ES2235375T3 - Metodos, kits y composiciones relativos a balizas lineales. - Google Patents
Metodos, kits y composiciones relativos a balizas lineales.Info
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Abstract
Un polímero que comprende; a) una secuencia de nucleobases sonda no constituida por polinucleótidos para sondear una secuencia objetivo con respecto de la cual la secuencia de nucleobases es complementaria; b) al menos un resto dador de energía que está unido a la secuencia de nucleobases sonda; y c) al menos un resto aceptor de energía que está unido a la secuencia de nucleobases sonda, en el que al menos uno de los restos dadores de energía está separado de al menos uno de los restos aceptores de energía por al menos una porción de la secuencia de nucleobases sonda.
Description
Métodos, kits y composiciones relativos a balizas
lineales.
Esta invención está relacionada con el campo de
la detección, el análisis y la cuantificación de secuencias de ácido
nucleico empleando sondas. Más específicamente, esta invención se
refiere a nuevos métodos, kits y composiciones que pertenecen a las
Balizas Lineales.
La extinción de la señal de fluorescencia se
puede producir mediante Transferencia de Energía de Resonancia de
Fluorescencia "FRET" (del inglés "Fluorescence Resonance
Energy Transfer") (también conocida como transferencia de
energía no radiante; véase Yaron y col., Analytical Biochemistry
95: 228-235 (1979) en la página 232, columna 1,
líneas 32 a 39) o mediante interacciones no FRET (también conocidas
como transferencia de energía sin radiación; véase Yaron y col.,
Analytical Biochemistry 95 en la página 229, columna 2,
líneas 7 a 13). El factor crítico para la distinción entre la
extinción FRET y la no FRET es que la extinción no FRET requiere una
interacción de corto alcance por "colisión" o "contacto"
y, por tanto, no requiere un solapamiento espectral entre los
restos del par dador y aceptor (Véase: Yaron y col., Analytical
Biochemistry 95 en la página 229, columna 1, líneas 22 a 42).
Por el contrario, la extinción FRET requiere un solapamiento
espectral entre los restos dador y aceptor y la eficacia de la
extinción es directamente proporcional a la distancia entre los
restos dador y aceptor del par FRET (Véase: Yaron y col.,
Analytical Biochemistry 95 en la página 232, columna 1,
línea 46 hasta la columna 2, línea 29). En Clegg, R. M., Methods
Enzymol., 221: 353-388 (1992) y en
Selvin, P. R., Methods Enzymol., 246:
300-334 (1995) se presentan revisiones intensivas
del fenómeno FRET. Yaron y col. también sugirieron que los
principios descritos podrían ser aplicados a la hidrólisis de
oligonucleótidos (Véase: Yaron y col., Analytical Biochemistry
95 en la página 234, columna 2, líneas 14 a 18).
El fenómeno FRET ha sido utilizado para la
detección directa de secuencias objetivo de ácido nucleico sin el
requerimiento de que las sondas de hibridación o los prímeros de
ácido nucleico marcado sean separados del complejo de hibridación
ante de la detección (Véase: Livak y col., patente de EE.UU. nº
5.538.848). Perkin Elmer comercializa un método que utiliza FRET
para analizar el ácido nucleico amplificado por la Reacción en
Cadena de Polimerasa (PCR, del inglés "Polymerase Chain
Reaction") en un formato de tubo cerrado. El ensayo TaqMan®
utiliza una sonda de hibridación de ácido nucleico que está marcada
con un informador fluorescente y con un resto de extinción en una
configuración que da como resultado la extinción de la fluorescencia
en la sonda intacta. Durante la amplificación PCR, la secuencia de
sonda se hibrida de forma específica con el ácido nucleico
amplificado. Cuando está hibridaza, la actividad de exonucleasa de
la polimerasa Taq degrada la sonda, eliminando con ello la
extinción intramolecular mantenida por la sonda intacta. Debido a
que la sonda está diseñada para hibridarse específicamente con el
ácido nucleico amplificado, el aumento de la intensidad de
fluorescencia de la muestra, provocado por la degradación
enzimática de la sonda, puede correlacionarse con la actividad del
proceso de amplificación.
No obstante, este método requiere preferiblemente
que cada resto fluoróforo y de extinción esté localizado en los
extremos 3' y 5' de la sonda, de tal modo que se alcance la
relación señal-ruido óptima (Véase: Nazarenko y
col., Nucl. Acids. Res. 25: 2516-2521 (1997)
en la página 2516, columna 2, líneas 27 a 35). Sin embargo, esta
orientación necesariamente da como resultado una extinción de
fluorescencia inferior a la óptima debido a que los restos
fluoróforo y de extinción están separados en el espacio y la
transferencia de energía alcanza su máxima eficiencia cuando están
próximos. Por consiguiente, la emisión de fondo procedente de la
sonda sin hibridar puede ser bastante elevada en el ensayo TaqMan®
(Véase: Nazarenko y col., Nucl. Acids Res. 25: en la página
25, columna 2, líneas 36-40).
La Baliza Molecular de ácido nucleico es otro
constructo que utiliza el fenómeno FRET para detectar secuencias
objetivo de ácido nucleico (Véase: Tyagi y col. Nature
Biotechnology, 14: 303-308 (1996)). Una Baliza
Molecular de ácido nucleico comprende una secuencia sonda atrapada
entre dos secuencias de brazo complementario (Véase: Tyagi y col.
Nature Biotechnology, 14: 303, columna 1, líneas 22 a 30).
En cada extremo de la secuencia sonda hay bien un resto fluoróforo
o bien un resto de extinción. En ausencia del ácido nucleico
objetivo, las secuencias de brazo se enrollan unas en otras para
formar una estructura de lazo y de tallo de orquilla que pone en
contacto el fluoróforo con el resto de extinción (Véase: Tyagi y
col. Nature Biotechnology, 14: 304, columna 2, líneas 14 a
25). Cuando se ponen en contacto con el ácido nucleico objetivo, la
secuencia sonda complementaria y la secuencia objetivo se hibridan.
Debido a que el tallo de orquilla no puede coexistir con la doble
hélice rígida que se forma con la hibridación, el cambio
conformacional resultante fuerza la separación de las secuencias de
brazo y provoca que el fluoróforo y el resto de extinción se
separen (Véase: Tyagi y col. Nature Biotechnology, 14: 303,
columna 2, líneas 1 a 17). Cuando el fluoróforo y el resto de
extinción son separados, la energía del fluoróforo dador no se
transfiere al resto aceptor y entonces la señal de fluorescencia es
detectable. Puesto que las "Balizas Moleculares" no hibridadas
no son fluorescentes, no es necesario que cualquier sonda en exceso
sea eliminada del ensayo. Por consiguiente, Tyagi y col. establecen
que las Balizas Moleculares pueden ser usadas para la detección de
ácidos nucleicos objetivo en un ensayo homogéneo y en células vivas
(Véase: Tyagi y col. Nature Biotechnology, 14: 303, columna
2, líneas 15 a 77).
Las secuencias de brazos de los constructos de
Baliza Molecular de ácido nucleico descritas no están relacionadas
con la secuencia sonda (Véase: Tyagi y col. Nature
Biotechnology, 14: 303, columna 1, línea 30). Debido a que las
Balizas Moleculares de Tyagi y col. comprenden moléculas de ácido
nucleico, la formación adecuada y la estabilidad del tallo dependen
de la longitud del tallo, del contenido G:C de las secuencias de
brazo, de la concentración de sal en la que es disuelto y de la
presencia o ausencia de magnesio en el que la sonda es disuelta
(Véase: Tyagi y col. Nature Biotechnology, 14: 305, columna
1, líneas 1 a 16). Además, las Balizas Moleculares de ácido
nucleico de Tyagi y col. son susceptibles a la degradación mediante
endonucleasas y exonucleasas.
Después de la degradación de la sonda, la señal
fluorescente de fondo aumentará puesto que los restos dador y
aceptor ya no están próximos entre sí. Por lo tanto, los ensayos
que utilizan enzimas que presentan actividad de nucleasa exhibirán
un aumento continuo en la fluorescencia de fondo según se va
degradando la Baliza Molecular de ácido nucleico (Véase: Figura 7 en
Tyagi y col: los datos asociados a (\circ) y a (\Box)
demuestran que el fondo de fluorescencia, presumiblemente debido a
la degradación de la sonda, aumenta con cada ciclo de
amplificación). Adicionalmente, las Balizas Moleculares también
serán degradadas, al menos parcialmente, en las células vivas debido
a que las células contienen actividad de nucleasa activa.
Los constructos descritos por Tyagi y col. se
describen con más detalle en la patente WO95/13399 (denominada de
aquí en adelante "Tyagi2 y col."), excepto que Tyagi2 y col.
también describe que la Baliza Molecular de ácido nucleico también
puede ser bimolecular, donde se define bimolecular como sondas
unitarias de invención que comprenden dos moléculas (por ejemplo,
oligonucleótidos), en las que la mitad, o aproximadamente la mitad,
de la secuencia complemento objetivo, un miembro del par de
afinidad y un miembro del par de marca están presentes en cada
molécula (Véase: Tyagi2 et al., desde la página 8, línea 25,
hasta la página 9, línea 23). Sin embargo, Tyagi2 y col. establece
específicamente que en el diseño de una sonda unitaria para su uso
en una reacción PCR, uno debería elegir naturalmente una secuencia
complemento objetivo que no sea complementaria a uno de los
prímeros PCR (Véase: Tyagi2 y col., página 41, línea 27). Los
ensayos de la invención incluyen la detección en tiempo real y en
punto muerto de productos de cadena doble y de cadena sencilla
específicos de reacciones de síntesis de ácido nucleico, sin
embargo siempre que las sondas unitarias sean sometidas a fusión o a
otro tipo de desnaturalización, las sondas deben ser unimoleculares
(Véase Tyagi2 y col., página 37, líneas 1 a 9). Además, Tyagi2 y
col. estipulan que aunque las sondas unitarias de la invención
pueden ser usadas con amplificación o con otras reacciones de
síntesis de ácido nucleico, las sondas bimoleculares (tal como se
definen en Tyagi2 y col.) no son adecuadas para su uso en cualquier
reacción (por ejemplo, en PCR) en la que el par de afinidad sería
separado de un modo independiente del objetivo (Véase: Tyagi2 y
col., página 13, líneas 9 a 12). Ni Tyagi y col. ni Tyagi2 y col.
describen, sugieren o muestran nada acerca de PNA.
En una contribución más reciente se han descrito
los constructos de horquilla modificados que son similares a las
Balizas Moleculares de ácido nucleico de Tyagi y col., pero que son
adecuados como prímeros para la extensión de polimerasa (Véase:
Nazarenko y col., Nucleic Acids Res. 25:
2516-2521 (1997)). También se describe un método
adecuado para la detección directa de ADN amplificado mediante PCR
es un sistema cerrado. De acuerdo con el método, los constructos de
prímero de Nazarenko y col. son incorporados, mediante operación del
proceso PCR, en el producto de amplificación. La incorporación al
producto amplificado mediante PCR da como resultado un cambio en la
configuración que separa los restos dador y aceptor. Por
consiguiente, los incrementos en la intensidad de la señal
fluorescente en el ensayo pueden ser correlacionados directamente
con la cantidad de prímero incorporado en el producto amplificado
mediante PCR. Los autores concluyen que este método es
particularmente apropiado para el análisis de ácido nucleico
amplificado mediante PCR en un formato de tubo cerrado.
Debido a que son ácidos nucleicos, los
constructos de prímero de Nazarenko y col. están sometidos a
digestión de nucleasa, lo que provoca un incremento de la señal de
fondo durante el proceso PCR (Véase: Nazarenko y col., Nucleic
Acids Res. 25: en la página 2519, columna 1, líneas 28 a 39).
Una desventaja adicional de este método es que la Baliza Molecular
como constructo de prímero debe ser linealizada durante la
amplificación (Véase: Nazarenko y col., Nucleic Acids Res.
25: en la página 2519, columna 1, líneas 7 y 8). Por
consiguiente, la polimerasa debe leer a través del tallo y
disociarlo de la Baliza Molecular modificada como una horquilla
como constructo de prímero si se va a generar la señal
fluorescente. Nazarenko y col. no sugieren, muestran o describen
nada sobre PNA.
En otra aplicación de FRET en la detección de
secuencias de ácido nucleico objetivo, también se han usado sondas
de oligonucleótidos fluorescentes marcados doblemente, que se han
mostrado impermeables a digestión de exonucleasa, para detectar
secuencias objetivo de ácido nucleico en reacciones PCR y en PCR
in situ (Véase: Mayrand, patente de EE.UU. nº 5.691.146).
Las sondas de oligonucleótido de Mayrand comprenden una molécula
fluorescente (informador) unida a un primer extremo del
oligonucleótido y una molécula de extinción unida al extremo
opuesto del oligonucleótido (Véase: Mayrand, Resumen). Mayrand
sugiere que la técnica anterior muestra que la distancia entre el
fluoróforo y el resto de extinción es una característica importante
que debe ser minimizada y, por consiguiente, el espaciado preferido
entre los restos informador y de extinción de una sonda de ADN
debería ser de 6 a 16 nucleótidos (Véase: columna 7, líneas 8 a
24). Sin embargo, Mayrand muestra que la molécula de informador y
el resto de extinción están colocados preferiblemente a una
distancia de 18 nucleótidos (Véase: columna 3, líneas 35 y 36) o de
20 bases (Véase: columna 7, líneas 25 a 46) para alcanzar la
relación señal-ruido óptima. Por consiguiente,
tanto Mayrand como la técnica anterior que cita muestran que las
propiedades detectables de sondas de ácido nucleico (ADN ó ARN) que
comprenden un fluoróforo y un resto de extinción presentan una
fuerte dependencia de la longitud de la sonda.
La resistencia a la digestión por nucleasa
también es un aspecto importante (Véase: la patente de EE.UU. Nº
5.691.146 en la columna 6, líneas 42 a 64) y por lo tanto, Mayrand
sugiere que el extremo 5' del oligonucleótido puede hacerse
impermeable a la digestión por nucleasa mediante la inclusión de una
o más uniones ínter nucleótido modificadas en el extremo 5' de la
sonda de oligonucleótido (Véase: la patente de EE.UU. Nº 5.691.146
en la columna 6, líneas 45 a 50). Adicionalmente, Mayrand sugiere
que se puede usar un ácido nucleico de poliamida (PNA) o un péptido
como unión resistente a la nucleasa para modificar el extremo 5' de
la sonda de oligonucleótido de la invención y hacerla impermeable a
la digestión por nucleasa (Véase: la patente de EE.UU. Nº 5.691.146
en la columna 6, líneas 53 a 64). Sin embargo, Mayrand no describe,
sugiere o muestra que un constructo de sonda de PNA pueda ser un
sustituto adecuado para la práctica de la invención, a pesar de
presentar un obvio conocimiento de su existencia. Adicionalmente,
Mayrand no muestra a alguien con conocimientos en la técnica cómo
preparar y/o marcar un PNA con los restos fluoróforo y de
extinción.
Puesto que pueden verse influidos por la longitud
del oligonucleótido (por la distancia), la eficacia de la
transferencia de energía entre los restos dador y aceptor ha sido
examinada en profundidad y se ha aplicado particularmente en
aplicaciones de secuenciamiento de ácido nucleico fluorescente
(Véase: Mathies y col., patente Nº 5.707.894). Mathies y col.
establecen que dos fluoróforos se unirán a través de una cadena
principal en la que la distancia entre los dos fluoróforos puede
variar (Véase: patente de EE.UU. Nº 5.707.804 en la columna 4,
líneas 1 a 3). De este modo, la distancia debe elegirse para
proporcionar una transferencia de energía entre el dador y el
aceptor a través del conocido mecanismo de Foerster (Véase: patente
de EE.UU. Nº 5.707.804 en la columna 4, líneas 7 a 9).
Preferiblemente, los fluoróforos de un ácido nucleico de cadena
sencilla están separados por de 3 a 10 nucleósidos (Véase: la
patente de EE.UU. Nº 5.707.804 en la columna 7, líneas 21 a 25).
Mathies y col. no sugieren, muestran o describen nada acerca de
PNA.
De los análisis de las parejas de ADN se ha
observado que: 1: la eficacia de FET (o FRET como se ha definido
aquí) parece depender de algún modo de la secuencia de nucleobase
del oligonucleótido; 2: se producen cambios en la fluorescencia del
dador de un modo que sugiere que las interacciones
colorante-ADN afectan a la eficacia de FET; y 3: la
ecuación de Forster no tiene en cuenta de forma cuantitativa la
transferencia de energía observada y, por tanto, no se puede
cuantificar la longitud entre los restos dador y aceptor unidos a
los oligonucleótidos, aunque se puede usar de forma
cualitativamente (Véase: Promisel y col., Biochemistry, 29:
9261-9268 (1990). Promisel y col. sugieren que se
pueden deducir efectos que no son Forster a partir de algunos de
los resultados sin explicación que han sido observados (Véase:
Promisel y col., Biochemistry, 29: desde la página 9267,
columna 1, línea 43, hasta la página 9268, columna 1, línea 13).
Los resultados de Promisel y col. sugieren que los fenómenos FRET
no son completamente predecibles o no son bien comprendidos cuando
son utilizados en ácidos nucleicos. Promisel y col. no sugieren,
muestran o describen nada acerca de PNA y, de hecho, el texto es
anterior a la invención del PNA.
Por tanto, las técnicas antecedentes no
describen, sugieren o muestran nada acerca de los oligómeros de PNA
a los que están unidos directamente un par de restos dador y
aceptor. De hecho, el fenómeno FRET aplicado a la detección de
ácidos nucleicos, aparece restringido a la preparación de
constructos en los que la porción de la sonda que es complementaria
a la secuencia de ácido nucleico objetivo está a su vez compuesta
únicamente por ácido nucleico.
La FRET también ha sido utilizada en el campo de
los péptidos. (Véase: Yaron y col. Analytical Biochemistry 95
desde la página 232, columna 2, línea 30 hasta la página 234,
columna 1, línea 30). De hecho, el uso de péptidos adecuadamente
marcados como sustratos de enzimas es la utilidad primaria de los
péptidos que son marcados con pares dador y aceptor (Véase:
Zimmerman y col., Analytical Biochemistry, 70:
258-262 (1976), Carmel y col., Eur. J. Biochem.,
73: 617-625 (1977), Ng y col., Analytical
Biochemistry, 183: 50-56 (1989), Wang y col.,
Tett. Lett., 31: 6493-6496 (1990) y Meldal y
col., Analytical Biochemistry, 195: 141-147
(1991). Los primeros trabajos sugirieron que la eficacia de
extinción del par dador-aceptor era dependiente de
la longitud del péptido (Véase: Yaron y col., Analytical
Biochemistry 95 en la página 233, columna 2, líneas 36 a 40).
Sin embargo, los últimos trabajos han sugerido que una extinción
eficaz no depende tanto de la longitud del péptido (Véase: Ng y
col., Analytical Biochemistry, 183: desde la página 54,
columna 2, línea 23 hasta la página 55, columna 1, línea 12; Wang y
col., Tett. Lett., 31 en el que el péptido tiene ocho
aminoácidos de longitud; y Meldal y col. Analytical Biochemistry,
195 en la página 144, columna 1, líneas 33 a 37). Ng y col.
sugirieron que se la extinción observada en péptidos largos se
podría producir mediante un mecanismo aún sin determinar (Véase: Ng
y col., Analytical Biochemistry 183 en la página 55, desde
la columna 1, línea 13 hasta la columna 2, línea 7).
A pesar de su nombre, el ácido nucleico de
péptido (PNA) no es un péptido, ni un ácido nucleico y ni siquiera
es un ácido. El Ácido Nucleico de Péptido (PNA) es una poliamida
(pseudopéptido) que no existe de forma natural que puede hibridarse
con ácido nucleico (ADN y ARN) con especificidad de secuencia (Véase
la Patente de Estados Unidos Nº 5.539.082 y Egholm y col.,
Nature 365: 566-568 (1993)). Los PNAs se
sintetizan adaptando los procedimientos estándar de síntesis de
péptidos en un formato que ahora está disponible comercialmente.
(Para una descripción general de la preparación de monómeros y de
oligómeros de PNA por favor véase: Dueholm y col., New J. Chem.,
21: 19-31 (1997) o Hyrup y col., Bioorganic
& Med. Chem. 4: 5-23 (1996)). De forma
alternativa, los oligómeros de PNA marcados y sin marcar pueden ser
comprados (Véase: PerSeptive Biosystems Promotional Literature:
BioConcepts, Publicación Nº NL612, Practical PNA, Review and
Practical PNA, Volumen 1, Número 2).
Al no ser moléculas que existan de forma natural,
los PNAs no son sustratos de enzimas que degraden péptidos o ácidos
nucleicos. Por tanto, los PNAs deberían ser estables en muestras
biológicas, así como deberían presentar una elevada vida en
almacenamiento. Al contrario que la hibridación de ácido nucleico,
que es muy dependiente de la fuerza iónica, la hibridación de un
PNA con un ácido nucleico es bastante independiente de la fuerza
iónica y se ve favorecida por una baja fuerza iónica, condiciones
que desfavorecen profundamente la hibridación de ácido nucleico con
ácido nucleico (Egholm y col., Nature, en la página 567). El
efecto de la fuerza iónica sobre la estabilidad y la conformación
de los complejos de PNA han sido investigadas intensamente (Tomac y
col., J. Am. Chem. Soc. 118: 5544-5552
(1996)). La discriminación de secuencia es más eficaz para el PNA
que reconoce ADN que para el ADN que reconoce ADN (Egholm y col.,
Nature, en la página 566). Sin embargo, las ventajas en la
discriminación de la mutación puntual con sondas de PNA, en
comparación con las sondas de ADN, en un ensayo de hibridación en
cierto grado dependen de la secuencia (Nielsen y col.,
Anti-Cancer Drug Design 8:
53-65 (1993)). Como ventaja adicional, los PNAs se
hibridan con ácido nucleico tanto en orientación paralela como
antiparalela, aunque preferible la orientación antiparalela (Véase
Egholm y col., Nature en la página 566).
A pesar de la capacidad de hibridarse con ácido
nucleico de un modo específico respecto a la secuencia, existen
muchas diferencias entre las sondas de PNA y las sondas de ácido
nucleico estándar. Estas diferencias pueden ser dividirse
convenientemente en diferencias biológicas, estructurales y
fisicoquímicas. Como se discutirá en más detalle a continuación,
estas diferencias biológicas, estructurales y fisicoquímicas pueden
conducir a resultados impredecibles cuando se intenta usar sondas
de PNA en aplicaciones en las que típicamente se han utilizado
ácidos nucleicos. Esta no equivalencia de composiciones diferentes
es observada a menudo en el campo de la técnica química.
Con respecto a las diferencias biológicas, los
ácido nucleicos son materiales biológicos que juegan un papel
fundamental en la vida de los seres vivos en la forma de agentes de
transmisión y expresión genética. Sus propiedades in vivo
son bastante comprendidas. El PNA, por otro lado, es una molécula
totalmente artificial desarrollada recientemente, concebida en la
mente de químicos y fabricada usando química orgánica sintética. No
tiene ninguna función biológica conocida (es decir, el PNA nativo
(sin modificar) no es un sustrato de ninguna polimerasa, ligasa,
nucleasa o proteasa).
Estructuralmente, el PNA también difiere
drásticamente del ácido nucleico. Aunque ambos pueden emplear
nucleobases comunes (A, C, G, T y U), las cadenas principales de
estas moléculas son estructuralmente diversas. Las cadenas
principales del ARN y del ADN están compuestas de ribosa de
fosfodiéster que se repite y de unidades de
2-desoxirribosa. Por el contrario, las cadenas
principales de los PNAs más comunes están compuestas de subunidades
de N-[2-(aminoetil)]glicina. Adicionalmente, en los PNA las
nucleobases están conectadas a la cadena principal a través de un
resto de metilencarbonilo adicional.
El PNA no es un ácido y por tanto no contiene
grupos acídicos cargados tales como los presentes en el ADN o en el
ARN. Debido a que carecen de carga formal, los PNAs son
generalmente más hidrófobos que las moléculas de ácido nucleico
equivalentes. El carácter hidrofóbico del PNA permite la posibilidad
de que se produzcan interacciones no específicas (interacciones
hidrófobo/hidrófobo) que no se producen con los ácidos nucleicos.
Además, el PNA es aquiral, lo que le proporciona la capacidad de
adoptar conformaciones estructurales, sin existir algo equivalente
en el reino de los ARN/ADN.
Las características estructurales únicas de los
PNA dan como resultado un polímero que es altamente ordenado en
disolución, particularmente para polímeros ricos en purina (Véase:
Dueholm y col., New J. Chem., 21: 19-31
(1997) en la página 27, columna 2, líneas 6 a 30). Por el
contrario, un ácido nucleico de cadena sencilla es una hélice
aleatoria que presenta muy poca estructura secundaria. Debido a que
el PNA es altamente organizado, el PNA debería ser más resistente a
adoptar estructuras secundarias alternativas (por ejemplo, un tallo
de horquilla y/o lazo).
Las diferencias físicoquímicas entre el PNA y el
ADN o el ARN también son sustanciales. El PNA se une a su ácido
nucleico complementario más rápidamente de lo que las sondas de
ácido nucleico se unen a la misma secuencia objetivo. Se cree que
este comportamiento es debido, al menos parcialmente, al hecho de
que el PNA carece de carga en su cadena principal. Adicionalmente,
publiicaciones recientes demuestra que la incorporación de grupos
cargados positivamente en los PNAs mejora la cinética de
hibridación (Véase: Iyer y col., J. Biol. Chem. 270:
14712-14717 (1995)). Debido a que carece de carga en
la cadena principal, la estabilidad del complejo de PNA/ácido
nucleico es superior a la de un complejo análogo de ADN/ADN o de
ARN/ADN. En determinadas situaciones, el PNA forma complejos de
triple hélice altamente estables a través de un proceso denominado
"desplazamiento de cadena". En el mundo del ADN y del ARN no
se conocen procesos o estructuras de desplazamiento de cadena
equivalentes.
Recientemente, se ha descrito el "Escrutinio
basado en hibridación de conjuntos de oligómeros de ácido nucleico
de péptido (PNA)", en el que se sintetizaron conjuntos de unos
1000 oligómeros de PNA de secuencia individual (Véase: Weiler y
col., Nucl. Acids Res. 25: 2792-2799 (1997)).
Generalmente se usan conjuntos, en un ensayo único, para generar la
información de unión de afinidad (hibridación) sobre una secuencia
o muestra específica a numerosas sondas de composición definida. De
este modo, los conjuntos de PNA pueden ser útiles en aplicaciones
de diagnosis o para escrutar librerías de compuestos para ventajas
que pueden presentar utilidad terapéutica. Sin embargo, Weiler y
col. destacan que la afinidad y la especificidad de la hibridación
de ADN a oligómeros de PNA inmovilizados dependen de las condiciones
de hibridación más de lo esperado. Además, existe una tendencia
hacia la unión no específica a menor fuerza ácida. Adicionalmente,
se identificaron varias incongruencias de unión muy fuertes, que no
pudieron ser eliminadas mediante condiciones de lavado más severas.
Estos resultados inesperados son ilustrativos de la falta de
conocimiento que se tiene de estas recién descubiertas moléculas
(es decir, del PNA).
En resumen, debido a que los PNAs se hibridan a
ácidos nucleicos con especificidad de secuencia, los PNAs son
candidatos útiles para la investigación como sustituto de sondas
cuando se desarrollan ensayos de hibridación basados en sondas. Sin
embargo, las sondas de PNA no son el equivalente de las sondas de
ácido nucleico ni en estructura ni en función. Por consiguiente, las
propiedades biológicas, estructurales y fisicoquímicas únicas del
PNA requieren que se lleve a cabo experimentación para examinar si
los PNAs son adecuados en aplicaciones en las que las sondas de
ácido nucleico son utilizadas habitualmente.
Se han examinado numerosos polímeros de PNA en un
intento de preparar un Baliza Molecular de PNA. Los solicitantes han
determinado que todos los oligómeros de PNA que examinaron, que
contenían restos dador y aceptor localizados en extremos opuestos
del polímero, presentaban un fondo inherente bajo y un aumento
detectable en la señal después de la unión de la sonda con una
secuencia objetivo. De forma muy sorprendente, estas propiedades
características de la Baliza Molecular de ácido nucleico fueron
observadas tanto si el oligómero de PNA era adecuado para adoptar
una estructura de tallo de orquilla y de lazo de un modo que
concuerda con el diseño de la secuencia de nucleobases como si no
lo era. Por ejemplo, en los análisis de los ensayos de hibridación,
los oligómeros de PNA (originalmente diseñados como oligómeros de
control) que no poseen ningún segmento de brazo adecuado para crear
una horquilla, presentaron una relación señal (oligómero de PNA
unido a la secuencia objetivo) ruido (cuando no hay secuencia
objetivo presente) que es aproximadamente la mitad de la observada
para los PNAs que comprenden secuencias de nucleobases
auto-complementarias.
Esta invención está dirigida a las Balizas
Lineales. Una Baliza Lineal, transfiere de forma eficaz energía
entre los restos dador y aceptor unidos a la sonda en ausencia de
secuencia objetivo, tanto si comprende o no, por diseño, una
secuencia de nucleobases auto-complementaria. Con la
hibridación a una secuencia objetivo, la eficacia de la
transferencia de energía entre los restos dador y aceptor de la
Baliza Lineal se ve alterada de tal modo que la señal detectable de
al menos uno de los restos puede ser usada para escrutar o
cuantificar la presencia del proceso de hibridación. Nos referimos a
estas sondas como Balizas Lineales para distinguirlas de las
estructuras de horquilla asociadas típicamente a las Balizas
Moleculares de ácido nucleico. Sin embargo, los solicitantes no
pretenden dar a entender que estas sondas carecen de una estructura
secundaria ya que la bibliografía muestra que los PNAs pueden
encontrarse altamente organizados en disolución (Véase: Dueholm y
col., New J. Chem., 21: 19-31 (1997 en la
página 27, columna 2, líneas 6 a 30).
Las Balizas Moleculares de esta invención poseen
varias propiedades que son únicas y que no son predecibles. Por
ejemplo, los solicitantes demuestran que la eficacia de la
transferencia de energía entre los restos dador y aceptor de una
Baliza Lineal es sustancialmente independiente de la longitud, ya
que se observó esencialmente el mismo ruido (Véase: Ejemplo 17 de
esta especificación) y la misma relación señal ruido (Véase:
Ejemplo 18 de esta especificación) para oligómeros de 11 a 17
subunidades de longitud. Este fue un resultado muy sorprendente
puesto que la extinción intramolecular de oligómeros de ácido
nucleico adecuadamente marcados depende mucho de la longitud de la
sonda (Véase: Antecedentes y datos presentados en el Ejemplo 17 de
esta especificación).
Adicionalmente, los solicitantes han demostrado
que la eficacia de extinción de una Baliza Lineal no depende de la
secuencia, ni de depende sustancialmente del solapamiento espectral
de los restos dador y aceptor (Véase: Ejemplos 17, 18 y 21 de esta
especificación). Específicamente, la mayoría de las sondas de PNA
que han sido preparadas comprenden un resto dador de fluoresceína y
un resto de extinción (aceptor) de dabcyl. Aunque esta combinación
dador/aceptor no es un par FRET ideal ya que la emisión del resto
dador de fluoresceína no presenta un elevado grado de solapamiento
espectral con la absorción del resto aceptor de dabcyl, la
extinción observada por los solicitantes es sustancial en todos los
constructos. Además, se observó que las Balizas Lineales que
comprenden el par Cy3/dabcyl, dador/aceptor respectivamente,
presentan tanto un ruido como una relación señal ruido que era
similar a la observada con el sistema fluoresceína/dabcyl, a pesar
de que existe un solapamiento espectral sustancialmente menor entre
el Cy3 y el dabcyl (Véase: Ejemplos 17, 18 y 21 de esta
especificación). Por consiguiente, de manera sorprendente, los datos
recopilados por los solicitantes demuestran que las Balizas
Lineales no necesitan comprender pares FRET óptimos para ser
operativas.
Por consiguiente, los datos sugieren que el
contacto directo es el modo principal, aunque probablemente no el
único, de transferencia de energía puesto que el solapamiento
espectral es un requisito para la transferencia de energía FRET
pero no lo es para la transferencia de energía no FRET. Además, los
datos sugieren que independientemente de la longitud de la sonda,
los restos fluoróforo y de extinción de la Baliza Lineal están
situados de forma similar para alcanzar con ello un grado de
extinción que es bastante independiente de la longitud de la sonda
o de la secuencia de nucleobases.
Asimismo, los solicitantes han investigado qué
efecto tiene variar la fuerza iónica y particularmente la presencia
o la ausencia de magnesio sobre el ruido y sobre la relación señal
ruido de la sonda. De nuevo se descubrió que los PNAs presentan
ruidos y relaciones señal ruido que son sustancialmente
independientes de las diferencias en la fuerza iónica o de la
presencia o ausencia de magnesio, mientras que las propiedades de
las sondas de ADN de similar longitud y configuración de marcado
eran dependientes de las variaciones de la fuerza iónica y/o
altamente dependientes de la presencia o ausencia de magnesio.
En resumen, los solicitantes también han
observado que el ruido y la relación señal ruido para las Balizas
Lineales es sustancialmente independiente de la longitud o de las
subunidades que separan los restos dador y aceptor, de la fuerza
iónica del entorno o de la presencia o ausencia de magnesio. Cuando
son considerados globalmente, estos resultados fueron muy
inesperados a la luz de los conocimientos de la técnica anterior.
Por consiguiente, los datos de los solicitantes demuestran una
clara falta de equivalencia de estructura y función entre las sondas
de ácido nucleico y las sondas de PNA de similar longitud y
configuración de marcado. Como consecuencia, los nuevos métodos,
kits y composiciones de esta invención comprenden Balizas Lineales
que poseen propiedades únicas y sorprendentes.
En una realización, esta invención está dirigida
a una Baliza Lineal. Generalmente, una Baliza Lineal es un polímero
que como mínimo comprende al menos un resto dador de energía unido
y al menos un resto aceptor de energía unido, en el que dichos
restos dador y aceptor están separados por al menos una porción de
una secuencia de nucleobases sonda. Por diseño, una Baliza Lineal no
forma una horquilla de tallo y lazo. La Baliza Lineal se
caracteriza además por que la eficacia e la transferencia de
energía entre dichos restos dador y aceptor, cuando el polímero
está solvatado en disolución acuosa, es sustancialmente
independiente de al menos dos factores variables seleccionados del
grupo que consiste en la longitud de las subunidades que separan
los restos dador y aceptor, cuando el polímero está solvatado en
disolución acuosa, es sustancialmente independiente de al menos dos
factores variables seleccionados del grupo que consiste en la
longitud de las subunidades que separan los restos dador y aceptor,
el solapamiento espectral del resto dador y del resto aceptor, la
presencia o ausencia de magnesio en la disolución acuosa y la fuerza
iónica de la disolución acuosa. Preferiblemente, la Baliza Lineal
se caracteriza además por que la eficacia de la transferencia de
energía entre dichos restos dador y aceptor es sustancialmente
independiente de al menos tres factores variables, y más
preferiblemente es sustancialmente independiente de al menos cuatro
factores variables.
En una realización preferida, una Baliza
Molecular es un polímero que, como mínimo, consiste en una secuencia
de nucleobases sonda que tiene un primer y un segundo extremo. Al
menos un resto dador está unido a uno de los extremos, primero o
segundo, de la secuencia de nucleobases sonda; y al menos un resto
aceptor está unido al otro extremo, primero o segundo, de la
secuencia de nucleobases sonda.
Preferiblemente, el polímero es un PNA.
En una segunda realización, la invención se
refiere a un polímero que comprende;
- a)
- Una secuencia de nucleobases sonda para sondear una secuencia objetivo respecto a la cual la secuencia de nucleobases es complementaria;
- b)
- Al menos un resto dador de energía que está unido a la secuencia de nucleobases sonda; y
- c)
- Al menos un resto aceptor de energía que está unido a la secuencia de nucleobases sonda, en la que al menos un resto dador de energía está separado de al menos un resto aceptor de energía por al menos una porción de la secuencia de nucleobases sonda.
Preferiblemente, la secuencia de nucleobases
sonda tiene una longitud de 5 a 30 subunidades.
En la primera y en la segunda realización, cada
una de las subunidades de la secuencia de nucleobases sonda
preferiblemente presenta la fórmula:
en la
que,
- cada J es igual o diferente, y es seleccionado del grupo que consiste en: H, R^{1}, OR^{1}, SR^{1}, NHR^{1}, NR^{1}_{2}, F, Cl, Br y I;
- cada K es igual o diferente, y es seleccionado del grupo que consiste en: O, S, NH y NR^{1};
- cada R^{1} es igual o diferente, y es un grupo alquilo que presenta de uno a cinco átomos de carbono que puede contener opcionalmente un heteroátomo o un grupo arilo sustituido o sin sustituir;
- cada A es seleccionado del grupo que consiste en un enlace sencillo un grupo de fórmula; -(CJ_{2})_{s}- y un grupo de fórmula; -(CJ_{2})_{s}C(O)- en el que, J se define como anteriormente y cada s es un número entero entre uno y cinco;
- cada t es 1 ó 2;
- cada u es 1 ó 2; y
- cada L es igual o diferente, y es seleccionado de forma independiente del grupo que consiste en J, adenina, citosina, guanina, timina, uridina, 5-metil-citosina, 2-aminopurina, 2-amino-6-cloropurina, 2,6-diaminopurina, hipoxantina, pseudoisocitosina, 2-tiouracilo, 2-tiotimidina, otros análogos de nucleobases naturales, otras nucleobases no naturales, restos aromáticos sustituidos y no sustituidos, biotina y fluoresceí-na.
Preferiblemente, cada subunidad de PNA consiste
en una nucleobase natural o no natural unida al nitrógeno aza de la
cadena principal de una N-[2-(aminoetil)]glicina a través de un
enlace metilencarbonílico.
Preferiblemente, el resto dador es un fluoróforo
seleccionado del grupo que consiste en
5(6)-carboxifluoresceína y sus derivados,
ácido
5-(2'-aminoetil)-aminonaftalen-1-sulfónico
(EDANS), bodipy y sus derivados, rodamina y sus derivados, Cy2,
Cy3, Cy 3.5, Cy5, Cy5.5, rojo texas y sus derivados.
Preferiblemente, el resto aceptor es ácido
4-((4-(dimetil-amino)fenil)azo)
benzoico (dabcyl).
Preferiblemente, al menos un espacio molecular
separa una o las dos moléculas aceptor y dador de la secuencia de
nucleobases a la que están unidas.
Preferiblemente, la secuencia de nucleobases
sonda es perfectamente complementaria a la secuencia objetivo.
Preferiblemente, el polímero está inmovilizado
sobre un soporte.
Preferiblemente, el polímero es un polímero
componente de un conjunto.
En otra realización, esta invención está
relacionada con un método para la detección, la identificación o la
cuantificación de una secuencia objetivo en una muestra. El método
comprende poner en contacto la muestra con una Baliza Molecular y a
continuación detectar, identificar o cuantificar la hibridación del
polímero con la secuencia objetivo, bajo las condiciones de
hibridación adecuadas, en el que la presencia, ausencia o cantidad
de secuencia objetivo presente en la muestra de interés puede
correlacionarse con un cambio en la señal detectable asociada a al
menos un resto dador o aceptor del polímero. El cambio mensurable
en la señal detectable de al menos un resto dador o aceptor de la
sonda puede ser usado para determinar la presencia, ausencia o
cantidad de secuencia objetivo presente en la muestra de interés
puesto que los solicitantes han demostrado que la eficacia de la
transferencia de energía entre los restos dador y aceptor se ve
alterada por la hibridación de la Balizas Lineales con sus
secuencias objetivo, bajo las condiciones de hibridación adecuadas.
Se puede alcanzar una cuantificación precisa corrigiendo la señal
generada por una Baliza Lineal no hibridaza. Por consiguiente, las
Balizas Lineales de esta invención son particularmente adecuadas
para la detección, identificación o cuantificación de las secuencias
objetivo en tubos de ensayo cerrados y particularmente en ensayos
PCR asimétricos (Véase: Ejemplo 19 de esta especificación). Debido
a que las Balizas Lineales no son degradadas por enzimas, las
Balizas Lineales también son particularmente adecuadas para la
detección, identificación o cuantificación de secuencias objetivo
en células, tejidos u organismos, tanto vivos como no (Véase:
Ejemplo 20 de esta especificación).
En otra realización, la invención se refiere a un
método para la detección, identificación o cuantificación de una
secuencia objetivo en una muestra, comprendiendo dicho método:
- a)
- Poner en contacto la muestra con un polímero que comprende:
- i)
- Una secuencia de nucleobases sonda que es complementaria a la secuencia objetivo;
- ii)
- Al menos un resto dador de energía que está unido a la secuencia de nucleobases sonda; y
- iii)
- Al menos un resto aceptor de energía que está unido a la secuencia de nucleobases sonda y que está separada de al menos un resto aceptor de energía por al menos una porción de la secuencia de nucleobases sonda; y
- b)
- Detectar, identificar o cuantificar la hibridación del polímero con la secuencia objetivo, bajo las condiciones de hibridación adecuadas, en el que la presencia, ausencia o cantidad de secuencia objetivo presente en la muestra puede ser correlacionada con un cambio en la señal detectable asociada a al menos un resto dador o aceptor del polímero.
En cualquiera de estas dos realizaciones, el
método puede ser usado para detectar secuencia objetivo en un ensayo
de tubo cerrado (homogéneo). El método puede ser usado para detectar
un ácido nucleico que comprende una secuencia objetivo, en el que
dicho ácido nucleico ha sido sintetizado o amplificado en una
reacción que se produce en un ensayo de tubo cerrado
(homogéneo).
Preferiblemente, la síntesis de ácido nucleico o
la reacción de amplificación de ácido nucleico es seleccionada del
grupo que consiste en: Reacción en Cadena de Polimerasa (PCR, del
inglés "Polymerase Chain Reaction"), Reacción en Cadena de
Ligasa (LCR, del inglés "Ligase Chain Reaction"), Amplificación
de Desplazamiento de Cadena (SDA, del inglés "Strand Displacement
Amplification"), Amplificación Mediada por Transcripción (TMA,
del inglés "Transcription-Mediated
Amplification"), Amplificación Circular en Rollo (RCA, del inglés
"Rolling Circle Amplification") y la replicasa
Q-beta. En el que la reacción de amplificación de
ácido nucleico es una reacción PCR asimétrica.
Preferiblemente, la secuencia objetivo
sintetizada o amplificada se mide en tiempo real. Los métodos
pueden ser usados para detectar una secuencia objetivo en línea o
no en línea en una célula o tejido.
Preferiblemente, la secuencia objetivo en la
célula o tejido es detectada, identificada o cuantificada usando
hibridación in situ.
Preferiblemente, la muestra se pone en contacto
con dicho polímero y una o más sondas de bloqueo.
Opcionalmente, la detección, identificación o
cuantificación de la secuencia objetivo determina la presencia o la
cantidad de un organismo o de un virus en la muestra.
Alternativamente, la detección, identificación o
cuantificación de la secuencia objetivo determina la presencia o la
cantidad de una o más especies de un organismo en la muestra.
Alternativamente, la detección, identificación o
cuantificación de la secuencia objetivo determina el efecto de
agentes antimicrobianos sobre el crecimiento de uno o más
microorganismos en la muestra.
Alternativamente, la detección, identificación o
cuantificación de la secuencia objetivo determina la presencia o la
cantidad de un grupo taxonómico de organismos en la muestra.
La detección, identificación o cuantificación de
la secuencia objetivo facilita una diagnosis de una condición de
interés médico.
La secuencia objetivo puede ser inmovilizada
sobre una superficie. Alternativamente, el polímero puede ser
inmovilizado sobre una superficie.
El polímero puede un componente polímero de un
conjunto.
En otra realización más, esta invención está
relacionada con kits adecuados para llevar a cabo un ensayo que
detecta la presencia, la ausencia o el número de secuencias
objetivo en una muestra. Los kits de esta invención comprenden una o
más Balizas Lineales y otros reactivos o composiciones que son
seleccionados para llevar a cabo un ensayo o para simplificar la
realización de un ensayo.
Preferiblemente, uno o más de los polímeros del
kit presentan una secuencia de nucleobases sonda con una longitud de
11 a 17 subunidades.
Preferiblemente, dos o más polímeros son marcados
con restos detectables de forma independiente.
Preferiblemente, los restos detectables de forma
independiente son usados para detectar, identificar o cuantificar
independientemente al menos dos secuencias objetivos diferentes que
pueden estar presentes en la misma muestra.
Preferiblemente, el kit se usa en un ensayo de
hibridación in situ.
En otra realización más, esta invención también
está dirigida a un conjunto que comprende dos o más Balizas Lineales
unidas a soportes adecuadas para detectar, identificar o cuantificar
una secuencia objetivo de interés. Los conjuntos de Balizas
Lineales son convenientes debido a que proporcionan un medio para
interrogar rápidamente a numerosas muestras en referencia a la
presencia de una o más secuencias objetivo de interés en tiempo
real sin usar un sistema secundario de detección.
En otra realización, la invención se refiere a un
conjunto que comprende dos o más polímeros unidos a un soporte en
los que al menos un polímero del conjunto comprende:
- a)
- Una secuencia de nucleobases sonda para sondear una secuencia objetivo de la cual la secuencia de nucleobases sonda es complementaria;
- b)
- Al menos un resto dador de energía que está unido a la secuencia de nucleobases sonda; y
- c)
- Al menos un resto aceptor de energía que está unido a la secuencia de nucleobases sonda en el que al menos un resto dador está separado de al menos un resto aceptor por al menos una porción de la secuencia de nucleobases sonda; y
en el que dicho polímero es adecuado para
detectar, identificar o cuantificar una secuencia objetivo presente
en una muestra.
En cualquiera de las dos realizaciones
precedentes, el al menos un resto dador de energía de al menos un
polímero preferiblemente está unido a un primer o a un segundo
extremo de la secuencia de nucleobases sonda, y el al menos un resto
aceptor de energía de al menos un polímero preferiblemente está
unido al otro primer o segundo extremo de la secuencia de
nucleobases sonda.
Preferiblemente, el conjunto es adecuado para la
regeneración mediante el tratamiento con uno o más catalizadores de
regeneración seleccionados del grupos que consiste en calor, enzima
nucleasa y desnaturalizante químico.
La presente invención también se refiere al uso
de un kit como se ha descrito anteriormente para detectar organismos
en alimentos, bebidas, agua, productos farmacéuticos, productos de
cuidado personal, productos lácteos o muestras medioambientales, el
uso de un kit para evaluar materias primas, productos o procesos,
el uso de un kit para examinar muestras clínicas tales como
especímenes o equipamientos clínicos, muebles y productos usados par
tratar humanos o animales, el uso de un kit para detectar una
secuencia objetivo que es específica de una enfermedad genética o
que es específica de una predisposición a una enfermedad genética,
y el uso de un kit para detectar una secuencia objetivo en una
técnica forense tal como el escrutinio prenatal, la prueba de
paternidad, la confirmación de identidad o la investigación de un
crimen.
El kit puede ser usado para detectar una
secuencia objetivo asociada a una enfermedad seleccionada del grupo
que consiste en \beta-Talasemia, anemia celular
de hoz, Factor-V Leiden, fibrosis cística y
objetivos relacionados con el cáncer tales como p53, p10,
BRC-1 y BRC-2.
En otra realización, la invención se refiere al
uso de un kit como el descrito anteriormente. Los métodos, kits y
composiciones de esta invención son particularmente útiles para la
detección de secuencias objetivo de organismos que pueden
encontrarse en alimentos, bebidas, agua, productos farmacéuticos,
productos de cuidado personal, productos lácteos o muestras
medioambientales. El análisis de las bebidas preferidas incluye
soda, agua embotellada, zumo de naranja, cerveza, vino o licores.
Adicionalmente, los métodos, kits y composiciones serán
particularmente útiles para el análisis de materias primas,
equipamientos, productos o procesos usados para fabricar o
almacenar alimentos, bebidas, agua, productos farmacéuticos,
productos de cuidado personal o muestras medioambientales.
Tanto en disolución como unidos a soportes, los
métodos, kits y composiciones de esta invención son particularmente
útiles para la detección rápida, sensible, fiable y versátil de
secuencias objetivo que son particulares de organismos que podrían
encontrarse en ambientes clínicos. Por consiguiente, los métodos,
kits y composiciones de esta invención serán particularmente útiles
para el análisis de especímenes o equipamientos clínicos, muebles o
productos usados para tratar humanos o animales. Por ejemplo, el
ensayo puede ser usado para detectar una secuencia objetivo que es
específica de una enfermedad genética o que es específica de una
predisposición a una enfermedad genética. Ejemplos no limitantes de
enfermedades incluyen \beta-Talasemia, anemia
celular de hoz, Factor-V Leiden, fibrosis cística y
objetivos relacionados con el cáncer tales como p53, p10,
BRC-1 y BRC-2.
En otra realización, la secuencia objetivo puede
estar relacionada con un ADN cromosomal, en el que la detección,
identificación o cuantificación de una secuencia objetivo puede ser
usada en relación a técnicas forenses tales como el escrutinio
prenatal, la prueba de paternidad, la confirmación de identidad o la
investigación de un crimen.
a) Tal como se usa aquí, el término
"nucleobase" incluirá aquellos restos heterocíclicos naturales
y no naturales comúnmente conocidos por aquellos que utilizan la
tecnología de ácidos nucleicos o que utilizan la tecnología de ácido
nucleico de péptido para generar polímeros que pueden unirse con
especificidad de secuencia a ácidos nucleicos.
b) Tal como se usa aquí, el término "secuencia
de nucleobases" es cualquier segmento de un polímero que
comprende nucleobases que contienen subunidades. Ejemplos no
limitantes de polímeros adecuados o de segmentos de polímeros
incluyen oligonucleótidos, oligorribonucleótidos, ácidos nucleicos
de péptido y sus análogos o quimeras.
c) Tal como se usa aquí, el término "secuencia
objetivo" es cualquier secuencia de nucleobases que se pretende
detectar en un polímero. La "secuencia objetivo" puede
comprender el polímero completo o puede ser una subsecuencia de la
secuencia de nucleobases que es única en el polímero de interés. Sin
limitación, el polímero que comprende la "secuencia objetivo"
puede ser un ácido nucleico, un ácido nucleico de péptido, una
quimera, un polímero unido, un conjugado o cualquier otro polímero
que comprende los sustituyentes (por ejemplo, nucleobases) a los que
pueden unirse las Balizas Lineales de esta invención con
especificidad de secuencia.
d) Tal como se usa aquí, el término "ácido
nucleico de péptido" o "PNA" se definirá como cualquier
oligómero, polímero unido o polímero quimérico, que comprende dos o
más subunidades de PNA (residuos), que incluyen cualquiera de los
compuestos denominados o reivindicados como ácidos nucleicos de
péptido en las Patentes de Estados Unidos Nº 5.539.082, 5.527.675,
5.623.049, 5.714.331, 5.736.336, 5.773.571 ó 5.786.571. El término
"Ácido Nucleico de Péptido" o "PNA" también se aplicará a
los imitadores de ácido nucleico descritos en las siguientes
publicaciones: Diderichsen y col., Tett. Lett. 37:
475-478 (1996); Fujii y col., Bioorg. Med. Chem.
Lett. 7: 637-627 (1997); Jordan y col.,
Bioorg. Med. Chem. Lett. 4: 1081-1082 (1994);
Lowe y col., J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1, (1997) 1:
539-546; Lowe y col., J. Chem. Soc. Perkin
Trans. 1 1: 547-554 (1997); Lowe y col., J.
Chem. Soc. Perkin Trans. 1 1: 555-560 (1997); y
Petersen y col., Bioorg. Med. Chem. Lett. 6:
793-796 (1996).
En las realizaciones preferidas, un PNA es un
polímero que comprende dos o más subunidades de PNA de fórmula:
en la que, cada J es igual o
diferente, y es seleccionado del grupo que consiste en H, R^{1},
OR^{1}, SR^{1}, NHR^{1}, NR^{1}_{2}, F, Cl, Br y I. Cada
K es igual o diferente, y es seleccionado del grupo que consiste en:
O, S, NH y NR^{1}. Cada R^{1} es igual o diferente, y es un
grupo alquilo que presenta de uno a cinco átomos de carbono que
puede contener opcionalmente un heteroátomo o un grupo arilo
sustituido o sin sustituir. Cada A es seleccionado del grupo que
consiste en un enlace sencillo un grupo de fórmula;
-(CJ_{2})_{s}- y un grupo de fórmula;
-(CJ_{2})_{s}C(O)-, en el que J se define como
anteriormente y cada s es un número entero entre uno y cinco. Cada
número entero t es 1 ó 2 y el número entero u es 1 ó 2. Cada L es
igual o diferente, y es seleccionado de forma independiente del
grupo que consiste en J, adenina, citosina, guanina, timina,
uridina, 5-metil-citosina,
2-aminopurina,
2-amino-6-cloropurina,
2,6-diaminopurina, hipoxantina, pseudoisocitosina,
2-tiouracilo, 2-tiotimidina, otros
análogos de nucleobases naturales, otras nucleobases no naturales,
restos aromáticos sustituidos y no sustituidos, biotina y
fluoresceína. En la realización más preferida, una subunidad de PNA
consiste en una nucleobase natural o no natural unida al nitrógeno
aza de la cadena principal de la N-[2-(aminoetil)] glicina a través
de un enlace
metilencarbonílico.
Los métodos la estructuración química de PNAs son
bien conocidos (Véase: Patentes de Estados Unidos Nº 5.539.082,
5.527.675, 5.623.049, 5.714.331, 5.736.336, 5.773.571 ó 5.786.571.
Ahora los productos químicos y la instrumentación necesarios para
la estructuración química automatizada de Ácidos Nucleicos de
Péptido unidos a un soporte están disponibles comercialmente. La
estructuración química de un PNA es análoga a la síntesis de
péptidos en fase sólida, en la que en cada ciclo de la
estructuración el oligómero posee un extremo alquilamino reactivo
que es condensado con el siguiente sintón que se va a añadir al
polímero en crecimiento. Debido a que se utiliza una química de
péptidos estándar, se incorporan aminoácidos naturales y no
naturales de forma rutinaria al oligómero PNA. Debido a que el PNA
es una poliamida, presenta un extremo C (extremo carboxilo) y un
extremo N (extremo amino). Para los propósitos del diseño de una
sonda de hibridación adecuada para la unión antiparalela a la
secuencia objetivo (la orientación preferida), el extremo N de la
secuencia de nucleobases sonda de la sonda de PNA es el equivalente
al extremo 5'-hidroxilo de un oligonucleótido de ADN
o de ARN equivalente.
Las marcas unidas a las Balizas Lineales de esta
invención comprenden un conjunto (a partir de aquí denominado
"Conjunto(s) de Balizas") de restos de transferencia de
energía que comprenden al menos un resto dador de energía y al
menos un resto aceptor de energía. Típicamente, el Conjunto de
Balizas incluirá un único resto dador y un único resto aceptor. No
obstante, un Conjunto de Balizas puede contener más de un resto
dador y/o más de un resto aceptor. Los restos dador y aceptor
operan de tal modo que uno o más restos aceptor aceptan la energía
transferida desde uno o más restos dadores o producen la extinción
de la señal procedente del resto o restos dadores.
Preferiblemente, el resto dador es un fluoróforo.
Los fluoróforos preferidos son derivados de la fluoresceína,
derivados de bodipy, ácido
5-(2'-aminoetil)-aminonaftalen-1-sulfónico
(EDANS), derivados de la rodamina, Cy2, Cy3, Cy 3.5, Cy5, Cy5.5,
rojo de texas y sus derivados. Aunque los fluoróforos enumerados
anteriormente también podrían operar como aceptores,
preferiblemente, el resto aceptor es un resto de extinción.
Preferiblemente, el resto de extinción es un resto aromático o
heteroaromático no fluorescente. El resto de extinción preferido es
el ácido
4-((-4-(dimetilamino)-fenil)azo)benzoico
(dabcyl).
La transferencia de energía puede producirse a
través de la colisión de los restos íntimamente asociados de un
Conjunto de Balizas, o a través de un proceso no radiante tal como
la transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET).
Para que se produzca la FRET, la transferencia de energía entre los
restos dador y aceptor de un Conjunto de Balizas requiere que los
restos estén próximos en el espacio y que el espectro de emisión de
un dador(es) tenga un solapamiento sustancial con el
espectro de absorción del aceptor(es) (Véase: Yaron y col.,
Analytical Biochemistry, 95: 228-235 (1979) y
particularmente desde la página 232, columna 1 hasta la página 234,
columna 1). De forma alternativa, se puede producir la
transferencia de energía a través de colisiones (no radiante) entre
restos dador y aceptor asociados muy próximos con independencia de
que el espectro de emisión de un resto(s) dador tenga un
solapamiento sustancial con el espectro de absorción del
resto(s) aceptor (Véase: Yaron y col., Analytical
Biochemistry, 95: 228-235 (1979) y en
particular desde la página 229, columna 1, hasta la página 232,
columna 1). Este proceso se denomina colisión intramolecular ya que
se cree que la extinción es provocada por el contacto directo de los
restos dador y aceptor (Véase: Yaron y col.). Como han demostrado
los solicitantes, los restos dador y aceptor unidos a las Balizas
Lineales de esta invención no necesitan presentar un solapamiento
sustancial entre la emisión de los restos dadores y la absorbancia
de los restos aceptores. Sin pretender establecer una hipótesis,
estos datos sugieren que la colisión o el contacto actúan como modo
primario de extinción en las Balizas Lineales.
Debido a que la eficacia tanto de la
transferencia de energía a través de colisiones como de la
transferencia de energía radiante entre los restos dador y aceptor
de un Conjunto de Balizas es directamente dependiente de la
proximidad entre los restos dador y aceptor, se puede monitorizar
la detección de la formación de híbridos de una Baliza Lineal con
una secuencia objetivo midiendo al menos una propiedad física de al
menos un miembro del Conjunto de Balizas que es diferente de forma
detectable cuando se forma el complejo de hibridación, en
comparación con cuando la Baliza Lineal está en ausencia de una
secuencia objetivo. Nosotros nos referimos a este fenómeno como la
propiedad auto-indicativa de las Balizas Lineales.
Este cambio en la señal detectable dará como resultado el cambio en
la eficacia de la transferencia de energía entre el dador y el
aceptor, que procede de la hibridación de la Baliza Lineal.
Preferiblemente, los medios de detección incluirán la medida de la
fluorescencia de un fluoróforo dador o aceptor de un Conjunto de
Balizas. Aún más preferiblemente, el Conjunto de Balizas
comprenderá al menos un fluoróforo dador y al menos un aceptor de
extinción de tal modo que la fluorescencia del fluoróforo dador
será usada para detectar, identificar o cuantificar la
hibridación.
El marcado químico de un PNA es análogo al
marcado de péptidos. Debido a que la química sintética de
estructuración es esencialmente la misma, para marcar un PNA se
puede usar cualquier método usado habitualmente para marcar un
péptido. Típicamente, el extremo N del polímero es marcado mediante
reacción con un resto que tiene un grupo de ácido carboxílico o un
grupo de ácido carboxílico activado. Opcionalmente se pueden
introducir uno o más restos espaciadores entre el resto de marcado
y la secuencia de nucleobases sonda del oligómero. Generalmente, el
resto espaciador se incorpora antes de llevar a cabo la reacción de
marcado. Sin embargo, el espaciador puede encontrarse dentro de la
marca siendo incorporado durante la reacción de marcado.
Típicamente, el extremo C de la secuencia de
nucleobases sonda es marcado mediante una primera condensación de un
resto marcador con el soporte sobre el que se va a estructurar el
PNA. A continuación, el primer sintón de la secuencia de
nucleobases sonda puede ser condensada con el resto marcador. De
forma alternativa, se pueden introducir uno o más restos
espaciadores entre el resto marcador y el oligómero (por ejemplo,
ácido
8-amino-3,6-dioxaoctanoico).
Una vez que la Baliza Lineal está completamente estructurada y
marcada, es separada del soporte, desprotegida y purificada usando
metodologías estándar.
El resto marcado podría ser un derivado de lisina
en el que el grupo \varepsilon-amino es
modificado con un resto dador o aceptor. Por ejemplo, la marca
podría ser un fluoróforo tal como la
5(6)-carboxifluoresceína o un resto de
extinción tal como el ácido
4-((4-(dimetilamino)fenil)azo)benzoico
(dabcyl). La condensación del derivado de lisina con el soporte de
síntesis se llevaría a cabo usando una química de condensación (de
péptidos) estándar. El grupo \alpha-amino del
derivado de lisina se desprotegería a continuación y la
estructuración de la secuencia de nucleobases sonda se iniciaría
mediante la condensación del primer sintón de PNA con el grupo
\alpha-amino del aminoácido de lisina. Tal como
se ha discutido anteriormente, opcionalmente se podría insertar un
resto espaciador entre el aminoácido de lisina y el primer sintón de
PNA condensando un espaciador adecuado (por ejemplo, ácido
Fmoc-8-amino-3,6-dioxaoctanoico)
con el aminoácido de lisina antes de la condensación del primer
sintón de PNA de la secuencia de nucleobases
sonda.
sonda.
Alternativamente, se marca un grupo funcional del
polímero estructurado, o parcialmente estructurado, con un resto
dador o aceptor estando aún unido al soporte. Este método requiere
que se incorpore un grupo protector apropiado al oligómero para dar
lugar a una función reactiva a la que se une el resto dador o
aceptor, pero presenta la ventaja de que la marca (por ejemplo,
dabcyl o un fluoróforo) puede unirse en cualquier posición dentro
del polímero incluyendo la secuencia de nucleobases sonda. Por
ejemplo, el grupo \varepsilon-amino de una lisina
podría ser protegido con un grupo protector
4-metil-trifenilmetil (MTT),
4-metoxi-trifenilmetil (MMT) ó
4,4'-dimetoxitrifenilmetil (DMT). Los grupos MTT,
MMT ó DMT pueden ser eliminados del PNA (estructurado usando
monómeros de PNA Fmoc disponibles comercialmente y un soporte de
poliestireno que presenta un ligando PAL, PerSeptive Biosystems,
Inc., Framingham, MA) tratando la resina bajo condiciones
moderadamente ácidas. Por consiguiente, el resto dador o aceptor
puede ser condensado a continuación con el grupo
\varepsilon-amino del aminoácido de lisina.
Después de que se complete la estructuración y el marcado, el
polímero es separado del soporte, es desprotegido y purificado
usando metodologías bien conocidas.
Mediante otro método diferente, el resto dador o
aceptor es unido al polímero después de que se haya estructurado por
completo y de que haya sido separado del soporte. Este método es
preferible cuando la marca es incompatible con los regímenes de
separación del soporte, de desprotección o de purificación usados
normalmente para fabricar el oligómero. Con este método, el PNA será
etiquetado generalmente en disolución mediante la reacción de un
grupo funcional sobre el polímero y un grupo funcional sobre la
marca. Aquellos con conocimientos en la técnica reconocerán que la
composición de la disolución de acoplamiento dependerá de la
naturaleza del oligómero y del resto dador o aceptor. La disolución
puede comprender un disolvente orgánico, agua o cualquier
combinación de ellos. Generalmente, el disolvente orgánico será un
disolvente polar no nucleófilo. Los ejemplos no limitantes de
disolventes orgánicos incluyen acetonitrilo, tetrahidrofurano,
dioxano, sulfóxido de metilo y
N,N'-dimetilformamida.
Generalmente, el grupo funcional del polímero que
va a ser marcado será una amina y el grupo funcional de la marca
será un ácido carboxílico o un ácido carboxílico activado. Los
ejemplos no limitantes de grupos funcionales de ácido carboxílico
activado incluyen los ésteres de
N-hidroxisuccinimidilo. En disoluciones acuosas, el
grupo de ácido carboxílico tanto del PNA como de la marca
(dependiendo de la naturaleza de los componentes elegidos) puede ser
activado con una carbodiimida soluble en agua. El reactivo,
hidrocloruro de
1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida
(EDC), es un reactivo disponible comercialmente que se vende
específicamente para reacciones acuosas de condensación de
formación de amidas.
Generalmente, el pH de una disolución acuosa será
modulado con una disolución tampón durante la reacción de
condensación. Preferiblemente, el pH durante la condensación está en
el intervalo de 4 a 10. Si se condensa una arilamina con el ácido
carboxílico, el pH está preferiblemente en el intervalo de 7 a 10.
Generalmente, la basicidad de las reacciones no acuosas será
modulada mediante la adición de bases orgánicas no nucleófilas. Los
ejemplos no limitantes de bases adecuadas incluyen la
N-metilmorfolina, la trietetilamina y la
N,N-diisopropiletilamina. De forma alternativa, el
pH es modulado usando tampones orgánicos tales como el ácido
N-[2-hidroxietil]piperazina-N'-2-etanosulfónico
(HEPES) ó el ácido 4-morfolinetanosulfónico (MES) o
tampones inorgánicos tales como el bicarbonato sódico.
Generalmente, se usa espaciadores para minimizar
los efectos adversos que podrían presentar reactivos de marcado
voluminosos sobre las propiedades de hibridación de las Balizas
Lineales. Los ligandos inducen típicamente flexibilidad y
aleatoriedad en la Baliza Lineal, o unen dos o más secuencias de
nucleobases de una sonda. Los restos espaciadores/ligandos
preferidos para las sondas de esta invención consisten en uno o más
ácidos carboxílicos de aminoalquilo (por ejemplo, ácido
aminocaproico), la cadena lateral de un aminoácido (por ejemplo, la
cadena lateral de una lisina o de una ornitina), aminoácidos
naturales (por ejemplo, ácido succínico) o alquiloxi diácidos (por
ejemplo, ácido diglicólico). Los restos espaciadores/ligandos
también pueden ser diseñados para potenciar la solubilidad de la
Baliza Lineal.
Preferiblemente, un resto espaciador/ligando
comprende uno o más compuestos unidos que presentan la fórmula:
-Y-(O_{m}-(CW_{2})_{n})_{n}-Z-.
El grupo Y presenta la fórmula: un enlace sencillo,
-(CW_{2})_{p}-, -C(O)(CW_{2})_{p}-,
-C(S)(CW_{2})_{p}- y
-S(O_{2})(CW_{2})_{p}-. El grupo Z presenta la
fórmula NH, NR^{2}, S ó O. Cada W es independientemente H,
R^{2}, -OR^{2}, F, Cl, Br ó I; en el que, cada R^{2} es
seleccionado de forma independiente del grupo que consiste en
-CX_{3}, -CX_{2}CX_{3}, -CX_{2}CX_{2}CX_{3},
-CX_{3}CX(CX_{3})_{2}, y
-C(CX_{3})_{3}. Cada X es de forma independiente
H, F, Cl, Br ó I. Cada m es de forma independiente 0 ó 1. Cada n, o
y p son de forma independiente números enteros entre 0 y 10.
Un oligómero quimérico comprende dos o más
subunidades unidas que son seleccionadas entre las diferentes clases
de subunidades. Por ejemplo, una quimera PNA/ADN comprendería al
menos dos subunidades de PNA unidas a al menos una subunidad de
ácido 2'-desoxirribonucleico (para métodos y
composiciones relacionados con la preparación de quimeras PNA/ADN:
WO96/40709). Las subunidades componentes de los oligómeros
quiméricos son seleccionados del grupo que consiste en subunidades
de PNA, subunidades de ADN, subunidades de ARN y sus análogos.
Un polímero unidos comprende dos o más secuencias
de nucleobases que están unidas mediante un ligando. Las secuencias
de nucleobases que están ligadas para formar el polímero ligado son
seleccionadas del grupo que consiste en un oligodesoxinucleótido, un
oligorribonucleótido, un ácido nucleico de péptido y un oligómero
quimérico. Las sondas de PNA de esta invención incluyen polímeros
unidos en los que la secuencia de nucleobases sonda está unida a uno
o más oligodesoxinucleótidos, oligorribonucleótidos, ácidos
nucleicos de péptido o oligómeros quiméricos adicionales.
Aquellos con conocimientos en la técnica de la
hibridación de ácidos nucleicos reconocerán que los factores usados
habitualmente para imponer o controlar la severidad de la
hibridación incluyen la concentración de formamida (o de otro
reactivo químico desnaturalizante), la concentración de sal (es
decir, la fuerza iónica), la temperatura de hibridación, la
concentración de detergente, el pH y la presencia o ausencia de
caótropos. La severidad óptima para una combinación de secuencia de
nucleobases sonda/secuencia objetivo a menudo es determinada
mediante la conocida técnica de ajustar varios de los factores de
severidad anteriormente mencionados y, a continuación, determinar
el efecto de variar un único factor de severidad. Para controlar la
severidad de la hibridación de Balizas Lineares a secuencias
objetivo se pueden modular los mismos factores de severidad, con la
salvedad de que la hibridación de un PNA es bastante independiente
de la fuerza iónica. La severidad óptima para un ensayo puede ser
determinada experimentalmente mediante el examen de cada factor de
severidad hasta que se alcanza el grado de discriminación
deseado.
La secuencia de nucleobases sonda de una Baliza
Lineal es la porción de reconocimiento de la secuencia del
constructo. Por tanto, la secuencia de nucleobases sonda está
diseñada para hibridarse con al menos una porción de la secuencia
objetivo. Preferiblemente, la secuencia de nucleobases sonda se
hibrida con la secuencia objetivo completa. La secuencia de
nucleobases sonda no es un polinucleótido y, preferiblemente, la
secuencia de nucleobases sonda está compuesta exclusivamente por
subunidades de PNA. Por tanto, de forma general la longitud de
subunidad de la secuencia de nucleobases sonda será elegida de tal
modo que se forme un complejo estable entre la Baliza Lineal y la
secuencia objetivo que se pretende detectar, bajo las condiciones
de hibridación adecuadas. La secuencia de nucleobases sonda de un
oligómero de PNA, adecuado para la práctica de esta invención,
presentará de forma general una longitud de entre 5 y 30
subunidades de PNA. Preferiblemente, la secuencia de nucleobases
sonda tendrá de 8 a 18 subunidades de longitud. Aún más
preferiblemente, la secuencia de nucleobases sonda tendrá de 11 a 17
subunidades de longitud.
La secuencia de nucleobases sonda de Balizas
Lineales presentará de forma general una secuencia de nucleobases
que es complementaria a la secuencia objetivo. De forma
alternativa, podría usarse una secuencia sonda sustancialmente
complementaria puesto que se ha demostrado que se puede obtener una
mayor discriminación de secuencia cuando se utilizan sondas en las
que existe un único punto de mutación (incoherencia de bases) entre
la secuencia de nucleobases sonda y la secuencia objetivo (Véase:
Guo y col., Nature Biotechnology 15: 331-335
(1997), Guo y col., WO97/46711; y Guo y col., EE.UU.
5.780.233).
Las sondas de bloqueo son sondas de PNA o de
ácido nucleico que pueden ser usadas para suprimir la unión de la
secuencia de nucleobases sonda de una sonda a una posición de
hibridación que no está relacionada o relacionada íntimamente con
la secuencia objetivo (Véase: Coull y col., PCT/US97/21845, también
denominada WO98/24933). De forma general, las sondas de bloqueo
suprimen la unión de la secuencia de nucleobases sonda a secuencias
no objetivo íntimamente relacionadas debido a que la sonda de
bloqueo se hibrida con la secuencia no objetivo para formar un
complejo termodinámicamente más estable que el formado mediante la
hibridación entre la secuencia de nucleobases sonda y la secuencia
no objetivo. De este modo, las sondas de bloqueo habitualmente son
sondas no marcadas usadas en un ensayo para suprimir una señal no
específica. Debido a que normalmente son diseñadas para hibridarse
a secuencias no objetivo íntimamente relacionadas, de forma típica
se usará un conjunto de dos o más sondas de bloqueo en un ensayo
para suprimir una señal no específica procedente de secuencias no
objetivo que podrían estar presentes e interferir con la
realización del ensayo.
Se describen Balizas Lineales que son adecuadas
para facilitar la transferencia de energía entre los restos dador y
aceptor cuando la sonda no está hibridada a su secuencia objetivo.
Sin embargo, la hibridación de la sonda con su secuencia objetivo
alterará la eficacia de la transferencia de energía entre los restos
dador y aceptor, dando como resultado un cambio mensurable en la
señal asociada a al menos un miembro del Conjunto de Balizas.
Generalmente, una Baliza Lineal es un polímero
que como mínimo comprende al menos un resto dador unido y al menos
un resto aceptor unido, en el que dichos restos dador y aceptor
están separados por al menos una porción de una secuencia de
nucleobases sonda en la que la secuencia de nucleobases sonda es
adecuada para la hibridación con una secuencia objetivo
complementaria o sustancialmente complementaria, bajo las
condiciones de hibridación adecuadas. Por diseño, una Baliza Lineal
no forma un tallo de horquilla. Preferiblemente, los restos dador y
aceptor están unidos en extremos opuestos de la secuencia de
nucleobases sonda. La Baliza Lineal se caracteriza además porque la
eficacia de la transferencia de energía entre dichos restos dador y
aceptor, cuando el polímero está solvatado en disolución acuosa, es
sustancialmente independiente de al menos dos factores variables
seleccionados del grupo que consiste en la longitud de subunidades
que separan los restos dador y aceptor, el solapamiento espectral
del resto dador y del resto aceptor, la presencia o la ausencia de
magnesio en la disolución acuosa y la fuerza iónica de la disolución
acuosa. Preferiblemente, la Baliza Lineal se caracteriza además
porque la eficacia de la transferencia de energía entre dichos
restos dador y aceptor es sustancialmente independiente de al menos
tres factores variables y, aún más preferiblemente, sustancialmente
independiente de todos los cuatro factores variables.
En una realización preferida, la Baliza Lineal es
un polímero que, como mínimo, consiste en una secuencia de
nucleobases sonda que tiene un primer y un segundo extremo. La
secuencia de nucleobases sonda es complementaria o sustancialmente
complementaria a una secuencia objetivo de interés. Al menos un
resto dador está unido a uno de los extremos, primero o segundo, de
la secuencia de nucleobases sonda; y al menos un resto aceptor está
unido al otro extremo de la secuencia de nucleobases sonda. Se
pueden usar uno o más restos espaciadores o de unión para conectar
los restos dador y aceptor a los respectivos extremos de la
secuencia de nucleobases sonda. En una realización aún más
preferida, la Baliza Lineal es un oligómero de PNA.
Las Balizas Lineales pueden comprender una única
secuencia de nucleobases sonda (como se ha descrito previamente en
este documento) y restos dador y aceptor unidos de un Conjunto de
Balizas, u opcionalmente pueden comprender restos adicionales
unidos. Los ejemplos no limitantes de restos adicionales unidos
incluyen otros marcadores, ligandos, espaciadores, aminoácidos
naturales o no naturales, péptidos, proteínas, ácidos nucleicos,
enzimas y/o una o más subunidades de PNA, ADN o ARN. Los restos
adicionales pueden ser funcionales o no funcionales en un ensayo.
Sin embargo, generalmente los restos adicionales serán
seleccionados para ser funcionales, dentro del diseño del ensayo en
el que se van a usar las Balizas Lineales. Las Balizas Lineales de
esta invención opcionalmente pueden estar inmovilizadas sobre una
superficie.
Como ejemplo no limitante, una Baliza Lineal de
esta invención puede comprender un ácido nucleico unido a una
secuencia de nucleobases sonda en la que el ácido nucleico podría
hibridarse a una segunda secuencia objetivo. Como segundo ejemplo
no limitante, una Baliza Lineal puede comprender una enzima unida a
una secuencia de nucleobases sonda en la que la enzima podría ser
usada en un esquema de detección secundario. Un tercer ejemplo no
limitante de una Baliza Lineal podría comprender un anticuerpo
unido a la secuencia de nucleobases sonda en el que el anticuerpo
podría ser usado en un esquema de detección secundario. Como cuarto
ejemplo no limitante, una Baliza Lineal podría comprender uno o más
restos unidos a una secuencia de nucleobases sonda en la que se
usan uno o más restos espaciadores para enlazar la Baliza Lineal a
un soporte.
Existen muchas diferencias entre la técnica
anterior y los constructos de ácidos nucleicos y las Balizas
Lineales de esta invención. Por ejemplo, los constructos de ácidos
nucleicos comprenden una cadena principal de polinucleótidos,
mientras que las Balizas Lineales de esta invención comprenden una
secuencia de nucleobases sonda que no es un polinucleótido. En una
realización preferida, las Balizas Lineales compuestas de PNA
presentan todas las propiedades favorables de los PNA, tales como
resistencia a la degradación por nucleasa, hibridación de secuencia
con ácidos nucleicos complementarios independiente de la sal y una
cinética de hibridación extremadamente rápida.
Adicionalmente, la transferencia de energía entre
los restos dador y aceptor de una Baliza Lineal es sustancialmente
independiente de la presencia o de la ausencia de magnesio, de la
fuerza iónica del entorno de la sonda y de la secuencia de
nucleobases de la sonda (Véase: Ejemplos 17, 18 y 21 de esta
especificación). De forma más sorprendente, la eficacia de la
transferencia de energía entre los restos dador y aceptor de un
Conjunto de Balizas es sustancialmente independiente de la longitud
de subunidades que separan los restos dador y aceptor, mientras que
la transferencia de energía entre restos pertenecientes a ácidos
nucleicos que tienen la misma secuencia de nucleobases y la misma
configuración de marcado presenta una dependencia sustancial de la
longitud de la sonda (Véase: Ejemplos 17 y 18 de esta
especificación).
Aún más sorprendentemente, las Balizas Lineales
realizan su función tanto si los restos dador y aceptor presentan un
solapamiento sustancial o no del espectro de emisión del resto dador
y del espectro de absorbancia del resto aceptor (Véase: Ejemplos
17, 18 y 21 de esta especificación). Sin pretender restringirse a
esta hipótesis, estos datos sugieren que la colisión o el contacto
funcionan como modo primario de transferencia de energía en las
Balizas Lineales en comparación con los ácidos nucleicos en los que
se ha descrito la FRET como fuente primaria de la transferencia de
energía entre los restos dador y aceptor.
Las ventajas adicionales de las Balizas Lineales
incluyen la facilidad de síntesis en comparación con los
constructos que comprenden subunidades adicionales para formar
segmentos de brazo. Adicionalmente, los datos recopilados por los
solicitantes demuestran que las Balizas Lineales se hibridan más
rápidamente que los constructos que comprenden subunidades
adicionales para forma segmentos de brazo (Véase: Ejemplos 15 y 16
de esta especificación).
En otra realización, esta invención está dirigida
a conjuntos de Balizas Lineales adecuados para detectar o
identificar la presencia, ausencia o cantidad de dos o más
secuencias objetivo diferentes que podrían estar presentes en una
muestra. Las características de las Balizas Lineales adecuadas para
la detección, identificación o cuantificación de secuencias
objetivo han sido descritas aquí previamente. El agrupamiento de
Balizas Lineales en conjuntos que se caracterizan por la detección
específica de dos o más secuencias objetivo es una realización
preferida de esta invención.
Los conjuntos de sondas de esta invención
comprenderán al menos una Baliza Lineal, pero no necesitan
comprender únicamente Balizas Lineales. Por ejemplo, los conjuntos
de sondas de esta invención pueden comprender mezclas de Balizas
Lineales, otras sondas PNA y/o sondas de ácido nucleico, aunque
siempre que un conjunto comprenda al menos una Baliza Lineal como
las descritas aquí. En las realizaciones preferidas, al menos una
sonda del conjunto es una sonda de bloqueo, tal como se ha definido
aquí.
Opcionalmente se pueden inmovilizar una o más
Balizas Lineales sobre una superficie. En una realización, la sonda
puede ser inmovilizada sobre la superficie usando el conocido
proceso de reticulación mediante UV. De forma alternativa, el
oligómero de PNA es sintetizado sobre la superficie de un modo
adecuado para la desprotección pero no la separación del soporte de
síntesis.
Preferiblemente, la sonda se une covalentemente a
la superficie mediante la reacción entre grupos funcionales
adecuados entre la sonda y el soporte. Grupos funcionales tales como
los grupos amino, los ácidos carboxílicos y los tioles pueden ser
incorporados en una Baliza Lineal mediante la prolongación de uno de
los extremos con restos protegidos adecuados (por ejemplo, lisina,
ácido glutámico y Cistina). Cuando se prolonga un extremo, se puede
usar un grupo funcional de un aminoácido ramificado tal como la
lisina para incorporar la marca de dador o de aceptor en la posición
apropiada dentro del polímero (Véase: la Sección titulada
"Marcado de PNA"), mientras que el otro grupo funcional de la
rama se usa para prolongar opcionalmente aún más el polímero e
inmovilizarlo sobre una superficie.
Los métodos para la unión de sondas a superficies
generalmente incluyen la reacción de un grupo nucleófilo (por
ejemplo, una amina o un tiol) de la sonda que va a ser
inmovilizada, con un grupo electrófilo del soporte que se va a
modificar. De forma alternativa, el nucleófilo puede estar presente
sobre el soporte y el electrófilo (por ejemplo, un ácido
carboxílico activado) puede estar presente en la Baliza Lineal.
Debido a que el PNA nativo posee un extremo amino, un PNA no
requerirá necesariamente una modificación para ser inmovilizado
sobre una superficie (Véase: Lester y col., Póster titulado "PNA
Array Technology").
Las condiciones adecuadas para la inmovilización
de un PNA sobre una superficie generalmente serán similares a las
condiciones adecuadas para el marcado de un PNA (Véase: el
subapartado "Marcado de PNA"). La reacción de inmovilización es
esencialmente equivalente al marcado del PNA sustituyendo el
marcador por la superficie sobre la que la sonda de PNA va a ser
inmovilizada.
Numerosos tipos de superficies derivatizadas con
grupos amino, con grupos de ácido carboxílico, con isocianatos, con
isotiocianatos y con grupos de malimida están disponibles
comercialmente. Los ejemplos no limitantes de superficies adecuadas
incluyen membranas, vidrio, vidrio de poro controlado, partículas de
poliestireno (bolitas), sílice y nanopartículas de oro.
Cuando se encuentra inmovilizado sobre una
superficie, la transferencia de energía entre los restos de un
Conjunto de Balizas se producirá en la Baliza Lineal. Mediante la
hibridación con una secuencia objetivo bajo las condiciones de
hibridación adecuadas, la posición de la superficie sobre la que se
une la Baliza Lineal (de secuencia conocida) generará una señal
detectable basada en el cambio mensurable de la señal de al menos
un miembro del Conjunto de Balizas de la Baliza Lineal
inmovilizada. Por consiguiente, la intensidad de la señal sobre la
superficie puede ser usada para detectar, identificar o cuantificar
la presencia o la cantidad de una secuencia objetivo en una muestra
que se pone en contacto con la superficie sobre la que está
inmovilizada la Baliza Lineal. En una realización preferida, la
detección de fluorescencia superficial será usada para detectar la
hibridación con una secuencia objetivo.
En las realizaciones preferidas de esta
invención, se realiza un ensayo de hibridación múltiple. En un
ensayo múltiple, se examinan simultáneamente numerosas condiciones
de interés. El análisis múltiple se basa en la capacidad de
clasificar los componentes de la muestra o los datos asociados a
ellos, durante o después de que se haya completado el ensayo. En
las realizaciones preferidas de la invención, se usan restos
distintos detectables de forma independiente para marcar las
diferentes Balizas Lineales de un conjunto. La capacidad para
diferenciar y/o cuantificar cada uno de los restos detectables
independientemente proporciona los medios para realizar un ensayo
de hibridación múltiple debido a que los datos que se correlacionan
con la hibridación de cada una de las Balizas Lineales marcadas de
forma distinta (independientemente) con una secuencia objetivo
pueden ser correlacionados con la presencia, la ausencia o la
cantidad de la secuencia objetivo que se pretende detectar en la
muestra. Por consiguiente, los ensayos múltiples de esta invención
pueden ser usados para detectar simultáneamente la presencia, la
ausencia o la cantidad de una o más secuencias objetivo que puedan
estar presentes en la misma muestra en el mismo ensayo.
Preferiblemente, se usarán fluoróforos detectables
independientemente como restos detectables independientemente de un
ensayo múltiple que usa Balizas Lineales. Por ejemplo, dos Balizas
Lineales podrían ser usadas para detectar cada una de las dos
secuencias objetivo diferentes en las que se podría usar una sonda
marcada con fluoresceína (verde) para detectar la primera de las dos
secuencias objetivo y se podría usar una sonda marcada con rodamina
o Cy3 (rojo) para detectar la segunda de las dos secuencias
objetivo.
Por consiguiente, una señal verde, roja o verde y
roja en el ensayo significaría la presencia de la primera, segunda,
y primera y segunda secuencias objetivo, respectivamente.
Los sistemas son superficies sobre las cuales se
han inmovilizado dos o más sondas de interés en localizaciones
predeterminadas. En la bibliografía se han descrito sistemas
comprenden tanto sondas de ácido nucleico como de PNA. Las
secuencias sonda inmovilizadas sobre el sistema son elegidas
juiciosamente para analizar una muestra que puede contener una o
más secuencias objetivo de interés. Debido a que se conoce la
localización y la secuencia de cada sonda, generalmente los
sistemas son usados para detectar, identificar o cuantificar
simultáneamente la presencia o la cantidad de una o más secuencias
objetivo en la muestra. De este modo, los sistemas de PNA pueden
ser útiles en aplicaciones de diagnóstico o en el escrutinio de
compuestos en busca de características que podrían presentar
utilidad terapéutica.
Por ejemplo, en un ensayo de diagnosis la sonda
complementaria sobre la superficie del sistema captura una secuencia
objetivo y, a continuación, el complejo sonda/secuencia objetivo es
detectado usando un sistema de detección secundario. En una
realización el complejo sonda/secuencia objetivo es detectado
usando una segunda sonda que se hibrida con otra secuencia de la
molécula objetivo de interés. En otra realización, se usa un
anticuerpo marcado para detectar, identificar o cuantificar la
presencia del complejo sonda/secuencia objetivo.
Puesto que la composición de la Baliza Lineal es
conocida en la localización sobre la superficie del sistema (debido
a que el PNA fue sintetizado o unido en esta posición del sistema),
la composición de la secuencia(s) objetivo puede ser
detectada, identificada o cuantificada directamente mediante la
determinación de la localización de la señal detectable generada en
el sistema. Debido a que la hibridación de la Baliza Lineal con una
secuencia objetivo es auto-indicativa, no se
necesita ningún sistema de detección secundario para analizar el
sistema en busca de hibridación entre la Baliza Lineal y la
secuencia objetivo.
Los sistemas compuestos de PNAs presentan la
ventaja adicional de que los PNAs son altamente estables y no
deberían ser degradados por las enzimas que degradan ácidos
nucleicos. Por tanto, los sistemas de PNA deberían ser
reutilizables ya que el ácido nucleico procedente de una muestra
puede ser limpiado del sistema antes de introducir la segunda
muestra. Con la limpieza de las secuencias objetivo hibridadas, la
señal del sistema de Balizas Lineales debería volver de nuevo a
niveles de ruido de fondo. Debido a que los PNAs no son degradados
por el calor o por la actividad de endonucleasas y exonucleasas,
los sistemas de Balizas Lineales deberían ser adecuados para la
regeneración rápida y sencilla por tratamiento con calor, nucleasas
o desnaturalizantes químicos tales como las disoluciones acuosas
que contienen formamida, urea y/o hidróxido sódico.
En otra realización más, esta invención está
dirigida a un método para la detección, identificación o
cuantificación de una secuencia objetivo en una muestra. El método
comprende poner en contacto la muestra con una Baliza Lineal y a
continuación detectar, identificar o cuantificar el cambio en la
señal detectable asociada con al menos un resto de un Conjunto de
Balizas mediante el cual es posible la correlación entre la señal
detectable y la hibridación, ya que las Balizas Lineales son
auto-indicativas. Debido a que las Balizas Lineales
son auto-indicativas, este método es
particularmente adecuado para el análisis realizado en un ensayo en
tubo cerrado (también conocido como "ensayos homogéneos"). Con
ensayo de tubo cerrado queremos decir que una vez que los
componentes del ensayo han sido combinados, no hay necesidad de
abrir el tubo o de retirar el contenido del ensayo para determinar
el resultado. Ya que el tubo no necesita ser abierto, y
preferiblemente no lo será, para determinar el resultado, debe
haber algún cambio detectable o mensurable que se produzca y que
pueda ser observado o cuantificado sin abrir el tubo o retirar el
contenido del ensayo. De este modo, la mayoría de los ensayos en
tubo cerrado se basan en un cambio en la fluorescencia que puede
ser observado a simple vista o bien puede ser detectado y/o
cuantificado con un instrumento de fluorescencia que usa el tubo
como sujeción de la muestra. Los ejemplos de dichos instrumentos
incluyen el Light Cycler de Idazo Technologies y el Prism 7700 de
Perkin Elmer.
Los ensayos en tubo cerrado preferidos de esta
invención comprenden la detección de secuencias objetivo de ácido
nucleico que han sido sintetizadas o amplificadas mediante la
operación del ensayo. Los ejemplos no limitantes de síntesis de
ácidos nucleicos preferidos o de reacciones de amplificación de
ácido nucleico son la Reacción en Cadena de Polimerasa (PCR, del
inglés "Polymerase Chain Reaction"), la Reacción en Cadena de
Ligasa (LCR, del inglés "Ligase Chain Reaction"), la
Amplificación de Desplazamiento de Cadena (SDA, del inglés "Strand
Displacement Amplification"), la Amplificación Mediada por
Transcripción (TMA, del inglés
"Transcription-Mediated Amplification"), la
Amplificación Circular en Rollo (RCA, del inglés "Rolling Circle
Amplification") y la replicasa Q-beta. Las
Balizas Lineales presentes en el ensayo de tubo cerrado generarán
una señal detectable como respuesta a la producción de secuencia
objetivo procedente de la síntesis de ácido nucleico o de reacción
de amplificación de ácido nucleico que se está produciendo en el
ensayo en tubo cerrado. En una realización más preferida, el ensayo
es una reacción PCR asimétrica (Véase: Ejemplo 19 de esta
especificación).
Debido a que las Balizas Lineales de esta
invención pueden ser diseñadas para ser estables frente a las
enzimas que se encuentran en la célula, este método es
particularmente adecuado para detectar una secuencia objetivo dentro
de una célula, tejido u organismo, tanto si está vivo como si no.
De este modo, en las realizaciones preferidas, se usa la
hibridación in-situ como formato de ensayo
para detectar, identificar o cuantificar organismos objetivo (Véase:
Ejemplo 20 de esta especificación). Más preferiblemente, el formato
de ensayo es la hibridación in-situ de
fluorescencia (FISH ó PNA-FISH). Los ejemplos de
métodos para llevar a cabo la PNA-FISH puede
encontrarse en: Thisted y col., Cell Vision, 3:
358-363 (1996) ó la Solicitud de Patente de WIPO
WO97/18325.
Los organismos que han sido tratados con las
Balizas Lineales de esta invención pueden ser detectados mediante
varios métodos ejemplares. Las células pueden ser fijadas sobre
portaobjetos y a continuación son visualizadas con un microscopio o
con un dispositivo de escaneo por láser. De forma alternativa, las
células pueden ser fijadas y a continuación analizadas en un
citómetro de flujo (Véase por ejemplo: Lansdorp y col.; Solicitud
de Patente de WIPO nº WO97/14026). Los escáneres de portaobjeto y
los citómetros de flujo son particularmente útiles para cuantificar
de forma rápida el número de organismos objetivo presentes en una
muestra de interés.
Debido a que el método de esta invención puede
ser usado en un ensayo de hibridación basado en sondas, esta
invención encontrará utilidad en la mejora de los ensayos usados
para detectar, identificar o cuantificar la presencia o la cantidad
de un organismo o de un virus en una muestra a través de la
detección de secuencias objetivo asociadas al organismo o al virus.
(Véase: Patente de Estados Unidos Nº 5.641.631, titulada "Method
for detecting, identifying and quantitating organisms and
viruses". De forma similar, esta invención también encontrará
utilidad en un ensayo usado en la detección, identificación o
cuantificación de una o más especies de un organismo en una muestra
(Véase: Patente de Estados Unidos Nº 5.288.611, titulada "Method
for detecting, identifying and quantitating organisms and
viruses"). Esta invención también encontrará utilidad en un
ensayo usado para determinar el efecto de agentes antimicrobianos
sobre el crecimiento de uno o más microorganismos en una muestra
(Véase: Patente de Estados Unidos Nº 5.612.183, titulado "Method
for determining the effect of antimicrobial agents on growth using
ribosomal nucleic acid subunit subsequence specific probes").
Esta invención también encontrará utilidad en un ensayo usado para
determinar la presencia o la cantidad de un grupo taxonómico de
organismos en una muestra (Véase: Patente de Estados Unidos Nº
5.601.984, titulada "Method for detecting the presence of amount
of a taxonomic group of organisms using specific
r-RNA subsequences as probes").
Cuando se lleva a cabo el método de esta
invención, puede ser preferible usar una o más sondas sin marcar o
detectables de forma independiente en el ensayo para suprimir con
ello la unión de la Baliza Lineal a una secuencia no objetivo. La
presencia de la "sonda(s) de bloqueo" ayuda a
incrementar la discriminación del ensayo y con ello mejorar la
fiabilidad y la sensibilidad (relación señal ruido).
En determinadas realizaciones de esta invención,
una secuencia objetivo está inmovilizada sobre una superficie
mediante el tratamiento apropiado de la muestra. La inmovilización
del ácido nucleico puede ser llevada a cabo fácilmente mediante la
aplicación de la muestra a una membrana y a continuación mediante
reticulación con UV. Por ejemplo, las muestras pueden disponerse en
un sistema de tal modo que el sistema puede ser interrogado
secuencialmente con una o más Balizas Lineales para determinar con
ello si cada muestra contiene una o más secuencias objetivo de
interés.
En otra realización más, la Baliza Lineal es
inmovilizada sobre un soporte y las muestras son interrogadas
secuencialmente para determinar con ello si cada muestra contiene
una secuencia objetivo de interés. En las realizaciones preferidas,
las Balizas Lineales son inmovilizadas sobre un sistema que se pone
en contacto con la muestra de interés. Por consiguiente, la muestra
puede ser analizada simultáneamente para evaluar la presencia y la
cantidad de numerosas secuencias objetivo de interés en las que la
composición de las Balizas Lineales es elegida juiciosamente y son
dispuestas en localizaciones predeterminadas sobre la superficie de
tal modo que la presencia, la ausencia o la cantidad de secuencias
objetivo en particular puede ser determinada de forma no ambigua.
Los sistemas de Balizas Lineales son particularmente útiles debido
a que no se requiere un sistema de detección secundario. Por
consiguiente, esta invención también está dirigida a un sistema que
comprende dos o más Balizas Lineales unidas a soportes adecuadas
para la detección, identificación o cuantificación de una secuencia
objetivo de interés.
En otra realización más, esta invención está
dirigida a kits adecuados para llevar a cabo un ensayo que detecta
la presencia, la ausencia o la cantidad de una o más secuencias
objetivo que pueden estar presentes en una muestra. Las
características de las Balizas Lineales adecuadas para la detección,
identificación o cuantificación de la cantidad de una o más
secuencias objetivo han sido descritas previamente en este
documento. Además, los métodos adecuados para usar los componentes
de Baliza Lineal de un kit para detectar, identificar o cuantificar
una o más secuencias objetivo que pueden estar presentes en una
muestra que también ha sido descrita previamente en este
documen-
to.
to.
Los kits de esta invención comprenden una o más
Balizas Lineales y otros reactivos o composiciones que son
seleccionados para realizar un ensayo o para simplificar la
realización de un ensayo. Los kits preferidos contienen conjuntos
de Balizas Lineales, en los que cada una de al menos dos Balizas
Lineales del conjunto son usadas para detectar de forma distintiva
y para distinguir entre las dos o más secuencias objetivo
diferentes que pueden estar presentes en la muestra. De este modo,
las Balizas Lineales del conjunto están marcados preferiblemente
con restos detectables de forma independiente de tal modo que cada
uno de los dos o más secuencias objetivo diferentes pueden ser
detectadas, identificadas o cuantificadas de forma individual (un
ensayo múltiple).
Tanto unidos a un soporte como en disolución, los
métodos, kits y composiciones de esta invención son particularmente
útiles para la detección rápida, sensible, fiable y versátil de
secuencias objetivo que son particulares de organismos que podrían
ser encontrados en alimentos, bebidas, agua, productos
farmacéuticos, productos de cuidado personal, productos lácteos o
muestra medioambientales. El análisis de bebidas preferidas incluye
la soda, el agua embotellada, el zumo de fruta, la cerveza, el vino
o productos de licor. Por consiguiente, los métodos, kits y
composiciones de esta invención serán particularmente útiles para el
análisis de materias primas, equipamiento, productos o procesos
usados en la fabricación o el almacenamiento de comida, bebidas,
agua, productos farmacéuticos, productos de cuidado personal,
productos lácteos o muestras medioambientales.
Tanto unidos a soportes como en disolución, los
métodos, kits y composiciones de esta invención son particularmente
útiles para la detección rápida, sensible, fiable y versátil de
secuencias objetivo que son particulares de organismos que podrían
ser encontrados en entornos clínicos. Por consiguiente, los métodos,
los kits y las composiciones de esta invención serán
particularmente útiles para el análisis de especímenes o
equipamientos clínicos, muebles o productos usados para tratar
humanos o animales. Por ejemplo, el ensayo puede ser usado para
detectar una secuencia objetivo que es específica para una
enfermedad de base genética o que es específica para una
predisposición hacia una enfermedad de base genética. Los ejemplos
no limitantes de enfermedades incluyen
\beta-Talasemia, anemia de célula enferma,
Factor-V Leiden, fibrosis cística y objetivos
relacionados con el cáncer tales como p53, p10,
BRC-1 y
\hbox{BRC-2.}
En otra realización más, la secuencia objetivo
puede estar relacionada con un ADN cromosomal, en el que la
detección, la identificación o la cuantificación de la secuencia
objetivo puede ser usada en relación con técnicas forenses tales
como el escrutinio prenatal, la prueba de paternidad, la
confirmación de identidad o la investigación de un crimen.
La Figura 1A es una ilustración gráfica de
fluorescencia frente a los datos de temperatura para sondas de PNA
que presentan un Perfil Térmico Fluorescente de Tipo A.
Las Figuras 1B1, 1B2 y 1B3 son ilustraciones
gráficas de fluorescencia frente a los datos de temperatura para las
sondas de PNA que presentan un Perfil Térmico Fluorescente de Tipo
B.
La Figura 1C es una ilustración gráfica de
fluorescencia frente a los datos de temperatura para sondas de PNA
que presentan un Perfil Térmico Fluorescente de Tipo C.
Las Figuras 2A1 y 2A2 son una ilustración gráfica
de fluorescencia frente a datos de tiempo para sondas de PNA que
presentan un Perfil de Hibridación de Tipo A.
La Figura 2B es una ilustración gráfica de
fluorescencia frente a datos de tiempo para sondas de PNA que
presentan un Perfil de Hibridación de Tipo B.
La Figura 2C es una ilustración gráfica de
fluorescencia frente a datos de tiempo para sondas de PNA que
presentan un Perfil de Hibridación de Tipo C.
La Figura 3 es una ilustración gráfica de datos
de ruido (fluorescencia de fondo) para sondas de ADN y de PNA de
diferentes longitudes y configuraciones de marcado.
Las Figuras 4A, 4B, 4C, 4D y 4E son ilustraciones
gráficas de datos de relación señal ruido para sondas de PNA y de
ADN de 11 a 15 subunidades de longitud.
La Figura 5 es una imagen digital de dos tubos
eppendorf que contienen cada uno el contenido de una reacción que
sufrió 45 ciclos de PCR y que contiene una Baliza Lineal.
Las Figuras 6A y 6B son imágenes digitales de
portaobjetos de muestras que contienen bacterias de E. coli,
P. aeruginosa o B. subtilis que fueron tratadas con
Balizas Lineales y con yoduro de propidio en las que las Balizas
comprenden la secuencia de nucleobases sonda específica tanto para
P. aeruginosa (Figura 6A) o para B. subtilis (Figura
6B). Las imágenes fueron obtenidas usando un microscopio de
fluorescencia y filtros de luz disponibles comercialmente acoplados
al microscopio y a la cámara respectivamente. En ambas Figuras, los
cuadros I, III y IV son las imágenes rojas obtenidas usando un
microscopio rojo y un filtro de cámara en el que son visibles las
células tintadas con yoduro de propidio. En ambas Figuras, los
cuadros II, IV y VI son las imágenes verdes obtenidas usando un
microscopio verde y un filtro de cámara.
Las Figuras 7A y 7B son representaciones gráficas
de datos recopilados relativos al ruido y a las relaciones señal
ruido para una sonda de PNA Cy3 marcada con 15-mero
que presenta una secuencia de nucleobases revuelta.
La Figura 8 es una ilustración gráfica de
relaciones señal ruido de ensayos de hibridación para las sondas
enumeradas en la Tabla 1A.
Esta invención se ilustra ahora mediante los
siguientes ejemplos que no pretenden ser limitantes en modo
alguno.
A 20 mmol de
N-\alpha-(Fmoc)-N-\varepsilon-(t-boc)-L-lisina-OH
se les añadió 60 mL de diclorometano (DCM)/ácido trifluoroacético
(TFA) 2/1. Se dejó agitar la disolución hasta que el grupo
terc-butiloxicarbonilo (t-boc) ha sido completamente
eliminado del
N-\alpha-(Fmoc)-N-\varepsilon-(t-boc)-L-lisina-OH.
La disolución fue evaporado a continuación hasta sequedad y el
residuo fue redisuelto en 15 mL de DCM. A continuación se realizó
un intento para precipitar el producto mediante la adición gota a
gota de la disolución de 350 mL de éter etílico. Debido a que el
producto se salió, el éter etílico fue decantado y el aceite fue
puesto bajo un elevado vacío para dar lugar a una espuma blanca. La
espuma blanca fue disuelta en 250 mL de agua y la disolución fue
neutralizada hasta pH 4 mediante la adición de fosfato de sodio
saturado (dibásico). Se formó un sólido blanco que fue recogido
mediante filtración a vacío. El producto fue secado en un horno a
vacío a 35-40ºC a lo largo de toda la noche. El
rendimiento fue de 17,6 mmol, 88%.
A 1 mmol de
N-\alpha-(Fmoc)-N-\varepsilon-(NH_{2})-L-Lisina-OH
(Ejemplo 1) se le añadió 5 mL de
N,N'-dimetilformamida (DMF) y 1,1 mmol de TFA. Se
dejó agitar esta disolución hasta que el aminoácido se había
disuelto por completo.
A 1,1 mmol de éster de succinimidilo de ácido
4-((4-(dimetilamino) fenil) azo) benzoico
(Dabcyl-NHS; Molecular Probes, P/N
D-2245) se añadieron 4 mL de DMF y 5 mmol de
diisopropiletilamina (DIEA). A esta disolución en agitación se
añadió, gota a gota, la disolución de
N-\alpha-(Fmoc)-N-\varepsilon-(NH_{2})-L-Lisina-OH
preparada como se ha descrito anteriormente. Se dejó la reacción
agitando toda la noche y a continuación fue procesada.
El disolvente fue evaporado a vacío y el residuo
fue dividido en 50 mL de DCM y 50 mL de ácido cítrico acuoso al 10%.
Las capas fueron separadas y la capa orgánica fue lavada con
bicarbonato sódico acuoso y de nuevo con ácido cítrico acuoso al
10%. La capa orgánica fue secada a continuación con sulfato sódico,
fue filtrada y evaporada hasta obtener una espuma naranja. La espuma
fue cristalizada en acetonitrilo (ACN) y los cristales fueron
recolectados mediante filtración a vacío. El rendimiento fue de
0,52 mmol, 52%.
El
N-\alpha-(Fmoc)-N-\varepsilon-(dabcyl)-L-Lisina-OH
(Ejemplo 2) fue usado para preparar un soporte de síntesis útil
para la preparación de PNAs dabcylados. El grupo
fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) de 0,824 g del soporte de síntesis
Fmoc-PAL-Peg-PS
disponible comercialmente (PerSeptive Biosystems, Inc.; P/N
GEN913384) fue eliminado mediante tratamiento, en un recipiente de
flujo cruzado, con un 20% de piperidina en DCM durante 30 minutos.
El soporte fue lavado a continuación con DCM. Finalmente, el
soporte fue lavado con DMF y fue secado con una corriente de
argon.
Se preparó una disolución que contiene 0,302 g de
N-\alpha-(Fmoc)-N-\varepsilon-(dabcyl)-L-Lisina-OH,
3,25 mL de DMF, 0,173 g de hexafluorofosfato de
O-(7-azabenzotriaol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio
(HATU), 0,101 mL de DIEA y 0,068 mL de 2,6-lutidina
mediante la combinación secuencial de los reactivos. Esta
disolución fue añadida a continuación al soporte de síntesis lavado
y se dejó que reaccionara durante 2 horas. A continuación, la
disolución fue pasada a través del recipiente con una corriente de
argon y el soporte fue lavado secuencialmente con DMF, DCM y DMF. A
continuación la resina fue secada con una corriente de argon.
El soporte fue tratado con 5 mL de reactivo de
acabado de PNA estándar disponible comercialmente (PerSeptive
Biosystems, Inc., P/N GEN063102). El reactivo de acabado fue
limpiado entonces del recipiente y el soporte fue lavado con DMF y
con DCM. A continuación el soporte fue secado con una corriente de
argon. Finalmente, el soporte de síntesis fue secado en condiciones
de alto vacío.
La carga final del soporte fue determinada
mediante análisis de la carga de Fmoc de tres muestras de
aproximadamente 6 a8 mg. El análisis determinó que la carga era
aproximadamente de 0,145 mmol/g.
Este soporte de síntesis fue compactado en una
columna de síntesis de PNA vacía, según necesidad, y fue usado para
preparar oligómeros de PNA que presentan un resto de extinción
dabcyl en el extremo C unido al oligómero de PNA a través del grupo
\varepsilon-amino del aminoácido
L-lisina del extremo C.
Los PNAs fueron sintetizados usando reactivos e
instrumentación disponibles comercialmente obtenidos en PerSeptive
Biosystems, Inc. A menudo se llevó a cabo dobles acoplamientos para
asegurar que el producto crudo era de una pureza aceptable. Los
PNAs que poseen un resto dabcyl en el extremo C fueron preparados
llevando a cabo la síntesis usando el soporte de síntesis modificado
de dabcyl-lisina preparado como se ha descrito en
el Ejemplo 3 ó marcando el grupo
N-\varepsilon-amino del residuo de
lisina del extremo C mientras que el PNA todavía seguía unido al
soporte como se describe en el Ejemplo 10. Todos los PNAs que
poseen tanto un resto de fluoresceína en el extremo N como un resto
dabcyl en el extremo C fueron tratados con los reactivos de marcado
y con los ligandos adecuados (según se necesitara) antes de ser
separados del soporte de síntesis. Los PNAs que comprenden una marca
Cy3 en el extremo N (Amersham) fueron separados del soporte de
síntesis y fueron purificados con HPLC antes del marcado con Cy3
(Véase: Ejemplo 12).
El soporte de síntesis fue tratado con una
disolución de piperidina al 25% en DMF durante 5-15
minutos a temperatura ambiente. Después del tratamiento, el soporte
de síntesis fue lavado y secado en condiciones de alto vacío. A
continuación el soporte fue tratado con el reactivo de marcado
apropiado y/o fue separado del soporte de síntesis.
Se añadieron 50 mmol de TFA a 7,5 mmol de ácido
N-(terc-butiloxicarbonil)-8-amino-3,6-dioxaoctanoico
en agitación en 10 mL de DCM. La disolución fue agitada a
temperatura ambiente hasta que el grupo t-boc fue
eliminado por completo. A continuación se eliminó el disolvente
mediante evaporación a vacío y entonces el producto fue resuspendido
en 10 mL de DCM.
A esta disolución en agitación se añadió, gota a
gota, una disolución que contiene 7,5 mmol de éster de
Di-O-pivaloil-5(6)-carboxifluoresceína-NHS,
30 mmol de N-metilmorfolina (NMM) y 20 mL de DCM.
Se dejó la reacción durante la noche y a continuación fue
transferida a un embudo de decantación por la mañana.
Esta disolución orgánica fue lavada con ácido
cítrico al 10% en agua dos veces y a continuación fue secada con
sulfato sódico, filtrada y evaporada hasta obtener una espuma
marrón. El producto fue purificado en columna usando gel de sílice.
Se usó una fase móvil de DCM y un gradiente por pasos de metanol
para eluir el producto de la fase estacionaria. El rendimiento fue
de 2,8 g de espuma que fue precipitada mediante disolución de una
cantidad mínima de DCM y mediante la adición gota a gota de dicha
disolución a hexano. El rendimiento fue 2,32 g de polvo blanco. La
pureza del producto no era la adecuada para el marcado así que se
llevó a cabo una separación cromatográfica de fase inversa adicional
sobre una muestra de este material.
Se disolvió un gramo de producto precipitado en
30 mL de un acetato de trietilamonio 50 mM en agua (pH 7) que
contiene un 40% de acetonitrilo. Esta disolución fue añadida a
continuación a un cartucho preequilibrado 2g Waters
Sep-Pack Vac 12 cc tC18 (P/N WAT043380) en 10
alícuotas de 3 mL. Después de la adición de toda la carga de
disolvente, como primer lavado se cargaron dos alícuotas de 3 mL de
acetato de trietilamonio 50 mM (pH 7) que contiene un 40% de
acetonitrilo. A continuación se cargaron dos alícuotas de 3 mL de
acetato de trietilamonio 50 mM en agua (pH 7) que contienen un 60%
de acetonitrilo como segundo lavado. Finalmente, se usó una única
alícuota de 3 mL de acetonitrilo para eluir el material que quedaba
en la columna. El eluyente de cada alícuota fue recogido de forma
individual y se analizó su pureza mediante HPLC. Las alícuotas
fueron evaporadas a vacío y se determinó la masa de cada una. Se
redisolvieron fracciones con una pureza adecuada en DCM, las
fracciones fueron combinadas y precipitadas en hexano. El
rendimiento fue de 0,232 g.
Para el marcado con fluoresceína en el extremo N,
se eliminó el grupo fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc)
amino-terminal de varios de los oligómeros de PNA
completamente estructurados mediante tratamiento con piperidina y la
resina fue lavada y secada a vacío. A continuación, la resina fue
tratada durante 20-30 minutos con aproximadamente
300 \muL de una disolución que contiene
Fluoresceína-O-Ligando 0,07 M,
(HATU) 0,06 M, DIEA 0,067 M y 2,6-lutidina 0,1 M.
Después del tratamiento la resina fue lavada y secada en condiciones
de elevado vacío. A continuación, el oligómero de PNA fue separado,
desprotegido y purificado como se describe más adelante.
Este método fue usado como alternativa al
procedimiento descrito en el Ejemplo 7, para marcar PNAs con
5(6)-carboxifluoresceína. Este procedimiento
requiere que el extremo N del oligómero de PNA reaccione con ácido
Fmoc-8-amino-3,6-dioxaoctanoico
antes de llevar a cabo la reacción de marcado de tal modo que se
preparan constructos de PNA equivalentes. El grupo
fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc) del extremo amino del oligómero de
PNA completamente estructurado fue eliminado mediante tratamiento
con piperidina y el soporte de síntesis fue lavado y secado a
vacío. A continuación, el soporte de síntesis fue tratado durante
4-5 horas a 37ºC con aproximadamente 300 \muL de
una disolución que contiene
5(6)carboxifluoresceína-NHS 0,1 M
(Molecular Probes, P/N C-1311), DIEA 0,3 M y
2,6-lutidina 0,3 M. Después del tratamiento, el
soporte de síntesis fue lavado y secado en condiciones de alto
vacío. A continuación, el oligómero de PNA fue separado,
desprotegido y purificado como se describe más adelante.
Más preferiblemente, el soporte de síntesis fue
tratado durante 2-5 horas a 30-37ºC
con aproximadamente 250 \muL de una disolución que contiene
5(6)carboxifluoresceína-NHS 0,08 M,
DIEA 0,24 M y 2,6-lutidina 0,24 M.
Después de la reacción apropiada con los ligandos
y de la eliminación del grupo protector del extremo amino, la resina
fue tratada con 250 \muL de una disolución que contiene
5(6)carboxifluoresceína 0,5 M,
N,N'-diisopropilcarbodiimida 0,5 M,
1-hidroxi-7-azabenzotriazol
(HOAt) 0,5 M en DMF (Véase: Weber y col., Bioorganic &
Medicinal Chemistry Letters, 8: 597-600 (1998).
Después del tratamiento el soporte de síntesis fue lavado y secado
en condiciones de alto vacío. A continuación el oligómero de PNA fue
separado, desprotegido y purificado como se describe más
adelante.
Nota sobre el Marcado con Fluoresceína:
Los PNAs marcados con fluoresceína descritos aquí fueron preparados
usando diferentes procedimientos. Los distintos procedimientos han
evolucionado para optimizar las condiciones de marcado con
fluoresceína. En este momento preferimos usar el procedimiento de
Weber y col. para la mayoría de las operaciones de marcado.
Este procedimiento fue usado como alternativa al
uso del soporte prederivatizado cuando se preparan PNAs dabcylados.
Este procedimiento presenta la ventaja de que el resto de lisina (y
por tanto el resto dabcyl unido) puede ser colocado en una posición
del polímero que incluye la secuencia de nucleobases sonda.
La resina (todavía dentro de la columna de
síntesis) fue tratada con 10 mL de una disolución que contiene
ácido trifluoroacético al 1% y triisopropilsilano (TIS) al 5% en
diclorometano haciendo pasar la disolución a través de la columna a
lo largo de un periodo de aproximadamente 15 minutos. Después del
tratamiento, el soporte de síntesis fue lavado con DMF. Antes del
tratamiento con el reactivo de marcado el soporte fue neutralizado
mediante un tratamiento con aproximadamente 10 mL de una disolución
que contiene diisopropietilamina al 5% en DMF. Después del
tratamiento, el soporte fue tratado con Dabcyl-NHS
(como sustituto para el
5(6)carboxifluoresceína-NHS en el
procedimiento) esencialmente como se ha descrito en el Ejemplo
8.
Nota: Este procedimiento fue llevado a cabo sólo
sobre PNA preparado usando
Fmoc-PAL-PEG/PS (PerSeptive P/N
GEN913384). No fue llevado a cabo con el más lábil frente a ácidos
Fmoc-XAL-PEG/PS (PerSeptive P/N
GEN913394).
El soporte de síntesis
(Fmoc-PAL-PEG/PS; P/N GEN913384) fue
eliminado del cartucho de síntesis, fue transferido a un cartucho de
giro Ultrafree (Millipore Corp., P/N SE3P230J3) y fue tratado con
una disolución de TFA/m-cresol (tanto de 7/3 como
de 8/2 (preferida)) durante de 1 a 3 horas. Se hizo girar la
disolución a través del lecho soporte y el soporte fue tratado otra
vez con una disolución de TFA/m-cresol durante
1-3 horas. De nuevo se hizo girar la disolución a
través del lecho soporte. A continuación, los eluyentes combinados
(TFA/m-cresol) fueron precipitados mediante la
adición de aproximadamente 1 mL de dietiléter. El precipitado fue
peletizado mediante centrifugación. A continuación el pélet fue
resuspendido en etiléter y peletizado dos veces más. El pélet seco
fue resuspendido a continuación en acetonitrilo (ACN) al 20% en
agua que contiene un 0,1% de TFA (se añadió ACN adicional según
fuera necesario para disolver el pélet). El producto fue analizado
y purificado usando métodos cromatográficos de fase inversa.
Nota: se prepararon varios PNAs usando el nuevo
producto de soporte de síntesis
Fmoc-XAL-PEG/PS (P/N GEN 913394)
disponible en PerSeptive Biosystems, Inc. Este soporte presenta la
ventaja de que el PNA puede ser eliminado más rápidamente y en
condiciones de acidez más moderadas. Para los PNAs preparados con
Fmoc-XAL-PEG/PS, el soporte fue
tratado como se ha descrito anteriormente excepto que generalmente
se usa una disolución de TFA/m-cresol 9/1 durante un
periodo de 10-15 minutos (2x).
La amina purificada que contiene el PNA fue
disuelta en DMF/agua 1/1 con una concentración de 0,05 OD/\muL
para preparar una disolución de PNA de reserva. De la reserva se
llevaron aproximadamente 30 nmoles de PNA a un tubo. A
continuación, se añadieron a este tubo 125 \muL de HEPES 0,1 M (pH
8,5), y suficiente DMF/agua 1/1 para llevar el volumen total a 250
\muL. Esta disolución fue mezclada intensamente. Se añadieron los
250 \muL de disolución preparada como se ha descrito a un tubo
pre-empaquetado de colorante Cy3 (Amersham). El
tubo fue bien mezclado y a continuación se dejó reaccionar durante 1
hora a temperatura ambiente.
Después de la reacción, el disolvente fue
eliminado mediante evaporación en un speed-vac. A
continuación el pélet fue disuelto en 400 \muL de una disolución
que contiene TFA/ACN 3:1 al 1% en agua. Opcionalmente, la disolución
fue transferida a continuación a un filtro Ultrafree 5000 MW
(Millipore, P/N UFC3LCC25) o a un filtro 3000 MW (Amicon, P/N
42404) para eliminar el exceso de colorante. El producto recuperado
fue purificado a continuación usando métodos cromatográficos de
fase inversa.
Experimento
13
Todas las sondas de PNA fueron analizadas y
purificadas mediante HPLC de fase inversa. La composición de la
sonda fue confirmada por comparación con las masas teóricas
calculadas.
Generalmente, se usaron dos gradientes de
cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) diferentes para
analizar y purificar los oligómeros de PNA (Gradientes A y B). Las
purificaciones preparativas fueron escaladas en base a las
condiciones analíticas descritas en los Gradientes A y B. El
Gradiente B fue desarrollado debido a que la purificación inicial
usando gradientes estándar (Gradiente A) demostró ser menos que
satisfactoria. Las condiciones experimentales son como se describe
más adelante excepto que se realizaron varios intentos para mejorar
las purificaciones mediante la adición de formamida al 20% a las
disoluciones tampón en utilización durante algunas de las
purificaciones. Este procedimiento fue abandonado ya que no parecía
producir ningún resultado beneficioso. Sin embargo, curiosamente una
revisión detenida de los datos sugirió que las señales de HPLC que
previamente se pensaba que estaban relacionadas con la estructura
de determinadas sondas (Véase: Solicitud Provisional de Patente Nº
60/063.283, presentada el 27 de octubre de 1997) también estaban
relacionadas con la presencia de formamida durante la purificación.
Por lo tanto, ahora no se cree que exista ninguna correlación entre
la estructura de la sonda de PNA y los perfiles de HPLC observados
en los oligómeros purificados.
Disolución Tampón A = TFA al 0,1% en agua.
Disolución Tampón B = TFA al 0,1% en
acetonitrilo.
Caudal: 0,2 mL/min.
Temperatura de la columna: 60ºC.
Instrumento: Waters 2690 Alliance: Control por
Waters Millennium Software.
Fase Estacionaria: Waters Delta Pak C18, 300
\ring{A}, 5 \mum, 2 x 150 mm (P/N WAT023650)
Detección a 260 nm
Perfil del gradiente
A
Perfil del gradiente
B
Las muestras fueron analizadas usando un
espectrómetro de masas lineal DE MALDI-TOF (del
inglés "Voyager Delayed Extraction Matrix Assisted Laser
Desoption Ionization-Time Of Flight") (PerSeptive
Biosystems, Inc.). Se usó ácido sinípico como matriz de la muestra
y también se usó como un punto del calibrado del eje de masas. Se
usó insulina de bovino como patrón interno de calibrado para el
segundo punto del calibrado del eje de masas.
Generalmente, las muestras fueron preparadas para
el análisis preparando primero una disolución de ácido sinípico en
una concentración de 10 mg/ml en una mezcla 1:2 de acetonitrilo y de
ácido trifluoroacético al 0,1%. A continuación, se preparó una
disolución de insulina disolviendo 1 mg de insulina de bovino
(Sigma) en ácido trifluoroacético al 0,1% en agua. Finalmente, se
preparó una disolución insulina/matriz mezclando 9 partes de la
disolución de ácido sinípico y 1 parte de disolución de insulina de
bovino. Las muestras fueron preparadas para el análisis inyectando
1 \muL de la disolución de insulina/matriz seguido de la
inyección de 1 \muL de muestra diluida (aproximadamente de 0,1 a 1
OD por mL) en el objetivo del espectrómetro de masas. Se dejó secar
el objetivo del instrumento antes de ser insertado en el
espectrómetro de masas.
1. El Código es un medio sencillo de determinar
la longitud de las nucleobases complementarias a los extremos amino
y carboxilo del polímero de PNA y el número y posición de
cualesquier unidades de ligando de ácido
8-amino-3,6- dioxaoctanoico
flexible. La secuencia de nucleobases sonda es la misma para todas
las sondas enumeradas en la tabla. El primer dígito del Código
representa la longitud del segmento de brazo
N-terminal que es complementaria con el segmento de
brazo C-terminal. El segundo dígito del Código
representa el número de unidades de ligando flexible que pueden
unir el brazo N-terminal y la secuencia de
nucleobases sonda. El tercer dígito del código representa el número
de unidades de ligando flexible que une el brazo
C-terminal y la secuencia de nucleobases sonda. El
cuarto dígito del Código representa la longitud del segmento de
brazo C-terminal que es complementaria con el
segmento de brazo N-terminal. Por consiguiente, el
Código puede ser usado para comparar visualmente la estructura
general de los diferentes oligómeros de PNA enumerados en la Tabla
1.
2. En este constructo existe un solapamiento de 4
pb de coincidencia entre las nucleobases de los extremos amino y
carboxilo en lugar del solapamiento de 3 pb directamente
comparable.
Para las Tablas 1A, 1B y 1C, todas las secuencias
de PNA están escritas desde el extremo amino hacia el extremo
carboxilo. Las abreviaturas son: Flu =
5-(6)-carboxifluoresceína; dabcyl = ácido
4-((4-(dimetilamino)fenil)azo)benzoico; O =
ácido
8-amino-3,6-dioxaoctanoico;
K = el aminoácido L-Lisina y Cy3 es el colorante
cianina 3 disponible en Amersham.
Para este estudio, se sintetizaron
oligonucleótidos de ADN marcados con biotina adecuados como ácidos
nucleicos que comprenden una secuencia objetivo que es
complementaria a la secuencia sonda de PNA de las sondas de PNA
k-ras usando reactivos e instrumentación disponibles
comercialmente u obtenidos de vendedores comerciales.
Adicionalmente, los oligómeros de ADN de longitud de nucleobases y
de configuración de marcado equivalentes en comparación con varias
Balizas Lineales fueron preparados usando el soporte de síntesis de
dabcyl disponible en Glen Research (P/N 20-5911) y
otros reactivos de ADN e instrumentación disponibles
comercialmente. El marcado con
5-(6)-carboxifluoresceína de todos los ADNs fue
obtenido usando fosforamida Fluoredite (PerSeptive Biosystems,
Inc., P/N GEN080110). Todos los ADNs fueron purificados mediante
métodos convencionales. Las secuencias de los oligonucleótidos de
ADN preparadas se ilustran en las Tablas 2A y 2B. Los métodos y
composiciones para la síntesis y para la purificación de ADNs
sintéticos son bien conocidos por aquellos con conocimientos
ordinarios en la técnica.
Se tomaron medidas de fluorescencia usando un
espectrofluorómetro RF-5000 (Shimadzu) ajustado con
una sujeción de célula con camisa de agua (P/N
206-15439, Shimadzu) usando una cubeta de 1,6 mL con
una longitud de paso de 10 mm (Stama Cells, Inc.). La temperatura
de la cubeta fue modulada usando un baño de agua circulante
(Neslab). La temperatura del interior de la cubeta fue monitorizada
directamente usando una sonda termopar (Bamant; modelo Nº
600-0000) que fue insertada por debajo del nivel de
líquido haciendo pasar la punta de la sonda a través de la tapa de
la cubeta (fabricación a medida).
Se preparó disolución de reserva de oligómero de
PNA purificado mediante HPLC disolviendo el PNA en
N,N'-dimetilformamida (DMF) al 50% en agua. A partir
de cada reserva de PNA se preparó una disolución de oligómero de
PNA, cada una a una concentración de 10 pmol en 1,6 mL de Tampón de
Hibridación (Tris. HCl 50 mM pH 8,3 y NaCl 100 mM) mediante
dilución en serie de reserva de PNA purificado con Tampón de
Hibridación.
Las muestras fueron excitadas a 493 nm y la
fluorescencia fue medida a 521 nm. Se obtuvieron datos a numerosas
temperaturas según la cubeta se iba calentando, y a continuación se
midieron de nuevo según se dejaba enfriar la cubeta. Generalmente,
la temperatura del baño fue aumentada secuencialmente 5ºC y a
continuación se dejó equilibrar antes de que se registrara cada
dato. De forma similar, para generar el perfil de enfriamiento, la
temperatura del baño fue disminuida secuencialmente 5ºC y dejando
equilibrar antes de registrar cada dato.
Se espera que las Balizas Moleculares de ácido
nucleico que forman una estructura de horquilla exhiban un aumento
en la intensidad de fluorescencia cuando son calentadas, lo cual es
consistente con la fusión del tallo de horquilla y con a transición
física del tallo de la sonda desde una hélice hacia una bobina
aleatoria. En concordancia con la fusión de cualquier ácido
nucleico, se espera que el proceso sea reversible dando como
resultado una disminución de la fluorescencia al enfriar la
muestra, causada por la reformación de la estructura de hélice
resultante. El esperado fenómeno de fusión está documentado para las
Balizas Moleculares de ácido nucleico descritas por Tyagi y col.
(Véase: Tyagi y col. Nature Biotechnology, 14:
303-308 (1996) en la Figura 3).
Los resultados de los análisis de fusión térmica
de fluorescencia de los oligómeros de PNA se resumen en los datos
presentados en la Tabla 3 y son presentados gráficamente en las
Figuras 1A, 1B1, 1B2, 1B3 y 1C. En referencia a la Tabla 3, existen
tres Perfiles Térmicos generales diferentes observados para los
diferentes constructos y bajo las condiciones examinadas. Estos son
representados en la Tabla 3 como Tipos A, B y C.
El Perfil Térmico de Fluorescencia de Tipo A se
caracteriza por un incremento en la intensidad de fluorescencia
durante el calentamiento (fusión) y un descenso relacionado en la
intensidad de fluorescencia durante el enfriamiento (recocido).
Estos resultados son similares a los publicados para las Balizas
Moleculares de ácido nucleico que forman una estructura de lazo y de
tallo de horquilla. Por tanto, el Perfil Térmico de Fluorescencia
de Tipo A es consistente con la formación de una estructura de lazo
y de tallo de horquilla estables. Por tanto, se cree que este
fenómeno es causado por la fusión y el recocido de una estructura de
lazo y de tallo en la Baliza Molecular de PNA. Sin embargo, los
solicitantes sólo reivindican que el Perfil Térmico de
Fluorescencia de Tipo A es indicativo de una extinción de
fluorescencia bastante reversible, ya que pueden ser responsables
del fenómeno observado otras estructuras.
En la Figura 1A se ilustran representantes de
Perfiles Térmicos de Fluorescencia de Tipo A. Los datos presentados
en la Figura son de los oligómeros .001, .007 y .002. Se presentan
los datos para ambos, la fusión (símbolo abierto) y el recocido
(símbolo sólido). Las transiciones sigmoidales son consistentes con
una fusión o un recocido de un duplex.
El Perfil Térmico Fluorescente de Tipo B se
caracteriza por un incremento en la intensidad de fluorescencia
durante el calentamiento (fusión), pero no por una correlación
sustancial en la intensidad de fluorescencia durante el enfriamiento
de la muestra. De este modo, bajo las condiciones examinadas, las
interacciones que inicialmente provocan la extinción de
fluorescencia no parecen ser fácilmente reversibles. Por
consiguiente, los datos sugieren que un oligómero de PNA que exhibe
un Perfil Térmico de Fluorescencia de Tipo B, no presenta todas las
características de una Verdadera Baliza Molecular. Sin embargo,
como se ha observado en los datos del ensayo de hibridación, un
Perfil Térmico de Fluorescencia de Tipo B no prohibe que el
oligómero de PNA funcione como una Baliza de PNA.
En las Figuras 1B1, 1B2 y 1B3 se ilustran los
representantes de los Perfiles Térmicos de Fluorescencia de Tipo B.
Los datos se presentas en tres conjuntos de tal modo que cada traza
puede ser observada más claramente. Los datos presentados en las
Figuras son para los oligómeros de PNA .010, .008, .009 (Figura
1B1), .018, .011A, .017 (Figura 1B2), y .003 y .004 (Figura 1B3). Se
presentan los datos para la fusión (símbolo abierto) y para el
recocido (símbolo sólido).
El Perfil Térmico de Fluorescencia de Tipo C se
caracteriza por una elevada intensidad de fluorescencia inicial que
inicialmente disminuye con el calentamiento y vuelve a disminuir
con el enfriamiento de la muestra. La elevada intensidad de
fluorescencia inicial sugiere que este constructo no exhibe la
extinción de fluorescencia inicial observada con la mayoría de los
otros constructos de PNA examinados. La constante disminución en la
intensidad de fluorescencia durante el enfriamiento no se comprende
muy bien. Sin embargo, como se ha observado en los datos del ensayo
de hibridación, un Perfil Térmico de Fluorescencia de Tipo C no
prohibe que el oligómero de PNA funcione como una Baliza de
PNA.
En la Figura 1C se ilustran los representantes de
los Perfiles Térmicos de Tipo C. Los datos presentados en la Figura
1C para los oligómeros de PNA .005 y .006. Se presentan los datos
para la fusión (símbolo abierto) y para el recocido (símbolo
sólido).
Todos los datos de ensayo de hibridación fueron
recogidos usando un Wallac 1420 VICTOR equipado con una
lámpara-filtro F485 CW y un filtro de emisión F535.
Como recipiente de reacción se usó el NUNC Maxicorp, placa de
microtitulación de separación. Cada placa de microtitulación fue
prelavada con Tampón de Hibridación a temperatura ambiente durante
15 minutos antes de que se añadieran los componentes de reacción.
El volumen total de reacción fue 100 \muL de Tampón de
Hibridación.
Se preparó la disolución de reserva de ADN wt
k-ras2 disolviendo el ADN purificado en TE (Tris.
HCl 10 mM pH 8,0; EDTA 1,0 mM, Sigma Chemical). A partir de esta
reserva de ADN se preparó una disolución de ADN wt
k-ras2 a una concentración de 100 pmol/99 \muL
mediante dilución en serie de la reserva de ADN con Tampón de
Hibridación.
Cada muestra de reacción usada para el análisis
fue preparada combinando 1 \muL del oligómero de PNA apropiado
(25 pmoles/\muL) con 99 \muL de reserva de ADN wt
k-ras2 ó con 99 \muL de Tampón de Hibridación
(control) según se necesite para preparar 100 \muL de
muestra.
Las muestras fueron mezcladas y a continuación se
monitorizó la intensidad de fluorescencia con el tiempo usando el
instrumento Wallac VICTOR. Las muestras fueron analizadas por
triplicado para asegurar resultados reproducibles. Los datos fueron
adquiridos durante 20-25 minutos después de que los
reactivos fueran mezclados y a continuación los pocillos fueron
sellados y la placa calentada hasta 42-50ºC en un
incubador durante 30-40 minutos. Después de enfriar
hasta temperatura ambiente, se quitó el sello de los pocillos y a
continuación se recogieron otros diez datos durante aproximadamente
5 minutos.
Se espera que las Balizas Moleculares de ácido
nucleico que forman una estructura de tallo de horquilla y de lazo
exhiban un incremento en la intensidad de fluorescencia durante la
hibridación de la secuencia sonda con el ácido nucleico
complementario. El aumento esperado para la intensidad de
fluorescencia está documentado para las Balizas Moleculares de ADN
descritas por Tyagi y col. (Véase: Tyagi y col., Nature
Biotechnology, 14: 303-308 (1996)).
Los resultados del análisis de hibridación de los
oligómeros de PNA se resumen en la Tabla 3 presentada gráficamente
en las Figuras 2A1, 2A2, 2A3, 2B y 2C. En referencia a la Tabla 3,
existen tres Perfiles de Hibridación generales diferentes
observados para los distintos constructos examinados. Estos están
representados en la Tabla 3 como Tipos A, B y C. En la Figura 8, se
ilustra gráficamente la relación señal ruido (antes y después de la
calefacción) para todas las sondas examinadas, presentando también
los valores absolutos debajo de la Figura.
El Perfil de Hibridación Tipo A se caracteriza
por el aumento de la intensidad de fluorescencia en las muestras
que contienen ADN objetivo complementario en comparación con las
muestras que contienen sólo el oligómero de PNA. Después del
calentamiento, la intensidad de fluorescencia de las muestras que
contienen las secuencias objetivo aumenta pero la fluorescencia de
fondo de la muestra(s) de control no cambia de forma
significativa. Debido a que los PNAs poseen una fluorescencia
inherente muy baja, las sondas que presentan un Perfil de
Hibridación de Tipo A generalmente tienen las mayores relaciones
señal ruido. En las Figuras 2A1, 2A2, y 2A3 se ilustran
representantes de Perfiles de Hibridación de Tipo A. Los datos se
presentan en dos ilustraciones gráficas separadas para clarificar
la presentación. Los datos presentados en las Figuras corresponden
a los oligómeros de PNA .001, .007, .010 (Figura 2A1), .002, .008,
.009 (Figura 2A2), y .011A, .017 y .018 (Figura 2A3).
El Perfil de Hibridación Tipo B se caracteriza
por el rapidísimo incremento en la intensidad de fluorescencia en
las muestras que contienen el ADN objetivo complementario en
comparación con las muestras que contienen sólo el oligómero de
PNA. La intensidad de fluorescencia alcanza rápidamente un valor que
no cambia significativamente (o no cambia en absoluto) después del
calentamiento. La fluorescencia de fondo de la muestra(s) de
control no cambia significativamente incluso después del
calentamiento. Esto sugiere que la hibridación se produce
rápidamente, y con poca resistencia alcanza un equilibrio de unión
sin requerir calentamiento. En la Figura 2B se ilustran los
representantes de los Perfiles de Hibridación de Tipo B. Los datos
presentados en la Figura 2B corresponden a los oligómeros de PNA
.018, .003 y .004 aunque el oligómero .018 no exhibe todas las
características de un Perfil de Hibridación de Tipo B.
Específicamente, la señal de la sonda .018 no parece aumentar
después del calentamiento (Tipo B) sino que la cinética de
hibridación parece ser más del tipo de Perfil de Hibridación de Tipo
A.
Las sondas de control .003 y .004 (denominadas
aquí Balizas Lineales) exhiben un Perfil de Hibridación de Tipo B.
Por tanto, la rápida cinética de hibridación del Perfil de
Hibridación de Tipo B probablemente es el resultado de no presentar
tallo de horquilla, o cualquier otra fuerza de intensidad, que pueda
estabilizar la forma no fluorescente del polímero. Sin embargo, el
intervalo dinámico (relación señal ruido) observado en el ensayo de
hibridación de estas sondas típicamente es bastante elevado, y
sugiere que otras fuerzas que no son los enlaces de hidrógeno de
las nucleobases complementarias de los segmentos de brazo pueden
estabilizar las interacciones entre los restos dador y aceptor. Los
solicitantes han observado que las interacciones marcador/marcador
pueden ser bastante fuertes y pueden ser un factor importante en
este sorprendente resultado.
Aunque el fondo (ruido) es superior en las sondas
.003 y .004, en comparación con las sondas .001, .002, .007, .009 y
.010, la intensidad de fluorescencia después de la hibridación es
superior que la observada en cualquier sonda examinada. Como
resultado del mayor fondo, los oligómeros de PNA .003 y .004 tienen
una relación señal ruido muy favorable. Esta relación S/R es casi
tan favorable como cualquiera (y mejor en algunos casos) de los
otros oligómeros de PNA examinados tanto si poseen segmentos de
brazo o no. Los datos demuestran que no es necesario tener
segmentos formadores de brazo para crear una sonda que exhibe una
intensidad de fluorescencia inicial baja, y el correspondiente
incremento en la señal de fluorescencia durante la unión de la sonda
a una secuencia objetivo.
El Perfil de Hibridación C se caracteriza por un
moderado incremento de la intensidad de fluorescencia en las
muestras que contienen ADN objetivo en comparación con las muestras
que contiene sólo oligómeros de PNA. La intensidad de fluorescencia
alcanza rápidamente un estado que no cambia significativamente (o
no cambia en absoluto) después del calentamiento. La fluorescencia
de fondo de la muestra(s) de control es relativamente
elevada pero no cambia significativamente incluso después del
calentamiento. Los Perfiles de Hibridación B y C difieren
principalmente debido a que la fluorescencia de fondo en las
muestras de control, que no contienen ácido nucleico, es
drásticamente superior en el Perfil de Hibridación de Tipo C. Los
datos de hibridación obtenidos para las muestras que contienen ácido
nucleico complementario sugieren que la hibridación se produce
rápidamente y, con poca resistencia, alcanza el equilibrio. Sin
embargo, la elevadísima señal de fondo sugiere que las fuerzas que
deberían mantener los restos dador y aceptor en una íntima
proximidad no son suficientemente fuertes en estos constructos para
extinguir de forma eficaz la señal de fluorescencia. Como
consecuencia del moderado incremento en la fluorescencia durante la
unión de la secuencia objetivo y de la fluorescencia intrínseca
superior a lo habitual, una Baliza Molecular de PNA, que presenta un
Perfil de Hibridación de Tipo C, tiene una relación señal ruido muy
baja. En la Figura 2C se ilustran los representantes de los
Perfiles de Hibridación de Tipo C. Los datos presentados en la
Figura 2C corresponden a los oligómeros de PNA .006 y .005,
respectivamente.
El resultado más sorprendente de todos los
experimentos realizados por los solicitantes es que todos los
oligómeros de PNA examinados, que incluyen las sondas de control
.003 y .004, que no tienen segmentos forrmadores de brazo, exhiben
un correlación entre el aumento de la intensidad de fluorescencia y
la unión de la sonda con la secuencia objetivo. Por tanto, no es
crítico diseñar PNAs que posean segmentos formadores de brazo con
los que obtener constructorr que posean una intensidad d
fluorescencia intrínseca muy baja, pero que se vuelvan altamente
fluorescentes durante la hibridación con la secuencia objetivo.
Este es un resultado muy sorprendente a la luz de lo que se sabe de
las Balizas Moleculares de ácido nucleico. Por lo tanto, las Balizas
Lineales de esta invención pueden ser usadas para detectar,
identificar o cuantificar secuencias objetivo sin ningún
requerimiento de que el exceso de sonda sea separado del complejo
sonda/secuencia objetivo antes de la detección.
Para este ejemplo, se compararon sondas de PNA y
de ADN para determinar qué efecto tendrían sobre el ruido (línea
base o fluorescencia de fondo) las variaciones en la longitud de la
sonda nativa. Se realizaron comparaciones con respecto a los
cambios en la fuerza iónica (y cambios menores en el pH), cambios
en la naturaleza del par dador/aceptor y la presencia o ausencia de
magnesio.
Las sondas de PNA PNA003-11,
PNA003-13, PNA003-15,
PNA003-17 y CyPNA003-.15 (Véase: Tabla 1B) y las
sondas de ADN DNA003-11, DNA003-13,
DNA003-15 y DNA003-17 (Véase: Tabla
2B) fueron preparadas como se ha descrito. Las sondas purificadas
fueron diluidas en Tampón TE (Tris-HCl 10 mM pH 8,3,
EDTA 1 mM) hasta una concentración de 25 pmoles/\muL y a
continuación fueron diluidas hasta 25 pmoles/1,6 mL con una de las
disoluciones tampón, A, B ó C. Las muestras de las sondas fueron
preparadas por triplicado y cada muestra de 1,6 mL fue analizada
usando un espectrofluorómetro Shimadzu RF-5000 y una
célula con una longitud de paso de 10 mm. Para los oligómeros
marcados con fluoresceína, la longitud de onda de excitación fue
fijada en 493 nm y los datos fueron registrados para la emisión a
520 nm. Para los oligómeros marcados con Cy3, la longitud de onda
de excitación fue fijada en 545 nm y los datos fueron registrados
para la emisión a 560 nm. Todos los datos recogidos están
registrados en unidades de luz relativas (RLU, del inglés
"relative light units").
El fondo de cada sonda fue examinado en cada una
de las disoluciones tampón, A, B ó C. Los resultados de los análisis
por triplicado fueron promediados y los datos obtenidos se ilustran
gráficamente en la Figura 3, presentando el valor absoluto de RLU
media en la parte superior de cada barra. En referencia a la Figura
3, los datos están agrupados en los Tampones A, B y C para cada
sonda examinada. Con la excepción de la sonda
Cy3PNA003-15, todos los PNAs fueron marcados en el
extremo N con 5(6)-carboxifluoresceína y en
el extremo C con dabcyl. La sonda Cy3PNA003-15
difería de la PNA003-15 en que el Cy3 había sido
sustituido por 5(6)-carboxifluoresceína.
Todos los ADNs fueron marcados en el extremo 5' con
5(6)-carboxifluoresceína y en el extremo 3'
con un dabcyl. Dados los productos químicos disponibles
comercialmente, se han realizado intentos para asegurar que los
tipos de marcador y los espaciados de marcado de las sondas de ADN
y de PNA fueran tan comparables como fuera razonablemente
posible.
| Disolución Tampón A: | Fosfato de Sodio 10 mM, pH 7,0, MgCl_{2} 5 mM. |
| Disolución Tampón B: | Fosfato de Sodio 10 mM, pH 7,0. |
| Disolución Tampón C: | Tris-HCl 50 mM, pH 8,3, NaCl 100 mM. |
En referencia a la Figura 3, los datos para las
sondas de ADN marcadas con fluoresceína/dabcyl de 11, 13, 15 y 17
subunidades de longitud se presentan a la izquierda. Con un rápido
vistazo de los datos se deduce que existe una clara correlación
entre la longitud del oligonucleótido de ADN y la cantidad de ruido
(fondo). Específicamente e independientemente de la naturaleza de la
disolución tampón, el ruido aumentó sustancialmente con cada
incremento de dos subunidades del oligómero de ADN. Esta
observación coincide con los datos de Mayrand y col. (Véase:
patente de EE.UU. Nº 5.691.146, columna 7, líneas
8-24), de Mathies y col. (Véase: patente de EE.UU.
Nº 5.707.804, en la columna 7, líneas 21-25) y de
Nazarenko y col. (Véase: Nucl. Acids. Res. 25, en la página
2516, columna 2, líneas 36-40).
En lo que se refiere a los efectos específicos de
las disoluciones tampón, para todos los oligómeros de ADN, el ruido
observado en el Tampón A fue sustancialmente menor que el observado
cuando la sonda estaba en los Tampones B ó C. Puesto que los
Tampones A y B son de fuerza iónica comparable, la presencia de
magnesio en el Tampón A claramente redujo de forma sustancial el
ruido para todas las sondas. Aunque los Tampones B y C eran
sustancialmente diferentes en fuerza iónica y ligeramente
diferentes en pH, sólo se observó un pequeño aumento del ruido en
el cambio de Tampón B a Tampón C. Probablemente este cambio es más
resultado del aumento de pH, ya que la fluoresceína tendrá un mayor
rendimiento cuántico a un pH superior. Por consiguiente, el pequeño
incremento en el ruido observado entre los Tampones B y C se debe
probablemente al aumento en la fuerza iónica.
En resumen, el contenido de magnesio y la
longitud del oligómero parecen tener un efecto importante sobre el
ruido (fluorescencia de fondo) de las sondas de ADN, mientras que
las variaciones en la fuerza iónica del entorno de la sonda parecen
mostrar una influencia menor sobre el ruido.
En referencia a la Figura 3, los datos
correspondientes a las sondas de PNA marcadas de 11, 13, 15 y 17
subunidades de longitud se presentan a la derecha. En un rápido
vistazo de los datos se deduce que hay mucha menos diferencia entre
el ruido (fondo) observado para las sondas de diferente longitud.
Además, al contrario que con el ADN, no existe una correlación
clara entre la longitud de la sonda y la intensidad del ruido.
Con respecto a efectos específicos de la
disolución tampón, lo más drástico de todo fue la consistencia del
fondo independientemente de la naturaleza del tampón. Aunque había
diferencias pequeñas, la diferencia absoluta en el ruido
(fluorescencia de fondo) medido en cada una de las tres disoluciones
tampón fue marcadamente pequeña en comparación con las sondas de
ADN. Por consiguiente, se descubrió que el ruido de las sondas de
PNA era bastante independiente de la longitud de la sonda, de la
presencia o ausencia de magnesio y de la fuerza iónica del tampón.
De nuevo, el pequeño incremento en el ruido entre los Tampones B y
C es debido probablemente a un efecto del pH.
Los datos correspondientes a la sonda de PNA
Cy3PNA003-15 pueden ser comparados más eficazmente
con los datos correspondientes a la sonda de PNA
PNA003-15, ya que sólo difieren los fluoróforos
dadores (Fluoresceína frente a Cy3). Aunque la intensidad del ruido
(fondo) no puede ser correlacionada directamente puesto que las
longitudes de onda de excitación y de emisión usadas para examinar
los colorantes de fluoresceína y de Cy3 son sustancialmente
diferentes, para esta Baliza Lineal casi no existe ninguna
diferencia relativa en el ruido en cada uno de los tres tampones
examinados. Aún más destacable, no existe una diferencia sustancial
entre los datos correspondientes a los Tampones B y C. Esto
confirma el argumento de que el aumento en el ruido observado para
las sondas de fluoresceína es con toda probabilidad un efecto del pH
ya que el rendimiento cuántico del Cy3 debería verse menos afectado
por las pequeñas diferencias en el pH. Además, puesto que para el
examen se usan las longitudes de onda de excitación y de emisión
óptimas para los fluoróforos de fluoresceína y de Cy3, los fondos
comparativamente bajos correspondientes a las Balizas Lineales bajo
condiciones de fluoróforo optimizadas indican que se produce una
extinción sustancial de la fluorescencia para ambas sondas
independientemente de la naturaleza de las propiedades espectrales
del fluoróforo dador y del aceptor de extinción. Considerando en
conjunto todos los datos indican que el ruido de las sondas de PNA
es sustancialmente independiente de la longitud de la sonda, de la
fuerza iónica, de la presencia o ausencia de magnesio y de las
propiedades espectrales del Conjunto de Balizas.
En resumen, para las sondas de PNA, el ruido es
sustancialmente independiente de la presencia o ausencia de
magnesio, de la longitud del oligómero y de la fuerza iónica en
comparación con las sondas de ADN que tienen una longitud y una
configuración de marcado similar. Las Balizas Lineales también
poseen la propiedad poco frecuente de que la transferencia de
energía puede producirse independientemente de la naturaleza de las
propiedades espectrales del Conjunto de Balizas, lo que indica que
la transferencia de energía probablemente se produce principalmente
mediante contacto y no a través de FRET. No obstante, estos datos
demuestran una clara distinción en la estructura y la función entre
las sondas de PNA y las sondas de ADN examinadas.
Para este Ejemplo se compararon sondas de ADN y
de PNA para determinar qué efecto tendrían las variaciones en la
longitud sobre la relación señal ruido de la sonda nativa en la que
la relación señal ruido deriva de la señal generada en presencia de
la secuencia objetivo en comparación con el ruido o fluorescencia
de fondo de la sonda en ausencia de la secuencia objetivo. Se
realizaron comparaciones con respecto a los cambios en la longitud
de la sonda, en la fuerza iónica, cambios en la naturaleza del par
dador/aceptor y la presencia o ausencia de magnesio. A un nivel
práctico, estos datos difieren de los presentados en el Ejemplo 17
ya que compara la actividad relativa de las sondas en un ensayo de
hibridación. Para mayor brevedad, sólo se presentan los datos
correspondientes a los 11-meros y
15-meros de ADN y PNA.
Las sondas de PNA PNA003-11,
PNA003-15, Cy3PNA003-15 (Véase:
Tabla 1B) y las sondas de ADN DNA003-11 y
DNA003-15 (Véase: Tabla 2B) fueron preparadas como
se describe. Las sondas purificadas fueron diluidas en Disolución
Tampón TE (Tris-HCl 10 mM pH 8,3, EDTA 1 mM) a una
concentración de 25 pmoles/\muL y a continuación esta reserva fue
diluida aún más hasta 25 pmoles/50 \muL con cualquiera de los
Tampones A, B ó C. La composición de las disoluciones Tampón A, B y
C se describen en el Ejemplo 17. Se colocaron muestras de 50 \muL
de cada sonda en el Tampón apropiado en cada uno de los seis
pocillos de una placa de microtitulación de tal modo que para cada
sonda se llevaron a cabo tres reacciones de hibridación y tres
reacciones de control negativo (usadas para medir el ruido o la
fluorescencia de fondo). Para cada una de las reacciones de
hibridación, se añadieron a cada reacción 50 \muL de ADN objetivo
(wt k-ras, Tabla 2A), que habían sido preparadas
mediante dilución del ADN objetivo en un tampón TE hasta 100
pmoles/\muL y posterior dilución de esta reserva hasta 25
pmoles/\muL con cada una de las disoluciones Tampón A, B ó C.
Para cada control, se añadieron 50 \muL de uno de los Tampones A,
B ó C. Como consecuencia del tiempo necesario para pipetear y
mezclar los contenidos de los pocillos, todos los reactivos habían
sido mezclados durante aproximadamente 1 minuto antes de la primera
lectura de fluorescencia. Todas las reacciones de hibridación fueron
llevadas a cabo a temperatura ambiente.
Los datos de hibridación fueron recogidos usando
un contador multimarcador Wallac 1420 Victor. La intensidad de
fluorescencia de cada pocillo fue medida durante 0,1 segundos. Para
todas las muestras, se tomaron 40 medidas a lo largo de un periodo
de aproximadamente 30 minutos. Por consiguiente, la dependencia con
el tiempo de las relaciones señal ruido fue derivada de los datos
recogidos a lo largo de un periodo de 30 minutos. Se presentan las
relaciones señal ruido derivadas del valor medio de las tres
reacciones de hibridación, en comparación con las reacciones de
control, correspondientes a: 1) Los 11-meros de ADN
y de PNA en las Figuras 4A y 4B; 2) los 15-meros de
ADN y de PNA en las Figuras 4C y 4D; y 3) la sonda de
15-meros de PNA Cy3PNA003-15 en la
Figura 4E.
En referencia a la Figura 4A, se presenta la
relación señal ruido durante los 30 minutos de datos recogidos
correspondiente al 11-mero de ADN en cada una de las
disoluciones Tampón A, B y C. Puesto que una relación señal ruido de
1 indica que no existe señal, el resultado más sorprendente es la
ausencia de seña alguna cuando se usa el Tampón B. En comparación,
la adición de magnesio (Tampón A) o el aumento de la fuerza iónica
y el pH (Tampón C) da como resultado una mejora sustancial en la
relación señal ruido. Además, el ritmo de aumento de la relación
señal ruido con el tiempo es bastante distinto y puede ser usado
para monitorizar la cinética de hibridación.
La relación señal ruido obtenida para el
11-mero de PNA en todos los tampones se presenta
gráficamente en la Figura 4B. En comparación con el
11-mero de ADN, se obtuvo una relación señal ruido
superior a la unidad en todas las condiciones examinadas. Además,
existía un intervalo dinámico menor en la relación señal ruido para
cada una de las tres disoluciones tampón examinadas (el intervalo de
S/R para el 11-mero de ADN a los 30 minutos era
aproximadamente de 1 a 14 mientras que el intervalo de S/R para el
11-mero de PNA a los 30 minutos era aproximadamente
de 3 a 6). Por consiguiente, la relación señal ruido para el
11-mero de PNA, en comparación con el
11-mero de ADN, parece ser bastante independiente de
la fuerza iónica de su entorno aunque exista al menos algo de
aumento atribuible al cambio entre los Tampones B y C. Además, la
relación señal ruido del 11-mero de PNA parece ser
completamente independiente de la presencia o ausencia de magnesio,
ya que los datos correspondientes a los Tampones A y B son
esencialmente los mismos.
Adicionalmente, existe un incremento muy pequeño
en la relación señal ruido correspondiente al
11-mero de PNA con el tiempo. Por consiguiente, los
datos sugieren que la cinética de hibridación de la Baliza Lineal,
PNA003.11, es extremadamente rápida en todos los Tampones
examinados y que la hibridación prácticamente ha alcanzado el
equilibrio en los primeros minutos de la reacción.
En referencia a las Figuras 4C y 4D, los datos
correspondientes a los 15-meros de ADN y de PNA,
respectivamente, se ilustran gráficamente. De forma general, todos
los datos obtenidos para los 15-meros siguen la
misma tendencia que los observados para los
11-meros. Específicamente, la relación señal ruido
correspondiente al 15-mero de ADN en el Tampón B es
1, lo cual indica que se detecta hibridación alguna dentro de los
límites del experimento. En los Tampones A y C, el
15-mero de ADN da lugar a una relación señal ruido
que aumenta con el tiempo de tal modo que se puede determinar la
cinética de hibridación mediante el análisis de los datos.
Adicionalmente, el intervalo dinámico de la relación señal ruido
correspondiente al 15-mero de ADN en los Tampones A
y C está entre 6 y 11 en comparación con el 15-mero
de PNA, en el que la relación señal ruido está aproximadamente
entre 7 y 13.
Considerando todos los datos en conjunto,
demuestran que la relación señal ruido del 15-mero
de PNA es bastante independiente de la presencia o ausencia de
magnesio ya que los datos son esencialmente los mismos para las
disoluciones Tampón A y B. Además, la relación señal ruido
correspondiente al 15-mero de PNA, en comparación
con el 15-mero de ADN, parece ser bastante
independiente de la fuerza iónica de su entorno aunque existe al
menos algo de incremento atribuible al cambio entre los Tampones B
y C. Finalmente, los datos sugieren que la cinética de hibridación
de la Baliza Lineal, PNA003-15, son extremadamente
rápidos en todos los Tampones examinados ya que la hibridación
prácticamente ha alcanzado el equilibrio en los primeros minutos de
reacción en comparación con la cinética de hibridación del
15-mero de ADN que es sustancialmente más lenta.
En referencia a la Figura 4E, se presentan los
datos de relación señal ruido correspondientes al
15-mero de PNA marcado con Cy3,
Cy3PNA003-15. Los datos de esta sonda pueden ser
comparados más eficazmente con los datos de la sonda de PNA,
PNA003-15, ya que sólo se ha alterado el fluoróforo
dador (fluoresceína por Cy3). Una rápida visión de los datos indica
que, nuevamente, se obtiene una relación señal ruido positiva en
las tres disoluciones Tampón. El intervalo dinámico de la relación
señal ruido es de aproximadamente 6 a 11, lo que concuerda con los
datos correspondientes al PNA003-15 indicando que no
existe una dependencia sustancial de la presencia o ausencia de
magnesio, o una dependencia sustancial de la fuerza iónica. Además,
los datos demuestran claramente que no se requiere un solapamiento
sustancial entre la emisión del resto dador y la absorbancia del
resto aceptor en la Baliza Lineal, ya que la relación señal ruido
es esencialmente la misma para el PNA003-15 y para
el Cy3PNA003-15 a pesar de las características
espectrales tan diferentes de los restos dador de fluoresceína y
Cy3 de los pares dador/aceptor (Conjunto de Balizas).
Sin embargo, curiosamente, para la sonda de PNA
Cy3PNA003-15, los Tampones A y B superan al Tampón
C. Este resultado es sustancialmente diferente al observado con las
sondas marcadas con fluoresceína (de ADN ó de PNA). Por
consiguiente, los datos sugieren que la naturaleza de los marcadores
o del par marcador (Conjunto de Balizas) puede ser el factor más
significativo de los que afectan al intervalo dinámico de las
relaciones señal ruido observadas para una única sonda en los
diferentes Tampones. Estos datos tienden a sugerir que la mayor
parte del intervalo dinámico en la relación señal ruido puede estar
relacionado con la naturaleza de los marcadores fortaleciendo el
argumento de que la estructura y la función de las Balizas Lineales
son bastante independientes de la presencia o de la ausencia de
magnesio y de la fuerza iónica del entorno, en comparación con las
sondas de ADN, ya que la mayor parte del intervalo dinámico
observado en los distintos Tampones probablemente es atribuible a
la naturaleza de los marcadores y no a la estructura o a la función
de la Baliza Lineal. En comparación, el amplio intervalo dinámico de
la relación señal ruido y la dependencia del ruido con respecto a
la longitud (Véase: Ejemplo 17) observada en las sondas de ADN
indica que la composición del entorno puede tener un efecto
sustancial sobre la estructura y la función de una sonda de ADN.
Para este ejemplo, se evaluó PCR asimétrico en
comparación con el PCR tradicional debido a que el PCR da lugar a un
exceso de ácido nucleico de cadena sencilla. Puesto que es posible
elegir cual de las cadenas del amplicón son amplificadas
preferentemente mediante un ajuste juicioso de la relación de
prímeros 5' y 3', fue posible diseñar el ensayo de tal modo que la
secuencia objetivo con la que se hibrida la Baliza Lineal estaba
contenida dentro del ácido nucleico de cadena sencilla
sobreproducido en el ensayo de PCR asimétrico.
Por consiguiente, se diseñó una Baliza Lineal
para hibridarse con una de las cadenas de una región de dsADN que se
pretende ampliar. Se añadió la Baliza Lineal al cóctel de PCR antes
de realizar el termociclo. Aunque las Balizas Lineales pueden
hibridarse con la secuencia objetivo durante el termociclo, no se
observó ninguna inhibición significativa del proceso de
amplificación. Por consiguiente, la amplificación de PCR fue
monitorizada con éxito usando la señal de fluorescencia detectable
de la Baliza Lineal generada en respuesta a la actividad de la
reacción PCR. Los datos presentados demuestran claramente la
posibilidad de usar Balizas Lineales para la detección de ácido
nucleico amplificado en un ensayo de tubo cerrado (homogéneo) si se
usa PCR tradicional o asimétrica.
Las reacciones de PCR fueron llevadas a cabo en
mini-tubos eppendorf en un termociclador
Perkin-Elmer 2400. El protocolo de PCR incluía un
calentamiento de 5 segundos hasta 94ºC (sólo en el primer ciclo),
seguido de la desnaturalización a 94ºC durante 5 segundos, el
recocido a 55ºC durante 30 segundos, y la extensión a 74ºC durante
30 segundos. El ciclo
desnaturalización-recocido-extensión
se repitió 45 veces. Se extrajeron muestras de 10 \muL de cada
reacción de PCR al final de la etapa de extensión de 30 segundos en
los ciclos número 30, 35, 40 y 45. Todas las muestras de 10 \muL
fueron colocadas en una placa de microtitulación de fondo cónico de
96 pocillos y se monitorizó la fluorescencia usando un lector de
placas Wallac 1420 Victor^{TM} Multilabel. Se registró la
intensidad de fluorescencia media en unidades relativas de luz
(RLU) durante 10 segundos (longitud de onda del filtro de
excitación 485 nm; longitud de onda del filtro de emisión 535
nm).
Todas las reacciones PCR fueron derivadas a
partir de una única "matriz maestra" a la que se añadió
plásmido (para las reacciones positivas) ó disolución tampón de
plásmido (reacciones negativas). Se prepararon reacciones PCR que
contienen 1 \muL de ADN de plásmido o de tampón de plásmido
(Tris-HCl 10 mM pH 8,0; EDTA 1 mM) como control, 50
pmoles del prímero 5', cantidades variables del prímero 3' como se
describe a continuación, 1 \muL de 10 pmoles/\muL de Baliza
Lineal de PNA003.MU (Tabla 1B) en
N,N'-dimetilformamida al 50% en agua, MgCl_{2} 3
mM, ATP 250 \muM, CTP 250 \muM, GTP 250 \muM, TTP 250 \muM,
2,85 unidades de polimerasa AmpliTaq de ADN, KCl 50 mM, y
Tris-HCl 10 mM pH 8,3, en un volumen total de 50
\muL. La relación de prímero 5' a prímero 3' fue 1:1 (50 pmoles
de prímero 3'), 10:1 (5 pmoles de prímero 3'), ó 100:1 (0,5 pmoles
de prímero 3').
El plásmido, pKRASMU, fue generado mediante
clonación de un amplicón de PCR procedente de ADN humano en el
plásmido pCR2.1 (Invitrogen). El ADN humano fue preparado a partir
de una línea de células, Calu-1, que contiene un
punto de mutación en la base 129 del gen K-ras. Los clones
fueron escrutados mediante análisis de fragmentos de restricción y
fueron secuenciados. Se generaron grandes preparaciones del
plásmido y fueron cuantificadas usando técnicas estándar. La región
amplificada bordea la mutación K-ras y tenía una longitud de
111 pb. Las reacciones PCR que no fueron termocicladas fueron usadas
como controles de fluorescencia.
| Prímero 5' | 5' ATGACTGAATATAAACTTGT 3' | Seq. ID Nº 7 |
| Prímero 3' | 5' CTCTATTGTTGGATCATATT 3' | Seq. ID Nº 8 |
Como se ha presentado anteriormente, la Baliza
Lineal PNA003.MU fue diseñada de tal modo que no solape con las
regiones de prímeros.
La Tabla 4 presenta los datos de fluorescencia
registrados para las reacciones PCR en los ciclos número 30, 35, 40
y 45. Para mayor comodidad en la discusión, a las filas de la Tabla
se les han asignado números del 1 al 6 y a las columnas se les han
asignados letras de la A a la G. El fondo medio, obtenido a partir
de los controles que no han sido sometidos a termociclos, ha sido
sustraído de los datos presentados en la Tabla.
En referencia a la Tabla 4, las relaciones de
prímeros 5' y 3', respectivamente, que fueron usadas en cada ensayo
se presentan en la fila 1. El símbolo mostrado en la fila 2 de la
tabla se usa para indicar la presencia (+) o la ausencia (-) de 1
fmol del plásmido de pKRASMU (molde de PCR) en cada ensayo. Las
filas 3 a 6 de la columna A indican en total de ciclos de PCR que
se han llevado a cabo para generar los datos presentados.
El valor de los datos correspondientes a las
reacciones que no contienen molde (columnas B, D y F) oscilan entre
-280 y 636, con una media de 338, mientras que los datos
correspondientes a las reacciones que contienen molde (columna C, E
y G) son significativamente superiores en todos los casos excepto
en la fila 3, columna G. Adicionalmente, la intensidad de
fluorescencia de las muestras que contienen molde exhiben una
correlación entre la relación de prímeros y el número de ciclos de
PCR. Por ejemplo, los datos correspondientes a una reacción PCR
(columna C), en la que se usan cantidades equivalentes de los
prímeros 5' y 3', presentaron una intensidad de fluorescencia
bastante consistente en todos los ciclos para los que se
registraron los datos. En comparación, la fluorescencia
correspondiente a PCR asimétrica (columna E), en la que la relación
prímero 5' a 3' fue de 10 a 1, fue sustancialmente más intensa.
Estos datos sugieren que la relación 10 a 1 de prímeros 5' a 3'
facilita una amplificación robusta en la que se sobreexpresa
significativamente el ácido nucleico de cadena sencilla que
contiene la secuencia objetivo.
La fluorescencia correspondiente a PCR asimétrica
(columna G), en la que la relación prímero 5' a 3' fue de 100 a 1,
no fue intensa en comparación con los datos mostrados en la columna
G. Sin embargo, la PCR asimétrica exhibió una clara correlación
entre el número creciente de ciclos de PCR y la intensidad de
fluorescencia. La menor fluorescencia observada con una relación de
prímeros de 100 a 1 probablemente es el resultado de una menor
abundancia total de secuencia objetivo que contiene ácido nucleico
de cadena sencilla que es causada por presentar diez veces menos
prímero 3' en los ciclos iniciales de la reacción de amplificación
PCR en comparación con la muestra cuyos datos se presentan en la
columna E.
La Figura 5 es una imagen digital de una foto de
la muestra (aproximadamente 10 \muL) que permanecen en los tubos
3 y 4 después de 45 ciclos de PCR. El tubo 3 (izquierda)
corresponde a los datos presentados en la fila 6, columna D, y el
tubo 4 (derecha) corresponde a los datos presentados en la fila 6,
columna E. La foto fue tomada con un transiluminador de UV. El tubo
4, que contenía el molde, es fluorescente bajo inspección visual
mientras que el tubo 3, que era un control que no contenía el
molde, no es visiblemente fluorescente, lo cual confirma un
resultado negativo mediante una mera inspección visual.
Considerados en conjunto, los datos presentados
en este ejemplo demuestra que las Balizas Lineales pueden ser usadas
para detectar ácido nucleico que ha sido amplificado en un ensayo de
tubo cerrado (homogéneo). Para las reacciones PCR asimétricas, la
intensidad de la señal de fluorescencia no sólo fue sustancialmente
mayor sino que la PCR asimétrica demostró presentar una correlación
entre el número de ciclos completados y la intensidad de la señal.
De este modo, la cuantificación de ácido nucleico amplificado fue
posible usando este método.
Se cultivaron cultivos individuales de bacterias
de 3 mL a lo largo de una noche en caldo de cultivo Tryptic Soy
Broth (TSB) a 30ºC. Se midió la OD_{600} de cada muestra y a
continuación se diluyó el cultivo con TSB fresco hasta una
OD_{600} de 0,5. Se deja que los cultivos se dobles
3-4 veces antes de la recolección. Se peletizaron
células procedentes de un cultivo de 20 mL mediante centrifugación
a 8000 rpm. durante 5 minutos, fueron resuspendidas en 20 mL de PBS
(Na_{2}HPO_{4}7 mM; NaH_{2}PO_{4} 3 mM; NaCl 130 mM), fueron
peletizadas de nuevo y resuspendidas en Tampón de Fijación
(paraformaldehído al 3% en PBS). Las bacterias fueron incubadas a
temperatura ambiente durante 30-60 minutos antes de
fueran peletizadas otra vez (centrifugación a 8000 rpm durante 5
minutos) y después de la eliminación de la disolución de fijación,
fueron resuspendidas en 20 mL de etanol al 50% en agua. Las
bacterias fijadas pueden ser usadas después de 30 minutos de
incubación a temperatura ambiente o pueden ser almacenadas a -20ºC
durante varias semanas antes de ser usadas.
Para cada ensayo, se transfirieron 100 \muL de
células fijadas en etanol al 50% en agua a un tubo de
microcentrífuga de 1,5 mL y fueron centrifugadas a 8000 rpm durante
5 minutos. A continuación se eliminó el etanol acuoso y el pélet
fue resuspendido en 100 \muL de PBS estéril y fueron peletizadas
de nuevo mediante centrifugación a 8000 rpm durante 5 minutos. Se
eliminó el PBS del pélet, y las células fueron resuspendidas en 100
\muL de tampón de hibridación (Tris-HCl 25 mM, pH
9,0; NaCl 100 mM; SDS 0,5%) que contenía la Baliza(s)
Lineal(es) apropiada en una concentración de aproximadamente
30 pmoles/mL. Se llevó a cabo la reacción de hibridación a 50ºC
durante 30 minutos. Las Balizas Lineales y sus organismos objetivo
se enumeran en la Tabla 1C. Las sondas de Pseudomonas fueron usadas
en una mezcla de 1 a 1 para cada hibridación, en la que la
concentración de cada sonda fue 30 pmol/mL en cada reacción de
hibridación.
A continuación, la muestra fue centrifugada a
8000 rpm durante 5 minutos. El tampón de hibridación fue eliminado y
las células fueron resuspendidas en 100 \muL de
TE-9.0 esterilizado (Tris-HCl 10 mM,
pH 9,0; EDTA 1 mM). Se colocó una alícuota de 2 \muL de esta
suspensión de células en un portaobjetos de vidrio, se dispersó y
se dejó secar. Por último, se depositaron 2 \muL de Vectashield
(Vector Laboratorios, P/N H-1000) sobre las células
secas y se añadió un cubreobjetos y su posición fue fijada usando
una par de gotas de esmalte de uñas.
Se inspeccionó los portaobjetos usando un
microscopio de fluorescencia Nikon equipado con un objetivo de
inmersión en aceite de 60x, un ocular de 10x (el aumento total es
de 600) y filtros de luz obtenidos en Omega Optical (XF22 (verde) y
XF34 (rojo)). Se tomaron imágenes digitales electrónicas de
porciones de los portaobjetos usando una cámara SPOT CCD y el
software obtenido en Diagnostic Instruments, Inc., Sterling
Heights, MI (EE.UU.).
Las imágenes digitales obtenidas se presentan en
la Figura 6A y 6B. Las células fijadas de E. coli, P.
aeruginosa y B. subtilis fueron hibridadas todas con una
Baliza Lineal de P. aeruginosa (Figura 6A) o con una de B.
sutiles (Figura 6B) como se ha descrito anteriormente. En ambas
Figuras, 6A y 6 B, las imágenes rojas presentadas en los paneles I,
III y V pertenecen a células tintadas con yoduro de propidio que
eran visibles usando el filtro de microscopio rojo. En ambas
Figuras, 6A y 6B, las imágenes verdes presentadas en los paneles
II, IV y VI pertenecen a células que presentan fluorescencia verde
provocada por la hibridación de la Baliza Lineal marcada con
fluoresceína y la secuencia de rARN objetivo y que son visibles
usando el filtro de microscopio verde. Con fines comparativos, las
imágenes rojas y verdes correspondientes a cada sonda examinada son
de la misma sección de cada portaobjetos y están presentadas una
sobre la otra en las Figuras.
En referencia a la Figura 6A, se pueden observar
las células de E. coli, P. aeruginosa y B.
subtilis en las imágenes rojas presentadas en los paneles I,
III y V, respectivamente. Las células son rojas ya que el yoduro de
propidio tintará todas las bacterias presentes. En referencia a los
paneles II, IV y VI de la Figura 6A, las células verdes son las más
intensamente visibles sólo en el panel IV, lo que confirma que la
Baliza Lineal puede ser usada para identificar de manera específica
la presencia del organismo objetivo P. aeruginosa.
En referencia a la Figura 6B, de nuevo se pueden
observar las células de E. coli, P. aeruginosa y
B. subtilis en las imágenes rojas presentadas en los paneles
I, III y V, respectivamente. En referencia a los paneles II, IV y
VI de la Figura 6B, las células verdes son más intensamente
visibles sólo en el panel VI, lo que confirma que la Baliza Lineal
puede ser usada para identificar de manera específica la presencia
del organismo objetivo B. subtilis.
En resumen, las Balizas Lineales dirigidas a
P. aeruginosa y a Bacillus proporcionan una detección
inequívoca de organismos objetivo incluso aunque el protocolo no
incluya ninguna etapa de lavado después de que se ha llevado a cabo
la reacción de hibridación.
Se llevó a cabo este ejemplo para determinar si
el fenómeno observado por los solicitantes era dependiente de la
secuencia. Por tanto, la secuencia de nucleobases de la sonda de
PNA Cy3PNA003-15 (Véase: Tabla 1B) fue
reestructurada para producir la sonda Cy3SCBL03-15
(Véase: Tabla 1B).
Se ha descrito la preparación, el marcado y la
purificación de oligómeros de PNA. Se examinó la sonda
Cy3SCBL03-15 en las disoluciones Tampón B y C básicamente como se ha descrito en el Ejemplo 18 de esta especificación usando el objetivo de ADN SCBL-DNA (Véase: Tabla 2A). Los datos obtenidos se representan gráficamente en las Figuras 7A y 7B.
Cy3SCBL03-15 en las disoluciones Tampón B y C básicamente como se ha descrito en el Ejemplo 18 de esta especificación usando el objetivo de ADN SCBL-DNA (Véase: Tabla 2A). Los datos obtenidos se representan gráficamente en las Figuras 7A y 7B.
En referencia a la Figura 7A, la señal primaria y
los datos de ruido se ilustran para los dos tampones examinados.
Tal como fue observado con la sonda Cy3PNA003- 15, los resultados
correspondientes a la sonda Cy3SCBL03-15 parecen ser
sustancialmente independientes del tampón, con lo que se confirma
que la fuerza iónica y un cambio mínimo en el pH no afectan a los
resultados. En referencia a la Figura 7B, la relación señal ruido
es aproximadamente 6-8 durante la hibridación con
la secuencia objetivo. Esto concuerda con los datos presentados en
la Figura 4E correspondientes a la sonda
Cy3PNA003-15. Por tanto, los datos indican que el
fenómeno observado por los solicitantes no es sustancialmente
dependiente de la secuencia de nucleobases de la Baliza Lineal.
Aunque esta invención ha sido mostrada y descrita
en particular en referencia a sus realizaciones preferidas, aquellos
con conocimientos en la técnica deberán entender que se pueden
realizar varios cambios en la forma y en los detalles sin alejarse
del espíritu y el alcance de la invención tal como se define en las
reivindicaciones anexas. Aquellos con conocimientos en la técnica
serán capaces de averiguar, sin usar más que una experimentación
rutinaria, muchas realizaciones equivalentes de la invención
descrita aquí. Se pretende que dichos equivalentes sean abarcados
por el alcance de las reivindicaciones.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<110> Gildea, Brian D.
\hskip1cmCoull, James M.
\hskip1cmHyldig-Nielser, Jens J.
\hskip1cmFiandaca, Mark J.
\hskip1cmBoston Probes, Inc.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Métodos, kits y composiciones que
pertenecen a balizas lineales
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> BP9703-PCT
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/063.283
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
27-10-1998
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.0
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 31
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Características_varias
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 5' Biotina
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: SONDA U OBJETIVO SINTÉTICO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtggtagttg gagctggtgg cgtaggcaag a
\hfill31
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: SONDA U OBJETIVO SINTÉTICO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggtagtgtct ggtgatgctg gaggcaa
\hfill27
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Características_varias
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 5' Fluoresceína
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Características_varias
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (11)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 3' Dabcyl
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: SONDA U OBJETIVO SINTÉTICO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgccaccagct c
\hfill11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Características_varias
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 5' Fluoresceína
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Características_varias
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (13)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 3' Dabcyl
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: SONDA U OBJETIVO SINTÉTICO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgccaccagc tcc
\hfill13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Características_varias
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 5' Fluoresceína
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Características_varias
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (15)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 3' Dabcyl
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: SONDA U OBJETIVO SINTÉTICO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipacgccaccag ctcca
\hfill15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Características_varias
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 5' Fluoresceína
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Características_varias
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (17)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> 3' Dabcyl
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: SONDA U OBJETIVO SINTÉTICO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptacgccacca gctccaa
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: SONDA U OBJETIVO SINTÉTICO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipacgactgaat ataaacttgt
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: SONDA U OBJETIVO SINTÉTICO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctctattgtt ggatcatatt
\hfill20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 111
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: SONDA U OBJETIVO SINTÉTICO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgagataacaa cctagtataa gcaggtgttt tactaagact taatcgactt agcagttccg
\hfill60
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptgagaacgga tgcggtgttc gaggttgatg gtgttcaaat ataagtcagt a
\hfill111
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 111
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo Sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la Secuencia
Artificial: SONDA U OBJETIVO SINTÉTICO
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctctattgtt ggatcatatt cgtccacaaa atgattctga attagctga attagctgta tcgtcaaggc
\hfill60
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipactcttgcct acgccacaag ctccaactac cacaagttta tattcagtca t
\hfill111
Claims (48)
1. Un polímero que comprende;
- a)
- una secuencia de nucleobases sonda no constituida por polinucleótidos para sondear una secuencia objetivo con respecto de la cual la secuencia de nucleobases es complementaria;
- b)
- al menos un resto dador de energía que está unido a la secuencia de nucleobases sonda; y
- c)
- al menos un resto aceptor de energía que está unido a la secuencia de nucleobases sonda, en el que al menos uno de los restos dadores de energía está separado de al menos uno de los restos aceptores de energía por al menos una porción de la secuencia de nucleobases sonda.
2. Un polímero como el reivindicado en la
Reivindicación 1, en el que la secuencia de nucleobases sonda tiene
una longitud de 5 a 30 subunidades.
3. Un polímero como el reivindicado en cualquiera
de las reivindicaciones anteriores, en el que cada una de las
subunidades de la secuencia de nucleobases sonda presenta la
fórmula:
en la
que,
- cada J es igual o diferente y es seleccionado del grupo que consiste en: H, R^{1}, OR^{1}, SR^{1}, NHR^{1}, NR^{1}_{2}, F, Cl, Br y I;
- cada K es igual o diferente y es seleccionado del grupo que consiste en: O, S, NH y NR^{1};
- cada R^{1} es igual o diferente y es un grupo alquilo que tiene de uno a cinco átomos de carbono que opcionalmente puede contener un heteroátomo o un grupo arilo sustituido o sin sustituir;
- cada A es seleccionado del grupo que consiste en un único enlace, un grupo que presenta la fórmula; -(CJ_{2})- y un grupo que presenta la fórmula; -(CJ_{2})_{s}C(O)- en la que, J se define como anteriormente y cada s en un número entero entre uno y cinco;
- cada t es 1 ó 2;
- cada u es 1 ó 2; y
- cada L es igual o diferente y se selecciona de forma independiente del grupo que consiste en J, adenina, citosina, guanina, timina, uridina, 5-metil-citosina, 2-aminopurina, 2-amino-6-cloropurina, 2,6-diaminopurina, hipoxantina, pseudoisocitosina, 2-tiouracilo, 2-tiotimidina, otros análogos de nucleobases naturales, otras nucleobases no naturales, restos aromáticos sustituidos o sin sustituir, biotina y fluoresceína.
4. Un polímero como el reivindicado en la
Reivindicación 3, en el que cada subunidad de PNA consiste en una
nucleobase natural o no natural unida al nitrógeno aza de una
cadena principal de N-[2-(aminoetil)] glicina mediante un enlace
metilencarbonílico.
5. Un polímero como el reivindicado en la
Reivindicación 1, en la Reivindicación 3 ó en la Reivindicación 4,
en el que dicho polímero no forma una horquilla de tallo y lazo y
que además se caracteriza porque la eficacia de transferencia
de energía entre dichos restos dador y aceptor, cuando el polímero
está solvatado en una disolución acuosa, es sustancialmente
independiente de al menos dos variables seleccionadas del grupo que
consiste en:
- a)
- la longitud de secuencia de nucleobases que separan al menos un resto dador de al menos un resto aceptor;
- b)
- el solapamiento espectral de la menos un resto dador unido y de al menos un resto aceptor unido;
- c)
- la presencia o ausencia de magnesio en la disolución acuosa; y
- d)
- la fuerza iónica de la disolución acuosa.
6. Un polímero como el reivindicado en la
Reivindicación 5, en el que al menos un resto dador de energía está
unido a uno de los extremos, primero o segundo, de una secuencia de
nucleobases sonda, y al menos un resto aceptor de energía está
unido al otro de los extremos, primero o segundo, de la secuencia de
nucleobases sonda.
7. Un polímero como el reivindicado en la
Reivindicación 5 o en la Reivindicación 6, en el que el polímero es
un PNA.
8. Un polímero como el reivindicado en cualquier
reivindicación precedente, en el que el resto dador es un
fluoróforo seleccionado del grupo que consiste en
5(6)-carboxifluoresceína y sus derivados,
ácido
5-(2'-aminoetil)-aminonaftalen-1-sulfónico
(EDANS), bodipy y sus derivados, rodamina y sus derivados, Cy2,
Cy3, Cy 3.5, Cy5, Cy5.5, rojo Texas y sus derivados.
9. Un polímero como el reivindicado en cualquier
reivindicación precedente, en el que el resto aceptor es ácido
4-((-4-(dimetilamino)fenil)azo)benzoico
(dabcyl).
10. Un polímero como el reivindicado en cualquier
reivindicación precedente, en el que al menos un resto espaciador
separa uno o los dos restos dador y aceptor de la secuencia de
nucleobases a la que está unida.
11. Un polímero como el reivindicado en
cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 10, en el que la secuencia
de nucleobases sonda es perfectamente complementaria a la secuencia
objetivo.
12. Un polímero como el reivindicado en cualquier
reivindicación precedente, en el que el polímero está inmovilizado
sobre un soporte.
13. Un polímero como el reivindicado en la
Reivindicación 12, en el que el polímero es un polímero componente
de un conjunto.
14. Un método para la detección, identificación o
cuantificación de una secuencia objetivo en una muestra,
comprendiendo dicho método:
- a)
- poner en contacto la muestra con un polímero que comprende:
- i)
- una secuencia de nucleobases sonda no formada por polinucleótidos que es complementaria a la secuencia objetivo;
- ii)
- al menos un resto dador de energía que está unido a la secuencia de nucleobases sonda; y
- iii)
- al menos un resto aceptor de energía que está unido a la secuencia de nucleobases sonda y que está separado de al menos un resto aceptor de energía por al menos una porción de la secuencia de nucleobases sonda; y
- b)
- detectar, identificar o cuantificar la hibridación del polímero con la secuencia objetivo, bajo las condiciones de hibridación adecuadas, en las que la presencia, ausencia o cantidad de secuencia objetivo presente en la muestra puede ser correlacionada con un cambio en la señal detectable asociada con al menos un resto dador o aceptor del polímero.
15. Un método para la detección, identificación o
cuantificación de una secuencia objetivo en una muestra como se
reivindica en la Reivindicación 14, en el que dicho polímero no
forma una horquilla de tallo y lazo; y dicho polímero se
caracteriza adicionalmente porque la eficacia de
transferencia de energía entre dichos restos dador y aceptor cuando
el polímero está solvatado en disolución acuosa es sustancialmente
independiente de al menos dos variables seleccionadas del grupo que
consiste en:
- i)
- la longitud de la secuencia de nucleobases entre dicho al menos un resto dador de energía y dicho al menos un resto aceptor de energía;
- ii)
- el solapamiento espectral de al menos un resto dador y al menos un resto aceptor;
- iii)
- la presencia o ausencia de magnesio en la disolución acuosa; y
- iv)
- la fuerza iónica de la disolución acuosa.
16. Un método como el reivindicado en la
Reivindicación 15, en el que al menos un resto dador de energía
está unido a uno de los extremos, primero o segundo, de la
secuencia de nucleobases sonda y al menos un resto aceptor de
energía está unido al otro de los extremos, primero o segundo, de
la secuencia de nucleobases sonda.
17. Un método como el reivindicado en la
Reivindicación 15 o en la Reivindicación 16, en el que el polímero
es un PNA.
18. Un método como el reivindicado en cualquiera
de las Reivindicaciones 14 a 17, en el que el método se usa para
detectar secuencias objetivo en un ensayo de tubo cerrado
(homogéneo).
19. Un método como el reivindicado en la
Reivindicación 18, en el que el método es usado para detectar ácido
nucleico que comprende una secuencia objetivo en el que dicho ácido
nucleico ha sido sintetizado o amplificado en una reacción que se
produce en un ensayo de tubo cerrado (homogénea).
20. Un método como el reivindicado en la
Reivindicación 19, en el que la síntesis del ácido nucleico o la
reacción de amplificación del ácido nucleico es seleccionada del
grupo que consiste en: Reacción en Cadena de Polimerasa (PCR, del
inglés "Polymerase Chain Reaction"), Reacción en Cadena de
Ligasa (LCR, del inglés "Ligase Chain Reaction"),
Amplificación de Desplazamiento de Cadena (SDA, del inglés
"Strand Displacement Amplification"), Amplificación Mediada por
Transcripción (TMA, del inglés
"Transcription-Mediated Amplification"),
Amplificación Circular en Rollo (RCA, del inglés "Rolling Circle
Amplification") y la replicasa Q-beta.
21. Un método como el reivindicado en la
Reivindicación 20, en el que la reacción PCR es una reacción PCR
asimétrica.
22. Un método como el reivindicado en la
Reivindicación 20, en el que la secuencia objetivo amplificada o
sintetizada se mide en tiempo real.
23. Un método in vitro como el
reivindicado en cualquiera de las Reivindicaciones 14 a 22, en el
que el método se usa para detectar una secuencia objetivo en una
célula o tejido, tanto vivo como no.
24. Un método como el reivindicado en la
Reivindicación 23, en el que la secuencia objetivo de la célula o
tejido es detectada, identificada o cuantificada usando hibridación
in situ.
25. Un método como el reivindicado en cualquiera
de las Reivindicaciones 14 a 24, en el que la muestra se pone en
contacto con dicho polímero y una o más sondas de bloqueo.
26. Un método como el reivindicado en cualquiera
de las Reivindicaciones 14 a 25, en el que la detección,
identificación o cuantificación de la secuencia objetivo determina
la presencia o la cantidad de un organismo o de un virus en la
muestra.
27. Un método como el reivindicado en la
Reivindicación 25, en el que la detección, identificación o
cuantificación de la secuencia objetivo determina la presencia o la
cantidad de una o más especies de un organismo en la muestra.
28. Un método como el reivindicado en cualquiera
de las Reivindicaciones 14 a 24, en el que la detección,
identificación o cuantificación de la secuencia objetivo determina
el efecto de los agentes antimicrobianos sobre el crecimiento de
uno o más microorganismos en la muestra.
29. Un método como el reivindicado en la
Reivindicación 26, en el que la detección, identificación o
cuantificación de la secuencia objetivo determina la presencia o la
cantidad de un grupo taxonómico de organismos en la muestra.
30. Un método in vitro como el
reivindicado en cualquiera de las Reivindicaciones 14 a 28, en el
que la detección, identificación o cuantificación de la secuencia
objetivo facilita una diagnosis de una condición de interés
médico.
31. Un método como el reivindicado en la
Reivindicación 14 o en la Reivindicación 17, en el que la secuencia
objetivo es inmovilizada sobre una superficie.
32. Un método como el reivindicado en la
Reivindicación 14 o en la Reivindicación 17, en el que el polímero
es inmovilizado sobre una superficie.
33. Un método como el reivindicado en la
Reivindicación 14 o en la Reivindicación 17, en el que el polímero
es un polímero componente de un conjunto.
34. Un conjunto que comprende dos o más polímeros
unidos a un soporte, en el que al menos un polímero del conjunto
comprende:
- a)
- una secuencia de nucleobases sonda que no es un polinucleótido para sondear una secuencia objetivo con respecto a la cual la secuencia de nucleobases sonda es complementaria;
- b)
- al menos un resto dador de energía que está unido a la secuencia de nucleobases sonda; y
- c)
- al menos un resto aceptor de energía que está unido a la secuencia de nucleobases sonda, en el que al menos un resto dador está separado de al menos un resto aceptor por al menos una porción de la secuencia de nucleobases sonda; y
\newpage
en el que dicho polímero es adecuado para
detectar, identificar o cuantificar una secuencia objetivo presente
en una muestra.
35. Un conjunto como el reivindicado en la
Reivindicación 34, en el que dicho polímero no forma una horquilla
de tallo y lazo y que adicionalmente se caracteriza porque
la eficacia de transferencia de energía entre dicho restos dador y
aceptor, cuando el polímero está solvatado en disolución acuosa, es
sustancialmente independiente de al menos dos variables
seleccionadas del grupo que consiste en:
- a)
- la longitud de la secuencia de nucleobases que separa el al menos un resto dador del al menos un resto aceptor;
- b)
- el solapamiento espectral del al menos un resto dador y el al menos un resto aceptor;
- c)
- la presencia o ausencia de magnesio en la disolución acuosa; y
- d)
- la fuerza iónica de la disolución acuosa; y
- en el que dicho polímero es adecuado para detectar, identificar o cuantificar una secuencia objetivo presente en una muestra.
36. Un conjunto como el reivindicado en la
Reivindicación 34 o en la Reivindicación 35, en el que el al menos
un resto dador de energía del al menos un polímero está unido a uno
de los extremos, primero o segundo, de la secuencia de nucleobases
sonda, y el al menos un resto aceptor de energía del al menos un
polímero está unido al otro extremo, primero o segundo, de la
secuencia de nucleobases sonda.
37. Un conjunto como el reivindicado en
cualquiera de las Reivindicaciones 34 a 36, en el que el conjunto
es adecuado para la regeneración mediante tratamiento con uno o más
catalizadores de regeneración seleccionados del grupo que consiste
en calor, enzima nucleasa y desnaturalizante químico.
38. Un kit adecuado para llevar a cabo un ensayo
que detecta la presencia, ausencia o cantidad de secuencia objetivo
en una muestra, en el que dicho kit comprende:
- a)
- al menos un polímero que presente al menos un resto dador de energía unido y al menos un resto aceptor de energía unido, en el que dichos restos dador y aceptor están separados por al menos una porción de una secuencia de nucleobases sonda no constituida por polinucleótidos, y en el que dicho polímero no forma una horquilla de tallo y lazo y adicionalmente se caracteriza porque la eficacia de transferencia de energía entre dichos restos dador y aceptor, cuando el polímero está solvatado en disolución acuosa, es sustancialmente independiente de al menos dos variables seleccionadas del grupo que consiste en:
- i)
- la longitud de la secuencia de nucleobases que separan el al menos un resto dador y el al menos un resto aceptor;
- ii)
- el solapamiento espectral del al menos un resto dador de energía y el al menos un resto aceptor;
- iii)
- la presencia o ausencia de magnesio en la disolución acuosa; y
- iv)
- la fuerza iónica de la disolución acuosa; y
- b)
- otros reactivos o composiciones necesarios para llevar a cabo el ensayo.
39. Un kit como el reivindicado en la
Reivindicación 38, en el que uno o más de los polímeros del kit
presentan una secuencia de nucleobases sonda de 11 a 17 subunidades
de longitud.
40. Un kit como el reivindicado en la
Reivindicación 38 o en la Reivindicación 39, en el que dos o más
polímeros son marcados con restos detectables de forma
independiente.
41. Un kit como el reivindicado en la
Reivindicación 40, en el que los restos detectables de forma
independiente son usados para detectar, identificar o cuantificar
de forma independiente al menos dos secuencias objetivo diferentes
que pueden estar presentes en la misma muestra.
42. Un kit como el reivindicado en cualquiera de
las Reivindicaciones 38 a 41, en el que el kit es usado en un
ensayo de hibridación in-situ.
43. El uso de un kit como el reivindicado en
cualquiera de las Reivindicaciones 38 a 42 para detectar organismos
en alimentos, bebidas, agua, productos farmacéuticos, productos de
cuidado personal, productos lácteos o muestras
medioambientales.
\newpage
44. El uso de un kit como el reivindicado en
cualquiera de las Reivindicaciones 38 a 42, para evaluar materias
primas, productos o procesos.
45. El uso de un kit como el reivindicado en
cualquiera de las Reivindicaciones 38 a 42, para examinar muestras
clínicas tales como especímenes o equipamientos, muebles y
productos clínicos usados para tratar humanos o animales.
46. El uso de un kit como el reivindicado en
cualquiera de las Reivindicaciones 38 a 42, para detectar en una
muestra una secuencia objetivo que es específica para una
enfermedad con base genética o que es específica para una
predisposición hacia una enfermedad con base genética.
47. El uso como el reivindicado en la
Reivindicación 46, en el que el kit es usado para detectar una
secuencia objetivo asociada a una enfermedad seleccionada del grupo
que consiste en \beta-Talasemia, anemia celular de
hoz, Factor-V Leiden, fibrosis cística y objetivos
relacionados con el cáncer tales como p53, p10,
BRC-1 y BRC-2.
48. El uso de un kit como el reivindicado en
cualquiera de las Reivindicaciones 38 a 42, para detectar en una
muestra una secuencia objetivo en una técnica forense tal como la
monitorización prenatal, la prueba de paternidad, la confirmación
de identidad o la investigación criminal.
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