ES2236686T3 - Factores mitogenicos gliales, su preparacion y uso. - Google Patents

Abstract

SE PRESENTA LA CARACTERIZACION Y PURIFICACION DE UN ADN QUE CODIFICA NUMEROSOS POLIPEPTIDOS UTILES PARA LA ESTIMULACION DE LA MITOGENESIS DE CELULAS GLIALES (EN PARTICULAR LA CELULA DE SCHWANN) Y EL TRATAMIENTO DE TUMORES DE CELULAS GLIALES. TAMBIEN SE PRESENTAN SECUENCIAS DE ADN QUE CODIFICAN NUEVOS POLIPEPTIDOS QUE PUEDEN SER UTILES PARA ESTIMULAR LA MITOGENESIS DE CELULAS GLIALES Y PARA EL TRATAMIENTO DE TUMORES DE CELULAS GLIALES. TAMBIEN SE PRESENTAN LOS METODOS PARA LA SINTESIS, PURIFICACION Y ENSAYO DE POLIPEPTIDOS NUEVOS Y CONOCIDOS PARA SU USO COMO AUXILIARES TERAPEUTICOS Y DE DIAGNOSTICO PARA EL TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES EN LAS QUE INTERVIENEN CELULAS GLIALES. TAMBIEN SE PRESENTAN METODOS PARA EL USO DE ESTOS POLIPEPTIDOS PARA LA PREPARACION DE SONDAS DE ANTICUERPOS UTILES PARA FINES DE DIAGNOSTICO Y TERAPEUTICOS DE ENFERMEDADES EN QUE INTERVIENEN CELULAS GLIALES.

Description

Factores mitogénicos gliales, su preparación y uso.

Antecedentes del invento

Este invento se refiere a polipéptidos encontrados en especies vertebradas, polipéptidos que son factores de crecimiento mitogénicos para células gliales, incluyendo células de Schwann. El invento también tiene que ver con procesos capaces de producir tales factores, y con la aplicación terapéutica de tales factores.

Las células gliales de vertebrados constituyen el tejido conectivo especializado de los sistemas nerviosos central y periférico. Células gliales importantes incluyen células de Schwann que proporcionan soporte metabólico para las neuronas y que proporciona un recubrimiento (vainas) de mielina alrededor de los axones de ciertas neuronas periféricas, formando de ese modo fibras nerviosas individuales. Las células de Schwann mantienen a las neuronas y proporcionan un efecto de recubrimiento formando capas concéntricas de membranas alrededor de axones neuronales adyacentes, girando según se desarrollan alrededor de los axones. Estas vainas de mielina son un elemento susceptible de muchas fibras nerviosas, y de daño a las células de Schwann, o de fallo en el crecimiento y desarrollo, y pueden estar asociadas con una desmielinización significativa o degeneración nerviosa característica de un número de enfermedades y trastornos del sistema nervioso periférico. En el desarrollo del sistema nervioso, se ha hecho evidente que las células requieren diversos factores para regular su división y crecimiento, y tales diversos factores han sido identificados en los últimos años, incluyendo algunos que se ha encontrado que tienen un efecto en la división o desarrollo de las células de Schwann.

Así, Brockes y otros, inter alia, in J. Neuroscience, 4 (1984) 75-83 describe un factor de crecimiento protéico presente en extractos de cerebro bovino y tejido pituitario, que fue llamado Factor de Crecimiento Glial (GGF). Este factor estimulaba células de Schwann de rata cultivadas hasta su división frente a un medio antecedente que contenía diez por ciento de suero de ternera fetal. También se describió que el factor tenía un peso molecular de 31.000 Daltones y que dimerizaba fácilmente. En Meth. Enz., 147 (1987), 217-225, Brockes describe un ensayo para detectar GGF basado en células de Schwann.

Brockes y otros, supra, también describe un método de purificación de GGF hasta una clara homogeneidad. En resumen, un método de purificación a gran escala descrito implica la extracción de los lóbulos anteriores bovinos liofilizados y la cromatografía del material obtenido de ese modo usando una elución por gradiente de NaCl a partir de CM celulosa. Se llevó a cabo después una filtración en gel con una columna Ultrogel, seguido de elución a partir de una columna de fosfocelulosa, y finalmente una electroforesis en gel con SDS a pequeña escala. Alternativamente, el material CM-celulosa fue aplicado directamente a una columna de fosfocelulosa, las fracciones de la columna fueron reunidas y purificadas mediante electroforesis en gel en condiciones nativas preparativa, seguido por una electroforesis final en gel con SDS.

Brockes y otros, observan que en experimentos de filtración en gel documentados previamente (Brockes y otros, J. Biol. Chem. 255 (1980) 8374-8377), se observó que el pico principal de actividad de factor de crecimiento migra con un peso molecular de 56.000 Daltones, mientras que en el primero de los procedimientos anteriormente descritos la actividad se observó predominantemente al peso molecular de 31.000 Daltones. Se ha documentado que el dímero GGF es retirado en gran medida como resultado del gradiente de elución de la CM-celulosa en este procedimiento.

Benveniste y otros (PNAS, 82 (1985), 3930-3934) describe un factor promotor del crecimiento de la glia derivado de linfocitos T. Este factor, en condiciones reductoras, exhibe un cambio en el peso molecular aparente en geles con SDS.

Kimura y otros, (Nature, 348 (1990), 257-260) describen un factor que llaman factor de crecimiento derivado de Schwannoma (SDGF) que se obtiene de un tumor de la vaina del nervio ciático. Los autores afirman que el SDGF no estimula la incorporación de TdR marcado con tritio en células de Schwann cultivadas en condiciones en las que, por el contrario, la fracción de pituitaria parcialmente purificada que contiene GGF es activa. El SDGF tiene un peso molecular aparente de entre 31.000 y 35.000.

Davis y Stroobant (J. Cell. Biol., 110 (1990), 1353-1360) describen el cribado de un número de mitógenos candidatos. Se usaron células de Schwann de rata, siendo examinadas las sustancias candidatas elegidas en lo que se refiere a su capacidad para estimular la síntesis de ADN en las células de Schwann en presencia de FCS (suero de ternera fetal) 10%, con y sin forskolina. Uno de los factores ensayados fue la fracción GGF-carboximetil celulosa (GGF-CM), que era mitogénico en presencia de FCS, con y sin forskolina. El trabajo reveló que en presencia de forskolina, inter alia, el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) era un potente mitógeno para las células de Schwann, cuando previamente se había pensado que el PDGF no tenía efecto en las células de Schwann.

Holmes y otros. Sciences (1992) 256: 1205 y Wen y otros Cell (1992) 69: 559 demuestra que las secuencias de ADN que codifican las proteínas que se unen a un receptor (P185^{erbB2}) están asociadas con varios tumores humanos.

La proteína p185^{erbB2} es una proteína transmembrana de 185 kilodaltones con actividad tirosina quinasa. La proteína está codificada por el proto-oncogén erbB2 (Yarden y Ullrich Ann. Rev. Biochem. 57: 443 (1988)). El gen erbB2, también llamado HER-2 (en células humanas) y neu (en células de rata), está íntimamente relacionado con el receptor para el factor de crecimiento epidérmico (EGF). Evidencias recientes indican que las proteínas que interaccionan con (y activan la quinasa de) p185^{erbB2} inducen proliferación en las células que llevan p185^{erbB2} (Holmes y otros, Science 256: 1205 (1992); Dobashi y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. 88: 8582 (1991); Lupu y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. 89: 2287 (1992)). Adicionalmente, es evidente que el gen que codifica las proteínas de unión a p185erbB2 produce un número de tránscritos de ARN de tamaño variable, y de corte y empalme diferencial que dan lugar a una serie de proteínas, que son de diferente longitud y contienen algunas secuencias peptídicas comunes y algunas secuencias peptídicas únicas. Esto está apoyado por los tránscritos de ARN de corte y empalme diferencial recuperables a partir de cáncer de mama humano (MDA-MB-231) (Holmes y otros. Science 256: 1205 (1992)). Un apoyo adicional deriva del amplio intervalo de tamaños de proteínas que actúan (como se describe aquí) como ligandos para el receptor p185^{erbB2} (véase a continuación).

Sumario del invento

En general el invento proporciona métodos para estimular la mitogénesis de las células gliales (en particular, células de Schwann y glia del sistema nervioso central), así como nuevas proteínas que exhiben tal actividad mitogénica de células gliales. Además, se proporciona el ADN que codifica para estas proteínas y anticuerpos que se une a estas y otras proteínas relacionadas.

Las nuevas proteínas del invento incluyen productos de corte y empalme alternativo de secuencias que codifican polipéptidos conocidos. Generalmente, estas proteínas conocidas son miembros de la familia de proteínas GGF/p185^{erbB2}.

Específicamente, el invento proporciona los polipéptidos de una fórmula especificada, y las secuencias de ADN que codifican para estos polipéptidos.

El invento proporciona un polipéptido codificado por un gen ligando GGF/p185^{erbB2}, en el que dicho polipéptido interacciona con un receptor p185^{erbB2}, dicho polipéptido comprende un dominio E codificado por la SEQ ID Nº: 163 o un dominio E que comprende la secuencia aminoacídica de la SEQ ID Nº: 210, y un dominio tipo factor de crecimiento epidérmico que comprende:

a)

una secuencia de ácidos nucleicos C (SEQ ID Nº 177) y bien una secuencia de ácidos nucleicos C/D (SEQ ID Nº 178) o bien una secuencia de ácidos nucleicos C/D' (SEQ ID Nº 143) en el orden 5' ó 3' C-C/D o C-C/D';

b)

la secuencia de ácidos nucleicos de la SEQ ID Nº 151, 152, 220, 221, 222, 223, 224, ó 225; o

c)

aminoácidos 362-411 de la SEQ ID Nº 170.

Según un primer aspecto del invento, el polipéptido induce mitogénesis de células gliales.

Según un segundo aspecto del invento, el polipéptido induce la síntesis del receptor de acetilcolina en una célula.

Según un tercer aspecto del invento, el polipéptido induce la mielinización de una célula neural por una célula glial.

Según una realización preferida del invento, el polipéptido comprende la secuencia aminoacídica de la SEQ ID Nº 170.

El invento también proporciona una secuencia de ácidos nucleicos aislada que codifica para el polipéptido definido aquí anteriormente.

Según una realización preferida del invento, la secuencia de ácidos nucleicos comprende la SEQ ID Nº 21.

El invento incluye además vectores que incluyen secuencias de ADN que codifican secuencias aminoacídicas, como se definen anteriormente. También se incluye una célula hospedadora que contiene un ADN aislado que codifica las secuencias aminoacídicas, como se define anteriormente. El invento incluye además aquellos compuestos que se unen al receptor p185^{erbB2} y estimulan la mitogénesis de células gliales in vivo y/o in vitro como se define aquí.

Además, los anticuerpos contra cualquiera de los péptidos aquí descritos pueden ser usados para la purificación de polipéptidos aquí descritos. Los anticuerpos frente a los polipéptidos pueden ser también usados para el inhibidor terapéutico de la mitogénesis de células gliales.

El invento también incluye un método para la preparación de un factor mitogénico de células gliales que consiste en cultivar células hospedadoras modificadas como se define anteriormente en condiciones que permitan la expresión de las secuencias de ADN del invento.

Un método para estimular la mitogénesis de una célula glial puede ser efectuado poniendo en contacto la célula glial con un polipéptido definido anteriormente como un mitógeno de célula glial in vivo o in vitro. Un método para producir un efecto mitogénico de célula glial en un vertebrado (preferiblemente en mamíferos, más preferiblemente en humanos) puede ser efectuado administrando una cantidad eficaz de un polipéptido como se define aquí.

Un método de tratamiento o profilaxis para una enfermedad o trastorno nervioso puede ser efectuado con los polipéptidos aquí descritos. Un método para la profilaxis o tratamiento de un estado patofisiológico del sistema nervioso en el que un tipo celular que está implicado es sensible o responde a un polipéptido como se define aquí puede ser también efectuado con dichos polipéptidos. Los métodos anteriormente mencionados de tratamiento incluyen métodos para cuando el estado implica daño en los nervios periféricos; daño en los nervios en el sistema nervioso central; trastornos neurodegenerativos; desmielinización en el sistema nervioso periférico o central; o daño o pérdida de células de Schwann, oligodendrocitos, microglia, o astrocitos. Por ejemplo, una neuropatía de las fibras nerviosas sensoriales o motoras, o el tratamiento de un trastorno neurodegenerativo están incluidos. En cualquiera de estos casos, el tratamiento consiste en administrar una cantidad eficaz del polipéptido.

Un método para inducir regeneración y/o reparación neural puede ser efectuado administrando una cantidad eficaz de un polipéptido como se define anteriormente. Tal medicamento se hace administrando el polipéptido con un vehículo farmacéuticamente eficaz.

El invento incluye el uso de un polipéptido como se define anteriormente en la fabricación de un medicamento.

Los polipéptidos como se define anteriormente pueden ser usados

- para inmunizar un mamífero para producir anticuerpos, que pueden ser opcionalmente usados para propósitos terapéuticos o diagnósticos

- en un ensayo competitivo para identificar o cuantificar moléculas que tienen características de unión a receptor correspondientes a las del polipéptido; y/o

- para poner en contacto una muestra con un polipéptido, como se menciona anteriormente, junto con un receptor capaz de unirse específicamente al polipéptido con el propósito de detectar inhibición competitiva de unión al polipéptido.

- en un proceso de aislamiento de afinidad, opcionalmente cromatografía de afinidad, para la separación de un receptor correspondiente.

El invento incluye además los polipéptidos EGFL1, EGFL2, EGFL3, EGFL4, EGFL5 y EGFL6, Figuras 38 a 43 y las SEQ ID Nºs 220-225, respectivamente, para usar en la estimulación de mitogénesis in vivo e in vitro de células gliales.

También incluida en el invento está la administración del polipéptido GGF-II, cuya secuencia se muestra en la Figura 45A para la estimulación de la mitogénesis de células gliales.

En un aspecto adicional del invento, los nuevos polipéptidos descritos aquí pueden ser usados para estimular la síntesis de los receptores de acetilcolina.

Como se menciona anteriormente, el invento proporciona nuevos factores de crecimiento glial a partir de fuentes mamíferas, incluyendo bovinas y humanas, que se distinguen de los factores conocidos. Estos factores son mitogénicos para las células de Schwann frente a un fondo de plasma de ternera fetal (FCP). El invento también proporciona procesos para la preparación de estos factores, y un método mejorado para definir la actividad de estos y otros factores. La aplicación terapéutica de los factores es un aspecto significativo adicional del invento.

El invento incluye además las secuencias que tiene más del 60%, preferentemente 80%, identidad de secuencia de homología con las secuencias indicadas anteriormente.

Mientras que el presente invento no está limitado a un grupo particular de condiciones de hibridación, el siguiente protocolo da una guía general que puede, si se desea, ser seguida:

Las sondas de ADN pueden ser marcadas para una actividad altamente específica (aproximadamente 10^{8} a 10^{9} ^{32}P dmp/\mug) mediante marcaje de sondas o mediante reacciones de PCR según Schowalter y Sommer (Anal. Biochem., 177: 90-94, 1989) y purificadas mediante desalado en columnas G-150 Sephadex. Las sondas pueden desnaturalizarse (10 min en agua hirviendo seguido de inmersión en agua con hielo), después añadirse a las disoluciones de hibridación de tampón B 80% (2 gr. de Polivinilpirrolidina, 2 gr. de Ficoll-400, 2 gr. de albúmina de suero bovina, 50 ml de Tris-HCl 1M (pH 7,5), 58 gr. de NaCl, 1 gr. de pirofosfato sódico, 10 gr. de dodecil sulfato sódico, 950 ml de H_{2}O) que contenía dextrán sulfato 10% a 10^{6} dpm ^{32}P por ml e incubado durante toda la noche (aproximadamente 16 horas) a 60ºC. Los filtros pueden ser después lavados a 60ºC en tampón B durante 15 minutos seguido de tres lavados de 20-minutos en SSC 2x, SDS 0,1%, después uno durante 20 minutos en SSC 1x, SDS 0,1%.

Desde otros puntos de vista, el invento proporciona:

(a) un factor polipeptídico básico que tiene, si se obtiene a partir de material de pituitaria bovina, un peso molecular observado, sea en condiciones reductoras o no, de desde alrededor de 30 KD hasta alrededor de 36 KD en electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida usando los siguientes patrones de peso molecular:

Lisozima (clara de huevo de gallina)	14.400
Inhibidor de tripsina de soja	21.500
Anhidrasa carbónica (bovina)	31.000
Ovalbúmina (clara de huevo de gallina)	45.000
Albúmina de suero bovina	66.200
Fosforilasa B (músculo de conejo)	97.400;

factor que tiene actividad mitogénica de célula glial que incluye estimular la división de células de Schwann de rata en presencia de plasma de ternera fetal, y que cuando se aísla usando un HPLC de fase inversa conserva al menos un 50% de dicha actividad después de 10 semanas de incubación en ácido trifluoroacético 0,1% a 4ºC; y

(b) un factor polipeptídico básico que tiene, si se obtiene a partir de material de pituitaria bovina, un peso molecular observado, en condiciones no reductoras, de desde alrededor de 55 KD hasta alrededor de 63 KD en gel de electroforesis SDS-poliacrilamida usando los siguientes patrones de peso molecular:

Lisozima (clara de huevo de gallina)	14.400
Inhibidor de tripsina de soja	21.500
Anhidrasa carbónica (bovina)	31.000
Ovalbúmina (clara de huevo de gallina)	45.000
Albúmina de suero bovina	66.200
Fosforilasa B (músculo de conejo)	97.400;

factor cuyo equivalente humano está codificado por el clón de ADN GGF2HBS5 descrito aquí y factor que tiene actividad mitogénica de células gliales que incluye estimular la división de las células de Schwann de rata en presencia de plasma de ternera fetal, y que cuando se aísla usando HPLC de fase inversa conserva al menos un 50% de la actividad después de 4 días de incubación en ácido trifluoroacético 0,1% a 4ºC.

Por conveniencia de la descripción sólo, a los factores de menor peso molecular y de mayor peso molecular de este invento se hace referencia de aquí en adelante como "GGF-I" y "GGF-II", respectivamente. La designación "GGF2" se usa para todos los clones aislados con datos de secuencias peptídicas derivadas de la proteína GGF-II (es decir, GGF2HBS5, GGF2BPP3).

Se apreciará que los límites de intervalos de peso molecular citados no son exactos, sino que están sujetos a ligeras variaciones dependiendo de la fuente del factor polipeptídico particular. Una variación de alrededor del 10% no sería, por ejemplo, imposible para un material de otra fuente.

Otro aspecto del presente invento usa el hecho de que los factores de crecimiento glial y las proteínas ligando de p185^{erbB2} están codificadas pro el mismo gen. Una variedad de variantes de corte y empalme del ARN mensajero (y sus proteínas resultantes) se derivan a partir de este gen y muchos de estos productos muestran unión a y activación de p185^{erbB2}. Varios de los productos génicos (GGF-II) han sido usados para mostrar actividad mitogénica de células de Schwann. Este invento proporciona un uso para todos los productos conocidos del gen ligando GGF/p185^{erbB2} (descrito en las referencias listadas anteriormente) como mitógeos de las células de Schwann.

Este invento también se refiere a otras variantes de corte y empalme, aún no aisladas de su medio natural, del gen del factor de crecimiento glial. La Figura 30, muestra los patrones conocidos de corte y empalme derivados de experimentos de reacción en cadena de la polimerasa (en ARN retrotranscrito) y análisis de clones de cADN (como presentados dentro) y derivados de lo que ha sido publicado como secuencias que codifican los ligandos p185^{erbB2} (Peles y otros, Cell 69: 205 (1992) y Wen y otros, Cell 69: 559 (1992). Estos patrones, así como otros adicionales descritos aquí, representan probables variantes de corte y empalme que existen. Así, otro aspecto del presente invento se refiere a las secuencias nucleotídicas que codifican factores proteicos nuevos derivados de este gen. El invento también proporciona procesos para la preparación de estos factores. La aplicación terapéutica de estos nuevos factores es un aspecto adicional del invento.

Así, otros aspectos importantes del invento son:

Una serie de factores polipeptídicos que tienen actividad mitogénica de células gliales que incluye estimular la división de células de Schwann y que están purificados y caracterizados según los procedimientos resumidos por Lupu y otros, Science 249: 1552 (1990); Lupu y otros, Proc. Natl. Acad. Sci USA 89: 2287 (1992); Holmes y otros, Science 256: 1205 (1992); Peles y otros, 69: 205 (1992); Yarden y Peles, Biochemistry 30: 3543 (1991); Dobashi y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. 88: 8582 (1991); Davis y otros, Biochem. Biophys. Res. Commun. 179: 1536 (1991); Beaumont y otros, solicitud de patente PCT/US91/03443 (1990); Greene y otros, solicitud de patente PCT/US91/02331 (1990); Usdin y Fischbach, J. Cell. Biol. 103: 493-507 (1986); Falls y otros, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 55: 397-406 (1990); Harris y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7664-7668 (1991); y Falls y otros, Cell 72: 801-815
(1993).

Las secuencias peptídicas humanas descritas anteriormente y presentadas en las Figuras 31, 32, 33 y 34, (SEQ ID Nºs 192, 194, 195, y 197-219) respectivamente, representan una serie de variantes de corte y empalme que pueden ser aisladas como ADNs complementarios (cADNs) de longitud completa a partir de las fuentes naturales (bibliotecas de cADN preparadas a partir de los tejidos apropiados) o pueden ser ensambladas como constructos de ADN con exones individuales (por ejemplo, derivados como exones separados) por alguien experto en la técnica.

Otros compuestos en particular, péptidos, que se unen específicamente al receptor p185^{erbB2} pueden ser usados aquí como un mitógeno de células gliales. Un compuesto candidato pueden ser cribado rutinariamente en busca de unión a p185^{erbB2}, y si se une, puede ser cribado en busca de actividad mitogénica de células gliales usando los métodos descritos aquí.

El invento incluye cualesquiera modificaciones o equivalentes de los factores polipeptídicos anteriores que no exhiben una actividad reducida significativamente. Por ejemplo, están incluidas las modificaciones en las que el contenido en aminoácidos o la secuencia están alterados sin afectar adversamente de modo significativo a la actividad. Por medio de ilustración, en el documento de patente europea EP-A 109748 se describen mutaciones de proteínas nativas en las que la posibilidad de enlaces disulfuro no deseados se evita reemplazando cualquier cisteína en la secuencia nativa que no sea necesaria para la actividad biológica con un aminoácido neutro. Las afirmaciones de efecto y uso contenidas aquí tienen por lo tanto que ser interpretadas consecuentemente, empleando tales usos y efectos factores modificados o equivalentes que son parte del invento.

Las nuevas secuencias del invento establecen los beneficios de la tecnología recombinante. Así, este invento también incluye los siguientes aspectos:

(a) Construcciones de ADN que comprenden secuencias de ADN como se definen anteriormente en posición de marco de lectura operativa dentro de los vectores (posicionadas en relación a las secuencias testigo a modo de permitir la expresión de las secuencias) en células hospedadoras elegidas tras la transformación de las mismas por los constructos (preferiblemente la secuencia testigo incluye promotores regulables, por ejemplo, Trp). Se apreciará que la selección de un promotor y secuencias reguladoras (si hay alguna) son materia de elección para aquellos con experiencia en la técnica;

(b) las células hospedadoras modificadas por incorporación de constructos como se define en (a) lo inmediato anterior de modo que dichas secuencias de ADN pueden ser expresadas en dichas células hospedadoras - la elección del hospedador no es crítica, y las células elegidas pueden ser procariotas o eucariotas y pueden ser modificadas genéticamente para incorporar dichos constructos mediante métodos conocidos en la técnica; y,

(c) un proceso para la preparación de factores como los definidos anteriormente que comprenden el cultivo de las células hospedadoras modificadas en condiciones que permitan la expresión de las secuencias de ADN. Estas condiciones pueden ser fácilmente determinadas, para cualquier realización particular, por aquellos con experiencia en la técnica de la tecnología de ADN recombinante. Los mitógenos de células gliales preparados por estos medios están incluidos en el presente invento.

Ninguno de los factores descritos en la técnica tiene la combinación de las características poseídas por los nuevos factores polipeptídicos presentes.

Como se indica, el ensayo de células de Schwann usado para caracterizar los factores presentes emplea un fondo de plasma de ternera fetal. En todos los otros sentidos, el ensayo puede ser el mismo que el descrito por Brockes y otros, en Meth. Enz., supra, pero con FCP 10% reemplazando al FCS 10%. Esta diferencia en las ténicas de ensayo es significativa, puesto que la ausencia de los factores derivados de plaquetas en plasma de ternera fetal (en oposición al suero) permite una definición más rigurosa de la actividad en las células de Schwann eliminando efectos potencialmente espurios de algunos otros factores.

El invento también incluye un proceso para la preparación de un polipéptido como se define anteriormente, extrayendo material de cerebro de vertebrados para obtener proteína, sometiendo el extracto resultante a purificación cromatográfíca mediante hidroxiapatito-HPLC y después sometiendo estos factores a electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida. Se recoge la fracción que tiene un peso molecular observado de alrededor de 30 KD a 36 KD y/o la fracción que tiene un peso molecular observado de alrededor de 55 KD a 63 KD. En cualquier caso, la fracción es sometida a electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida usando los siguientes patrones de peso molecular:

Lisozima (clara de huevo de gallina)	14.400
Inhibidor de tripsina de soja	21.500
Anhidrasa carbónica (bovina)	31.000
Ovalbúmina (clara de huevo de gallina)	45.000

Albúmina de suero bovina	66.200
Fosforilasa B (músculo de conejo)	97.400.

En el caso de la fracción de pesos moleculares mas pequeños, el gel de SDS-poliacrilamida se corre en condiciones no reductoras, en condiciones reductoras o, en el caso de la fracción de pesos moleculares más grandes el gel se corre en condiciones no reductoras. Las fracciones son después ensayadas en lo que se refiere a su actividad estimuladora de la división de las células de Schwann frente a un fondo de plasma de ternera fetal.

Preferentemente, el proceso anterior empieza por aislar una fracción relevante obtenida por cromatografía en carboximetil celulosa, por ejemplo, a partir de material de pituitaria bovina. También es preferido que el hidroxiapatito-HPLC, cromatografía de intercambio catiónico, filtración en gel, y/o HPLC de fase inversa puedan ser empleadas previo a la electroforesis en gel de de SDS-poliacrilamida. En cada etapa en el proceso, la actividad puede ser determinada usando incorporación de yododesoxiuridina radioactiva en células de Schwann como medida en un ensayo generalmente como está descrito por Brockes en Meth. Enz., supra, pero modificado sustituyendo FCP 10% por FCS 10%. Como ya se ha observado, tal ensayo es un aspecto del invento en su propia sustancia para SNC o SNP, por ejemplo, efectos mitogénicos en células de Schwann.

Así, el invento también incluye un ensayo para la actividad mitogénica de células gliales en el que un fondo de plasma de ternera fetal es empleado frente al cual evaluar la síntesis de ADN en células gliales estimuladas (si es que se puede) por una sustancia en ensayo.

Otro aspecto del invento es una formulación farmacéutica o veterinaria que comprende cualquier factor como se define anteriormente formulado para su uso farmacéutico o veterinario, respectivamente, opcionalmente junto con un diluyente, vehículo o excipiente aceptables y/o en forma de dosificación unitaria. Al usar los factores del invento, se puede emplear la práctica farmacéutica o veterinaria convencional para proporcionar formulaciones o composiciones adecuadas.

Así, las formulaciones de este invento pueden ser aplicadas a la administración parenteral, por ejemplo, intravenosa, subcutánea, intramuscular, intraorbital, oftálmica, intraventricular, intracreneal, intracapsular, intraespinal, intracisternal, intraperitoneal, tópica, intranasal, aerosol, punción cicatrizante, y también administración oral, bucal, rectal o vaginal.

Las formulaciones de este invento pueden también ser administradas mediante el trasplante en el paciente de células hospedadoras que expresan el ADN del invento inmediato o mediante el uso de implantes quirúrgicos que liberan las formulaciones del invento.

Las formulaciones parenterales pueden estar en la forma de disoluciones líquidas o suspensiones; para administración oral, las formulaciones pueden estar en la forma de tabletas o cápsulas; y para las formulaciones intranasales, en la forma de polvos, gotas nasales, o aerosoles.

Los métodos bien conocidos en la técnica para hacer formulaciones se pueden encontrar en, por ejemplo, "Remington's Pharmaceutical Sciences". Las formulaciones para la administración parenteral pueden, por ejemplo, contener como excipientes agua estéril o salino, polialquilenglicoles tales como el polietilénglicol, aceites de origen vegetal, o naftalenos hidrogenados, polímero láctidos biodegradables biocompatibles, o copolímeros polioxietilén-polioxipropileno pueden ser usados para controlar la liberación de los factores presentes. Otros sistemas de liberación parenteral para los factores potencialmente útiles incluyen partículas de copolímeros de etilén-vinilacetato, bombas osmóticas, sistemas de infusión implantables, y liposomas. Las formulaciones para inhalación pueden contener como excipientes, por ejemplo lactosa, o pueden ser disoluciones acuosas que contienen, por ejemplo, polietilen-9-lauril éter, glicocolato y desoxicolato, o pueden ser disoluciones oleicas para administración en forma de gotas nasales, o como un gel para ser aplicado intranasalmente. Las formulaciones para la administración parenteral pueden también incluir glicocolato para administración bucal, metoxisalicilato para administración rectal, o ácido cítrico para administración
vaginal.

Los presentes factores pueden ser usados como agentes activos únicos, o pueden usarse en combinación con otros ingredientes activos, por ejemplo, otros factores de crecimiento que pudieran facilitar la supervivencia neuronal en enfermedades neurológicas, o inhibidores de peptidasa o proteasas.

La concentración de los presentes factores en las formulaciones del invento variarán dependiendo de un número de cuestiones, incluyendo la dosificación a ser administrada, y la ruta de administración.

En términos generales, los factores de este invento pueden ser proporcionados en una disolución tampón fisiológica acuosa que contiene alrededor de 0,1 a 10% p/v del compuesto para administración parenteral. Intervalos de dosis generales van desde alrededor de 1 mg/kg a alrededor de 1 g/kg de peso corporal por día; un intervalo de dosis preferido va desde alrededor de 0,01 mg/kg a 100 mg/kg de peso corporal por día. La dosificación preferida para ser administrada es probable que dependa del tipo y extensión de la progresión del estado patofisiológico al que se dirige, la salud global del paciente, la preparación de la formulación, y la ruta de administración.

Como se indica anteriormente, las células de Schwann (las células gliales del sistema nervioso periférico) son estimuladas para que se dividan en presencia de los factores del invento. Las células de Schwann del sistema nervioso periférico están implicadas en mantener a las neuronas y en crear las vainas de mielina alrededor de las fibras nerviosas. Esta vaina es importante para la conducción apropiada de los impulsos eléctricos a los músculos y desde los receptores sensoriales.

Hay una variedad de neuropatías periféricas en las que las células de Schwann y las fibras nerviosas están dañadas, bien de modo primario o de modo secundario. Hay muchas neuropatías de tanto las fibras sensoriales como de las fibras motoras (Adams y Victor, Principles of Neurology). Las más importantes de estas neuropatías son probablemente las neuropatías asociadas con diabetes, esclerosis múltiple, síndrome de Landry-Guillain-Barr, neuropatías causadas por carcinomas, y neuropatías causadas por agentes tóxicos (algunos de los cuales se usan para tratar carcinomas).

El invento, sin embargo, prevé el tratamiento o la profilaxis de estados en los que el daño en el sistema nervioso ha sido provocado por cualquier causa básica, pro ejemplo, infección o lesión. Así, junto con el uso de los presentes factores en el tratamiento de trastornos o enfermedades del sistema nervioso en el que la desmielinización o pérdida de células de Schwann está presente, tales factores de crecimiento glial pueden ser valiosos en el tratamiento de trastornos del sistema nervioso que han sido causados por daño a los nervios periféricos. Después del daño a nervios periféricos, el proceso de regeneración es dirigido por el crecimiento o el reestablecimiento de las células de Schwann, seguido por el avance de fibras nerviosas de nuevo a sus dianas. Acelerando la división de las células de Schwann se puede promover el proceso regenerativo después del daño.

Aproximaciones similares podrían usarse para tratar lesiones o enfermedades neurodegenerativas del sistema nervioso central (cerebro y columna vertebral).

Adicionalmente, hay una variedad de tumores de células gliales, el más común de los cuales es probablemente la neurofibromatosis, que es un tumor pequeño irregular creado por el sobrecrecimiento de células gliales. También, se ha encontrado que una actividad muy similar a GGF puede encontrarse en algunos tumores de las células de Schwann, y por lo tanto inhibidores de la acción de los factores presentes sobre sus receptores proporciona una terapia de un tumor glial, que comprende administrar una cantidad eficaz de una sustancia que inhibe la unión de un factor, como se define anteriormente, a un receptor.

En general, el invento permite el uso de los factores polipeptídicos presentes en la profilaxis o tratamiento de cualquier estado patofisiológico del sistema nervioso en el que está implicado un tipo celular sensible a factor o que responde a factor.

Los factores polipeptídicos del invento pueden también ser usados como inmunógenos para hacer anticuerpos, tales como anticuerpos monoclonales, siguiendo técnicas estándar. Tales anticuerpos están incluidos dentro del presente invento. Estos anticuerpos pueden, a su vez, ser usados para propósitos terapéuticos o diagnósticos. Así, a los estados tal vez asociados con niveles anormales del factor se les puede seguir la pista usando tales anticuerpos. Se pueden usar técnicas in vitro, empleando ensayos en muestras aisladas usando métodos estándar. Los métodos de imagen en los que los anticuerpos están, por ejemplo, marcados con isótopos radioactivos que pueden ser visualizados fuera del cuerpo usando ténicas para la técnica de toma de imágenes pueden ser también empleadas.

El invento también preve el uso general de los factores presentes como mitógenos de células gliales in vivo o in vitro, y los factores para tal uso. Una realización específica implica administrar una cantidad eficaz de un factor del invento en un método para producir un efecto mitogénico de células gliales en un vertebrado, especialmente un método para el tratamiento o profilaxis de una enfermedad o trastorno del sistema nervioso.

Un aspecto general adicional del invento es el uso de un factor del invento en la fabricación de un medicamento, preferiblemente para el tratamiento de una enfermedad o trastorno nervioso, o para la regeneración o reparación neural.

También incluidos en el invento están el uso de los factores del invento en ensayos competitivos para identificar o cuantificar moléculas que tienen características de unión a receptor correspondiente a las de dichos polipéptidos. Los polipéptidos pueden ser marcados, opcionalmente con un radioisótopo. Un ensayo competitivo puede identificar tanto antagonistas como agonistas del receptor relevante.

En otro aspecto, el invento proporciona el uso de cada uno de los factores del invento en un proceso de aislamiento por afinidad, opcionalmente cromatografía de afinidad, para la separación de un receptor correspondiente respectivo. Tales procesos para el aislamiento de receptores correspondientes a proteínas particulares son conocidos en la técnica, y un número de técnicas están disponibles y pueden ser aplicadas a los factores del presente invento. Por ejemplo, en relación con IL-6 e IFN\gamma el lector es referido a Novick, D.; y otros, J. Chromatogr. (1990) 510: 331-7. Con respecto a la hormona de liberación de gonadotropina se hace referencia a Hazum, E., J. (1990) Chromatogr. 510: 233-8. En relación a G-CSF se hace referencia a Fukunaga, R., y otros, J. Biol. Chem., 265; 13386-90. En relación a IL-2 se hace referencia a Smart, J. E., y otros, (1990) J. Invest. Dermatol., 94: 158S-163S, y en relación a IFN-gamma humano se hace referencia a Stefanos, S, y otros, (1989) J. Interferon Res., 9: 719-30.

Breve descripción de los dibujos

Los dibujos serán primero descritos.

Dibujos

Las Figuras 1 a 8 se refieren al Ejemplo 1, y son brevemente descritas a continuación:

La Fig. 1 es el perfil para el producto de cromatografía en carboximetil celulosa;

La Fig. 2 es el perfil para el producto de hidroxiapatito HPLC;

La Fig. 3 es el perfil para el producto de Mono S FPLC;

La Fig. 4 es el perfil para el producto de FPLC por filtración en gel;

Las Figs. 5 y 6 describen los perfiles para dos de los productos polipeptídicos parcialmente purificados a partir del HPLC de fase inversa; y

Las Figs. 7 y 8 describen las curvas de dosis-respuesta para las fracciones GGF-I y GGF-II del HPLC de fase inversa usando bien un fondo de un suero de ternera fetal o de plasma de ternera fetal;

Las Figs. 9 a 12 describen las secuencias peptídicas derivadas de GGF-I y GGF-II, SEQ ID Nºs. 1-20, 22-29, 32-41, 43, y 44-53, 169, (véase el Ejemplo 2 más adelante);

La Fig. 9 muestra las 21 secuencias peptídicas (SEQ ID Nºs 1-20, y 169, obtenidas de la digestión con lisil endopeptidasa y proteasa V8 de GGF-1 de pituitaria bovina purificada);

En la Fig. 10 A y 10 B, las secuencias de los péptidos GGF-I usados para diseñar sondas oligonucleotídicas degeneradas y cebadores de PCR degenerados están listadas (SEQ ID Nºs 1, 22-29, y 17). Algunas de las secuencias en la Fig. 10 A fueron también usadas para diseñar péptidos sintéticos. La Fig. 10B es un listado de las secuencias de los péptidos que eran demasiado cortos (menos de 9 aminoácidos) para el diseño de sondas degeneradas o cebadores de PCR degenerados (SEQ ID Nºs. 19 y 32);

La Fig. 11 muestra diversas secuencias peptídicas de tripsina y lisil endopeptidasa C derivadas de GGF-II, SEQ ID Nºs 33-34, 164-166, 51, y 52.

En la Fig. 12, el Panel A, es un listado de las secuencias de los péptidos GGF-II usados para diseñar sondas oligonucleotídicas degeneradas y cebadores de PCR degenerados (SEQ ID Nºs. 45-52). Algunas de las secuencias en el Panel A fueron usadas para diseñar péptidos sintéticos. El panel B es un listado del péptido que era demasiado corto (menos de 6 aminoácidos) para el diseño de sondas degeneradas o cebadores de PCR degenerados (SEQ ID Nº.
53);

Las Figuras 13 a 20 se refieren al Ejemplo 3, a continuación y describen la actividad mitogénica de los factores del invento;

La Figura 13 muestra una gráfica que compara un BrUdR-ELISA y métodos de contaje de [^{125}I]UdR para el ensayo de la síntesis del ADN en cultivos de células de Schwann.

Las Figs. 14A y 14B muestran las gráficas que comparan la inmunoreactividad Br-UdR con el número de células marcadas Br-UdR.

La Fig. 15 muestra la respuesta mitogénica de las células de Schwann del nervio ciático de rata a GGFs.

La Fig. 16 muestra una gráfica de cuantificación de la síntesis de ADN en células de Schwann del nervio ciático de rata y fibroblastos 3T3 en presencia de GGFs.

La Fig. 17 muestra una gráfica de la respuesta mitogénica de las células BHK 21 C13 a FCS y a GGFs.

La Fig. 18 muestra una gráfica de supervivencia y proliferación de microcultivos de células BH 21 C13 después de 48 horas en presencia de GGFs.

La Fig. 19 muestra una gráfica de la respuesta mitogénica de las células C6 a FCS.

Las Figs. 20A y 20B son gráficas que muestran la respuesta mitogénica de las células C6 a aFGF y GGFs.

Las Figuras 21 a 28 (a, b y c) se refieren al Ejemplo 4, a continuación y se describen brevemente a continuación:

La Fig. 21 es un listado de las sondas oligonucleotídicas degeneradas (SEQ ID Nºs. 54-76, 78-88) designadas por las secuencias peptídica en la Figura 10, Panel A y Figura 12, Panel A;

La Fig. 22 describe un fragmento de la secuencia génica del GGF-II bovino putativa a partir del fago genómico GGF2BG1 bovino recombinante, que contiene el sitio de unión de las sondas oligonucleotídicas degeneradas 609 y 650 (véase la Figura 21, SEQ ID Nºs 69 y 72, respectivamente). La figura es la hebra codificante de la secuencia de ADN (SEQ ID Nº 89) y la secuencia aminoacídica deducida (SEQ ID Nº 169) en el tercer marco de lectura. La secuencia del péptido 12 del factor 2 (en negrita) es parte de un marco de lectura abierta de 66 aminoácidos (nucleótidos 75272);

La Fig. 23A muestra los cebadores de PCR degenerados SEQ ID Nºs 90-108) y la Fig. 22B muestra los cebadores de PCR únicos SEQ ID Nºs 109-119) usados en los experimentos para aislar los segmentos de las secuencias codificantes GGF-II bovinas presentes en el ARN a partir de la pituitaria posterior;

La Fig. 24 describe las nueve estructuras y secuencias de cADN de GGF-II bovina contiguas distintas que fueron obtenidas en experimentos de amplificación de PCR usando la lista de cebadores en la Figura 12, Paneles A y B, y el ARN de la pituitaria posterior. La línea superior de la Figura es un esquema de las secuencias codificantes que contribuyen a las estructuras de cADN que fueron caracterizadas;

La Fig. 25 es un mapa físico del fago de GGF2BG1 recombinante bovina. El fragmento bovino es aproximadamente 20 kb de longitud y contiene dos exones (negrita) del gen GGF-II bovino. Los sitios de restricción para las enzimas Xba1, SpeI, Nde1, EcoR1, Kpn1, y SstI han sido colocados en este mapa físico. Las porciones sombreadas corresponden a fragmentos que fueron subclonados para secuenciación;

La Fig. 26 es un esquema de la estructura de tres productos génicos alternativos del gen GGF-II bovino putativo. Los exones se listan A hasta E en orden de su descubrimiento. Los patrones de corte y empalme alternativos 1, 2 y 3 generan tres estructuras proteicas deducidas solapantes (GGF2BPP1, 2, y 3), que se muestran en las diversas Figuras 28a, b, c (descritas a continuación);

La Fig. 27 (SEQ ID Nºs. 120-132, 45, 52, y 53) es una comparación de las secuencias GGF-I y GGF-II identificadas en las secuencias proteicas deducidas mostradas en las Figuras 28A-28E (descritas a continuación) con las secuencias peptídicas listadas en las Figuras 10 y 12. La Figura muestra que seis de las nueve secuencias peptídicas GGF-II se explican en estas secuencias proteicas deducidas. Se encontraron también dos secuencias peptídicas similares a
GGF-I.

La Fig 28A es un listado de la secuencia de ADN de la hebra codificante (SEQ ID Nº 133) y la secuencia aminoacídica deducida (SEQ ID Nº 190) del cADN obtenido a partir del patrón de corte y empalme número 1 en la Figura 26. Este cADN parcial del gen GGF-II bovino putativo codifica una proteína de 206 aminoácidos de longitud. Los péptidos en negrita fueron los identificados a partir de las listas presentadas en las Figuras 10 y 12. Los sitios potenciales de glicosilación están subrayados (junto con la señal de poliadenilación AATAAA (SEQ ID Nº 189);

La Fig. 28(B-C) es un listado de la secuencia de ADN de la hebra codificante (SEQ ID Nº 134) y la secuencia aminoacídica deducida (SEQ ID Nº 91) del cADN obtenido del patrón de corte y empalme número 2 en la Figura 26. Este cADN parcial del gen GGF-II bovino putativo codifica una proteína de 281 aminoácidos de longitud. Los péptidos en negrita son los identificados a partir de las listas presentadas en las Figuras 10 y 12. Los sitios de glicosilación potenciales están subrayados (junto con la señal de poliadenilación AATAAA (SEQ ID Nº 189);

La Fig. 28 (D-E) es un listado de la secuencia de ADN de la hebra codificante (SEQ ID Nº 135) y la secuencia aminoacídica deducida (SEQ ID Nº 193) del cADN obtenido a partir del patrón de corte y empalme número 3 en la Figura 26. Este cADN parcial del gen GGF-II bovino putativo codifica una proteína de 257 aminoácidos de longitud. Los péptidos en negrita son los identificados a partir de las listas en las Figuras 10 y 12. Los sitios de glicosilación potenciales están subrayados (junto con la señal de poliadenilación AATAAA (SEQ ID Nº 189).

La Fig. 29, que se refiere al Ejemplo 6 a continuación, es un autoradiograma de un análisis de hibridación cruzada de las secuencias del gen GGF-II bovino putativo con una variedad de ADNs de mamífero en una transferencia Southern. El filtro contiene los carriles del ADN digerido con EcoRI (5 \mug por carril) de las especies listadas en la Figura. La sonda detecta una única banda fuerte en cada muestra de ADN, incluyendo un fragmento de cuatro kilobases en el ADN bovino como se anticipó por el mapa físico en la Figura 25. Se observan también las bandas de intensidad relativamente menor, que podrían representar las secuencias de ADN relacionadas. La banda que hibrida de modo fuerte a partir de cada una de las otras muestras de ADN de mamífero representan el homólogo GGF-II de estas especies.

La Fig. 30 es un diagrama de variantes de corte y empalme representativas. Los segmentos codificantes se representan por F, E, B, A, G, C, C/D, C/D', D, D', H, K y L. La localización de las secuencias peptídicas derivadas de la proteína purificada se indican mediante "o".

La Fig. 31 (A-R) es un listado de las secuencias de ADN (SEQ ID Nºs 42, 44, 77, 136-147, 160, 161, 163, y 173-179) son secuencias peptídicas predichas de los segmentos codificantes de GGF. La línea 1 es un listado de las secuencias aminoacídicas predichas del GGF bovino, la línea 2 es un listado de las secuencias nucleotídicas del GGF bovino, la línea 3 es un listado de las secuencias nucleotídicas del GGF humano (heregulina) (los emparejamientos de bases nucleotídicas se indican con una línea vertical) y la línea 4 es un listado de las secuencias aminoacídicas predichas del GGF/heregulina humano en el que difiere de la secuencia bovina predicha. los segmentos codificantes E, A' y K representan sólo las secuencias bovinas. El segmento codificante D' representa sólo la secuencia humana (heregulina)

La Fig. 32 (A-B) es la secuencia aminoacídica de GGF2 predicha y la secuencia nucleotídica de BPP5 (SEQ ID Nº 195 y SEQ ID Nº 148, respectivamente) La línea superior es la secuencia nucleotídica y la línea inferior es la secuencia aminoacídica predicha.

La Fig. 33 (A-B) es la secuencia aminoacídica predicha y la secuencia nucleotídica de GGF2BPP2 (SEQ ID Nº 149 y SEQ ID Nº 192, respectivamente. La línea superior es la secuencia nucleotídica y la línea inferior es la secuencia aminoacídica predicha.

La Fig. 34 (A-F) es la secuencia aminoacídica predicha y la secuencia nucleotídica de GGF2BPP4 (SEQ ID Nº 194 y SEQ ID Nº 150, respectivamente) La línea superior es la secuencia nucleotídica y la línea inferior es la secuencia aminoacídica predicha.

La Fig. 35 (SEQ ID Nºs. 151-152) describe el alineamiento de dos secuencias peptídicas de GGF (GGF2bpp4 y GGF2bpp5) con el EGF humano (hEGF). Los asteriscos indican posiciones de cisteínas conservadas.

La Fig. 36 describe el nivel de actividad de GGF (ensayo mitogénico de células de Schwann) y fosforilación en tirosinas de una proteína de aprox. 200 KD (intensidad de una banda de 200 kD en un autoradiograma de una transferencia Western desarrollada con un anticuerpo antifosfotirosina policlonal) en respuesta a cantidades crecientes de GGF.

La Fig. 37 (A-B) es una lista de variantes de corte y empalme derivadas de las secuencias mostradas en la Figura 31 (A-R)

La Fig. 38 es la secuencia aminoacídica predicha, parte inferior (SEQ ID Nº 220), y la secuencia nucleica, parte superior, de EGFL1 (SEQ ID Nº. 154).

La Fig. 39 es la secuencia aminoacídica predicha, parte inferior (SEQ ID Nº 221), y la secuencia nucleica, parte superior, de EGFL2 (SEQ ID Nº. 155).

La Fig. 40 es la secuencia aminoacídica predicha, parte inferior (SEQ ID Nº 222), y la secuencia nucleica, parte superior, de EGFL3 (SEQ ID Nº. 156).

La Fig. 41 es la secuencia aminoacídica predicha, parte inferior (SEQ ID Nº 223), y la secuencia nucleica, parte superior, de EGFL4 (SEQ ID Nº. 157).

La Fig. 42 es la secuencia aminoacídica predicha, parte inferior (SEQ ID Nº 224), y la secuencia nucleica, parte superior, de EGFL5 (SEQ ID Nº. 158).

La Fig. 43 es la secuencia aminoacídica predicha, parte inferior (SEQ ID Nº 225), y la secuencia nucleica, parte superior, de EGFL6 (SEQ ID Nº. 159).

La Fig. 44 es un mapa de un segmento codificante a escala del clón. T3 se refiere al promotor del bacteriófago usado para producir mARN a partir del clón. R= los sitios de la enzima de restricción EcoRI flanqueantes. 5' UT se refiere a la región 5' no traducida. E, B, A, C, C/D', y D se refieren a los segmentos codificantes. O = sitio de iniciación de la traducción. A = el límite 5' de la región homóloga con el segmento E bovino (véase el ejemplo 6) y 3' UT se refiere a la región 3' no traducida.

La Fig. 45 (A-D) es la secuencia aminoacídica predicha (zona media) (SEQ ID Nº 170), y la secuencia de ácidos nucleicos (parte superior) (SEQ ID Nº 219) del GGF2HBS5. La secuencia inferior (intermitente) representa las secuencias peptídicas derivadas de las preparaciones GGF-II (véase las Figuras 11, 12).

La Fig. 46 es una gráfica que describe la actividad mitogénica de las células de Schwann de los factores de crecimiento humano y bovino glial recombinante.

La Fig. 47 es una curva de dosis-respuesta que describe los datos de actividad de proliferación de células de Schwann que resulta de la administración de alícuotas de diferente tamaño de medio condicionado de células CHO.

La Fig. 48 es una curva dosis-respuesta que describe la actividad mitogénica de células de Schwann secretada en el medio extracelular por células Sf9 de insecto infectadas con baculovirus que contiene el clón de cADN GGF2HBS5.

La Fig. 49 es una transferencia Western de medio condicionado de células CHO recombinante usando un anticuerpo del péptido GGF.

La Fig. 50 (A) es una gráfica de actividad de proliferación de células de Schwann de GGF-II humano (producido por células CHO) recombinante (rhGGF-II) del pico eluido de la columna de intercambio catiónico; (B) es una inmunotransferencia frente al pico GGFII recombinante usando anticuerpo policlonal hecho frente a un péptido específico de rhGGFII;

La Fig. 51 (A-C) es una gráfica que muestra la purificación de rhGGF-II (producido por células CHO) en una columna de intercambio catiónico por fracción. (B-C) es una fotografía de una transferencia Western usando fracciones como se describe en (A) y un anticuerpo específico para rhGGF-II.

La Fig. 52 es una fotografía de un gel que describe la fosforilación en tirosina en las células de Schwann tratadas con factores de crecimiento glial recombinantes.

La Fig. 53 es las secuencias de los polipéptidos GGFHBS5, GGFHFB1 y GGFBPP5 (SEQ ID NºS: 170, 171, y 172, respectivamente).

La Fig. 54 es un mapa del vector de expresión en células CHO pcDHFRpoliA.

Descripción detallada

El invento concierne al aislamiento y purificación de factores de crecimiento glial nuevos y a la clonación de secuencias de ADN que codifican para estos factores. Otros componentes del invento son varias variantes de corte y empalme génico que potencialmente codifican una serie de factores de crecimiento glial, en particular el GGF2HBS5 en una variante particular que codifica el equivalente humano del GGF-II bovino. Es evidente que el gen que codifica GGFs y proteínas de unión a p185^{erbB2} produce un número de tránscritos de ARN de tamaño variable, cortados y empalmados de modo diferencial para dar lugar a una serie de proteínas, que son de diferentes longitudes y contienen algunas secuencias peptídicas comunes y algunas secuencias peptídicas únicas. Esto está apoyado por las secuencias cortadas y empalmadas de modo diferencial que son recuperables del ARN de la pituitaria posterior bovina (como se presenta aquí), de ARN de cáncer de mama humano (MDA-MB-231) (Holmes y otros, Science 256: 1205 (1992) y ARN de cerebro de pollo (Falls y otros, Cell 72: 1-20 (1993)). Un apoyo adicional se deriva del amplio intervalo de tamaños de proteínas que actúan tanto como mitógenos para las células de Schwann (como se describe aquí) como como ligandos para el receptor p185^{erbB2} (véase a continuación).

Una evidencia adicional para apoyar el hecho de que los genes que codifican para GGF y p185^{erbB2} son homólogos viene de la comparación de las secuencias nucleotídicas. Science, 256 (1992), 1205-1210) Holmes y otros, demostraron la purificación de una proteína humana de 45 kilodaltones (Heregulina-\alpha) que interacciona de modo específico con la proteína receptora p185^{erbB2}, que se asocia con varias enfermedades humanas. Varios clones de ADN complementario que codifican la Heregulina-\alpha fueron aislados. Peles y otros (Cell 69: 205 (1992)) y Wen y otros (Cell 69: 559 (1992)) describen un ADN complementario aislado a partir de células de rata que codifica una proteína llamada "factor de diferenciación neu" (NDF). El producto de traducción del cADN de NDF tiene actividad de unión a p185^{erbB2}. Usdin y Fischbach, J. Cell. Biol. 103: 493-507 (1986); Falls y otros, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 55: 397-406 (1990); Harris y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 7664-7668 (1991); y Falls y otros, Cell 72: 801-815 (1993) demuestran la purificación de una glicoproteína de 42 Kd que interaccion con una proteína receptora p185^{erbB2} y se aislaron varios clones de cADN complementarios (Falls y otros Cell 72: 801-815 (1993). Varios otros grupos han documentado la purificación de proteínas de diversos pesos moleculares con actividad de unión a p185^{erbB2}. Estos grupos incluyen Lupu y otros (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 2287; Yarden y Peles (1991) Biochemistry 30: 3543; Lupu y otros. (1990) Science 249: 1552); Dobashi y otros. (1991) Biochem. Biophys. Res. Comm. 179: 1536; y Huang y otros. (1992). J. Biol. Chem. 257: 11508-11512.

Otras realizaciones

El invento incluye cualquier proteína que es sustancialmente homóloga a los segmentos codificantes en la Figura 31, como se define aquí anteriormente, así como otros polipéptidos GGF presentes de manera natural. También están incluidos: variaciones alélicas; mutantes naturales; mutantes inducidos; proteínas codificadas por ADN que hibridan en condiciones de alta o baja rigurosidad a un ácido nucleico presente de manera natural (para definiciones en alta o baja rigurosidad véase Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, 1989, 6.3.1-6.3.6; y polipéptidos o proteínas específicamente unidas por antisueros al polipéptido GGF. El término también incluye polipéptidos quiméricos que incluyen los polipéptidos GGF que comprenden secuencias de la Figura 31.

Los siguientes ejemplos no pretenden limitar el invento, sino que se proporcionan para ilustrar de modo útil el mismo, y proporcionar una guía específica para técnicas preparativas eficaces.

Como se verá del Ejemplo 3, a continuación, los presentes factores exhiben actividad mitogénica en un intervalo de tipos celulares. La actividad en relación con fibroblastos indican una capacidad de reparación de heridas, y el invento abarca este uso. Las afirmaciones generales del invento anteriores en relación con formulaciones y/o medicamentos y su fabricación debería interpretarse claramente a modo de que incluyan productos y usos apropiados. Esto es claramente una expectativa razonable para el presente invento, dados los documentos de actividades similares para factores de crecimiento de fibroblastos (FGFs). Se puede hacer referencia, por ejemplo, a Sporn y otros, "Peptide Growth Factores and their Receptors I", página 396 (Baird y Bohlen) en la sección enunciada "FGFs in Wound Healing and Tissue Repair".

Ejemplo 1 Purificación de GGF-1 y GGF-II a partir de pituitarias bovinas I. Preparación de la Fracción Factor-CM

4.000 pituitarias bovinas completas congeladas (aprox. 12 kg) fueron descongeladas durante toda la noche, lavadas brevemente con agua y después homogeneizadas en un volumen igual de sulfato amónico 0,15 M en lotes en un licuadora Waring. El homogenado fue llevado a pH 4,5 con HCl 1,0 M y centrifugado a 4.900 g durante 80 minutos. Cualquier material graso en el sobrenadantes fue eliminado haciéndolo pasar por lana de vidrio. Después de tomar el pH del sobrenadante a 6,5 usando NaOH 1,0 M, se añadió sulfato amónico sólido para dar una disolución saturada al 36%. Después de varias horas de agitación, la suspensión fue centrifugada a 4.900 g durante 80 min y el precipitado fue descartado. Después de filtración a través de lana de vidrio, se añadió al sobrenadante sulfato amónico sólido adicional para dar una disolución saturada al 75% que fue de nuevo centrifugada a 4.900 g durante 80 minutos después de varias horas de agitación. El precipitado fue resuspendido en aprox. 2 L de fosfato sódico 0,1 M pH 6.0 y dializado frente a 3 x 40 L del mismo tampón. Después de confirmar que la conductividad del dializado estaba por debajo de 20,0 \muSiemens, se cargó en una columna Bioprocess (120 x 113 mm, Pharmacia) empaquetada con carboximetil celulosa (CM-52, Whatman) a un caudal de 2 ml min^{-1}. La columna fue lavada con 2 volúmenes de fosfato sódico 0,1 M pH 6,0, seguido de 2 volúmenes de NaCl 50 mM, y finalmente 2 volúmenes de NaCl 0,2 M ambos en el mismo tampón. Durante la etapa final, se recogieron fracciones de 10 ml (5 minutos). Las fracciones 73 a 118 inclusive fueron reunidas, dializadas frente a 10 volúmenes de fosfato sódico 10 mM pH 6,0 dos veces y clarificadas por centrifugación a 100.000 g durante 60 minutos.

II. Hidroxiapatito-HPLC

Hidroxiapatito-HPLC no es una técnica hasta ahora usada para aislar factores de crecimiento glial, pero ha demostrado ser particularmente eficaz en este invento. El material obtenido de la cromatografía de CM-celulosa anterior fue filtrado a través de un filtro de 0,22 \mum (Nalgene), cargado a temperatura ambiente sobre una columna de hidroxiapatito de alto rendimiento (50 x 50 mm, Biorad) equipada con una carcasa de columna (15 x 25 mm, Biorad) y equilibrada con fosfato potásico 10 mM pH 6,0. La elución a temperatura ambiente fue llevada a cabo a un caudal de 2 ml.minuto^{-1} usando el siguiente gradiente lineal programado:

Tiempo (min)	%B	Disolvente A: fosfato potásico 10 mM pH 6.0
0,0	0	Disolvente B: fosfato potásico 1,0 M pH 6.0
5,0	0
7,0	20
70,0	20
150,0	100
180,0	100
185,0	0

fracciones de 6,0 ml (3 minutos) fueron recogidas durante el gradiente de elución. Las fracciones 39-45 fueron reunidas y dializadas frente a 10 volúmenes de fosfato sódico 50 mM pH 6,0.

III. Mono S FPLC

Mono S FPLC permitió preparar un material más concentrado para una subsiguiente filtración en gel.

Cualquier material particulado en el material reunido de la columna de hidroxiapatito fue eliminado mediante una centrigufación clarificadora a 100.000 g durante 60 minutos previo a la carga en la columna de intercambio catiónico HR10/10 Mono S preparativa (100 x 10 mm, Pharmacia) que fue después reequilibrada con fosfato sódico 50 mM pH 6,0 a temperatura ambiente con un caudal de 1,0 ml/minuto^{-1}. en estas condiciones, la proteína unida fue eluida usando el siguiente gradiente lineal programado:

Tiempo (min)	%B	Disolvente A: fosfato potásico 50 mM pH 6,0
0,0	0	Disolvente B:Cloruro sódico 1,2 M, fosfato sódico 50 mM pH 6,0
70,0	30
240,0	100
250,0	100
260,0	0

fracciones de 1 ml (1 minuto) fueron recogidas a través del programa de gradiente. Las fracciones 99 a 115 inclusive fueron reunidas.

IV. FPLC por filtración en gel

Esta etapa comenzó la separación de los dos factores del invento previo a la purificación final, produciendo fracciones enriquecidas.

Para los propósitos de esta etapa, una columna de FPLC Superosa 12 preparativa (512 x 20 mm, Pharmacia) fue empaquetada según las instrucciones de los fabricantes. Para estandarizar esta columna, se hizo una medida de placas según las instrucciones de los fabricantes, dando un valor de 9.700 placas teóricas.

La cantidad reunida del material eluído de Mono S fue aplicado a temperatura ambiente en alícuotas de 2,5 ml a esta columna en fosfato sódico 50 mM, NaCl 0,75 M pH 6,0 (previamente pasado a través de una columna C18 de fase inversa (Sep-pak, Millipore)) a un caudal de 1,0 ml/minuto^{-1}. Fracciones de 1 ml (0,5 minutos) fueron recogidas desde 35 minutos después de que cada muestra fuera aplicada a la columna. Las fracciones 27 a 41 (GGF-II) y 42 a 57 (GGF-I) inclusive de cada ensayo fueron reunidas.

V. HPLC de fase inversa

Las muestras reunidas de GGF-I y GGF-II a partir de los ensayos de Superosa 12 anterior fueron divididas cada una en tres alícuotas iguales. Cada alícuota fue cargada sobre una columna C8 de fase inversa (Aquapore RP-300 7 \mu C8 220 x 4,6 mm, Applied Biosystems) protegidas por una carcasa de cartucho (RP-8, 15 x 3,2 mm, Applied Biosystems) y equilibradas a 40ºC a 0,5 ml.minuto. La proteína fue eluída en estas condiciones usando el siguiente gradiente lineal programado:

Tiempo (min)	%B	Disolvente A: ácido trifluoroacético (TFA)
0		Disolvente B: acetonitrilo 90%, TFA 0,1%
60	66,6
62,0	100
72,0	100
75,0	0

fracciones de 200 \mul (0,4 minutos) fueron recogidas en tubos de silicona (tubos Multilube, Bioquote) desde 15,2 minutos después del comienzo del gradiente programado.

VI. Electroforesis en gel de SDS- Poliacrilamida

En esta etapa, se emplearon los patrones de pesos moleculares de proteínas, de intervalo bajo, nº de catálogo 161-0304, de Bio-Rad Laboratories Limited, Watford, Inglaterra. Las proteínas usadas en concreto, y sus patrones de pesos moleculares, han sido listadas aquí previamente.

Las fracciones 47 a 53 (GGF-I) y las fracciones 61 a 67 (GGFII) inclusive de los ensayos en fase inversa fueron reunidas individualmente. 7 \mul del material reunido fueron hervidos en un volúmen igual de Tris-Cl 0,0125 M, SDS 4%, glicerol 20%, y \beta-mercaptoetanol 10% para GGF-I, durante 5 minutos y cargados en un gel Laemmli de poliacrilamida 11% con un gel concentrante al 4% y corridos a un voltaje constante de 50 V durante 16 horas. Este gel fue entonces fijado y teñido usando un kit de tinción con plata (Amersham). En estas condiciones, los factores son vistos cada uno como una banda algo difusa a pesos moleculares relativos de 30.000 a 36.000 Daltones (GGF-I) y 55.000 a 63.000 Daltones (GGFII) como se definen por marcadores de peso molecular. A partir de la tinción del gel, es evidente que hay un pequeño número de otras especies proteicas presentes a niveles equivalentes a las especies GGF-I y GGF-II en el material reunido de los ensayos de fase inversa.

VII. Estabilidad en ácido trifluoroacético

Los datos de estabilidad fueron obtenidos para los presentes factores en presencia de ácido trifluoroacético, como se muestra a continuación:

GGF-I: El material de HPLC de fase inversa, en presencia de TFA 0,1% y acetonitrilo, fue ensayado dentro de las 12 horas de que se completara el paso por la columna y luego después de 10 semanas de incubación a 40ºC. Después de incubación, el GGF-I tuvo al menos un 50% de la actividad del material ensayado directamente al salir de la
columna.

GGF-II: El material del HPLC de fase inversa, en presencia de TFA 0,1% y acetonitrilo, y almacenado a -20ºC, fue ensayado después de ser descongelado y luego después de 4 días de incubación a 40ºC. Tras incubación, el GGF-II tuvo al menos 50% de la actividad del material recién descongelado.

Se apreciará que la concentración del ácido trifluoroacético usado en los estudios anteriores es el más comúnmente usado para cromatografía de fase inversa.

VIII. Condiciones de ensayo de la actividad

A menos que se indique de otro modo, todas las operaciones fueron llevadas a cabo a 37ºC, y, con referencia a las Figuras 1 a 6, la actividad en cada etapa fue determinada usando las técnicas Brockes (Meth. Enz., supra) con las siguientes modificaciones. Así, para preparar las células de Schwann, se añadió forskolina 5 \muM junto con DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium), FCS y GGF. Las células usadas en el ensayo fueron células de Schwann libres de fibroblastos con un número de pases menor de 10, y estas células fueron retiradas de las botellas con tripsina y puestas en placas de 96 pocillos de fondo plano a 3,3 mil células por pocillo.

[^{125}I]IUDR fue añadido durante las 24 horas finales después de la adición de la disolución de ensayo. La incorporación de fondo (sin estimular) a cada ensayo fue menor de 100 cpm, y la incorporación máxima fue de 20 a 200 veces por encima del fondo dependiendo del lote de células de Schwann y el número de pases.

En el caso de las fracciones GGF-I y GGF-II de HPLC de fase inversa como se describe anteriormente, se produjeron también dos curvas de dosis-respuesta para cada factor, usando exactamente el método anterior para una de las curvas para cada factor, y el método anterior modificado en el procedimiento de ensayo sólo sustituyendo plasma de ternera fetal por suero de ternera fetal para obtener la otra curva para cada factor. Los resultados están en las Figuras 7 y 8.

Ejemplo 2 Secuencias aminoacídicas de GGF-I y GGF-II purificadas

Los estudios de análisis de secuencias aminoacídicas fueron realizados usando GGF-I y GGF-II de pituitaria bovina altamente purificada. Se usó el código convencional de letra única para describir las secuencias. Los péptidos fueron obtenidos mediante digestión por lisil endopeptidasa y proteasa V8, llevado a cabo en muestras reducidas y carboximetiladas, con las digestiones de lisil endopeptidasa de GGF-II llevado a cabo en material eluído de la región 55-65 RD de un SDS-PAGE 11% (PM relativo a los marcadores anteriormente citados).

Un total de 21 secuencias peptídicas (véase la Figura 9, SEQ IN Nºs 1-20, 169) fueron obtenidas para GGF-I, de los cuales 12 péptidos (véase la Figura 10, SEQ ID Nºs 1, 22-29, 17, 19, y 32) no están presentes en las bases de datos de proteínas actuales y por lo tanto representa secuencias únicas. Un total de 12 secuencias peptídicas (véase la Figura 11, SEQ ID Nºs 33-39, 51, 52, y 164-166 fueron obtenidas para GGF-II, de las cuales 10 péptidos (véase la Figura 12, SEQ ID Nºs 45-53) no están presentes en las bases de datos de proteínas actuales y por lo tanto representan secuencias únicas (una excepción es el péptido GGF-II 06 que muestra secuencias idénticas en muchas proteínas que probablemente no tienen significancia dado el pequeño número de residuos). Estas secuencias nuevas es extremadamente probable que correspondan a porciones de las secuencias aminoacídicas de GGFs I y II.

Se puede atraer una atención particular a las secuencias GGF-I 07 y GGF-II 12, que están claramente muy relacionadas. Las similitudes indican que las secuencias de estos péptidos son casi con certeza las de las especies GGF asignadas, y es muy poco probable que se deriven de proteínas contaminantes.

Además, en el péptido GGF-II 02, la secuencia X S S es consistente con la presencia de un resto carbohidrato unido por su extremo N a una asparagina en la posición indicada por X.

En general, en las Figuras 9 y 11, X representa un residuo desconocido que indica un ciclo de secuenciación en el que no podría llamarse con seguridad una posición única bien porque haya más de una señal de igual tamaño en el ciclo o bien porque no haya ninguna señal presente. Como el asterisco indica, esos péptidos en los que el último aminoácido mencionado corresponde con el último aminoácido presente en ese péptido. En los péptidos restantes, la fuerza de señal después del último aminoácido mencionado fue insuficiente para continuar llamando la secuencia hasta el final del péptido. La columna de la derecha indica el resultado de una búsqueda de bases de datos computerizada usando los programas de empaquetamiento de GCG FASTA Y TFASTA para analizar las bases de datos de secuencias de NBRF y EMBL. El nombre de una proteína en esta columna indica la identidad de una porción de su secuencia con la secuencia aminoacídica del péptido mencionado permitiendo un máximo de dos errores de emparejamiento. Un signo de interrogación demuestra tres errores de emparejamiento permitidos. Las abreviaturas usadas son como sigue:

HMG-1	Proteína 1 del grupo de alta movilidad
HMG-2	Proteína 2 del grupo de alta movilidad
LH-alfa	subunida alfa de la hormona luteinizante
LH-beta	subunida beta de la hormona luteinizante

Ejemplo 3 Actividad mitogénica de GGF-I y GGF-II purificado

La actividad mitogénica de una muestra altamente purificada que contiene tanto GGF I como II fue estudiada usando un método cuantitativo, que permite un microcultivo único para ser examinado en lo que se refiere a la síntesis de ADN, morfología celular, número de células y expresión de antígenos celulares. Esta técnica ha sido modificada de un método documentado anteriormente por Muir y otros, Analytical Biochemistry 185, 377-382, 1990. Las principales modificaciones son: 1) el uso de placas de microvaloración sin recubrir, 2) el número de céulas por pocillo, 3) el uso de plasma bovino fetal (FBP) 5% en vez de suero de ternera fetal (FCS), y 4) el tiempo de incubación en presencia de mitógenos y bromodesoxiuridina (BrdU), añadido simultáneamente a los cultivos. Además, la monocapa celular no fue lavada antes de la fijación para evitar pérdidas de células, y el tiempo de incubación con anticuerpo anti-BrdU monoclonal de ratón y anticuerpo de inmunoglobulina (IgG) anti-ratón de cabra conjugado con peroxidasa fue duplicado para aumentar la sensibilidad del ensayo. El ensayo, optimizado para células de Schwann del nervio ciático de rata, ha sido también usado para varias líneas celulares, después de las modificaciones apropiadas a las condiciones de cultivo celular.

I. Método de ensayo de mitogénesis

A día 1, las células de Schwann purificadas fueron puestas en placas de 96 pocillos sin recubrir en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM)/FBP 5% (5.000 células/pocillo). A día 2, GGFs u otros factores de ensayo fueron añadidos a los cultivos, así como el BrdU a una concentración final de 10 \muM. Después de 48 horas (día 4) la incorporación de BrdU fue terminada aspirando el medio y las células fueron fijadas con 200 \mul/pocillo de etanol 70% durante 20 min a temperatura ambiente. A continuación, las células fueron lavadas con agua y el ADN fue desnaturalizado mediante incubación con 100 \mul de HCl 2N durante 10 min a 37ºC. Tras la aspiración, el ácido residual fue neutralizado rellenando los pocillos con tampón borato 0,1 M, pH 9,0, y las células fueron lavadas con tampón fosfato salino (PBS). Las células fueron después tratadas con 50 \mul de tampón de bloqueo (PBS que contiene Tritón X 100 0,1% y suero de cabra normal 2%) durante 15 min a 37ºC. Tras aspiración, el anticuerpo anti-BrdU monoclonal de ratón (Dako Corp., Santa Barbara, Ca) (50 \mul/pocillo, 1,4 \mug/ml diluido en tampón de bloqueo) fue añadido e incubado durante dos horas a 37ºC. Los anticuerpos sin unir fueron eliminados mediante tres lavado en PBS que contenía Tritón X-100 0,1% y se añadió anticuerpo IgG anti-ratón de cabra conjugado con peroxidasa (Dako Corp., Santa Barbara, CA) (50 \mul/pocillo, 2 \mug/ml diluído en tampón de bloqueo) y se incubó durante una hora a 37ºC. Después de tres lavados en PBS/Tritón y un lavado final en PBS, los pocillos recibieron 100 \mul/pocillo de tampón fosfato/citrato 50 mM, pH 5,0, que contenía 0,05% del cromógeno soluble o-fenilendiamina (OPD) y H_{2}O_{2} 0,02%. La reacción fue terminada después de 5-20 min a temperatura ambiente, pipeteando 80 \mul de cada pocillo a una placa que contenía 40 \mul/pocillo de ácido sulfúrico 2N. La absorbancia fue medida a 490 nm usando un lector de placas (Dynatech Labs). Las placas de ensayo que contenían las monocapas celulares fueron lavadas dos veces con PBS y teñidas para inmunocitoquímica para BrdU-ADN añadiendo 100 \mul/pocillo del sustrato diaminobenzicina (DAB) y H_{2}O_{2} para generar un producto insoluble. Después de 10-20 min la reacción de tinción fue parada lavando con agua, y los núcleos positivos para BrdU observados y contados usando un microscopio invertido. Ocasionalmente, los núcleos negativos fueron contrateñidos con Azul de Toluidina 0,001% y contados como antes.

II. Líneas celulares usadas para ensayos de mitogénesis

Fibroblastos Swiss 3T3: Las células, de los laboratorios Flow, fueron mantenidas en medio DMEM suplementado con FCS 10%, penicilina y estreptomicina, a 37ºC en una atmósfera humidificada de CO_{2} 10% en aire. Las células fueron alimentadas o subcultivadas cada dos días. Para el ensayo mitogénico, las células fueron puestas en placas a una densidad de 5.000 células/pocillo en medio completo e incubadas durante una semana hasta que las células estuvieron confluentes y quiescentes. El medio que contenía suero fue eliminado y la monocapa de células fue lavada dos veces con medio libre de suero. Se añadieron 100 \mul de suero libre de medio que contenía mitógenos y 10 \muM de BrdU a cada pocillo e incubadas durante 48 horas. Las respuestas a dosis para GGFs y suero o PDGF (como un testigo positivo) fueron realizadas.

Fibroblastos BHK (Baby Hamster Kidney) 21 C13: Las células de la colección europea de cultivos celulares animales (ECACC), fueron mantenidas en Medio Eagle Modificado Glasgow (GMEM) suplementado con caldo fosfato triptosa 5%, FCS 5%, penicilina y estreptomicina, a 37ºC en una atmósfera humidificada de CO_{2} 5% en aire. Las células fueron alimentadas o subcultivadas cada dos o tres días. Para el ensayo mitogénico, las células fueron puestas en placas a una densidad de 2.000 células/pocillo en medio completo durante 24 horas. El medio que contenía suero fue después retirado y después se lavó con medio libre de suero, se reemplazó con 100 \mul de GMEM que contenía FCS 0,1% o con GMEM solo. Se añadieron GGFs y FCS o bFGF como testigos negativos, simultáneamente con BrdU 10 \muM, y se incubaron durante 48 horas. Los cultivos celulares fueron después procesados como se describe para las células de Schwann.

Línea celular de glioma de rata C6: las células, obtenidas en el pase 39, fueron mantenidas en DMEM que contenía FCS 5%, suero de caballo (HS) 5%, penicilina y estreptomicina, a 37ºC en una atmósfera humidificada de CO_{2} 10% en aire. Las células fueron alimentadas o subcultivadas cada tres días. Para el ensayo mitogénico, las células fueron cultivadas a una densidad de 2.000 células/pocillo en medio completo e incubadas durante 24 horas. Después el medio fue reemplazado con una mezcla de DMEM 1:1 y medio F12 que contenía FCS 0,1%, después de lavar en medio libre de suero. Las respuestas a dosis de GGFs, FCS y \alphaFGF fueron después realizadas y las células fueron procesadas a través de ELISA como se describió previamente para otros tipos celulares.

PC12 (Células de feocromocitoma adrenal de rata): las células de ECACC, fueron mantenidas en RPMI 1640 suplementadas con HS 10%, FCS 5%, penicilina y estreptomicina, en frascos recubiertos de colágeno, a 37ºC en una atmósfera humidificada de CO_{2} 5% en aire. Las células fuero alimentadas cada tres días reemplazando el 80% del medio. Para el ensayo mitogénico, las células fueron puestas en placas a una densidad de 3.000 células/pocillo en medio completo, en placas recubiertas por colágeno (50 \mul/pocillo de colágeno, Vitrogen Collagen Corp., diluídas 1:50, 30 min a 37ºC) e incubadas durante 24 horas. El medio fue después reemplazado con RPMI nuevo bien solo o conteniendo insulina 1 mM o FCS 1%. Las respuestas a dosis de FCS/HS (1:2) como testigo positivo y de GGFs fueron realizadas como antes.

Después de 48 horas, las células fueron fijadas y el ELISA fue realizado como se describió previamente.

III. Resultados de los ensayos de mitogénesis

Los tres experimentos presentados en este Ejemplo fueron realizados usando una muestra altamente purificada a partir de una etapa de purificación cromatográfica en Sepharosa 12 (véase el Ejemplo 1, sección D) que contenía una mezcla de GGF-I y GGF-II (GGFs).

Primero, los resultados obtenidos con el ensayo de incorporación de BrdU fueron comparados con el ensayo mitogénico clásico para las células de Schwann basados en incorporación de [125]I-UdR en ADN de células en división, descritas por J.P. Brockes (Methods Enzymol. 147: 217, 1987).

La Figura 13 muestra la comparación de datos obtenidos con los dos ensayos, realizados en las mismas condiciones de cultivo celular (5.000 células/pocillo, en FBP/DMEM 5%, incubadas en presencia de GGFs durante 48h). Como se demuestra claramente, los resultados son comparables, pero el ensayo de incorporación de BrdU parece ser ligeramente más sensible, como se sugiere por el desplazamiento de la curva hacia la izquierda de la gráfica, es decir a concentraciones más bajas de GGFS.

Como se describe en la sección "Métodos de ensayos de mitogénesis", después de que la inmunoreactividad BrdU-ADN ha sido cuantificada leyendo la intensidad del producto soluble de la reacción de peroxidasa OPD, las placas de ensayo originales que contienen las monocapas celulares pueden ser sometidas a la segunda reacción dando como resultado el producto insoluble DAB, que tiñe los núcleos positivos para BrdU. Los microcultivos pueden ser entonces examinados en un microscopio invertido, y la morfología celular y el número de núcleos positivos y negativos para BrdU pueden ser observados.

En la Figura 14a y la Figura 14b la inmunoreactividad BrdU-ADN, evaluada leyendo la absorbancia a 490 nm, se compara al número de núcleos positivos para BrdU y al porcentaje de núcleos positivos para BrdU sobre el número total de células por pocillo, contadas en los mismos cultivos. Las desviaciones estándar fueron menores del 10%. Los dos métodos de evaluación muestran una muy buena correlación y la discrepancia entre los valores a la dosis más alta de GGFs puede ser explicada por el diferente grado de síntesis de ADN en células detectadas como positivas para BrdU.

El ensayo de incorporación de BrdU puede, por lo tanto, proporcionar información útil adicional acerca de la actividad biológica de los polipéptidos en las células de Schwann cuando se compara con el ensayo de incorporación de (125) I-UdR. Por ejemplo, los datos documentados en la Figura 15 muestran que los GGFs pueden actuar sobre las células de Schwann para inducir la síntesis de ADN, pero a dosis inferiores aumentar el número de células negativas presentes en el microcultivo después de 48 horas.

El ensayo ha sido después usado en varias líneas celulares de diferente origen. En la Figura 16 las respuestas mitogénicas de las células de Schwann y los fibroblastos Swiss 3T3 a GGFs son comparadas; pese a la débil repuesta obtenida en fibroblastos 3T3, algunos núcleos claramente positivos para brdU fueron detectados en estos cultivos. Los cultivos testigos fueron realizados en paralelo en presencia de varias dosis de FCS o PDGF recombinante humano, mostrando que las células podrían responder a estímulos apropiados (datos no mostrados).

La capacidad de los fibroblastos para responder a GGFs fue investigada además usando la línea celular BHK 21 C13. Estos fibroblastos, derivados de riñón, no exhiben inhibición por contacto ni alcanzan el estado quiescente cuando están confluentes. Por lo tanto las condiciones experimentales fueron diseñadas para tener una muy baja proliferación basal sin comprometer la viabilidad celular. Los GGFs tienen una actividad mitogénica significativa sobre las células BHK21 C13 como se muestra en la Figura 17 y Figura 18. La Figura 17 muestra que la incorporación de BrdU en el ADN por las células BHK 21 C13 estimuladas por GGFs en presencia de FCS 0,1%. La buena respuesta mitogénica a FCS indica que las condiciones de cultivo celular no fueron limitantes. En la Figura 18 el efecto mitogénico de GGFs se expresa como el número de células positivas para BrdU y negativas para BrdU y como el número total de células contadas por pocillo. Los datos son representativos de dos experimentos realizados en duplicados; al menos se contaron tres campos por pocillo. Como se observa para las células de Schwann además de un efecto proliferativo a bajas dosis, los GGFs también aumentan los números de células sobrevivientes que no responden. El porcentaje de células positivas para BrdU es proporcional a las cantidades crecientes de GGFs añadidas a los cultivos. El número total de células después de 48 horas en presencia de dosis más altas de GGFs es al menos duplicada, confirmando que los GGFs inducen la síntesis de ADN y la proliferación en células BHK21 C13. En las mismas condiciones, las células mantenidas durante 48 horas en presencia de FCS 2% mostraron un aumento de alrededor de 6 veces (datos no mostrados).

Las células de glioma C6 han proporcionado un modelo útil para estudiar las propiedades de las células gliales. El fenotipo expresado parece ser dependiente del número de pases celulares, las células se parecen más a un fenotipo de astrocitos en un estadío temprano, y a un fenotipo oligodendrocítico a estadíos más tardíos (más allá del pase 70). Las células C6 usadas en estos experimentos fueron del pase 39 al pase 52. Las células C6 son una población altamente proliferativa, por lo tanto las condiciones experimentales fueron optimizadas para tener un fondo muy bajo de incorporación de BrdU. La presencia de suero al 0,1% fue necesaria para mantener la viabilidad celular sin afectar significativamente a las respuestas mitogénicas, como se muestra por la respuestas a dosis de FCS
(Figura 19).

En la Figura 20 las respuestas mitogénicas a aFGF (factor de crecimiento de fibroblastos ácido) y GGFs son expresadas como los porcentajes máximos de incorporación de BrdU obtenidos en presencia de FCS (8%). Los valores son promedio de dos experimentos, realizados en duplicados. El efecto de los GGFs fue comparable al de una preparación pura de aFGF. aFGF ha sido descrito como un factor de crecimiento específico para las células C6 (Lim R. Y otros, Cell Regulation 1: 741-746, 1990) y por esa razón fue usado como testigo positivo. El contaje directo de células positivas y negativas para BrdU no fue posible debido a la alta densidad celular en los microcultivos. Al contrario que en las líneas celulares que se han documentado hasta ahora, las células PC12 no mostraron ninguna respuesta evidente a GGFS, cuando se trataron en condiciones de cultivo en las que PC12 pudieran responder a suero (mezcla de FCS y HS como se usan rutinariamente para el mantenimiento celular. Sin embargo, el número de células puestas en placas por pocillo parece que afectan el comportamiento de las células PC12, y por lo tanto se requieren experimentos adicionales.

Ejemplo 4 Aislamiento y clonación de secuencias nucleotídicas que codifican proteínas que contienen los péptidos GGF-I y GGF-II

El aislamiento y clonación de las secuencias nucleotídicas GGF-II fue realizado como se resume aquí, usando la información de las secuencias peptídicas y el cribado de la biblioteca, y se realizó como se expone a continuación. Se apreciará que los péptidos de las Figuras 4 y 5 pueden ser usados como el punto de partida para el aislamiento y clonación de las secuencias GGF-I siguiendo las técnicas descritas aquí. En realidad, la Figura 21, SEQ ID Nºs 54-76 y 78-88 muestra las posibles sondas oligonucleotídicas degeneradas para este propósito, y la Figura 23(A-B), SEQ ID Nºs 90-119, lista los posibles cebadores de PCR. La secuencia de ADN y la secuencia polipeptídica deberían ser obtenibles por estos medios como con GF-II, y también las construcciones de ADN y los vectores de expresión que incorporan tal secuencia de ADN, las células hospedadoras genéticamente alteradas que incorporan tales constructos/vectores, y las proteínas obtenibles cultivando tales células hospedadoras. El invento prevé tal materia sujeto.

I. Diseño y síntesis de sondas y cebadores oligonucleotídicos

Las sondas oligómeras de ADN degeneradas fueron diseñadas retrotraduciendo las secuencias aminoacídicas (derivadas a partir de los péptidos generados de la proteína GGF purificada) en las secuencias nucleotídicas. Los oligómeros representaron tanto la hebra codificante como la hebra no codificante de la secuencia de ADN. Cuando la serina, arginina o leucina fueron incluidas en el diseño del oligómero, entonces se prepararon dos síntesis por separado para evitar ambiguedades. Por ejemplo, la serina fue codificada bien por TCN o AGY como en 537 y 538 ó 609 y 610. La misma separación de codones se hizo para arginina o leucina (por ejemplo 544, 545). Los oligómeros de ADN fueron sintetizados en el sintetizador de ADN Biosearch 8750 4-column usando la química del \beta-cianoetil operada a escala de síntesis de 0,2 micromoles. Los oligómeros fueron retirados de la columna mediante corte (resinas CpG de 500 angstrom) y desprotegidos en hidróximo amónico concentrado durante 6-244 horas a 55-60ºC. Los oligómeros desprotegidos fueron secados al vacío (Speedvac) y purificados mediante electroforesis en geles de acrilamida 15% (20 mono : 1 bis), tampón Tris-borato-EDTA 50 mM que contenía urea 7 M. Los oligómeros de longitud completa fueron detectados en los geles mediante proyección de UV, después las bandas fueron cortadas y los oligómeros de ADN eluídos en 1,5 ml de H_{2}O durante 4-16 horas con agitación. El eluído fue secado redisuelto en 0,1 ml de H_{2}O y las medidas de absorbancia fueron tomadas a 260 nm.

Las concentraciones fueron determinadas según la siguiente fórmula:

(A 260 \times unidades/ml) (60,6/longitud = \times \muM)

Todos los oligómeros fueron ajustados hasta una concentración de 50 \muM mediante la adición de H_{2}O.

Las sondas degeneradas diseñadas como antes se muestran en la Figura 21, SEQ ID Nºs 54-76 y 78-88.

Los cebadores de PCR fueron preparados mediante los mismos procedimientos que fueron usados para las sondas con las siguientes modificaciones. Los sitios de unión de los trece nucleótidos que contienen sitios de restricción fueron incluidos en los extremos 5' de los oligómeros degenerados para usarlos en la clonación en los vectores. La síntesis de ADN fue realizada a una escala de 1 micromol usando una resina CpG de 1.000 angstrom y la inosina fue usada en las posiciones en las que los cuatro nucleótidos fueron incorporados normalmente en sondas degeneradas. Las purificaciones de los cebadores de PCR incluyeron una precipitación de metanol tras la purificación en gel de electroforesis.

II. Construcción y cribado de la biblioteca

Una biblioteca de ADN genómico bovina fue adquirida de Stratagene (número de catálogo: 945701). La biblioteca contenía 2 x 10^{6} fragmentos de ADN bovino de 15-20 kb digeridos parcialmente por Sau3Al clonados en el vector lambda DashII. Una biblioteca de cADN de cerebro total bovino fue adquirida de Clonetech (Número de catálogo: BL 10139). Las bibliotecas de ADN complementario fueron construidas (In Vitrogen; Stratagene) a partir de mARN preparado de cerebro bovino total, de pituitaria bovina y pituitaria posterior bovina. InVitrogen preparó dos bibliotecas de cADN: una biblioteca fue en el vector lambda g10, la otra en el vector pcDNAI (una biblioteca plasmídica). Las bibliotecas de Stratagene fueron preparadas en el vector lambda unizap. Colectivamente, las bibliotecas de cADN contenían 14 millones de fagos recombinantes primarios.

La biblioteca genómica bovina fue puesta en placas sobre la cepa hospedadora LE392 K12 de E. coli en placas de 23 x 23 cm (Nunc) de 150.000 a 200.000 placas de fagos por placa. Cada placa representa aproximadamente un equivalente genómico bovino. Siguiendo una incubación durante toda la noche a 37ºC, las placas fueron refrigeradas y se prepararon filtros replicados según los procedimientos de Maniatis y otros (2:60-81). Cuatro cubiertas de placas se prepararon a partir de cada placa en membranas de nilón no cargadas (Pall Biodyne A o MSI Nitropure). El ADN fue inmovilizado en las membranas mediante entrecruzamiento en luz UV durante 5 minutos o, poniéndolo al horno a 80ºC al vacío durante 2 horas. Las sondas de ADN fueron marcadas usando polinucleótido quinasa T4 (New England Biolabs) con gamma 32P ATP (New England Nuclear; 6500 Ci/mmol) según las especificaciones de los proveedores. Brevemente, 50 pmoles de oligómeros de ADN degenerados fueron incubados en presencia de 600 \muCi de gamma ^{32}P-ATP y 5 unidades de polinucleótido quinasa T4 durante 30 minutos a 37ºC. Se terminaron las reacciones, se añadió tampón de carga de geles de electroforesis y después las sondas fueron purificadas mediante electroforesis. Las sondas marcadas con 32P fueron cortadas de las láminas de gel y eluídas en agua. Alternativamente, las sondas de ADN fueron marcadas vía amplificación de PCR mediante incorporación de \alpha-32P-dATP o \alpha-32P-dCTP según el protocolo de Schowalter y Sommer, Anal. Biochem 177:90-94 (1989). Las sondas marcadas en las reacciones de PCR fueron purificadas mediante desalado en columnas Sephadex G-150.

La prehibridación e hibridación fueron llevadas a cabo en tampón GMC (NaPi 0,52 M, SDS 7%, BSA 1%, EDTA 1,5 mM, NaCl 0,1 M, tARN 10 mg/ml). Los lavados fueron llevados a cabo en oligowash (160 ml de Na_{2}HPO_{4} 1 M, 200 ml de SDS 20%, 8,0 ml de EDTA 0,5 M, 100 ml de NaCl 5M, 3632 ml de H_{2}O). Típicamente, 20 filtros (400 centímetros cuadrados cada uno) que representaban copias replicadas de diez equivalentes genómicos bovinos fueron incubados en 200 ml de disolución de hibridación con 100 pmoles de sondas oligonucleotídicas degeneradas (degeneradas 128-512 veces). La hibridación se dejó que tuviera lugar durante toda la noche a 5ºC por debajo de la temperatura de fusión mínima calculada para la sonda degenerada. El cálculo de la temperatura de fusión mínima asume 2ºC para un par AT y 4ºC para un par GC.

Los filtros fueron lavados en cambios repetidos de oligowash a las temperaturas de hibridación de cuatro a cinco horas y finalmente, en cloruro de tetrametilamonio 3,2 M, SDS 1% dos veces durante 30 min a una temperatura dependiente de la longitud de la sonda de ADN. Para 20 mers, la temperatura del lavado final fue de 60ºC. Los filtros fueron montados, después expuestos a una película de rayos X (Kodak XAR5) usando pantallas intensificadoras (Dupont Cronex Ligntening Plus). Normalmente, una exposición de la película de tres a cinco días a menos 80ºC fue suficiente para detectar señales duplicadas en estos cribados de bibliotecas. Tras los análisis de los resultados, se pudieron retirar las sondas de los filtros y volverlos a incubar con otras sondas. Las sondas de los filtros fueron eliminadas incubando a través de dos ciclos sucesivos de quince minutos en un microondas a máxima potencia en una disolución de SDS 1% que contenía EDTA 10 mM pH 8,0. Los filtros se hicieron pasar a través de al menos de tres a cuatro ciclos de eliminado de sondas y vueltos a incubar con diversas sondas.

III. Aislamiento, crecimiento y preparación de ADN de fagos recombinantes

Estos procedimientos siguieron el protocolo estándar como se describe en Recombinant DNA (Maniatis y otros 2: 60-2: 81).

IV. Análisis de clones aislados usando digestión de ADN y transferencia Southern

Las muestras de ADN de fagos recombinantes (2 microgramos) fueron digeridas según las condiciones recomendadas por el proveedor de las endonucleasas de restricción (New England Biolabs). Siguiendo una incubación de cuatro horas a 37ºC, los productos de las reacciones fueron precipitados en presencia de acetato sódico 0,1 M y tres volúmenes de etanol. El ADN precipitado fue recogido mediante centrifugación, lavado en etanol 75% y secado. Todas las muestras resuspendidas fueron cargadas en geles de agarosa (típicamente 1% en tampón TAE; Tris acetato 0,04 M, EDTA 0,002 M). Los geles se corrieron a 1 voltio por centímetro desde 4 a 20 horas. Los marcadores incluyeron los fragmentos de ADN Hind III lambda y/o los fragmentos de ADN \diameterX174HaeIII (New England Biolabs). Los geles fueron teñidos con 0,5 microgramos/ml de bromuro de etidio y fotografiados. Para la transferencia southern, el ADN fue primero despurinizado en el gel mediante tratamiento con HCl 0,125 N, desnaturalizado en NaOH 0,5 N y transferido en SSC 20X (cloruro sódico 3 M, citrato sódico 0,03 M) a membranas de nilón no cargadas. La transferencia fue hecha durante 6 horas hasta 24 horas, después los filtros fueron neutralizados en Tris HCl 0,5 M pH 7,5, cloruro sódico 0,15 M, después lavados brevemente en tris-borato EDTA 50 mM.

Para el entrecruzamiento, los filtros fueron envueltos primero en plástico de envolver transparente, después el ADN fue expuesto durante 5 minutos a una luz ultravioleta. La hibridación y el lavado fueron realizados como se describió para el cribado de la biblioteca (véase sección 2 de este Ejemplo). Para el análisis de la hibridación en la que se ha de determinar si existen genes similares en otras especies, se hicieron ligeras modificaciones. El filtro del ADN fue adquirido de Clonetech (Número de catálogo 7753-1) y contenía 5 microgramos de ADN digerido con EcoRI de diversas especies por carril. La sonda fue marcada mediante reacciones de amplificación de PCR como se describe en la sección 2 anterior, y se hicieron hibridaciones en tampón B 80% (2 g de polivinilpirrolidina, 2 g de Ficoll-400, 2 g de albúmina de suero bovina, 50 ml de Tris-HCl 1 M (pH 7,5) 58 g de NaCl, 1 g de pirofosfato sódico, 10 g de dodecil sulfato sódico, 950 ml de H_{2}O) que contenía dextrán sulfato 10%. Las sondas fueron desnaturalizadas hirviéndolas durante 10 minutos, después enfriándolas rápidamente en agua con hielo. La sonda fue añadida al tampón de hibridación a 10^{6} dpm ^{32}P por ml e incubadas durante toda la noche a 60ºC. Los filtros fueron lavados a 60ºC primero en tampón B seguido de 2X SSC, SDS 0,1% después en 1x SSC, SDS 0,1%. Para experimentos de alta rigurosidad, los lavados finales se hicieron en 0,1% SSC, SDS 1% y la temperatura se elevó a 65ºC.

Los datos de transferencia southern fueron usados para preparar un mapa de restricción del clón genómico y para indicar qué subfragmentos hibridaban con las sondas GGF (candidatos para subclonaje).

V. Subclonaje de segmentos de ADN homólogos a las sondas de hibridación

Los ADNs digeridos (por ejemplo 5 microgramos) fueron cargados en geles de 1% de agarosa, después los fragmentos apropiados fueron cortados de los geles tras la tinción. El ADN fue purificado mediante absorción en bolas de cristal seguido de la elución usando el protocolo descrito por el proveedor (Bio 101). Los fragmentos de ADN recuperados (100-200 ng) fueron ligados en vectores linealizados defosforilados, por ejemplo PT3T7 (Ambion), que es un derivado de pUC18, usando ligasa T4 (New England Biolabs). Este vector lleva el gen \beta lactamasa de E. coli, por lo tanto, los transformantes pueden ser seleccionados en placas que contienen ampicilina. El vector también suministra complementación de \beta-galactosidasa a la célula hospedadora, por lo tanto los no recombinantes (azul) pueden ser detectados usando isopropiltiogalactósido y Bluogal (Bethesda Research Labs). Una porción de las reacciones de ligación fue usada para transformar células K12 XL1 blue de E. coli. (Stratagene, número de catálogo: 200236) y después los transformantes fueron seleccionados en placas LB que contenían 50 microgramos por ml de ampicilina. Las colonias blancas fueron seleccionadas y se prepararon mini preps plasmídicas para la digestión del ADN y los análisis de secuencias de ADN. Los clones seleccionados fueron vueltos a ensayar para determinar si su ADN insertado hibridaba con las sondas GGF.

VI. Secuenciación del ADN

Los moldes de ADN plasmídicos de doble hebra fueron preparados a partir de 5 ml de cultivos según los protocolos estándar. La secuenciación fue por el método de terminación de cadena por didesoxi usando Sequenase 2.0 y un kit de secuenciación didesoxinucleótido (US Biochemical) según al protocolo de los fabricantes (una modificación de Sanger y otros, PNAS; USA 74: 54463 (1977)). Alternativamente, la secuenciación fue hecha en un termo-ciclador de ADN (Perkin Elmer, modelo 4800) usando un kit de secuenciación de ciclos (New England Biolabs; Bethesda Research Laboratories) y fue realizada según las instrucciones de los fabricantes usando un cebador con el extremo 5' marcado. Los cebadores de secuencias fueron, bien los suministrados con los kits de secuenciación o bien fueron sintetizados según la secuencia determinada a partir de los clones. Las reacciones de secuenciación fueron cargadas y resueltas en geles de secuenciación de poliacrilamida al 6% de 0,4 mm de grosor. Los geles fueron secados y expuestos a una película de rayos X. Típicamente, el 35S fue incorporado cuando se usaron los kits de secuenciación estándar y un cebador marcado en su extremo con 32P fue usado para reacciones de secuenciación en ciclos. Las secuencias fueron leídas en un editor de secuencias de ADN desde la parte inferior del gel hasta la parte superior (5' dirección a 3') y los datos fueron analizados usando programas suministrados por Genetics Computer Group (GCG, Universidad de Wisconsin).

VII. Preparación del ARN y amplificación por PCR

Los marcos de lectura abiertos detectados en el ADN genómico y que contenían secuencias que codifican péptidos GGF fueron extendidos vía amplificación de PCR del ARN de pituitaria. El ARN fue preparado a partir de tejido bovino congelado (Pelfreeze) según el procedimiento de guanidino neutro-CsCl (Chirgwin y otros Biochemistry 18; 5294 (1979)). El ARN poliadenilado fue seleccionado por cromatografía de columan de oligo-dT celulosa (Aviv y Leder PNAS (USA) 69: 1408 (1972)).

Las secuencias diana de ADN específicas fueron amplificadas empezando bien con muestras de ARN total o bien con muestras de ARN poliadeniladas que habían sido convertidas a cADN usando el kit de PCR/ARN de Perkin Elmer número: N808-0017. Las reacciones de transcripción inversa de la primera hebra usaron 1 \mug de ARN molde y bien los cebadores de oligo dT con sitios de unión con sitios de reconocimiento de enzimas de restricción unidos o bien los cebadores antisentido específicos determinados a partir de secuencias clonadas con los sitios de restricción unidos. Para producir la segunda hebra, los cebadores fueron o bien las secuencias únicas de la hebra mas como se usaron en las reacciones 3' RACE (Frohman y otros, PNAS (USA) 85: 8998 (1988)) o bien fueron cebadores oligo dT con sitios de restricción unidos si el segundo sitio diana había sido añadido mediante marcaje de colas por transferasa terminal de los productos de reacción de la primera hebra con dATP (por ejemplo reacciones 5' race, Frohman y otros, ibid). Alternativamente, como ocurre en las reacciones de PCR ancladas los cebadores de la segunda hebra eran degenerados, por lo tanto representaban secuencias peptídicas particulares.

Los perfiles de amplificación siguieron el siguiente esquema general: 1) cinco minutos de un ciclo de remojo a 95ºC; 2) un ciclo térmico de 1 minuto, 95ºC; 1 minuto de disminución hasta una temperatura de emparejamiento de 45ºC, 50ºC o 55ºC; manteniendo la temperatura de emparejamiento durante un minuto; aumento hasta 72ºC a lo largo de un minuto; extensión a 72ºC durante un minuto o durante un minuto mas una autoextensión de 10 segundos; 3) ciclo de extensión a 72ºC, cinco minutos, y; 4) un ciclo de remojo a 4ºC durante tiempo infinito. Los ciclos térmicos (#2) fueron corridos normalmente durante 30 ciclos. Una muestra de dieciseis \mul de cada 100 \mul de amplificación fue analizada mediante electroforesis en geles de Nusieve 2% agarosa 1% corrida en tampón TAE a 4 voltios por centímetro durante 3 horas. Los geles fueron teñidos, después transferidos a membranas de nilón no cargadas que fueron incubadas con sondas de ADN marcadas que eran internas a los cebadores.

Grupos específicos de productos de amplificación de ADN pudieron ser identificados en los experimentos de transferencia y sus posiciones usadas como guía para la purificación y reamplificación. Cuando fue apropiado, las porciones restantes de las muestras seleccionadas fueron cargadas en geles preparativos, después tras electroforesis se tomaron del gel de cuatro a cinco láminas de 0,5 mm de grosor (agrupando la posición esperada del producto específico). La agarosa fue machacada, luego puesta en remojo en 0,5 ml de tampón de electroforesis desde 2-16 horas a 40ºC. La agarosa machacada fue centrifugada durante dos minutos y la fase acuosa fue transferida a tubos limpios.

La reamplificación fue hecha en cinco microlitros (aproximadamente 1% del producto) del material eluído usando los mismo grupos de cebadores y los perfiles de reacción como en las reacciones originales. Cuando las reacciones de reamplificación fueron completadas, las muestras fueron extraídas con cloroformo y transferidas a tubos limpios. Los tampones de enzimas de restricción concentrados y las enzimas fueron añadidos a las reacciones para cortar en los sitios de restricción presentes en los sitios de unión. Los productos de PCR digeridos fueron purificados mediante electroforesis en gel, después subclonados en vectores como se describe en la sección de subclonaje anterior. La secuenciación de ADN fue hecha como se describe anteriormente.

VIII. Análisis de las secuencias de ADN

Las secuencias de ADN fueron ensambladas usando un programa de ensamblaje de fragmentos y las secuencias aminoacídicas deducidas por los programas GCG GelAssemble, Map y Translate. Las secuencias proteícas deducidas fueron usadas como una secuencia de búsqueda para buscar bases de datos de secuencias proteicas usando

\hbox{WordSearch.}

Los análisis fueron hechos en un ordenador VAX Station 3100 operando en VMS 5.1. La búsqueda de bases de datos fue hecha en SwissProt número de reparto 21 usando GCG Versión 7.0.

IX. Resultados de la clonación y secuenciación de los genes que codifican GGF-I y GGF-II

Como se indica a continuación, para identificar la secuencia de ADN que codifica el GGF-III bovino se diseñaron sondas oligonucleotídicas degeneradas a partir de las secuencias GGF-II. El GGF-II 12 (SEQ ID Nº 44), un péptido generado vía diestión por lisil endopeptidasa de una preparación de GGF-II purificado (véase las Figuras 11 y 12) mostró una homología de secuencia aminoacídica muy grande con GGF-I 07 (SEQ ID Nº 39), un péptido tríptico generado a partir de una preparación de GGF-I purificado. El GGF-II 12 fue usado así para crear diez sondas oligonucleotídicas degeneradas (véanse los oligos 609, 610 y 649 a 656 en la Figura 21, SEQ ID Nºs 69, 70, 71 y 79 respectivamente). Un grupo duplicado de filtros fue incubado con sondas de dos grupos (grupo 1 = 609, 610; grupo 2 = 649-5656) de sondas que codifican dos porciones solapantes de GGF-II 12. Las señales de hibridación fueron observadas, pero, sólo uno de los clones hibridó con ambos grupos de sondas. El clón (designado GGF2BG1) fue purificado.

Los análisis por transferencia Southern del ADN a partir del clón del fago GGF2BG1 confirmó que ambos grupos de sondas hibridaron con la secuencia de ADN bovina, y mostró además que ambas sondas reaccionaron con el mismo grupo de fragmentos de ADN dentro del clón. Basados en esos experimentos un subfragmento de 4 Kb digerido con EcoR1 del clón original fue identificado, subclonado y secuenciado parcialmente. La figura 22 muestra la secuencia nucleotídica SEQ ID Nº 89) y la secuencia aminoacídica deducida (SEQ ID Nº 196) de las lecturas de secuencia de ADN iniciales que incluían los sitios de hibridación de sondas 609 y 650, y confirmaron que una porción de este ADN genómico bovino codificaba el péptido 12 (KASLADSGEYM (SEQ ID Nº 129)).

Los análisis de secuencias adicionales demostraron que el GGF-II 12 residía en un marco de lectura abierto de 66 aminoácidos (véase a continuación) que se ha convertido en el sitio de inicio para el aislamiento de las secuencias solapantes que representan un gen GGF-II bovino y un cADN.

Varios procedimientos de PCR fueron usados para obtener secuencias codificantes adicionales para el gen GGF-II bovino putativo. El ARN total y las muestras de ARN (que contienen poli A) seleccionadas con oligo dT fueron preparadas a partir de pituitaria bovina total, pituitaria anterior, pituitaria posterior, e hipotálamo. Usando cebadores a partir de la lista mostrada en la Figura 23, SEQ ID nºs 109-119, se usaron reacciones de PCR de una sola dirección (RACE) para amplificar los extremos de cADN tanto en las direcciones 3' como 5', y las reacciones de PCR ancladas fueron realizadas con cebadores oligonucleotídicos representando péptidos GGF-II adicionales. La Figura 24 resume las estructuras y secuencias de ADN contiguas obtenidas en esos experimentos. A partir de las reacciones 3' RACE, tres secuencias de cADN de corte y empalme alternativo fueron producidas, las cuales habían sido clonadas y secuenciadas. Una reacción 5' RACE llevó al descubrimiento de un exón adicional que contenía la secuencia codificante durante al menos 52 aminoácidos. El análisis de esa secuencia aminoacídica deducida reveló péptidos GGF-II-6 y una secuencia similar a GGF-I-18 (véase a continuación). Las reacciones de PCR ancladas llevaron a la identificación de (cADN) secuencias codificantes de los péptidos GGF-II-1, 2, 3 y 10 contenidos dentro de un segmento de cADN adicional de 300 pb. El límite 5' de este segmento (es decir, segmento E, véase Fig. 31) está definido por el oligonucleótido que codifica el péptido GGF-II-1 y que fue usado en la reacción de PCR (datos de secuencias 5' adicionales existen como se describen para el clón humano en el Ejemplo 6). Así, este clón contiene las secuencias nucleotídicas que codifican seis de un total de nueve nuevas secuencias peptídicas GGF-II existentes.

El gen clonado fue caracterizado primero construyendo un mapa físico de GGF2BG1 que permitió determinar la posición de las secuencias codificantes como fueron encontradas (véase a continuación, Figura 25). Las sondas de ADN a partir de las secuencias codificantes descritas anteriormente han sido usadas para identificar fragmentos de ADN adicionales que contiene los exones en este clón de fago y para identificar clones que solapan en ambas direcciones. El gen GGF-II bovino putativo se divide en al menos 5 segmentos codificantes. Los segmentos codificantes se definen como longitudes diferenciadas de una secuencia de ADN que puede ser traducida en secuencias polipeptídicas usando el código genético universal. Los segmentos codificantes descritos en la Figura 31 y a los que se hace referencia en la presente solicitud son: 1) exones paticulares dentro del gen GGF (por ejemplo segmento codificante a), ó 2) derivado de grupos de dos o más exones que aparecen en subgrupos específicos de mARNs, en los que cada grupo puede ser traducido en los segmentos polipeptidicos específicos como en los productos génicos mostrados. Los segmentos polipeptídicos a los que se hace referencia en las reivindicaciones son los productos de traducción de los segmentos codificantes de ADN análogos. Sólo los segmentos codificantes A y B han sido definidos como exones y secuenciados y representados en un mapa hasta ahora. El sumario de las secuencias codificantes contiguas identificadas se muestra en la Figura 26. Los exones son listados (alfabéticamente) en el orden de su descubrimiento. Es evidente a partir de los límites intrón/exón que el exón B puede estar incluido en los cADNs que conectan el segmento codificante E y el segmento codificante A. Esto es, el exón B no puede ser extraído mediante corte sin comprometer el marco de lectura abierta. Por lo tanto, sugerimos que los tres patrones de corte y empalme alternativos pueden producir las secuencias 1, 2 y 3 de cADN de GGF-II bovino putativas. Las secuencias codificantes de éstas, designadas GGF2BPP1.CDS, GGF2BPP2.CDS y GGF2BPP3.CDS, respectivamente, son dadas en las Figuras 28A (SEQ ID Nº 133), 28 B-C (SEQ ID Nº 124), y 28 D-E (SEQ ID Nº 135), respectivamente. La secuencia aminoacídica deducida de los tres cADNs también se da en las Figuras 28A, (SEQ ID Nº 190), 28 B-C (SEQ ID Nº 191), y 28 D-E (SEQ ID Nº 193).

Las tres estructuras deducidas codifican proteínas de longitudes 206, 281 y 257 aminoácidos. Los primeros 183 residuos de la secuencia proteica deducida son idénticos en los tres productos génicos. En la posición 184 los clones difieren significativamente. Un codon para la glicina GGT en GGF2BPP1 también sirve como un donante de corte y empalme para el GGF2BPP2 y GGF2BPP3, que se añade alternativamente sobre los exones C, C/D, C/D' y D o C, C/D y D, respectivamente, como se muestra en la figura 33, SEQ ID Nº 149). El GGFIIBPP1 es un producto génico truncado que se genera leyendo más allá de la zona de unión del segmento A de corte y empalme codificante en la secuencia de intervención siguiente (intrón). Este representa el segmento codificante A' en la figura 31 (SEQ ID Nº 140). El transcrito termina adyacente a una secuencia de poliadenilación AATAAA canónica, y se sugiere que este producto génico truncado representa un transcrito maduro bona fide. Los otros dos productos génicos más largos comparten la misma secuencia 3' no traducida y el sitio de poliadenilación.

Las tres de estas moléculas contienen seis de las nueve secuencias peptídicas GGF-II nuevas (véase la Figura 12) y otro péptido es altamente homólogo con GGF-I-18 (véase la Figura 27). Este hallazgo da una elevada probabilidad de que este molécula recombinante codifique al menos una porción del GGF-II bovino. Adicionalmente, los puntos isoeléctricos calculados para los tres péptidos son consistentes con las propiedades físicas de GGF-I y II. Puesto que el tamaño molecular de GGF-II es aproximadamente 60 KD, el más largo de los tres cADNs debería codificar una proteína con aproximadamente la mitad del número predicho de aminoácidos.

Una sonda que abarca los exones B y A fue marcada vía amplificación de PCR y usada para cribar una biblioteca de cADN hecha a partir de ARN aislado a partir de pituitaria posterior bovina. Un clón (GGF2BBPP5) mostró el patrón indicado en al figura 30 y contenía un segmento codificante de ADN adicional (G) entre los segmentos codificantes A y C. La secuencia de ácidos nucleicos entera se muestra en la figura 32 (SEQ ID Nº 148). El producto de la traducción predicho a partir del marco de lectura abierto más largo es de 241 aminoácidos. Una porción de un segundo cADN (GGF2BPP4) fue también aislada a partir de la biblioteca de pituitaria posterior bovina usando la sonda descrita anteriormente. Este clón mostró el patrón indicado en la Figura 30. Este clón está incompleto en el extremo 5', pero es una variante de corte y empalme en el sentido que le faltan los segmentos codificantes G y D. El BPP4 también muestra un extremo 3' nuevo con regiones H, K y L más allá de la región C/D. La secuencia de BPP4 se muestra en la Figura 34 (A-C) (SEQ ID Nº 150).

Ejemplo 5 Secuencias GGF en diversas especies

La búsqueda en bases de datos no ha revelado ninguna similitud significativa entre cualquier producto de traducción de GGF predicho y secuencias proteicas conocidas. Esto sugiere que el GGF-II es el primer miembro de una nueva familia o superfamilia de proteínas. En estudios de hibridación cruzada con otros ADNs de mamíferos (experimentos de transferencia de ADN) en condiciones de alta rigurosidad, los autores han demostrado, claramente, que las sondas de ADN de esta molécula recombinante bovina puede detectar fácilmente secuencias específicas en una variedad de muestras ensayadas. Una secuencia altamente homóloga es también detectada en el ADN genómico humano. El autoradiograma se muestra en la Figura 29. Las señales en los carriles que contienen ADN de rata y humano representan los equivalentes de rata y humano del gen GGF, las secuencias de varios cADNs codificados por este gen han sido recientemente documentadas por Holmes y otros (Science 256: 1205 (1992)) y Wen y otros (Cell 69: 559 (1992)).

Ejemplo 6 Aislamiento de una secuencia humana que codifica el GGF2 humano

Varios clones humanos que contenían secuencias del segmento E que codifica el GGFII bovino fueron aisladas mediante cribado de una bibliteca de cADN humano preparada a partir de bulbo raquídeo (Stratagene, número de catálogo 935206). Se siguió esta estrategia basándose en la fuerte unión entre la mayoría de los péptidos GGF2 (única para el GGF2) y la secuencia peptídica predicha a partir de los clones que contenían el segmento E bovino. Esta biblioteca fue cribada como se describe en el Ejemplo 4, sección II usando las sondas oligonucleotídicas 914-919, listadas a continuación.

914	TCGGGCTCCATGAAGAAGATGTA	(SEQ ID Nº 179)
915	TCCATGAAGAAGATGTACCTGCT	(SEQ ID Nº 180)
916	ATGTACCTGCTGTCCTCCTTGA	(SEQ ID Nº 181)
917	TTGAAGAAGGACTCGCTGCTCA	(SEQ ID Nº 182)
918	AAAGCCGGGGGCTTGAAGAA	(SEQ ID Nº 183)
919	ATGARGTGTGGGCGGCGAAA	(SEQ ID Nº 184)

Los clones detectados con estas sondas fueron analizados adicionalmente mediante hibridación. Una sonda derivada del segmento codificante A (véase la Figura 21), que se produjo marcando un producto de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) del segmento A, fue también usada para cribar la biblioteca primaria. Varios clones que hibridaron tanto con la sonda derivada A como con la sonda derivada B fueron seleccionados para análisis adicionales. Este clón se representa por el patrón de los segmentos codificantes (EBACC/D'D como se muestra en la Figura 31). El segmento E en este clón es el equivalente humano de la versión bovina truncada de E mostrada en la Figura 37. GGF2HBS5 es el candidato más probable para codificar el GGF-II de todos los candicatos GGF-II "putativos" descritos. La longitud del segmento E de la secuencia codificante es 786 nucleótidos mas 264 bases de secuencia no traducida. El tamaño predicho de la proteína codificada por GGF2HBS5 es aproximadamente 423 aminoácidos (aproximadamente 45 kilodaltones, véase la Figura 45 (A-D), SEQ ID Nº 170), que es similar al tamaño de la forma desglicosilada de GGF-II (véase el Ejemplo 16). Adicionalmente, siete de los péptidos GGF-II listados en la figura 27 tienen secuencias equivalentes que caen dentro de la secuencia proteica predicha a partir de la región E. Los péptidos II-6 y II-12 son excepciones, que caen en el segmento codificante B y el segmento codificante A, respectivamente. El ARN que codifica la proteína GGF2HBS5 fue producido en un sistema de transcripción in vitro dirigido por el promotor del bacteriófago T7 residente en el vector (Bluescript SK (Stratagene Inc.) véase la Figura 44) que contiene el inserto GGF2HBS5. Este ARN fue traducido en un sistema de traducción libre de células (reticulocitos de conejo) y el tamaño de la proteína producto fue de 45 Kd.

Adicionalmente, el producto libre de células ha sido ensayado en un ensayo mitogénico de células de Schwann para confirmar la actividad biológica. Las células de Schwann tratadas con un medio condicionado muestran tanto una proliferación aumentada medida por incorporación de ^{125I}-Uridina como fosforilación en tirosina de una proteína en el intervalo de 185 kilodaltones. Así, el tamaño del producto codificado por el GGF2HBS5 y la presencia de secuencias de ADN que codifican péptidos humanos altamente homólogos a los péptidos bovino mostrados en la Figura 12 confirman que el GGF2HBS5 codifica el equivalente humano del GGF2 bovino. El hecho que el medio condicionado preparado a partir de células transformadas con este clón provoca la actividad mitogénica de las células de Schwann confirma que el producto génico GGFIIHBS5 (a diferencia del producto génico BPP5) es secretado. Adicionalmente el producto génico GGFIIBPP5 parece mediar una respuesta de proliferación de células de Schwann vía un receptor tirosina quinasa tal como p185^{erbB2} o un receptor íntimamente relacionado (véase el Ejemplo 14).

Ejemplo 7 Expresión de GGF2 recombinante humano en células de mamífero e insecto

El clón de cADN de GGF2HBS5 que codifica el GGF2 humano (como se describe en el Ejemplo 6 y también referido aquí como HBS5) fue clonado en el vector pcDL-SR\alpha296 (Takebe y otros Mol. Cell. Biol. 8: 466-472 (1988) y células COS-7 fueron transfectadas en placas de 100 mm por el método DEAE-dextrano (Sambrook y otros Molecular Cloning; A Laboratory Manual 2nd ed. CSH Laboratory NY (1989). Los lisados celulares o de medio condicionado de células COS que expresan de modo transitorio fueron recogidos 3 ó 4 días post-transfección. Para preparar lisados, las monocapas celulares fueron lavadas con PBS, raspadas de las placas, lisadas mediante tres ciclos de congelación/descongelación en 150 \mul de Tris-HCl 0,25 M, pH8. Los restos celulares fueron precipitados y el sobrenadante recuperado. Las muestras de medio condicionado (7 ml.) fueron recogidas, después concentradas y el tampón cambiado por Tris 10 mM, pH 7,4 usando unidades Centiprep-10 y Centricon-10 como se describen por el fabricante (Amicon, Beverly, MA). Las células de Schwann de nervio de rata fueron ensayadas en lo que se refiere a la incorporación de precursores de la síntesis de ADN, como se describe (véase el Ejemplo 3). Las muestras de medio condicionado o de lisados celulares fueron ensayadas en el ensayo de proliferación de células de Schwann como se describe en el Ejemplo 3. Los datos de actividad mitogénica se muestran en la Fig. 46. El cADN, GGF2HBS5, que codifica GGF2 dirigió la secreción del producto proteico al medio. Una pequeña proporción de la actividad total fue detectable dentro de las células como se determina mediante ensayo usando lisados celulares. Los cADNs de GGF2HFB1 y GGFBPP5 no pudieron dirigir la secreción del producto al medio extracelular. La actividad de GGF a partir de estos clones fue detectable sólo en los lisados celulares (Fig. 46).

El GGF2 recombinante fue también expresado en células CHO. El cADN de GGF2HBS5 que codifica el GGF2 fue clonado en el sitio EcoRI del vector pcdhfrpolyA (Fig. 54) y transfectado en la línea celular CHO negativa para DHFR (DG44) mediante el método de coprecipitación con fosfato cálcico (Graham y Van Der Eb, Virology 52: 456-467 (1973). Los clones fueron seleccionados en un medio \alpha libre de nucleótidos y nucleósidos (Gibco) en placas de 96-pocillos. Después de 3 semanas, las muestras de medio condicionados de clones individuales fueron cribadas en lo que respecta a la expresión de GGF mediante el ensayo de proliferación de células de Schwann como se describe en el Ejemplo 3. Se identificaron clones estables que secretan niveles significativos de actividad GGF en el medio. Los datos de actividad de proliferación de células de Schwann de alícuotas de diferentes volúmenes de medio condicionado de células CHO fueron usados para producir la curva de dosis respuesta mostrada en la Fig. 47 (Graham y Van Der Eb, Virology 52: 456, 1973). Este material fue analizado en una transferencia de Western incubada con antisueros policlonales generados contra un péptido específico de GGF2. Una banda ancha de aproximadamente 69-90 Kd (el tamaño esperado del GGF2 extraído de pituitaria y glicoformas de pesos moleculares mayores) es marcada específicamente (Fig. 49, carril 12).

El GGF2 recombinante fue también expresado en células de insectos usando expresión de Baculovirus. Las células de insecto Sf9 fueron infectadas con baculovirus que contenían el clón de cADN de GGF2HBS5 a una multiplicidad de 3-5 (10^{6} células/ml) y cultivadas en medio Sf900-II (Gibco). La actividad mitogénica de células de Schwann fue secretada en el medio extracelular (Fig. 48). Los diferentes volúmenes de medio condicionado de células de insecto fueron ensayados en el ensayo de proliferación de células de Schwann en ausencia de forskolina y los datos usados para producir la curva de dosis respuesta se muestran en la Fig. 48.

Este material fue también analizado en una transferencia Western (Fig. 47) incubada con el anticuerpo específico para GGF II descrito anteriormente. Una banda de 45 Kd, el tamaño del GGF-II desglicosilado (véase el Ejemplo 16) fue observada.

Los métodos usados en este ejemplo fueron como sigue:

La actividad mitogénica de células de Schwann de factores de crecimiento glial recombinantes humano y bovino fue determinada como sigue: Las respuestas mitogénicas de las células de Schwann cultivadas fueron medidas en presencia de 5 \muM de forskolina usando preparaciones de GGF recombinante en bruto obtenidas a partir de experimentos de expresión transitoria en mamíferos. La incorporación de [125I]-Uridina fue determinada tras una exposición de 18-24 horas a materiales obtenidos a partir de células COS transfectadas o transfectadas con un vector vacío como se describe en los Métodos. Se muestran la media y la desviación estándar de cuatro grupos de datos. La respuesta mitogénica a GGF de pituitaria bovina nativa parcialmente purificada (fracción carboximetil celulosa; Goodearl y otros, enviado para su publicación) se muestra (GGF) como un estándar de una actividad del cien por
ciento.

Los cADNs (Fig. 53) fueron clonados en pcDL-SR\alpha296 (Takebe y otros, Mol. Cell Biol. 8; 466-472 (1988)), y las células COS-7 fueron transfectadas en placas de 100 mm por el método de DEAE-dextrano (Sambrook y otros, en Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2nd. Ed. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989)). Los lisados celulares o de medio condicionado fueron recogidos 3 ó 4 días posterior a la transfección. Para preparar lisados, las monocapas celulares fueron lavadas con PBS, raspadas de las placas, y lisadas mediante tres ciclos de congelación/descongelación en 150 \mul de Tris-HCl 0,25 M, pH 8. Los restos celulares fueron precipitados y el sobrenadante recuperado. Las muestras de medio condicionado (7 mls) fueron recogidas, luego concentradas y el tampón cambiado por Tris 10 mM, pH 7,4 usando unidades Centriprep-10 y Centricon-10 como se describe por el fabricante (Amicon, Beverly, MA). Las células de Schwann del nervio ciático de rata fueron ensayadas en lo que se refiere a la incorporación de precursores de la síntesis de ADN, como está descrito (Davis y Stroobant, J. Cell Biol. 110: 1353-1360 (1990); Brockes y otros, Brain Res. 165:105-118 (1979)).

La transferencia Western de medio condicionado de células CHO recombinantes fue realizada como sigue: Un clón de CHO recombinante fue cultivado en 7 ml de medio MCDB302 libre de proteínas durante 3 días. Se concentraron 2 ml de medio condicionado, el tampón fue intercambiado por Tris-HCl 10 mM, pH 7,4 y liofilizado hasta secado. El precipitado fue resuspendido en tampón de muestras SDS-PAGE, sometido a electroforesis en gel de SDS reductor y analizado mediante transferencia Western con un anticuerpo del péptido GGF. Un testigo de células CHO fue hecho usando medio condicionado del hospedador CHO-DG44 sin transfectar y los niveles de CHO HBS5 fueron ensayados usando medio condicionado del clón recombinante.

Ejemplo 8 Aislamiento de otras secuencias humanas relacionadas con GGF bovino

Los resultados en los Ejemplos 5 y 6 indican que las secuencias relacionadas a GGF de fuentes humanas pueden ser también fácilmente aisladas usando sondas de ADN derivadas de secuencias de GGF bovinas. Alternativamente el procedimiento descrito por Holmes y otros (Science 256: 1205 (1992)) puede ser usado. En este ejemplo una proteína humana (heregulina \alpha), que se une a y activa el receptor p185^{erbB2} (y está relacionada con GGF), se purifica de una línea celular tumoral y la secuencia peptídica derivada se usa para producir sondas oligonucleotídicas que fueron utilizadas para clonar el cADN que codifica la heregulina. El ensayo bioquímico para la activación del receptor p185^{erbB2} se distingue de la proliferación de células de Schwann. Esto es una aproximación similar a la usada en los ejemplos 1-4 para la clonación de secuencias de GGF a partir de cADNs de pituitaria. La proteína heregulina y los ADNs complementarios fueron aislados a partir de líneas celulares tumorales según los siguientes procedimientos.

La heregulina fue purificada a partir de medio condicionado haciendo crecer células de cáncer de mama MDA-MB-231 (ATCC # HTB 26) en bolas microvehículos Percell Biolytica (Hyclone Labs). El medio (10 litros) fue concentrado \sim25 veces mediante filtración a través de membranas (10 kD tamaño límite) (Millipore) y clarificado mediante centrifugación y filtración a través de un filtro (0,22 \mum). El filtrado fue aplicado a una columna de Sefarosa (Pharmacia) y las proteínas fueron eluídas con etapas de NaCl a 0,3, 0,6, y 0,9 M en tampón fosfato salino. La actividad en las diversas fracciones cromatográficas fueron medidas cuantificando el aumento en fosforilación en tirosina de p185^{erbB2} en células tumorales de mama MCF-7 (ATCC # HTB 22). Las células MCF-7 fueron puestas en placas Costar de 24 pocillos en medio esencial mínimo de Dulbecco (50%) F12 que contenía suero (10%) (10^{5} células por pocillo), y se dejó que se adhirieran durante al menos 24 horas. Previo al ensayo, las células fueron transferidas en medio sin suero durante un mínimo de 1 hora. Las fracciones de las columnas (10 a 100 \mul) fueron incubadas durante 30 min. a 37ºC. Los sobrenadantes fueron después aspirados y la reacción fue detenida mediante la adición de 100 \mul de tampón de muestra SDS-PAGE). Las muestras fueron calentadas durante 5 min. a 100ºC, y las porciones (10 a 15 \mul) fueron aplicadas a un gel de tris-glicina (4 a 20%). (Novex). Tras la electroforesis, las proteínas fueron electrotransferidas a una membrana de polivinilidendifluoruro (PVDF) y después bloqueadas con albúmina de suero bovina (5%) en tris- salino tamponado que contenía Tween-20 (0,05%) (TBST). Las membranas fueron incubadas con un anticuerpo monoclonal (dilución 1:1000) para fosfotirosina (Upstate Biotechnology) durante un mínimo de 1 hora a temperatura ambiente. Las membranas fueron lavadas con TBST, incubadas con un anticuerpo para inmunoglobulina G de ratón conjugada con fosfatasa alcalina (Promega) (diluída 1:7500) durante un mínimo de 30 minutos a temperatura ambiente. Las bandas reactivas fueron visualizadas con 5-bromo-4-cloro-3-indoil-1-fosfato y nitro-azul de tetrazolium. Las inmunomembranas fueron escaneadas con un densitómetro Scan Jet Plus (Hewlett-Packard). Las intensidades de señal para células MCF-7 sin estimular fueron de 20 a 30 unidades. El p185^{erbB2} totalmente estimulado dio señales de 180 a 200 unidades. La fracción reunida de NaCl 0,6 M, que contenía la mayoría de la actividad, fue aplicada a una columna de ácido poliaspártico (PolyLC) equilibrada en fosfato sódico 17 mM (pH 6,8) que contenía etanol (30%). Se usó un gradiente lineal de NaCl a 0,3 M a 0,6 M en el tampón de equilibrado para eluir las proteíans unidas. Un pico de actividad (NaCl a \sim0,45 M) fue fraccionado adicionalmente en una columna de fase inversa C4 (SynChropak RP-4) equilibrada en tampón que contenía TFA (0,1%) y acetonitrilo (15%). Las proteínas fueron eluídas de esta columna con un gradiente de acetonitrilo desde 25 a 40% a lo largo de 60 minutos. Las fracciones (1 ml) fueron recogidas, ensayadas en lo que se refiere a su actividad, y analizadas mediante SDS-PAGE en geles de tris-glicina (4-20%, Novex). La HRG-\alpha purificada por HPLC fue digerida con lisina C en SDS (0,1%), ditiotreitol 10 mM, NH_{4}HCO_{3} 0,1 M (pH 8.0) durante 20 horas a 37ºC y los fragmentos resultantes fueron resueltos en una columna C4 Synchrom (4000 \ring{A}, 0,2 por 10 cm). La columna fue equilibrada en TFA 0,1% y eluída con un gradiente de 1-propanol en TFA 0,1% (W.J. Henzel, J. T. Stults, C. Hsu, D. W. Aswad, J. Biol. Chem. 264, 15905 (1989)). Los picos del ensayo cromatográfico fueron secados al vacío y secuenciados. Uno de los péptidos (que eluyó en 1-propanol \sim24%) dio la secuencia [A] AEKEKTF [C] VNGGEXFMVKDLXNP (SEQ ID Nº 162). Los residuos entre paréntesis no eran seguros y una X representa un ciclo en el que no era posible identificar el aminoácido. El rendimiento inicial fue de 8,5 pmoles y la secuencia no correspondía con ninguna proteína conocida. Los residuos 1, 19, 15, y 22 fueron después identificados en la secuencia de cADN como cisteína. La secuenciación directa de una banda de \sim45 KD de un gel que que había sido cargado con un exceso y transferido a una membrana de PVDF reveló una secuencia de poca abundancia XEXKE[G][R]GK[G]K [G] KKKEXGXG[K] (SEQ ID Nº 30) con un rendimiento inicial muy bajo (0,2 pmoles). Esto correspondió a los residuos aminoacídicos 2 a 22 de heregulina-\alpha (Fig. 31), sugiriendo que la serina 2 está en el extremo NH_{2} de proHRG-\alpha. Aunque el extremo NH_{2} estaba bloqueado, se observó que ocasionalmente una pequeña cantidad de una proteína normalmente bloqueada no puede ser postraduccionalmente modificada. La asignación del extremo NH_{2} fue confirmada mediante espectrometría de masas de la proteína tras la digestión con bromuro de cianógeno. El extremo COOH de la proteína aislada no ha sido identificado de modo definitivo; sin embargo, mediante la secuenciación de mezclas de digestiones proteolíticas, la secuencia madura no parece extenderse mas allá del residuo 241. Las abreviaciones para los residuos son: A, Ala; C, Cys; D, Asp; E, Glu; F, Phe; G, Gly; H, His, I, Ile, K, Lys; L, Leu; M, Met; N, Asn; P, Pro; Q, Gln; R, Arg; S, Ser; T, Thr; V, Val; W, Trp; e Y, Tyr.

Como fuente de clones de cADN, se construyó una biblioteca de cADN usando el cebador oligo (dT) \lambdagt10 (T. V. Huynn, R. A. Young, R. W. Davis, \lambdagt10 and \lambdagt11 DNA Cloning Techniques: A practical Approach, D. Glover, Ed. (IRC Press, Oxford, (1984)) (U. Gubler y B. J. Hoffman, Gene 25, 263 (1983)) con mARN purificado (J. M. Chirwin, A. E. Przbyla, R. J. MacDonald, W. J. Rutter, Biochemistry 18, 5294 (1979)) de células MDA-MB-231. El siguiente desoxioligonucleótido antisentido degenerado ocho veces que codifica la secuencia de 13 aminoácidos AEKEKTFCVNGGE (SEQ ID Nº 31) (13) fue diseñado en base a la frecuencia óptima del codon humano (R. Lathe, J. Mol. Biol. 183, 1 (1985) y sintetizado químicamente:

5'-CTCGCC (G ó T) CC (A ó G) TTCAC (A ó G) CAGAAGGTCTTCTCCTTCTCAGC-3' (SEQ ID Nº 40). Para el propósito de diseño de sondas se asignó una cisteína a un residuo desconocido en la secuencia aminoacídica. La sonda fue marcada mediante fosforilación e hibridada en condiciones de baja rigurosidad a la biblioteca de cADN. La proteína proHRG-\alpha fue identificada en esta biblioteca. El cADN de HRB-\beta1 fue identificado incubando con una sonda una segunda biblioteca \lambdagt10 usando el cebador oligo (dT) hecha a partir de mARN de células MDA-MB-231 con secuencias derivadas de tanto los extremos 5' como 3' de proHRG-\alpha. El clón 13 (Fig. 2A) fue un producto de cribar una biblioteca \lambdagt10 de MDA-MB-231 con la secuencia 5' HRG-\alpha (cebador 5' -CCTCGCTCCTTCTTCTTGCCCTTC-3' (SEQ ID Nº 41); nucleótidos antisentido proHRG-\alpha de 33 a 56). Se usó una secuencia correspondiente al extremo 5' del clón 13 como sonda para identificar proHRG\beta2 y proHRG\beta3 en una tercera biblioteca \lambdagt10 usando el cebador oligo (dT) derivada del mARN de células MDA-MB-231. Dos clones de cADN que codifican cada uno de los cuatro HRGs fueron secuenciados (F. Sanger, S. Milken, A. R. Coulson, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74, 5463 1977]). Otro cADN designado clón 84 tiene una secuencia aminoacídica idéntica al proHRG\beta2 hasta el aminoácido 420. Un codon stop en la posición 421 está seguido de una secuencia 3' no traducida diferente.

Ejemplo 9 Aislamiento de una variante de corte y empalme adicional

Los métodos en el Ejemplo 6 produjeron cuatro secuencias íntimamente relacionadas (heregulina \alpha,\beta_{1},\beta_{2},\beta_{3}) que surgieron como resultado de variaciones de corte y empalme. Peles y otros (Cell 69, 205 (1992)), y Wen y otros (Cell 69, 559 (1992)) han aislado otra variante de corte y empalme (de rata) usando una purificación y una aproximación de clonación similar a la descrita en los Ejemplos 1-4 y 6 que implican una proteína que se une a p185^{erbB2}. el clón de cADN fue obtenido como sigue (vía la purificación y secuenciación de una proteína de unión a p185^{erbB2} a partir de una línea celular de fibroblastos de rata transformada).

Una proteína de unión p185^{erbB2} fue purificada a partir de medio condicionado como sigue. Medio condicionado reunido de tres cultivos de 500 botellas rotatorias (120 litros total) fueron aclaradas mediante filtración a través de filtros de 0,2 \mu y concentradas 31 veces con un sistema de ultrafiltración Pelicon usando membranas con un tamaño límite de 20 kd. Todas las etapas de purificación fueron realizadas usando un sistema rápido de cromatografía líquida de proteínas de Pharmacia. El material concentrado se cargó directamente en una columna de heparina-Sepharosa (150 ml, preequilibrada con tampón fosfato salino (PBS)). La columna fue lavada con PBS que contenía NaCl 0,2 M hasta que no se pudo detectar absorbancia a 280 nm de longitud de onda. Las proteínas unidas fueron después eluidas con un gradiente contínuo (250 ml) de NaCl (de 0,2 M a 1,0 M), y fracciones de 5 ml fueron recogidas. Las muestras (0,01 ml de las fracciones recogidas fueron usados para el ensayo cuantitativo de la actividad estimuladora quinasa. Las fracciones activas de los ensayos de las tres columnas (volumen total = 360 ml) fueron reunidas, concentradas hasta 25 ml usando una membrana de ultrafiltración YM10 (Amicon, Danvers, MA), y se añadió sulfato amónico para alcanzar una concentración de 1,7 M. Tras ser aclarado mediante centrifugación (10.000 x g, 15 min), el material reunido fue cargado en una columna de fenil-Superosa (HR10/10, Pharmacia). La columna fue desarrollada con un gradiente de 45 ml de (NH_{4})_{2}SO_{4} (desde 1,7 M hasta nada de sal) en Na_{2}PO_{4} (pH 7,4), y fracciones de 2 ml fueron recogidas y ensayadas (0,002 ml por muestra) para estimulación de la quinasa (como se describe en el Ejemplo 6). El pico principal de actividad fue reunido y dializado frente a tampón fosfato sódico 50 mM (pH 7,3). Una columna de intercambio catiónico Mono-S (HR5/5, Pharmacia) fue preequilibrada con fosfato sódico 50 mM. Tras cargar el material activo (0,884 mg de proteína; 35 ml), la columna fue lavada con el tampón de inicio y después desarrollada a una velocidad de 1 ml/min. con un gradiente de NaCl. La actividad estimuladora de la quinasa fue recuperada a 0,45-0,55 M de sal y estaba repartida en cuatro fracciones de 2 ml cada una. Estas fueron reunidas y cargadas directamente en una columnas quelantes de Cu^{+2} (1,6 ml, Superosa quelante HR2/5, Pharmacia). La mayoría de las proteínas se adsorbieron a la resina, pero se eluyeron gradualmente con un gradiente lineal de 30 ml de cloruro amónico (0-1 M). La actividad fue eluida en un pico único de proteína en el intervalo de NH_{4}Cl de 0,05 a 0,2 M. Las muestras a partir de diversas etapas de purificación fueron analizadas mediante electroforesis en gel seguido de tinción con plata usando un kit de ICN (Costa Mesa, CA), y sus contenidos en proteína fueron determinados con un ensayo de unión al colorante Azul de Coomassie usando un kit de Bio-Rad (Richmond, CA).

La proteína p44 (10 \mug) fue reconstituida en 200 \mul de tampón bicarbonato amónico 0,1 M (pH 7,8). La digestión fue llevada a cabo con tripsina tratada con L-1-tosil-amida 2-feniletil clorometil cetona (Serva) a 37ºC durante 18 h. a una relación enzima a sustrato de 1:10. La mezcla peptídica resultante fue preparada mediante HPLC de fase inversa y monitorizada a 215 nm usando una columna VydaC C4 micro (2,1 mm i.d. x 15 cm, 300 \ring{A}) y un sistema de cromatografía líquida 1090 HP equipado con un detector de arreglo de diodos y un ordenador. La columna fue equilibrada con ácido trifluoroacético 0,1% (fase móvil A), y la elución fue efectuada con un gradiente linel de fase móvil B desde 0% a 55% (acetonitrilo 90% en ácido trifluoracético 0,1%) a lo largo de 70 min. El caudal fue de 0,2 ml/min. y la temperatura de la columna fue controlada a 25ºC. Un tercio de las alícuotas de los picos del péptido recogidas manualmente a partir del sistema HPLC fueron caracterizadas mediante análisis de la secuencia N-terminal mediante degradación de Edman. La fracción eluída después de 27,7 min. (T27,7) contuvo secuencias aminoacídicas mixtas y fue recromatografiada adicionalmente tras reducción como sigue: Una alícuota de 70% de la fracción peptídica fue secada al vacío y reconstituida en 100 \mul de tampón bicarbonato amónico 0,2 M (pH 7.8). Se añadió DTT (concentración final 2 mM) a la disolución, que fue entonces incubada a 37ºC durante 30 min. La mezcla peptídica reducida fue después separada mediante HPLC de fase inversa usando una columna Vydac (2.1 mm i.d. x 15 cm). Las condiciones de elución y caudal fueron idénticas a las descritas anteriormente. El análisis de la secuencia aminoacídica del péptido fue realizado con un secuenciador de proteínas Modelo 477 (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) equipado con un analizador de aminoácidos feniltiohidantoína (PTH) on-line y un sistema de análisis de datos Modelo 900 (Hunkapiller y otros (1986) en Methods of Protein Microcharacterization, J. E. Shively, ed. (Clifton, New Jersey: Humana Press p. 223-247). Se cargó la proteína en un disco de fibra de vidrio tratado con ácido trifluoroacético preciclado con polibreno y NaCl. El análisis de aminoácido-PTH fue realizado con un micro sistema de cromatografía líquida (Modelo 120) usando bombas de jeringas duales y columnas de calibre estrecho de fase reversa (C-18) (Applied Biosystems, 2.1 mm x 250 mm).

El ARN fue aislado a partir de células Rat1-EJ mediante procedimientos estándar (Maniatis y otros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor, New York (1982) y se seleccionó poli (A)+ usando un kit separador de mARN (Clontech Lab, Incl. Palo Alto, CA). El cADN fue sintetizado con el kit Superscript (de BRL Life Technologies, Inc., Bethesda, MD). El cADN de doble hebra fraccionado en columna fue ligado en un vector plasmídico pJT-2 digerido en Sal1- y Not1, un derivado del vector pCD-X (Okayama y Berg, Mol. Cell Biol. 3: 280 (1983)) y transformado en células DH10B E. coli mediante electroporación (Dower y otros, Nucl. Acids Res. 16: 6127 (1988)). Aproximadamente 5 x 10^{5} transformantes primarios fueron cribados con dos sondas oligonucleotídicas que fueron derivadas de las secuencias proteicas del extremo N- terminal de NDF (residuos 5-244) y el péptido tríptico T40.4 (residuos 7-12). Sus respectivas secuencias fueron como sigue (N indica cualquiera de los 4 nt):

1

Los oligonucleótidos sintéticos fueron marcados en los extremos con [\gamma-^{32}P]ATP con polinucleótido quinasa T4 y usados para grupos de cribado replicados de filtros de nitrocelulosa. La disolución de hibridación contenía 6 x SSC, fosfato sódico 50 mM (pH 6.8), pirofosfato sódico 0,1%, Disolución de Denhardt 2 x, 50 \mug/ml de ADN de esperma de salmón, y formamida 20% (para la sonda 1) o sin formamida (para la sonda 2). Los filtros fueron lavados tanto a 50ºC con SSC 0,5 x, SDS 0,2%, EDTA 1 mM (para la sonda 1) como a 37ºC con SSC 2 x, SDS 0,2%, EDTA 2 mM (para la sonda 2). La autoradiografía de los filtros dio diez clones que hibridaron con ambas sondas. Estos clones fueron purificados volviéndolos a poner en placas e hibridándolos con sondas como se describe anteriormente. Los clones de cADN fueron secuenciados usando un secuenciador de ADN automatizado 373A de Applied Biosystems y kits de secuenciación en ciclos Taq DyeDeoxy^{TM} Terminator de Applied Biosystems siguiendo las instrucciones de los fabricantes. En algunos casos, las secuencias fueron obtenidas usando [^{35}S]dATP (Amersham) y kits de Sequenasa^{TM} de U.S. Biochemicals siguiendo las instrucciones de los fabricantes. Ambas hebras del clón 44 de cADN fueron secuenciadas usando oligonucleótidos sintéticos como cebadores. La secuencia de los 350 nt más hacia el 5' fue determinada en siete clones de cADN independientes. El clón resultante demostró el patrón mostrado en la figura 30 (NDF).

Ejemplo 10 Estrategias para detectar otras posibles variantes de corte y empalme posibles

El alineamiento de las secuencias aminoacídicas deducidas de los clones CADN y los productos de PCR de las secuencias bovina, y la humana publicada (Fig 31) y las secuencias de rata muestran un alto nivel de similitud, indicando que estas secuencias se derivan de genes homólogos dentro de tres especies. El número variable de transcritos de ARN mensajero detectable a nivel del producto cADN/PCR es probablemente debido al extenso corte y empalme específico de tejido. Los tejidos obtenidos y mostrados en la Figura 30 sugieren que existen otras variantes de corte y empalme. Una lista de variantes de corte y empalme probables se indica en la Figura 37. Muchas de estas variantes pueden ser obtenidas mediante sondas específicas de segmentos codificantes de bibliotecas de cADN derivadas de diferentes tejidos y mediante experimentos de PCR usando pares de cebadores específicos para segmentos codificantes particulares. Alternativamente, las variantes pueden ser ensambladas a partir de clones de cADN específicos, productos de PCR o regiones de ADN genómicas vía técnicas de corte y empalme conocidas para una persona con experiencia en la técnica. Por ejemplo, un sitio de corte de una enzima de restricción rara en un segmento común (por ejemplo, A), puede ser usada para conectar el extremo animo terminal FBA del GGF2BPP2 a las secuencias carboxilo terminales de GGF2BPP1, GGFBPP2, GGFBPP3, o GGFBPP4. Si la presencia o ausencia del segmento codificante E y/o G proporciona beneficios para los usos contemplados y afirmados, entonces estos segmentos codificantes pueden estar incluídos en las construcciones de expresión. Estas secuencias variantes pueden expresarse en sistemas recombinantes y los productos recombinantes pueden ser ensayados para determinar sus niveles de actividad mitogénica de células de Schwann así como su capacidad para unir y activar el receptor p185^{erbB2}.

Ejemplo 11 Identificación de los elementos funcionales de GGF

Las estructuras deducidas de la familia de secuencias GGF indican que las formas más largas (como se representa por GGF2BPP4) codifican proteínas transmembranas en las que la parte extracelular contiene un dominio que se asemeja al factor de crecimiento epidérmico (véase Carpenter y Wahl en Peptide Growth Factors and Their Receptors I pp. 69-133) Springer-Verlag, NY 1991). Las posiciones de los residuos de cisteína en los segmentos codificantes de las secuencias peptídicas C y C/D o C/D' están conservadas con respecto a los residuos análogos en la secuencia peptídica del factor de crecimiento epidérmico (EGF) (véase la Figura 35, SEQ ID Nºs. 151-153). Esto sugiere que el dominio extracelular funciona como sitios de reconocimiento del receptor y de activación biológica. Varias de las formas variantes carecen de los segmentos codificantes H, K, y L y así pueden expresarse según se secretan, proteínas biológicamente activas difusibles. Las secuencias de ADN de GGF que codifican polipéptidos que abarcan el dominio similar a EGF (EGFL) pueden tener actividad biológica plena para estimular la actividad mitogénica de células
gliales.

Las versiones unidas a la membrana de esta proteína pueden inducir la proliferación de células de Schwann si se expresan sobre la superficie de las neuronas durante la embriogénesis o durante la regeneración nerviosa (en la que las superficies de las neuronas están íntimamente asociadas con las superficies de las células de Schwann proliferativas).

Los GGFs secretados (no unidos a membranas) pueden actuar como factores difusibles clásicos que pueden interaccionar con las células de Schwann a cierta distancia de su punto de secreción. Otras formas pueden ser liberadas a partir de intracélulas generadas vía daño tisular y ruptura celular. Un ejemplo de un GGF secretado es la proteína codificada por GGF2HBS5 (véase el ejemplo 6); éste es el único GGF conocido que se ha encontrado que está directamente hacia el exterior de la célula (ejemplo 7). La secreción está probablemente mediada vía secuencia hidrofóbica N-terminal encontrada sólo en la región E, que es el dominio N-terminal contenido dentro del GGF-II recombinante codificado por GGF2HBS5.

Otros GGFs parece que no son secretados (véase el ejemplo 6). Estos GGFs pueden ser formas de respuestas a daños que se liberan como consecuencia del daño tisular.

Otras regiones de la estructura proteica predicha de GGF-II (codificada por GGF2HBS5) y otras proteínas que contienen las regiones B y A exhiben similitudes a la proteína núcleo de heparán sulfato proteoglicano de la membrana basal humana (ref.). El péptido ADSGEY, que se socaliza junto a la segunda cisteína de la inmunoglobulina C2 plegada en estos GGFs, tiene lugar en nueve de veintidós repeticiones C-2 encontradas en esa proteína de la lámina basal. Esta evidencia sugiere fuertemente que estas proteínas pueden asociarse con proteínas de la matriz tales como las asociadas con neuronas y glia, y puede sugerir un método para secuestrar factores de crecimiento gliales en los sitios diana.

Ejemplo 12 Purificación de GGFs de células recombinantes

Para obtener GGFs longitud completa o porciones de GGFs para ensayar la actividad biológica, las proteínas pueden ser producidas en exceso usando ADN clonado. Varias aproximaciones pueden ser usadas. Una célula de E. coli recombinante que contiene las secuencias descritas anteriormente puede ser construida. Los sistemas de expresión tales como pNH8a o pHH16a (Stratagene, Inc.) pueden ser usados para este propósito siguiendo los procedimientos de los fabricantes. Alternativamente, estas secuencias pueden ser insertadas en un vector de expresión y una línea celular sobreproductora puede ser construida. Como ejemplo para este propósito, el ADN que codifica para GGF, clón GGF2BPP5, ha sido expresado tanto en células COS como en células de ovario de hamster chino (véase el Ejemplo 7) (J. Biol. Chem. 263, 3521-3527, (1981)). Este vector que contiene secuencias de ADN de GGF puede ser transfectado en células hospedadoras usando procedimientos establecidos.

La expresión transiente puede ser examinada o los clones resistentes a G418 pueden ser hechos crecer en presencia de metotrexato para seleccionar células que amplifiquen el gen dhfr (contenido en el vector pMSXND) y, en el proceso, co-amplificar la secuencia cadificante de la proteína GGF adyacente. Debido a que las células CHO pueden ser mantenidas en un medio totalmente libre de suero y libre de proteínas (Hamilton y Ham, In Vitro 13, 537-547 (1977)), la proteína deseada puede ser purificada del medio. Los análisis de Western usando los antisueros producidos en el Ejemplo 9 pueden ser usados para detectar la presencia de la proteína deseada en el medio condicionado de las células sobreproductoras.

La proteína deseada (rGGF-II) fue purificada a partir del medio condicionado expresando de modo transitorio células cos como sigue. La rGGF-II fue recogida del medio condicionado y parcialmente purificada usando cromatografía de intercambio catiónico (POROS-HS). La columna fue equilibrada con MES 33,3 mM pH 6,0. El medio condicionado fue cargado a un caudal de 10 ml/min. El pico que contenía la actividad de proliferación de células de Schwann y la inmunoreactividad (usando el anticuerpo policlonal contra un péptido GGFII descrito anteriormente) fue eluído con Tris 50 mM, NaCl 1 M pH 8.0. (Figura 50A y 50B respectivamente).

La rGGF-II se expresó también usando una línea celular estable de ovario de Hamster chino. La rGGF-II del medio condicionado recogido fue fácilmente purificada usando cromatografía de intercambio catiónico (POROS-HS). La columna fue equilibrada con PBS pH 7,4. El medio condicionado fue cargado a 10 ml/min. El pico que contenía la actividad proliferativa de células de Schwann y la inmunoreactividad (usando antisuero policlonal GGFII) fue eluído con Hepes 50 mM, NaCl 500 mM pH 8,0. Un pico adicional fue observado a Hepes 50 mM, NaCl 1 M pH 8.0 tanto con proliferación como con inmunoreactividad (Fig. 51).

La rGGF-II puede ser purificada adicionalmente usando cromatografía de interacción hidrofóbica como una etapa de alta resolución; Una cromatografía de intercambio catiónico/fase inversa (si fuera necesaria una segunda etapa de alta resolución); una etapa de inactivación viral y una etapa de eliminación del ADN tal como una cromatografía de intercambio aniónico.

Una descripción detallada de los procedimientos usados es como sigue:

La actividad de proliferación de las células de Schwann del pico de GGF-II recombinante eluído de la columna de intercambio catiónico fue determinada como sigue: Las respuestas mitogénicas de las células de Schwann cultivadas fueron medidas en presencia de Forskolina 5 M usando el pico eluído por Tris 50 mM, NaCl 1 M pH 8.0. El pico fue añadido a 20 l, 10 1 (1:10) 10 1 y (1:100) 10 l. La incorporación de ^{125}I-Uridina fue determinada y expresada como (CPM) tras una exposición de 18-24 horas.

Una inmunotransferencia usando anticuerpos poli-clonales generados frente a un péptido de GGF-II fue llevada a cabo como sigue: 10 \mul de diferentes fracciones fueron corridos en geles de gradiente 4-12%. Los geles fueron transferidos a papel de nitrocelulosa, y las membranas de nitrocelulosa fueron bloqueadas con BSA 5% e incubadas con anticuerpos específicos para GGF-II (una dilución 1:250). La ^{125}I proteína A (dilución 1:500, actividad específica = 9,0/Ci/g) fue usada como anticuerpo secundario. Las inmunomembranas fueron expuestas a películas de rayos X Kodak durante 6 horas. Las fracciones pico eluídas con NaCl 1 M mostraron una banda inmuno-reactiva ancha a 65-90 Kd que es el intervalo de tamaño esperado para GGFII y glicoformas de peso molecular más elevado.

La purificación de GGF-II en columnas de intercambio catiónico fue realizada como sigue: El medio condicionado de células CHO que expresan rGGFII fue cargado en la columna de intercambio catiónico a 10 ml/min. La columna fue equilibrada con PBS pH 7,4. La elución fue lograda con Hepes 50 mM, NaCl 500 mM pH 8,0 y Hepes 50 mM, NaCl 1 M pH 8,0 respectivamente. Todas las fracciones fueron analizadas usando el ensayo de proliferación de células de Schwann (CPM) descrito aquí. La concentración de proteínas (mg/ml) fue determinada mediante el ensayo Bradford usando BSA como el estándar.

Se realizó una transferencia Western usando 10 \mul de cada fracción. Como se indicó en la Figura 51A y 51B, la inmunoreactividad y la actividad de células de Schwann comigran.

El ensayo mitogénico de células de Schwann descrito aquí puede ser usado para ensayar el producto expresado del clón de longitud completa o cualquier porción biológicamente activa del mismo. El clón de longitud completa GGF2BPP5 ha sido expresado de modo transitorio en células COS. Los extractos intracelulares de las células COS transfectadas muestran actividad biológica cuando son ensayados en los ensayos de proliferación de células de Schwann descritos en el Ejemplo 1. Además, el clón de longitud completa que codifica el GGF2HBS5 ha sido expresado de modo transiente en células CHO y de insecto (Ejemplo 7). En este caso tanto el extracto celular como el medio condicionado muestran actividad biológica en el ensayo de proliferación de células de Schwann descrito en el Ejemplo 1. Cualquier miembro de la familia de variantes de corte y empalme de ADNs complementarios derivados del gen GGF (que incluyen las Heregulinas) puede ser expresado de esta manera y ensayado en el ensayo de proliferación de células de Schwann por una persona con experiencia en la técnica.

Alternativamente, el material recombinante pueden ser aislado a partir de otras variantes según Wen y otros (Cell 69, 559 (1992)) que expresó la variante de corte y empalme del factor de diferenciación Neu (NDF) en células COS-7. Los clones de cADN insertados en el vector plasmídico eucariótico pJT-2 están bajo el control del promotor temprano SV40, y están flanqueados en 3' por las señales de terminación y poliadenilación de SV40. Las células COS-7 fueron transfectadas con el ADN plasmídico pJT-2 mediante electroporación como sigue: 6 x 10^{6} células (en 0,8 ml de DMEM y FEBS 10%) fueron transfectados a una cubeta de 0,4 cm y mezclada con 20 \mug de ADN plasmídico en 10 \mul de disolución TE (Tris- HCl 10 mM (pH 8.0), 1 mM EDTA). La electroporación fue realizada a temperatura ambiente a 1600 V y 25 \muF usando un aparato Gene Pulser de Bio-Rad con la unidad controladora del pulso establecida a 200 ohms. Las células fueron después diluídas en 20 ml de DMEM, FBS 10% y transferidas a un frasco T75 (Falcon). Después de 14 h. de incubación a 37ºC, el medio fue reemplazado con DMEM, FBS 1%, y la incubación continuo durante unas 48 h adicionales. El medio condicionado que contenía la proteína recombinante que fue recogida de las células demostró actividad biológica en una línea celular que expresaba el receptor para esta proteína. Esta línea celular (línea celular AU 565 de carcinoma de mama humano cultivada) fue tratada con material recombinante. Las células tratadas exhibieron un cambio morfológico que es característico de la activación del receptor erbB2. El medio condicionado de este tipo también puede ser ensayado en el ensayo de proliferación de células de Schwann.

Ejemplo 13 Purificación y ensayo de otras proteínas que se unen al receptor p185^{erbB2} I. Purificación de gp30 y p70

Lupu y otros (Science 249, 1552 (1990)) y Lippman y Lupu (número de solicitud de patente PCT/US91/03443 (1990)), aquí incorporada mediante referencia, han purificado una proteína a partir de medio condicionado de una línea celular de cáncer de mama humano MDA-MB-231, como sigue.

Las colecciones de medio condicionado fueron llevadas a cabo usando procedimientos bien conocidos. El medio fue concentrado 100 veces en una celdilla de ultra filtración Amicon (membrana YM5) (Amicon, Danvers, MA). Una vez clarificados y concentrados, los medios fueron almacenados a -20ºC mientras que colecciones consecutivas fueron hechas durante los siguientes días. Los medios concentrados fueron dializados usando tubos Spectra/por® 3 (Spectrum Medical Industries, Los Angeles, CA) frente a 100 volúmenes de ácido acético 0,1 M a lo largo de un período de dos días a 4ºC. El material que precipitó durante diálisis fue eliminado mediante centrifugación a 4000 rpm durante 30 min. a 4ºC; se añadieron inhibidores de proteasas. La muestra clarificada fue entonces liofilizada.

El medio condicionado liofilizado fue disuelto en ácido acético 1 M hasta una concentración final de alrededor de 25 mg/ml de proteína total. El material insoluble fue eliminado mediante centrifugación a 10.000 rpm durante 15 minutos. La muestra fue después cargada en una columna de Sephadex G-100 (XK 16, Pharmacia, Piscataway, NJ), fue equilibrada y fue sometida a elución con ácido acético 1 M a 4ºC con un flujo ascendente de 30 ml/h. 100 ng de proteína fueron procesados a partir de 4 ml de medio concentrado 100 veces. Las fracciones que contienen 3 ml de eluído fueron liofilizadas y resuspendidas en 300 \mul de PBS para ensayar y servir como una fuente para una purificación adicional.

El material purificado por Sephadex G-100 fue corrido en una cromatografía líquida de alta presión de fase inversa (HPLC). La primera etapa implicaba un gradiente de un exceso de acetonitrilo. El gradiente de exceso de acetonitrilo y todas las otras etapas de HPLC fueron llevadas a cabo a temperatura ambiente tras el equilibrado de una columna de fase inversa C3 con TFA 0,05% (ácido trifluoroacético) en agua (pureza de HPLC). Las muestras fueron cargadas y las fracciones fueron eluídas con un gradiente lineal (acetonitrilo 0-45% en TFA 0,05%) a un caudal de 1 ml/min. a lo largo de un período de 30 minutos. La absorbancia fue monitorizada a 280 nm. Fracciones de 1 ml fueron recogidas y liofilizadas antes del análisis de su actividad competidora con el receptor EGF.

Una segunda etapa de HPLC implicó un gradiente bajo de acetonitrilo. La cantidad reunida de fracciones activas de la etapa de HPLC previa fue recromatografiada a lo largo de la misma columna. La elución fue realizada con un gradiente de acetonitrilo de 0-18% en TFA 0,05 a lo largo de un período de 5 minutos seguido de un gradiente de acetonitrilo 18-45% lineal en TFA 0,05% a lo largo de un período de 30 minutos. El caudal fue de 1,0 ml/min y se recogieron fracciones de 1 ml. El factor similar a TGF\alpha humano fue eluído a una concentración de acetonitrilo de 30-32% como un único pico detectable por RRA.

Lupu y otros (Proc. Natl. Acad. Sci. 89, 2287 (1992)) purificaron otra proteína que se une al receptor p185^{erbB2}. Esta proteína particular, p75 fue purificada a partir de medio condicionado usado para el crecimiento de SKBr-3 (una línea celular de cáncer de mama humano) propagada en medio Eagle mejorado (IMEM: GIBCO) suplementado con suero bovino fetal 10% (GIBCO). La proteína p75 fue purificada de medio condicionado concentrado (100X) usando una columna de afinidad para p185^{erbB2}. El dominio extracelular de 94 kilodaltones de p185^{erbB2} (que se une a p75) fue producido vía la expresión recombinante y fue acoplado a una matriz de cromatografía de afinidad de poliacrilamida hidrazido-Sefarosa. Tras el acoplamiento, la matriz fue lavada abundantemente con HCl 1,0 M enfriado en hielo y las bolas fueron activadas con NaNO_{2} 0,5 M. La temperatura fue mantenida a 0ºC durante 20 minutos y esto fue seguido de filtración y lavado con HCl 0,1 M enfriado en hielo. Se corrieron 500 ml de medio condicionado concentrado a través de las bolas mediante gravedad. La columna fue lavada y eluída en etapas con ácido cítrico 1,0 M a valores de pH entre 4,0 y 2,0 (para permitir la disociación de erbB2 y p75). Todas las fracciones fueron desaladas en columnas PD10 de Pharmacia. La purificación produjo un polipéptido homogéneo de 75 Kda a pH de elución 3,0-3,5 (confirmado mediante análisis de SDS/PAGE mediante tinción con plata).

II. Unión de gp30 a p185^{erbB2}

La proteína gp30 purificada fue ensayada en un ensayo para determinar si se une a p185^{erbB2}. Un ensayo de competición con un anticuerpo monoclonal frente a p185^{erbB2}. La proteína gp30 desplazó la unión del anticuerpo a p185^{erbB2} en células SK-BR-3 y MDA-MB-453 (líneas celulares de carcinoma de cáncer de mama que expresan el receptor p185^{erbB2}). La actividad de proliferación de células de Schwann de gp30 pueden también ser demostrada tratando cultivos de células de Schwann con gp30 purificada usando el procedimiento de ensayo descrito en los Ejemplos 1-3.

III. Unión de p75 a p185^{erbB2}

Para evaluar si el polipéptido de 75 Kda (p75) obtenido del medio condicionado SKBr-3 era en realidad un ligando para la oncoproteína erbB2 en las células SKBr-3, se usó un ensayo de competición como el descrito anteriormente para gp30.

Se encontró que la p75 exhibía una actividad de unión, mientras que el material de otras fracciones cromatográficas no mostró tal actividad (datos no mostrados). El material que fluyó a su través mostró cierta actividad de unión. Esto podría ser debido a la presencia de ECD erbB2 desprendido.

IV. Otros ligandos p185erbB2

Peles y otros (Cell 69, 205 (1992)) han purificado también un ligando estimulador de p185^{erbB2} a partir de células de rata, (NDF, véase el Ejemplo 8 para los métodos). Holmes y otros (Science 256, 1205 (1992)) han purificado Heregulina \alpha a partir de células humanas que se une a y estimula 185^{erbB2} (véase el ejemplo 6). Tarakovsky y otros Oncogene 6: 218 (1991) han demostrado la unión de un polipéptido de 25 KD aislado de macrófagos activados al receptor Neu, un homólogo de p185^{erbB2}, incorporado aquí mediante referencia.

VI. Aislamiento de NDF

Yarden y Peles (Biochemistry 30, 3543 (1991) han identificado una glicoproteína de 35 kilodaltones que estimula el receptor 185^{erbB2}. La proteína fue identificada en medio condicionado según el siguiente procedimiento. Las células de Rata I-EJ fueron hechas crecer hasta confluencia en frascos de 175 cm^{2} (Falcon). Las monocapas fueron lavadas con PBS y dejadas en medio libre de suero durante 10-16 h. El medio fue descartado y reemplazado por medio libre de suero fresco que fue recogido tras 3 días en cultivo. El medio condicionado fue aclarado mediante centrifugación a baja velocidad y concentrado 100 veces en una celda de ultracentrifugación Amicon con una membrana YM2 (peso molecular límite de 2000). Los análisis bioquímicos de la actividad estimuladora neu en medio condicionado indican que el ligando es una glicoproteína de 35-kD que es estable al calor pero sensible a la reducción. El factor es precipitable tanto por concentraciones elevadas de sal o alcohol ácido. Una purificación parcial de la molécula por precipitación selectiva, cromatografía de heparina-agarosa, y filtración en gel en ácido diluído resultó en un ligando activo, que es capaz de estimular el receptor protooncogénico pero que es ineficaz sobre la proteína neu oncogénica, que es constitutivamente activa. La fracción purificada, sin embargo, conservó la capacidad para estimular también el receptor relacionado para EGF, sugiriendo que estos dos receptores están funcionalmente acoplados a través del mecanismo bidireccional. Alternativamente, el supuesto ligando interacciona simultáneamente con ambos receptores. La característica bioquímica del factor puede ser usada para permitir un factor completamente purificado con el que explorar estas posibilidades.

En otras publicaciones, Davis y otros (Biochem. Biophys. Res. Commun. 179, 1536 (1991), Proc. Natl. Acad. Sci. 88, 8582 (1991) y Greene y otros, solicitud de patente PCT/US91/02331 (1990)) describe la purificación de una proteína a partir de medio condicionado de una línea celular humana de células T (ATL-8).

La línea celular ATL-2 es una línea celular T HTLV-1 (+) independiente de IL-2. Las células ATL-2 libres de micoplasma fueron mantenidas en medio RPMI 1640 que contenía FCB 10% como el medio de cultivo (FCS 10%-RPMI 1640) a 37ºC en una atmósfera humidificada con CO_{2} 5%.

Para purificación de la sustancia proteinácea, las células TL-2 fueron lavadas dos veces en 1 x PBS y cultivadas a 3 x 10^{5} ml en medio RPMI 1640 libre de suero/L-glutamina 2 mM durante setenta y dos horas seguido de la precipitación de las células. El sobrenadante del cultivo así producido es el llamado "medio condicionado" (M.C.).

El M. C. fue concentrado 100 veces, desde 1 litro hasta 10 ml, usando una membrana Diaflo YM-10 (Amicon, Boston, MA) con un tamaño límite de 1000 d. Para usar en algunos ensayos, el C.M. concentrado que contenía componentes mayores de 1000 PM fue rediluído al volumen original con medio RPMI. La electroforesis en gel usando un gel en gradiente de poliacrilamida (Integrated Separation Systems, Hyde Park, MD o Phorecast System por Amersham, Arlington Heigts, IL) seguido de tinción de plata de algunos de los materiales purificados en estas dos columnas a partir de la preparación de un litro reveló al menos de cuatro a cinco bandas de las cuales las bandas de 10 kD y 20 kD fueron únicas para este material. El M.C. aprobado que contenía componentes de menos de 1000 PM fue usado sin dilución.

El medio condicionado concentrado fue esterilizado por filtración con un filtro de 0,45 \mu uniflo (Schleicher y Schuell, Keenne, NH) y después purificado adicionalmente aplicándolo a una columna de intercambio aniónico DEAE-SW (Waters, Inc., Milford, MA) que había sido preequilibrada con Tris-Cl 10 mM pH 8,1. Las proteínas del M.C. concentrado que representan un litro del medio condicionado TL-2 por ensayo de HPLC fueron absorbidas en la columna y después eluídas con un gradiente lineal de NaCl 0 mM a 40 mM a un caudal de 4 ml/ml. Las fracciones fueron ensayadas usando un ensayo de inmunocomplejo quinasa in vitro con 10% de la fracción DEAE apropiada (el material purificado de una columna) o 1% de las fracciones C18 apropiadas (material purificado de dos columnas). La actividad que aumentó la actividad tirosina quinasa de p185c-neu en una manera dependiente de dosis usando el ensayo de inmunocomplejo quinasa in vitro fue eluída como un pico dominante a lo largo de 4 a 5 fracciones (36-40) alrededor de 220 a 240 mM de NaCl. Tras la purificación de HPLC-DEAE, las proteínas en las fracciones activas fueron concentradas y reunidas, concentradas y sometidas a cromatografía de fase inversa C18 (matriz millón) (Waters, Inc., Milford, MA) (a la que se hace referencia como la etapa C18+1 o material purificado de dos columnas). La elución fue realizada en un gradiente lineal de 2-propanol frente a TFA 0,1%. Todas las fracciones fueron dializadas frente a medio RPMI 1640 para eliminar el 2-propanol y ensayadas usando el ensayo de inmunocomplejo quinasa in vitro, descrito a continuación, y una concentración de 1% de la fracción apropiada. La actividad que aumenta la actividad tirosina quinasa de p185c-neu fue eluída en dos picos. Una eluyó en la fracción 11-13, mientras que la segunda, un pico ligeramente menos activo eluyó en las fracciones 20-23. Estos dos picos corresponden a alrededor de 5 a 7% de isopropanol y 11 a 14% de isopropanol respectivamente. Las fracciones 11-13 C18#1 generadas fueron usadas en los estudios de caracterización. Las fracciones activas obtenidas a partir de la segunda etapa cromatográfica fueron reunidas, y designadas como la muestra sustancia proteinácea.

Una preparación de veinte libros empleó la misma estrategia de purificación. Las fracciones activas DEAE 35-41 fueron reunidas y sometidas a cromatografía c18 como se trata anteriormente. Las fracciones C18#1 11-13 y 21-24 tuvieron ambas una actividad dosis dependiente. La muestra reunida de las fracciones 11-13 fue sometida a una etapa cromatográfica C18 adicional (a la que se hace referencia como C18#2 o material purificado de tres columnas). De nuevo, las fracciones 11-13 y 21-24 tuvieron actividad. La dosis respuesta de la fracción 23 como se determinó mediante un ensayo de inmunocomplejo quinasa como se describe en el Ejemplo 8 puede ser obtenida tras la adición de 0,005% por volumen de la fracción 23 y 0,05% por volumen de la fracción 23. Esto represente la mayor pureza lograda.

Los intervalos de pesos moleculares fueron determinados basándose en la cromatografía de filtración en gel y análisis de membrana de ultrafiltración. Aproximadamente se mantuvieron iguales cantidades de actividad tirosina quinasa y se hicieron pasar por un filtro de peso molecular límite de 10.000. Casi toda la actividad fue hecha pasar por un filtro de peso molecular límite de 30.000. Los intervalos de peso molecular para fracciones cromatográficas activas fueron determinados comparando las fracciones que contenían actividad activadora de neu dosis dependiente con los perfiles de elución de un grupo de estándares de pesos moleculares proteicos. (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) generados usando las mismas condiciones de ensayo. Una región de actividad de bajo peso molecular entre 7.000 y 14.000 daltones fue identificada. Un segundo intervalo de actividad osciló desde alrededor de 14.000 a alrededor de 24.000 daltones.

Tras la electroforesis en gel usando un gel de gradiente de poliacrilamida (Integrated Separation systems, Hyde Park, MD o Phorecase System por Amersham, Arlington Heights, IL), se hizo una tinción de plata del material purificado por las tres columnas (c18#2) con un kit de tinción de plata disponible comercialmente (BioRad, Rockville Centre, NY). Las fracciones 21, 22, 23, y 24 de la purificación c18#2 de la preparación de veinte litros fue corrida con marcadores. Las fracciones 22 y 23 mostraron las respuestas a dosis más potentes en el ensayo quinasa 185^{erbB2} (neu) (véase a continuación). El hecho que las fracciones de peso molecular seleccionadas interaccionen con 185^{erbB2} fue demostrado con un ensayo de inmunocomplejo quinasa.

Huan y otros (1992, J. Biol. Chem. 257: 11508-11512), incorporado aquí mediante referencia, han aislado un factor de crecimiento ligando de neu/erb B2 adicional a partir de riñón bovino. El factor polipeptídico de 25 kD fue aislado por un procedimiento de fraccionamiento en columna, seguido de cromatografía en columna secuencial sobre DEAE/celulosa (DE52), Sulfadex (Sephadex G-50 sulfatado), heparina-Sefarosa 4B, y Superdex 75 (cromatografía líquida de proteína rápida). El factor, NEL-GF, estimula la autofosforilación específica de tirosina del producto génico neu/erb B2.

VII. Ensayo de inmunocomplejo quinasa NDF para la unión del ligando a p185^{erb}B2

Este ensayo refleja las diferencias en la actividad de autofosforilación del p185 inmunoprecipitado impulsada mediante la preincubación del lisado celular PN-NR6 con cantidades variables de medio condicionado ATL-2 (M.C.) o de una sustancia proteinácea y a la que se hace referencia de aquí en adelante como actividad activadora de neu.

Las líneas celulares usadas en el ensayo de inmunocomplejo quinasa fueron obtenidas, preparadas y cultivadas según los métodos descritos en Kokai y otros, Cell 55, 287-292 (28 de Julio, 1989) descripciones que están incorporadas aquí mediante referencia como si estuvieran totalmente expuestas aquí, y el número de serie de la solicitud de patente norteamericana 386.820 archivada el 27 de Julio, 1989 bajo el nombre de Mark I. Green titulado "Methods of Treating Cancerous cells with Anti-receptor Antibodies", las descripciones de las cuales están aquí incorporadas por referencia como si estuvieran totalmente expuestas aquí.

Las líneas celulares fueron todas mantenidas en medio DMEM que contenía FCS 5% como el medio de cultivo (FCS 5%-DMEM) a 37ºC en una atmósfera humidificada con CO_{2} 5%.

Los cultivos densos de células en placas de 150 mm fueron lavados dos veces con PBS frío, raspadas en 10 ml de tampón congelado-descongelado (NaCl 150 mM, MgCl_{2} 1 mM, Hepes 20 mM, pH 7,2, glicerol 10%, EDTA, 1 mM, Aprotinina 1%), y centrifugados (600 x 6, 10 minutos). Los precipitados celulares fueron resuspendidos en 1 ml de tampón de lisis (Hepes 50 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, Brij 35 3%, EDTA 1 mM, MgCl_{2} 1,5 mM, Aprotinina 1%, EGTA 1 mM, Na_{3}VO_{4} 20 \muM, glicerol 10%) y hechos rotar durante treinta minutos a 4ºC. Todos los agentes químicos fueron de Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, a menos que se indique de otra manera. Los materiales insolubles fueron eliminados por centrifugación a 40.000 x g durante treinta minutos. El sobrenadante claro que fue usado subsiguientemente es designado como lisado celular.

Los lisados celulares fueron incubados durante quince minutos con 50 \mul de Proteína A-sefarosa 50% (volumen/volumen) (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri), y centrifugados durante dos minutos para preaclarar los lisados. Las alícuotas de 50 \mul de lisado celular preclarificado fueron incubadas en hielo durante quince minutos con medio condicionado, la sustancia proteinácea, u otros factores como se especifican, en un volumen final de 1 ml con tampón de lisis. La muestra fue después incubada con 5 \mug de anticuerpo monoclonal 7.16.4, que reconoce el dominio extracelular de p185neu y p185c-neu, u otros anticuerpos apropiados, durante veinte minutos en hielo, seguido de una incubación de veinte minutos con 50 \mul de proteína A-sefarosa 50% (volumen/volumen) con rotación a 4ºC. Los inmunocomplejos fueron recogidos mediante centrifugación, lavados cuatro veces con 500 \mul de tampón de lavado (Hepes 50 mM, pH 7,5, Brij 35 0,1%, NaCl 150 mM, EDTA 2 mM, Aprotinina 1%, Na_{3}VO_{4} 30 \muM), después dos veces con tampón de reacción (Hepes 20 mM (pH 7,4), MnCl2 3 mM y Brij 35 0,1%, Na_{3}VO_{4} 30 \muM). Los precipitados fueron resuspendidos en 50 \mul de tampón de reacción y se añadió (Gamma-32P)-ATP (Amersham, Arlington Heights, IL) dando una concentración final de 0,2 \muM. Las muestras fueron incubadas a 27ºC durante veinte minutos o a 4ºC durante 25 minutos con muestras más puras. Las reacciones fueron terminadas mediante la adición de tampón de muestras 3 x SDS que contenían ATP 2 mM y EDTA 2 mM y después incubándolas a 100ºC durante cinco minutos. Las muestras fueron después sometidas a análisis SDS-PAGE en geles de acrilamida 10%. Los geles fueron teñidos, secados, y expuestos a películas KodaK XAR o SRP con pantallas intensificadoras.

VIII. Purificación de la actividad inductora del receptor de acetilcolina (ARIA)

ARIA, una proteína de 42 kD que estimula la síntesis del receptor de acetilcolina, ha sido aislada en el laboratorio de Gerald Fischbach (Falls y otros, Cell 72: 801-815 (1993)). ARIA induce la fosforilación en tirosina de una proteína transmembrana muscular de 185 Kda que se asemeja a p185^{erbB2}, y estimula la síntesis del receptor de acetilcolina en miotubos embriónicos cultivados. Los análisis de secuencias de clones de cADN que codifican ARIA muestran que ARIA es un miembro del grupo de proteínas ligando GGF/erbB2, y ésto es potencialmente útil en la estimulación de la mitogénesis de células gliales y otras aplicaciones de, por ejemplo, GGF2 descritas aquí.

Ejemplo 14 Fosforilación de proteínas en tirosina mediada por GGF en células de Schwann

Las células de Schwann de rata, tras el tratamiento con niveles suficientes de Factor de Crecimiento Glial para inducir la proliferación, mostraron la estimulación de la fosforilación de proteínas en tirosina (figura 36). Cantidades variables de GGF parcialmente purificado fueron aplicadas a un cultivo primario de células de Schwann de rata según el procedimiento resumido en el Ejemplo 3. Las células de Schwann fueron hechas crecer en DMEM/suero de ternera fetal 10%/forskolina 5 \muM/0,5 \mug por mL de GGF-CM (0,5 ml por pocillo) en placas de 24 pocillos recubiertas con poli D-lisina. Cuando estuvieron confluentes, las células fueron alimentadas con DMEM/suero de ternera fetal 10% a 0,5 mL por pocillo y dejadas en el incubador toda la noche hasta quiescencia. El día siguiente, las células fueron alimentadas con 0,2 mL de DMEM/suero de ternera fetal 10% y dejadas en el incubador durante 1 hora. Las muestras de ensayo fueron después añadidas directamente al medio a diferentes concentraciones y durante diferentes intervalos de tiempo como se requería. Las células fueron después lisadas en tampón de lisis hirviendo (fosfato sódico, 5 mM, pH 6,8; SDS, 2%, \beta-mercaptoetanol, 5%; ditiotreitol, 0,1 M; glicerol, 10%; Azul de Bromofenol 0,4%; vanadato sódico, 10 mM), incubadas en un baño de agua hirviente durante 10 minutos y después bien analizadas directamente o congeladas a -70ºC. Las muestras fueron analizadas corriéndolas en geles SDS-PAGE 7,5% y después electrotransferidas a nitrocelulosa usando procedimientos estándar como se describe por Towbin y otros (1979) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 4350-4354. La nitrocelulosa transferida fue incubada con anticuerpos antifosfotirosina usando métodos estándar como se describen en Kamps y Selton (1988) Oncogene 2: 305-315. Las membranas incubadas fueron expuestas a película autoradiográfica durante toda la noche y reveladas usando un procesador de laboratorio estándar. Las medidas densitométricas fueron llevadas a cabo usando un densitómetro de láser potenciado XL Ultrascan (LKB). La asignación de los pesos moleculares fue hecha relativo a los estándares de alto peso molecular preteñidos (Sigma). Las respuestas a dosis de fosforilación de proteína y proliferación de células de Schwann son muy similares (figura 36). El peso molecular de la banda fosforilada está muy próxima al peso molecular de p185^{erbB2}. Resultados similares fueron obtenidos cuando las células de Schwann fueron tratadas con medio condicionado preparado a partir de células COS transformadas con el clón GGF2HBS5. Estos resultados correlacionaron bien con la interacción esperada de lo sGGFs con y la activación de p185^{erbB2}.

Este experimento ha sido repetido con GGF-II recombinado. El medio condicionado derivado de una línea celular CHO transformada de modo estable con el clón GGF-II (GGF2HBS5) estimula la fosforilación de proteínas en tirosina usando el ensayo descrito anteriormente. Las células CHO transfectadas con un vector vacío no estimularon esta actividad (Fig. 52).

Ejemplo 15 Ensayo para la proliferación de células de Schwann por el factor proteico de la línea celular MDA-MB-231

La proliferación de células de Schwann está mediada por el medio condicionado derivado de la línea celular de cáncer de mama MDA-MB-231. A día 1 del ensayo, 10^{4} células de Schwann de rata primarias fueron puestas en placas en 100 \mul de medio Eagle modificado de Dulbecco suplementado con plasma bovino fetal 5% por pocillo en una placa de microvaloración de 96 pocillos. A día 2 del ensayo, 10 \mul de medio condicionado (de la línea celular de cáncer de mama humano MDA-MB-231, cultivada como se describe en el Ejemplo 6) fue añadida a cada pocillo de la placa de microvaloración. A día 6, el número de células de Schwann por placa fue determinado usando un ensayo de fosfatasa ácida (según el procedimiento de Connolly y otros Anal. Biochem. 152: 136 (1986)). La placa fue lavada con 100 \mul de tampón fosfato salino (PBS) y 100 \mul de tampón de reacción (acetato sódico 0,1 M, ((pH 5.5)), Tritón X-100 0,1%, y p-nitrofenil fosfato 10 mM) fueron añadidos por pocillo. La placa fue incubada a 37ºC durante dos horas y la reacción fue detenida mediante la adición de 10 \mul de NaOH 1N. La densidad óptica de cada muestra fue leída en un espectrofotómetro a 410 nm. Un 38% de estimulación de número de células sobre las céluals de Schwann tratadas con medio condicionado a partir de una línea celular testigo (HS-294T, que no produce el ligando erbB-2) fue observada. Este resultado muestra que una proteína secretada por la línea celular MDA-MB-231 (que secreta una actividad de unión p185^{erbB2}) estimula la proliferación de células de Schwann.

Ejemplo 16 N-glicosilación de GGF

La secuencia proteica predicha a partir de la secuencia de cADN de los clones candidatos GGF2BPP1, 2 y 3 de GGF-II contiene un número de motivos de N-glicosilación consenso. Un hueco en la secuencia peptídica GGFII02 coincide con el residuo de asparagina en uno de estos motivos, indicando que el carbohidrato está probablemente unido en este sitio.

La N-glicosilación de los GGFs fue estudiada observando los cambios en movilidad en SDS-PAGE tras incubación con N-gluconasa, una enzima que corta las uniones covalentes entre el carbohidrato y los residuos de asparagina en las proteínas.

El tratamiento con N-gluconasa de GGF-II dio una banda principal de PM 40-42 Kda y una banda secundaria a 45-48 kDa. Experimentos de elución de la actividad en condiciones no reductoras mostraron una especie desglicosilada activa única a aprox. 45-50 kDa.

Los experimentos de elución de la actividad con GGF-I también demuestran un aumento en la movilidad electroforética cuando son tratados con N-gluconasa, dando una especie activa de PM 26-28 kDa. La tinción de plata confirmó que hay un desplazamiento de movilidad, aunque no se pudo asignar a una banda N-desglicosilada debido a una tinción de fondo en la muestra usada.

Depósito

El ácido nucleico que codifica para la proteína GGF-II (cADN, GGF2HBS5) (Ejemplo 6) en un plásmido
pBluescript 5k, bajo el control del promotor T7, fue depositado en la colección de Cultivos Tipo Americana, Rockville, Maryland, el 2 de septiembre, 1992, y se le dio el nº de acceso de ATCC 75298. El solicitante reconoce su responsabilidad para reemplazar este plásmido si no fuera viable antes del final del término de una patente publicada aquí, y su responsabilidad para notificar a la ATCC de la provisionalidad de tal patente, al tiempo al cual se pondrá a disposición el depósito al público. Previo a este tiempo el depósito se pondrá a disposición del Comisionado de Patentes bajo los términos de 37 CFR \NAK1.14 y 35 USC \NAK112.

<110> GOODEARL, ANDREW

\hskip1cm STROOBANT, PAUL

\hskip1cm MINGHETTI, LUISA

\hskip1cm WATERFIELD, MICHAEL

\hskip1cm MARCHIONNI, MARK

\hskip1cm CHEN. MARIO S.

\hskip1cm HILES, IAN

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<120> FACTORES DE CRECIMIENTO MITOGÉNICO, SU PREPARACIÓN Y USO

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<130> 04585/D02EP5

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<140> 93918139.2

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<141> 1993-06-29

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<150> 07/907,138

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<151> 1992-06-30

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<150> 07/940,389

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<151> 1992-09-03

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<150> 07/965,173

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<151> 1992-10-23

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<150> 08/036,555

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<151> 1993-03-24

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<150> PCT/US93/06228

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<151> 1993-06-29

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<160> 257

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<170> FastSEQ para Windows Versión 4.0

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<210> 1

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<211> 8

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<212> PRT

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<213> Bos taurus

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<400> 1

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\sa{Phe Lys Gly Asp Ala His Thr Glu}

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<210> 2

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<211> 13

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<212> PRT

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<213> Bos taurus

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<221> VARIANTE

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<222> (1)...(12)

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<223> XAA en posición 1 es Lisina o Arginina; Xaa en posición 12 es desconocida

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<400> 2

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\sa{Xaa Ala Ser Leu Ala Asp Glu Tyr Glu Tyr Met Xaa Lys}

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<210> 3

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<211> 12

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<212> PRT

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<213> Bos taurus

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<220>

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<221> VARIANTE

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<222> (1)...(10)

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<223> Xaa en posición 1 es Lisina o Arginina; Xaa en posición 10 es desconocido

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<400> 3

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\sa{Xaa Thr Glu Thr Ser Ser Ser Gly Leu Xaa Leu Lys}

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 4

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Bos taurus

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

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<222> (1)...(1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa en posición 1 es Lisina o Arginina

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 4

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\sa{Xaa Lys Leu Gly Glu Met Trp Ala Glu}

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 5

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<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

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<222> (1)...(1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa en posición 1 es Lisina o Arginina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 5

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\sa{Xaa Leu Gly Glu Lys Arg Ala}

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<210> 6

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<211> 16

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<212> PRT

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<213> Bos taurus

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<221> VARIANTE

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<222> (1)... (1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa en posición 1 es Lysina o Arginina

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 6

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\sa{Xaa Ile Lys Ser Glu His Ala Gly Leu Ser Ile Gly Asp Thr Ala Lys}

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 7

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<211> 13

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<212> PRT

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<213> Bos taurus

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<220>

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<221> VARIANTE

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<222> (1)... (1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa en posición 1 es Lisina o Arginina

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 7

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\sa{Xaa Ala Ser Leu Ala Asp Glu Tyr Glu Tyr Met Arg Lys}

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 8

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<211> 16

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<212> PRT

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<213> Bos taurus

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<221> VARIANTE

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<222> (1)...(1)

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<223> Xaa en posición 1 es Lisina o Arginina

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 8

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\sa{Xaa Ile Lys Gly Glu His Pro Gly Leu Ser Ile Gly Asp Val Ala Lys}

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

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<213> Bos taurus

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<220>

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<221> VARIANTE

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<222> (1)...(12)

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<223> Xaa en posición 1 es Lisina o Arginina, Xaa en posición 12 es desconocido

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 9

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\sa{Xaa Met Ser Glu Tyr Ala Phe Phe Val Gln Thr Xaa Arg}

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 10

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<211> 14

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<212> PRT

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<213> Bos taurus

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<221> VARIANTE

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<222> (1)...(1)

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<223> Xaa en posición 1 es Lisina o Arginina

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<400> 10

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\sa{Xaa Ser Glu His Pro Gly Leu Ser Ile Gly Asp Thr Ala Lys}

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<210> 11

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<211> 10

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<212> PRT

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<213> Bos taurus

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\vskip0.400000\baselineskip

<220>

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<221> VARIANTE

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<222> (1)...(8)

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<223> Xaa en posición 1 es Lisina o Arginina, Xaa en posición 8 es desconocido

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

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\sa{Xaa Ala Gly Tyr Phe Ala Glu Xaa Ala Arg}

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<210> 12

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<211> 9

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<212> PRT

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<213> Bos taurus

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<220>

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<221> VARIANTE

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<222> (1)...(7)

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<223> Xaa en posición 1 es Lisina o Arginina, Xaa en posición 7 es desconocido

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

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\sa{Xaa Lys Leu Glu Phe Leu Xaa Ala Lys}

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

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<212> PRT

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<213> Bos taurus

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<220>

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<221> VARIANTE

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<222> (1)...(1)

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<223> Xaa en posición 1 es Lisina o Arginina

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

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\sa{Xaa Thr Thr Glu Met Ala Ser Glu Gln Gly Ala}

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<210> 14

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<211> 10

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<212> PRT

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<213> Bos taurus

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<220>

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<221> VARIANTE

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<222> (1)...(1)

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<223> Xaa en posición 1 es Lisina o Arginina

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<400> 14

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\sa{Xaa Ala Lys Glu Ala Leu Ala Ala Leu Lys}

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<210> 15

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<211> 8

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<212> PRT

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<213> Bos taurus

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<220>

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<221> VARIANTE

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<222> (1)...(1)

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<223> Xaa en posición 1 es Lisina o Arginina

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

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\sa{Xaa Phe Val Leu Gln Ala Lys Lys}

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<210> 16

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<211> 6

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<212> PRT

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<213> Bos taurus

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<220>

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<221> VARIANTE

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<222> (1)...(1)

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<223> Xaa en posición 1 es Lisina o Arginina

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\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

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\sa{Xaa Leu Gly Glu Met Trp}

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<210> 17

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<211> 16

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<212> PRT

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<213> Bos taurus

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<400> 17

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\sa{Glu Tyr Lys Cys Leu Lys Phe Lys Trp Phe Lys Lys Ala Thr Val Met}

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<210> 18

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<211> 10

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<212> PRT

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<213> Bos taurus

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<220>

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<221> VARIANTE

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<222> (8)...(8)

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<223> Xaa en posición 8 es desconocido

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<400> 18

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\sa{Glu Ala Lys Tyr Phe Ser Lys Xaa Asp Ala}

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\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)...(2)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa en posición 2 es desconocido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Glu Xaa Lys Phe Tyr Val Pro}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Glu Leu Ser Phe Ala Ser Val Arg Leu Pro Gly Cys Pro Pro Gly Val}

\sac{Asp Pro Met Val Ser Phe Pro Val Ala Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 2003

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> variación

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (31)...(32)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N en las posiciones 31 y 32 podría ser A o G

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (265)...(1530)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

2

3

4

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (11)...(11)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa en posición 11 es desconocido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ala Ser Leu Ala Asp Glu Tyr Glu Tyr Met Xaa Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (9)...(9)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa en posición 9 es desconocido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Thr Glu Thr Ser Ser Ser Gly Leu Xaa Leu Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ala Ser Leu Ala Asp Glu Tyr Glu Tyr Met Arg Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (7)...(7)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa en posición 7 es desconocido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ala Gly Tyr Phe Ala Glu Xaa Ala Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Thr Thr Glu Met Ala Ser Glu Gln Gly Ala}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ala Lys Glu Ala Leu Ala Ala Leu Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Phe Val Leu Gln Ala Lys Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Glu Thr Gln Pro Asp Pro Gly Gln Ile Leu Lys Lys Val Pro Met Val}

\sac{Ile Gly Ala Tyr Thr}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(19)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa, en posiciones 1, 13, 17 y 19 es desconocido

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Glu Xaa Lys Glu Gly Arg Gly Lys Gly Lys Gly Lys Lys Lys Glu}

\sac{Xaa Gly Xaa Gly Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ala Glu Lys Glu Lys Thr Phe Cys Val Asn Gly Gly Glu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (6)...(6)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa en posición 6 es desconocido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Leu Glu Phe Leu Xaa Ala Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa en posición 1 es Lisina o Arginina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Val His Gln Val Trp Ala Ala Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(11)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa en posición 1 es Lisina o Arginina, Xaa en posición 11 es desconocido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Tyr Phe Phe Phe Met Glu Pro Glu Ala Xaa Ser Ser Gly}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(13)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa en posición 1 es Lisina o Arginina, Xaa en posición 13 es desconocido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Leu Gly Ala Trp Gly Pro Pro Ala Phe Pro Val Xaa Tyr}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa en posición 1 es Lisina o Arginina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Trp Phe Val Val Ile Glu Gly Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa en posición 1 es Lisina o Arginina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Ala Ser Pro Val Ser Val Gly Ser Val Gln Glu Leu Val Gln Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa en posición 1 es Lisina o Arginina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Val Cys Leu Leu Thr Val Ala Ala Leu Pro Pro Thr}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 7

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(6)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa en posición 1 es Lisina o Arginina, Xaa en posición 6 es desconocido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 39

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Asp Leu Leu Leu Xaa Val}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cagaaggtct tctccttctc agc

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 41

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cctcgctcct tcttcttgcc cttc

\hfill

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 4

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 42

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Val Leu Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 43

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agtacgtcca ctccctttct gtctctgcct gaatag

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 569

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(569)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 44

\vskip1.000000\baselineskip

6

7

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 45

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Val His Gln Val Trp Ala Ala Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANT

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (10)...(10)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa en posición 10 es desconocido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 46

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Tyr Ile Phe Phe Met Glu Pro Glu Ala Xaa Ser Ser Gly}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (12)...(12)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa en posición 12 es desconocido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 47

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Gly Ala Trp Gly Pro Pro Ala Phe Pro Val Xaa Tyr}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 8

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 48

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Trp Phe Val Val Ile Glu Gly Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 49

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 49

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ala Ser Pro Val Ser Val Gly Ser Val Gln Glu Leu Val Gln Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 50

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Val Cys Leu Leu Thr Val Ala Ala Leu Pro Pro Thr}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 51

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Val His Gln Val Trp Ala Ala Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 52

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (12)...(12)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa en posición 12 es desconocida

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 52

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Ala Ser Leu Ala Asp Ser Gly Glu Tyr Met Xaa Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 53

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (5)...(5)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa en posición 5 es desconocido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 53

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Asp Leu Leu Leu Xaa Val}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 54

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> variación

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(18)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N en posiciones las 3, 12 y 18 es C o T; N en posición 6 es A o G; N en las posiciones 9 y 15 es A, T, G o C.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 54

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttnaanggng angcncanac

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 55

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> variación

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(21)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N en las posiciones 7 y 13 es C o T; N en las posiciones 4, 10, y 16 es A o G; N en posiciones 19 es A, T, G o C.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 55

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

catntantcn tantcntcng c

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 56

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> variación

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (3)...(18)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N en las posiciones 3 y 15 es C o T; N en las posiciones 6, 9, y 18 es A, T, G o C

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 56

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgntcngang ccatntcngt

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 57

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> variación

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (3)...(17)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N en las posiciones 3 y 15 es C o T; N en posición 6 es A o G; N en las posiciones 9 y 18 es A, T, G o C.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 57

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgntcnctng ccatntcngt

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 58

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> variación

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (3)...(18)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N en posición 3 es A, G o T; N en posición 18 es C o T; N en las posiciones 6, 12, y 15 es A, T, G o C.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 58

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccnatnacca tnggnacntt

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 59

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> variación

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (3)...(18)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N en posición 12 es C o T; N en posición 15 es A o G; N en las posiciones 3, 9 y 18 es A, T, G o C.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 59

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcngcccana cytgrtgnac

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> variación

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(20)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N en las posiciones 3 y 9 es C o T; N en las posiciones 5 y 8 es A o G; N en posición 6 es A, T, G o C; N en las posiciones 15 y 18 es A o G.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 60

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcntcnggnt ccatnaanaa

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 61

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> variación

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(20)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N en posición 6 es A, G o T; N en posición 3 es C o T; N en posición 15 es A o G; N en las posiciones 9 y 12 es A, T, G o C.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 61

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccntcnatna cnacnaacca

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 62

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> variación

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(17)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N en las posiciones 6 y 9 es A o G; N en las posiciones 3, 12 y 15 es A, T, G o C.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 62

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tcngcnaant anccngc

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 63

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> variación

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(20)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N en las posiciones 12 y 15 es C o T; N en las posiciones 3, 6, 9 y 18 es A, T, G o C

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 63

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcngcnagng cntcnttngc

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 64

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> variación

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(20)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N en las posiciones 6, 12 y 15 es C o T; N en las posiciones 3, 9, y 18 es A, T, G o C.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 64

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcngcnaang cntcnttngc

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 65

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> variación

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(20)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N en las posiciones 3 y 9 es C o T; N en posición 18 es A o G; N en las posiciones 6, 12 y 15 es A, T, G o C.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 65

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttnttngcnt gnagnacnaa

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 66

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> DNA

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> variación

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(20)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N en las posiciones 3, 9 y 12 es C o T; N en posición 18 es A o G; N en las posiciones 6 y 15 es A, T, G o C.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 66

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttnttngcnt gnaanacnaa

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 67

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> variación

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(17)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N en las posiciones 9 y 12 es C o T; N en las posiciones 3, 6 y 15 es A, T, G o C.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 67

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgnacnagnt cntgnac

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 68

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> variación

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(17)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N en las posiciones 6, 9, y 12 es C o T; N en las posiciones 3 y 15 es A, T, G o C.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 68

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tgnacnaant cntgnac

\hfill

17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 69

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> variación

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(21)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N en posición 7 es C o T; N en las posiciones 4 y 16 es A o G; N en las posiciones 10, 13 y 19 es A, T, G o C.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 69

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

catntantcn ccngantcng c

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 70

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> variación

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(21)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N en las posiciones 7 es C o T; N en las posiciones 4, 13 y 16 es A o G; N en las posiciones 10 y 19 es A, T, G o C.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 70

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

catntantcn ccnctntcng c

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 71

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> variación

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(21)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N en las posiciones 10 y 19 es C o T; N en posición 4 es A o G; N en las posiciones 1, 7, 13 y 16 es A, T, G o C.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 71

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ngantcngcn aangangcnt t

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 72

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> variación

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(21)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N en posición 19 es C o T; N en posición 4 es A o G; N en las posiciones 1, 7, 10, 13 y 16 es A, T, G o C.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 72

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ngantcngcn agngangcnt t

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 73

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> variación

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(21)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N en las posiciones 10 y 19 es C o T; N en las posiciones 1 y 4 es A o G; N en las posiciones 7, 13 y 16 es A, T, G o C.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 73

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

nctntcngcn aangangcnt t

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 74

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> variación

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(21)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N en posición 19 es C o T; N en las posiciones 1 y 4 es A o G; N en las posiciones 7, 10, 13 y 16 es A, T, G o C.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 74

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

nctntcngcn agngangcnt t

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 75

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> variación

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(21)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N en las posiciones 10 y 19 es C o T; N en las posiciones 4 y 13 es A o G; N en las posiciones 1, 7 y 16 es A, T, G o C.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 75

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ngantcngcn aanctngcnt t

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 76

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> variación

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(21)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N en posición 19 es C o T; N en las posiciones 4 y 13 es A o G; N en las posiciones 1, 7, 10 y 16 es A, T, G o C.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 76

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ngantcngcn agnctngcnt t

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 77

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 730

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 77

\vskip1.000000\baselineskip

1650

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 78

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> variación

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(21)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N en las posiciones 10 y 19 es C o T; N en las posiciones 1, 4 y 13 es A o G; N en las posiciones 7 y 16 es A, T, G o C.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 78

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

nctntcngcn aanctngcnt t

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 79

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> variación

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(21)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N en posición 19 es C o T; N en las posiciones 1, 4 y 13 es A o G; N en las posiciones 7, 10 y 16 es A, T, G o C.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 79

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

nctnctngcn agnctngcnt t

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 80

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> variación

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(20)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N en posición 9 es A o G; N en las posiciones 3, 6, 17 y 18 es A, T, G o C.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 80

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

acnacngana tggctcnnga

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 81

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> variación

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(20)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N en posición 16 es C o T; N en posición 9 es A o G; N en posiciones 3, 6, 17 y 18 es A, T, G o C.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 81

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

acnacngana tggcagnnga

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 82

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> variación

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(20)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N en posición 3 es C o T; N en posición 6 es A o G; N en las posiciones 9, 15 y 18 es A, T, G o C.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 82

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

cancangtnt gggcngcnaa

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 83

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> variación

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(20)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N en posición 3 es C o T; N en posición 15 es A o G; N en las posiciones 5, 9 y 18 es A, T, G o C; N en posición 12 es A, C o T.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 83

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ttngtngtna tnganggnaa

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 84

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> variación

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(20)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N en posiciones 9 y 15 es C o T; N en posición 3 es A o G; N en las posiciones 6, 12 y 18 es A, T, G o C.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 84

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aanggngang cncanacnga

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 85

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> variación

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(20)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N en las posiciones 7 y 16 es C o T; N en posición 3 es A o G; N en las posiciones 6, 9, 12, 15 y 18 es A, T, G o C.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 85

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gangcnntng cngcnntnaa

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 86

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> variación

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(20)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N en posición 19 es C o T; N en las posiciones 15 y 18 es A o G; N en las posiciones 3, 6, 9 y 12 es A, T, G o C.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 86

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtnggntcng tncangannt

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 87

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> variación

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(20)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N en posición 19 es C o T; N en las posiciones 15 y 18 es A o G; N en las posiciones 3, 6, 9 y 12 es A, T, G o C.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 87

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gtnggnagng tncangannt

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 88

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> variación

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(21)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N en las posiciones 4, 7 y 16 es C o T; N en posición 12 es A o G; N en las posiciones 1, 10 y 19 es A, T, G o C; N en posición 133 es A, C o T.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 88

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

nacnttnttn annatntgnc c

\hfill

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 89

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 417

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 89

\vskip1.000000\baselineskip

8

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 90

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> variación

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(33)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N en posición 16 puede ser A o G; N en posición 22 puede ser A o G; N en posición 28 puede ser C o T.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<440> 90

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccgaattctg cagganacuc anccugancc ugg

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 91

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> variación

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(37)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N en posición 17 puede ser A o G; N en posición 26 puede ser A, C o T.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 91

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aaggatcctg cagugtntau gcuccnatua ccatugg

\hfill

37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 92

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> variación

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(34)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N en posición 19 puede ser C o T; N en posición 28 puede ser A o G; N en posición 31 puede ser C o T.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 92

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccgaattctg caggcugant cugguganta natg

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 93

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> variación

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(33)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N en posición 19 puede ser C o T; N en posición 22 puede ser C o T; N en posición 28 puede ser A o G; N en posición 31 puede ser C o T.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 93

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccgaattctg caggcugana gngguganta nat

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 94

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> variación

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(34)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N en posición 20 puede ser A o G; N en posición 23 puede ser C o T; N en posición 32 puede ser A o G.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 94

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aaggatcctg caguuucatn tantcuccug antc

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 95

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> variación

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(34)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N en posición 20 puede ser A o G; N en posición 23 puede ser C o T; N en posición 29 y 30 puede ser A o G; N en posición 32 puede ser A o G.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 95

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aaggatcctg caguuucatn tantcuccnn tntc

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 96

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> variación

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(33)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N en posición 16 puede ser C o T; N en posición 19 puede ser A o G.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 96

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccgaattctg cagcancang tutgggcugc taa

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 97

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> variación

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(35)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N en posición 16 puede ser A o G; N en posición 19 puede ser C o T; N en posición 22 puede ser C o T; N en posición 28 puede ser A o G; N en posición 34 puede ser A o G.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 97

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccgaattctg cagatnttnt tnatggancc ugang

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 98

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> variación

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (30)...(30)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N en posición 30 puede ser C o T.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 98

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccgaattctg cagggggucc uccugcuttn ccugt

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 99

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> variación

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(33)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N en posición 19 puede ser C o T; N en posición 28 puede ser A o C o T; N en posición 31 puede ser A o G.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 99

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccgaattctg cagtggttng tugtuatnga ngg

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 100

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> variación

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(34)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N en posición 17, 20, y 26 es Inosina. Y en 14 y 29 puede ser citidina o timidina.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 100

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aaggatcctg cagyttngcn gcccanacyt grtg

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 101

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> variación

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(33)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N en posición 16 puede ser C o T; N en posición 22 puede ser C o T; N en posición 28 puede ser A o G; N en posición 31 puede ser A o G.

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 101

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aaggatcctg caggcntcug gntccatnaa naa

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 102

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> variación

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(33)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N en posición 19 puede ser A o G.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 102

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aaggatcctg cagacuggna augcuggugg ucc

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 103

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> variación

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(35)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N en posición 14 puede ser C o T; N en posición 20 puede ser C o T; N en posición 23 puede ser A o g o T; N en posición 32 puede ser A o G.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 103

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aaggatcctg cagnttuccn tcnatuacua cnaac

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 104

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> variación

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(33)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N en posición 4 puede ser A o G; N en posición 7 puede ser C o T; N en posición 10 puede ser A o G; N en posición 13 puede ser C o T.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 104

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

catntantcn tantctcugc aaggatcctg cag

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 105

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> variación

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(33)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N en posición 16 puede ser A o G; N en posición 22 puede ser C o T; N en posición 28 puede ser C o T.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 105

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccgaattctg cagaanggug angcucanac uga

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 106

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> variación

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(33)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N en posición 6 puede ser C o T; N en posición 12 puede ser C o T; N en posición 15 puede ser C o T.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 106

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcugcnaaug cntcnttugc aaggatcctg cag

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 107

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> variación

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(33)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N en posición 12 puede ser C o T; N en posición 15 puede ser C o T.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 107

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

gcugcuagug cntcntttgc aaggatcctg cag

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 108

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> variación

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(30)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N en posición 6 puede ser A o G; N en posición 9 puede ser A o G.

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 108

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tcugcnaant auccugcaag gatcctgcag

\hfill

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 109

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 109

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

catcgatctg caggctgatt ctggagaata tatgtgca

\hfill

38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 110

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 110

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aaggatcctg cagccacatc tcgagtcgac atcgatt

\hfill

37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 111

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 111

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccgaattctg cagtgatcag caaactagga aatgaca

\hfill

37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 112

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 112

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

catcgatctg cagcctagtt tgctgatcac tttgcac

\hfill

37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 113

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 113

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aaggatcctg cagtatattc tccagaatca gccagtg

\hfill

37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 114

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 114

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aaggatcctg caggcacgca gtaggcatct ctta

\hfill

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 115

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 115

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ccgaattctg cagcagaact tcgcattagc aaagc

\hfill

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 116

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 116

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

catcccggga tgaagagtca ggagtctgtg gca

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 117

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 117

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atacccgggc tgcagacaat gagatttcac acacctgcg

\hfill

39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 118

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 118

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aaggatcctg cagtttggaa cctgccacag actcct

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 119

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 119

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atacccgggc tgcagatgag atttcacaca cctgcgtga

\hfill

39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 120

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 120

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{His Gln Val Trp Ala Ala Lys Ala Ala Gly Leu Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 121

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 121

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gly Gly Leu Lys Lys Asp Ser Leu Leu Thr Val Arg Leu Gly Ala Asn}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 122

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(12)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa en posición 12 es desconocido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 122

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Gly Ala Trp Gly Pro Pro Ala Phe Pro Val Xaa Tyr}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 123

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 123

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Leu Thr Val Arg Leu Gly Ala Trp Gly His Pro Ala Phe Pro Ser}

\sac{Cys Gly Arg Leu Lys Glu Asp}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 124

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (10)...(10)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa en posición 10 es desconocido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 124

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Tyr Ile Phe Phe Met Glu Pro Glu Ala Xaa Ser Ser Gly}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 125

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 125

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Glu Asp Ser Arg Tyr Ile Phe Phe Met Glu Pro Glu Ala Asn Ser}

\sac{Ser Gly Gly Pro Gly Arg Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 126

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 126

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Val Ala Gly Ser Lys Leu Val Leu Arg Cys Glu Thr Ser Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 127

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 127

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Glu Tyr Lys Cys Leu Lys Phe Lys Trp Phe Lys Lys Ala Thr Val Met}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 128

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 128

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Cys Glu Thr Ser Ser Glu Tyr Ser Ser Leu Lys Phe Lys Trp Phe Lys}

\sac{Asn Gly Ser Glu Leu Ser Arg Lys Asn Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 129

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 129

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Ala Ser Leu Ala Asp Ser Gly Glu Tyr Met}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 130

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 130

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Glu Leu Arg Ile Ser Lys Ala Ser Leu Ala Asp Ser Gly Glu Tyr Met}

\sac{Cys Lys Val Ile Ser Lys Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 131

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 131

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ala Ser Leu Ala Asp Glu Tyr Glu Tyr Met Arg Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 132

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 132

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Arg Ile Ser Lys Ala Ser Leu Ala Asp Ser Gly Glu Tyr Met Cys}

\sac{Lys Val Ile Ser Lys Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 133

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 744

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (8)...(625)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 133

\vskip1.000000\baselineskip

9

10

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 134

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1193

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 134

11

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 135

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1108

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (8)...(778)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 135

12

13

14

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 136

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 559

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (459)...(558)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<221> variación

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (214)...(214)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N en posición 214 es desconocido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 136

\vskip1.000000\baselineskip

15

16

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 137

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 252

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (3)...(251)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<221> variación

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (8)...(8)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N en posición 8 podría ser tanto A como G.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<221> variación

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)...(2)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es desconocido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 137

17

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 138

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 178

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 138

18

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 139

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 122

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)...(121)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 139

\vskip1.000000\baselineskip

19

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 140

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 417

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (84)...(272)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 140

\vskip1.000000\baselineskip

20

21

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 141

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 102

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (3)...(101)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 141

\vskip1.000000\baselineskip

22

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 142

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 69

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(69)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 142

\vskip1.000000\baselineskip

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 143

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(60)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 143

\vskip1.000000\baselineskip

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 144

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 144

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

agtacgtcca ctccctttct gtctctgcct gaatag

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 145

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(27)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 145

\vskip1.000000\baselineskip

2400

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 146

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 569

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(565)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 146

\vskip1.000000\baselineskip

25

26

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 147

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 730

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)...(652)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 147

28

29

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 148

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1652

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (459)...(1181)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 148

\vskip1.000000\baselineskip

30

31

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 149

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1140

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(840)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<221> variación

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (6)...(6)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N es desconocido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<221> variación

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)...(2)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es desconocido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 149

\vskip1.000000\baselineskip

33

34

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 150

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 1764

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)...(1681)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 150

\vskip1.000000\baselineskip

35

36

37

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 151

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 151

38

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 152

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 152

39

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 153

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 153

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Glu Cys Leu Arg Lys Tyr Lys Asp Phe Cys Ile His Gly Glu Cys Lys}

\sac{Tyr Val Lys Glu Leu Arg Ala Pro Ser Cys Lys Cys Gln Gln Glu Tyr}

\sac{Phe Gly Glu Arg Cys Gly Glu Lys Ser Asn Lys Thr His Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 154

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 198

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(195)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 154

\vskip1.000000\baselineskip

40

41

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 155

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 192

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(189)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 155

\vskip1.000000\baselineskip

42

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 156

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 183

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(180)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 156

\vskip1.000000\baselineskip

43

44

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 157

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 210

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(207)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 157

\vskip1.000000\baselineskip

45

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 158

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 267

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(264)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 158

\vskip1.000000\baselineskip

46

47

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 159

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 252

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(249)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 159

48

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 160

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 128

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (3)...(125)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 160

49

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 161

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 141

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)...(139)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 161

50

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 162

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (15)...(22)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa en las posiciones 15 y 22 es desconocido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 162

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ala Ala Glu Lys Glu Lys Thr Phe Cys Val Asn Gly Gly Glu Xaa Phe}

\sac{Met Val Lys Asp Leu Xaa Asn Pro}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 163

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 745

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(744)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 163

\vskip1.000000\baselineskip

51

52

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 164

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa en posición 1 es Lys o Arg.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 164

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Ala Leu Ala Ala Ala Gly Tyr Asp Val Glu Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 165

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 5

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(1)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa en posición 1 es Lys o Arg.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 165

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Leu Val Leu Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 166

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(3)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa en posición 1 es Lys o Arg; Xaa en las posiciones 2 y 3 es desconocido.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 166

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Xaa Xaa Xaa Tyr Pro Gly Gln Ile Thr Ser Asn}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 167

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> variación

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (25)...(36)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N en las posiciones 25 y 31 es desconocido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 167

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atagggaagg gcgggggaag ggtcnccctc ngcagggccg ggcttgcctc tggagcctct

\hfill

60

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 168

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> variación

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (16)...(16)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> N en posición 16 es desconocido

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 168

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tttacacata tattcncc

\hfill

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 169

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 169

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Glu Thr Gln Pro Asp Pro Gly Gln Ile Leu Lys Lys Val Pro Met Val}

\sac{Ile Gly Ala Tyr Thr}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 170

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 422

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 170

\vskip1.000000\baselineskip

53

54

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 171

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 69

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 171

\vskip1.000000\baselineskip

55

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 172

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 172

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg Lys Gly Asp Val Pro Gly Pro Arg Val Lys Ser Ser Arg Ser Thr}

\sac{Thr Thr Ala}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 173

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 231

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (132)...(231)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 173

56

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 174

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 178

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (3)...(178)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 174

57

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 175

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 122

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (2)...(122)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 175

\vskip1.000000\baselineskip

58

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 176

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 102

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (3)...(101)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 176

\vskip1.000000\baselineskip

59

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 177

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 128

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (3)...(128)

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 177

\vskip1.000000\baselineskip

60

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 178

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 69

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> CDS

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (1)...(69)

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 178

\vskip1.000000\baselineskip

61

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 179

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 179

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tcgggctcca tgaagaagat gta

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 180

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 180

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

tccatgaaga agatgtacct gct

\hfill

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 181

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 181

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atgtacctgc tgtcctcctt ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 182

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 182

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atgtacctgc tgtcctcctt ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 183

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 183

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atgtacctgc tgtcctcctt ga

\hfill

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 184

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 184

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

atgargtgtg ggcggcgaaa

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 185

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 185

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Glu Gly Lys Val His Pro Gln Arg Arg Gly Ala Leu Asp Arg Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 186

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 186

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Pro Ser Cys Gly Arg Leu Lys Glu Asp Ser Arg Tyr Ile Phe Phe Met}

\sac{Glu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 187

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 187

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Glu Leu Asn Arg Lys Asn Lys Pro Gln Asn Ile Lys Ile Gln Lys Lys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 188

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 349

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 188

63

64

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 189

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 6

\vskip0.400000\baselineskip

<212> ADN

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens & Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 189

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

aataaa

\hfill

6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 190

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 206

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 190

\vskip1.000000\baselineskip

65

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 191

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 263

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 191

66

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 192

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 280

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 192

67

68

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 193

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 254

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 193

\vskip1.000000\baselineskip

69

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 194

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 560

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 194

70

71

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 195

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 241

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 195

\vskip1.000000\baselineskip

72

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 196

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 137

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (14)...(135)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa en las posiciones 14, 23, 90, 100, 126, y 135 es desconocido

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 196

74

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 197

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 197

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Met Ser Glu Arg Arg Glu Gly Lys Gly Lys Gly Lys Gly Gly Lys Lys}

\sac{Asp Arg Gly Ser Gly Lys Lys Pro Val Pro Ala Ala Gly Gly Pro Ser}

\sac{Pro Ala}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 198

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 83

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 198

75

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 199

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 59

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 199

\vskip1.000000\baselineskip

76

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 200

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 200

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Ser Glu Leu Arg Ile Ser Lys Ala Ser Leu Ala Asp Ser Gly Glu}

\sac{Tyr Met Cys Lys Val Ile Ser Lys Leu Gly Asn Asp Ser Ala Ser Ala}

\sac{Asn Ile Thr Ile Val Glu Ser Asn Ala}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 201

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 201

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Glu Ile Thr Thr Gly Met Pro Ala Ser Thr Glu Thr Ala Tyr Val Ser}

\sac{Ser Glu Ser Pro Ile Arg Ile Ser Val ser Thr Glu Gly Thr Asn Thr}

\sac{Ser Ser Ser}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 202

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 202

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Thr Ser Thr Ser Thr Ala Gly Thr Ser His Leu Val Lys Cys Ala Glu}

\sac{Lys Glu Lys Thr Phe Cys Val Asn Gly Gly Glu Cys Phe Met Val Lys}

\sac{Asp Leu Ser Asn Pro Ser Arg Tyr Leu Cys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 203

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 203

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Cys Gln Pro Gly Phe Thr Gly Ala Arg Cys Thr Glu Asn Val Pro}

\sac{Met Lys Val Gln Thr Gln Glu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 204

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 188

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 204

\vskip1.000000\baselineskip

77

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 205

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 217

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 205

78

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 206

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 63

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus & Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 206

79

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 207

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus & Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 207

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Cys Pro Asn Glu Phe Thr Gly Asp Arg Cys Gln Asn Tyr Val Met}

\sac{Ala Ser Phe Tyr}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 208

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Bos taurus & Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 208

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ser Thr Ser Thr Pro Phe Leu Ser Leu Pro Glu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 209

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 209

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Met Ser Glu Arg Lys Glu Gly Arg Gly Lys Gly Lys Gly Lys Lys Lys}

\sac{Glu Arg Gly Ser Gly Lys Lys Pro Glu Ser Ala Ala Gly Ser Gln Ser}

\sac{Pro}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 210

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 248

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 210

\vskip1.000000\baselineskip

80

81

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 211

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 58

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 211

\vskip1.000000\baselineskip

82

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 212

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 212

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Ser Glu Leu Arg Ile Asn Lys Ala Ser Leu Ala Asp Ser Gly Glu}

\sac{Tyr Met Cys Lys Val Ile Ser Lys Leu Gly Asn Asp Ser Ala Ser Ala}

\sac{Asn Ile Thr Ile Val Glu Ser Asn Ala}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 213

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 213

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Glu Ile Ile Thr Gly Met Pro Ala Ser Thr Glu Gly Ala Tyr Val Ser}

\sac{Ser Glu Ser Pro}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 214

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 214

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Thr Ser Thr Ser Thr Thr Gly Thr Ser His Leu Val Lys Cys Ala Glu}

\sac{Lys Glu Lys Thr Phe Cys Val Asn Gly Gly Glu Cys Phe Met Val Lys}

\sac{Asp Leu Ser Asn Pro Ser Arg Tyr Leu Cys}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 215

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 215

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Cys Gln Pro Gly Phe Thr Gly Ala Arg Cys Thr Glu Asn Val Pro}

\sac{Met Lys Val Gln Asn Gln Glu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 216

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 216

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys His Leu Gly Ile Glu Phe Met Glu}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 217

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 190

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 217

83

84

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 218

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 218

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{His Asn Leu Ile Ala Glu Leu Arg Arg Asn Lys Ala His Arg Ser Lys}

\sac{Cys Met Gln Ile Gln Leu Ser Ala Thr His Leu Arg Ala Ser Ser Ile}

\sac{Pro His Trp Ala Ser Phe Ser Lys Thr Pro Trp Pro Leu Gly Arg}

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 219

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 239

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 219

\vskip1.000000\baselineskip

85

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 220

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 65

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 220

87

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 221

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 63

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 221

\vskip1.000000\baselineskip

88

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 222

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 222

\vskip1.000000\baselineskip

89

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 223

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 69

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 223

\vskip1.000000\baselineskip

90

91

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 224

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 88

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 224

92

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 225

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 83

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 225

93

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 226

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 425

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 226

94

95

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 227

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 604

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (604)...(604)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es Arg.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 227

96

97

98

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 228

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 821

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 228

\vskip1.000000\baselineskip

99

100

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 229

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 868

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 229

101

102

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 230

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 613

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (613)...(613)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es Arg.

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 230

104

105

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 231

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 830

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 231

106

107

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 232

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 877

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 232

108

109

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 233

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 601

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (601)...(601)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es Arg.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 233

110

111

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 234

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 818

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 234

112

113

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 235

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 865

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 235

\vskip1.000000\baselineskip

115

116

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 236

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 610

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (610)...(610)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es Arg.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 236

117

118

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 237

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 827

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 237

119

120

121

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 238

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 874

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 238

\vskip1.000000\baselineskip

122

123

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 239

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 459

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 239

\vskip1.000000\baselineskip

124

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 240

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 638

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (638)...(638)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es Arg.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 240

125

126

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 241

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 855

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 241

\vskip1.000000\baselineskip

127

128

129

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 242

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 902

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 242

\vskip1.000000\baselineskip

130

131

132

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 243

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 647

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (647)...(647)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es Arg.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 243

\vskip1.000000\baselineskip

133

134

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 244

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 864

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 244

135

136

137

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 245

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 911

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 245

138

139

140

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 246

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 456

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 246

\vskip1.000000\baselineskip

141

142

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 247

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 635

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (635)...(635)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es Arg.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 247

143

144

145

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 248

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 852

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 248

146

147

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 249

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 899

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 249

148

149

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 250

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 644

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<221> VARIANTE

\vskip0.400000\baselineskip

<222> (644)...(644)

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Xaa es Arg.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 250

150

151

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 251

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 861

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 251

152

153

154

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 252

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 908

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 252

155

156

157

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 253

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 371

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 253

\vskip1.000000\baselineskip

158

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 254

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 133

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 254

159

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 255

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 381

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 255

160

161

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 256

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 155

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 256

\vskip1.000000\baselineskip

162

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 257

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 404

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 257

163

164

Claims (14)

1. Un polipéptido codificado por un gen ligando GGF/p185erbB2, en el que dicho péptido interacciona con un receptor p185erbB2, comprendiendo dicho polipéptido un dominio E codificado por la SEQ ID Nº: 163 o un dominio E que comprende la secuencia aminoacídica de SEQ ID Nº 210, y un dominio similar al factor de crecimiento epidérmico que comprende:

a)

una secuencia de ácidos nucleicos C (SEQ ID Nº 177) y bien una secuencia de ácidos nucleicos C/D (SEQ ID Nº 178) o una secuencia de ácidos nucleicos C/D' (SEQ ID Nº 143) en el orden 5' a 3' C-C/D o C-C/D';

b)

la secuencia aminoacídica de SEQ ID Nº 151, 152, 220, 221, 222, 223, 224, ó 225; o

c)

aminoácidos 362-411 de SEQ ID Nº 170.

2. El polipéptido de la reivindicación 1, en el que dicho polipéptido induce la mitogénesis de células gliales.

3. El polipéptido de la reivindicación 1, en el que dicho polipéptido induce la síntesis del receptor de acetilcolina en una célula.

4. El polipéptido de la reivindicación 1, en el que dicho polipéptido induce la mielinización de una célula neural por una célula glial.

5. El polipéptido de la reivindicación 1, en el que dicho polipéptido comprende la secuencia aminoacídica de SEQ ID Nº 170.

6. Una secuencia de ácidos nucleicos aislada que codifica el polipéptido de la reivindicación 1.

7. La secuencia de ácidos nucleicos de la reivindicación 6, en la que dicha secuencia de ácidos nucleicos comprende la SEQ ID Nº 21.

8. Un vector recombinante que comprende la molécula de ácidos nucleicos aislada de la reivindicación 6, operativamente unida a un promotor.

9. Una línea celular transformada o transfectada con la molécula de ácidos nucleicos aislada de la reivindicación 6.

10. Un método para producir el polipéptido de la reivindicación 1, que comprende proporcionar la línea celular de la reivindicación 9, cultivar dicha línea celular en condiciones que permitan la expresión de dicha secuencia de ácidos nucleicos, y aislar dicho polipéptido.

11. Un anticuerpo específico para un polipéptido según la reivindicación 1.

12. Un método de purificar un polipéptido con actividad mitogénica de células gliales, comprendiendo dicho método el poner en contacto un extracto celular con un anticuerpo según la reivindicación 11.

13. Un método para identificar la presencia de un receptor para el polipéptido de la reivindicación 1 en una muestra, que comprende poner en contacto dicha muestra con dicho polipéptido y determinar la unión entre ellos, en la que dicha unión es indicativa de la presencia de dicho receptor.

14. Una formulación farmacéutica o veterinaria que comprende un polipéptido según la reivindicación 1 formulada para uso farmacéutico o veterinario, respectivamente, junto con un diluyente, vehículo o excipiente aceptable y/o en una forma de dosificación unitaria.