ES2235548T3 - Composiciones recombinantes de tratamiento del cabello. - Google Patents

Abstract

Un método para formular una composición para el tratamiento capilar, comprendiendo el método las etapas de: seleccionar un individuo humano, basándose en que dicho individuo tenga características de cabello atractivo; obtener ácidos nucleicos, al menos uno, cada uno de los cuales codifique una variante alélica diferente de la queratina que esté presente en el cabello del individuo humano; introducir cada uno de los ácidos nucleicos identificados en un vector de expresión para que se produzca una población de construcciones de expresión, cada una de las cuales codifique una variante alélica de queratina, incluyendo la población vectores que codifiquen al menos una variante alélica de queratina; introducir cada construcción de expresión en una célula hospedadora, de manera que se produzca una población de células hospedadoras, cada una de las cuales haya recibido una construcción de expresión individual y exprese una variante alélica de queratina no entrecruzada a partir de la misma; identificar aquellas células hospedadoras en la población de células hospedadoras que expresen al menos una de las citadas variante alélicas de queratina de una manera que no resulte en el entrecruzamiento de al menos una de las citadas variantes alélicas de queratina producidas; purificar cada una de las citadas variantes alélicas de queratina de la célula hospedadora que las produce; y combinar las citadas variantes alélicas de queratina purificadas entre sí y también con componentes de una composición para el tratamiento capilar a fin de formar una composición para el tratamiento capilar.

Description

Composiciones recombinantes de tratamiento del cabello.

Antecedentes de la invención

El pelo humano varía mucho en longitud, grosor y color en los diferentes individuos y entre las diferentes razas de la humanidad. Un pelo consiste en una raíz -que es la parte implantada en la piel- y un tallo -que es la parte que se proyecta desde la superficie. El tallo piloso consiste, desde adentro hacia afuera, en tres partes: la médula, la corteza y la cutícula. Cada capa tiene una naturaleza multicelular. La médula, por lo general más angosta en los pelos finos, está compuesta por hileras de células poliédricas. La corteza constituye la parte principal del tallo piloso; sus células son elongadas y se unen para formar fibras planas, ahusadas, que contienen gránulos pigmentados en el pelo oscuro y aire en el pelo blanco. La cutícula consiste en una sola capa de escamas planas que se superponen entre sí. La exposición del cabello al sol, al viento y los productos y las técnicas modernas de modelado capilar, (por ejemplo, la aplicación de champú, la decoloración, la tintura, los tintes y el modelado del cabello con preparaciones para ondularlo), imparte un daño significativo e indeseable a la cutícula y la corteza del tallo piloso. Como los daños ocasionados a ciertas proteínas presentes en el cabello se acumulan, el resultado es una pérdida del cuerpo, del brillo y de la suavidad de la textura. Estos daños también se reflejan en una compatibilidad deficiente tanto en el cabello mojado como seco, en una mayor carga electrostática, en una menor resistencia máxima a la tracción, en el resquebrajamiento del cabello y en el mal aspecto que presentan los peinados.

El componente estructural del cabello consiste en una disposición colateral superpuesta de filamentos intermedios, que se clasifican como fibras proteicas resistentes y duraderas presentes en el citoplasma de las células que están sujetas a un esfuerzo mecánico. Las proteínas de los filamentos intermedios consisten en una gran superfamilia de proteínas que comparten una organización estructural común. Estas proteínas contienen un dominio delgado de varillas a-helicoidales con extremos no helicoidales, que se unen a través de doble espiral dimérico. Los dímeros forman subunidades de oligómeros de orden más elevado, que se tuercen y compactan entre sí para formar cuerdas microscópicas que se tejen entre sí de diversas maneras, para formar una red en el citoplasma de la célula. Esta red actúa para conectar las células entre sí y es un componente estructural importante de los tejidos epiteliales. En los seres humanos, por lo menos tres cuartos de todas las proteínas de los filamentos intermedios son queratinas (Lane y colaboradores., Curr. Op. in Genet. Dev. V. 4, pp 412-418. 1994).

Las queratinas son el grupo más complejo de las proteínas de los filamentos intermedios. Hay por lo menos 30 proteínas de queratina, que pueden dividirse a su vez en queratinas duras (las queratinas del cabello y las uñas) y queratinas blandas (las queratinas epidérmicas) (Yu y colaboradores, The Journal of Investigative Dermatology, V. 101, NO. l, Suplemento de julio de 1993; y Fuchs, Ann. Rev. Biochem., V. 63, pp. 345-382, 1994). Las proteínas de la queratina del pelo humano pueden distinguirse de sus contrapartidas epidérmicas por un contenido relativamente mayor de cisteína, que refleja la utilización de uniones de disulfuro en la producción de una estructura más resistente y duradera (Yu y colaboradores, supra). Todas las queratinas se pueden dividir además en proteínas de queratinas ácidas del tipo I y básicas del tipo II que se heterodimerizan para formar la estructura de mayor orden común a los filamentos intermedios (Fuchs y colaboradores, supra). En la actualidad, hay siete queratinas capilares del tipo I conocidas (las queratinas capilares ácidas [ Hair acidic] hHa1, hHa2, hHa3-I, hHa3-II, hHa4, hHa5 y hHRa1) (Winter y colaboradores Nature Genetics, V.16, agosto, pp. 372-374, 1997) y cuatro queratinas capilares del tipo II conocidas (las queratinas capilares básicas [ Hair basic] hHb1, hHb3, hHb5 y hHb6) (Rogers y colaboradores, Differentiation, V. 61, pp. 187-194, 1997). En forma conjunta con los denominados pares menores de queratina capilares, Hax/Hbx, la familia de las queratinas capilares comprende 13 miembros. Las queratinas se expresan en la corteza del tallo piloso, (por ejemplo, Hb1) y en la cutícula (por ejemplo, Ha1 y dos isoformas de Ha3) (Winter y colaboradores, The Journal of Investigative Dermatology, V. 106, NO. 3, marzo, pp. 544-548, 1996).

Existe una sorprendente heterogeneidad en las proteínas epiteliales de la queratina expresadas en diferentes individuos. Esta heterogeneidad resulta de un polimorfismo de los respectivos genes de queratina epitelial (Mischke y colaboradores, The Journal of Investigative Dermatology, V. 88, No. 2, febrero, pp. 191-197, 1987; Lane y colaboradores, supra). Asimismo, una sutil variación alélica puede resultar en defectos fenotípicos importantes en el tejido epitelial (Lane y colaboradores, supra; Winter y colaboradores, supra; Fuchs y colaboradores, supra). Por ejemplo, los ratones transgénicos que expresan genes mutados de queratina epidérmica humana exhiben una red queratinosa alterada además de anormalidades tisulares que se parecen a las enfermedades de la piel humana autosómicas dominantes, epidermólisis bullosa simple o hiperqueratosis epidermolítica (Winter y colaboradores, supra). Sin la adecuada red de filamentos intermedios, las células epidérmicas se tornan frágiles y proclives a romperse ante un esfuerzo mecánico, lo cual deriva en la formación de ampollas en la piel.

Dada la heterogeneidad de las queratinas epidérmicas y el efecto de esta heterogeneidad en el aspecto de la piel, no fue de asombrarse que también se encontrase que los polimorfismos estuvieran asociados con las proteínas de la queratina capilar. En un ejemplo, se identificaron dos lugares polimórficos en el gen hHa2 cuticular y se demostró que se heredaban como rasgos mendelianos (Winter y colaboradores, 1997 supra). La heterogeneidad en las proteínas de la queratina puede tener efectos directos sobre la resistencia a la tracción, flexibilidad y dinámica de los filamentos intermedios, lo cual significa que aun una sutil heterogeneidad en las proteínas de los filamentos intermedios puede influir sobre las características externas del cabello o de la piel.

El uso de materiales proteicos en la formulación de productos modernos para el cuidado del cabello para ofrecer brillo, fuerza, suavidad, tersura y buenas propiedades para el peinado es ampliamente conocido. La queratina, en particular, se utiliza con frecuencia. Como la queratina natural siempre está entrecruzada y las fibras entrecruzadas son insolubles (es decir, insolubles en agua), la queratina primero se solubiliza usando una variedad de métodos químicos y enzimáticos que hidrolizan la proteína (documento de patente de los Estados Unidos No. 4.439.417; documento de patente de los Estados Unidos No. 4.542.014; documento de patente de los Estados Unidos No. 5.612.024; documento de patente de los Estados Unidos No. 4.465.664; documento de patente de los Estados Unidos No. 4.906.460; documento de patente de los Estados Unidos No. 3.842.843; documento de patente de los Estados Unidos No. 4.495.173). Los materiales de partida pueden incluir, por ejemplo, pelo animal, pelo humano, plumas, garras, cuernos, pezuñas y escamas, usándose entre ellos preferiblemente la lana y las plumas.

Dado que las proteínas de la queratina provienen de una variedad de recursos naturales, no reflejan ninguna composición de queratina capilar deseable en particular y como la proteína de la queratina se hidroliza en sus aminoácidos constituyentes, no mantiene la estructura de la proteína de la queratina, sino que es meramente una simple mezcla de aminoácidos que se añade a la composición de tratamiento capilar. Un mejor producto para el tratamiento capilar evitaría el uso de queratinas entrecruzadas y, preferiblemente, proporcionarían incluso un mecanismo para diseñar la composición del producto a la medida de las necesidades o deseos de los individuos en particular.

Sumario de la invención

La presente invención pertenece a un tratamiento capilar o composición de belleza que incluye una proteína con filamentos intermedios no naturales, formulada como una composición para el tratamiento capilar. Las proteínas de los filamentos intermedios preferiblemente son de origen humano y no se han entrecruzado previamente. La proteína, lo más preferiblemente, se selecciona del grupo que consiste en queratinas de pelo humano. La proteína de la queratina puede incluir al menos una parte adicional de la secuencia aminoácidos no naturales, seleccionándose preferiblemente la parte de la secuencia de aminoácidos del grupo que consiste en una secuencia hidrofóbica, una secuencia hidrofílica y una secuencia rica en cisteína.

En las realizaciones preferidas de la presente invención, la composición para el tratamiento capilar se formula para reproducir uno o más aspectos de las proteínas de la queratina hallados en el cabello de un individuo seleccionado. En particular, un aspecto de la presente invención comprende el reconocimiento de que los diferentes individuos pueden producir diferentes variantes alélicas o poblaciones de variantes alélicas de proteínas de la queratina en su piel. Tal como se usa en la presente, la expresión "variantes alélicas" se refiere a diferentes versiones de una proteína o a un gen que codifica a esa proteína, presente en la población humana. Las variantes de proteínas pueden diferir entre sí por la adición, sustitución o eliminación de uno o más aminoácidos. Normalmente, dichas proteínas se producen a partir de variantes genéticas que difieren entre sí por la adición, sustitución o eliminación de uno o más nucleótidos. De un modo alternativo o adicional, dichas variantes proteicas se pueden producir por empalme alternativo u otro tipo de procesamiento de las secuencias genéticas.

De acuerdo con una realización particularmente preferida de la presente invención, se selecciona un individuo en particular basándose en que tiene características atractivas en su cabello. Se identifica la composición alélica de una o más proteínas de la queratina en el cabello de esa persona y esa composición se reproduce en una composición para el tratamiento capilar. Los expertos con los conocimientos comunes en la técnica reconocerán que el concepto de cabello "atractivo" puede variar de acuerdo con las preferencias del fabricante de la composición para el tratamiento capilar o de la persona en quien vaya a usarse la composición para el tratamiento capilar. Por ejemplo, en ciertos contextos, el cabello es "atractivo" si cuenta con atributos característicos del cabello de un individuo famoso. En otros contextos, el cabello puede ser "atractivo" si tiene ciertas características deseables. Algunos ejemplos no limitativos son la suavidad, el lustre, la resistencia a la tracción, la flexibilidad, el cuerpo, la tersura. Otros ejemplos no limitativos incluyen características capilares tales como el color, su condición de lacio y de rizado. En otro contexto más todavía, el cabello es "atractivo" si tiene atributos similares o idénticos a los de la persona a quien se aplicará la composición para el tratamiento capilar de modo que puedan minimizarse o evitarse las reacciones inmunes negativas.

Descripción detallada de las realizaciones preferidas Definiciones

Un aspecto de la invención es una composición para el tratamiento capilar que contiene una forma no natural de una proteína de queratina capilar. Las siguientes definiciones aclaran el alcance de este y otros aspectos de la invención:

Los términos "fórmula", "fórmula para el tratamiento capilar" o "composición para el tratamiento capilar", tal como se usan en la presente, incluyen cualquier tipo de producto que se aplique de cualquier manera, directamente a la persona.

Las expresiones "proteína de queratina capilar" o "proteína de la queratina" se refieren a aquellas macromoléculas que constituyen los filamentos intermedios de las células capilares. Las dos clases principales de proteínas de la queratina son las proteínas de la queratina denominadas queratinas duras -que comprenden, por ejemplo, el cabello, las uñas y la lengua- y las denominadas proteínas blandas de la queratina -que comprenden proteínas de la queratina epiteliales.

"No naturales", cuando se aplica a las proteínas de la queratina de la presente invención se refiere a los polipéptidos que no se han entrecruzado previamente. Dichas proteínas de la queratina se pueden producir por métodos que son bien conocidos para los expertos en la técnica en (y que se describen en mayor detalle en la presente), por ejemplo, células huésped bacterianas o eucarióticas.

"No naturales", cuando se aplica a las secuencias de nucleótidos que codifican las proteínas de la queratina de la presente invención se refiere a una parte del ácido nucleico genómico, ADNc o ácido nucleico sintético que, en virtud de su origen o manipulación: (i) no está asociada con la totalidad de un ácido nucleico con el que está asociada en la naturaleza; (ii) está unida a un ácido nucleico u otra parte química distinta de aquélla a la que está unida en la naturaleza; o (iii) no está presente en la naturaleza.

Una característica significativa de las presentes composiciones para el tratamiento capilar es que las proteínas de la queratina no naturales de la invención no se han entrecruzado previamente. "No entrecruzadas previamente" quiere decir que las proteínas de las composiciones para el tratamiento capilar:

a. no se han entrecruzado dentro de un organismo para formar filamentos intermedios.

b. no se han entrecruzado in vitro para formar filamentos intermedios. Habrá de destacarse que las proteínas de la queratina tienen la aptitud de auto ensamblarse en filamentos intermedios in vitro.

El término "soluble" se refiere a la solubilidad del precursor en soluciones acuosas, tales como el agua.

Tal como se utiliza en la presente, la expresión "variante alélica" se refiere a diferentes versiones de una proteína, o a un gen que codifica esa proteína, presente en la población humana. Las variantes de proteínas pueden diferir entre sí por la adición, sustitución o eliminación de uno o más aminoácidos. Normalmente, dichas proteínas se producen a partir de variantes genéticas que difieren unas de las otras por la adición, sustitución o eliminación de uno o más nucleótidos. De un modo alternativo o adicional, dichas variantes de proteínas se pueden producir por empalme alternativo u otro tipo de procesamiento de las secuencias genéticas.

El término "recombinante" tal como se utiliza en la presente se refiere a una proteína preparada por expresión en un sistema de células hospedadoras en el que esa proteína no se expresa en la naturaleza y en el que la proteína no se entrecruza. En la técnica se conocen varios métodos para producir proteínas recombinantes, lo cual comprende, por ejemplo, la expresión de un gen particular en una célula hospedadora por la introducción de secuencias de ADN exógenas en la célula o la activación del gen endógeno (documento de patente de los Estados Unidos No. 5.641.670).

De acuerdo con la presente invención, al referirse a substituciones de aminoácidos, una secuencia de aminoácidos es "funcionalmente equivalente" en comparación con las secuencias de proteínas conocidas si la secuencia de aminoácidos contiene uno o más residuos de aminoácidos dentro de la secuencia que puedan ser sustituidos por otro aminoácido de propiedades similares que actúe de una manera funcionalmente equivalente al aminoácido original. Los sustitutos para un aminoácido dentro de la secuencia pueden seleccionarse, preferiblemente, entre otros miembros de la clase a la que pertenece el aminoácido. Los aminoácidos no polares (hidrofóbicos) incluyen alanina, leucina, isoleucina, valina, glicina, prolina, fenilalanina, triptofano y metionina. Los aminoácidos polares (hidrofílicos), neutros incluyen serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina y glutamina. Los aminoácidos con carga positiva (básicos) incluyen arginina, lisina e histidina. Los aminoácidos con carga negativa (ácidos) incluyen ácido aspártico y ácido glutámico.

Polipéptidos y proteínas de la queratina

Tal como se comentara anteriormente, la presente invención provee composiciones para el tratamiento capilar formuladas a partir de proteínas de la queratina no naturales. Estas proteínas pueden derivarse de mamíferos tales como vacas, ovejas o cerdos. Preferiblemente, no obstante, las composiciones de la invención utilizan proteínas de la queratina humana. Las proteínas particularmente preferidas usadas en la invención son las proteínas "duras" de la queratina expresadas en el pelo humano.

Las queratinas representan los principales componentes estructurales del sistema de filamentos intermedios insolubles en agua en el cabello. Se han clonado los genes que codifican las queratinas del tipo I y II y se determinaron las secuencias de proteínas (Fink y colaboradores, Biochem. Biophys. Acta 1264:12-14, 1995; Rowers y colaboradores, Differentiation, V. 61, pp. 187-194, 1997; Winter y colaboradores, 1997 supra; Yu y colaboradores, supra). Al igual que con todas las proteínas de subunidad con filamentos intermedios, se encuentra una estructura secundaria común: un dominio alfa-helicoidal, altamente conservado, central, que consiste en cuatro segmentos de doble espiral y dominios no helicoidales terminales de diversas secuencias y longitudes que determinan la especificidad de la cadena de una queratina capilar individual. Las queratinas capilares por lo general varían en peso molecular de 40 a 62 kD. Existe un alto grado de conservación de aminoácidos en las queratinas capilares entre diversas especies (ratón, oveja y ser humano) (Yu y colaboradores, supra). La diferencia más significativa entre las queratinas capilares y otras queratinas es el contenido de residuo de cisteína, que promedia el 7,6% en la queratina del pelo humano en comparación con sólo el 2,9% en las queratinas epidérmicas. Esto refleja una mayor utilización de la unión de disulfuro en las queratinas capilares para producir una estructura más resistente, más duradera (Yu y colaboradores, supra).

Las proteínas de la queratina utilizadas en la presente invención se pueden preparar mediante cualquiera de una variedad de técnicas disponibles, pero es importante que las proteínas no pasen por una etapa de entrecruzamiento que deba revertirse para solubilizar las proteínas, tal como se comentara anteriormente. Es preferible evitar el entrecruzamiento de las proteínas durante la expresión y la purificación de la proteína de la queratina.

En algunas realizaciones preferidas de la invención, las proteínas se sintetizan usando los métodos disponibles de síntesis química. Por ejemplo, las proteínas de la queratina no naturales de la invención se pueden sintetizar usando un procedimiento sintético en estado sólido apropiado (Steward y Young, Solid Phase Peptide Synthesis). Freemantle, San Francisco, CA, 1968). Un método preferido es el procedimiento de Merrifield, (Merrifield, Recent Prog. Hormone Res., 23: 451, 1967).

De un modo alternativo, los genes que codifican las proteínas se pueden aislar y las proteínas se pueden preparar usando procedimientos recombinantes. Los "procedimientos recombinantes" se pueden definir como cualquier método de preparación de proteínas por expresión en células huésped en las que las proteínas de la queratina no están entrecruzadas. En la técnica se conoce ampliamente una variedad de métodos de producción de proteínas recombinantes que comprenden la expresión de un gen particular en la célula hospedadora mediante la introducción de secuencias de ADN exógenas en la célula o la activación del gen endógeno, (documento de patente de los Estados Unidos No. 5.641.670). Los "procedimientos recombinantes" también se pueden usar con referencia a los métodos de transcripción y traslación in vitro para preparar las proteínas de la queratina.

Los protocolos para el aislamiento de genes que codifican proteínas particulares por lo general comprenden aislar el ARN mensajero total de los tejidos de los vertebrados, tales como pelo humano, pelo animal, lana y plumas o de líneas celulares que probablemente expresen la proteína de interés. Las proteínas codificadas luego pueden expresarse en un sistema de expresión apropiado bien conocido en la técnica. Una ventaja particular de utilizar un sistema de expresión recombinante es que la subunidad de la proteína se expresa por separado de su proteína compañera con la que se heterodimeriza y por lo tanto, es menos probable que se entrecruce y pierda solubilidad.

Normalmente, el ARN total de un tejido o de las células en el cultivo se aisla usando los métodos convencionales. El posterior aislamiento de ARNm normalmente se logra por oligo (dT) cromatografía. El ARN mensajero se fracciona según el tamaño por electroforesis y las transcripciones de ARN se transfieren, por ejemplo, a nitrocelulosa, de acuerdo con los protocolos estándar (Sambrook, J. y colaboradores, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y.). Por ejemplo una sonda marcada generada por una reacción en cadena de la polimerasa (PCR, polymerase chain reaction) capaz de hibridarse con secuencias de nucleótidos de queratina humana (Rogers y colaboradores, Erperimental Cell Research, 220: 357-362, 1995) puede servir para identificar transcripciones de ARN complementarias a al menos una parte del gen deseado de la proteína de la queratina. Si el análisis Northern indica que el ARN aislado del tejido del cuero cabelludo humano con una sonda marcada contiene una variante alélica de queratina, entonces las células del cuero cabelludo humano se utilizan para la preparación de un banco de ADNc que se someterá a una detección sistemática en busca del gen deseado.

El análisis Northern se puede usar para confirmar la presencia de fragmentos de ARNm en el banco, que se hibridan a una sonda que corresponde a todo o parte del gen relevante. El análisis Northern revela la presencia y el tamaño de la transcripción. Esto permite que uno determine si un clon dado de ADNc tiene la longitud suficiente para abarcar a la transcripción completa o si es necesario obtener otros clones para generar un ADNc de extensión completa, es decir, si la longitud del clon del ADNc es menor que la longitud de las transcripciones de ARN según se observa por análisis Northern. Si el ADNc no tiene la longitud suficiente, es necesario llevar a cabo varias etapas, tales como: (i) volver a realizar una detección sistemática del mismo banco con las sondas más largas disponibles para identificar un ADNc más largo; (ii) realizar una detección sistemática de un banco de ADNc diferente con la sonda más larga; y (iii) preparar un banco de ADNc extendido con cebadores, usando un cebador de nucleótidos correspondiente a una región cercana a, pero no sita en, la región disponible más 5'. Esta secuencia de nucleótidos se usa para cebar la transcripción inversa. El banco extendido con cebadores luego se somete a detección sistemática con la sonda que corresponde a las secuencias disponibles ubicadas en 5' con respecto al cebador (véase, por ejemplo, Rupp y colaboradores, Neuron, 6: 811, 1991).

El clon preferido utilizado para la expresión tiene una secuencia de codificación completa, es decir, una que comienza con metionina, termina con un codón de detención y preferiblemente tiene otro codón de detención dentro del cuadro 5' con respecto a la cebadora metionina. También es conveniente tener un ADNc que incluya todas las secuencias si n traducir 5' y 3'.

Por supuesto, como sabrán apreciarlo los expertos con los conocimientos comunes en la técnica, el procedimiento de detección sistemática que se describiera con anterioridad es sólo un abordaje para el aislamiento de genes para permitir la expresión recombinante de proteínas. Para nombrar una modificación aceptable de la metodología, puede emplearse una sonda de oligonucleótidos en lugar de una sonda generada por PCR para realizar la detección sistemática del banco. Una sonda de oligodesoxinucleótidos por lo general tiene una secuencia un tanto más larga que la que se usa para los cebadores de PCR. Se prefiere una secuencia más larga para la sonda y es importante minimizar la degeneración del codón. Un protocolo representativo para la preparación de una sonda de oligonucleótidos para realizar la detección sistemática de un banco de ADNc se describe en Sambrook y colaboradores, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Nueva York 1939. En general la sonda está marcada, por ejemplo con ^{32}P y se usa para realizar la detección sistémica de clones de un banco de ADNc o genómico.

Como otra modificación, no es necesario realizar la detección sistemática del banco por hibridización en absoluto, sino que puede prepararse como un banco de expresión que se puede someter a detección sistemática usando técnicas de inmunoensayo convencionales, tales como las que se describen en Harlow y Lane, D., Antibodies, Cold Spring Harbor Press, Nueva York, 1988. Los anticuerpos preparados usando proteína purificada como un inmunógeno preferiblemente primero se someten a prueba para determinar la reactividad cruzada con el homólogo de la proteína proveniente de otras especies.

En otra versión, un banco de ADNc se somete a una detección sistemática usando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR, polymerase chain reaction). La detección por PCR permite el uso de pequeñas muestras para el análisis. Esta técnica depende de la aptitud de amplificar pequeñas cantidades de ARNm o ADN de cabello usando PCR y se basa en los procedimientos que se explican en los protocolos estándar. Véase, por ejemplo, Sambrook y colaboradores, supra. Por ejemplo, se extrae una muestra que comprenda tan pocos como un mil a tantos como cien mil ARNm específicos para liberar el ARN total. El ARNm se convierte en ADNc usando transcriptasa inversa (véase el Ejemplo 2). El ADNc creado se amplifica en la misma mezcla de reacción usando PCR. Los cebadores para la reacción de la PCR preferiblemente se diseñan para hibridarse en extremos opuestos de la secuencia del ARN mensajero relevante, amplificando de esta manera el segmento de ARNm completo.

Para obtener la máxima especificidad y rendimiento en la PCR uno debe ajustar una variedad de parámetros de reacción ampliamente conocidos para los expertos con los conocimientos comunes en la técnica. (Véase por ejemplo McPherson, "PCR: A Practical Approach", Oxford University Press. Nueva York. 1991). Los cebadores deben tener un contenido de 40-60% G + C, ningún tramo largo de ninguna base y ningún inter-cebador complementariamente más largo que dos bases, especialmente en los extremos 3'. Dadas estas condiciones, las siguientes etapas pueden aumentar la especificidad de la PCR: la reacción puede llevarse a cabo con concentraciones de cebador, molde y dNTP ubicadas en el medio del intervalo recomendado, usando 2,5 unidades de polimerasa de ADN Taq, usando una temperatura de hibridación por lo menos 10 grados centígrados inferior a la óptima. Si se observan productos no específicos, uno puede optimizar la temperatura de hibridación y ajustar las concentraciones de cebador y dNTP.

Los métodos recombinantes para producir las proteínas de la queratina humanas, no naturales, particularmente preferidas de la invención están fácilmente disponibles. Un método comprende construir un banco de ADNc humano y realizar una detección sistemática del mismo en busca de ADNc de la queratina. Los clones resultantes se pueden introducir en un sistema de vectores de expresión y proteínas se pueden expresar y purificar usando métodos estandarizados. Véase, por ejemplo, Ausubel y colaboradores, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, Nueva York, V. 1&2, 1996 y Sambrook y colaboradores, supra. Las proteínas recombinantes producidas de esta manera se pueden caracterizar, por ejemplo, por el análisis de electroforesis con gel de poliacrilamida (PAGE polyacrylamide gel electrophoresis) y secuenciamiento del término N.

En una realización preferida en particular de la presente invención, un banco de ADNc humano, ya fuera preparado a partir de un individuo seleccionado, conforme se describe más adelante, o comprado a un proveedor comercial (por ejemplo, Clontech, Palo Alto, CA) se somete a una detección sistemática para identificar ADNc que codifiquen la queratina humana. Los clones positivos se someten a secuenciamiento y se pueden caracterizar por digestión de la endonucleasa de restricción para aislar y volver a realizar la detección sistemática del banco de ADNc original. Las variaciones en la secuencia entre los ADNc identificados indican la presencia de variantes alélicas de la proteína (véase más adelante).

Sin embargo, si el gen de interés se aisla, las proteínas se pueden expresar en cualquier sistema de expresión conveniente, lo cual incluye sistemas in vivo o in vitro. Los sistemas de expresión in vivo bien conocidos utilizan células procarióticas y/o eucarióticas (es decir, de levaduras, humanas). Véase, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology, pp. 16.0.1-16.31.9, supra; véase además, Gene Expression Technology, Volumen 185, Methods in Enzymology, (ed. D.V. Goiddel), Academic Press Inc., 1990.

Se ha construido una gran cantidad de vectores que contienen promotores poderosos que generan grandes cantidades de ARNm complementarios a las secuencias clonadas de ADN introducidas en el vector. Por ejemplo y en forma no limitativa, la expresión de la secuencia de nucleótidos eucarióticos en el E. coli puede lograrse usando los promotores lac, trp, lamda y recA. Véase por ejemplo, "Expression in Escherichia coli", Sección II pp. 11-195, V. 135, Methods in Enzymology, supra; véase también Hawley, D.K., y McClure, W.R., "Compilation and Analysis of Escherichia coli promoter DNA sequences", Nucl. Acids Res., 11:4391, 1933. La expresión de cualquier proteína de la queratina deseada (incluso, por ejemplo, una queratina de pelo humano) en un sistema de expresión bacteriana recombinante se puede lograr fácilmente.

Las células de las levaduras adecuadas para la expresión de las proteínas de la invención incluyen las muchas cepas de Saccharomyces cerevisiae así como también, Pichia pastoris. Véase "Heterologous Gene Expression in Yeast", Sección IV, pp. 231-432, V. 185, Methods in Enzymology, supra. Además, un gran número de sistemas hospedadores de vector-mamífero conocidos en la técnica se puede usar toda vez que la proteína de la queratina producida no esté entrecruzada en dichas células. Véase, Sambrook y colaboradores, Volumen III, supra y "Expression of Heterologous Genes in Mammalian Cells", Sección V, pp. 435-596. V. 185. Methodos in Enzymology, supra.

Los sistemas de expresión adecuados incluyen aquéllos que expresaron ADN en forma transitoria o estable y aquéllos que comprenden los vectores de expresión viral derivados del virus 40 del simio (SV40), retrovirus y baculovirus. Estos vectores normalmente proveen un promotor y otros elementos tales como potenciadores, secuencias aceptantes y/o donantes de empalmes y señales de poliadenilación. Cualquiera fuere el sistema de expresión que se elija, es importante que ninguna de las células hospedadoras usadas produzcan proteínas de la queratina entrecruzadas. Los vectores posibles incluyen, entre otros, cósmidos, plásmidos o virus modificados, pero el sistema de vectores debe ser compatible con la célula hospedadora usada. Los vectores virales incluyen, entre otros, el virus vaccinia o los derivados lambda. Los plásmidos incluyen, entre otros, los derivados de plásmidos pBR322, pUC o Bluescript® (Strata-gene). Las moléculas recombinantes se pueden introducir en las células hospedadoras, por ejemplo, mediante transformación, transfección, infección, eletroporación, lipofección, etc. (Véase Current Protocols in Molecular Biology, pp. 9.0.1-9.17.3, supra) Generalmente, la introducción de moléculas de proteínas en el hospedador se logra usando un vector que contenga ADN de proteína bajo el control de regiones reguladoras del ADN que actúan en la célula hospedadora. La expresión puede lograrse de un modo alternativo, por activación del gen de la queratina endógena. (Véase, por ejemplo, el documento de patente de los Estados Unidos No. 5.641.670)

Se encuentra comercialmente disponible una amplia selección de sistemas de expresión y abarca muchos vectores y células hospedadoras posibles. Ciertos sistemas de expresión preferidos ofrecen la sobreproducción de la proteína recombinante de la queratina. Véanse por ejemplo, los métodos de sobreproducción que se describen en el documento de patente de los Estados Unidos 4.820.642 (Edman y colaboradores, 11 de abril de 1989). Véase también, Current Protocols in Molecular Biology, pp. 16.0.1-16.21.9, supra.

Una vez que se expresan las proteínas o polipéptidos recombinantes de la presente invención, se pueden aislar y purificar por métodos estándar, que incluyen cromatografía (por ejemplo, intercambio de iones, afinidad y cromatografía con columna de exclusión molecular), centrifugación, solubilidad diferencial o por cualquier otra técnica estándar para la purificación de proteínas. Véase, por ejemplo, Scopes, "Protein Purification; Principles and Practice", 2ª edición, Springer-Verlag, Nueva York, 1987. Para la cromatografía de inmunoafinidad en particular, se puede aislar una proteína de la queratina de la invención codificada por secuencias de nucleótidos humanas uniéndola a una columna de afinidad que comprenda anticuerpos que se generen contra esa proteína y que se unieron a un soporte fijo. De un modo alternativo, se pueden colocar etiquetas de afinidad -tales como la secuencia con recubrimiento de influenza y glutation-S-transferasa- a las proteínas de la invención para permitir la fácil purificación por pasaje sobre una columna de afinidad apropiada.

Fragmentos

Las composiciones para el tratamiento capilar de la presente invención pueden utilizar proteínas de extensión completa o, de un modo alternativo, pueden emplear fragmentos de proteínas. Los fragmentos se pueden generar, por ejemplo, a través de la expresión de secuencias codificadoras sólo parciales o se pueden generar directamente desde la proteína intacta.

Las proteínas se segmentan específicamente por enzimas proteolíticas, que incluyen, entre otras tripsina, quimotripsina o pepsina. Cada una de estas enzimas es específica para el tipo de unión peptídica que ataca. La tripsina cataliza la hidrólisis de las uniones peptídicas cuyo grupo carbonilo proviene de un aminoácido básico, normalmente, arginina o lisina. La pepsina y quimotripsina catalizan la hidrólisis de las uniones peptídicas provenientes de los aminoácidos aromáticos, en particular, triptofano, tirosina y fenilalanina. Se generan grupos alternados de fragmentos de polipéptidos segmentados evitando la segmentación en un sitio que sea susceptible a una enzima proteolítica. Por ejemplo, la reacción de los grupos -amino de la lisina con etiltrifluorotioacetato en una solución suavemente básica produce un residuo de aminoácido bloqueado cuya unión peptídica adyacente ya no es susceptible a hidrólisis por tripsina. Goldberger y colaboradores, Biochem., 1:401, 1962. El tratamiento de dicho polipéptido con tripsina se segmenta así solamente en los residuos de arginilo.

Una modificación preferida (véase más abajo) de las proteínas de la queratina (o genes que codifican la proteína de la queratina) de acuerdo con la presente invención consiste, por lo tanto, en hacer que las proteínas sean susceptibles a hidrólisis catalizada por enzimas proteolíticas. Por ejemplo, la alquilación de residuos de cisteína con &-halo etilaminas produce uniones peptídicas que son hidrolizadas por la tripsina. Lindley, Nature, 178: 647, 1956. Además, se pueden usar reactivos químicos que segmentan las cadenas de polipéptidos en los residuos específicos. Withcop, Adv. Proteína Chem. 16: 221, 1961. Por ejemplo, el bromuro de cianógeno segmenta los polipéptidos en los residuos de metionina. Gross y colaboradores, J. Am Chem Soc., 83:1510, 1961. De esta manera, al tratar las proteínas de la invención con diversas combinaciones de modificadores, enzimas proteolíticas y/o reactivos químicos, se generan numerosos péptidos discretos que se superponen, de diversos tamaños. Estos fragmentos peptídicos se pueden aislar y purificar a partir de dichos materiales digeridos por métodos cromatográficos.

Modificaciones

En ciertas realizaciones preferidas de la presente invención, las proteínas de la queratina no naturales utilizadas en las composiciones de la invención para el tratamiento capilar incluyen una parte destinada a mejorar o aumentar la función de la proteína. Por ejemplo, las proteínas de la presente invención se pueden unir a una parte que: (i) aumente las capacidades de penetración capilar de la proteína; (ii) aumente la solubilidad en agua o en aceite de la proteína; y/o (iii) aumente la aptitud de la proteína de actuar como un tensioactivo. Estas partes adicionales pueden estar presentes en la proteína natural (es decir, nativa). Sin embargo, si están presentes en la proteína nativa, las partes adicionales: (i) están unidas a las proteínas actuales no naturales de la queratina de la invención en una posición diferente de la que ocupan en la proteína nativa; y/o (ii) están presentes en las proteínas no naturales de la queratina de la invención en cantidades que difieren de aquéllas que ocupan en la proteína nativa.

Estas partes adicionales pueden incluir una variedad de sustancias y compuestos químicos, los cuales incluyen, entre otros, liposomas, ácidos grasos, carbohidratos, lípidos, proteínas y similares. Las partes más preferidas son las secuencias peptídicas. Las secuencias adicionales se pueden encontrar en cualquier posición en la cadena proteica. Preferiblemente, se sitúan en el extremo del término amino de la proteína, el extremo del término carboxilo de la proteína o tanto en los términos amino como carboxilo.

Pueden introducirse partes adicionales en la proteína por unión de una secuencia de nucleótidos que codifica la parte con una secuencia de nucleótidos que codifica la proteína, lo cual resulta en la expresión de proteínas de fusión. Dichas proteínas de fusión contienen la proteína de la queratina con una parte específica y conveniente de aminoácidos, que está unida, por ejemplo, para facilitar la expresión o purificación de la proteína de la queratina.

A modo de ejemplo, pueden unirse secuencias adicionales de nucleótidos que codifican las partes con secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en secuencias de aminoácidos hidrofílicos, secuencias de aminoácidos hidrofóbicos, secuencias de aminoácidos ricos en cisteína y combinaciones de las secuencias anteriores a la queratina que codifica secuencias de nucleótidos. Las secuencias adicionales de nucleótidos pueden unirse de tal manera que la proteína de la queratina de la invención, cuando se exprese en un sistema de expresión adecuado, contenga las partes de aminoácido adicionales ya fuera: (i) internamente; (ii) en el término amino, el término carboxilo y/o tanto en el término amino como en el término carboxilo de la proteína.

En particular, las secuencias adicionales de nucleótidos preferidas que introducen aminoácidos del término amino pueden tener la fórmula (I):

(I)ATG-(NNN)_{x}-;

donde A = ácido adenílico, T = ácido timidílico y G = ácido guanílico, todos unidos entre sí por uniones de fosfoéster;

donde x = 1 a 20;

donde N = una base de nucleótidos, como por ejemplo, adenina, timina, citosina, guanina, uracilo;

donde (NNN)_{x} = una pluralidad de codones.

El término "N", también puede incluir bases modificadas tales como, entre otras, 4-acetil citidina, 5-(carboxihidro-
ximetil) uridina, 2'-O-metilcitidina, dihidrouridina, los metilpseudouridinas, inosina, 1-metil adenosina, 1-metil guanosina, N6-metil adenosina y otras.

Las secuencias de nucleótidos de esta fórmula pueden unirse a la secuencia de nucleótidos de una proteína de la queratina de la invención de manera que el extremo del término amino de la proteína codificada contenga una parte hidrofóbica de la secuencia de aminoácidos que tenga aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en, por ejemplo, fenilalanina (codificada por los tripletes UUU y UUC), triptofano (codificado por el triplete UGG), prolina (codificada por los tripletes CCU, CCC, CCA y CCG), glicina (codificada por los tripletes GGU, GGC, GGA y GGG), valina (codificada por los tripletes GUU, GUC, GUA y GUG) y combinaciones de los aminoácidos anteriores. De la misma manera, las secuencias de nucleótidos adicionales que codifican para los aminoácidos que deben unirse en el término amino también pueden codificar partes hidrofílicas de secuencias de aminoácidos que tengan aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en, por ejemplo, ácido aspártico (codificado por los tripletes GAU y GAC), ácido glutámico (codificado por los tripletes GAA y GAG) y combinaciones de los aminoácidos anteriores. Además, las secuencias de nucleótidos pueden incluir una parte de secuencia de aminoácidos rica en lisina (codificada por los tripletes AAA y AAG). La expresión "rica en lisina" se refiere a las secuencias de aminoácidos que contienen por lo menos un 30 por ciento de residuos de lisina.

Las secuencias de nucleótidos adicionales o alternativas incorporadas pueden codificar partes de aminoácidos que puedan unirse en el término carboxilo de la proteína de la queratina. En este caso, los nucleótidos incorporados tienen la fórmula (II):

(II)-(NNN)_{x} \ TGA;

donde A = ácido adenílico, T = ácido timidílico y G = ácido guanílico, todos unidos entre sí por enlaces fosfodiéster;

donde x = 1 a 20;

donde N = una base de nucleótidos, tal como, por ejemplo, adenina, timina, citosina, guanina, uracilo;

donde (NNN)_{x} = una pluralidad de codones.

El término "N", también puede incluir bases modificadas, tales como -entre otras- 4-acetilcitidina, 5-(carboxihidro-
ximetil)uridina, 2'-O-metilcitidina, dihidrouridina, las metilpseudouridinas, inosina, 1-metilo adenosina, 1-metilo guanosina, N6-metilo adenosina y otras.

Los codones pueden codificar una parte hidrofóbica de la secuencia de aminoácidos que tenga aminoácidos seleccionados del grupo que consiste en, por ejemplo, fenilalanina, triptofano, prolina, glicina, valina y combinaciones de los anteriores aminoácidos. Del mismo modo las partes hidrofílicas y ricas en lisina de aminoácidos se pueden añadir al término carboxilo de la proteína de la invención, usando nucleótidos que codifiquen secuencias de aminoácidos tales como las que se describieran con anterioridad. Las secuencias hidrofóbicas de aminoácidos tienden a aumentar la solubilidad lipídica de la proteína de la invención. Los aminoácidos hidrofílicos sirven para aumentar la solubilidad en agua de la proteína. Las secuencias de aminoácidos ricas en cisteína aumentan el entrecruzamiento de la proteína de la queratina.

El posicionamiento de las partes de la secuencia tanto en el término amino como en el término carboxilo de las proteínas de la invención puede aumentar las propiedades anfipáticas de la proteína de la queratina. "Anfipáticas" se refiere a una molécula que tiene tanto grupos hidrofílicos como hidrofóbicos. Las moléculas anfipáticas normalmente son buenas emulsionantes (es decir, pueden dispersar un líquido en un segundo líquido inmiscible) y tensioactivas (es decir, pueden reducir la tensión superficial de los líquidos o reducir la tensión interfacial entre dos líquidos o un líquido y un sólido).

También pueden introducirse partes adicionales en las proteínas de la invención conjugando las partes con la proteína expresada de la queratina, mediante el uso de varias moléculas enlazadoras bien caracterizadas. Los expertos con los conocimientos comunes en la técnica reconocerán que puede usarse una gran variedad de posibles enlazadores con las proteínas de la invención. Véase, por ejemplo, Contributions to Microbiology and Immunology, J.M. Cruse y R.E. Lewis, Jr (eds). Carger Press, Nueva York, (1989). La conjugación de las proteínas de la invención con otra parte (por ejemplo secuencias de aminoácidos hidrofílicas) se puede lograr mediante cualquier reacción química que una las dos moléculas, toda vez que ambas moléculas retengan su respectiva actividad. Esta unión puede incluir muchos mecanismos químicos, por ejemplo, unión covalente, unión por afinidad, intercalación, unión coordinada y formación de complejos.

No obstante, la unión preferida es la unión covalente. La unión covalente se puede lograr ya sea por condensación directa de las cadenas laterales existentes o por la incorporación de moléculas puente externas. Muchos agentes de enlace bivalentes o polivalentes resultan de utilidad en el acoplamiento de moléculas de proteínas a otras moléculas. Por ejemplo, los agentes de acoplamiento representativos pueden incluir compuestos orgánicos, tales como tioésteres, carbodiimidas, ésteres de succinimida, diisocianatos, glutaraldehídos, diazobencenos y hexametilen-diaminas. Este listado de las diversas clases de agentes de acoplamiento conocidos en la técnica no pretende ser exhaustivo, sino que en cambio, es ejemplar de los agentes de acoplamiento más comunes. (Véase Killen y colaboradores J. Immunol, 133: 1335, l984; Jansen y colaboradores, Immuno Rev. 62: 185, 1982; y Vitetta y colaboradores, supra).

Los enlazadores preferidos para acoplar una parte a las proteínas de la invención se describen en la literatura. Véase, por ejemplo, Ramakrishnan y colaboradores, Cancer Res. 44: 201, 1984 que describen el uso del MBS (éster de M-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida). Véase también, Umemoto y colaboradores documento de patente de los Estados Unidos 5.030.719, que describe el uso de un derivado de acetil-hidrazida halogenado acoplado a un anticuerpo por medio de un enlazador oligopeptídico. Los enlazadores particularmente preferidos incluyen: (i) EDC hidrocloruro de (1-etil-3-(3-dimetilamino-propil) (véase el Ejemplo 4); (ii) SMPT (4succinimidiloxicarbonil-alfa-metil-alfa-(2-piridil-ditio)-tolueno (Pierce Chem. Co., Cat. # 21558G); (iii) SPDP (succinimidil-6 [3-(2-piridilditio) propionamido] hexanoato (Pierce Chem. Co., Cat # 21651G); (iv) Sulfo-LC-SPDP (sulfosuccinimidilo 6 [3-(2-piridilditio)propianamida] hexanoato (Pierce Chem. Co. Cat. # 21650G); y (v) sulfo-NHS (N-hidroxi-sulfo-succinimida: Pierce Chem. Co., Cat. # 24510) conjugado con EDC.

Los enlazadores que se describieron con anterioridad contienen componentes que tienen atributos diferentes, conllevando así a moléculas con diferentes propiedades fisio-químicas. Por ejemplo, los sulfo-NHS ésteres de carboxilatos de alquilo son más estables que los sulfo-NHS ésteres de carboxilatos aromáticos. Los enlazadores que contienen NHS-éster son menos solubles que los sulfo-NHS ésteres. Además, el enlazador SMPT contiene una unión disulfuro estéricamente impedida y puede formar moléculas con mayor estabilidad. Las uniones de disulfuro por lo general son menos estables que otras uniones porque la unión de disulfuro se segmenta in vivo, lo cual hace que haya menos conjugado disponible. Sulfo-NHS, en particular, puede mejorar la estabilidad de los acoplamientos de carbodiimida. Los acoplamientos de carbodimida (tales como EDC) cuando se usan en forma conjunta con sulfo-NHS, forman ésteres que son más resistentes a la hidrólisis que la reacción de acoplamiento de carbodiimida sola.

La modificación de las proteínas de la queratina para usar en la presente invención se puede lograr explotando la actividad de procesamiento in vivo de un hospedador o por medios químicos in vitro, por ejemplo, por fosforilación, glicosilación, entrecruzamiento, acilación, segmentación proteolítica, unión a una molécula de anticuerpos, molécula de la membrana u otro ligando (Ferguson y colaboradores, Ann. Rev. Biochenr. 57: 235, 1988).

Además, las secuencias de ácido nucleico que codifican las proteínas de la invención pueden someterse a técnicas de ingeniería, para modificar el procesamiento o la expresión. Por ejemplo y no a modo de limitación, la(s) secuencia(s)
de nucleótidos que codifica(n) las proteínas no naturales de la queratina se pueden combinar con una secuencia promotora y/o un sitio de unión de ribosoma usando métodos bien caracterizados y facilitando así la cosecha o biodisponibilidad.

De un modo adicional, una secuencia de nucleótidos dada se puede mutar in vitro o in vivo, para crear variaciones en las regiones codificadoras y/o para formar nuevos sitios de restricción de endonucleasa o destruir los preexistentes, para facilitar una nueva modificación in vitro. Puede usarse cualquier técnica para la mutagénesis conocida en la técnica, como por ejemplo, entre otras la mutagénesis dirigida al sitio in vitro (Hutchinson y colaboradores, J. Biol. Chem. 253: 6551, 1978), el uso de enlazadores TAB© (Pharmacia), mutagénesis dirigida por PCR y similares.

Ciertas modificaciones preferidas a las proteínas de la queratina utilizadas de acuerdo con la presente invención incluyen los cambios que reducen la antigenicidad probable de las proteínas. Como se notara anteriormente, el mero hecho de que la presente invención utilice proteínas solubles ya reduce la posibilidad de que estas proteínas induzcan una respuesta inmune; de un modo alternativo o adicional, puede analizarse la secuencia de aminoácidos de la(s) proteína(s) no natural(es) de la queratina que se pretende usar en las composiciones para el tratamiento capilar para identificar porciones de la molécula que puedan estar asociadas con una menor inmunogenicidad.

Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos puede someterse a análisis por computadora para identificar epitopos superficiales que presentan gráficos generados por computadora del índice antigénico, una hélice anfofílica, una lámina anfofílica, hidrofilicidad y similares.

Variantes alélicas

Tal como lo apreciarán los expertos con los conocimientos comunes en la técnica, pueden existir múltiples versiones o variantes alélicas, de las proteínas dentro de las poblaciones. Dichas variantes alélicas difieren entre sí en la sustitución, adición o eliminación de uno o más aminoácidos. A menudo, estas diferencias en la secuencia de la proteína reflejan las diferencias en la secuencia genómica de los alelos genéticos que codifican las proteínas. En otros casos, la misma secuencia genómica codifica más de una proteína de variante alélica por las diferencias en los empalmes de ARN, edición de ARN, otros procesamientos del ARN o eventos de traslación o post-traslación. Por ejemplo, la Ha3 humana tiene dos isoformas, Ha3-I y Ha3-II (Ropers y colaboradores, Mot. Biol. Rep. 20: 155-161, 1995).

Un aspecto de la presente invención es el reconocimiento de que los individuos que pertenecen a una población expresarán diferentes colecciones de variantes alélicas de la proteína de la queratina en su cabello. Como cada individuo podría incluso tener una constelación única de dichas variantes, puede pensarse por lo tanto que la colección particular presente en el cabello de un individuo dado es una "huella dactilar de queratina". En una realización preferida de la presente invención, las composiciones para el tratamiento capilar se formulan para re-crear una parte o la totalidad de la huella dactilar de queratina de un individuo seleccionado (véase el análisis más profundo que se desarrolla más adelante).

Se ha demostrado que la secuencia de aminoácidos y de ADNc de la queratina, incluso de las queratinas capilares, revela una considerable variabilidad, probablemente debido a mutaciones puntuales u otros reacomodamientos de secuencias, por ejemplo, adiciones, eliminaciones e inserciones de nucleótidos. Véase, por ejemplo, Mischke y colaboradores, The Journal of Investigative Dermatology, V. 88, NO. 2, 2 de febrero, pp. 191-197, 1987; y Winter y colaboradores, The Journal of Investigative Dermatology, V. 106, NO. 3, 2 de marzo, pp. 544-548, 1996. Pueden producirse mutaciones espontáneas, por ejemplo, como resultado de los errores cometidos por la polimerasa del ADN durante el proceso de replicación de ADN.

Las variantes alélicas de la proteína producidas por empalme alternativo se denominan en la presente "isoformas" de la proteína o "isomorfos". Es posible que las variantes alélicas sean isoformas que resulten del empalme alternativo, aunque hasta ahora no se han identificado ejemplos al respecto. En breve, la mayoría de los genes que codifican proteína del ADN eucariótico contienen secuencias presentes en el correspondiente ARNm maduro en segmentos de ADN genómicos discontinuos (exones) intercalados entre las secuencias (intrones) que no forman parte del ARNm maduro. Estas secuencias de intrones se escinden precisamente mediante un procedimiento que comprende múltiples etapas. La mayoría de los ejemplos estudiados hasta el momento, todos y cada uno de los exones presentes en un gen, se incorporan en un ARNm maduro a través de la unión no variante de pares consecutivos de sitios de empalme de donantes y aceptores, eliminando cada intrón. Este tipo de empalme "constitutivo" deriva en un producto de un solo gen de cada unidad de transcripción, incluso cuando su secuencia codificadora se divide en varios exones.

Hay ejemplos, sin embargo, en los que los exones no consecutivos se unen en el procesamiento de algunas, aunque no de todas, las transcripciones que parten de un solo gen. Este patrón "alternativo" de empalme excluye secuencias de exones individuales del ARNm maduro en algunas transcripciones, pero las incluyen en otras. El uso de estos patrones de empalme alternativo en las transcripciones de un solo gen deriva en ARNm que tienen estructuras primarias diferentes. Cuando los exones involucrados contienen secuencias traducidas, estos ARNm empalmados en forma alternativa codificarán proteínas relacionadas pero diferentes, que en adelante se llamarán "isomorfos". La capacidad de generar isomorfos de la proteína diferentes pero íntimamente relacionados por empalme alternativo aumenta de un modo significativo la variabilidad genotípica que se puede obtener de genes individuales, tales como la queratina.

Las consecuencias de las mutaciones en el ADN que codifica proteínas estructurales de la queratina son significativas. Por ejemplo, el monilethrix es un defecto capilar dominante autosomal muy raro. Los cabellos de los individuos afectados muestran una estructura que se parece a una sarta de cuentas. Este defecto capilar es producto de una sustitución de aminoácidos de un residuo de ácido glutámico conservado por un residuo de lisina o arginina en la posición 410 en el motivo de terminación helicoidal de la queratina capilar hHb6 del tipo II (Winter y colaboradores Hum Genet, Diciembre; 101 (2): 165-169, 1997; y Winter y colaboradores, Nat Genet, Agosto; 16(4): 372-374, 1997). Una segunda mutación puntual se identificó en individuos afectados con el moniletrix, que sustituye el residuo de ácido glutámico 403, en la queratina capilar hHb1 del tipo II, con un residuo de lisina (Winter y colaboradores, supra). Tanto la hHbl como la hHb6 se co-expresan en la corteza del tallo piloso. Esto indica que el moniletrix es una enfermedad de la corteza capilar y demuestra que los pequeños cambios en la secuencia de ADN que codifica proteínas capilares de la queratina pueden tener un efecto severo sobre el aspecto externo del cabello.

En vista del ejemplo anterior, es posible que las diferentes variantes alélicas de proteínas de la queratina, basadas en diferencias en las regiones de codificación de del ARN mensajero de la queratina, también presenten propiedades biológicas alteradas. Observamos que una característica importante que distingue a las queratinas capilares de las queratinas blandas es que los dominios terminales de las queratinas capilares contienen una cantidad diferente de residuos de cisteína por molécula que las queratinas blandas. Como los dominios terminales están sobre la superficie de filamento formado, la mayoría de estos residuos de cisteína se consideran involucrados en la formación de uniones de disulfuro intermolecular entre la queratina y cualquiera de las otras moléculas de queratina o de la matriz. De esta manera, los entrecruzamientos intermoleculares covalentes entre los polipéptidos de la queratina pueden verse afectados por mutaciones que afectan los residuos conservados de cisteína.

La preparación de variantes alélicas de las proteínas de la queratina es relativamente directa, una vez que se aisla el mensaje que codifica la proteína. Por ejemplo, una vez que el ARN mensajero conocido de la queratina se ha amplificado por el método de la PCR, hay una o más formas de la secuencia del ARN mensajero de la queratina presentes en una cantidad suficiente para el análisis. La adición, eliminación o sustitución de cualquier nucleótido -uno o más- en la secuencia amplificada se puede determinar clonando el ADNc amplificado y determinando la secuencia de nucleótidos real del gen clonado.

De un modo alternativo, se puede determinar la presencia o ausencia de cualquier exón particular en la secuencia amplificada preparando una serie de sondas de ADN basadas en secuencias de exones conocidas (véase la Tabla 3 y las referencias allí citadas). El ADN amplificado puede sondearse por hibridación para detectar la presencia o ausencia de cada exón sin secuenciar directamente al ADN. Este método por lo general se prefiere al método descrito inmediatamente arriba, para la identificación de formas isommórficas de las proteínas de la queratina, porque demanda menos tiempo y es más económico. Las sondas de hibridación del ADN identifican todo exón faltante y describen la secuencia del ARN mensajero en forma lo suficientemente precisa como para que pueda construirse en un sistema de expresión para la eventual expresión de ese isomorfo preciso de la queratina.

La preparación de variantes alélicas no isomórficas es igualmente directa considerando las enseñanzas de la presente. Cuando las diferencias en la secuencia de la proteína reflejan diferencias en el ADN genómico, pre-ARNm, ARNm y/o ácidos nucleicos editados o procesados, las variantes pueden prepararse como se describiera con anterioridad, a través de la producción de un banco de ADNc partiendo de las células en las que las variantes se producen naturalmente.

Cuando las diferencias en la secuencia de la proteína no reflejan diferencias en la secuencia del ácido nucleico, de todas maneras pueden identificarse por aislamiento de la proteína partiendo de células en las cuales se producen las proteínas variantes. Las proteínas aisladas luego pueden someterse a cualquiera de una variedad de métodos analíticos, incluso, entre otros, los inmunoensayos tales como Western Blots u otros estudios de unión, estudios de fragmentación, secuenciamiento de proteínas, etc. tal como se conoce en la técnica, para que se determine la estructura química precisa de las variantes. Una vez que se conoce la estructura química, los ADNc que codifican esa estructura se pueden preparar (por ejemplo, sintéticamente a través de PCR o usando tecnología de ADN recombinante) para permitir una fácil preparación de grandes cantidades de cada variante individual.

Se apreciará que el análisis de las proteínas presentes en el cabello de un individuo necesariamente implicará el análisis de las formas procesadas, entrecruzadas, insolubles de dichas proteínas. La información recabada de dichos análisis, no obstante ello, permite la preparación de proteínas solubles análogas, tal como se describe en la presente.

En ciertas realizaciones preferidas de la invención, las composiciones para el tratamiento capilar se formulan de tal manera que contengan más de una variante alélica de la misma proteína; otras realizaciones preferidas contienen dos o más proteínas diferentes, cada una de las cuales puede estar presente en más de una forma alélica. En las realizaciones especialmente preferidas, se seleccionan las proteínas particulares y las variantes alélicas y la composición se formula para reproducir las cantidades relativas de las proteínas y/o variantes alélicas presentes en el cabello de un individuo seleccionado (ver más adelante).

Preferiblemente, se selecciona un individuo cuyas características capilares pretenden emularse, se determinan las cantidades relativas de una o más proteínas de la queratina o variantes alélicas según se describe en la presente, luego se produce cada proteína de la queratina o variante alélica por separado, preferiblemente en forma sintética o por expresión de un gen obtenido por técnicas de ingeniería en una célula hospedadora y las proteínas y/o variantes producidas por separado, que nunca se han entrecruzado se recombinan entre sí en relaciones que se aproximan a las que se observan en el cabello del individuo seleccionado. Lo más preferiblemente, el individuo es un ser humano.

Equivalentes funcionales

Las composiciones para el tratamiento capilar de la presente invención que contienen proteínas no naturales de la queratina incluyen, entre otras, aquéllas que contienen la secuencia primaria de aminoácidos de queratina, variantes alélicas proteicas de la misma y similares. Las proteínas no naturales de la queratina pueden incluir secuencias modificadas en las cuales los residuos de aminoácidos funcionalmente equivalentes se sustituyen por residuos dentro de la secuencia, lo cual resulta en un cambio silencioso.

De acuerdo con la presente invención, una secuencia de aminoácidos es "funcionalmente equivalente", en comparación con las secuencias conocidas de proteínas, si la secuencia de aminoácidos contiene uno o más residuos de aminoácidos dentro de la secuencia que se pueden sustituir por otro aminoácido de propiedades similares que actúe en una forma funcionalmente equivalente al aminoácido original. Los sustitutos para un aminoácido dentro de la secuencia pueden seleccionarse de otros miembros de la clase a la que el aminoácido pertenece. Los aminoácidos no polares (hidrofóbicos) incluyen alanina, leucina, isoleucina, valina, glicina, prolina, fenilalanina, triptofano y metionina. Los aminoácidos polares (hidrofílicos), neutros incluyen serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina, y glutamina. Los aminoácidos con carga positiva (básicos) incluyen arginina, lisina e histidina. Los aminoácidos con carga negativa (ácidos) incluyen ácido aspártico y ácido glutámico.

Las sustituciones se seleccionan por su efecto sobre: (i) el mantenimiento de la estructura de la estructura principal peptídica en el área de la substitución, por ejemplo, como una lámina o conformación helicoidal; (ii) el mantenimiento de la carga o hidrofobicidad de la molécula; o (iii) el mantenimiento del volumen de la cadena lateral. Las sustituciones que en general es de esperar que produzcan mayores cambios y que deben evitarse son aquéllas en las cuales: (a) la glicina y/o prolina son sustituidas por otro aminoácido o eliminadas o insertas; (b) un residuo hidrofílico, por ejemplo, cerilo o treonilo, se sustituye para (o por) un residuo hidrofóbico, por ejemplo, leucilo, isoleucilo, fenil-alanilo o alanilo; (c) un residuo de cisteína se sustituye para (o por) cualquier otro residuo; (d) un residuo que tiene una cadena lateral electropositiva, por ejemplo, lisilo, arginilo o histidilo, se sustituye para (o por) un residuo que tiene una carga electronegativa, por ejemplo, glutamilo o aspartilo, o (e) un residuo que tiene una cadena lateral voluminosa, por ejemplo, fenilalanina se sustituye para uno (o por) uno que no tenga esta cadena lateral, por ejemplo, glicina.

Sin embargo, es de esperar que la mayoría de las eliminaciones e inserciones en las proteínas no produzcan cambios radicales en las características de la proteína. No obstante, cuando es difícil predecir el efecto exacto de la sustitución, eliminación o inserción antes de proceder a realizarlas, un experto en la técnica apreciará que el efecto se evaluará usando los ensayos de detección sistemática de rutina, tal como se describen en la presente.

Criterios de selección

Ya se han analizado varios de los criterios de selección convenientemente utilizados para formular la composición para el tratamiento capilar de la presente invención y variarán según el uso que pretenda dársele a la fórmula para el tratamiento capilar.

La presente invención provee métodos para formular composiciones para el tratamiento capilar que imitan la composición de la proteína de la queratina de un individuo que tiene ciertas características capilares deseables. Por ejemplo, es de amplio conocimiento en la industria de productos para el tratamiento capilar que los usuarios de productos para el tratamiento capilar desean tener un cabello atractivo. En una realización particularmente preferida de la presente invención, el cabello de los seres humanos se analiza visualmente para seleccionar a aquellos sujetos que tengan el cabello más atractivo. Una o más, preferiblemente al menos dos, proteínas de las variantes alélicas de la queratina se identifican luego por ser producidas por las células del sujeto y se prepara una composición para el tratamiento capilar que contenga formas solubles de estas variantes alélicas conforme se describe en la presente.

Los expertos con los conocimientos comunes en la técnica reconocerán que no hay un estándar universalmente aceptado de lo que constituye un "cabello atractivo". Por lo general, cuando una persona razonable consideraría que el cabello de un sujeto tiene aspectos que normalmente caracterizan al cabello atractivo (por ejemplo, suavidad, lustre, flexibilidad, cuerpo y tersura) se considera que el sujeto tiene un cabello atractivo. Sin embargo, la presente invención contempla que se tengan en cuenta las preferencias del usuario o fabricante individual de la composición para el tratamiento capilar. Se puede formular un "cosmético de un diseñador" tal como se describe en la presente para reproducir uno o más aspectos de la proteína de la composición de la queratina de cualquier individuo. El usuario o formulador puede seleccionar a cualquier persona, basándose en cualquier aspecto, (por ejemplo, un individuo famoso o un individuo con características capilares particularmente deseables), cuya composición de queratina deba limitarse. Las composiciones preferidas para el tratamiento capilar de la presente invención pueden considerarse, por lo tanto, "composiciones recombinantes para el tratamiento capilar" y proveen preparaciones para el tratamiento capilar diseñadas según el sujeto individual.

Formulaciones

La proteína de la queratina de acuerdo con la presente invención se puede incorporar a cualquiera de una variedad de composiciones para el tratamiento capilar. Una amplia variedad de composiciones para el tratamiento capilar están disponibles en la técnica (Véase el Ejemplo 1).

En una realización, la queratina de la presente invención se incorpora a una composición de limpieza para el cabello, como por ejemplo, un pre-champú, un champú o un enjuague acondicionador. En otra realización, la queratina no natural de la presente invención se incorpora a una composición para modelar o dar forma al cabello, por ejemplo, un gel, un spray o una mousse. En una realización alternativa, la queratina que se describe en la presente se adiciona a una composición para antes o después de la permanente, con el fin de fijar el cabello. En otra realización más, la composición de la presente invención se usa en composiciones para decolorar, teñir o dar color al cabello.

En otro aspecto, la queratina de la presente invención se puede agregar a productos para el cuidado de las uñas. Es de amplio conocimiento que las uñas de los dedos de las manos y de los pies tienen un alto porcentaje de proteína de la queratina y por ende, quedan encuadradas en el alcance de la presente invención. Por ejemplo, la proteína de la queratina se puede agregar al esmalte de uñas o a un removedor de esmalte de uñas.

Estas composiciones para el tratamiento capilar y de las uñas no incluyen todas las composiciones a las que se puede adicionar la proteína de la queratina de la presente invención y de ninguna manera pretenden limitar el alcance de la invención descrita en la presente. Aquellos expertos en la técnica apreciarán que la queratina no natural, de acuerdo con la presente invención se puede adicionar a cualquier composición de tratamiento capilar o de belleza siempre y cuando la queratina no esté entrecruzada.

Ensayos

Se puede llevar a cabo convenientemente uno cualquiera de una variedad de ensayos en las composiciones para el tratamiento capilar de la presente invención o en los componentes de los mismos para garantizar que cumplen con los criterios de formulación relevantes.

Por ejemplo, las proteínas de la queratina utilizadas en las composiciones de la invención preferiblemente tienen una alta purificación. La pureza de las proteínas contenidas con los cosméticos de la invención puede someterse a prueba purificando las proteínas mediante el uso de métodos convencionales, tales como electroforesis con gel SDS y estableciendo arbitrariamente una norma de pureza (por ejemplo, 95% de pureza) que satisfaga o exceda esa necesidad de pureza como para pasar los ensayos de análisis dermatológicos convencionales que se describen en la presente.

También se puede analizar la aptitud de las composiciones de la invención para el tratamiento capilar de ofrecer protección contra la radiación UV usando procedimientos conocidos. Por ejemplo, se lleva a cabo una serie de pruebas con ratas, en las que una parte de la piel del lomo de la rata se depila y luego se expone a radiación ultravioleta. Una composición en forma de mousse, por ejemplo como la que se enseña en el Ejemplo 1, se aplica a la piel expuesta de las ratas tratadas y a la piel no expuesta de las ratas de control. La piel de los animales tratados se observa para evaluar si hay escamación.

Se puede medir la aptitud de la composición para el tratamiento capilar de alterar las características del cabello mediante una variedad de métodos. Por ejemplo, el tratamiento del pelo humano o lana con un agente reductor usado en las composiciones ondulantes para permanentes siempre resulta en una pérdida del peso de la muestra de pelo, pero en presencia de polipéptidos de queratina siempre hay un aumento de peso o, como mucho, una pérdida menor de peso que cuando se usan agentes reductores solos, sin péptidos de queratina. (Véase el documento de patente de los Estados Unidos No. 3.842.848). Por lo tanto, el peso de la muestra de pelo antes y después del tratamiento con la composición para el tratamiento capilar puede ser una medición de la aptitud de la composición para el tratamiento capilar de cambiar las características del cabello. También se puede evaluar la aptitud del material de queratina de recubrir y proteger las muestras de pelo por el hecho de que la muestra mantenga su condición suave, tersa y sedosa, muy similar a la de las muestras antes del tratamiento con el agente reductor. Hay varios otros métodos disponibles para evaluar el efecto de una composición para el tratamiento capilar sobre el cabello (véase el Ejemplo 5).

Ejemplos

La presente invención se ilustrará a continuación mediante los siguientes ejemplos no limitativos, en los cuales todos los porcentajes son porcentajes en peso.

Ejemplo 1 Preparación de composiciones para el tratamiento capilar

Los siguientes son Ejemplos de composiciones para el cuidado capilar a las que puede incorporarse la proteína de la queratina de la presente invención. Los ejemplos se dan sólo a los efectos ilustrativos y no pretenden interpretarse como limitaciones de la presente invención, dado que son posibles muchas variaciones de las composiciones para el tratamiento capilar, sin apartarse de su espíritu o alcance.

(i) El siguiente champú se adoptó del documento de Patente de los Estados Unidos con el No. 4.439.417 y se prepara:

1

(ii) El siguiente champú aniónico se adoptó del documento de patente de los Estados Unidos Número 4.444.749 y se prepara:

2

A 250 cc de una solución al 2% de N,N-dimetiletilendiamina en agua se introducen en pequeñas porciones sucesivas y con vigorosa agitación, 8,85 g de un copolímero 1:1 de vinil-metil-éter y anhídrido maleico con una viscosidad específica de 0,1 a 0,5 en una solución al 1% de la resina en dimetilformamida a 25ºC, tomando la precaución de que cada porción sucesiva del copolímero se haya introducido cuando la porción precedente se haya disuelto por completo en la solución de amina. A la solución viscosa resultante se añade una mezcla de proporciones iguales de alcohol etílico y acetato de etilo que precipita un producto polimérico sólido.

Este producto de reacción se puede usar como un agente suavizante introduciéndolo en un champú en una proporción de un 0,5%. El champú tratado de este modo provee una espuma que es particularmente suave al tacto e imparte alto brillo y elasticidad al cabello.

El producto de este ejemplo también se puede emplear como un agente espesante para cosméticos, preferiblemente en una concentración de aproximadamente 2% o como un agente suavizante para el cabello, a concentraciones de 0,5-2% en peso.

(iii) El siguiente champú anfotérico se adoptó del documento de patente de los Estados Unidos No. 4.444.749 y se prepara:

3

\newpage

(iv) La siguiente pre-mezcla de goma de silicona/material en partículas se adoptó del documento de patente de los Estados Unidos Número 4.983.383 y se prepara:

Premezcla A

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4

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Premezcla B

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5

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
  ^{1}   \begin{minipage}[t]{143mm} Goma de silicona de alta
viscosidad (>1.000.000 CTSTK), comercializada a través de G. E.
Silicones.\end{minipage} \cr   ^{2} 
 \begin{minipage}[t]{143mm} Material polimérico en partículas
AMPHOMER® (que tiene un intervalo de tamaño de partícula original de
75-200 micrómetros, disponible a través de National
Starch).\end{minipage} \cr   ^{3}  Ciclometicona que tiene una
estructura D5, disponible a través de G. E. Silicones.\cr   ^{4} 
Disponible a través de G. E.
Silicones.\cr}

Usando una mezcladora como por ejemplo una mezcladora del tipo cinta, los componentes de la premezcla A se combinan y se mezclan hasta que se dispersan y hasta que el material en partículas AMPHOMER se haya pulverizado hasta formar partículas que tengan un diámetro promedio comprendido entre 0,15 m y 2,0 m. Usando un recipiente de mezcla separado, los componentes de la premezcla B se mezclan hasta alcanzar la homogeneidad. Luego, la premezcla A y la B se combinan a una relación de 57% de A a una relación de 43% de B y se mezclan hasta alcanzar la homogeneidad.

La solución de la premezcla luego se diluye de la siguiente manera, usando un recipiente de mezcla con un sistema de agitación de alta velocidad/par. La solución de la premezcla se mezcla con premezcla adicional B a una relación de 70,175% de solución de premezcla a 29,325 de premezcla B hasta alcanzar la homogeneidad. La solución de premezcla se mezcla con premezcla B adicional a una relación de 50% de solución de premezcla a 50% de premezcla B hasta alcanzar la homogeneidad. Esta premezcla de goma de silicona/material en partículas se puede usar para fabricar una variedad de productos para el cuidado del cabello, tal como se ilustra en los siguientes ejemplos.

En los ejemplos (v, vi, ix y x) la goma de dimeticona es una goma de silicona de alta viscosidad (>1.000.000 CSTK) comercializada por G.E. Silicones y el material en partículas del copolímero de octilacrilamida/acrilato/ metilacrilato de butilaminoetilo es un material en partículas AMPHOMER que tiene un intervalo de tamaño de partículas original de 75-250 micrómetros, disponible a través de National Starch, que cuando se dispersa en la goma de silicona se pulveriza de manera tal que el intervalo del tamaño de partículas se reduzca a desde aproximadamente 0,15 m a 2,0 m.

(v) El siguiente tónico capilar sin aerosol se adoptó del documento de patente de los Estados Unidos Número 4.983.383, incorporada en la presente por referencia y se prepara:

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Ejemplos de champúes

6

Procesamiento del champú

Se añaden laurilsulfato de amonio, ácido cítrico, citrato de sodio e hidróxido de sodio a agua destilada a una temperatura aproximada de 15ºC. La mezcla se calienta a una temperatura de entre 70ºC y 80ºC. Se añaden cocamido MEA y glicol diestearato en este momento. Se mezclan el laureth-3 sulfato de amonio, el alcohol cetearílico y la premezcla de silicona a una temperatura de 70ºC a 90ºC. Esta mezcla se añade al lote, después del diestearato de glicol. Después se añaden conservante y fragancia. El lote se mezcla durante 5 minutos, luego se tritura bajo alto esfuerzo cortante usando un aparato triturador convencional y se enfría a temperatura ambiente (15ºC a 25ºC). Se añaden cloruro de sodio y xilen-sulfonato de amonio para controlar la viscosidad según las necesidades. Las composiciones finales tienen un pH de entre aproximadamente 5,0 y aproximadamente 6,0.

Estas composiciones se utilizan de la misma manera en la que uno usaría un champú estándar. Luego el cabello se seca y se modula de la manera habitual. Cuando se usa de esta manera, las composiciones brindan al cabello una limpieza, acondicionamiento y modelado eficaces, como así también, el aspecto de tener mayor volumen.

(vi) El siguiente acondicionador se adoptó del documento de patente de los Estados Unidos Número 4.983.383 y se prepara:

\newpage

Ejemplos de acondicionador

7

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
  ^{1}  Provisto por G.E. Silicones\cr   ^{2} 
 \begin{minipage}[t]{135mm} Estos componentes se combinan como
una premezcla, por ejemplo, tal como se describe en
(iv).\end{minipage} \cr}

Procesamiento del acondicionador

Se añade hidroxietilcelulosa al agua destilada, a una temperatura de 15ºC a 40ºC. Esta mezcla se dispersa bien, luego se calienta a una temperatura de entre 60ºC y 90ºC. Se añaden los materiales 2 a 8 al lote mientras la temperatura se mantiene en este intervalo. Luego la mezcla se agita durante aproximadamente 10 minutos, después se enfría a aproximadamente 50ºC. Los materiales restantes se añaden a esta temperatura. La mezcla se tritura bajo alto esfuerzo constante durante aproximadamente 2 minutos usando un aparato triturador convencional, luego se enfría a temperatura ambiente. Las composiciones terminadas tienen un pH de entre aproximadamente 3,5 y aproximadamente 4,5.

Estas composiciones se usan tal como uno usaría los productos acondicionadores del tipo para enjuagar estándar, es decir, después de aplicar el champú, el acondicionador se aplica al cabello, se lo deja reposar allí durante al menos un minuto aproximadamente y luego se lo enjuaga para sacarlo del cabello. Éste después se seca y se modula como siempre. Cuando se usan de esta manera, estas composiciones proveen al cabello un acondicionamiento y modulado eficaces, además del aspecto de tener mayor volumen.

(vii) La siguiente loción para fijar el cabello se adoptó del documento de patente de los Estados Unidos Número 4.444.749 y se prepara:

8

(viii) El siguiente tónico capilar sin aerosol se adoptó del documento de patente de los Estados Unidos Número 4.983.383. y se prepara:

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9

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Se prepara un producto tónico capilar en spray, sin aerosol de la siguiente manera. El óxido de lauramida se mezcla con una parte del agua a una relación de 4 a 1 con, por ejemplo, una mezcladora del tipo cinta, hasta que se alcanza la homogeneidad. La cocamida DEA se añade y se mezcla hasta que se alcanza la homogeneidad. La premezcla de (iv) se añade y se mezcla hasta que se alcanza la homogeneidad.

El resto del agua se coloca en un recipiente de mezcla de acero inoxidable. El Carbomer 956 se mezcla en el agua usando, por ejemplo, una mezcladora del tipo triblender o eductor. La mezcla continúa hasta que el Carbomer se disuelve por completo. El hidróxido de potasio se añade mientras se mezcla.

La premezcla se añade mientras se mezcla hasta que se alcanza la homogeneidad. Luego se añade el PVP/VA y la mezcla continúa hasta que el lote queda homogéneo. Se añade el conservante y la mezcla continúa hasta que se alcanza la homogeneidad. Se incorpora el perfume y la mezcla continúa por otros 10 minutos más. Una vez que el lote está bien mezclado, se procede a la homogenización del lote usando un aparato convencional. El producto final es un líquido opaco que tiene un pH de aproximadamente 6 y 7. El tónico capilar se rocía sobre el cabello húmedo, el cual luego se seca/modula. La cantidad de tónico usada dependerá de los beneficios de volumen/fijación deseados y de la cantidad de cabello que se está tratando, así como también, de la textura del cabello. La aplicación de este producto al cabello confiere al mismo un aspecto de mayor volumen. La textura del cabello es convenientemente suave y manejable, no rígida ni pegajosa, tal como resulta con la mayoría de los productos para modelar el cabello. La fijación del peinado también es duradera.

(ix) Las siguientes composiciones en mousse se adoptaron del documento de patente de los Estados Unidos Número 4.933.383 y se preparan:

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(Tabla pasa a página siguiente)

10

	^{1} Una mezcla de propano (20%), isobutano (78%) y n-butano (2%)
	^{2} Provisto por G.E. Silicones
	^{3} Estos componentes se combinan en una premezcla como en (iv).

Las composiciones en gel de la presente invención se preparan usando el método explicado en (viii) para el tónico capilar, salvo que el Carbomer 940 se reemplaza por el Carbomer 956 y la trietanolamina se añade antes del conservante y se incorpora por mezcla hasta que se alcanza la homogeneidad. Estas composiciones tienen un pH de aproximadamente 6 a 7.

Estas composiciones se usan de la misma manera que las composiciones del tipo mousse de (ix). Cuando se usan de esta forma estas composiciones en gel proveen al cabello un acondicionamiento y modelado eficaces, además de un aspecto de tener mayor volumen.

Las mousses en aerosol de la presente invención se preparan combinando todos los ingredientes excepto el propelente del aerosol en un lote que se llama concentrado. Este concentrado se prepara combinando con agitación todos los ingredientes salvo el conservante y la premezcla preparada como en (iv) y mezclando hasta que se disperse bien. El conservante y la premezcla se añaden por último y la mezcla continúa hasta que éstos se dispersan por completo. La mezcla resultante luego se homogeniza usando un aparato convencional. El concentrado resultante tiene un pH de entre 6 y 7. Las latas para la mousse en aerosol se preparan colocando 135 gramos de concentrado en 5 onzas de latas recubiertas con epoxi aluminio, colocando válvulas para mousse en las partes superiores de las latas, ejerciendo un vacío para evacuar el espacio de cabeza (para eliminar el aire) y comprimiendo las válvulas hasta calzarlas en su sitio. El propelente (15 gramos) se añade por presión, llenando a través de la varilla de la válvula.

Estas composiciones se masajean para que penetren en el cabello limpio/húmedo y el cabello luego se seca y se modula. La cantidad de mousse usada dependerá de los beneficios volumen/fijación deseados y la cantidad de cabello que se está tratando, así como también la textura del cabello. Cuando se utiliza de esta manera, estas composiciones de mousse proveen un acondicionamiento y modulado eficaz y un aspecto de mayor volumen del cabello.

(x) Las siguientes composiciones en gel se adoptaron del documento de patente de los Estados Unidos No. 4.983.383 y se preparan.

11

	^{1} Provisto por G.E. Silicones
	^{2} Estos componentes se combinan en una premezcla como en (iv).

(xi) El siguiente spray para el cabello de silicona sin aerosol se adoptó del documento de patente de los Estados Unidos Número 4.983.383 y se prepara:

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(Tabla pasa a página siguiente)

12

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 ^{1}  Ciclometicona que tiene una estructura D ^{5} , disponible a
través de G. E. Silicones\cr   ^{2}  Copoliol de dimeticona FF400,
disponible a través de Dow Corning\cr   ^{3}  
 \begin{minipage}[t]{138mm} Copolímero de octilacrilamida/
Acrilato/Metacrilato de butilaminoetilo que tiene un tamaño de
partícula original (antes de pulverizarlo) de 75-200
micrómetros, comercializado a través de National
Starch.\end{minipage} \cr   ^{4}  Quaternium
18  -  Bentonita, comercializado a través de United
Catalysts\cr   ^{5}  Goma SE  -  30 comercializada a
través de G.E.
Silicones\cr}

El material en partículas Amphomer® primero se dispersa en la goma de polidimetilsiloxano usando una mezcladora del tipo amasadora a baja velocidad, durante aproximadamente 4 horas. La mezcla de Amphomer®/goma luego se añade a la ciclometicona y se mezcla hasta que se disuelve usando una mezcladora del tipo amasadora durante aproximadamente 8 horas. El copoliol de dimeticona se añade y la composición se mezcla usando la mezcladora del tipo amasadora hasta que se alcanza la homogeneidad. El Tixogel® luego se añade y se mezcla usando la mezcladora del tipo amasadora hasta que se alcanza la homogeneidad. Mediante el uso de una machacadora Tek Mar® la composición se tritura lentamente con el etanol hasta que se alcanza la homogeneidad. Usando mezcla convencional, se añade el PVP/VA/copolímero. El salicilato de octilo, los aminoácidos de queratina y la fragancia se mezclan en la composición en ese orden. El spray para el cabello resultante provee beneficios de acondicionamiento y volumen al cabello con una fijación más suave del mismo. Se obtienen resultados sustancialmente similares cuando se sustituye una cantidad equivalente de un quarternium-18-hectorita (por ejemplo, el material comercializado bajo el nombre comercial Bentene-38® por NL Chemicals), o una bentonita de estearalconio (por ejemplo, el material comercializado bajo el nombre comercial Tixogel VZ® por United Catalysts) o un estearaldonio hectorita (por ejemplo, el material comercializado bajo el nombre comercial Bentone-27® por NL Chemicals), para la arcilla Tixogel VP®.

(xii) El siguiente spray para cabello con silicona en aerosol se adoptó del documento de patente de los Estados Unidos Número 4.983.383, incorporado en la presente por referencia y se prepara:

Spray para cabello con silicona en aerosol

Un spray para el cabello con silicona en aerosol se puede preparar combinando la composición de (iv) con un propelente, por ejemplo, el propelente A-31, que es un propelente de isobutano comercializado a través de Phillips Petroleum, Inc., a una relación de 3 partes de composición para el cabello en spray a 1 parte de propelente.

(xiii) La siguiente composición para el cabello en spray se adoptó del documento de patente de los Estados Unidos Número 4.983.383 y se prepara:

\newpage

Composición para el cabello en spray

13

Premezcla 1

14

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
  ^{1}  Copoliol de dimeticona FF400, comercializado a través de Dow
Coming\cr   ^{2}  Ciclometicona que tiene una estructura D5,
comercializada a través de G.E. Silicones\cr   ^{3}  GE SR545,
comercializado a través de G.E. Silicones\cr   ^{4}  Goma
SE-76, comercializada a través de General Electric
Co.\cr   ^{5}   \begin{minipage}[t]{138mm} Copolímero de
octilacrilamida/Acrilato/Metacrilato de Butilaminoetilo, que tiene
un tamaño de partícula original (antes de la trituración) de
75-300 micrómetros, comercializado a través de
National
Starch\end{minipage} \cr}

El Amphomer® se dispersa primero en la goma de Polidimetilsiloxano usando una mezcladora del tipo amasadora a una velocidad de bajo esfuerzo cortante durante aproximadamente 4 horas. La mezcla de Amphomer®/goma se incorpora luego a la ciclometicona y resina de siloxano y se mezcla hasta disolver, usando una mezcladora del tipo amasadora durante aproximadamente 8 horas. El agua DRO se añade y se mezcla hasta que se alcanza la homogeneidad. El óxido de lauramina se añade y se mezcla hasta que se alcanza la homogeneidad. La cocamido DEA se incorpora después y se mezcla hasta que se alcanza la homogeneidad. El alcohol SD 40 luego se tritura con la mezcla anterior hasta que se alcanza la homogeneidad. El polímero PVP/VA, copoliol de dimeticona, salicilato de octilo, aminoácidos de queratina y perfume se incorporan cada uno en su turno en la composición y se los mezcla. El spray para el cabello resultante provee al mismo, beneficios mejorados de acondicionamiento y volumen, fijándolo y haciéndolo más suave al tacto.

(xiv) El siguiente removedor de esmalte para uñas se adoptó del documento de patente de los Estados Unidos Número 5.173.288 y se prepara:

15

	^{1} Crotein ASK, solución al 10-15% en alcohol (de Croda).
	^{2} EMCOL t655 (de Croda)
	^{3} CROTEIN AD (ex Croda)

Otros ejemplos de productos para el cuidado del cabello pueden encontrarse en los documentos de patente de los Estados Unidos Números 4.495.173, 4.542.014 y 5.612.014.

Ejemplo 2 Amplificación por PCR del ADNc de la queratina capilar Oligonucleótidos usados para la amplificación

Los oligonucleótidos se sintetizan en un sintetizador de ADN Biosearch. La mayoría de los cebadores son cebadores específicos del ARNm. Los cebadores 5' y los cebadores 3' están diseñados para hibridarse a los extremos opuestos de la secuencia de ARNm de la elastina en particular.

Método de amplificación

El ARN se transcribe en forma inversa en el ADNc usando métodos convencionales. En breve, una mezcla de reacción 10-:1 de transcripción inversa que contiene 1 :g de ARN celular total, 1 x tampón para PCR (Tris HCl 20 mM, pH 8,3, KCl 50 mM; MgCl_{2} 2.5 mM /100 :g de albúmina de suero bovino por ml), ditiotreitol 1 mM, dNTP 0,5 mM, 10 unidades de RNasin (Promega Biotec), 0,1 :g de oligo (dT) y 100 unidades de trasncriptasa inversa del virus de la leucemia murina BRL Moloney (Bethesda Research Laboratories) se incuba a 37ºC durante 60 minutos, se calienta a 95ºC durante 5-10 minutos y luego se enfría rápidamente en hielo. Se lleva a cabo la PCR a una final concentración de 1 x tampón para PCR/50 :M dNTPs/0,1 :M de cada uno de los cebadores 5' y 3' /1 x 10^{6} cpm de cebador con marcaje terminal [^{32}P]/1 unidad de polimerasa de ADN de Thermus aquaticus (Taq polymerase) (Perkin-Elrner/Cetus) en un volumen total de 50:1. A la mezcla se le superpone aceite mineral y luego se amplifica con el ciclador térmico Perkin-Elmer Cetus. El perfil de amplificación comprende la desnaturalización a 95ºC durante 30 segundos, la hibridación del cebador a 55ºC durante 30 segundos y la extensión a 72ºC durante 1 minu-
to.

Ejemplo 3 Construcción y detección sistemática de un banco de ADNc de cuero cabelludo humano

Este método se adaptó de Rogers y colaboradores, Differentiation, V.61, pp. 187-194, 1997 y de Rogers y colaboradores, Experimental Cell Research, V. 220, pp. 357-362, 1995.

El ARNm total se aisla de un trozo de 3 cm^{3} de cuero cabelludo humano extirpado quirúrgicamente (Winter y colaboradores, Exp. Cell Res., V. 212, pp. 190-200, 1994). Cinco microgramos de ARN poly(A)* se usan para preparar un banco de ADNc en Lambda Zap II de acuerdo con las instrucciones de fábrica (cDNA Cloning Systems, Stratagene).

La genoteca se somete a una detección sistemática con un fragmento de 700-bp StyI/StyI del clon mHa2 de la queratina capilar del tipo I murina (véase Winter y colaboradores, Exp. Cell Res., V. 212, pp. 190-200, 1994) que contiene las dos secuencias que codifican para un subdominio a-helicoidal y el término carboxi, como así también las secuencias no codificadoras 3'. Puede llevarse a cabo una segunda detección sistemática con un fragmento de 570-bp StyI/StyI del clon mHb4 de la queratina capilar del tipo II murina (véase Yu y colaboradores, J. Invest. Dermatol., V. 97, pp. 354-363, 1991; y Tobiasch y colaboradores, Mol. Biol. Rep. V. 16, pp. 39-47, 1992) que abarcan exclusivamente secuencias de codificación de hélice a. Las sondas se pueden marcar por traslación de mellas con un un [^{32}P] dCTP.

De un modo alternativo, las sondas de detección se pueden sintetizar por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR, polymerase chain reaction). Un segmento de 182-bp de la región que codifica para el término amino del clon mHb4 (posiciones de nucleótidos 197-379) de la queratina capilar del tipo II MHKB2 (Yu y colaboradores, J. Invest. Dermatol., V. 97, pp. 354363, 1991) se amplifica a partir del ADN genómico de ratón, usando los cebadores 5'CCTGCTACCGAGGACTCTCAGG-3' (cebador directo) y 5'CGATCTCCAGGTTCAGGGGTGT-3' (cebador inverso). De un modo similar, un segmento de 284-bp de la región que codifica para el término carboxi y la región no codificadora de 3' del clon pmKII-6 de la queratina capilar del tipo II (véase Tobiashch y colaboradores, Mol. Biol. Rep., V. 16, pp., 39-47; 1992) se amplifica usando los cebadores 5'-TGCAGCGGAAACGTGGTGG-3' (cebador directo) y 5'CTGGGGCAGCGGATCCTCCAG-3' (cebador inverso). El fragmento de ADN amplificado se puede usar como una sonda para detectar el banco de ADNc del cuero cabelludo humano (según Rogers y colaboradores, Differentiation, 61, 187-194, 1997). Un banco de cósmidos humano, (por ejemplo pWEl5: Clontech. Palo Alto. CA), puede someterse a detección sistemática con ADN genómico de la queratina capilar clonada por PCR (ghHKb2-1) marcada por traslación de mellas con g[^{32}P]-dCTP (véase Bowden y colaboradores, The Journal of Investigative Dermatology, V. 110, No. 2, febrero de 1998). Los expertos con los conocimientos comunes en la técnica pueden generar cebadores similares partiendo de secuencias conocidas de ARNm de otras proteínas. Una vez que se han aislado los clones apropiados, las proteínas de la queratina se pueden expresar y purificar.

La PCR se lleva a cabo en 1 x tampón para PCR que es: Tris-HCl 10 mM,.pH 8,85, KCl 25 mM, (NH_{4})_{2}SO_{4}, MgSO_{4} 2,0 mM, con dNTP 200 mM, 50 pmol de cebador y 2,5 unidades de polimerasa Taq a 94ºC durante 30 segundos; 56ºC durante 40 segundos; 72ºC durante 50 segundos, por 30 ciclos. Los productos de PCR se separan en gel de agarosa al 3,5% de bajo punto de fusión y se purifican por digestión Gelase (Biozym, Oldendorf, Alemania) y precipitación de etanol.

Sin embargo, las sondas se generan y se usan en un esquema de hibridación de placas de baja severidad (prehibridación e hibridación con 6X SSC, SDS 1%, 5 X solución de Denhardt a 50ºC durante 24 horas. Los filtros se lavaron 3X durante 30 minutos con 2 X SSC, SDS 1% a 55ºC) (Rogers y colaboradores, Exp. Cell Res., supra).

Caracterización de los cADN de la queratina

Los clones bacteriófago-positivos se purifican y se convierten en fagémidos Bluescript por escición automática, de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Stratagene) y se secuencian desde ambos extremos. Las secuencias parciales se analizan usando la base de datos de nucleótidos EMBL para eliminar clones que codifiquen para queratinas conocidas (lo más probable, queratinas epidérmicas). El secuenciamiento de los restantes clones posiblemente únicos se lleva a cabo por el método tenninación de cadena didesoxi, (véase Sanger y colaboradores, Proc. Nad. Acad. Sci. USA, V. 75, pp. 5463-5467, 1977) usando inicialmente los cebadores universales M13 y T3 seguidos por los cebadores "walking primers" de oligonucleótido 17-mer específicos para la secuencia recientemente clonada.

Hibridación con sondas específicas de los exones

Las secuencias de oligonucleótidos específicos para los exones individuales se seleccionan por métodos que se describen en la presente. Los oligonucleótidos específicos de los exones se sintetizan usando una modificación del método de fosfitos de Mateeucci (J. Am. Chem. Soc., 103: 3185, 1981) empleando un sintetizador programable MilliGen (Bedford, MA). Los oligonucleótidos sintéticos se purifican por cromatografía líquida de fase inversa y alta presión (Varian 5000).

Los oligonucleótidos sintéticos específicos de los exones se marcan radiactivamente en el extremo 5', con [^{32}P]dATP, por una reacción de intercambio de fosfatos catalizada por la quinasa de polinucleótido T4. Para dilucidar la presencia o ausencia de una secuencia específica de los exones dentro de los clones de cuero cabelludo humano identificados, se desnaturalizan 100 ng del ADNc inserto, se espolvorean sobre filtros de nitrocelulosa y se hibridan con 10 ng de la sonda de oligonucleótidos radiomarcada específica de los exones. La prehibridación del filtro se lleva a cabo en una solución que consiste en NaCl 0,9 M, citrato de sodio 90 mM (pH 7,0), dodecilsulfato sódico al 0,5%, 100 mg/ml de ADN del esperma de salmón desnaturalizado, polivinil-pirrolidina al 0,1%, albúmina de suero bovino al 0,1% y Ficoll al 0,1%, a 42ºC durante 2 horas. La hibridación, luego de la adición de la sonda de oligonucleótidos sintética marcada, se lleva a cabo durante 16 horas en la misma solución. Los filtros se lavan con una severidad final de NaCl 0,15 M, citrato de sodio 15 mM, a 55ºC durante 60 minutos.

Ejemplo 4 Producción de queratina humana recombinante

Los siguientes procedimientos se adoptaron de Manabe y colaboradores, Biochemical and Biophysical Research Communications, V. 229, pp. 965-973, 1996.

Construcción del vector de expresión y expresión de la queratina

El ADNc de queratina, inversamente transcripto a partir del ARNm de células de cuero cabelludo humano (véase el Ejemplo 3) se clona en un vector de expresión, como por ejemplo PECE. Preferiblemente, se inserta un ADNc de extensión completa, ya fuera de los genes de queratina capilar ácida o básica humana en el sitio de clonación Eco RI de PECE, bajo el control del promotor precoz SV40. Se desarrollan unas células PtK2 (adquiridas del American Type Culture Collection) y queratinocitos epidérmicos de rata (Dr. Howard P. Baden de la Harvard University Boston) en DMEM (Gibco), suplementado con suero de ternero fetal al 10% (Gibco). Todos los cultivos se desarrollaron en una atmósfera de CO_{2} al 5% a 37ºC. Las transfecciones en las células PtK2 y en los queratinocitos epidérmicos de las ratas se llevan a cabo por el método de lipofección usando el reactivo LipofectAMINE y LipofectACE (Gibco), respectivamente, de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Para determinar la presencia y el estado de las proteínas transferidas, las células se alteran 48 horas después de la trasfección y un se obtiene un pelet insoluble de queratina por extracción secuencial en un detergente no iónico con tampones con alto y bajo contenido de sal (véase Schweizer y colaboradores, Exp. Cell. Res. V. 184, pp. 193-206, 1993). El pelet se resuspende en el tampón de muestra y se separa por SDS-PAGE. Las muestras luego se transfieren a una membrana de nitrocelulosa usando un aparato de transferncia Bio-Rad y las membranas se bloquean por incubación durante toda la noche en un tampón MT (leche deshidratada descremada al 5%, Tween 20 al 0,2% en PBS durante 2 horas a temperatura ambiente (véase Schweizer y colaboradores, Exp. Cell. Res., supra). La membrana se sondea con anticuerpos contra las proteínas de la queratina deseadas (véase por ejemplo, Westgate y colaboradores Br. J. Dermatol., Julio, 197(1): 24-30, 1997). La presencia de anticuerpo ligado se detecta por incubación con antisuero anti-ratón de cabra biotinilado y complejo de avidina-peroxidasa (SensiTek, Sytek) seguido por el posterior desarrollo usando quemiluminiscencia (ECL, Amersham) de acuerdo con las recomendaciones del fabricante.

Ejemplo 5 Evaluación de las características del cabello

(i) Las propiedades del cabello también se pueden evaluar mediante los siguientes métodos: (Véase el documento de patente de los Estados Unidos No. 5.612.024).

a) Mediciones de elongación sobre el cabello tratado

Unos mechones de cabello Alkinco del tipo 6621 (largo del mechón: 12 cm) se utilizan para la medición.

Los mechones se tratan durante 20 minutes con el champú de prueba, luego se enjuagan durante aproximadamente 30 segundos y se secan con un secador de pelo durante aproximadamente 1,5 horas a 38ºC. Los mechones se ultradecoloran durante 20 minutos (composición de la ultradecoloración: 6% en peso de peróxido de hidrógeno, 15% en peso de peroxidisulfato de amonio, amoníaco concentrado a pH 9,4, resto de agua) y se enjuaga con agua durante aproximadamente 1 minuto. Los mechones mojados luego se lavan con champú, se enjuagan y se secan tal como se describiera anteriormente. Los mechones se ondean en frío (solución de ondulado: 7% en peso de ácido tioglicólico, amoníaco conc. a un pH 9,0, resto agua), se enjuagan con agua (38ºC) durante aproximadamente 1 minuto y se tratan con una solución fijadora (2% en peso de peróxido de hidrógeno, ácido cítrico a un pH de 4,0, resto agua), se lavan con champú, se enjuagan y se secan como se describiera anteriormente. El ciclo de ultradecoloración, enjuague, aplicación de champú, enjuague, secado, ondulado en frío, enjuague, fijación, enjuague, aplicación de champú, enjuague y secado luego se repite otras dos veces más. Para la medición en seco, los mechones se calientan al aire a 38ºC. Para las mediciones en mojado, los mechones se conservan en agua hasta el momento preciso de la medición. Pueden determinarse los siguientes valores:

Esfuerzo de rotura máximo (fuerza de tracción a la cual se rompe el cabello).

Valor de elongación del 15% (fuerza de tracción a la que el cabello se elonga en un 15%).

Elongación en la rotura (% de elongación en el cual el cabello se rompe).

Fragilidad.

Los detalles del proceso de medición se pueden encontrar en la literatura (Arztl. Kosmetologie l5, 347-355 (1985) y Parfumerie & Kosmetik 72, 74-81 (1991)).

La fragilidad se determina como el porcentaje de cabellos que muestran una rotura al 20% de elongación y menos.

b) Determinación del trabajo para peinar en seco

El trabajo para peinar en seco puede determinarse, por ejemplo, sobre cabello castaño, (Alkinco 6634, con una longitud del mechón de 12 cm, un peso del mechón de 1 g) a modo de comparación de valores promedio por pares. Para determinar el valor cero, los mechones se enjuagan con agua (1 1/min, 38ºC) durante 1,5 minutos y se peinan. Los mechones luego se secan con un secador de cabello durante 40 minutos a 45ºC. Después de aplicar acondicionadora durante 12 horas a 30ºC/40% de humedad relativa del aire, se determina el trabajo para peinar. Los mechones se tratan con 100 g de la formulación durante 5 minutos y luego se enjuagan, secan y acondicionan como se describiera anteriormente. El trabajo para peinar en seco se determina con posterioridad. Los detalles del procedimiento de medición se pueden hallar en la literatura (Arztl. Kosmetologie 20, 498-502 (1990)). Las condiciones se mantienen de tal manera que no se produzca un entrecruzamiento de las proteínas de la queratina durante la expresión, lo cual requiera posiblemente la expresión de un solo polipéptido de la queratina en una célula individual.

(ii) Método de evaluación para el tratamiento pre-champú: (Véase el documento de patente de los Estados Unidos No. 4.495.173).

a) Textura del cabello durante el lavado

A cada uno de unos mechones hechos con cabello de una mujer japonesa de una longitud de 20 cm y un peso de 20 g se aplican 2 g de cada tratamiento pre-champú. Luego de dejar actuar durante 5 minutos, se aplica al cabello 2 g de un champú común comercializado en el mercado y se forma la espuma habitual durante 1 minuto, momento en el cual se evalúa la textura del cabello. La evaluación se realiza mediante una prueba de comparación por pares, en la que se usa como control un mechón tratado con un tratamiento capilar de pre-champú común comercializado en el mercado compuesto principalmente por lanolina.

b) Textura del cabello mientras está mojado

Una vez que se termina la evaluación de la textura del cabello durante el lavado, se lava con agua corriente a 40ºC durante 1 minuto y se seca con una toalla para eliminar el excedente de agua. El mechón se evalúa de un modo similar al mechón durante el lavado para conocer la textura cuando está mojado.

c) Textura y facilidad para peinar después de seco

Luego de la evaluación de (b), los mechones de cabello mojado, cada uno de ellos, se seca al aire y su textura se evalúa de acuerdo con el método de (b). Luego se evalúa la facilidad para peinar, de una forma similar al método de (a) usando un peine de nylon comercialmente disponible.

Claims (9)

1. Un método para formular una composición para el tratamiento capilar, comprendiendo el método las etapas de:

seleccionar un individuo humano, basándose en que dicho individuo tenga características de cabello atractivo;

obtener ácidos nucleicos, al menos uno, cada uno de los cuales codifique una variante alélica diferente de la queratina que esté presente en el cabello del individuo humano;

introducir cada uno de los ácidos nucleicos identificados en un vector de expresión para que se produzca una población de construcciones de expresión, cada una de las cuales codifique una variante alélica de queratina, incluyendo la población vectores que codifiquen al menos una variante alélica de queratina;

introducir cada construcción de expresión en una célula hospedadora, de manera que se produzca una población de células hospedadoras, cada una de las cuales haya recibido una construcción de expresión individual y exprese una variante alélica de queratina no entrecruzada a partir de la misma;

identificar aquellas células hospedadoras en la población de células hospedadoras que expresen al menos una de las citadas variante alélicas de queratina de una manera que no resulte en el entrecruzamiento de al menos una de las citadas variantes alélicas de queratina producidas;

purificar cada una de las citadas variantes alélicas de queratina de la célula hospedadora que las produce; y

combinar las citadas variantes alélicas de queratina purificadas entre sí y también con componentes de una composición para el tratamiento capilar a fin de formar una composición para el tratamiento capilar.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la etapa de obtención comprende ya sea:

(a) obtener al menos dos ácidos nucleicos; o

(b) obtener al menos uno o preferiblemente, al menos dos, ácidos nucleicos, cada uno de los cuales codifique una variante alélica de queratina que sea una proteína seleccionada de las proteínas de la queratina hHa1, hHa2, hHa3-I, hHa3-II, hHa4, hHa5, hHRa1, hHb1, hHb3, hHb5, hHb6, Hax y Hbx.

3. Un método para formular una composición para el tratamiento capilar que comprende queratina, comprendiendo el método:

seleccionar un individuo humano en particular basándose en que dicho individuo tenga características de cabello atractivo;

obtener ácidos nucleicos, al menos uno, cada uno de los cuales codifique una de las citadas variantes alélicas diferentes de la queratina que se produzca naturalmente en el cabello del individuo humano seleccionado;

introducir cada uno de los citados ácidos nucleicos en un vector de expresión;

introducir cada uno de los vectores de expresión en su propia célula hospedadora para que cada una de las citadas variantes alélicas de queratina se produzca en una célula hospedadora;

purificar cada una de las variantes alélicas de queratina producidas por técnicas recombinantes;

combinar las citadas variantes alélicas de queratina purificadas entre sí y también, con componentes de una composición para el tratamiento capilar.

4. El método de acuerdo con la reivindicación 3, en el que la etapa de introducir cada uno de los citados ácidos nucleicos en un vector de expresión comprende introducir al menos dos ácidos nucleicos.

5. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que:

(a) la etapa de combinación comprende combinar la al menos única o preferiblemente, las dos variantes alélicas de queratina purificadas como mínimo entre sí, en relaciones que se aproximen a aquéllas en las que se encuentran en la epidermis del individuo seleccionado;

(b) la etapa de selección comprende seleccionar a un individuo humano en quien vaya a aplicarse la composición para el tratamiento capilar;

(c) la etapa de selección comprende seleccionar a un individuo humano que no fuera aquél en quien vaya a aplicarse la composición para el tratamiento capilar;

(d) la etapa de selección comprende seleccionar a un individuo humano cuyas características del cabello atraigan a un individuo en quien vaya a aplicarse la composición para el tratamiento capilar;

(e) la etapa de selección comprende seleccionar a un individuo humano sobre la base de criterios predeterminados establecidos por el fabricante de la composición;

(f) la etapa de selección comprende seleccionar a un individuo humano sobre la base de criterios predeterminados establecidos por quien usará la composición;

(g) la etapa de selección comprende seleccionar a un individuo humano basándose en que ese individuo será quien use la composición;

(h) cada una de las variantes alélicas de queratina, al menos una o preferiblemente al menos dos, se selecciona del grupo que consiste en queratina de extensión completa;

(i) cada una de las variantes alélicas de queratina, al menos una o preferiblemente al menos dos, se selecciona del grupo que consiste en queratina truncada;

(j) cada una de las variantes alélicas de queratina, al menos una o preferiblemente al menos dos, se selecciona del grupo que consiste en queratina hidrolizada;

(k) la etapa de obtención comprende las etapas de:

preparar un banco de ADNc partiendo de células del individuo seleccionado que expresen las variantes alélicas;

someter al banco de ADNc a una detección sistemática para identificar al menos uno o preferiblemente al menos dos aislados que contengan secuencias clonadas que codifiquen diferentes varaintes alélicas de las proteínas de la queratina;

(l) la etapa de purificación comprende purificar cada variante alélica de la queratina hasta que alcance una pureza de al menos 95% aproximadamente;

(m) el cabello atractivo se selecciona basándose en una o más características seleccionadas del grupo que consiste en suavidad, tersura, individuo famoso, lustre, resistencia a la tracción, flexibilidad, cuerpo, color preferido, calidad de lacio, calidad de rizado y calidad de ondeado.

6. Una composición para el tratamiento capilar que comprende:

una solución acuosa de un detergente;

variantes alélicas de la proteína de la queratina, al menos una, presentes en relaciones aproximadamente idénticas a las que se encuentran las variantes en el cabello de un individuo seleccionado.

7. Una composición para el tratamiento capilar de acuerdo con la reivindicación 6 en la que:

(a) al menos dos variantes alélicas de la proteína de la queratina están presentes en relaciones aproximadamente idénticas a las que se encuentran las variantes en el cabello de un individuo seleccionado;

(b) al menos una o, preferiblemente al menos dos, de las variantes alélicas de la proteína de la queratina han sido modificadas para aumentar su solubilidad; y

opcionalmente en la que la modificación comprende la adición de una parte seleccionada del grupo que consiste en liposomas, ácidos grasos, carbohidratos, lípidos y proteínas;

y, también adicionalmente, en la que la modificación comprende la adición de aminoácidos a una proteína seleccionada del grupo que consiste en aminoácidos hidrofóbicos, aminoácidos hidrofílicos o aminoácidos ricos en cisteína; o

(c) al menos una o, preferiblemente al menos dos, variantes alélicas de la proteína de la queratina han sido modificadas para reducir su antigenicidad, y

opcionalmente, en la que la modificación comprende la alteración de una porción accesible para el disolvente de la variante alélica de la proteína de queratina.

8. Un removedor acuoso de esmalte de uñas basado en acetona, el cual comprende:

a. de 40 a 90% en peso de acetona, y

b. de 0,1 a 10% en peso de proteína de la queratina, en el que la proteína de la queratina es una variante alélica de la queratina.

9. El removedor de esmalte de uñas de acuerdo con la reivindicación 8, que:

(a)

comprende de 50 a 80% en peso de acetona;

(b)

comprende de 0,005 a 1% en peso de queratina; o

(c)

comprende, asimismo, de 1 a 20% en peso de lanolina o un derivado de la misma.