone que
superan muchos de los problemas típicos de los procedimientos
actuales y, consecuentemente, mejoran la amplificación de la
respuesta señal. Éstas tienen como tema principal varios
procedimientos, como la utilización de la RCP asociada con el
descubrimiento de determinadas proteínas (WO9421676); la
utilización de enzimas híbridas de ingeniería genética conjugadas
con ligandos, por ejemplo epítopes del virus HIV-1
(WO942636); la utilización de epítopes virales generados a partir
de ácidos nucleicos combinados con proteínas enlazando al antígeno
(WO9406934); la utilización de partes del ADNc viral, por ejemplo
tomado de VHC, para expresar un epítope viral conectado a una
secuencia de control y a un anticuerpo monoclónico dirigido contra
el epítope. En el caso anterior, la región de interés del ADNc
permite llevar a cabo controles de referencia cruzada entre la
respuesta del anticuerpo y lo que resulta después de la hibridación
con el ADN (EP388232).
Por otra parte, hay una patente que trata sobre
la construcción de una biblioteca de determinantes antigénicos,
obtenidos por la digestión con ADNasa-I del genoma
de un virus, por ejemplo HIV, seguido por la expresión de los
fragmentos obtenidos por medio de un vector apropiado y la selección
subsiguiente de los mencionados productos de expresión por la
utilización de los anticuerpos (EP373070).
En este contexto, el valor de la presente
invención consiste en tener como asunto principal un procedimiento
extremadamente versátil, que se puede utilizar en una amplia gama
de diferentes situaciones y propósitos, según los procedimientos
que permiten resolver varios problemas presentes en esta
técnica.
El procedimiento según la invención no presupone
la producción de anticuerpos específicos, sino la utilización de
fagos filamentosos recombinantes que se exhiben en la cápside de
una molécula capaz de interaccionar con la molécula de interés en
la mezcla a examinar.
Esto también permite, cuando un fago se encuentra
exhibiendo una molécula adecuada, la detección de la presencia de
cualquier tipo de molécula de interés (no simplemente aminoácidos),
incluso si la molécula en cuestión se encuentra presente en
cantidades infinitesimales, en muestras biológicas de varios
orígenes (no sólo en muestras tomadas del cuerpo humano o del cuerpo
de animales, sino también de muestras de otros tipos, por ejemplo
agua, bebidas o sustancias alimenticias). La combinación de las
operaciones que forman el sujeto de la invención también se
encuentra articulada para eliminar el riesgo de asociación no
específico entre ADN, reactivos y el entorno consecuente, que puede
comprometer la claridad de los resultados.
Estas ventajas son una consecuencia del hecho de
que el ADN utilizado para detectar por la RCP no se encuentra
directamente expuesto a los reactivos, sino que se encuentra dentro
de los fagos recombinantes empleados.
La presencia de la cápside proteica envolvente
previene que el ADN utilizado para la detección subsecuente
interfiera durante la reacción enlazante entre la molécula ligando
(la expuesta en la cápside) y la molécula receptora (la de interés
en la muestra).
A continuación, después de la interacción entre
la molécula ligando y la molécula receptora, se llevan a cabo
operaciones adecuadas de lavado para eliminar los fagos que no se
han enlazado por interacción específica al receptor. Finalmente,
las secuencias de nucleótido del ADN del fago se amplifican
añadiendo los reactivos necesarios según el proceso que evita el
inconveniente de la falta de especificidad. De hecho, el ADN que va
a ser amplificado permanece protegido durante las etapas iniciales
por las proteínas de la cápside del fago, que sólo se
desnaturalizan en el momento en el que comienza la reacción de
polimerización.
Una ventaja adicional deriva del hecho de que el
fagómido recombinante básico, utilizado para construir los fagos
receptores, lo secreta principalmente la E. Coli como una
partícula conteniendo una única cadena de ADN. De hecho, esto se
conoce en la técnica como la utilización de la RCP en un modelo de
ADN de cadena única y proporciona mejores resultados que el llevado
a cabo en un ADN de cadena doble.
La invención se clarificará en más detalle con
referencias a las figuras del anexo.
La figura 1 muestra el resultado de la
amplificación del ADN de un fago P787, exhibiendo en la superficie
de la cápside un péptido capaz de enlazar anticuerpos
anti-VHC. La visualización se ha realizado con
fluorescencia UV en gel de agarosa conteniendo bromuro de etidio. M
es una referencia a los pesos moleculares obtenidos por hidrólisis
del ADN plásmido pUC19 con la enzima de restricción Hinf I.
La figura 2 muestra el resultado de la
amplificación del ADN de una mezcla de fagos después de su
incubación con los sueros C17 y C22 de pacientes cuyo suero
contiene anticuerpos anti-VHC. La visualización se
ha realizado con fluorescencia UV en gel de agarosa conteniendo
bromuro de etidio. PC89 es el fago no recombinante con el que se
construyó la biblioteca de fagos, utilizada aquí como control
negativo.
La figura 3 muestra el resultado de la
amplificación del ADN de la misma mezcla de fagos utilizada en la
figura 2, después de incubarla con los sueros N57 y N60 de dos
voluntarios, cuyo suero no contiene anticuerpos
anti-VHC y los cuales se consideran, por lo tanto,
controles negativos. La visualización se ha realizado con
fluorescencia UV en gel de agarosa conteniendo bromuro de etidio.
P89 es un fago de control negativo descrito anteriormente en el
ejemplo 1. M es una referencia a los pesos moleculares obtenidos al
hidrolizar el ADN plasmídico pUC19 con la enzima de restricción
Hinf I.
El tema principal de la presente invención es un
procedimiento para la determinación y medida de la presencia de
ciertas moléculas de interés, también llamadas en este contexto
moléculas receptoras, sobre la base de su habilidad para que se
puedan reconocer específicamente al menos por una molécula
determinada, conocida aquí como molécula ligando, que se expone en
la cápside del fago.
Es necesario resaltar como en la presente
descripción los conceptos de molécula ligando y molécula receptora
son estrictamente interdependientes, y estrictamente enlazados al
contexto de trabajo específico. Como consecuencia de esto, una
molécula expuesta a la superficie de la cápside se define como
"ligando" sólo bajo la base de su habilidad para enlazarse
específicamente a la molécula que presumiblemente se encuentra en
la muestra, la presencia o concentración que se va a medir, que se
define por lo tanto como "receptor" y viceversa.
En la presente invención, toda molécula obtenida
a partir de fluidos biológicos, superficies de células o tejidos, se
considera que es un "receptor" si su presencia se puede
identificar por medio de interacción con un "ligando"
específico como se ha definido anteriormente. Por ejemplo, los
anticuerpos capaces de reconocer claramente antígenos identificados
(tales como antígenos virales, antígenos tumorales o antígenos
presentes en tejidos normales), o antígenos a los que no se ha
identificado su naturaleza molecular exacta, perteneciendo a la
categoría de "ligandos", aunque ahora no se encuentren solos
en esa categoría. En este caso, a estos antígenos se les considerará
"receptores". Estas definiciones están conectadas, por
ejemplo, al caso en el que la presencia y/o concentración de estos
antígenos en los fluidos biológicos o en las superficies de las
células y tejidos sometidas a examen es una indicación con valor de
diagnóstico. De todas formas, según el procedimiento de acuerdo con
la presente invención, los antígenos se pueden utilizar como
"ligandos" en el caso de que la molécula receptora de interés,
la presencia o la concentración que es necesario determinar, estén
formadas por anti-
cuerpos.
cuerpos.
De la misma forma se puede considerar a los
"receptores", si son de interés, incluso receptores
específicos presentes en la membrana de las células sencillas o de
las células en tejidos, junto con los receptores solubles presentes
en fluidos biológicos, que en este caso los detectarán moléculas
capaces de enlazarse específicamente con ellos actuando como
"ligandos". Obviamente, también se puede invertir la relación
cuando las moléculas de interés no se encuentran formadas por
receptores de membrana (que en este caso actúan como
"ligandos"), excepto para sus ligandos específicos (que en este
caso se considerarán "receptores").
Por lo tanto se puede entender que se puede
incluir dentro de la categoría de "receptores" a toda molécula
cuya presencia en la muestra a examinar sea susceptible de tener un
valor de diagnóstico y/o pronóstico (después de haber verificado su
asociación con la presencia de una patología específica) o es de
interés para cualquier propósito.
Las muchas aplicaciones de este procedimiento son
bastante evidentes, particularmente en los campos médico y
veterinario, pero también en otros campos como por ejemplo
alimentación y medio ambien-
te.
te.
Este procedimiento se ha redactado a continuación
de la verificación por parte de los inventores de la posibilidad de
utilizar bacteriófagos filamentosos, bien recombinantes o no
recombinantes, para detectar la interacción entre un "ligando"
y una molécula receptora presente en la muestra, incluso a
concentraciones extremadamente bajas, por amplificación de
secuencias de nucleótidos específicos presentes en el genoma del
fago y asociadas con el ligando, bien de forma física bien de forma
genética.
De forma breve, se puede decir que el
procedimiento según la invención se puede aplicar constantemente y
en él es posible identificar:
A) una molécula receptora o una clase homogénea
de "receptores" formando un grupo, la presencia de lo que está
relacionado con una cierta patología en fluidos biológicos o en
superficies de células o en tejidos o en todos casos tiene un
interés considerable para, por ejemplo, propósitos de
diagnóstico;
B) un "ligando" o una clase de
"ligandos", por ejemplo de tipo polipéptido, cuya estructura
les permita estar expuestos en la cápside de los bacteriófagos,
manteniendo la habilidad para enlazarse específicamente a la
molécula receptora.
El tema principal de la presente invención es por
lo tanto un procedimiento basado esencialmente en las siguientes
operaciones:
a) inmovilizar las moléculas de interés sin
destruir la habilidad para que estas moléculas interaccionen con las
moléculas expuestas en las superficies del fago;
b) lograr que una molécula de interés,
inmovilizada como se ha descrito anteriormente, se enlace
específicamente con al menos uno de los bacteriófagos filamentosos
recombinantes, los cuales tienen internamente una molécula de ADN
de cadena única cuya secuencia se conoce al menos parcialmente, y
exponiendo a las superficies de la cápside al menos una molécula
capaz de enlazarse específicamente con al menos una molécula de
interés presente en la muestra biológica;
c) separar el complejo
molécula-bacteriófago obtenido de esta forma en la
reacción de mezcla;
d) lavar para eliminar los complejos generados
por interacción no específica entre la molécula y el
bacteriófago;
e) añadir los reactivos para llevar la cabo la
operación descrita en g) más adelante;
f) lisis de proteínas formando la cápside de
proteínas de los bacteriófagos seleccionados de esta forma;
g) amplificación del ADN obtenido como se explica
arriba por la reacción en cadena de al polimerasa (RCP);
h) detección del ADN amplificado como se describe
anteriormente, por ejemplo utilizando procedimientos
convencionales.
Los procedimientos para detectar el ADN
amplificado pueden ser por ejemplo electroforesis en gel de agarosa
en presencia de bromuro la etidio, electroforesis capilar,
hibridación para radioactividad específica marcada o sondas
luminiscentes.
En particular, la operación indicada en g), que
es una amplificación del ADN del fago, se lleva a cabo utilizando
técnicas de la RCP, utilizando un par de oligonucleótidos de los
que al menos uno es complementario de una secuencia conocida del
ADN del fago. Además, se ha encontrado que utilizando un protocolo
para la lisis de las proteínas de la cápside del fago a la
temperatura a la que ocurre la desnaturalización del ADN, lo cual
normalmente cae dentro del rango de 93-96ºC, el
contacto entre los cebadores y el modelo de ADN ocurre a la misma
temperatura, obteniendo de esta forma un "inicio caliente" de
la RCP, con la eliminación virtual consecuente de los productos de
reacción no específicos.
Una aplicación importante de este método es
cuando las moléculas de interés son anticuerpos.
Otra aplicación específica es cuando la
eliminación de las moléculas de interés se lleva a cabo en fase
sólida. En este caso, la eliminación se logra por adsorción pasiva
y/o por la utilización de anticuerpos específicos para las
moléculas en si.
En todo caso, la inmovilización se puede lograr
con la utilización de bacterias y de al menos una de las proteínas
bacterianas seleccionadas del grupo que comprende proteína A de
estafilococos aureus, proteína G de estreptococos del grupo C y
otras proteínas bacterianas capaces de enlazarse a las
inmunoglobulinas animales.
Otras aplicaciones de interés particular de este
procedimiento son aquellas en las que los bacteriófagos utilizados
aparecen en las superficies de la cápside viral de los antígenos,
autoantígenos (antígenos que se pueden presentar en el animal y que
son las fuentes de los fluidos biológicos), alergénicos, receptores
de membranas celulares, partes de dichas moléculas o oligopéptidos
capaces de imitar su presencia en los fluidos biológicos sometidos
a examen, así como en receptores de membranas de células
específicas o en péptidos derivados de éstos, o en ligandos del
tipo aminoácido cuyo receptor se encuentra presente en los fluidos
a probar.
Entre los aspectos fundamentales de este
procedimiento se encuentra en primer lugar el hecho de que los
instrumentos empleados para la detección son siempre bacteriófagos
filamentosos, generalmente del tipo recombinante M13, f1 o fd, los
cuales hacen posible la exposición a la cápside de una o más
moléculas, preferentemente de tipo aminoácido, que actúan como
"ligandos" capaces de interactuar específicamente con el
"receptor" que se va a probar. Esto forma un primer elemento
de originalidad, teniendo en cuenta que ya no existe la utilización
directa de moléculas ligando, sino fagos que contienen
"ligandos" apropiados naturalmente seleccionados, sus partes o
sus imitaciones.
La presente invención se distingue de otros
métodos de detección descritos en el pasado, tales como
inmuno-RCP, en que un anticuerpo se enlaza
artificialmente a una molécula de polinucleótido con una secuencia
conocida utilizada como sonda, en el hecho de que en esta invención
la información genética contenida dentro del fago se utiliza para
determinar la presencia de una molécula de interés.
Además, la habilidad para utilizar
simultáneamente diferentes fagos hace posible detectar
simultáneamente diferentes partes de una molécula de interés, o
incluso varias moléculas de interés.
De todas formas, la característica principal es,
por encima de toda otra consideración, la asociación del
"ligando" expuesto en las superficies del fago y del ADN del
fago, utilizado por detección de la RCP. Ésta puede estar formada
por la información genética codificada para el "ligando", pero
también y más generalmente de una secuencia de nucleótidos del
genoma del fago.
Como consecuencia de este procedimiento de la
invención, también es posible seleccionar las secuencias de
nucleótidos asociadas con el "ligando" que se van a utilizar
para la detección, de tal forma que aumente la especificidad y
disminuya el tiempo de reacción de amplificación. Efectivamente,
para conseguir la RCP, la secuencia de los cebadores
oligonucleótidos, la duración y la temperatura a la que tiene lugar
cada incubación junto con el número de ciclos en cada reacción, se
pueden preseleccionar en este momento con el fin de obtener
amplificaciones extremadamente rápidas y altamente específi-
cas.
cas.
Efectivamente, debido a su naturaleza, la
información genética presente dentro del fago y utilizada para la
detección es particularmente propensa a su amplificación utilizando
procedimientos actuales de RCP, los cuales hacen posible resaltar
la presencia de incluso una única molécula de ADN en el tubo de
ensayo en el que ocurre la reacción. La sensitividad que se puede
obtener utilizando la reacción en cadena de la polimerasa no se
puede alcanzar fácilmente utilizando otros métodos de detección
actualmente en
uso.
uso.
Otra ventaja adicional que resulta de lo anterior
se encuentra conectada al hecho de que las sondas del
oligonucleótido utilizadas para la amplificación se pueden diseñar
para proporcionar una amplificación específica de una secuencia
particular presente en el fago, incluso con la presencia del ADN de
otros fagos que no lo incluyen. Por ejemplo, es posible diseñar las
sondas para que se amplifique solamente el ADN de los fagos que
contienen una inserción específica (por ejemplo la que codifica la
molécula que actúa como "ligando" cuando se expone en la
cápside), incluso con la presencia del ADN de los fagos que no
contienen esta inserción o que contienen inserciones con una
secuencia diferente. La consecuencia más directa de esto es que es
posible que reaccione la molécula receptora (o las moléculas
receptoras) sometidas a examen con una mezcla de diferentes fagos y
se identifique el enlace con cada tipo de fago, e incluso con la
presencia de otros.
Además, el hecho de que el ADN esté contenido
dentro de la cápside proteica permite solucionar una de las
limitaciones de la especificidad típica de las detecciones de los
procedimientos de la RCP. Esta limitación es la necesidad de situar
la plantilla de ADN en contacto con las sondas de amplificación a
una temperatura relativamente baja, según la secuencia de los dos
cebadores. Cuando se alcanza la temperatura para empezar el primer
ciclo de amplificación, parte del ADN permanece acomplejado a la
sonda y esto resulta en una elongación no específica de la sonda en
la plantilla de ADN. Para remediar este problema se han propuesto
varios procedimientos (4, 5). El procedimiento de la presente
invención, como se ha mencionado anteriormente, permite resolver
eficientemente el problema haciendo uso del hecho de que se utilice
un ADN natural dentro de una cápside, lo que permite que este ADN
esté protegido del contacto con las sondas específicas hasta el
momento de la lisis de la cápside. En este sentido, se puede
obtener una especificidad extremadamente alta simplemente
perfeccionando el procedimiento y utilizando un protocolo de lisis
termal, que permite el contacto entre el ADN y la sonda específica
sólo a altas
temperaturas.
temperaturas.
De este modo, llevando a cabo la realización de
forma simple y práctica, es posible obtener lo que técnicamente se
conoce como un "inicio caliente" de la RCP.
Hasta este momento se ha proporcionado una
descripción general de la presente invención. A partir de ahora se
va a proporcionar una descripción más detallada de las formas de
realización específicas con los siguientes ejemplos, siempre
teniendo presente el proporcionar un mejor entendimiento de los
objetos, características, ventajas y procedimientos operativos de
la invención. Estos ejemplos son meramente ilustrativos y en ningún
caso limitan el alcance de la presente invención, la cual se define
en las reivindicaciones adjuntas.
El siguiente procedimiento se ha utilizado según
la invención:
En los pocillos de una placa de policarbonato de
96 pocillos, actualmente utilizada para los procedimientos de RCP
(Thermowell-II^{TM} tipo 6509 producido por
Costar) se absorbieron varias cantidades de inmunoglobulina
goat-anti-IgG humana, específica
para la porción Fc. Después de la incubación, la placa se lavó con
una disolución reguladora de fosfato salino, y las zonas de
absorción de residuos se bloquearon por incubación en una disolución
reguladora en la que se suspendió leche desnatada en polvo (como se
describe en la documentación al respecto). En los pocillos de la
placa se distribuyó lo que se preparó de la siguiente forma: 1)
cantidades del suero humano a probar diluido en varios niveles; en
este ejemplo se utilizaron los tipos de suero humano C17 y C22 de
pacientes infectados con el VHC y que contenían anticuerpos
anti-VHC. De individuos sanos se obtuvieron los
tipos de suero N57 y N60, en los que no se encontraron anticuerpos
anti-VHC. Las cantidades de estos sueros se
mezclaron con un fago de tipo no recombinante, que actúa como un
transportador no específico. Se añadió también un fago recombinante
2A, que se puede amplificar en la RCP pero que no exhibe el ligando
específico en la cápside, en este ejemplo, los péptidos capaces de
enlazarse a los anticuerpos anti-VHC humanos; y
alternativamente 2B el fago VHC específico P787.
Después de la incubación a 37ºC durante 90
minutos, la placa se vació y se lavó con una disolución reguladora
de fosfato para eliminar todos los fagos recombinantes que no se
enlazaron específicamente. Después se añadió a cada pocillo, que
contenía una disolución reguladora adecuada para la RCP, una mezcla
que contenía sondas de ADN específicas para amplificación, el Taq de
la polimerasa y dioxinucleótidos trifosfato. La placa se transfirió
a una incubadora térmica para que la RCP y el proceso continuaran
con los ciclos de reacción que empezaron con el calentamiento a
95ºC durante 5 minutos. Este paso es particularmente importante ya
que sólo a esta temperatura ocurre la lisis de las proteínas del
fago y consecuentemente también ocurre el contacto de las sondas
específicas con el ADN a amplificar. La RCP empieza a altas
temperaturas (inicio caliente) y continua con 25 ciclos de 10
segundos a 94ºC y 10 segundos a 72ºC. La reacción termina con 2
minutos de incubación a 72ºC.
El ADN del fago P787 amplificado de esta forma se
resalta por electroforesis en gel de agarosa que contiene bromuro
de etidio, tal como aparece en el ejemplo específico de la figura
1.
Para diagnosticar la presencia de anticuerpos
anti-VHC en un suero se utilizó una composición con
varios fagos específicamente seleccionados, cada uno de ellos
conteniendo réplicas de diferentes regiones proteicas del virus de
la hepatitis C humana. Debido a que los fagos se pueden distinguir
según la secuencia que llevan, pero también y de forma más sencilla
por la longitud de su inserción, es posible observar la
amplificación de fragmentos de ADN de diferentes longitudes en el
gel de agarosa según las dimensiones de la inserción del ADN del
fago.
En este ejemplo se muestra como, utilizando una
mezcla de fagos, es posible obtener una respuesta en gel de agarosa
de la forma que se describe en el ejemplo 1. El ejemplo muestra que
una mezcla de fagos es más predecible que la utilización de un
único
fago.
fago.
Es sorprendente que en un suero sea posible
identificar anticuerpos de antígenos diferentes, y que la respuesta
de amplificación sea específica. El resultado que aparece en las
figuras 2 y 3 consiste en una respuesta que se puede analizar por
electroforesis, como se describió anteriormente en el ejemplo
1.
1.
En este ejemplo se describe un procedimiento en
el que se inmoviliza el receptor de IL-6 en una
placa y los fagos que expresan el IL-6 se utilizan
para detectar la presencia de los mismos en medios de cultivo
extracelulares.
El código del ADNc humano para el
hIL-6 se combinó con el amino terminal final del
gen III de un fagómido obtenido de M13, como se describe en la
documentación al respecto. El fago
hIL-6/M13-pIII recombinante se puede
utilizar para detectar la presencia del receptor de la
interleuquina-6 humana. Técnicamente se ha
proporcionado una descripción de cómo es posible seleccionar un fago
que exprese el hIL-6 que es capaz de enlazar in
vitro a los anticuerpos hIL-6/R y
anti-hIL-6, tal como se describe en
la documentación al respecto. Se ha probado que el reconocimiento
es posible y más efectivo si se utiliza el procedimiento descrito
en la presente
invención.
invención.
En un soporte sólido, por ejemplo en una perla de
plástico, se fijó 1 \mug de anticuerpos
anti-hIL-6 monoclonales en 10 mM de
NaCO_{3} a pH 9,2 y se incubó a 4ºC durante la noche. Después de
bloquear las perlas en 1 ml de TBS/6% BSA durante 4 horas a 4ºC,
éstas se incubaron durante la noche con hIL-6 a 4ºC.
Las perlas se lavaron dos veces con 2 ml de TBST y a continuación
se incubaron durante 1 hora en 1 ml de TBST/0,1% BSA a 20ºC. A
continuación los fagos se extrajeron con 500 \mul de 100 mM de
glicina con HCl a pH 2,2 y la extracción se neutralizó con 3M Tris
HCl pH 8,9. Los fagos enlazados a los anticuerpos se pudieron
detectar por la RCP de la forma que se describe en la invención.
Se describe un procedimiento en el que receptor
IL-6 humano, expresado en células cancerígenas
ováricas diseñadas, se detecta según el procedimiento descrito en
la presente invención y es posible cuantificarlo utilizando fagos
capaces de expresar el IL-6 o los superantagonistas
del IL-6.
Una línea celular CHO (CsRh14) es capaz de
secretar una forma soluble del receptor de la
interleuquina-6 (ref). Utilizando 100 \mul de
tosil activado Dynabeads M450 (unipath) se preparó la forma
concentrada, utilizando un concentrador de partículas magnéticas,
lavado con 50 mM de borato de sodio a pH 9,5 e incubándolo durante
24 horas a 25ºC en 400 \mul de la misma disolución reguladora,
que contiene 15 \mug de anticuerpos
anti-hIL-6R\alpha. Después de
saturar el paso en TBS/0,1%BSA durante 12 horas a 4ºC, las perlas se
incubaron durante 4 horas a 25ºC con 400 \mul de un medio
condicionado sin contener suero, obtenido de la línea CsRh14,
conteniendo 250 ng de shIL-6R\alpha. Después de
lavar las perlas varias veces, a las que se enlazó el
shIL-6R\alpha, éstas se incubaron con fagos
expresando hIL-6 (en un ratio de 1:4) durante 16
horas a 4ºC. El volumen de reacción se llevó hasta 1 ml añadiendo
una cantidad apropiada de TBS/0,1%BSA. Las perlas se lavaron 3
veces con 1 ml de TBST y los fagos se extrajeron en 400 ml de 100
mM de disolución reguladora de citrato a pH 3,2. Después de la
neutralización con 3M Tris CHl Ph 8,9, los fagos enlazados se
detectaron por amplificación de la RCP, según la naturaleza de la
presente
invención.
invención.
1. V. Ruzicka, W. Marz, A.
Russ and W. Gross: 1993 Science 260,
698-699.
2. T. Sano, C.L. Smith, C.R.
Cantor: 1992 Science 258,
120-122.
3. H. Zhou, R.J. Fischer and T.S.
Papas: 1993 Nucl. Ac. Res. 21,
6038-3039.
4. D.E. Birch, L. Kolmodin, J.
Wong, G.A. Zangenberg and M.A. Zoccoli:
1996 Nature 381, 445-446.
5. J. Cheng, M.A. Shoffner, G.E.
Hvichia, L.J. Kricka and P. Wilding:
1996 Nucl. Ac. Res. 24, 380-385.
6. G.J. Nuovo PCR in situ
hybridization, Protocols and applications. Rower Press
1994.
Claims (14)
1. Un procedimiento para la detección de la
presencia de moléculas de interés en muestras biológicas,
comprendiendo las siguientes operaciones:
a) inmovilizar las moléculas de interés sin
destruir la habilidad para que estas moléculas interaccionen con las
moléculas expuestas en las superficies del fago;
b) hacer que una molécula de interés,
inmovilizada como se ha descrito anteriormente, se enlace
específicamente con al menos uno de los bacteriófagos filamentosos
recombinantes, los cuales tienen internamente una molécula de ADN
de cadena única cuya secuencia se conoce al menos parcialmente, y
exponiendo a las superficies de la cápside al menos una molécula
capaz de enlazarse específicamente con al menos una molécula de
interés presente en la muestra biológica;
c) separar el complejo
molécula-bacteriófago obtenido de esta forma en la
reacción de mezcla;
d) lavar para eliminar los complejos generados
por interacción no específica entre la molécula y el
bacteriófago;
e) añadir los reactivos para llevar la cabo la
operación descrita en g) más adelante;
f) lisis de proteínas formando la cápside de
proteínas de los bacteriófagos seleccionados de esta
forma;
forma;
g) amplificación del ADN obtenido como se explica
arriba por la reacción en cadena de al polimerasa (RCP);
h) detección del ADN amplificado como se describe
anteriormente.
2. El procedimiento para la detección de la
presencia de moléculas de interés en muestras biológicas según la
reivindicación 1, en el que la operación indicada en f) se lleva a
cabo a la temperatura en la que la ocurre la desnaturalización del
ADN, que forma un paso de la operación siguiente indicada en g), es
inmediatamente seguida de lisis de la cápside proteica y ocurre a la
misma temperatura, logrando así un "inicio caliente" de la
RCP.
3. El procedimiento para la detección de la
presencia de moléculas de interés en muestras biológicas según
alguna de las reivindicaciones 1 ó 2, en el que las moléculas de
interés son anticuerpos.
4. El procedimiento para la detección de la
presencia de moléculas de interés en muestras biológicas según
alguna de las reivindicaciones 1 a 3, en el que las moléculas de
interés se inmovilizan en fase
sólida.
sólida.
5. El procedimiento para la detección de la
presencia de moléculas de interés en muestras biológicas según la
reivindicación 4, en el que la inmovilización en la fase sólida de
las moléculas de interés ocurre por absorción pasiva.
6. El procedimiento para la detección de la
presencia de moléculas de interés en muestras biológicas según la
reivindicación 4, en el que la inmovilización de las moléculas de
interés en la fase sólida ocurre por la utilización de anticuerpos
específicos a las moléculas.
7. El procedimiento para la detección de la
presencia de moléculas de interés en muestras biológicas según la
reivindicación 3, en el que la inmovilización de las moléculas en
la fase sólida ocurre por la utilización de bacterias o por la
utilización de al menos una de las proteínas bacterianas
seleccionadas del grupo que comprende proteína A de estafilococos
aureus, proteína G de estreptococos del grupo C y otras proteínas
de bacterias capaces de enlazarse a la inmunoglobulina animal.
8. El procedimiento para la detección de la
presencia de moléculas de interés en muestras biológicas según
alguna de las reivindicaciones 1 a 7, en el que los bacteriófagos
aparecen en las superficies de la cápside viral de los antígenos,
partes de éstos o oligopéptidos capaces de imitar los efectos de su
presencia en los fluidos biológicos bajo examen.
9. El procedimiento para la detección de la
presencia de moléculas de interés en muestras biológicas según
alguna de las reivindicaciones 1 a 7, en el que los bacteriófagos
aparecen en las superficies de la cápside de los autoantígenos,
partes de éstos o oligopéptidos capaces de imitar los efectos de su
presencia en los fluidos biológicos bajo examen.
10. El procedimiento para la detección de la
presencia de moléculas de interés en muestras biológicas según
alguna de las reivindicaciones 1 a 7, en el que los bacteriófagos
aparecen en las superficies de la cápside de los alergenos, partes
de éstos u oligopéptidos capaces de imitar los efectos de su
presencia en los fluidos biológicos bajo examen.
11. El procedimiento para la detección de la
presencia de moléculas de interés en muestras biológicas según
alguna de las reivindicaciones 1 a 7, en el que los bacteriófagos
aparecen en las superficies de la cápside de los receptores de
membrana celular, partes de los mencionados receptores u
oligopéptidos capaces de imitar la actividad biológica de
éstos.
12. El procedimiento para la detección de la
presencia de moléculas de interés en muestras biológicas según
alguna de las reivindicaciones 1 a 7, en el que los bacteriófagos
aparecen en las superficies de la cápside de los receptores de
membrana celular específica o en los péptidos que derivan de
éstos.
13. El procedimiento para la detección de la
presencia de moléculas de interés en muestras biológicas según
alguna de las reivindicaciones 1 a 7, en el que los bacteriófagos
aparecen en las superficies de la cápside de los ligandos con
naturaleza de aminoácidos cuyo receptor se supone que está presente
en los fluidos a probar.
14. El procedimiento para la detección de la
presencia de moléculas de interés en muestras biológicas según
alguna de las reivindicaciones 1 a 7, en el que los bacteriófagos
aparecen en las superficies de la cápside junto con:
- a)
- antígenos virales, partes de éstos u oligopéptidos capaces de imitar los efectos de su presencia en los fluidos biológicos bajo examen (según la reivindicación 8),
- b)
- autoantígenos, partes de éstos u ligopéptidos capaces de imitar los efectos de su presencia en los fluidos biológicos bajo examen (según la reivindicación 9),
- c)
- alergenos, partes de éstos ú oligopéptidos capaces de imitar los efectos de su presencia en los fluidos biológicos bajo examen (según la reivindicación 10),
- d)
- receptores de membrana celular, partes de los mencionados receptores u oligopéptidos capaces de imitar la actividad biológica de éstos (según la reivindicación 11),
- e)
- receptores de membrana celular específica o péptidos que derivan de éstos (según la reivindicación 12), y/o
- f)
- ligandos con naturaleza de aminoácidos cuyo receptor se supone que está presente en los fluidos a probar (según la reivindicación 13).
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|---|---|---|---|
| IT97RM000304A IT1291913B1 (it) | 1997-05-22 | 1997-05-22 | Metodo che prevede l'uso di batteriofagi per la rivelazione della presenza di molecole di interesse in campioni biologici |
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|---|---|---|---|
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Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES2325825A1 (es) * | 2008-03-17 | 2009-09-18 | Consejo Superior De Investigaciones Cientificas (Csic) (75%) | Procedimiento y sistema para dectectar y/o cuantificar bacteriofagos susceptibles de infectar una cepa huesped bacteriana predeterminada, uso de un dispositivo micrelectronico sensor para detectar dichos bacteriofagos y dispositivos microelectronico sensor para llevar a cabo dich. |
Families Citing this family (29)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2334170A1 (en) | 1998-07-27 | 2000-02-10 | Genentech, Inc. | Improved transformation efficiency in phage display through modification of a coat protein |
| GB9912743D0 (en) * | 1999-06-02 | 1999-08-04 | Proteome Sciences Plc | Method and kit for ligand assay |
| US20020192676A1 (en) * | 2001-06-18 | 2002-12-19 | Madonna Angelo J. | Method for determining if a type of bacteria is present in a mixture |
| DE10129815A1 (de) * | 2001-06-24 | 2003-01-09 | Profos Ag | Verfahren zur Aufreinigung von Bakterienzellen und Zellbestandteilen |
| US20050003346A1 (en) * | 2002-04-12 | 2005-01-06 | Colorado School Of Mines | Apparatus and method for detecting microscopic living organisms using bacteriophage |
| JP4490112B2 (ja) * | 2002-04-12 | 2010-06-23 | コロラド・スクール・オブ・マインズ | 標的細菌性細胞を感染させるためにファージを使用する低濃度の標的細菌を検出するための方法 |
| US8216780B2 (en) * | 2002-04-12 | 2012-07-10 | Microphage (Tm) Incorporated | Method for enhanced sensitivity in bacteriophage-based diagnostic assays |
| GB0304832D0 (en) | 2003-03-04 | 2003-04-09 | Secr Defence | Assay method |
| AU2004250256B8 (en) * | 2003-06-20 | 2010-04-08 | Ambit Biosciences Corporation | Assay and kits for detecting protein binding |
| US20050250096A1 (en) * | 2004-02-13 | 2005-11-10 | Microphage, Incorporated | Microorganism detection using bacteriophage amplification |
| WO2006105504A1 (en) * | 2005-03-31 | 2006-10-05 | Microphage Incorporated | Apparatus and method for detecting microorganisms using flagged bacteriophage |
| US20110097702A1 (en) * | 2005-03-31 | 2011-04-28 | Voorhees Kent J | Methods and compositions for in situ detection of microorganisms on a surface |
| US20070178450A1 (en) * | 2006-01-27 | 2007-08-02 | Microphage (Tm) Incorporation | Method and apparatus for determining level of microorganisms using bacteriophage |
| CN100386628C (zh) * | 2006-04-21 | 2008-05-07 | 中国科学院武汉病毒研究所 | 噬菌体免疫pcr检测病原的方法 |
| JP2010508044A (ja) * | 2006-10-31 | 2010-03-18 | マイクロファージ・インコーポレーテッド | 潜在的に交差反応性の生物の選択阻害による、強化されたバクテリオファージベース診断アッセイの方法及び装置 |
| US8455186B2 (en) | 2007-06-15 | 2013-06-04 | MicroPhage™ Incorporated | Method of detection of microorganisms with enhanced bacteriophage amplification |
| US8697434B2 (en) * | 2008-01-11 | 2014-04-15 | Colorado School Of Mines | Detection of phage amplification by SERS nanoparticles |
| US9441204B2 (en) * | 2008-04-03 | 2016-09-13 | Colorado School Of Mines | Compositions and methods for detecting Yersinia pestis bacteria |
| WO2010123626A1 (en) | 2009-04-24 | 2010-10-28 | University Of Southern California | Cd133 polymorphisms and expression predict clinical outcome in patients with cancer |
| WO2011084757A1 (en) | 2009-12-21 | 2011-07-14 | University Of Southern California | Germline polymorphisms in the sparc gene associated with clinical outcome in gastric cancer |
| WO2011085334A1 (en) | 2010-01-11 | 2011-07-14 | University Of Southern California | Cd44 polymorphisms predict clinical outcome in patients with gastric cancer |
| JP2014063220A (ja) * | 2012-09-19 | 2014-04-10 | Sharp Corp | 情報処理装置、情報処理装置の制御方法、制御プログラム、および記録媒体 |
| WO2014150870A2 (en) | 2013-03-15 | 2014-09-25 | Altria Client Services Inc. | Bacteriophage and methods of making and using |
| WO2016123427A1 (en) | 2015-01-29 | 2016-08-04 | Altria Client Services Llc | Bacteriophage and methods of using |
| WO2016123425A1 (en) | 2015-01-29 | 2016-08-04 | Altria Client Services Llc | Endolysin from bacteriophage against geobacillus and methods of using |
| FR3100819B1 (fr) | 2019-09-18 | 2024-04-19 | Centre Nat Rech Scient | Production et fonctionnalisation de nanoparticules dérivées du phage T5 et utilisations thérapeutiques |
| CN113265489B (zh) * | 2021-06-01 | 2021-12-14 | 广州医科大学 | 一种基于ms2噬菌体研究蛋白相互作用的新方法 |
| CN115537456A (zh) * | 2022-08-01 | 2022-12-30 | 北京中医药大学 | 噬菌体展示介导的免疫多重定量pcr方法及其重组噬菌体 |
| WO2025240660A1 (en) | 2024-05-15 | 2025-11-20 | Foresite Labs, Llc | Drug development and drug activity determination for coronary artery disease (cad) |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3590116T1 (es) * | 1984-03-19 | 1987-02-19 | ||
| US4957858A (en) * | 1986-04-16 | 1990-09-18 | The Salk Instute For Biological Studies | Replicative RNA reporter systems |
| US5077192A (en) * | 1988-10-25 | 1991-12-31 | The General Hospital Corporation | Method of detecting antigenic, nucleic acid-containing macromolecular entities |
| JPH05149949A (ja) * | 1991-11-26 | 1993-06-15 | Nisshin Flour Milling Co Ltd | 新規な微量物質測定法 |
| WO1993015229A2 (en) * | 1992-02-04 | 1993-08-05 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Amplification of assay reporters by nucleic acid replication |
| AU3776493A (en) * | 1992-02-28 | 1993-09-13 | Paul W. Judkins | Method and diagnostic kit for determination of bacteria |
| IT1270939B (it) * | 1993-05-11 | 1997-05-26 | Angeletti P Ist Richerche Bio | Procedimento per la preparazione di immunogeni e reagenti diagnostici,e immunogeni e reagenti diagnostici cosi' ottenibili. |
| IT1261693B (it) * | 1993-06-01 | 1996-05-29 | Angeletti P Ist Richerche Bio | Metodologia per la produzione di fagi filamentosi che espongono sulla superficie del capside peptidi capaci di legare la biotina, e fagi filamentosi e peptidi cosi' ottenibili. |
| US5576197A (en) * | 1995-04-07 | 1996-11-19 | Molecular Bio-Products | Polymerase chain reaction container and methods of using the same |
-
1997
- 1997-05-22 IT IT97RM000304A patent/IT1291913B1/it active IP Right Grant
-
1998
- 1998-05-22 US US09/424,302 patent/US6265169B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-05-22 DE DE69828502T patent/DE69828502T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1998-05-22 EP EP98923056A patent/EP0983386B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1998-05-22 WO PCT/IT1998/000130 patent/WO1998053100A1/en not_active Ceased
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- 1998-05-22 JP JP10550211A patent/JP3143477B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1998-05-22 IL IL13298098A patent/IL132980A0/xx unknown
- 1998-05-22 AT AT98923056T patent/ATE286540T1/de not_active IP Right Cessation
- 1998-05-22 PT PT98923056T patent/PT983386E/pt unknown
- 1998-05-22 AU AU75480/98A patent/AU733215B2/en not_active Ceased
- 1998-05-22 CA CA002290740A patent/CA2290740C/en not_active Expired - Fee Related
- 1998-05-22 EA EA199901057A patent/EA199901057A1/ru unknown
- 1998-05-22 CN CN98806434A patent/CN1261407A/zh active Pending
-
1999
- 1999-11-19 NO NO995700A patent/NO995700L/no not_active Application Discontinuation
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ES2325825A1 (es) * | 2008-03-17 | 2009-09-18 | Consejo Superior De Investigaciones Cientificas (Csic) (75%) | Procedimiento y sistema para dectectar y/o cuantificar bacteriofagos susceptibles de infectar una cepa huesped bacteriana predeterminada, uso de un dispositivo micrelectronico sensor para detectar dichos bacteriofagos y dispositivos microelectronico sensor para llevar a cabo dich. |
| WO2009115633A1 (es) * | 2008-03-17 | 2009-09-24 | Consejo Superior De Investigaciones Científicas (75%) | Procedimiento y sistema para detectar y/o cuantificar bacteriófagos susceptibles de infectar una cepa huésped bacteriana predeterminada, uso de un dispositivo microelectrónico sensor para detectar dichos bacteriófagos y dispositivo microelectrónico sensor para llevar a cabo dicho procedimiento. |
| ES2325825B1 (es) * | 2008-03-17 | 2010-06-25 | Consejo Superior De Investigaciones Cientificas (Csic) (75%) | Procedimiento y sistema para detectar y/o cuantificar bacteriofagos susceptibles de infectar una cepa huesped bacteriana predeterminada, uso de un dispositivo microelectronico sensor para detectar dichos bacteriofagos y dispositivo microelectronico sensor para llevar a cabo dicho. |
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