JPH04202164A - 被酸化性呈色試薬 - Google Patents

被酸化性呈色試薬

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JPH04202164A
JPH04202164A JP2329550A JP32955090A JPH04202164A JP H04202164 A JPH04202164 A JP H04202164A JP 2329550 A JP2329550 A JP 2329550A JP 32955090 A JP32955090 A JP 32955090A JP H04202164 A JPH04202164 A JP H04202164A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［発明の利用分野］ 本発明は、新規なｐ−フルオロアニリン誘導体又はその
塩、及びこれを発色成分として用いる酸化性物質又はペ
ルオキシダーゼ様物質の定量方法に関する。
［発明の背景コ 生体成分、例えば血液や尿などの体液成分を測定するこ
とは、その変動が疾病と大きく関連しているため、疾患
の診断、病態の解明、治療経過の判定を行う上で、必須
なものとなっている。例えば、血液中のコレステロール
、トリグリセライド、グルコース、尿酸、リン脂質、胆
汁酸、モノアミンオキシダーゼ等を初め、非常に多種類
の微量成分の測定法が開発されており、疾病の診断上役
立っていることは周知の通りである。
現在、血清成分の測定法としては、それが酵素以外のも
のである場合には、目的成分に特異的に作用する酵素を
用い、また、目的成分が酵素の場合には、その基質とな
るべき化合物を用いて、夫々酵素反応を行い、これによ
る生成物、を測定して目的成分量を求める、所謂″酵素
法″が一般的に広く普及している。中でも、過酸化水素
生成酵素、例えばオキシダーゼを働かせて目的成分に相
当する過酸化水素を生成させ、これをペルオキシダーゼ
、及び発色成分である被酸化性呈色試薬を用いて発色系
に導き、その呈色を比色定量することにより目的成分量
を求める方法が、被酸化性呈色試薬の開発と相まって増
加しつつある。例えば、コレステロール−コレステロー
ルオキシダーゼ、トリグリセライド−リボプロティンリ
パーゼ−グリセロールオキシダーゼ、尿酸−ウリカーゼ
等の組み合わせで発生する過酸化水素を、ペルオキシダ
ーゼ（ＰＯＤ）及び被酸化性呈色試薬を用いて発色系に
導き、その呈色の吸光度を測定することにより目的成分
量を求める方法がそれである。この方法に於いて用いら
れる発色成分である被酸化性呈色試薬の代表的なものと
しては、４−アミノアンチピリン又はその誘導体とフェ
ノール系化合物又はＮ、Ｎ−ジ置換アニリン系化合物と
を組み合わせた被酸化性呈色試薬、３−メチルベンゾチ
アゾリノンヒドラゾン（ＭＢＴＨ）とアニリン系化合物
との組み合わせ試薬、２，２′−アジノビス（３−エチ
ルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）、
トリフェニルメタン系ロイコ色素、ベンジジン誘導体、
ｏ−）リジン誘導体、トリアリルイミダゾール誘導体、
０−フェニレンジアミン等が挙げられる。
しかしながら、これらの呈色試薬に於いては、種々の問
題点、例えば、生成する色素が血清成分の影響により退
色する、吸収極大が短波長域にあるため測定試料中の有
色成分、例えば血清や尿中のヘモクロビンやビリルビン
等の影響を受は易く測定値の信頼性に乏しい、分子吸光
係数が小さいために測定感度が低く限られた測定対象物
にしか利用できない等の問題点があり、必ずしも満足で
きるものではなかった。
このような問題点を解決すべく、アニリン誘導体にフル
オロ基を導入したＰ−フルオロアニリン誘導体が開発さ
れている（特開昭６０−２４３０５０号公報等）。しか
しながら、これら既存のＰ−フルオロアニリン誘導体か
ら生成する色素は、血清成分の影響による退色現象は若
干改善されているものの、吸収極大が比較的短波長域に
あるため測定試料中の有色成分、例えば血清や尿中のヘ
モクロビンやビリルビン等の影響を受は易く測定値の信
頼性に乏しいという問題点は依然として解消されておら
ず、更なる改良が望まれている状況にある。
［発明の目的コ 本発明は、上記した如き状況に鑑みなされたもので、血
清等の生体体液中の共存成分の影響に基づく退色が殆ど
なく、測定感度が高く且つ吸取極大が長波長側にある色
素を生成し得る被酸化性呈色試薬のカップリング成分と
して有用なＰ−フルオロアニリン誘導体又はその塩、及
び該化合物を発色成分として用いる酸化性物質及びペル
オキシダーゼ様物質の精度の高い測定法を提供すること
にある。
［発明の構成コ 本発明は、−形成［Ｉコ （式中、Ｒ１及びＲ２は夫々独立して水素原子、アルケ
ニル基又は置換基を有していてもよいアルキル基を表わ
し、Ｒ３及びＲ４は夫々独立してアルコキシ基、アルケ
ニル基、水酸基、ハロゲン原子、スルホン酸基、カルボ
キシル基、ニトロ基、アリール基又は置換基を有してい
てもよいアルキル基を表わし、Ｒ５及びＲ６は夫々独立
して水素原子、アルコキシ基、アルケニル基又は置換基
を有していてもよいアルキル基を表わす。また、Ｒ１と
Ｒ２、Ｒ３とＲ５、Ｒ４とＲ６とが夫々結合して環を形
成していてもよい。） で示されるｐ−フルオロアニリン誘導体又はその塩、及
び該化合物を被酸化性呈色試薬のカップリング成分とし
て用いる酸化性物質並びにペルオキシダーゼ様物質の定
量方法の発明である。
本発明者らは、所謂”酵素法”に於いて広く用いられて
いる種々の被酸化呈色試薬が有する上記した如き問題点
を解決すべく鋭意研究の途上、アニリン系化合物に弗素
原子を導入したＰ−フルオロアニリン系化合物の内、更
に３位と５位とに置換基が導入された化合物を４−アミ
ノアンチピリン等と組み合わせたものを被酸化性呈色試
薬として用いた場合には、弗素原子の導入されていない
アニリン系化合物或は３位と５位との少なくとも一方に
は置換基が導入されていないＰ−フルオロアニリン誘導
体を使用した場合に比較して、生じる色素の極大吸取が
長波長側となり、しかも該色素は血清等の生体体液中の
共存成分の影響に基づく退色が殆どないと言う性質を有
していることを見出し本発明を完成するに至った。
一般式［１］で示される本発明のＰ−フルオロアニリン
誘導体に於いて、Ｒ１及びＲ２としては、夫々独立して
水素原子、例えばエチニル基（ビニル基）、１−プロペ
ニル基、２−プロペニル基（アリル基）、イソプロペニ
ル基、２−ブテニル基等の炭素数２〜４の低級アルケニ
ル基又は例えばメチル基、エチル基、プロピル基、ブチ
ル基、アミル基等の炭素数１〜５の置換基を有していて
もよいアルキル基（直鎖状、分枝状の何れにても可）が
挙げられ、アルキル基の置換基としては、水酸基、例え
ばメトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、ブトキシ基
、アミルオキシ基等の炭素数１〜５のアルコキシ基（直
鎖状、分枝状の何れにても可）、スルホ基、カルボキシ
ル基、アミノ基、アミド基、例えばアセトアミド基、プ
ロピオンアミド基等の置換アミド基、例えばアセチル基
、プロピオニル基、ブチリル基等のアシル基、例えばア
セチルオキシ基、エチルカルボニルオキシ基等のアシル
オキシ基等が挙げられる。また、これら置換基はアルキ
ル基に複数種、複数個導入されていてもよく、更にこれ
ら置換基のうち、スルホ基、カルボキシル基等は＠（例
えば、リチウム、すトリウム、カリウム等のアルカリ金
属との塩、アンモニウム塩等）を形成していてもよいし
、アミン基は鉱酸塩（例えば塩酸塩、硫酸塩等）や有機
酸塩（例えば酢酸塩、プロピオン酸塩等）を形成してい
てもよい。尚、Ｒ１とＲ２とが互いに結合してＮとＲ１
とＲ２とで例えばモルホリン環、ピペラジン環、ピペリ
ジン環の如き環を成していてもよい。
Ｒ３及びＲ４としては、夫々独立して例えばメトキシ基
、エトキシ基、プロポキシ基、ブトキシ基。
アミルオキシ基等の炭素数１〜５のアルコキシ基（直鎖
状、分枝状の何れにても可）、例えばエチニル基（ビニ
ル基）、１−プロペニル基、２−プロペニル基（アリル
基）、インプロペニル基、２−ブテニル基等の炭素数２
〜４の低級アルケニル基、水酸基１例えば沃素、塩素、
臭素、弗素等のハロゲン原子、スルホ基、カルボキシル
基、ニトロ基、例えばフェニル基、ナフチル基、トリル
基、フルオロフェニル基、フロロフェニル基、ブロモフ
ェニル基、ヨードフェニル基、メトキシフェニル基、ヒ
ドロキシフェニル基等のアリール基又は置換アリール基
、又は例えばメチル基、エチル基、プロピル基、ブチル
基、アミル基等の炭素数１〜５の置換基を有していても
よいアルキル基が挙げられ、アルキル基の置換基として
は、例えば沃素、塩素。
臭素、弗素等のハロゲン原子、水酸基等が・挙げられる
。これらの置換基のうちスルホ基、カルボキシル基等は
塩（例えば、リチウム、ナトリウム。
カリウム等のアルカリ金属との塩、アンモニウム塩等）
を形成していてもよい。
Ｒ５及びＲ６としては、夫々独立して水素原子、例えば
メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基。
ブトキシ基、アミルオキシ基等の炭素数１〜５のアルコ
キシ基（直鎖状、分枝状の何れにても可）、例えばエチ
ニル基（ビニル基）、１−プロペニル基。
２−プロペニル基（アリル基）、イソプロペニル基。
２−ブテニル基等の炭素数２〜４の低級アルケニル基、
水酸基、例えば沃素、塩素、臭素、弗素等のハロゲン原
子又は例えばメチル基、エチル基、プロピル基、ブチル
基、アミル基等の炭素数１〜５の置換基を有していても
よいアルキル基が挙げられ、アルキル基の置換基として
は、例えばメトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、ブ
トキシ基。
アミルオキシ基等の炭素数１〜５のアルコキシ基（直鎖
状、分枝状の何れにても可）等が挙げられる。尚、Ｒ３
とＲ５、或はＲ４とＲ６とが互いに結合して芳香環を形
成していてもよい。
本発明のｐ−フルオロアニリン誘導体は例えば塩酸、硫
酸等の鉱酸や例えば酢酸、プロピオン酸等の有機酸と塩
を形成していてもよい。
一般式［Ｔ］で示される本発明のＰ−フルオロアニリン
誘導体は例えば以下のようにして容易に合成し得る。尚
、以下の合成法は、全てＲ１及びＲ２が水素原子以外の
場合についてのものである。
即ち、例えば一般式［ＩＩ］ （式中、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６は前記に同じ。）で
示される化合物（以下、化合物■と略記する。）と、化
合物■１モルに対して１〜３モル、好ましくは１〜１．
２モルの一般式［■コ Ｘ−ＣＯＲ’［ｍコ （式中、Ｘはハロゲン原子を表わし、Ｒ′はアルキル基
を表わす。） で示される化合物とを、例えばメタノール、エタノール
、イソプロパツール等のアルコール類、例えば１，４−
ジオキサン、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）等の環状エ
ーテル類等の溶媒或はこれらに水を混したものに溶解し
、これに例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水
酸化カルシウム等の苛性アルカリ、例えば炭酸ナトリウ
ム、炭酸カリウム。
炭酸カルシウム等の炭酸アルカリを化合物■１当量に対
して１〜３当量、好ましくは１〜１．５当量添加しく添
加する際には水溶液としたものを用いてもよい。）−０
〜１２０℃、好ましくは１０〜１００℃で数時間乃至数
十時間反応させた後、常法により精製して、先ず一般式
［■コ （式中、Ｒ′、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６は前記に同じ
。） で示される化合物（以下、化合物■と略記する。）を得
る。
次に、化合物■に、化合物■１モルに対して１〜３モル
、好ましくは１〜１．２モルの一般式［ ％式％［］ （式中、Ｘ′はハロゲン原子を表わし、Ｒ２は前記に同
じ。） で示される化合物を、上記した反応と同様の反応条件、
即ち、アルコール系溶媒、１，４−ジオキサン。
ＴＨＦ等の溶媒中、１０〜１００°Ｃで数時間乃至数十
時間反応させた後、常法により精製を行えば、一般式［
■］ （式中、Ｒ″、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６は前記
に同じ。） で示される化合物（以下、化合物■と略記する。）が得
られる。
次いで、化合物■と、化合物■１モルに対して１〜３モ
ル、好ましくは１〜１．２モルの例えばＮ−フルオロピ
リジニウム坂（例えばＮ−フルオロ−２，４，６−ドリ
メチルビリジニウム　トリフレート、　Ｎ−フルオロピ
リジニウム　トリフレート、Ｎ−フルオロ−３，５−ジ
クロロピリジニウム　トリフレート等）等の弗素化剤と
を、例えばベンゼン、トルエン等の芳香族炭化水素類、
例えばジエチルエーテル。
ジイソプロピルエーテル、　ＴＨＦ、　１．４−ジオキ
サン等のエーテル類、例えばクロロホルム、ジクロロメ
タン、１，２−ジクロロエタン等のハロゲン化炭化水素
、ジメチルホルムアミド等の溶媒（何れも乾燥したもの
が望ましい。）中、０〜１５０℃、好ましくは２０〜１
２０℃で、数時間乃至数十時間反応させた後、常法によ
り精製することにより、一般式［ （式中、Ｒ″、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６は前記
に同じ。） で示される化合物（以下、化合物■と略記する。）を得
る。
次いで、化合物■を例えばメタノール、エタノール等の
溶媒中、化合物■１モルに対して、１〜３モル、好まし
くは１〜１．２モルの例えば水酸化ナトリウム、水酸化
カリウム、ナトリウムメチラート、ナトリウムエチラー
ト等の無機又は有機のアルカリと、０〜１５０℃、好ま
しくは２０〜６０°Ｃで、１乃至数時間反応させた後、
常法により精製すれば、一般式［■］ （式中、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６は前記に同じ
。）　　′ で示される化合物（以下、化合物■と略記する。）が得
られる。
次いで、化合物■と、化合物１１モルに対して１〜３モ
ル、好ましくは１〜２モルの一般式［ＩＸ］Ｘ”−Ｒ１
［ＩＸコ （式中、Ｘ”はハロゲン原子を表わし、Ｒ１は前記に同
じ。） で示される化合物とを、例えばメタノール、エタノール
、イソプロパツール等のアルコール類や例えば１，４−
ジオキサン、　ＴＨＦ等の環状エーテル類或はこれらに
水を加えたもの等の溶媒中、例えば水酸化ナトリウム、
水酸化カリウム、水酸化カルシウム等の苛性アルカリ又
は例えば炭酸ナトリウム。
炭酸カリウム、炭酸カルシウム等の炭酸アルカリの存在
下、０〜１２０℃、好ましくは５０〜１００°Ｃで数時
間乃至数十時間反応させた後、常法により精製を行えば
、目的とする一般式［Ｉ］で示される本発明のｐ−フル
オロアニリン誘導体を得ることができる。
尚、上記の反応に於いて、一般式［■コで示される化合
物は、例えば以下のような方法によっても得ることがで
きるので、このような方法により得られたものを用いて
もよい。
即ち、Ｊ　、　Ｃｈ　ｅ　ｍ　、　Ｓ　ｏ　ｃ　、　、
用競、’　５５５４頁に記載の方法に準じて、相当する
フルオロベンゼン誘導体をニトロ化して、一般式［■′
］ （式中、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５及びＲ６は前記に同じ。）で
示される４−フルオロニトロベンゼン誘導体を得る。
次いで、この４−フルオロニトロベンゼン誘導体を接触
還元等、芳香族ニトロ化合物還元の常法に従って還元す
ることにより、−形成［Ｉ［”１（式中、Ｒ３、Ｒ４、
Ｒ５及びＲ６は前記に同じ。）で示される化合物（以下
、化合物■゛と略記する。
）とし、然る後、これに−形成［Ｖ］ Ｘ’−Ｒ２［Ｖコ （式中、Ｘ′及びＲ２は前記に同じ。）で示される化合
物を、前記、化合物■に一般式［Ｖ］で示される化合物
を反応させる条件と同様の反応条件で反応させれば、−
形成［■コで示される化合物を得ることができる。
また、本発明のＰ−フルオロアニリン誘導体は、例えば
−形成［Ｘコ に同じ。） で示される化合物を、前記、化合物■を弗素化して化合
物■とする場合と同様の反応条件で弗素化することによ
っても同様に得ることができる。
尚、−形成［Ｉ］のＲ１及びＲ２のうち少なくとも一方
が水素原子である化合物を合成する場合には、上記した
合成法に於ける各反応工程のうち、必要な工程のみを行
えば良いことは言うまでもない。
本発明のｐ−フルオロアニリン誘導体の製造に用いられ
る化合物■は、市販品がある場合にはそれをそのまま用
いれば良いし、市販品がない場合には、相当するベンゼ
ン誘導体を常法に従いニトロ化、還元してアニリン誘導
体としたものを用いれば良い。
また、化合物Ｘについても全く同様である。
本発明のＰ−フルオロアニリン誘導体又はその塩は、水
成は界面活性剤の溶存する緩衝液中で極めて安定である
が、これと４−アミノアンチピリン又はその誘導体、フ
ェニレンジアミン、ＭＢＴＨ等の発色主剤とを組み合わ
せたものを、酸化剤により酸化（例えばペルオキシダー
ゼの存在下過酸化水素により酸化）すると呈色安定性に
優れた色素を定量的に形成する。しかも、この色素は、
従来の３位又は５位のどちらか一方にしか置換基を有さ
ないＰ−フルオロアニリン誘導体を用いて同様の方法に
より生成させた色素に比べて、極大吸収が長波長側にあ
り、しかも血清や尿等の生体体液を試料とした場合に於
ける該体液中の共存成分の影響に基づく退色も殆どない
と言う優れた性質を有している。従って、本発明のＰ−
フルオロアニリン誘導体又はその塩は、酸化性物質の定
量やペルオキシダーゼ様物質の定量に於ける発色試薬の
カップリング成分として有効に用い得るが、とりわけ酵
素反応により生成した過酸化水素をペルオキシダーゼの
存在下発色系に導き、その呈色を比色定量することによ
り行う、例えば血清、血漿、尿等の生体試料中の微量成
分の定量に於ける発色試薬のカップリング成分として有
効に使用し得る。
即ち、本発明の酸化性物質の定量方法は、基質、又は酵
素反応により生成した物質に酸化酵素を作用させ生成す
る過酸化水素を定量することにより行う生体試料中の微
量成分、即ち基質又は酵素活性の測定方法として特に効
果的に使用し得る。
本発明の方法により測定可能な生体試料中の微量成分と
しては、例えばコレステロール、グルコース、グリセリ
ン、トリグリセライド、遊離脂肪酸、尿酸、リン脂質、
胆汁酸、モノアミンオキシダーゼ、グアナーゼ、コリン
エステラーゼ等が挙げられるが、これらに限定されるも
のではなく、酵素反応により生成する過酸化水素を定量
することにより測定が可能な生体成分は全て定量が可能
である。
本発明の測定法は、発色試薬（被酸化性呈色試薬）とし
て、例えば４−アミノアンチピリン又はその誘導体、フ
ェニレンジアミン、Ｍ　Ｂ　Ｔ　Ｈ等の発色主剤と本発
明のｐ−フルオロアニリン誘導体又はその塩とを組み合
わせたものを用いる以外は自体公知の酵素法（過酸化水
素生成酵素を用いる）による測定法に準じてこれを行え
ば足りる。
発色試薬としての使用濃度としては、特に限定されない
が、発色主剤が通常５０〜２００μｍｏｌ／１、好まし
くは１００〜１０００μｍｏｌ／１の濃度範囲で、本発
明のＰ−フルオロアニリン誘導体又はその塩は通常１０
０〜２０００μｍｏ１／１、好ましくは５００〜１００
０μｍｏｌ／１の濃度範囲で、適宜組み合わせて用いら
れる。
本発明の方法による生体成分の定量に於いて、過酸化水
素を生成させる酵素として用いられる酸化酵素（オキシ
ダーゼ）及びその他の目的で用いられる酵素類並びに酵
素反応に関与する基質及びその他の物質の種類及び使用
量は、被酸化性呈色試薬を用いる自体公知の生体成分の
定量方法に準じて夫々測定対象となる物質に応じて適宜
選択すればよい。また、本発明による過酸化水素の定量
に於いて用いられるペルオキシダーゼ又はペルオキシダ
ーゼ様物質としては、その起源、由来に特に限定はなく
、植物、動物、微生物から得られるペルオキシダーゼ又
はペルオキシダーゼ様物質が、１種若しくは要すれば２
種以上組み合わせて用いられる。また、その使用量は目
的に応じて適宜定められ、特に限定されない。
本発明の方法による生体成分の定量は、通常ＰＨ４，０
〜１０．０、好ましくはｐＨ８，０〜８．０で実施され
る。用いられる緩衝剤としては、リン酸塩、クエン酸塩
、ホウ酸塩、炭酸塩、トリス（ヒドロキシメチル）アミ
ノメタン、グツド（Ｇｏｏｄ）の緩衝剤等の通常この分
野で用いられる緩衝剤が挙げられるが、特に限定されな
い。
本発明のｐ−フルオロアニリン誘導体は、発色主剤と組
み合わせて過酸化水素、過沃素酸等の酸化性物質の定量
に有効に用い得るが、また、これと発色主剤及び過酸化
水素とを組み合わせることによりペルオキシダーゼ様物
質の定量を行うことも可能である。ペルオキシダーゼ様
物質としては、ペルオキシダーゼそのものの他、ヘモグ
ロビンその他のヘム化合物が挙げられる。
即ち、本発明のｐ−フルオロアニリン誘導体又はその塩
は、例えばペルオキシダーゼを標識化合物に用いた酵素
免疫測定法や血清中のヘモグロビンを過酸化水素若しく
は過硼素酸Ｎａの様な酸化性物質を用いて測定する場合
等にも有効に使用し得る。
尚、本発明はビライケミストリーへも応用が可能である
。
以下に実施例及び参考例を挙げ、本発明を更に詳細に説
明するが、本発明はこれらにより何ら限定されるもので
はない。
［実施例コ 実施例１．Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）
−３゜５−ジメチル−４−フルオロアニリン［本発明化
合物（１）コの合成 ３．５−ジメチル−４−フルオロベンゼン（コロンビア
・オルガニック・ケミカル社製）１２０ｇを一１０℃で
硝酸１２０ｍ１に１時間を要して溶解させた後、温度を
一１５℃として更に１時間撹拌、反応させた。
反応後、反応液を氷の上に注ぎ、析出した黄色品を濾取
し、これを常圧蒸留して３，５−ジメチル−４−フルオ
ロ−１−ニトロベンゼン４０ｇをｂｐＨｌ〜１１２℃の
留分として得た。
この３，５−ジメチル−４−フルオロ−１−二トロベン
ゼン１５ｇをメタノール３１に溶解し、窒素置換後パラ
ジウムカーボンＬｏｇを投入して水素ガスによる接触還
元を行った。反応後、不溶物を濾去し、濾液を濃縮して
３，５−ジメチル−４−フルオロアニリン１２．３ｇを
得た。
得られた３、５−ジメチル−４−フルオロアニリン１２
゜３ｇと２−クロロエタノール８１ｇとを、エタノール
１００ｍ１と２Ｎ　ＮａＯＨ水溶液６０ｍ１との混合液
に溶解した後、３時間還流下に反応させた。反応後、エ
タノールを留去し、残渣を酢酸エチルで抽出、抽出液を
水洗、乾燥後濃縮して、粗Ｎ−（２−ヒドロキシエチル
）−３，５−ジメチル−４−フルオロアニリン１４ｇを
得た。
次いで、これをイソプロパツール１００ｍ１に溶解し、
ヨードエタン１５ｇと炭酸カリウム２０ｇを加えて、５
時間還流、反応させた。反応後、溶媒を留去し、残渣を
酢酸エチルで抽出、抽出液を水洗、乾燥後濃縮して、目
的物の組体１６ｇを得た。これをカラムクロマトグラフ
ィ［充填剤；ワコーゲルＣ−３００（和光紬薬工業（株
）登録商標）、溶出溶媒；酢酸エチル二〇−ヘキサン＝
１：２］により精製し、油状のＮ−エチル−Ｎ−（２−
ヒドロキシエチル）−３，５−ジメチル−４−フルオロ
アニリン９．５ｇを得た。
Ｉ　Ｒ（Ｎｅａｔ）　　：　２９００−２９８０ｃｍ　
　’（Ｃ１（）、１６００ｃｍ−’（Ａｒｏｍ　ａｔｉ
ｃ　　ＣＨ）　、　　１５００ｃｍ−’（Ａｒｏｍａｔ
ｉｃ　　ＣＨ）　、　１２００ｃｍ−１（Ｃｏ）。
ｍ　ｐ　　：　３３（１−３３５°Ｃ０元素分析値（Ｃ
，。Ｈ，８ＰＮＯ） 計算値は）　：　Ｃ６８，２２、Ｈ８，５９、Ｎ　　６
．６３、実測値（χ）　：　Ｃ６８，６２、Ｈ８，７９
、Ｎ　　６．２４゜実施例２．Ｎ−エチル−Ｎ−（２−
ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキ
シ−４−フルオロアニリン（本発明化合物［２コ）の合
成 ３．５−ジメトキシアニリン（アルドリッチ社製）３４
．７ｇを１，４−シ゛′オキサン４５０ｍ１と水２３０
ｍ１との混合液に溶解し、０℃に冷却した後、ＩＮ　Ｎ
ａ０１１３９０ｍ１とクロル炭酸エチル３０ｇとを加え
、２０’Ｃで２０時間反応させた。反応終了後、ＩＮ　
ＨＣＩを用いて反応液を酸性にし、酢酸エチルで抽出し
た。得られた有機層を、水洗し、無水硫酸マグネシウム
で乾燥後、溶媒を留去した。次いで、得られた残渣を、
Ｔ　ＨＦ　３００ｍ１に溶解し、水酸化ナトリウム９　
、０７ｇとヨードエタン３５．４ｇを加えて、４０℃で
２時間撹拌反応させた。
反応後、反応液を濃縮し、残渣に水を加えた後、１．２
−ジクロルエタン５００ｍ１で抽出した。抽出液を無水
硫酸マグネシウムで充分乾燥した後、これにＮ−フルオ
ロ−２，４，６−ドリメチルピリジニウム　トリフレー
ト（小野田セメント（株＞ｍ）　６４．８ｇを加えて１
００℃で８時間撹拌反応させた。反応後、溶媒を留去し
、残液に水を加えた後、ジクロロメタンで抽出し、得ら
れた有機層を、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。乾燥
後、溶媒を留去し、得られた残液をメタノール２００ｍ
１に溶解し、ＩＮ水酸化ナトリウム水溶液２３０ｍ１を
加えて５０℃で２時間脱炭酸エステル化反応を行った後
、カラムクロマトグラフィ［充填剤；ワコーゲルＣ−３
００（和光紬薬工業（株）登録商標）、溶出溶媒：ヘキ
サン：酢酸エチル＝４　：　１］により処理し、Ｎ−エ
チル−３，５−ジメトキシ−４−フルオロアニリンを含
む両分を得た。この両分から溶媒を留去し、残渣を水２
４ｍ１とイソプロピルアルコール２４ｍ１の混合液に溶
解し、これにＩＮ　ＮａＯＨ２４ｍ１と３−クロロ−２
−ヒドロキシプロピルスルホン酸Ｎａ塩（東京化成（株
）製）　４．７ｇを加えて８０℃で５時間撹拌反応させ
た。反応後、溶媒を留去し、残渣をエーテルで洗浄後、
水から再結晶を行って、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロ
キシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシ−４
−フルオロアニリンの白色結晶６．５９ｇを得た。
■Ｒ（ＫＢｒ）　　：　３４００ｃｍ−’（ＣＨ）、３
０５０−２８００ｃｍ　’（Ｃ１＋＞、１２００ｃｍ−
’　（ＳＯ２）、１０５１０５Ｏ１（Ｃｏ）。
ｍｐ：２１０〜２１５℃。
元素分析値（Ｃ１３Ｈ１ｇＦＮＮａＯ４Ｓ）計算値（χ
）：Ｃ４７，７０，Ｈ５，８５、Ｎ　　４．２８、実測
値（ぶ）：Ｃ４７，３７、Ｈ５，６５、Ｎ　　４．０２
゜参考例１０本発明化合物の諸性質の測定（１）分子吸
光係数及び吸収極大（λｍａｘ）の測定（発色溶液） ５０ｍＭ　ピペラジン−Ｎ、Ｎ’−ビス（２−エタンス
ルホン酸）　（ＰＩＰＥＳ）−水酸化ナトリウム緩衝液
（ｐＨ７，０）に、本発明化合物を０．５ｍＭ、４−ア
ミノアンチピリンを０．５ｍＭ及びペルオキシダーゼを
Ｉ　Ｕ／ｍｌとなるように溶解したものを発色溶液とし
た。
（操作法） 所定の本発明化合物を用いて調製した発色溶液３ｍｌに
、１ｍＭの過酸化水素水２０μｍを添加し良く混合した
後、３７℃で５分間加温した。この反応液の吸収曲線を
測定し、そのλｍａｘ及びλｍａｘに於ける吸光度Ｅｓ
を求めた。
尚、吸収曲線及びλｍａｘを求める際の対照としては、
各々の発色溶液３ｍｌに精製水２０μｍを添加し良く混
合した後、３７℃で５分間加温したものを用いた。
また、分子吸光係数は、各発色溶液を用いて得られたＥ
ｓと、各発色溶液の代りに４−アミノアンチピリンとフ
ェノールを夫々５０ｍＭずつ及びペルオキシダーゼをＩ
　Ｕ／ｍｌ含む５０ｍＭ　ＰＩＰＥＳ−水酸化ナトリウ
ム緩衝液（ｐＨ７，０）を用いて、上記の操作法により
得られる５０５ｎｍに於ける吸光度Ｅ。Ｈとを用いて、
次式により求めた。
分子吸光係数＝（Ｅｓ÷ＥｏＨ）×５×１０３結果を表
１−１に示す。
（２）血清成分の影響の測定 （１）で調製した発色溶液３ｍｌに、正常プール人血清
２０μｍを添加混合し、次いで１ｍＭの過酸化水素水２
０μｍを添加混合したものを３７℃で５分間反応させて
、この反応液のλｍａｘに於ける吸光度Ｅｅｆを測定し
た。また、正常プール人血清の代りに精製水を用いて、
前記と同じ発色溶液を用いて同様の操作を行い、吸光度
Ｅ　ｓｔｄを得た。
これらの値を次式に代入して、血清成分の影響を調べる
指標となるａ値を求めた。
ａ＝（Ｅｅｆ÷Ｅ　５ｔｄ）　Ｘ　１００尚、血清成分
の影響は、ａ値を基に以下のように表わした。
ｍ：８（直がＯ〜１゜ ±：ａ値が１〜２゜ ＋十：ａ値が３以上。
結果を表１−１に併せて示す。
尚、表１−１中の本発明化合物３〜５は、実施例１又は
２に記載の操作法に準じて合成したものである。
また、比較のために、表１−２及び表１−３に既知のｐ
−フルオロアニリン誘導体について同様にして諸性質を
測定した結果を併せて示した。
表１−１、表１−２及び表１−３の結果から明らかな如
く、本発明の化合物は、分子吸光係数に於いてはフルオ
ロ基に隣接した置換基がない既知のｐ−フルオロアニリ
ン誘導体から生じる色素よりは明らかに高いものの、フ
ルオロ基に隣接した置換基がどちらか一方にある既知の
Ｐ−フルオロアニリン誘導体から生じる色素と比較する
と同等乃至やや低いが、極大吸収波長は既知のｐ−フル
オロアニリン誘導体から生じる色素のそれに比較して明
らかに長波長側にシフトしており、且つ既知のＰ−フル
オロアニリン誘導体に於いて若干問題となっていた血清
等の生体体液を試料とした場合に体液中の共存成分の影
響により生ずる色素の退色現象が殆ど認められないこと
が判る。
実施例３．過酸化水素の定量 （測定試液） ５０ｍＭ　ＰＩＰＥＳ−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ
７，０）に以下の試薬を所定濃度溶解したものを測定試
液とした。
４−アミノアンチピリン　　　　　０．５＋ｎｔ４本発
明化合物［２コ　　　　　　　０．５ｍＭペルオキシダ
ーゼ　　　　　　　４　Ｕ／ｍｌ（試料） 市販の過酸化水素水を蒸留水で適宜希釈して、１．０．
２．０．３．０．４．０及び５．０ｍＭ溶液としたもノ
ヲ試料とした。
（操作法） 測定試液３ｍｌに試料２０μｍを加えよく混合し、３７
℃で５分間加温後、５９５ｎｍの吸光度（Ｅｓ）を測定
した。
また、試料の代りにイオン交換水を用いて同様の操作を
行い盲検値（Ｅ　Ｂｌ）を測定した。
（結果） 測定結果を第１図に示す。
第１図から明らかな如く、横軸の各過酸化水素濃度に対
して得られた吸光度（Ｅｓ−ＥＢＩ）を縦軸に沿ってプ
ロットした点を結んだ検量線は良好な直線性を示し、本
発明の方法により過酸化水素を定量的に測定し得ること
が判る。
実施例４．血清成分による呈色安定性への影響の検討 （測定試液及び試料） 実施例３と同じものを使用した。
（操作法） 測定試液３ｍｌに正常ヒト血清又はイオン交換水５０μ
ｍを加えよく混合し、更に試料２０μｍを加えよく混合
し、３７℃で５分間加温後、５９５ｎｍの吸光度（Ｅｓ
）を測定した。
また、試料の代りにイオン交換水を用いて同様の操作を
行い盲検値（ＦＢＩ）を測定した。
（結果） 測定結果を表２に示す。
表２ 表２から明らかな如く、本発明のｐ−フルオロアニリン
誘導体と４−アミノアンチピリンとから生成する色素は
血清成分による影響を殆ど受けないことが判る。
実施例５．尿酸の定量 （測定試液） ５０ｍＭ　ＰＩＰＥＳ−水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ
７，０）に以下の試薬を所定濃度溶解したものを測定試
液とした。
４−アミノアンチピリン　　　　　０．５ｍＭ本発明化
合物［２コ　　　　　　　０．５ｍＭペルオキシダーゼ
　　　　　　　４０／ｍｌウリカーゼ　　　　　　　　
　　０．０５０／ｍｉ（試料） １０ｍｇ／ｄｌの尿酸を含有する標準液及びヒト血清５
検体を試料とした。
（操作法） 測定試液３ｍｌに試料２０μｍを加えよく混合し、３７
℃で５分間加温後、５９５ｎｍの吸光度（Ｅｓ）を測定
した。
また、試料の代りにイオン交検水を用いて同様の操作を
行い盲検値（Ｅ　Ｂｌ）を測定した。
次式に従いヒト血清中の尿酸濃度を算出した。
尿酸（ｍｇ／ｄｌ）＝（ヒト血清のＥｓ−ＦＢＩ）÷（
標準液のＥｓ−ＥＢＩ）　Ｘ　１０ （結果） 結果を表３に示す。
参考例１．尿酸の定量 実施例５と同じ試料を用い、尿酸測定用の市販キット（
尿酸Ｃ−テストヮコー、和光紬薬工業（株）製）を使用
して、尿酸濃度を測定した。
結果を表３に併せて示す。
表３ 表３から明らかな如く、本発明のｐ−フルオロアニリン
誘導体を発色試薬のカップリング成分として用いた実施
例５の測定法により得られた尿酸の測定値は、市販キッ
トを用いた従来法のそれと良い相関を示していることが
判る。
［発明の効果］ 以上述べた如く、本発明は、従来同様の目的で用いられ
ていた化合物が有する問題点、即ち水、或は界面活性剤
の溶存する緩衝液中で不安定であることや、生成する色
素が比較的低波長側に極大吸収を有しているため血清や
尿等の生体試料中に共存する成分による測定値への影響
を受は易いことや、血清や尿等の生体試料中に共存する
成分の影響により、生じた色素の呈色安定性が低下する
（退色する）こと等の問題点を全て解決した新規なｐ−
フルオロアニリン誘導体又はその塩、及びこれを発色成
分として用いる酸化性物質の定量方法を提供するもので
あり、斯業に貢献するところ大なる発明である。
【図面の簡単な説明】
第１図は、実施例３に於いて得られた検量線を表わし、
横軸の各過酸化水素濃度（ｍＭ）について得られた５９
５ｎｍの吸光度を縦軸に沿ってプロットした点を結んだ
ものである。 特許出願人　和光純薬工業株式会社

Claims (12)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）一般式［ I ］ ▲数式、化学式、表等があります▼［ I ］ （式中、Ｒ＾１及びＲ＾２は夫々独立して水素原子、ア
    ルケニル基又は置換基を有していてもよいアルキル基を
    表わし、Ｒ＾３及びＲ＾４は夫々独立してアルコキシ基
    、アルケニル基、水酸基、ハロゲン原子、スルホン酸基
    、カルボキシル基、ニトロ基、アリール基又は置換基を
    有していてもよいアルキル基を表わし、Ｒ＾５及びＲ＾
    ６は夫々独立して水素原子、アルコキシ基、アルケニル
    基又は置換基を有していてもよいアルキル基を表わす。 また、Ｒ＾１とＲ＾２、Ｒ＾３とＲ＾５、Ｒ＾４とＲ＾
    ６とが夫々結合して環を形成していてもよい。） で示されるｐ−フルオロアニリン誘導体又はその塩。
  2. （２）発色主剤及び請求項１に記載のｐ−フルオロアニ
    リン誘導体又はその塩を発色成分として用いることを特
    徴とする酸化性物質の定量方法。
  3. （３）発色主剤が４−アミノアンチピリン又はその誘導
    体である、請求項２に記載の定量方法。
  4. （４）酸化性物質が過酸化水素である、請求項２に記載
    の定量方法。
  5. （５）ペルオキシダーゼの存在下、発色成分を酸化発色
    させてその呈色を比色定量する、請求項４に記載の定量
    方法。
  6. （６）過酸化水素が、酵素反応により生成する過酸化水
    素である、請求項４又は５に記載の定量方法。
  7. （７）過酸化水素が、生体試料中の微量成分の定量に於
    いて酵素反応により生成する過酸化水素である、請求項
    ６に記載の定量方法。
  8. （８）生体試料中の微量成分の定量が、基質又は酵素反
    応により生成した物質に酸化酵素を作用させ生成する過
    酸化水素を定量することにより行う生体試料中の基質又
    は酵素活性の定量である、請求項７に記載の定量方法。
  9. （９）発色主剤及び請求項１に記載のｐ−フルオロアニ
    リン誘導体又はその塩を発色成分として用いることを特
    徴とするペルオキシダーゼ様物質の定量方法。
  10. （１０）発色主剤が４−アミノアンチピリン又はその誘
    導体である、請求項９に記載の定量方法。
  11. （１１）ペルオキシダーゼ様物質がペルオキシダーゼで
    ある、請求項９に記載の定量方法。
  12. （１２）ペルオキシダーゼ様物質がヘモグロビン又はそ
    の他のヘム化合物である、請求項９に記載の定量方法。
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