JPH05509079A

JPH05509079A - ヒト癌遺伝子ｅｒｂＢ―２を過剰発現している細胞の増殖を阻害する増殖因子

Info

Publication number: JPH05509079A
Application number: JP3510228A
Authority: JP
Inventors: リップマン，マーク; ルプ，ルース
Original assignee: Georgetown University
Current assignee: Georgetown University
Priority date: 1990-05-25
Filing date: 1991-05-22
Publication date: 1993-12-16
Also published as: WO1991018921A1; EP0597845A4; AU7960591A; EP0597845A1; CA2083688A1; AU667026B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔発明の名称〕ヒト癌遺伝子ｅｒｂＢ−２を過剰発現している細胞の増殖を阻害する増殖因子［技術分野］本発明はヒト癌遺伝子ｅｒｂＢ−２と相互作用し、この癌遺伝子を過剰発現している細胞の増殖を阻害する増殖因子に関する。

〔背景技術〕・発癌は細胞の増殖制御に関与する遺伝子の変化の多段階過程と信じられている。

いろいろな癌原遺伝子および癌遺伝子が腫瘍細胞の活性化における制御因子として関係しているとされている。例えば、癌遺伝子性蛋白質キナーゼは不適当なまたは過剰な蛋白質リン酸化により細胞の形質転換を誘導し、悪性新生物の抑制されない増殖を生じると信じられている。Ｈｉｕｏｐ＊＋ｈｏｌｏｇ７．　Ｗ＋ｂｔ　Ｆ、ｕ　ｚｌ、ｉｓ。

７１７６　：１９８９１　を参照されたい。

癌原遺伝子の１つの群は細胞増殖因子またはそれらの受容体をコードしている。

ｃ−ｅｒｂＢ−１遺伝子は上皮増殖因子またはそれらの受容体をコードしている。

ｃ−ｓｉｓ遺伝子は血小板由来増殖因子のＢ鎖をコードしている。ｃ−ｆｍｓ遺伝子は顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子の受容体と同一または関連する分子をコードしている。ｎｅｕと称されている癌原遺伝子のこの群を構成する第４のものはエチルニトロソ尿素−誘発ラット神経芽細胞腫において同定された。

ＨＥＲ−２／ｎｅｕまたはｃ−ｅｒｂＢ−２と称されるｎｅｕのヒト対応物は配ＨＥＲ−２／ｎｅｕまたはｃ−ｅｒｂＢ−２癌遺伝子はｅｒｂＢ様癌遺様子遺伝子群ており、上皮増殖因子受容体（Ｅ　Ｇ　Ｆ　Ｒ）と関連しているが明らかに異なっている。この癌遺伝子は多くのヒト腺癌に関係していることが示されており、ｐ１８５蛋白生成物の発現レベルの上昇を導いている。例えば、この癌遺伝子は乳房、卵巣、胃および肺組織の腺腫て増殖されていることが観察されている。

さらに、ｃ−ｅｒｂＢ−２癌遺伝子の増幅が、そのような形の癌をわずらっている虫者の全生存時間および再発までの時間を予言するのに重要（最も重要ではないにしろ）であることが多くの場合観察されている。

乳房および卵巣の癌は女性におけるすべての癌の約３分の１を占めており、およびあわせて女性の癌関連死の約４分の１の原因となっている。重要なことには、Ｃ−ｅｒｂＢ−２癌遺伝子は、ヒトの主要な乳ガンの２５から３０％において増幅されていることがわかった。５ｃｉｅｎｃｅ、５ｌｕｏｎ、　Ｄ、ｅｔ　ｔｌ、２４４．　７０７−７ｆＨ１９ｇ９年５月１２日）を参照されたい。

ｃ−ｅｒｂＢ−２癌遺伝子は１８５ｋｄのトランスメンブラン糖蛋白質（ｐｔ８５　ｅ　ＩｂＢ−２）を発現することが知られている。発現された蛋白質はそのＥＧＦＲとの相同性から増殖因子受容体であると示唆されてきた。しかしながら、ＥＧＦまたはＴＧＦαのような既知のＥＧＦＲリガンドはｐ１８５″ｂＢ〜２に結合しない。現在のところこの蛋白質に結合するりガントに知られていない。

従って（ｐ　１８５　”ｂＢ’）のリガンドに対する要望は引き続いである。そのようなりガントは発癌を促進するｃ−ｅｒｂＢ２癌遺伝子の過剰発現の効果を中和するように使用されるであろう。

〔発明の開示〕

従って、本発明の目的はｅｒｂＢ−２癌遺伝子と直接的に相互作用する増殖因子を提供することである。

前述の増殖因子の単離および精製法を提供するのもまた本発明の目的である。

ヒト癌遺伝子ｅｒｂＢ−２を過剰発現している細胞の増殖を阻害する方法を提供することもまた本発明の１つの目的である。

前記の目的およびその他の目的は３０ｋＤｘＴＧＦα様糖蛋白賀により達成される。

〔図の簡単な説明〕

図１は本発明の３０ｋｄ増殖因子の単離を示している。Ａ部分は低親和性ヘパリンクロマトグラフィーを使用した結果を示しており、一方Ｂ部分は逆相クロマトグラフィーを使用した結果を示している。

図２は５Ｋ−Ｂｒ−３細胞中のリン酸化された蛋白質の検出を示している。

図３はＭＤＡ−４５３細胞におけるリン酸化された蛋白質の検出を示している。

図４は無傷のＣＨＯ／’ＤＨＦＲおよびＣＨＯ／”ｅｒｂＢ　２細抱中の１８５ｅ　Ｌ　ｂ　”−２Ｈ白質のリン酸化を示している。

図５は５Ｋ−Ｂｒ−３細胞におけるｐｔ　ｓ　５　ＬＴｂＢ−２受容体競合アッセイを示している。

図６はｇｐ３０によるｐｌｓ　ｓ　ｅ　Ｉ　ｂ　Ｂ　２と４Ｄ５抗体との架橋形成の阻害を示している。

〔発明を実施するための最良の形態〕

ヒトｃ−ｅｒｂＢ−２癌遺伝子は蛋白質キナーゼ活性を持つ１８５ｋｄトランスメンブラン糖蛋白質をコードしている。ｐ１８５ｅ！ｂＢ−２として知られているこの糖蛋白質はｐ１７０上皮増殖因子受容体（Ｅ　Ｇ　Ｆ’　Ｒ）と多（の構造類似性を示し、それ故増殖因子受容体と考えられている。しかしながらＥＧＦＲの適音リガンドであるＥＧＦまたはＴＧＦαの両方とも　１　ｓ　ｓ　ｅｒｂＢ−２とは直接的には相互作用しない。実際、この糖蛋白質に対するリガンドは記載されていない、ｅｒｂＢ−２癌遺伝子は多（の腺腫て増幅されており、ヒト乳癌患者のほとんど３０％で過剰発現されているので、この１８５ｋｄ糖蛋白質に対するリガンドを発見することは非常に望ましいことであろう。さらに、癌遺伝子により形質転換された細胞の悪性表現型の維持にｐｌｓ　ｓ　ｅｒ　ｂ　Ｂ　−２が必要であることが知られている。

本発明に従うと、驚くことにニストロジエン受容体陰性細胞株ＭＤＡ−２３１から分泌される３０ｋｄ増殖因子がｐｌｓ　５ｅＴｂＢ−２糖蛋白質のりガントとして有効であることが発見された。本発明の３０ｋｄ糖蛋白質はまたＴＧＦａ様活性も示した。例えば、本発明の３０ｋｄ糖蛋白質はＥＧＦＨに結合し、ＥＧＦＲをリン酸化でき、並びにＮＲＫコロニー形成を誘導する。翻訳された蛋白質のペプチドマツピングにより示されるように本発明の３０ｋｄ増殖因子はＴＧＦα の通富の前駆体または成熟ＴＧＦαとは明らかに異なるため、このことは非常に驚かされることである。

一般的には、３０ｋｄ糖蛋白質は抗−ＴＧＦαポリクローナル抗体で免疫沈降され、ＥＧＦ放射性受容体アンセイおよびＮＲＫおよびＡｌＮ４Ｔ細胞コロニー形成アツセイで検定されるようなＴＧＦａ様生物古生物活性た。３０ｋｄ増殖因子はまた成！！％６ｋｄ　ＴＧＦαよりも有効にＥＧＦ受容体の自己リン酸化を促進させた。

ＥＧＦおよびＴＧＦαと異なり３０ｊｃ塘蛋白質はヘパリン−セフ７０−スに結合することが観察され、ヘパリンアフィニティークロマトグラフィーおよび続いての逆相クロマトグラフィーにより明らかに均質なまでに精製された。

イン　ビボでのツニカマインン処理またはイン　ビトａでのＮ−グリコナーゼ脱グリコノル化は成、ＩＩＩＩＴＧＦαの１８ｋａ前駆体と対照的な２２ｋｌｌの前駆体を明らかにした。さらに、イン　ビトロでのＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞からの全ｍＲＮＡの翻訳によりこれらの観察が確認された。３０ｋａ　ＴＧＦα様蛋白賀の生化学的特徴付けは脱グリコジル化ポリペプチドおよび翻訳生成物のＶ８−プロテアーゼ消化により得られた。ｖ８−消化免疫沈降物質のペプチドマツピングはＴＧＦαと異なったアミノ酸配列を示唆した。このため、３０ｋｄポリペプチド（ＥＧＦ／′ＴＧＦａ群に関連してはいるが）は異なった遺伝子によりコードされており、成熟ＴＧＦαの翻訳後修飾物ではない。

本発明の３０ｋｄ糖蛋白賀を得ると、本発明の別の観点に従い、それはＣ−ｅｒｂＢ−２癌遺伝子を過剰発現している細胞の増殖の阻害に使用される。

本発明に従うと、本発明の３０？ｌＩ！蛋白質はそれ自身でまたは他の医薬物質と一緒にｃ−ｅｒｂＢ−２癌遺伝子を過剰発現している任意の細胞の増殖の阻害に使用できるであろう。

一般的には本発明の３０ｋｄ糖蛋白質は腺腫細胞、好適にはｅｒｂＢ−２癌遺伝子およびＥＧＦＲを過剰発現している乳房、卵巣、胃および肺組織の腺腫細胞の増殖の阻害に都合よく使用されるであろう。

本発明をさらに例示するため、いくつかの実施例が参照されるが、それらは単に例示のために与えられるものであり制限的であることを意図するものではない。

３０ｉｄ糖蛋白質を得るための材料および方法細胞系以下の細胞源が使用された　ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＮＨＫクローン４９Ｆ線維芽細胞はアメリカンタイプ力ルチャーコレクンヨンｆＲｏｃｋｖｉｌｌ＋、　ＶＤ）から得られた。Ｈ３５７８Ｔ細胞、Ａ４３１ｍ＋胞、およびＨ８細胞、ＴＧＦα−トランスフェクトＭＣＦ−７乳癌細胞株は種々の供給源から要請により入手可能であった。発癌物質−不死化正常哺乳器官上皮細胞亜株１８４ＡＩＮ４およびその５Ｖ−４０−１−ランスフエクト透導体１８４　Ａ　Ｉ　Ｎ　４　Ｔもまた要請により入手可能であった。ラット−ＦｅＳｒＶトランスフェクト細胞もまた要請により提供された。すべての細胞株は１０％ウノ拾児血ｒＩＩ（Ｆ　Ｂ　Ｓ、　Ｇｉｂｃｏｌを補給した改良された修正イーグル培地（ｒＭＥＭ、　Ｇｉｂｃｏ、　Ｇ＋ｓｎｄ　ｌ＋１ｚｏａ！ＩＹ）中で増殖させた。

条件付は培地の調製、採取および濃度条件付は培地の採取はよく知られた方法を用いて実施された。培地はアミコン限外濾過セル（ＹＫ５メンプラン）１′＾ｍ１ｃｏｎ　Ｄｔａｖｅｎ、　ｌｌＡｌ中で１００倍に濃縮された。清澄化し、濃縮されたら、培地は一２０℃で貯蔵され、連続的な採取が続いての日々に行われた。濃縮培地はスペクトラフォア３チユービング（Ｓｐｅｅｔ！１ｔ１１ｅｄｉｃｘｌ　Ｉｎｄｕ＋Ｈｉｅ＋、Ｌｏｔ　Ａｎｇｅｎｌｕ、ＣＡ）を用い１００容量の０，１Ｍ酢酸に対し４℃にて２日間透析された。透析中に沈殿してくる物質は４℃にて４．　０００ＴｐＨで３０分間遠心分離して除去した。プロテアーゼ阻害剤が添加された。清澄化試料は次に凍結乾燥された。

代謝標識および免疫沈降細胞はＩＭＥＭ中８０％コンフルエントにまで増殖させた。細胞単層をＰＢＳで３回洗浄し、メチオニンおよびシスティンを欠きグルタミン（２，９ｇ／４）を補給した無血清ＩＭＥＭｆＢｉｏｆｌｕｉｄ＋、Ｒｏｅｋｖｉｌｌｅ１ＭＤｊ中で２時間インキュベートした。この培地は続いて除去し、２．　５ｍＣ１／ｍｌ　Ｃ”Ｓ〕　システィンおよびメチオニン（＾ｍｅｎｔｕｍ、＾ｒｉｌｉＨｔｏｎ　ｆｌｅｉｇ？＋、ＩＬ、１Ｉ７５ｃｉ／ミリモル）を代わりに含むメチオニンおよびシスティンを欠く無血清ＩＭＥＭに置き換えた。この培地は総計で２．５ｍｌが５ｃ１１の皿に対して使用された。３７℃で１６時間後培養物から培地を採取し、遠心分離により清澄化した。細胞は１［ＰＢＳで洗浄し、こすりとって採取し、１ｍｌのＲ［’Ａ緩衝！（３００ｍＭ　ＮａＣ７１１００ｍｌｌトリス−ＨＣｌ、２％トリトン×１００．２％デオキシコール酸Ｎａ、０．２％５ＤＳ１Ｑ、４％ＢＳＡおよび２ｍＭ　ＰＭＳＦ含有）中で溶解させた。氷上で３０分間インキュベーション後、溶解物は遠心分離により清澄化しく４．ＯＯＯ＋ｐｍで３０分間）、直ぐ使用するかまたは一７０℃で貯蔵した。異なった細胞株により条件付は培地中に放出されたＣ３５Ｓ’］　−標識蛋白質は４５％硫酸アンモニウム沈殿により部分精製された１０ｇの（特異的または非特異的）抗体で免疫沈降された。

免疫沈降物を可溶化後１５％５ＤＳ−ＰＡＧＥおよび続いてのフルオログラフィーにより分析された。前もって染色された分子量マーカー（Ｂｉｏ＋ｉｄ、Ｒｉｃｈｍｏｎａ。

Ｃ＾）が平行するレーンで実験された。

ツニカマイシン処理ツニカマイシン（Ｓｉｇｍｔ　Ｓｔ、　Ｌｏｕｉ＋、　ｖｏｌを５０ｍＭの炭酸ナトリウム（ｐＨ１０，０）に溶解し、０．２２ｍフィルターで濾過滅菌した。

代謝標識に先立って４時間、２０ｇ／ｍｌツニカマインン（特に指示しない限り）の存在下ＩＭＥＭ中でＭＤＡ−ＭＢ−２３１，ＭＣＦ−７およびＨｓ５７８Ｔ細胞のコンフルエント単層を増殖させた。代謝標識はツニカマイシン処理を続けながら、前記のように実施された。

エラスターゼ処理ＴＧＦα一様活性を含む試料は５０ｍＭグリシルグリシン（ｐＨ７，９）中に溶解した２０ｇのブタ膵臓エラスターゼ（Ｓｉｇ鵬１）と２２℃にて１時間インキュベートした。試料は次に免疫沈降および５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析にかけた。

供された大腸菌で合成された４００ｇの組換えＴＧＦαで０日目にウサギに免疫化することにより得られた。免疫原は最初にキーホールカサガイヘモンアニン（Ｋ　Ｌ　Ｈ）と複合させ完全フロインドアジュバント中で乳化させ、多数の部位に皮内に注射した。追加の注射は以下のように与えられた二６０日日、１７５ｇＴＧＦαおよび９０，１５０．１８０および２１０日目ζ１００ｇＴＧＦα。補助注射は不完全フロインドアジュバントで、多数の部位に皮下で行われた。各々の注射に続いての１０から１４日後ＥＬｒＳＡによりウサギ血清の抗体力価を検定した。Ｒ３９９と称される１８０日目日日められた抗血清は免疫沈降およびラジオイムノアッセイに使用された。

モノクローナル抗体：組換えＴＧＦαに対するモノクローナル抗体は親切にもＧｅｎＮｅｃｈ　Ｃ０ＴＰより提供された。

ＥＬ［ＳＡによる抗ＴＧＦＵ抗体（Ｒ３９９）の測定マイクロ−Ｅ１ｉｓａプレート（Ｄ７ｎｔｌｕｈ−１ｍｍｕａｏｌｏｎ　Ｉｆ、Ｄ７ｎｘｔｅｅｈＬ＋ｂｏ：＋ｔｏ＋ｉｏ、ＩｎＣ，Ｃｈｘｎ＋１ｌ１７　ＶＡ、）を５０ｍＭの炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９，６）に溶解した５００ＩＩｇ／′ｍｌの組換えＴＧＦα で４℃にて１６時間被覆した。検定されるべき試料（抗体）は０．１５Ｍ　ＮａＣｊ、０．０５ＭｈリスーＨＣｌ　（ｐＨ７，４）　、２ｍＭ　ＥＤＴＡ、５■ ／ｍｌウン血清アルブミン、０．０５％トウイーン２０　（ＴＢＳ−ＢＳＡ−トウィーン）で１・ｔ、ｏｏｏ〜１・６４．０００に連続的に希釈し、ウェル中で３７℃にて２時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ−トウイーンで５回洗浄し、次にＴＢＳ−ＢＳＡ−トゥイーンに溶解した西洋ワサビベルオキシダーゼー複合ヤギ抗ウサギ免疫グロブリンと３７℃にて１時間インキュベートした。プレートを次にＰＢＳ−１−ウィーンで５回洗浄し、ウェル当り１００１のＯ，１Ｍリン酸−クエン酸緩衝液（ｐＨ５，０）に溶解した０、１■／＋ａｌの０−フェニレンジアミン、０．０１２％Ｈ２Ｏ２と２２℃にて４時間インキュベートした。５（ｌｉ／ｗｅｌｌの２．５ＮＨ２Ｓ０４の添加により反応を停止させ、ＵＲ７００マイクロプレートリーダーｆＤｙｎｚｌｅＣｈ　Ｌｚｂ、、Ｉｎｃ、Ｃｈｚａｌｉｌｌｙ、ＶＡ、）を用いて４９２ｕｍで吸光度を測定した。

ナル抗−ラットＴＧＦαおよびラット（１２５１）ＴＧＦαを含むＲＩＡキットｊＢｉｏｌｏｐｅ、Ｉｎｃ、Ｓ１１目１ｅ、Ｗ＾）を用いて決定された。この抗体はヒトＥＧＦと交差反応しない。条件付は培地の一部を４０−のジチオスレイトールで還元し、沸煮水浴中に１分間浸すことにより変性させた。製造元のプロトコールに従ってアッセイは二重に行われ、条件付は培地を集めたものは各々少くとも２回検定された。

固相ＲＩＡ、９６ウエルマイクロタイタープレートは抗ＴＧＦα（Ｒ３９９またはモノクローナル抗体）により３７℃にて２時間被覆された。ウェルは次にＴＧＦα活性が検定されるカラム分画の１００１で満たされた。０．０７５から１５ｄｇの非標識ＴＧＦαを用いて標準曲線を作製した。２時間のインキュベーション後５　Ｘ　Ｌ　Ｏｃｐｓの（１２５１〕ＴＧＦａまたは２Ｘ１０５ｃｐｍの代謝的に標識された抗原を各ウェルに添加した。プレートはさらに４℃にて１６時間インキュベートされた。ウェルを洗浄し、ガンマカウンター（モデル８５００２．　ＰｉｃｋｕｄＩｎ＋ｔ：ａｍｅｎ＋＋　Ｃｏ、、Ｓｔｅｒｌｉｎｇ、ＶＡＩを用いて計数した。ＥＧＦ　ＲＩＡは抗ＥＧＦ抗体（Ｏｎｅｏｇ！ｎｔ　５ｃｉｅｎＣｅクローン１４４−８．　！ｂｎｈｚｏｔｌ、ＮＹ）　で実施した。ヒトＥＧＦ（ＨＥＧＦ、レセプターグレード、　Ｃｏ１１ｒｂｏ＋ｕｉｖｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、７ｇｌ＋ｈｕ、　＋４＾）を用いて標準曲線が作製された。

Ｎ−グリコナーゼ消化精製３０ｋＤｘＴＧＦα様蛋白質はＮ−グリコナーゼによる消化にかけられた。

１１００ｎと等量の試料を５０１の０．２Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ８，６）、１．２５％ＮＰ４０とインキユベートシ、続いて各々の試料に２〜６ｇのＮ−グリコナーゼ’、Ｇｅｎ＋７＋ｕ　Ｃａｍｐ、、　Ｂｏｔ＋ｏｎ、　１１Ａ）を添加し、３７℃にて１６時間インキュベートした。５０１の３＠に濃縮した充填用緩衝液を電気泳動分析の前に加え、前に概説したように実施した。ゲルは銀染色された。

ＥＧＦ放射受容体アッセイＡ４３１腹はＫｉｍｂａ　Ｉ　ｌおよびＷａｒｎｅｒの方法に従って調製された。

Ａ４３１細胞を窒素下で破壊し、低速遠心分離により核および細胞小器官をペレット化した。３５．０００＋ｐΦで１時間遠心分離することにより膜をペレット化し、２０ｍＭ　ＨＥＰＥＳＩＩ！衡液（ｐＨ７，４）に再懸濁した。膜（２，５ｇ／ｍｌ）を９６ウエルプレートに置き、使用前に３７℃にて一夜乾燥させた。標準結合競合試験はＣ１２５ＩＩ　ＥＧＦ　（ＩｃＮ、　Ｃｏａｘ　Ｍｅｎ、Ｃｓ１ｉ１ｏ＋ｎｉｘ、比活性１００ｃｉ／ｇ、約５０．０００　ＣＰＭ／ウェル）を用いて実施された。標準曲線は０．０７５〜１０ｎＨの非標識ｈＥＧＦ　（受容体用、Ｃｏ１１ｚｂｏ＋ａ＋ｉｗｅ　Ｒｕｅｕｃｈ）で作製された。分析されるべき異なった分画は凍結乾燥され、ＰＢＳ中で再構成された（０．　！Ｍ１５０Ｃ１＋１条件付は培地）。結合緩衝液（５０ｄ　ＨＥＰＥＳおよび０．１％ＢＳＡを含むＩＭＥＭ、［）Ｒ７，７）中、標識ＥＧＦおよび１０７の試料を３７℃にて２時間インキュベートした後、ウェルを洗浄し、プレートから切り出して計数した。ＥＧＦ競合活性はｌ’１ｅｖｌｅ口Ｐｘｃｋｘｒｄ　ＲＩＡプログラムを用いて計算された。

足場非依存性増殖アッセイ軟寒天クローニングアッセイが０．　６％Ｂａｃｔｏ−寒天（Ｄｉｆｃｏ、　ＤｅｔｒｏＨ。

Ｍｌ）、１０％ＦＢＳおよび２１ＩＩＩグルタミンを含むｒＭＥＭの底面層１ｍｌを用いて３５閣組織培養血中で実施された。試験試料、０．３６０６寒天、１０℃％ＦＢＳおよび３Ｘ１０４ＮＲＫ細胞を含むＩＭＥＭの０．８ｍｌの上面層を底面層が固化した後に加えた。すべての試料は播種前に０．２２ｒｎ　Ｍｉｌｌｅｘ　ＣＵミリポアフィルタ−を用いて濾過滅菌された。プレートを３７℃にて加湿および５％ＢａｕｓｃｈおよびＬｏｍｂ　Ｓｔｅｍセルコロニーカウンター（Ａｔｌｅｘ　５ｔＩｔｌｔ’５Ｃｏｒｐ、Ｆｕｍｉｎｇｄｚｌｅ、ＮＹＩで計数した。

足場依存性増殖アッセイ細胞を５％ＦＣ８を含むＩＭＥＭで増殖させた。コンフルエントになったら細胞をトルブシンーバーセネート液（Ｂｉｏｌｌｏｉｄ＋、　Ｒｏｃｋマ酉Ｉｅ、　ＭＤＩを用いて引離し、１：２０から１：５０に希釈した。細胞の型に依存するが４．０００〜１０．０００細胞／ウエルで１２ウエルプレートに細胞を播種した（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１，８，０００細胞／ウエル、無血清ＩＭＥＭ中）。２４時間後に培地を交換し、細胞をＥＧＦで処理し、トリプシンーバーセネート液を用いて１゜２および４日目にＴＧＦαまたはＴＧＦα様蛋白質を採取した。細胞はコールタ−カウンターを用いて計数された。

ヘパリンアフィニティークロマトグラフィーＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞で条件付けされた培地を４℃にて２．０００＋ｐ１１で２０分間遠心分離して清澄化させた。上澄液を集め、−７０℃で貯蔵した。ヘパリン−セファ０−ス（Ｐｈｉｒｍｉｃｉｓ、Ｐｉ＠ｅ畠１ｔｖｓ７．　ＮＪ）をＰＢＳで膨潤させた後、２ｍｌのゲルをＥｃｏｎｏカラムｆＢｉｏｎｄ、　ＲｉｃｈｍｏＩｌｄ、　ＣＡＩに入れ、約１００ベツト容量のＰＢＳで洗浄した。条件付は培地はビーズを重力のみで通過した（流速２０から５０ｍ１／ｈ＋）。ゲルは次に５容量のＰＢＳで洗浄し、１１０ｆｆ１トリス−ＨＣｌｐＨ７，０、中のＮａＣ１の濃度勾配を段階的に増加させて溶出した（溶出緩衝液）　、　０．　４Ｍ、１．　１Ｍ、２．　０Ｍおよび３．０Ｍ　ＮａＣｊの段階的濃度勾配を溶出緩衝液に使用し、各々の段階は２８０ｕの吸収がベースラインに戻るまで溶出させた（通常３から５カラムベツト容量）。溶出液はＧ−２５カラム（Ｐｈｕｍｔｃｉｔ　ＰｉｓｃｚｌｚｖＢ、Ｍｌ）上で脱塩し、異なったノくイオアツセイに使用する前に濾過滅菌した。

活性物質を含むプールされた分画もまたＨＰＬＣおよびＦＰＬＣを行う前にＦＤ１０カラム：Ｐｈ＆＋ｕｃ＋ｔ　Ｐｉｔｃｔｕｖｓ７．　！ｉ月で脱塩された。

分子濾過りａマドグラフィー凍結乾燥された条件付は培地を約２５■７′＠ｌ総蛋白質の最終濃度になるように１Ｍ酢酸に溶解した。不溶性物質は１０．ＯＯＯＩｐｍで１５分間遠心分離することにより除去された。試料を次にセファデックスＧ−４００カラム’ＸＫ１６゜Ｐｈｕｍｏｉｓ、ＰｉＩｃ！ｔｚｎｙ、Ｎｌ）に充填し、平衡化し、４℃にて最大流量３０ｍ１／ｌｕで１Ｍ酢酸で溶出させた。４ｍｌの１００倍濃縮培地からＩＱＯａｇの蛋白質が得られた。３ｉ１の溶出液を含む分画が凍結乾燥され、アッセイおよびさらなる精製のための材料源にするため３００１のＰＢＳに再懸濁させた。

逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰ　Ｌ　Ｃ）急なアセトニトリル濃度勾配、急なアセトニトリル濃度勾配および他のすべてのＨＰＬＣ工程はＣ３−逆相カラムを０．０５％ＴＦＡ　（トリフルオロ酢酸）の水溶液（ＨＰ　Ｌ　Ｃ用）で平衡化した後室温で実施した。試料を充填し、１ｍ１Ｚ分のｆＬ速で直線的濃度勾配で３０分間溶出させた（００５％ＴＦＡ中Ｏ〜４５％アセトニトリル）。吸光度は２８０ｎｍでモニターした。１ｍｌずつ分画を集めＥＧＦ受容体−競合活性を分析する前に凍結乾燥させた。

緩和なアセトニトリル濃度勾配、前記のＨＰＬＣ工程からの活性分画のプールを同一のカラムで再りσマドグラフィーを行った。５分間で０．０５％ＴＦＡ中０〜１８％のアセトニトリル濃度勾配、続いて３０分間で０．０５％ＴＦＡ中直線的１８〜４５％アセトニトリルの濃度勾配で溶出を行った。流速はＬ　Ｏｎｌ／分であり、１ｍｌずつの分画を集めた。ヒトＴＧＦα様因子は３０〜３２％のアセトニトリル濃度にて、ＲＲＡで検出可能な単一ピークとして溶出された。

ゲルからの放射性標識蛋白質の電気泳動溶出５ＤＳ−ＰＡＧＥのフルオログラフィー後、問題とするバンドを削り出し、１２０ボルトで１６時間以上かけて透析チューブ内へ蛋白質を溶出した。透析袋の内容物は４℃に冷却し、次に２０％の最終濃度までトリフルオロ酢酸を加えて沈殿させた。沈殿は遠心分離によりペレット化しエチルエーテルで２度洗浄し、充填緩衝液に再懸濁した。

精製溶出蛋白質の消化法電気的に溶出した蛋白質は０．１２５Ｍトリス−ＨＣｌ　（ｐＨ６，８）、０、　５％ＳＤＳ、１０％グリセロールおよび０．００１％ブロモフェノールブルーを含む充填緩衝液巾約０，５■／′１１で溶解させた。試料は次に１００℃に５分間加熱した。蛋白質分解消化は、常法に従って２５ｇ／ｍｌの最終濃度になるようにスタフィロコッカスアウレウスｆｓｔｚｐｈ７１ｏｃｏｃｃ＋ｕ　ｚｕｅｕ）プロテアーゼｖ８ｆｓｉｇｍｔ　Ｓｔ、　Ｌｏ口目、　ＭＯ＋を加え、３７ ℃にて３０分間実施した。ｐ−メルカプトエタノールおよびＳＤＳを各々２０％および２％の最終濃度となるように続いて添加した。蛋白分解は２分間煮沸することにより停止させた。試料は次にＣ１８逆相ＨＰＬＣカラムへ注入した。

ＥＧＦ受容体のリン酸化サブコンフルエントのＡ４３１！！！胞をＴＭＥＭ中１０〜１２時間培養した。

細胞を１０〜３０％Ｍ　ＴＧＦａ、ＥＧＦまたはＴＧＦａ様増殖因子で３７℃にて３０分間処理した。２０ＩＩＭトリスーＨＣｌ　（＋）Ｈ７，４）　、１５０ｍＭ　ＮａＣ！’。

１％ＮＰ４０．１ｍ１ｌ　ＥＤＴＡ、２ａＭ　ＰＭＳＦ、４２ｍＭロイペプチンで細胞を溶解させ、ＥＧＦ受容体に対して向かうモノクローナル抗体２２５（ＯＩＩＣｏｇｅｌ１２Ｓｃｉｅｎｃｅ、　１１ｔｎｂｓ＋＋ｅｔ、　ＮＹ）を用いて前記のように免疫沈降された。免疫沈降物はＲＩＰＡＩＩｆｒ液で３回洗浄し、４０１のＴＮＥ　（０，０１Ｍトリス−ＨＣｌ。

ｐＨ７，５、Ｑ、１５Ｍ　ＮａＣｌ、１ｍ１ｌ　ＥＤＴＡ）に再懸濁した。５Ｃｉの〔γ−３２Ｐ）ＡＴＰを免疫沈降物へ加え、全ＡＴＰ濃度（最終）を６０１の容量中１５＋＋ｉｌに調整した。反応混合物は２０１の３×試料緩衝液の添加の前に５分間氷上でインキュベートした。試料は５分間沸蕉させ、変性７．５％５ＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。

ＲＮＡ抽出グアニジンイソチオンアネート中で均質化し、続いて塩化セシウムクツンツン上で遠心分離することにより細胞から全細胞ＲＮＡが抽出された。全細胞ＲＮＡを１０１１Ｍトリス−０，５Ｍ　ＮａＣｊ　ｐＨ８，０で平衡化させたオリゴ（Ｄ　Ｔ）セルロースカラム（ＰｈｕｍｘｃｉＲ，Ｐｉｔｃｓ＋ｓｖ＊７．　ＮＪＩ　を通過させ、１０ｍＭｔ−リスでポリ（Ａ）　ｍ　ＲＮ　Ａを溶出させた。エタノール（６０％容量／容量）および０．１Ｍ酢酸で沈殿化後、全およびポリ（Ａ）　選択ＲＮＡの両方とも１０ｄトリス−１ｚＭ　ＥＤＴ、へ′ａ衛液に再懸濁し、１％アガロース、６％ホルムアミドゲルで分離した。電気泳動は５１１Ｍ　ＮａＡｃ、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、２０ｍＭ　３−〔Ｎ−モルホリノ〕プロパンスルホン酸ｐ　Ｈ７，０４ＭＯＰＳ−５ｉｇ＋ｅｚｉ中、１４〜１６時間にわたり２０ボルトで実施された。ゲルはＲＮＡの質および量の検査を可能にするため２、Ｏｇ／′ｌ１ｌＪのエチジウムプロミドで染色された。ヱ乞　旦上三翻訳７ノセイがＷｅａｔ　Ｇｅｒｍキットを用い製造元の手引に従って実施されたチオニンおよびｃ３５ｓ＞　システィンで代謝的に標識した。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＴＧＦａ−トランスフェクトＭＣＦ−７（Ｈ８）およびＨ５５７８Ｔｗｉ胞カラノ代謝的に標識された条件付は培地は固相ＲＩＡにより組換え６ｋｄ　ＴＧＦａに対して高められたポリクローナル抗体（Ｒ３９９）およびモノクローナル抗体で免疫反応性を試験した。ＭＤＧＡ−ＭＢ−２３１細胞からの代：ｌＩＩ標識ＴＧＦａ様物質はポリクローナル抗体のみと反応した。対照的にＨ８細胞からの代謝標識物質は２つの抗体と交差反応し、免疫前血清（正常ウサギ血清Ｎ　ＲＳ　）またはＨｓ５７８Ｔ乳癌肉腫細胞からの代謝標識物質付は培地（ＴＧＦａＭＲＮＡを産生しない）とは何の免疫反応も起こさなかった（図１）。それ故モノクローナル抗体のみが異なったＴＧＦα橿間の区別をすることが可能である。アッセイの特異性は非標ｍＭｉ換えＴＧＦａを用いる競合ｔＡにより示された。

ＭＤＧ−ＭＢ−２３１、Ｈ８およびラット−ＦｅＳｒＶ細胞からの標識物質は抗 −ＴＧＦαポリクローナル抗体で免疫沈降された。約３０ｋＤｒの大きさの免疫反応性種の検出はＭＤＡ−ＭＢ〜２３１４ｔｌｌ胞中での高分子量ＴＧＦａ様ポリペプチドの分泌を立証した。古典的ＴＧＦαを過剰発現するＨ８１［１胞からは６　ｋＤａ生峻物が得られた。古典的８ｋＤｘの予りされる１８ｋＤ＊前駆体は、“正常°前駆体を分泌することが知られているラント−ＦｅＳｒＶから沈降された。過剰の非標識ＴＧＦαの存在下で免疫沈降が実施された場合バンドの強度が弱（なった。免疫前ウサギ血清によっては何の特異的バンドも免疫沈降しなかった。

より大きなＴＧＦａ様化学橿はグリコジル化されているより大きなＴＧＦα化字種の大きさにおける明らかな不均一性、およびＡｓｎ２５におけるＴＧＦα前駆体のＮ−結合グリコジル化の可能性から、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞から分泌される高分子量ＴＧＦａ様ポリペプチドがＴＧＦａのグリコジル化形であるかどうかを考えなくてはならない。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞がツニカマイノンとインキュベートされ（同時翻訳Ｎ−結合グリコシル化の阻害剤）、培地が抗ＴＧＦα ポリクローナル抗体で免疫沈降された場合、２２ｋＤｓの化学種に前に観察された３ＱｋＤｘ種が置き換えられた。エラスターゼによる２２ｋＤＪポリペプチドのさらなる切断によりラット−ＦｅＳｒＶ標識培地中に観察された成熟６ｋＤＩＴＧＦαと異なった明らかな１ｌｋＤｔ生成物が得られた。

１１ｋＤｘ生成物は３ＱｋＤｘおよび２２ｋＤＩポリペプチドよりＲ３９９抗体に対してより高い免疫反応性を持っていた。より短いゲルの暴露は１ｌｋＤｓ分子量の近くに明瞭な沈降バンドを示した。ＲＩＡおよびＥＧＦ受容体結合アッセイの両方で決定されるように、ツニカマインン処理は分泌されたＴＧＦα活性のレベルには著しくは影響しなかった。

３０ｋＤｘポリペプチドがＮ−グリコジル化で処理された場合、銀染色により２２ｋＤ＊生成物が検出された。０−グリコナーゼ処理後に精製３０ｋ［ｌｔポリペプチドが切断されないことは０−グリコジル化がこの系では起こっていないことを示唆している。

ＴＧＦａ様ポリペプチドの精製ＴＧＦａ様物質はＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の無血清条件性は培地から単離された。ＴＧＦａ様ポリペプチドのレベルは３つの独立したアッセイにより定量された：軟寒天中ＮＲＫ線維芽細胞の足場非依存性増殖を促進する能力、Ａ４３１ヒト癌腫細胞膜上でのＥＧＦ受容体結合に対しての（”Ｊ）ＥＧＦとの競合能力、および成熟ＴＧＦαに対して高まったポリクローナル抗体に対する交差反応性。

ＥＧＦ受容体結合活性およびＴＧＦα免疫反応性はＢｉｏｔｏｐｓにより提供されるＲＩＡキットを用いて検出された。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１由来ＴＧＦａ様蛋白質の大よその分子量を決定するために、５ｍｌの１００倍濃縮透析条件付イナ培地に対しセファデックスＧ−４００を用いるゲル濾過クロマトグラフィーを行った。１．０Ｍ酢酸で溶出を行い、分画は蛋白質含量で確認した。ＴＧＦα様活性はカラムから単一の幅広いピークとして溶出された。最大の活性は明らかに３ＱｋＤｘの分子量で観察され、べｙｈ容量中に存在する夾雑蛋白質の大部分から分離された。ＴＧＦα免疫反応性を示すすべての分画はまたＥＧＦ受容体結合活性も含んでいた。しかしながら、これらの分画に存在する受容体結合活性および免疫反応性の相対量は異なっているようである。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞からのＴＧＦａ様ポリペプチドのさらなる分析はヘパリン−セファ０−スアフイニテイークロマトグラフイーを用いて実施された。ヘパリン−セファ０−スアフイニテイークロマトグラフイーはＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞からの非濃縮条件材は培地に対して実行された。すべての実験において、カラムへ負荷したＴＧＦα活性の２０％未満が非吸着分画に回収された。０．４〜０．５Ｍ　Ｎａ（Ｊ濃度でのヘパリン−セファ０−スクロマトグラフイーによりＥＧＦ受容体結合活性の鋭いピークが溶出された。この活性は１つの主たる３ＱｋＤｘの分子量の蛋白質により示され、負荷した活性の７０〜８０％を保持していた。

ＴＧＦａ様ポリペプチドは２工程の逆相クロマトグラフィー（ＨＰ　Ｌ　Ｃ）によりさらに精製された。ヘパリン−セファロースクロマトグラフィーからのＥＧＦ受容体−競合活性を含む分画のプールを０．０５％ＴＦＡ水溶液とし、Ｂｏｎｄａｐａｋ　Ｃ３カラムでクロマトグラフィーを行った。この工程では急なアセトニトリル濃度勾配（０〜１００％）が使用された。ＴＧＦａ様ポリペプチドは３０％アセトニトリルで鋭いピークとして溶出し、夾雑している大部分の蛋白質から分離された。ＥＧＦ受容体結合に競合するおよび軟寒天中でＮＨＫ細胞の増殖を促進する個々の分画の能力が決定された。活性分画（横棒で示されている）を集めたものは同じカラムで再びクロマトグラフィーを行う。５分間０．０５％ＴＦＡ中Ｏ〜２０％のアセトニトリル濃度勾配で溶出し、続いて直線状２０〜４０％のアセトニトリル濃度勾配で分画を溶出した。ＴＧＦａ様ポリペプチド活性は２５〜３０９６のアセトニトリルで溶出され、他の夾雑蛋白質から効果的に分離された。

銀染色により検出された不純物（データは示されていない）からのＴＧＦａ様ポリペプチドの完全な分離を達成するために酸性条件下でのサイズ排除クロマトグラフィーを使用した。ＥＧＦ受容体競合活性を示す分画を集め、５Ｏ３−ＰＡＧＥにより分析した。銀染色後車−のポリペプチドバンドが観察された。

ＴＧＦａ様ポリペプチドの分離および精製を導く工程のまとめが表１に示されている。活性の回収率は２７％であり、約５．４００倍の精製が達成された。

ＴＧＦα嘩物質の生物学的特徴付け３０ｉＤｚＴＧＦａ様蛋白質のＥＧＦ受容体結合活性がＥＧＦのその活性と放射性受容体アンセイにおいて比較された。両方の増殖因子ともＡ４３１膜上の受容体部位に対して（１２ＪＩ　ＥＧＦと競合した。精製ＴＧＦａ様ポリペプチドの特異的ＥＧＦ競合活性は１−１　５Ｘ１０６単位／■であることが観察された：ＥＧＦ結合を５０％阻害するにはＬ　ｌｎｇのＴＧＦα様ポリペプチドが必要とされた。ＴＧＦａ様ポリペプチドはＥＧＦ受容体結合においてＥＧＦと同様に有効であった。さらに、精製３０ｋＤＩＴＧＦα様ポリペプチドは血清ＮＲＫ線維芽細胞の増殖を刺激し、軟寒天においてこれらの細胞のコロニー形成を誘導した。精製ＴＧＦａ様ポリペプチドの生物活性は発癌物質−不死化ヒト哺乳器官上皮細胞１８４ＡＩＮ４の足場依存性増殖アッセイおよび５Ｖ４０Ｔ抗原で部分的に形賀転換された１８４ＡＩＮ４由来細胞１８４ＡＩＮ４Ｔの足場非依存性増殖アッセイにより試験された。これらの細胞に対するＴＧＦａ様ポリペプチドの用量応答曲線はＥＧＦおよびＴＧＦＵで観察されたものと同じであった。精製３０ｋＤｓＴＧＦα様因子の生物学的活性はＥＧＦ受容体の自己リン酸化を誘導するその能力を試験することによりさらに評価された。ＥＧＦ受容体を過剰発現するＡ４３１細胞を種々の濃度のＥＧＦ、ＴＧＦＵまたはＴＧＦα様増殖因子とインキュベートした。３つのペプチドの各々が同様にＥＧＦ受容体の自己リン酸化を刺激した。

ペプチドマツピング新規３０ｋＤｓＴＧＦα様増殖因子および成熟ＴＧＦαの間の相同性の程度を決定するために、Ｃ１ｅｖａｎｄの方法を用いてペプチドマツピングを実施した。

ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、Ｈ８およびラット−ＦｅＳｒＶ細胞からの代謝的標識条件性は培地のＲ３９９抗−ＴＧＦαポリクローナル抗体による免疫沈降が実施された。免疫沈降物は５ＤＳ−ＰＡＧＥ上で分析され特異的バンドが電気的に溶出された（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞から３０ｋＤｓ、Ｈ８細胞から６　ｋＤｓおよびラット−ＦｅＳｒＶ細胞から１８　ｋＤｓ）。これらの蛋白質はＮ−グリコナーゼおよびエラスターゼによる酵素的処理にかけられた。沈殿したバンドの大きさは表２にまとめられている。生成物は次に２５ｇ／ｍｌのｖ８−プロテアーゼを用いるべブモド消化にかけられた。完全に消化した後、試料はＣ１，８逆相クロマトグラフイーにより分析された。逆相クロマトグラフィーにより異なったアセトニトリル濃度のところで３つの主なペプチドビークが溶出された。しかしながら、ＭＤＡ−ＭＢ　２３１細胞から単離されたペプチドが溶出される濃度は（１６％。

１８．７％および２１．７％）はＨ８およびＦｅ５ｒＶ細胞から単離されたペプチドの溶出濃度（２４％、２９％および３２．６％）と異なっていた。Ｈ８細胞およびラット−ＦｅＳｒＶ細胞から得られるＴＧＦＵ（６ｋＤａｌのペプチド溶出パターンは本質的に同じであった。４０ｇのｖ８プロテアーゼでも同じ結果が得られ、酵素の濃度は異なったペプチド切断の原因にならないことを示唆している。

さらに、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞およびＨ８細胞に由来するｍＲＮＡのインビトロ翻訳が行われ、生じるポリペプチドはＮ〜グリコナーゼおよびニラスターゼ処理後の精製３ＱｋＤａ因子よりも同じペプチドマツピングプロフィールを持っていた。これらの結果は、“正ｔ”ＴＧＦα前駆体と異なった前駆体はＭＤＡ− ＭＢ−２３１細胞のｍＲＮＡから翻訳されるという証拠を提出している。さらに、前記の結果はＭＤＡ　ＭＢ　２３１由来のＴＧＦａ様ポリペプチドは成熟ＴＧＦαと非常にわずかな（もしあったとしても）共通ペプチド配列しか共有していないことを示している。

本発明の３０ｋｌ）ｓ１１蛋白賀の細胞効果を特徴付けるため、種々の実験が行われた。以下の実施例は単に本発明の例示のために示されるものであり制限的であることを意図しているわけではない。

４６８および５Ｋ−Ｂｒ−３における千ロジンリン酸化の誘導を評価した。特に、ＭＤＡ−４６８細胞はＥＧＦＲ遺伝子の増幅および過剰発現を行うがｅｒｂＢ −２受容体様蛋白質は発現しない、５Ｋ−Ｂｒ−３細胞はｅｒｂＢ−２の増幅および過剰発現並びに比較的高いＥＧＦＲレベルを示す。３０ｋｄｌＪガント、ＴＧＦＵおよびＥＧＦは両方の細胞株で千ロジンリン酸化を誘導することが観察されており、ＥＧＦＲ阻止抗体はＭＤＡ−４６８細胞において３つの増幅因子により誘導されたリン酸化を消滅させた。しかしながら、この抗体は本発明の３０ｋｄリガンドおよび５Ｋ−Ｂｒ−３細胞により誘導されたリン酸化を完全には阻止しなかった。しかしながら、それはＴＧＦＵにより誘導されたリン酸化は阻止した。

上述の結果から、３０ｋｄ因子で処理した５Ｋ−Ｂｒ−３細胞で起こっている蛋白質のチロシンリン酸化はＥＧＦＲとは異なっていることは明らかである。未処理５Ｋ−Ｂｒ−３細胞および抗−ＥＧＦＲ抗体単独で処理された細胞においてはリン酸化は観察されなかった。

実施例２ヒト哺乳器官癌腫細胞株ＭＤＡ−４５３において（ｅｒｂＢ−２を過剰発現するが、ＥＧＦ受容体蛋白質またはｍＲＮＡは検出できないレベルである）、３゜ｋｄリガンドは１．２５■／′ｆｆ１１から５０■／ｍｌの濃度範囲において用量依存様式でチロシンリン酸化を著しく増加させることが観察された。対照的に、ＥＧＦおよびＴＧＦＵは１８５ｋＤｚ範囲では（２５■／ｍｌの濃度）チロシンリン酸化を誘導できなかった。未処理細胞ではリン酸化は観察されなかった。前記のことから、３０ｋｄリガンドと１８５ｋｄ糖蛋白質の間に直接的な相互作用が起こっているよう乳癌腫細胞株のコロニー形成での増殖に対する本発明の３０ｋｄリガンドの効果を決定するために以下の実験が実施された。

５Ｋ−Ｂｒ−３細胞の増殖を阻害するため、細胞は本発明の３０ｋｄ増殖因子、ＥＧＦ、ＴＧＦＵおよび抗−ｅｒｂＢ−２抗体で処理された。

抗−ｅｒｂＢ−２抗体は５Ｋ−Ｂｒ−３およびＭＤＡ−４５３１［胞の増殖を６０〜７０％阻害したがＭＤＡ−４６８細胞の増殖は阻害しなかった。驚くことに、５Ｋ−Ｂｒ−３、ＭＤＡ−４５３およびＭＤＡ−４６８細胞を本発明の３゜ｋｄリガンド蛋白質に暴露すると、すべての細胞株に対して細胞増殖の６０〜７０％の阻害が観察された。

３０ｋｄリガンド蛋白質による増殖の阻害はＭＤＡ−４６８細胞においてはＥＧＦＲ阻止抗体により回復したが、５Ｋ−Ｂｒ−３またはＭＤＡ−４５３細胞では回復しなかった。このことは５Ｋ−Ｂｒ−３およびＭＤＡ−４５３細胞に対する３ＱＭ蛋白賀の影響はＥＧＦＲを媒介していないことを示している。

対照的に、本発明の３０ｋａ糖蛋臼賀はＥＧＦＲおよびｅｒｂＢ−２が正常レベルであるＭＣＦ−７細胞に対しては何の影響も示さなかった。さらに、ＥＧＦおよびＴＧＦａはＭＤＡ−４６８細胞および５Ｋ−Ｂｒ−３１１１胞の足場依存性増殖を阻害したが、ＭＤＡ−４５３またはＭＣＦ−７細胞のそれは阻害しなかった。

５Ｋ−Ｂｒ〜３およびＭＤＡ−４６８細胞のＥＧＦ−誘発足場依存性増殖阻害は抗〜ＥＧＦＲ阻止抗体により回復した。３０？ｌ糖蛋白質存在下では、５Ｋ−Ｂｒ−３、ＭＤＡ−４５３およびＭＤＡ−４６８細胞の増殖はほとんど完全に阻害された。

本発明の３０に４製ガントの増殖阻害特性は、Ａ４３１細胞およびＭＤＡ−４６８細胞のようなＥＧＦＲを発現しているものどれに対してもＥＧＦに対して記載されている特性と類似しているように思われる。

実施例４さらに、ＣＨＯ／’ｅ　ｒ　ｂ　Ｂ−２トランスフェクト細胞の増殖が本発明の３０１ａ糖蛋白質による処理後７０〜８０％阻害された。ＣＨＯ／ＤＨＦＲ対照トランスフェクト体および親Ｃ）（０株に対しては何の影響も観察されなかった。同じモルａＫでのＴＧＦＵは３つの株の増殖に対して何の影響も示さなかった。ＣＨＯ／ＤＨＦＲ細胞および親ＣＨＯ細胞株の千ロジンリン酸化および細胞増殖は本発明の３０ｋｄリガンドまたはＴＧＦＵによる処理の後も影響されなかった。

実施例５ｇｐ３０による細胞の生長の阻害５Ｋ−Ｂｒ−３、ＭＤＡ４５３、ＭＤＡ４６８およびＭＣＦ−７細胞を、５％Ｆｅ３を補ったＴＨＥＭ（バイオフルイズ（Ｂｉｏｔｌｕｉｄｓ））中で２４個のウェルのあるプレート中で平板培養した。親のＣＦ（Ｏ細胞、およびＤＨＦＲ遺伝子またはｅｒｂＢ−２遺伝子を感染させたＣＨＯ細胞を、１０％の透析したＦｅ３゜０．７５■／ｍｌ　Ｇ４１８お、Ｊ−びｃＨＯＩｌｉｌ胞およびＣＨＯ− ＤＨＦＲ細胞に対しては５０％ＭＳＣＨＯ−ｅ　ｒｂＢ−２細胞に対しては２５０％Ｍのメトトレキセート（ＭＴＸ）を補ったａ−ＭＥＭ（バイオフルイズ（Ｂｉｏｆｌｕｉｄ＋ｌ）中で２４８のウェルのあるプレート（コスタ−（ＣＯＩＩＩＯ）中で平板培養した。２４時間後に培１液を除去して、フィブロネクチン、トランスフェリン、ヘペス、グルタミン、微量元素、およびＢＳＡを含む対照血清を含まない培養ｒ＆（ＳＦＭ）または２、Ｏｎｇ／’Ｉｌｌ　ｇｐ　３０．１０　ｎｇ７　ｍ１組換えＴＧＦａ　（ジエネテノクＧｅｎｅ＋！ｃｂ）　）をｊ）０．ｊたＳＦＭ、またｌ！２．５ｇ／ｍｌ　４Ｄ５特異的抗　ｐ１８５””− ２モ／クロ一ナル抗体に取り替えた。細胞を対照の合流点の９０％に生長させて数えた。

各グループを３回アッセイした。生長の対照に対する相対値として結果を示す。

実験は３回行い、結果は再現性があった。結果を下の表２に示す。

５Ｋ−８＋−３！ｊＤＡ−４５３ＣＩＯ／ｅＩｂＢ−２ＣＩＯ／ＤＨＦＲＭＤＡ −１６８ＶＣＦ−７ｇｐ３０　３１　２４　Ｈ９９１８１Ｇ０４Ｄ５抗体　３２　３４　２２　９８　１０４　９２ＴＧＦα　７３　９１　Ａ９　９５　７９　１０５本発明の様々な観点をさらに記載するために、今から本明細書の図に言及する。

図１・ｇｐ３Ｑの！離Ａ部は低親和性ヘパリンクロマトグラフィーの使用を説明している。特に、ＭＤＡ−２３１細胞の調節培養液のアフィニティクロマトグラフィーをヘパリン−セファロースカラムで行った。画分を、Ａ４３１細胞膜のＥＧＦレセプター結合活性についてアッセイした。加えた培養液および活性を含むフラクションのアリコートを１５％５ＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、次に銀染色を行った。

レーン１は濃縮していない調節培養液を示す。レーン２は活性フラクションを示す。

Ｂ部は逆層クロマトグラフィーの使用を説明している。特に、ヘパリン−セファ０−スクロマトグラフイー後に得たＥＧＦ／ＴＦＧＡ活性フラクシ３ンを００５％ＴＦＡ中でμボンダパック０３カラムで２回クロマトグラフィーを行った。サンプルはアセトニトリルの急勾配で溶出させた。ＥＧＦレセプター結合活性を示したフラクションは次に再度クロマトグラフィーを行い、アセトニトリルのゆるやかな勾配で溶出させた。ＥＧＦと競合する活性は２５〜３０Ｔアセトニトリル勾配で常Ｃ−溶出した。得られたフラクションを１５？６ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび銀染色で分析した。サイズをキロダルトンで示した。

図２：　ＳＫ−Ｒｒ−３ｍ胞中のリン酸化された蛋白質の検出ＳＫ−Ｂｒ−３ｍｌｔｌを２４−２３１１プレート（コスタ−（Ｃａｓｔｏｒ）中で合流点の９００６に生長させた。細胞を３０℃で、［ＭＥＭで（レーン１および２）　、２５ｎｇ／ｍ１組換えＴＧＦａ　（ジェネテック（Ｇｅｎｅｔｅｃｈ）　、カリホルニア）を含むＩＭＥＭで（レーン３および４）、および５ｎｇ／ｍｌ　ｇ　ｐ　３０を含むＩＭＥＭで、そしてこれらのすべては抗ＥＧＦレセプター封鎖抗体（ジエネテック！Ｇｅｎｅｔｅｃｈ）、カリホルニア）の存在下で（レーン１．　４．　５）　、および非存在下で（レーン２．　３．　６）処理した。２０分後に培養液を除去して、１％ＳＤＳ。

０．１％β−メルカプトエタノール、０．１５Ｍトリス−塩酸（ｐＨ６，８）、１０％グリセロール、０．０２％ブロモフェノールブルー、１ｍ１ｌ　ＥＤＴＡ、２ｍＭＰｍｓｆおよび４２ｍＭロイペプチンを含むサンプル緩衝液１００μ！中で細胞を溶解させた。９５℃で５分間処理後、５０ａｇの蛋白質を７．５％５ＤＳ−ＰＡＧＥに供した。次に蛋白質をニトロセルロース膜へイムノブロッティングのために（ホエファーサイエンティフィックインストルメンツ（ｆｌｏｅｆｅｒ　５ｃｉｅ＋Ｈｉ＋１ｃＩｎｔｊ＋ｕｍｅｎ＋＋ｉ力リホルニア）トウビン（τｏｗｌ＋ｉｎ）らの改良法の電気泳動によって、電気泳動転写装置（ホエファ−（Ｈｏｒｆｅ＋）　、ＴＥ２２）を用いて転写した。電気泳動による転写は室温で１時間、１２５ｍＡで２５ｉ１ｉグリシン、１２９ｍ１ｎリス（ｐＨ８，３）および２０％メタノールを含む緩ｌｒｒ液中で行った。転写後フィルターを、０，５％ツイーン２０を含むトリスで緩衝化させた塩水に溶かした５％ＢＳＡでブロックした。抗すン酸化トリョシン抗体（アマ−ジャム！Ａｌａｔ　ｒ　Ｉｈ　ｉｗ）　）を５％ＢＳＡ　（シグマｌｓｉｇａｕ）ラジオイムノアッセイグレード）中で固定化した蛋白質と反応させた。免疫複合体はアルカリホスファターゼと結合させたヤギの抗マウス抗体によって検出した。プロットを次にＮＢＦおよびＢＣｒＰ（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇｉ）　）を含む発色基賀溶液でインキュベートした。

図３　：ＭＤＡ−４５３細胞中のリン酸化された蛋白質の検出ＭＤＡ−４５３細胞を２４−２３１１プレート（コスタ−（Ｃｏｓｌｚ＋）ｌ中で合流点の９０％に生長させて、３７℃でｒＭＥＭで（レーン１）　、２５ａｇ／ｍ１組換えＴＧＦａ（ジエネテック：Ｇｅｎｅ＋ｅｃｈｌ、カリホルニア）を含むＩＭＥＭで（レーン１０）、または１．２５〜４０Ｂ／’ｍｌ　ｇｐａｏを含むＩＭＥＭで（レーン２〜９）処理した。図２に記述したように２０分後に培ａｌｌ！を除去して、細胞を１００μｌのサンプル緩衝液中で溶解させた。９５℃で５分間処理後、５０ａｇの蛋白質を７．５％５ＤＳ−ＰＡＧＥに供した。次に図２で記述したように、抗すン酸化トリョンン抗体（アマーンヤム（入ｍｅｎｈｓｍ）　）を用いたイムノプロブティングのために、蛋白質をニトロセルロース膜へ転写した。

図４．無傷のＣＨＯ／Ｄｔ（ＦＲ，およびＣＨＯ／ｅｒｂＢ−２１１胞中のｐ１８５蛋白質のリン酸化細胞を合流点の９０％まで２４−２３１１プレート（コスタ−（Ｃｏ山Ｔ））中で１０％の透析したＦｅ２，０．７５■／ｍｌ　Ｇ４１８、およびメトトレキセーｈ　（ＭＴＸ）を５ＱｎＭの濃度で（ＣＨＯ１ｉ細胞およびＣＨＯ−ＤＨＦＲ）または２５０ｆｉＭの濃度で（ＣＨＯ−ｅ　ｒｂＢ−２）補ったＡＭＥＭ（／（イオフルイズｆ８ｉｏ！１＋＋ｉｄ＋日中で生長させた。ＣＨＯ／ＤＨＦＲ（図４Ａ）およびＣＨＯ−ｅｒｂＢ−２（図４Ｂ）細胞を３７℃で２０１Ｍヘペス（ｐＨ７，４）を補った（ＡおよびＢレーン１および４）　、１０ｕ／ｍ１組換えＴＧＦａ（ジエネテブク（Ｇｅｎｅｊｅｃｈ）　、カリホルニア）を補った（ＡおよびＢレーン２および５）対照培養液および２．Ｏｎ＊／ｍｌ　ｇｐａｏを補った対照培養液で（ＡおよびＢレーン３および６）処理した。２０分後に、培養液を除去して細胞を１００μｍの（図２に記述した）サンプル緩衝液中で溶解した。抗すン酸化トリョシン抗体（ＡおよびＢレーン１から３）（アマ−ジャム（Ａｍｔｎｋｓｍ）　）および抗ｅｒｂＢ−２抗体（ＡおよびＢレーン４から６）（ＮＥＮ）を５％ＢＳＡ　（シグマ（Ｓ　ｉ　ｇｍｘ）ラジオイムノアッセイグレード）中で固定化した蛋白質と反応させた。免疫複合体を図２に記述したようにして検出した。

５Ｃ５：５Ｋ−Ｂ工さ連！り封玉〔」］証圭ｌゴ上二在二東ｒ上旦５Ｋ−Ｂｒ−３１１胞を２４個のウェルのあるプレート中で、５％ＦＣ３を補ったＩＭＥＭ　（バイオフルイズｊＢｉｏｆｌｕｉｄｓｌｌ中で平板培養した。結合緩衝液（１■／ｍｌ　ＢＳＡ、１０ｍＭへペスおよび２０１Ｍグルタミンを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２ｐｉ−ｆ７．４）で洗浄した後に、細胞を３０分間３７℃で結合緩衝液でインキュベーンジンした。ＥＧＦＫＲを３０Ｊ　ＥＧＦで２時間４ ℃で飽和させた。

４Ｄ５に対して様々な濃度の非標識ｇｐ３０の存在下で、ｌｎＭのヨウ素で処理した４Ｄ５でｐ１８５結合研究を３時間４℃で行った。インキュベーション後、細胞を３回結合緩衝液で洗浄して１％ＳＤＳで可溶化した。非特異的結合を過剰の（１００ｎＭ）非標識抗体を用いて決定した。各グループを３回ア・ソセイした。実験は５回行い、再現性のある結果を得た。

図６：ｇｐ３０の４Ｄ５抗体とのｐ１８５架橋結合の阻害結合アッセイを図５に記述したように行った。結合は、ヨウ素で処理した４Ｄ５（１ｎＭ）単独で（レーン１）、１１００ｎの非標識４Ｄ５の存在下で（レーン２）、および２１１Ｍ　ｇｐａｏの存在下で（レーン３）行った。１００ｎｉｌ　ＥＧＦを対照として用いた（レーン４）。次に細胞を架橋結合試薬ＥＧＳで４５分間４℃で処理して、０１ｍｌの２０ＩＩＭ　ＮＨ４Ｃ１を加えることによって消光した。

可溶化させた細胞を、ｅｒｂＢ−２２のＣ末端部分に対するポリクローナル抗体（ジエネテブク（Ｇｅｎｅｊｅｃｈ）　、カリホルニア）で免疫沈降させた。沈殿を５％５ＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。

本発明の３Ｑｋｄの糖蛋白質を、ｅｒｂＢ−２腫瘍遺伝子およびＥＧＦＲを過剰発現する様々な型の腺癌細胞の生長を阻害するために都合よく使用できる。

ｅｒｂＢ−２腫瘍遺伝子およびＥＧＦＲを過剰発現する胸、卵巣、胃および肺組織の腺癌細胞の生長を阻害するために用いるのが好ましい。

哺乳動物、好ましくはヒトにおける上の悪性腫瘍細胞の生長を阻害するために本発明の３０ｋｄの糖蛋白質を用いるにあたって、比較的低濃度の糖蛋白質を使用することができる。例えば合計して１日当たり約１から１０，０００ｎｇの糖蛋白質を投与するように、およそ１〜５０　ｎｇ／′ｍｌの濃度の水性溶液を患者へ都合よく投与できる。しかし１日当たりおよそ１〜１．ＯＯＯｎｇを投与することが好ましい。

従って本発明は、ＥＧＦＲおよびｐ１８５ｅ！ｂＢ−２との直接的な相互作用における本発明の３０ｋｄのＴＧＦα類似の糖蛋白質の使用に関する。このため別の観点ｅ：ｂＢ−２から、本発明はＥＧＦＲまたはｐ１８５　のいずれかと３Ｑｋｄの糖蛋白質のリガンドの共役体を提供する。さらに別の観点から、本発明はこれらの兵役体を使用する診断上のおよび治療上の方法を提供する。さらに本発明は本共役体を使用する診断のための試験キットを提供する。

別の観点から、本発明はｇｐａｏのモノクローナル抗体の調製および、患者の血清中のｇｐａｏの存在を検出するためのこれらのモノクローナル抗体の使用に関連する。

ｇｐｓｏはＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳癌細胞によって生産されることが知られており、他の腺癌細胞によっても生産されるらしいので、本発明は患者の血清中のｇｐａｏを検出するための方法も提供する。

一般的に本発明によれば、ｐ１８５またはｇｐａｏのいずれかの単なる検出は検出した蛋白質が過剰発現しているという結論に基づく。順にこの結論は腫瘍のより積極的な治療法の使用を必要とする患者の悪い予後につながる。

さらに詳しく述べると、本発明は、ＥＧＦＲまたはｅｒｂＢ−２１１瘍遺伝子のいずれかを過剰発現する腺癌細胞の存在を検出するための、３０ｋａの糖蛋白質およびＥＧＦＲ，ならびに３０に４の糖蛋白質およびｐ１８５ｅｒｂＢ−２の共役体の使用を具体的に最初に企図している。検出される腺細胞は胸、卵巣、胃および肺組織のものであることが好ましい。

３０ｋｄの糖蛋白質のリガンドが表面に結合して、ＥＧＦＲまたはｅｒｂＢ−２腫瘍遺伝子のいずれかを過剰発現すると推測される細胞を含む腫瘍部分を含む水性溶液と接触させる生化学的な検出法において一般的に本共役体を都合よく使用できる。ＥＧＦＲまたはｐ１８５のいずれかが細胞表面上で見い出されることができるので、これを都合よく行うことができる。もしそのような細胞が存在するならば、ＥＧＦＲまたはｐｌ　ｓ　５ｅｒｂＢ−’ｌのいずれかがリガンドと結合するようになるだろう。その後水性溶液を結合した抗リガンド材料から分離し、抗リガンド材料をそれに関連した既知の検出方法で都合よく検出できる。例えば増幅させた酵素に共役させたイムノアッセイを使用できる。リガンドが結合する表面を、非特異的な結合の量を制限するために１つまたはそれ以上の試薬で処理する。そのような試薬は、アッセイを解釈するときに問題になる非特異的結合のために生ずる「ノイズ」を減少させる。

上の手順に従って、診断のための試験キットを様々な方法で設計できる。

例えば、試験キットはｇｐ３０リガンドが結合する表面を含む試験液体の入った容器を含むように設計することができる。これは多くのウェルのある試験プレートであることが好ましい。試薬の溶液を含む少なくとも他の１つの容器も含む。

非特異的な結合を制限する試薬をキットの溶液中に加えることもでき、またはそれが供給される前に最初の容器の表面を処理するために使用されていてもよい。

次に腫瘍または腫瘍サンプルの部分を水性溶液中に加えて、結合したｇｐａｏと接触させることができる。

ヒトの密書においてＥＧＦＲまたはｅｒｂＢ−２腫瘍遺伝子の過剰発現を都合よく検出するために、既知のサンドイッチアッセイ技術を使用すると有利である。

例えば本発明により使用され得る１つのアッセイ法および試験キットは米国特許第４．６６８，６３９号に記載され、これは完全に本明細書に編入される。

このために本発明は、ＥＧＦＲまたはｅｒｂＢ−２腫瘍遺伝子を過剰発現する腺癌細胞の検出のための任意の診断上のまたは治療上の方法を企図し、特別に目的とするものであり、その方法は本発明の３０ｋａの糖蛋白質およびＥＧＦＲまたはｐ１８５ｅＩｂＢ−２のいずれかとの間の共役体の形成を使用するものである。

上記にて注目したように、本発明はｇｐ３ｏに対するモノクローナル抗体を使用するｇｌ）３０の検出のためのアッセイおよび試験キットを提供する。

この目的のためにポリクローナルまたはモノクローナル抗体のいずれも使用することができるが、モノクローナル抗体を用いることが好ましい。

そのようなアッセイにおいて、好ましくはｇり３０に対するモノクローナル抗体をミクロタイタープレートまたは多くのウェルのあるプレートに結合させて、ｇｐ３Ｑを含むと推測される患者の血清にさらす。従来の検出法によるｇｐａｏの存在の検出においては、悪い予後の結論から腫瘍に対するより積極的な治療法の使用が必要になる。しかし重要なことは、患者の血清中の３０１ｄの糖蛋白質（ｇ　ｐ　３０）の存在を、モノクローナルまたはポリクローナル抗体を利用して事実上任意の型のイムノアッセイで検出できることである。これらは従来の競合結イブチ」アッセイのいずれも含む。

上記のアッセイで、試験キットも提供する。一般的にキットは、ｇｐａｏに対する特異性をもつ抗体を含む最初の容器、およびｇｐａｏに対する特異性をもち、そして検出可能なシグナルを与えることのできるレポーター分子で標識した第２の抗体を含む２本目の容器を含む。最初の抗体を固体の表面に固定化する。

ｇｐａｏの検出のための上記のアッセイおよび試験キットを、米国特許第４．９２１，７９０号に従って類推によってそれぞれ処理し、および構成することができ、その特許の内容は完全に本明細書に含まれる。

本発明の３０ｋｄの糖蛋白質は次のことから充分に特徴付けられる、１）ヘパリンに結合する蛋白質であること：２）ＥＧＦレセプターへ結合できること；３）ＴＧＦαに対する抗体への交差反応を示すこと：４）ニラスターゼによって切断できること；および５）正常なラット腎（ＮＲＫ）細胞における形質転換の活性を刺激できること。

ｇｐａｏに対して生産されるポリクローナルまたはモノクローナル抗体を既知の技術に従って生産できる。例えば、Ｆ、　Ｍ、アウスベル（Ｆ、　Ｌ　Ａ＋＋＋ｂｅｌ）らが編集したＣｏｒｎｅｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｅＩｌ１１ｒ　Ｂｉｏｌｏ（７（ウィリー（Ｗｉｌｅｙ）　１９８７）の、特に免疫学に関する１１章を見よ。本発明のアッセイおよび診断のための試験キットにおいて使用されるイムノアッセイも、上記の論文によっておよびその特許が完全に本明細書に含まれる米国特許！４．９２１　７９０号中に発表された方法によって証明されるように、当業者によ（知られている。

上に記述したように、本発明の診断の観点は、ｐ１８５、ＥＧＦＲまたはｇｐａｏのいずれかの検出のための方法および試験キットの使用に関連する。これらの蛋白質の任意の１つの検出は、１つまたはそれ以上の腺癌の積極的な冶！ＩＩ法の使用を必要とする悪い予後のための基礎を形成できる。

本発明はｇｐａｏそれ自身およびｇｌ）３０−ＥＧＦＲおよび／ま？、ｌ＊ｇｐ３０−　ｐ１８５ｅｒｂＢ−２の共役体にも関連している。

本発明の治療上の観点は、ＥＧＦＲおよび／またはｅｒｂＢ−２腫瘍遺伝子を過剰発現する腺癌細胞の生長を阻害するための、ｇｐａｏの使用に関連している。

一般的に、治療薬として投与すべきｇｐａｏの量は、治療する医師のその場その堝での根拠に基ついて決められるだろう。指針として、腺癌の程度、密書の体重および年齢を考慮して１日当たりおよそ１０．０００ｎｇまでを使用できるが、一般的に１日当たりせいぜい多くて１．０００ｎｘより多くはなく、しかし１日当たりおよそ５から５００ｎｇを使用するのが好ましい。しかし特に上記の量はその場その場の根拠に基づいて変えてよい。

本発明の３０ｋｄの糖蛋白質を治療薬として単独で投与してよいが、１つまたはそれ以上の他の治療薬と組み合わせて投与することもできる。例えば３０ｋＪの糖蛋白質を任意の化学療法剤、生長阻害剤または免疫刺激剤とともに投与できる。

本発明はそのような組み合わせを具体的に企図している。

今、本発明を記載したように、当業者にとっては、本発明の範囲および意図からはずれることなく、上記の態様に多くの変化および修飾を加えることができることが今では明らかであろう。

ロロＣ）浄書（内容に変更なしｊ４０５Ａｂ　濃度（ｎＭ）ＦＩＧ、、５とｂノ浄書（内容に変更なし八費Ｄａ４３→ 浄書（内容に変更な− 要　約　書ヒトの腺癌腫細胞の成長を阻害する方法であって、この細胞は癌遺伝子ｅｒｂＢ −２を過剰発現し、この方法は該ヒトに該細胞の成長を阻害するために３０ｋｄの糖蛋白質の有効量を投与することを伴う。

手続補正書坊幻１、事件の表示ＰＣＴ／ＵＳ９１１０３４４３平成３年特許願第５１０２２８号２、発明の名称ヒト癌遺伝子ｅｒｂＢ−２を過剰発現している細胞の増殖を阻害する増殖因子３、補正をする者事件との関係　特許出願人住所名　称　ジョージタウン・ユニバーシティ４、代理人住　所　東京都千代田区大手町二丁目２番１号新大手町ビル　２０６区電話３２７０−６６４１〜６６４６５、補正命令の日付　平成　５年　８月１０日　溌送日）６、補正の対象（１）出願人の代表書名を記載した国内書面国際調査報告凹ｇｈｍｅｎｔ　ｔｏ　ＦｏｒｍＪ）Ｏｐｃ’ｒ　ＵＳ９Ｌ　０３４４３Ｔｈｉｓ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｃｏｎｔａｉｎｓ　ｃｌａｉｍｓ　ｄｉｒ＠ｃｔｅｄ　ｔ。

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Claims

【特許請求の範囲】

１．ヒトに腺癌腫細胞の増殖を阻害するのに有効な量の３ｋｄ糖蛋白質を投与することからなる、癌遺伝子ｅｒｂＢ−２またはＥＧＦＲを過剰発現しているヒトの腺癌腫細胞の増殖の阻害方法。
２．前記腺癌腫細胞が乳房、卵巣、胃または肺組織の腺癌腫細胞である請求項１に記載の方法。
３．前記ヒトに１日当たり約１〜１０，０００ｎｇの３０ｋｄ糖蛋白質を投与することからなる請求項１に記載の方法。
４．ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト乳癌細胞から得られた３０ｋｄ糖蛋白質。
５．ＭＤ−ＭＢ−２３１ヒ乳癌細胞から得られた３０ｋｄ糖蛋白質およびヒトｅｒｂＢ−２癌遺伝子から発現された１８５ｋｄ糖蛋白質の複合体。
６．ＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト乳癌細胞から得られた３０ｋｄ糖蛋白質およびヒトＥＧＦＲの複合体。
７．ａ）前記１８５ｋｄ糖蛋白質またはＥＧＦＲを含んでいると疑われる患者からの腫癌部分の溶液とＭＤＡ−ＭＢ−２３１ヒト乳癌細胞から得られた結合３０ｋｄ糖蛋白質を接触させ、それにより前記１８５ｋｄｓ糖蛋白質またはＥＧＦＲと前記結合３０ｋｄ糖蛋白質の複合体を形成させ、そしてｂ）検出手段を用いて前記の形成された複合体を検出または検出を試みることからなるヒト血清中のヒトｅｒｂＢ−２癌遺伝子またはＥＧＦＲにより発現される１８５ｋｄ糖蛋白質の検出方法。