ES2235977T3 - Analogos de 8-(anilino)-1-naftalenosulfonato y su uso en ensayos de deteccion de analitos. - Google Patents

Analogos de 8-(anilino)-1-naftalenosulfonato y su uso en ensayos de deteccion de analitos.

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ES2235977T3
ES2235977T3 ES00973725T ES00973725T ES2235977T3 ES 2235977 T3 ES2235977 T3 ES 2235977T3 ES 00973725 T ES00973725 T ES 00973725T ES 00973725 T ES00973725 T ES 00973725T ES 2235977 T3 ES2235977 T3 ES 2235977T3
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tert
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Yeung Siu Yu
Adva Yani
Paing C. Huang
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Abstract

Un análogo del 8-(anilino)-1-naftalenosulfonato (ANS) descrito por la fórmula: **(Fórmula)** En la que: N es de 1 a 5; y X es independientemente isopropilo o terc-butilo, y en la que el análogo de ANS es capaz de reaccionar con hidrocloruro de 3-metil-2-benzotiazolinona hidrazona(MBTH), o uno de sus análogos, para producir un producto colorante que tiene una desviación reducida en al menos aproximadamente un 35% comparado con el producto colorante producido en al reacción del ANS y MBTH, o uno de sus análogos.

Description

Análogos de 8-(anilino)-1-naftalenosulfonato y su uso en ensayos de detección de analitos.
Introducción Campo de la invención
El campo de esta invención son composiciones de colorantes, particularmente composiciones de colorantes adecuados para su utilización en ensayos de detección de analitos, por ejemplo ensayos de detección de glucosa.
Antecedentes de la invención
La detección de analitos en fluidos fisiológicos, por ejemplo sangre o productos derivados de la sangre, tiene cada día más importancia en la sociedad actual. Los ensayos de detección de analitos se utilizan en numerosas aplicaciones, incluyendo pruebas en el laboratorio, pruebas en casa, etc. Los resultados de estas pruebas tienen un importante papel en el diagnóstico y la gestión de varias enfermedades. Los analitos de interés incluyen glucosa para la gestión de la diabetes, colesterol, y otros de este tipo. Como respuesta a la cada vez mayor importancia de la detección de analitos, se ha desarrollado una amplia gama de protocolos e instrumentos para la detección de analitos para su utilización clínica y casera.
Muchos de los protocolos e instrumentos que se han desarrollado hasta la fecha emplean un sistema que produce una señal para identificar la presencia del analito de interés en una muestra fisiológica como puede ser sangre. Por ejemplo, un sistema de detección de glucosa empleado actualmente utiliza un sistema que produce una señal que incluye la glucosa oxidasa, peroxidasa del rábano, meta[3-metil-2-benzotiazolina hidrazona]N-sulfonil bencenosulfonato monosódico (MBTHSB) y 8-(anilino)-1-naftalenosulfonato (ANS). Véase la patente de Estados Unidos nº 5.563.031. Cuando la glucosa se combina con el anterior sistema productor de una señal en presencia de oxígeno, se lleva a cabo la siguiente reacción:
10
A pesar de los buenos resultados que se han logrado con la pareja de colorantes MBTHSB-ANS, tal como se ha descrito anteriormente, hay posibilidades de mejora en este sistema. Por ejemplo, el producto colorante azul, producido por el sistema productor de la señal de la anteriormente descrita pareja de colorantes MBTHSB/ANS, se encuentra sujeto a desviaciones durante la fase de detección del ensayo, que en último término puede causar resultados inexactos.
Según esto, existe un interés continuado en el desarrollo de nuevos compuestos para su utilización en sistemas que producen señales para la detección de analitos. El desarrollo de un sustituto del ANS que proporcione un producto de reacción que no esté sujeto a desviaciones durante la detección tendrá un interés especial.
Literatura relevante
Las patentes de interés incluyen: 4.935.346; 4.962.040; 5.453.360; 5.563.031; 5.776.719 y 5.922.530. También tiene interés: Kosower & Kanety, "Intramolecular Dono-Acceptor Systems. 10. Multiple Fluorescentes from 8-(fenilami-na)-1-naftalenosulfonatos," J. Am. Chem. Soc. (1983) 105: 6236-6243.
Sumario de la invención
Se proporcionan procedimientos y análogos del ANS para su utilización como se define en las reivindicaciones adjuntas. Los análogos del ANS reaccionan con el hidrocloruro de 3-metil-2-benzotiazolinona hidrazona (MBTH) o sus análogos, por ejemplo MBTHSB, para producir un producto de reacción que muestre una desviación reducida comparada con los productos de reacción del ANS y MBTH, e incluso con los análogos del MBTH. Los análogos del ANS del objeto se encuentran más caracterizados por tener al menos un sustituyente que no es hidrógeno presente en su mitad fenílica. Los análogos del objeto se pueden utilizar en una gama de aplicaciones, siendo especialmente aptos para su utilización en ensayos de detección de analitos, tales como los ensayos de detección de glucosa.
Descripción de las formas de realización específicas
El objeto de la invención proporciona nuevos análogos del ANS del objeto como se define en la reivindicación 1. Estos análogos del ANS del objeto se caracterizan por tener al menos presente un sustituyente isopropilo o terc-butilo en sus mitades fenólicas. La presencia de este sustituyente isopropilo o terc-butilo proporciona una reducción de la desviación (como se define más adelante) en el producto de reacción de los análogos del objeto con MBTH (o sus análogos). También se proporcionan procedimientos de utilización de los análogos del ANS del objeto en ensayos de detección analítica, por ejemplo ensayos de detección de glucosa. Cuando se describe el objeto de la invención, los análogos del objeto se describen primero, seguidos por una discusión de los procedimientos de utilización de los análogos del objeto en ensayos de detección de analitos.
Antes de describir el objeto de la invención más en detalle, se tiene que entender que la invención no se limita a las formas de realización particulares de la invención descritas a continuación, ya que se pueden llevar a cabo variaciones de las formas de realización particulares y sin embargo éstas pueden caer dentro del ámbito de las reivindicaciones adjuntas. También se tiene que entender que la terminología empleada tiene por objeto describir las formas de realización particulares y no tiene por objeto limitarlas. Sin embargo, el alcance de la presente invención se establece en las reivindicaciones adjuntas.
En esta memoria y en las reivindicaciones adjuntas, las referencias singulares incluyen el plural, a no ser que el contexto indique claramente lo contrario. A menos que se defina de otro modo, todos términos técnicos y científicos utilizados aquí tienen el mismo significado que el que entienden comúnmente las personas con conocimientos normales en la materia a la que pertenece esta invención.
Análogos del ANS
La invención proporciona nuevos análogos del ANS. Los análogos del ANS del objeto se caracterizan en que pueden reaccionar con MBTH, o sus análogos, en presencia de un agente oxidante, una peroxidasa y oxígeno para producir un producto de reacción cromogénico, específicamente azul, que muestra una reducida desviación. Se entiende por "desviación reducida" que los productos de reacción producidos por combinación de los análogos del ANS del objeto con MBTH (o un análogo de éste) tiene mayor estabilidad de lectura comparada con la lectura inexacta observada en la reacción del ANS con MBTH, o su mismo análogo MBTH, donde la desviación se mide durante un periodo mayor de 2 minutos a partir del inicio de la reacción. Véase la sección experimental, infra, para un protocolo detallado de la desviación de la lectura medida. La desviación leída de los productos de reacción producidos por los análogos del objeto se reduce en al menos un 35% aproximadamente, normalmente en al menos un 60% y en muchas formas de realización en al menos un 80%. Además, la intensidad del color proporcionado por los productos de reacción producidos por los análogos del objeto es con frecuencia mayor que el observado para el ANS en muchas formas de realización de la invención del objeto, donde cuando la intensidad del color es mayor, la intensidad del color puede ser al menos un 5% mayor, normalmente al menos aproximadamente un 20% y en muchas formas de realización al menos un 35% mayor aproximadamente. La intensidad del color se determina según el protocolo proporcionado en la sección experimental, infra.
Los análogos del ANS del objeto se caracterizan por tener al menos un sustituyente isopropilo o terc-butilo presente en sus mitades fenílicas. El número de sustituyentes isopropilo y/o terc-butilo presentes en la mitad fenílica puede variar desde 1 hasta 5, normalmente desde 1 hasta 3 y más normalmente 1 ó 2. Generalmente, los sustituyentes isopropilo y/o terc-butilo reducirán las tendencias de agregación del producto colorante por el análogo con MBTH (o sus análogos).
Los análogos del objeto se describen por la fórmula estructural:
1
en la que:
n es un número entero de 1 a 5, normalmente de 1 a 3 y más normalmente 1 ó 2;
y cada X es independiente
Son de particular interés los siguientes análogos del ANS: 8-(4'-terc-butilfenil)amino-1-naftalenosulfonato; 8-(4'-isopropilfenil)amino-1-naftalenosulfonato; 8-(2'-terc-butilfenil)amino-1-naftalenosulfonato; y 8-(3',5'-di-terc-butilfenil)amino-1-naftalenosulfonato.
Son de interés los análogos del objeto en su forma ácida o en su forma salina, donde los cationes presentes en la forma salina incluyen: amonio, sodio, potasio, calcio, magnesio y similares.
Los anteriormente descritos análogos del ANS de la invención del objeto se pueden preparar utilizando algún protocolo conveniente, donde los protocolos adecuados representativos se proporcionan en la sección experimental, infra.
Utilidad
Los compuestos del ANS del objeto (bien en su forma ácida o en su forma salina) se utilizan en una variedad de diferentes aplicaciones como indicadores de la presencia de agentes oxidantes. En otras palabras, los análogos del objeto se utilizan como miembros reactivos de sistemas que producen señales que detectan la presencia de agentes oxidantes. Los agentes oxidantes que se pueden detectar utilizando sistemas que producen señales que incluyen los análogos del objeto, incluyen: peróxidos, por ejemplo el peróxido de hidrógeno, peróxido de hidrógeno de cumeno, peróxido de hidrógeno de urea, peróxido de benzoilo; perboratos, por ejemplo sodio, potasio, etc.
Los análogos del objeto son particularmente apropiados para su utilización como reactivos en sistemas que producen señales diseñados para detectar la presencia de un analito en una muestra, normalmente una muestra fisiológica, por ejemplo sangre o un producto de la sangre derivado de la sangre entera. Los analitos de interés que se pueden detectar utilizando sistemas que producen señales, que incluyen los análogos del objeto, incluyen: glucosa, colesterol, ácido úrico, alcoholes (por ejemplo metanol, etanol), formaldehído, glicerol-3-fosfato, y similares. Es de interés particular la utilización de los análogos del objeto en sistemas que producen señales diseñados para detectar la presencia de glucosa en una muestra fisiológica, particularmente sangre entera.
Los sistemas de producción de señales de los que los análogos del objeto son miembros, también incluyen típicamente: una oxidasa, una peroxidasa y un segundo miembro de una pareja de colorantes (en el que uno de los análogos del ANS del objeto es el primer miembro). La oxidasa que se encuentra presente en el sistema productor de señales se elige generalmente según la naturaleza del analito a detectar, donde las oxidasas apropiadas incluyen: glucosa oxidasa, colesterol oxidasa, uricasa, alcohol oxidasa, aldehido oxidasa, glicerofosfato oxidasa y similares. Las peroxidasas que pueden ser miembros de un sistema productor de señales incluyen: peroxidasa del rábano, otras enzimas y análogos sintéticos que tienen actividad peroxidativa u oxidantes químicos y similares. Véase por ejemplo, Y. Ci, F. Wang; Analytica Chimica Acta, 233 (1990), 299-302.
El segundo miembro de una pareja de colorantes del sistema productor de una señal, del que los análogos del ANS del objeto son el primer miembro, es generalmente MBTH o un análogo de éste. Los análogos del MBTH apropiados, que se pueden emplear como miembros del sistema de producción de señales del objeto, incluyen los descritos en las patentes de Estados Unidos números: 5.922.530, 5.776.719, 5.563.031, 5.453.360 y 4.962.040. Los siguientes análogos del MBTH tienen un interés particular: meta[3-metil-benzotiazolinona hidrazona]N-sulfonil bencenosulfonato monosódico (MBTHSB), hidrocloruro de 3-metil-2-benzotiazolinona hidrazona (MBTH), 3-metil-6-(sulfonato sódico)bezotiazolinona-2-hidrazona, 6-hidroxi-3-metil-2-benzotiazolinona hidrazona, 4-hidroxi-3-metil-2-benzotiazolinona hidrazona y 6-carboxil-3-metil-2-benzotiazolinona hidrazona.
Cuando se detecta un analito utilizando un sistema de producción de señales al que pertenecen los análogos del objeto, particularmente los miembros de una pareja de colorantes tal como se ha expuesto anteriormente, en una muestra sospechosa de comprender el analito de interés (es decir, el analito objetivo), normalmente una muestra biológica, por ejemplo sangre entera o un producto derivado de la sangre, lo contactan los miembros del sistema productor de señales, bien secuencialmente o bien simultáneamente. La presencia de analitos resulta en la producción de especies oxidantes, como el peróxido de hidrógeno, y se produce un producto de reacción cromogénica por enlace covalente de los dos miembros de la pareja de colorantes del sistema productor de una señal descrito anteriormente. El producto de reacción cromogénica es generalmente un producto de reacción azul, que se caracteriza por una baja desviación en ciertas configuraciones de ensayos (por ejemplo, la configuración del ensayo de SureStep®) tal como se ha descrito anteriormente. La presencia de un producto cromogénico se relaciona, por lo tanto, con la presencia de un analito en la muestra inicial, donde se pueden llevar a cabo determinaciones cuantitativas o cualitativas de la cantidad de analito en la muestra original.
Los sistemas productores de señales que comprenden los análogos del objeto son particularmente apropiados para su utilización en dispositivos de ensayos de detección de analitos, en los que los miembros del sistema productor de una señal se encuentran presentes en una base porosa, por ejemplo una tira en la que se coloca la muestra y desde la que se lee la señal. Los dispositivos representativos en los que se utilizan los análogos del objeto son los descritos en los documentos con número: 4.734.630; 4.900.666; 4.935.346; 5.059.394; 5.304.468; 5.306.623; 5.418.142; 5.426.032; 5.515.170; 5.526.120; 5.563.042; 5.620.863; 5.753.429; 5.573.452; 5.780.304; 5.789.255; 5.843.691; 5.846.486 y similares.
Los siguientes ejemplos ofrecen una forma de ilustración y no una forma de limitación.
Parte experimental I. Síntesis de los análogos del ANS A. Sal 4'-terc-butil ANS de amonio
Ácido 8-amino-1-naftalenosulfónico (1,53 g), 4'-terc-butil anilina (3,60 g) y sal 2,6-dietilanilina-HCl (0,95 g) se mezclaron en un recipiente de teflón y éste se sello después de purgarlo con N_{2}. El recipiente se introdujo en una bomba Parr, la bomba se dejó dentro de un horno y se calentó a 165ºC durante 18 horas. La mezcla se volvió a agitar y calentar durante otras 15 horas. Después de que se completara la reacción, la bomba se enfrió en un baño de hielo. La mezcla se introdujo en un vaso de precipitados y se disolvió en acetato de etilo. La purificación se llevó a cabo por cromatografía (una columna empaquetada en silica gel 60 GF_{254}) con acetato de etilo como eluyente. Preparación de la sal 4'-terc-butil ANS de amonio: se disolvió 4'-terc-butil ANS en una mezcla de disolventes formada por etanol y acetato de etilo. Se añadió una disolución acuosa de NH_{4}OH al compuesto y se evaporó el disolvente para producir unos sólidos cristalinos de color amarillo claro. Se eliminaron las impurezas de color rojo oscuro enjuagando el producto sólido con etanol.
B. Sal 4'-isopropil ANS de amonio
Ácido 8-amino-1-naftalenosulfónico (1,53 g), 4'-isopropilanilina (3,60 g) y sal 2,6-dietilanilina-HCl (0,95 g) se mezclaron en un recipiente de teflón y éste se sello después de purgarlo con N_{2}. El recipiente se introdujo en una bomba Parr, la bomba se dejó dentro de un horno y se calentó a 165ºC durante 18 horas. La mezcla se volvió a agitar y calentar durante otras 15 horas. Después de que se completara la reacción, la bomba se enfrió en un baño de hielo. La mezcla se introdujo en un vaso de precipitados con la ayuda de enjuagues de 2-propanol. (Normalmente, se observa una cantidad significativa de producto cristalino que se podría recristalizar en su correspondiente sal de amonio). La purificación se llevó a cabo por cromatografía (una columna empaquetada con silica gel 60 GF_{254}) con acetato de etilo como eluyente. Preparación de la sal 4'-isopropil ANS de amonio: se disolvió 4'-isopropil ANS en una mezcla de disolventes formada por etanol y acetato de etilo. Se añadió una disolución acuosa de NH_{4}OH al compuesto y se evaporó el disolvente para producir unos sólidos cristalinos de color amarillo claro. Se eliminaron las impurezas de color rojo oscuro enjuagando el producto sólido con etanol.
C. Sal 2'-terc-butil ANS de amonio
Ácido 8-amino-1-naftalenosulfónico (1,53 g), 2'-terc-butil anilina (3,60 g) y sal 2,6-dietilanilina-HCl (0,95 g) se mezclaron en un recipiente de teflón y éste se sello después de purgarlo con N_{2}. El recipiente se introdujo en una bomba Parr, la bomba se dejó dentro de un horno y se calentó a 195ºC durante 48 horas. La mezcla se volvió a agitar y calentar durante otras 48 horas. Después de que se completara la reacción, ésta se enfrió en un baño de hielo. La mezcla se introdujo en un vaso de precipitados y se disolvió en acetato de etilo. La purificación se llevó a cabo por cromatografía (una columna empaquetada en silica gel 60 GF_{254}) con acetato de etilo como disolvente. Preparación de la sal 2'-terc-butil ANS de amonio: se disolvió 2'-terc-butil ANS en una mezcla de disolventes formada por etanol y acetato de etilo. Se añadió una disolución acuosa de NH_{4}OH al compuesto y se evaporó el disolvente para producir unos sólidos cristalinos de color amarillo claro. Se eliminaron las impurezas de color rojo oscuro enjuagando el producto sólido con etanol.
D. Sal 3',5'-di-terc-butil ANS de amonio
Ácido 8-amino-1-naftalenosulfónico (1,53 g), 3',5'-di-terc-butil anilina (3,80 g) y sal 2,6-dietilanilina-HCl (0,95 g) se mezclaron en un recipiente de teflón y éste se sello después de purgarlo con N_{2}. El recipiente se introdujo en una bomba Parr, la bomba se dejó dentro de un horno y se calentó a 190ºC durante 34 horas. La mezcla se volvió a agitar y calentar durante otras 24 horas. Después de que se completara la reacción, la bomba se enfrió en un baño de hielo. La mezcla se introdujo en un vaso de precipitados y se disolvió en acetato de etilo. La purificación se llevó a cabo por cromatografía (una columna empaquetada en silica gel 60 GF_{254}) con acetato de etilo como disolvente. Preparación de la sal (3',5'-di-terc-butil) ANS de amonio: se disolvió (3',5'-di-terc-butil) ANS en una mezcla de disolventes formada por etanol y acetato de etilo. Se añadió una disolución acuosa de NH_{4}OH al compuesto y se evaporó el disolvente para producir unos sólidos cristalinos de color amarillo claro.
II. Pruebas de los análogos del ANS
Los anteriormente análogos del ANS sintetizados se probaron de la siguiente forma:
A. Preparación de las tiras de prueba
La parte porosa de una membrana de polisulfona de 0,35 \mum (matriz de reacción - obtenida de U. S. Filter, San Diego, CA) se sumerge en el baño acuoso que aparece en la tabla 1 hasta que queda saturada. Se saca del baño y el exceso de reactivo se estruja con una barra de vidrio. A continuación la tira se cuelga dentro de un horno de recirculación de aire a 56ºC durante 10 minutos. Después de ese tiempo la tira se saca del horno y se sumerge en el baño orgánico descrito en la tabla 2 hasta que esté saturada. A continuación se seca de nuevo como en el paso previo. La tira que resulta de este proceso queda con la forma deseada para las pruebas.
2 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
3
B. Pruebas
Las configuraciones de las tiras de SureStep® se utilizaron para las pruebas de la respuesta a la glucosa. Las pruebas se llevaron a cabo en una habitación a 35ºC con un 50% de humedad relativa. Los datos de reflectancia se recogieron de los contadores de SureStep® modificados. Las muestras de sangre se ajustaron normalmente a 120 mg/dL de glucosa en la sangre entera.
4 
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 \begin{minipage}{145mm} K/S = K/S es una medida de la
reflectancia, discutida y definida en el documento USP 4.935.346,
col. 14, lo que se incluye en este punto como
referencia\end{minipage} \cr  K/S Max. = valor máximo del K/S
durante los 2 minutos de medida\cr  % K/S = [(K/S max. del
análogo)/(K/S max. del ANS)] x 100\cr  60s K/S = K/S @ 660 nm tomado
60 seg después de la aplicación de sangre en la tira\cr  %
desviación = [(K/S max.-60s K/S)/(K/S max)] x
100\cr}
III. Resultados
Se ha encontrado que cuando los análogos del ANS de la invención del objeto se emplean en un ensayo de glucosa como se describe en II, supra, se observa una disminución de la desviación en el producto colorante, comparado con los sistemas en los que se emplea el ANS. Además, la intensidad del color se incrementa por comparación con los sistemas en los que se emplea el ANS. Finalmente, se encontró que el 4'-terc-butil ANS completa más rápidamente la reacción que el ANS o los otros análogos del ANS que se probaron.
A partir de los anteriores resultados y de la discusión, es evidente que la invención del objeto proporciona varias ventajas en comparación con el ANS cuando se utiliza un sistema que produce una señal que además incluye MBTH (o análogos de éste). Estas ventajas incluyen una reducida desviación y un incremento en la intensidad del color. Además, los análogos del objeto son apropiados para utilizarse con un mayor rango de análogos del MBTH que del ANS. De esta forma la invención del objeto representa una contribución significativa a la técnica.
La citación de cualquier publicación es para su divulgación anterior a la fecha de solicitud de la presente invención y no se debe interpretar como una admisión de que la presente invención no tiene el derecho de preceder a tal publicación en virtud de invención previa.
Aunque la anteriormente citada invención se ha descrito en algunos detalles por medio de ilustraciones y ejemplos, con el objeto de clarificar el conocimiento, es fácilmente aparente para aquellos con conocimientos normales en la materia, en la línea de esta invención, que ciertos cambios y modificaciones pueden llevarse a cabo en ella sin salir del alcance de las reivindicaciones anexas.

Claims (7)

1. Un análogo del 8-(anilino)-1-naftalenosulfonato (ANS) descrito por la fórmula:
5
En la que:
N es de 1 a 5; y
X es independientemente isopropilo o terc-butilo,
y en la que el análogo de ANS es capaz de reaccionar con hidrocloruro de 3-metil-2-benzotiazolinona hidrazona (MBTH), o uno de sus análogos, para producir un producto colorante que tiene una desviación reducida en al menos aproximadamente un 35% comparado con el producto colorante producido en al reacción del ANS y MBTH, o uno de sus análogos.
2. Un análogo del 8-(anilino)-1-naftalenosulfonato (ANS) de la reivindicación 1, que es 8-(4'-terc-butilfenil)amino-1-naftalenosulfonato.
3. Un análogo del 8-(anilino)-1-naftalenosulfonato (ANS) de la reivindicación 1, que es 8-(4'-isopropilfenil)amino-1-naftalenosulfonato.
4. Un análogo del 8-(anilino)-1-naftalenosulfonato (ANS) de la reivindicación 1, que es 8-(2'-terc-butilfenil)amino-1-naftalenosulfonato.
5. Un análogo del 8-(anilino)-1-naftalenosulfonato (ANS) de la reivindicación 1, que es 8-(3',5'-di-terc-butilfenil)amino-1-naftalenosulfonato.
6. Un procedimiento para producir un producto de reacción cromógeno, dicho procedimiento comprende:
hacer reaccionar un compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 con MBTH, o uno de sus análogos, en presencia de oxígeno, peróxido de hidrógeno y peroxidasa.
7. El uso de MBTH, o uno de sus análogos, y un compuesto de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 como colorante de acoplamiento para detectar la presencia de un analito en una muestra.
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