JPH08509357A - グリア細胞分裂誘発因子とその調製及び使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 グリア細胞（特にシュワン（Ｓｃｈｗａｎｎ）細胞）の細胞分裂の刺激とグリア細胞の腫瘍の治療とに有用な様々なポリペプチドをコード化するＤＮＡの特徴付けと精製とが開示される。更に、グリア細胞の細胞分裂の刺激及びグリア細胞の腫瘍の治療における利用可能性を有する新規なポリペプチドをコード化するＤＮＡ配列も開示される。グリア細胞に関連する疾病の治療において治療及び診断の補助手段としての利用のために公知及び新規なポリペプチドを合成、精製及びテストをする方法も提供される。更に、グリア細胞の関する疾病における診断及び治療に有用な抗体プローブを合成する方法も提供される。

Description

【発明の詳細な説明】 グリア細胞分裂誘発因子とその調製及び使用 関連出願の相互参照 本出願は、１９９２年１０月２３日出願の出願番号第０７／９６５，１７３号 と、１９９２年９月３日出願の出願番号第０７／９４０，３８９号と、１９９２ 年６月３０日出願の出願番号第０７／９０７，１３８号と、１９９２年４月３日 出願の出願番号第０７／８６３，７０３号との一部継続出願である。 発明の背景 本発明は、脊椎類に見られ、シュワン細胞を含むグリア細胞の細胞分裂誘発成 長因子であるポリペプチドに関する。本発明は、更に、そのような因子を生成可 能な方法と、そのような因子の治療的利用とにも関する。 脊椎類のグリア細胞は、中枢及び末梢神経システムの特殊化した接続組織を構 成している。重要なグリア細胞としてシュワン細胞があるが、これは、ニューロ ンの為の代謝支持体を提供するとともに、特定の末梢神経の神経軸索の周囲に髄 鞘（ミエリン鞘）を提供することによって、個別の神経繊維を形成する。シュワ ン細胞は、ニ ューロンを支持し、近接する神経軸索の周囲において近接同心の膜層を形成し、 その成長につれて前記軸索の周囲において捻れながら形成されることによってミ エリン鞘効果を提供するものである。これらのミエリン鞘は、多くの神経線維の 弱い部分であり、これらシュワン細胞の損傷、発育及び成長の不全が、数多くの 末梢神経システムの疾患と障害を特徴付ける大幅な脱髄や神経退化に関連してい る可能性がある。神経システムの発達において、その細胞がその分裂と成長を制 御するのに様々な因子を必要とすることが明らかになった。そして、近年、この ような種々の因子が同定され、これらの内のいくつかはシュワン細胞の分裂と発 達に影響することが判っている。 従って、ブロックス（Ｂｒｏｃｋｅｓ）他，ｉｎｔｅｒａｌｉａ，ｉｎ Ｎｅ ｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，４（１９８４）７５−８３は、ウシの脳と下垂体組織と からの抽出物質に存在するタンパク質成長因子について記載しており、これはグ リア細胞成長因子（ＧＧＦ）と命名された。この因子は、胎児子ウシ血清を１０ ％含有するバックグラウンド培地において、培養ラットのシュワン細胞を刺激し てこれを分裂させた。又、この因子は分子量が ３１，０００ダルトンであり、容易にダイマー化することも記載されている。Ｉ ｎ Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．，１４７（１９８７），２１７−２２５において、ブロ ックス（Ｂｒｏｃｋｅｓ）は、ＧＧＦの、シュワン細胞に基づく分析について記 載している。 ブロックス（Ｂｒｏｃｋｅｓ）他，上記、は、更に、ＧＧＦの外見上の均質状 態への精製方法についても記載している。要約すると、ここに記載された一つの 大規模精製方法は、凍結乾燥したウシの前頭葉の抽出と、それによって得られた 物質をＣＭセルロースからのＮａＣｌグラジエント溶 出を使用したクロマトグ ラフィーに関するものである。次に、ゲル濾過を、先ずウルトロゲル（Ｕｌｔｒ ｏｇｅｌ）カラムで、次に、ホスホセルロースカラムで、そして最後に、小規模 ＳＤＳゲル電気泳動法で行う。あるいは、前記ＣＭセルロース物質を、ホスホセ ルロースカラムに直接に適用し、該カラムからのフラクションをプールして、調 製天然ゲル電気泳動によって精製し、その後、最終的なＳＤＳゲル電気泳動にか ける。 ブロックス（Ｂｒｏｃｋｅｓ）他は、以前に報告 されたゲル濾過実験（ブロックス（Ｂｒｏｃｋｅｓ）他，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅ ｍ．２５５（１９８０）８３７４−８３７７）において、成長因子活性の大きな ピークが、分子量５６，０００ダルトンで移動（ｍｉｇｒａｔｅ）することが観 察され、これに対して、上述の手法の最初のものにおいては、分子量３１，００ ０においておもに活性が観察された、と述べている。ＧＧＦダイマーは、この実 験において、主として、ＣＭセルロースからのグラジエント溶出の生成物として 除去されることが報告されている。 ベンヴェニスト（Ｂｅｎｖｅｎｉｓｔｅ）他（ＰＮＡＳ，８２（１８８５）， ３９３０−３９３４）は、Ｔリンパ球由来のグリア細胞発育誘発因子について記 載している。この因子は、還元状態において、ＳＤＳゲルの見かけ上の分子量の 変化を示す。 キムラ（Ｋｉｍｕｒａ）他（Ｎａｔｕｒｅ，３４８（１９９０），２５７−２ ６０）は、自ら神経線維腫由来成長因子（ＳＤＧＦ）と呼称する座骨神経鞘腫瘍 から得られる因子について記載している。これらの著者は、反対に部分的に精製 された下垂体フラクション含有の ＧＧＦが活性な状態においては、ＳＤＧＦは、トリチウム標識化ＴｄＲのシュワ ン細胞への結合を刺激しないと述べている。ＳＤＧＦの見かけ上の分子量は３１ ，０００ないし３５，０００である。 デイヴィス（Ｄａｖｉｓ）とストローバント（Ｓｔｒｏｏｂａｎｔ）（Ｊ．Ｃ ｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１１０（１９９０），１３５３−１３６０）とは、多数の 候補細胞分裂誘発物質について記載している。ラットのシュワン細胞を使用し、 選択された候補物質が、ＦＣＳ（胎児子ウシ血清）が１０％存在して、フォルス コリン（ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ）が存在する場合と、存在しない場合とにおいて、 シュワン細胞へのＤＮＡ合成を刺激する能力をテストした。テストした因子の一 つは、ＧＧＦ−カルボキシメチルセルロースフラクション（ＧＧＦ−ＣＭ）であ り、これはＦＣＳが存在する場合、フォルスコリン（ｆｏｒｓｋｏｌｉｎ）が存 在及び不在の両方の場合において細胞分裂誘発作用を有していた。この研究に依 り、フォルスコリンの存在下において、特に血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）が 、シュワン細胞に対する潜在的細胞分裂誘発物質であることが判った。ＰＤＧＦ は、以前には、シュワン細胞に影響しないと考えられていたもので ある。 ホルムズ（Ｈｏｌｍｅｓ）他，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９２）２５６：１２０５ 及びウェン（Ｗｅｎ）他，Ｃｅｌｌ（１９９２）６９：５５９は、レセプタ（ｐ １８５^erbB2）に結合するタンパク質をコード化するＤＮＡ配列がいくつかのヒ トの腫瘍に関連していることを示している。 前記ｐ１８５^erbB2タンパク質は、チロシンキナーゼ活動を備えた１８５キロ ダルトン膜長のタンパク質である。そしてこのタンパク質は、ｅｒｂＢ２プロト −がん遺伝子によってコード化される（ヤーデン（Ｙａｒｄｅｎ）及びユルリッ チ（Ｕｌｌｒｉｃｈ）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５７：４３３（１９８ ８））。前記ｒｂＢ２遺伝子は、ＨＥＲ−２（ヒト細胞）、あるいはｅｎｅｕ（ ラット細胞）とも呼称されるが、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）のレセプタに密接 に関連している。最近の証拠に依れば、ｐ１８５^erbB2と作用する（そしてその キナーゼを活性化する）タンパク質は、ｐ１８５^erbB2を有する細胞の増殖を誘 発することが示されている（ホルムズ（Ｈｏｌｍｅｓ）他，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２ ５６： １２０５（１９９２）；ドバシ他，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８ ８：８５８２（１９９１）；ルプ（Ｌｕｐｕ）他，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ ｄ．Ｓｃｉ．８９：２２８７（１９９２））。更に、ｐ１８５^erbB2結合タンパ ク質をコード化する前記遺伝子が、それぞれ長さが異なり、かつ、いくつかの共 通のペプチド配列とユニークなペプチド配列とを含む一連のタンパク質を生成す る多くの、大きさとスプライシングとが異なったＲＮＡ転写体を生成することが 明らかである。これは、ヒトの乳ガン（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）から得られるス プライシングが異なったＲＮＡ転写体によって証明されている（ホルムズ（Ｈｏ ｌｍｅｓ）他，Ｓｃｉｅｎｃｅ２５６：１２０５（１９９２））。更に、これは （ここに記載されているように）ｐ１８５^erbB2レセプタのためのリガンドとし て作用する広範囲のタンパク質によっても証明されている（下記参照）。 発明の要旨 一般に、本発明は、グリア細胞（特に、シュワン細胞と中枢神経システムのグ リア）の分裂を刺激する方法と、更に、そのようなグリア細胞の分裂誘発活性を 示す新規なタンパク質とに関する。更に、これらのタンパク質と これらタンパク質と、関連タンパク質とに結合する抗体をコード化すＤＮＡも提 供される。 本発明の新規なタンパク質は、公知のポリペプチドをコード化する配列の別の スプライス生成物を含む。一般に、これらの公知タンパク質は、前記ＧＧＦ／ｐ １８５^erbB2族タンパク質のメンバーである。 より詳しくは、本発明は、所定の式のポリペプチドと、これらのポリペプチド をコード化するＤＮＡ配列とを提供する。即ち、これらポリペプチドは、以下の 式を有する。 ＷＹＢＡＺＣＸ ここで、ＷＹＢＡＺＣＸは、図３１に示されるアミノ酸配列から成り（配列認 識番号１３６−１３９，１４１−１４７，１６０，１６１）、Ｗは、ポリペプチ ドセグメントＦを有するかあるいは有さず、Ｙは、ポリペフチドセグメントＥを 有するかあるいは有さず、Ｚは、ポリペプチドセグメントＧを有するかあるいは 有さず、そして、ここにＸはポリペプチドセグメントＣ／Ｄ ＨＫＬ， Ｃ／Ｄ Ｈ，Ｃ／Ｄ ＨＬ，Ｃ／Ｄ Ｄ，Ｃ／Ｄ’ＨＬ，Ｃ／Ｄ’ＨＫＬ，Ｃ／ Ｄ’Ｈ，Ｃ／Ｄ’Ｄ，Ｃ／Ｄ Ｃ／Ｄ’ＨＫＬ，Ｃ／Ｄ Ｃ／Ｄ’Ｈ，Ｃ／Ｄ Ｃ／Ｄ’ＨＬ，Ｃ／Ｄ Ｃ／Ｄ’Ｄ，Ｃ／Ｄ Ｄ’Ｈ，Ｃ／Ｄ Ｄ’ＨＬ，Ｃ／ Ｄ Ｄ’ＨＫＬ，Ｃ／Ｄ’Ｄ’Ｈ，Ｃ／Ｄ’Ｄ’ＨＬ，Ｃ／Ｄ’Ｄ’ＨＫＬ，Ｃ ／Ｄ Ｃ／Ｄ’Ｄ’Ｈ，Ｃ／Ｄ Ｃ／Ｄ’Ｄ’ＨＬ，またはＣ／Ｄ Ｃ／Ｄ’Ｄ ’ＨＫＬを含み、 以下のいずれかの条件を満たす、 ａ）Ｆ、Ｙ、Ｂ、Ａ、Ｚ、Ｃ又はＸの少なくとも一つは、ウシ由来である、 ｂ）ＹはポリペプチドセグメントＥであるか、又は、 ｃ）ＸはポリペプチドセグメントＣ／Ｄ ＨＫＬ，Ｃ／Ｄ Ｄ，Ｃ／Ｄ’ＨＫ Ｌ，Ｃ／Ｄ Ｃ／Ｄ’ＨＫＬ，Ｃ／Ｄ Ｃ／Ｄ’Ｄ，Ｃ／Ｄ Ｄ’Ｈ，Ｃ／Ｄ Ｄ’ＨＬ，Ｃ／Ｄ Ｄ’ＨＫＬ，Ｃ／Ｄ’Ｄ’Ｈ，Ｃ／Ｄ’Ｄ’ＨＫＬ，Ｃ／Ｄ Ｃ／Ｄ’Ｄ’Ｈ，Ｃ／Ｄ Ｃ／Ｄ’Ｄ’ＨＬ，Ｃ／Ｄ Ｃ／Ｄ’ＨＫＬ，Ｃ／ Ｄ’Ｈ，Ｃ／Ｄ Ｃ／Ｄ’Ｈ，またはＣ／Ｄ Ｃ／Ｄ’ＨＬを含む。 更に、本発明は、コード化セグメント^5'ＦＢＡ^3'と、図３１に示されるアミノ 酸配列（配列認識番号１３６，１３８，１３９）を有する対応のポリペプチドセ グメントを備えたＤＮＡ配列も含む。 前記ＤＮＡ配列は、コード化セグメント^5'ＦＢＡ^3'と、図３１に示されるアミ ノ酸配列（配列認識番号１３６，１３８，１４０）を有する対応のポリペプチド セグメントを含む。 前記ＤＮＡ配列は、コード化セグメント^5'ＦＥＢＡ^3'と、図３１に示されるア ミノ酸配列（配列認識番号１３６−１３９）を有する対応のポリペプチドセグメ ントを含む。 前記ＤＮＡ配列は、コード化セグメント^5'ＦＥＢＡ^3'と、図３１に示されるア ミノ酸配列（配列認識番号１３６−１３８，１４０）を有する対応のポリペプチ ドセグメン卜を含む。そして、 前記ＤＮＡ配列は、ＣＧＦ２ＨＢＳ５ ｃＤＮＡクローンのポリペプチドコー ド化セグメントを含む（ＡＴＣＣ Ｄｅｐｏｓｉｔ Ｎｏ．７５２９８，ｄｅｐ ｏｓｉｔｅｄ １９９２年９月２日）。 本発明は、更に、式ＦＢＡ，ＦＥＢＡ，ＦＢＡ’，ＦＥＢＡ’のペプチドと、 これらペプチドをコード化するＤＮＡ配列とを含み、前記ポリペプチドセグメン トは、図３１において、それぞれ、配列認識番号（１３６，１３８及び１３９） 、（１３６−１３９）と（１３６、１３８及び１４０）、及び（１３６−１３８ 及び１４０）とで示されるアミノ酸配列に対応する。精製ＧＧＦ−ＩＩポリペプ チド（配列認識番号１ ６７）である前記ポリペプチドも本発明の一部に含まれ る。 更に、本発明の一態様は、中枢神経システムのグリア、特に乏突起膠細胞、小 グリア細胞及び星状膠細胞、の治療に有用なペプチドと、これらのペプチドをコ ード化するＤＮＡと、更にこれらのペプチドの投与方法を含む。 本発明は、更に、前記定義のアミノ酸配列をコード化するＤＮＡ配列を含むベ クトルを含む。又、前述のアミノ酸配列をコード化する単離ＤＮＡを含有するホ スト細胞も含まれる。本発明は、更に、前記ｐ１８５^erbB2レセプタを結合し、 生体内及び／又は生体外でグリア細胞 分裂を刺激する化合物を含む。 又、前述の新規なペプチドに対する抗体も本発明の一部として含まれる。更に 、ここに記載のすべてのペプチドに対する抗体は、ここに記載のポリペプチドの 精製に利用可能である。又、これらのポリペプチド対する抗体は、グリア細胞の 細胞分裂治療用インヒビタとしても利用可能である。 本発明は、更に、グリア細胞の細胞分裂を刺激する方法も提供し、該方法は、 グリア細胞を以下の式で定義されるポリペプチドに接触させる工程を有する、即 ち、 ＷＹＢＡＺＣＸ ここで、ＷＹＢＡＺＣＸは、図３１に示されるアミノ酸配列から成り（配列認 識番号１３６−１３９，１４１−１４７，１６０，１６１）、Ｗは、ポリペプチ ドセグメントＦを有するかあるいは有さず、Ｙは、ポリペフチドセグメントＥを 有するかあるいは有さず、Ｚは、ポリペプチドセグメントＧを有するかあるいは 有さず、そして、ここにＸはポリペプチドセグメントＣ／Ｄ ＨＫＬ， Ｃ／Ｄ Ｈ，Ｃ／Ｄ ＨＬ，Ｃ／Ｄ Ｄ，Ｃ／Ｄ’ＨＬ，Ｃ／Ｄ’ＨＫＬ，Ｃ／ Ｄ’Ｈ，Ｃ／Ｄ’Ｄ，Ｃ／Ｄ Ｃ／Ｄ’ＨＫＬ，Ｃ／Ｄ Ｃ／Ｄ’Ｈ，Ｃ／Ｄ Ｃ／Ｄ’ＨＬ，Ｃ／Ｄ Ｃ／Ｄ’Ｄ，Ｃ／Ｄ Ｄ’Ｈ，Ｃ／Ｄ Ｄ’ＨＬ，Ｃ／ Ｄ Ｄ’ＨＫＬ，Ｃ／Ｄ’Ｄ’Ｈ，Ｃ／Ｄ’Ｄ’ＨＬ，Ｃ／Ｄ’Ｄ’ＨＫＬ，Ｃ ／Ｄ Ｃ／Ｄ’Ｄ’Ｈ，Ｃ／Ｄ Ｃ／Ｄ’Ｄ’ＨＬ，またはＣ／Ｄ Ｃ／Ｄ’Ｄ ’ＨＫＬを含む。 本発明は、更に、グリア細胞分裂誘発因子を合成する方法に関し、この方法は 、上記定義の変成ホスト細胞を、本発明のＤＮＡ配列の発現を許容する条件下に おいて培養することから構成される。 本発明のペプチドは、薬用又は獣医用としての薬用調合物質又は獣医療調合物 質の製造に利用可能である。オプションとして、前記調合物質は、許容可能な希 釈液、キャリア又は補形薬との併用で、及び／又は単位投与薬の形態として使用 可能である。 グリア細胞を生体内又は生体外においてグリア細胞分裂誘発物質としての上述 のポリペプチドと接触させるこ とによってグリア細胞の細胞分裂を刺激する方法も本発明の一態様を構成するも のである。有効量の前述のポリペプチドを投与することによって脊椎類（好まし くは哺乳類、更に好ましくはヒト）においてグリア細胞細胞分裂効果を作り出す 方法も本発明の一部である。 前述のポリペプチドを使用して様々な疾病及び障害を治療する方法も本発明の 一部である。例えば、前述のポリペプチドによって、神経疾病又は障害の治療又 は予防方法を行うことができる。更に、前記ポリペプチドに対して敏感であるか 又は反応する種類の細胞における神経系の病態生理学的症状を予防又は治療する 方法も、本発明の一部を構成する。 更に、本発明は、末梢神経の損傷、中枢神経系における神経損傷、神経性障害 、末梢又は中枢神経系における脱髄、シュワン細胞の損傷又は消失、乏突起膠細 胞、小グリア細胞、星状膠細胞に関連する病状の治療方法にも関する。例えば、 知覚神経繊維又は運動神経繊維の神経障害や、神経変成性障害の治療が含まれる 。これらのいずれの場合においても、その治療方法は、有効量の前記ポリペプチ ドを投与する工程から成る。 本発明は、更に、有効量の前記ポリペプチドを投与することによって、神経の 再生及び／又は修復する方法にも関する。そのような薬品は、前記ポリペプチド を薬剤的に有効なキャリアと共に投与することによって得られる。 本発明は、薬品の製造における前記ポリペプチドの使用にも関する。 本発明は、更に、前記定義のポリペプチドの以下に記載するような使用を含む 。 ・選択的に治療又は診断目的に利用可能な抗体を生成するために哺乳動物を免 疫化するのに利用すること。 ・前記ポリペプチドのレセプタ結合特性に対応するレセプタ結合特性を有する 分子を同定したり定量化したりする競合アッセイに利用すること、及び／または 、 ・前記ポリペプチドに特異的に結合可能なレセプタとともにこのポリペプチド にサンプルを接触させて、該ポリペプチドに対する結合の競合阻害を検出する目 的 に利用すること、 ・例えば、アフィニティークロマトグラフィ等のアフィニティー分離プロセス に使用して対応のレセプタを分離するのに利用すること、 本発明は、更に、グリア細胞腫瘍の予防又は治療方法にも関する。この方法は 、前記ペプチドによって定義される因子の結合を抑止する物質の有効量を投与す ることから成る。 更に、本発明は、以下に記載するものをグリア細胞に適用することによってグ リア細胞細胞分裂誘発活性を刺激する方法にも関する、即ち、 ・ＭＤＡ−ＭＢ２３１ヒト胸細胞ラインから分離された３０ｋＤのポリペプチ ド因子、又は ・ラットＩ−ＥＪ形質転換線維芽細胞系からグリア細胞に分離された３５ｋＤ のポリペプチド因子、又は ・ＳＫＢＲ−３ヒト胸細胞系から分離された７５ｋＤ のポリペプチド因子、又は ・ラットＩ−ＥＪ形質転換線維芽細胞系から分離された４４ｋＤのポリペプチ ド因子、又は ・活性化マウス腹膜マクロファージから分離された２５ｋＤのポリペプチド因 子、又は ・ＭＤＡ−ＭＢ２３１ヒト胸細胞から分離された４５ｋＤのポリペプチド因子 、又は ・ＡＴＬ−２ヒトＴ−細胞ラインからグリア細胞に分離された７ないし１４ｋ Ｄのポリペプチド因子、又は ・ウシ腎臓細胞から分離された２５ｋＤのポリペプチド因子、又は ・脳から分離された４２ｋＤのポリペプチド因子（ＡＲＩＡ）。 本発明は、更に、生体内及び生体外でのグリア細胞の細胞分裂誘発の刺激用の 、それぞれ図３８ないし４３において配列認識番号１５４−１５９によって示さ れ ＥＧＦＬ１、ＥＧＦＬ２、ＥＧＦＬ３、ＥＧＦＬ４、ＥＧＦＬ５、ＥＧＦＬ６ポ リペプチドの利用方法にも関する。 本発明には、更に、グリア細胞の細胞分裂誘発を刺激する図４５のその配列を 示すＧＣＦ−ＩＩポリペプチドの投与も含まれる。 本発明の他の一態様は、上記のペプチドをシュワン細胞を刺激し、科学的用途 又は治療用途に採取可能な成長因子を生成させる使用にも関する。 更に、ここに記載のペプチドは、再髄鞘形成が必要な、例えばＭＳ等の疾患の 治療のための、中枢グリア細胞の増殖及び再髄鞘形成誘発に利用することも可能 である。 本発明の更に別の態様において、ここに記載の新規なポリペプチドは、アセチ ルコリンレセプタの合成を刺激するのに利用できる。 上述のように、本発明は、公知の因子とは異なった、ウシやヒトを含むほ乳類 源から得られる新規なグリア成 長因子を提供するものである。これらの因子は、胎児子ウシプラズマ（ＦＣＰ） をバックグラウンドとして、シュワン細胞に対して細胞分裂誘発活性を有する。 本発明は、更に、これらの因子の調合方法と、これら及びその他の因子の活性を 定義する改良方法も提供するものである。これら因子の治療への適用も本発明の 重要な一態様である。 従って、本発明の重要な特徴は以下の通りである。 （ａ）胎児子ウシプラズマの存在下においてグリア細胞分裂誘発活性、特に、 シュワン細胞分裂誘発活性を有し、分子量が約３０ｋＤないし約３６ｋＤの範囲 で、そのアミノ酸配列内に、以下に記載のペプチド配列の一つ又は複数を有する 基礎（ベーシック）ポリペプチド因子、 ＦＫＧＤＡＨＴＥ ＡＳＬＡＤＥＹＥＹＭＸＫ ＴＥＴＳＳＳＧＬＸＬＫ ＡＳＬＡＤＥＹＥＹＭＲＫ ＡＧＹＦＡＥＸＡＲ ＴＴＥＭＡＳＥＱＧＡ ＡＫＥＡＬＡＡＬＫ ＦＶＬＱＡＫＫ ＥＴＱＰＤＰＧＱＩＬＫＫＶＰＭＶＩＧＡＹＴ ＥＹＫＣＬＫＦＫＷＦＫＫＡＴＶＭ ＥＸＫＦＹＶＰ ＫＬＥＦＬＸＡＫ、及び （ｂ）胎児子ウシプラズマの存在下において、グリア細胞の細胞分裂誘発、特 に、シュワン細胞の分裂誘発を刺激する基礎ポリペプチド因子であって、分子量 が約５５ｋＤないし約６３ｋＤの範囲であり、そのアミノ酸配列内において以下 のペプチド配列のうちの一つ又は複数のものを含む、 ＶＨＱＶＷＡＡＫ ＹＩＦＦＭＥＰＥＡＸＳＳＧ ＬＧＡＷＧＰＰＡＦＰＶＸＹ ＷＦＶＶＩＥＧＫ ＡＳＰＶＳＶＧＳＶＱＥＬＱＲ ＶＣＬＬＴＶＡＡＬＰＰＴ ＫＶＨＱＶＷＡＡＫ ＫＡＳＬＡＤＳＧＥＹＭＸＫ ＤＬＬＬＸＶ ＥＧＫＶＨＰＱＲＲＧＡＬＤＲＫ ＰＳＣＧＲＬＫＥＤＳＲＹＩＦＦＭＥ ＥＬＮＲＫＮＫＰＱＮＩＫＩＱＫＫ 分子量が小さなポリペプチド因子と、分子量が大きなポリペプチド因子とから 得られる上記の新規なペプチド配列も、それ自身本発明の権利の一部を構成する ものである。これらの配列は、本発明のポリペプチド因子について、広範囲の様 々な種からこのような因子（又は対応の遺伝子配列）を調査し、分離し、あるい は合成し、又は、このような因子を遺伝子組替え技術によって合成するためのプ ローブ源として有用であり、更には、対応する抗体、好ましくはモノクローナル 抗体、であってそれ自身が有用な研究手段であり、また治療物質としての可能性 も有する抗体の、従来技術による合成にも有用である。本発明は、更に、本発明 の新規なペプチド配列のための前記の方法によって得られる、遺伝子配列又はそ のフラグメントをコード化する分離グリア細胞細胞分裂誘発活性にも関する。 本発明における高度に精製された因子から得られる短いペプチドの使用により 、更に別の配列も特定することが可能になった（下記の例参照）。 従って、本発明は、更に、グリア細胞細胞分裂誘発活性を有し、以下に記載す るＤＮＡ配列によってコード化されるアミノ酸配列を備えたポリペプチド因子も 含む。 即ち、 （ａ）図２８ａ，２８ｂ又は２８ｃのいずれかにおいてそれぞれ配列識別番号 １３３−１３５で示されるＤＮＡ配列、 （ｂ）図２２において、配列識別番号８９によって示されるＤＮＡ配列、 （ｃ）図２８ａにおいて配列識別番号１３３によって示される配列のヌクレオ チド２８１−５５７によって表されるＤＮＡ配列、 （ｄ）前記（ａ），（ｂ）又は（ｃ）によって、いずれかのＤＮＡとハイブリ ッド可能なＤＮＡ配列。 本発明は、更に、上述の配列に対して６０％以上、好ましくは８０％以上の相 同同一性を有する配列を含む。 本発明は、特定のハイブリッド形成条件に限定されるものではないが、以下の 実験記録は、便宜的に従われるガイダンスを提供するものである。 ＤＮＡプローブは、ショワルター（Ｓｃｈｏｗａｌｔｅｒ）及びゾマー（Ｓｏ ｍｍｅｒ）（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１７７：９０−９４，１９８９）に 従い、ニックトランスレーションあるいはＰＣＲ反応によって、高比活性（約１ ０⁸ないし１０^{9 32}Ｐｄｍｐ／μｇ）に標識化して、Ｇ−１５０セファーデック ス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）カラムでの脱塩によって精製できる。プローブは、変性 し（沸騰水中で１０分間、その後、冷水に漬ける）、次に、１０⁶ｄｐｍ³²Ｐ／ ｍｌにて１０％の硫酸デキストランを含有する８０％のバッファＢ（ポリビニル ピロリジン２ｇ、Ｆｉｃｏｌｌ−４００ ２ｇ，ウシ血清アルブミン２ｇ，ＩＭ Ｔｒｉｓ ＨＣＬ（ｐｈ７．５）５０ｍｌ，ＮａＣｌ ５８ｇ，ピロ燐酸塩ナ トリウム１ｇ、ドデシル硫酸ナトリウム１０ｇ、Ｈ₂Ｏ ９５０ｍｌ）のハイブ リッド化溶液に加え、６０℃で一晩（約１６時 間）培養することができる。次に、前記フィルタを、６０℃にて、先ず、バッフ ァＢ中で１５分間、次に、２Ｘ ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で２０分間洗浄を３ 回、ＩＸ ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中での２０分間の洗浄を１回行うことによっ て洗浄することができる。 その他の態様において、本発明は、以下記載のものを提供する、 （ａ）ウシ下垂体物質から得られた場合には、還元状態であるか否かに関わら ず、下記の分子量標準を使用したＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動におい て、約３０ｋＤないし約３６ｋＤの分子量が観察される基礎ポリペプチド因子： リゾチーム（鶏卵白） １４，４００ 大豆トリプシン インヒビター ２１，５００ カルボニック アンヒドラーゼ（ウシ） ３１，０００ 卵白アルブミン（鶏卵白） ４５，０００ ウシ血清アルブミン ６６，２００ フォスフォリラーゼ Ｂ（ラビット筋肉） ９７，４００ そして当該因子は、胎児子ウシプラズマの存在下において、ラットシュワン細胞 の分裂を含むグリア細胞分裂誘発活性を有し、逆相ＨＰＬＣを使用して分離した 場合、４℃で０．１％のトリフルオロ酢酸中での１０週間の培養後においてその 活性の少なくとも５０％を保持する。そして、 （ｂ）ウシ下垂体物質から得られた場合に、非還元状態において、下記の分子 量標準を使用したＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動において、約５５ｋＤ ないし約６３ｋＤの分子量が観察される基礎ポリペプチド因子： リゾチーム（鶏卵白） １４，４００ 大豆トリプシン インヒビター ２１，５００ カルボニック アンヒドラーゼ（ウシ） ３１，０００ 卵白アルブミン（鶏卵白） ４５，０００ ウシ血清アルブミン ６６，２００ フォスフォリラーゼ Ｂ（ラビット筋肉） ９７，４００ そして当該因子のヒトの等価物質は、ここに記載のＤＮＡクローンＧＧＦ２ＨＢ Ｓ５によってコード化され、また 該因子は、胎児子ウシプラズマの存在下において、ラットシュワン細胞の分裂を 含むグリア細胞分裂誘発活性を有し、逆相ＨＰＬＣを使用して分離した場合、４ ℃で０．１％のトリフルオロ酢酸中での１０週間の培養後においてその活性の少 なくとも５０％を保持する。 尚、便宜上、本発明の低い分子量の因子と高い分子量の因子とを、それぞれ、 ”ＧＧＦ−Ｉ”、”ＧＧＦ−ＩＩ”と称する。前記ＧＧＦ−ＩＩという表示は、 ＧＧＦ−ＩＩタンパク質由来のペプチド配列データで分離されたすべてのクロー ン（即ち、ＧＧＦ２ＨＢＳ５，ＧＧＦ２ＢＰＰ３）に使用される。 尚、前述の分子量範囲は、正確なものではなく、特定のポリペプチド因子のソ ースによって僅かに変化するものである。たとえば、別のソースからの物質にお いて約１０％の変化は不可能であろう。 本発明の別の重要な特徴は、グリア細胞細胞分裂誘発活性を有するポリペプチ ドをコード化するＤＮＡ配列であって、以下のＤＮＡ配列である、 （ａ）図２８ａ，２８ｂ又は２８ｃのいずれかにおいてそれぞれ配列識別番号 １３３−１３５で示されるＤＮＡ配列、 （ｂ）図２２において、配列識別番号８９によって示されるＤＮＡ配列、 （ｃ）図２８ａにおいて配列識別番号１３３によって示される配列のヌクレオ チド２８１−５５７によって表されるＤＮＡ配列、 （ｄ）前記（ａ），（ｂ）又は（ｃ）により、他のＤＮＡとハイブリッド可能 なＤＮＡ配列。 本発明の別の態様は、グリア細胞因子とｐ１８５^erbB2リガンドタンパク質と が前記同じ遺伝子によってコード化されるという事実を利用するものである。こ の遺伝子から様々なメッセンジャＲＮＡスプライシング変異体が由来し、これら の生成物質の多くが、ｐ１８５^erbB2結合及び活性を示す。前記（ＧＧＦ−ＩＩ ）遺伝子生成物のいくつかを使用して、シュワン細胞細胞分裂誘発活性が示され た。本発明は、前記ＧＧＦ／ｐ１８５^erbB2リ ガンド遺伝子のすべて公知の生成物（前記参考文献に記載されている）のシュワ ン細胞細胞分裂誘発物質としの利用を提供するものである。 本発明は、更に、その他のこれまで自然には分離されていないグリア成長因子 遺伝子のスプライシング変異体にも関する。図３０は、ポリメラーゼ連鎖反応実 験（逆転写ＲＮＡにおける）とｃＤＮＡクローン（ここに記載）の分析、更に、 ｐ１８５^erbB2リガンドをコード化する配列として公開されているもの（ペレス （Ｐｅｌｅｓ）他，Ｃｅｌｌ ６９：２０５（１９９２）及びウェン（Ｗｅｎｎ ）他，Ｃｅｌｌ ６９：５５９（１９９２））からのスプライシングの公知のパ ターンを示している。これらのパターンは、ここに記載のその他のパターンとと もに、存在する可能なスプライシング変異体を表すものである。従って、本発明 の別の態様は、この遺伝子から由来の新規なタンパク質因子をコード化するヌク レオチド配列に関する。本発明は、更に、これらの因子の合成方法にも関する。 これらの新規な因子の治療への適用も本発明の更に別の態様を構成するものであ る。 従って、本発明の他の重要な特徴は以下の通りである、 （ａ）シュワン細胞の分裂の刺激を含むグリア細胞細胞分裂誘発活性を有する 一連のヒト及びウシポリペプチド因子。これらのポリペプチド配列は、図３１， ３２，３３及び３４において、それぞれ配列識別番号１３６−１３７として示さ れている。 （ｂ）シュワン細胞の分裂の刺激を含むグリア細胞細胞分裂誘発活性を有する 一連のポリペプチド因子であって、以下の記載概要に基づいて精製され、特徴付 けられるもの、即ち、ルプ（Ｌｕｐｕ）他，Ｓｃｌｅｎｃｅ ２４９：１５５２ （１９９０）；ルプ（Ｌｕｐｕ）他，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ ８９：２２８７（１９９２）；ホルムズ（Ｈｏｌｍｅｓ）他，Ｓｃｉｅ ｎｃｅ ２５６：１２０５（１９９２）；ペレス（Ｐｅｌｅｓ）他，６９：２０ ５（１９９２）；ヤーデン（Ｙａｒｄｅｎ）およびペレス（Ｐｅｌｅｓ），Ｂｉ ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０：３５４３（１９９１）；ドバシ（Ｄｏｂａｓｈｉ ）他，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８８：８５８２（１９９１）； デイヴィス（Ｄａｖｉｓ）他，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ． Ｃｏｍｍｕｎ．１７９：１５３６（１９９１）；ビューモント（Ｂｅａｕｍｏｎ ｔ）他，特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９１／０３４４３（１９９０）；グリーン（Ｇｒ ｅｅｎ）他，特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９１／０２３３１（１９９０）、アスディン （Ｕｓｄｉｎ）およびフィッシュバック（Ｆｉｓｃｈｂａｃｈ），Ｊ．Ｃｅｌｌ ．Ｂｉｏｌ．１０３：４９３−５０７（１９８６）；フォールズ（Ｆａｌｌｓ） 他，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ． Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏ ｌ．５５：３９７−４０６（１９９０）；ハリス（Ｈａｒｒｉｓ）他，Ｐｒｏｃ ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：７６６４−７６６８（１９９１ ）；及びフォールズ（Ｆａｌｌｓ）他，Ｃｅｌｌ ７２：８０１−８１５（１９ ９３）。 （ｃ）シュワン細胞の分裂の刺激を含むグリア細胞細胞分裂誘発活性を有する ポリペプチド因子（ＧＧＦＢＰＰ５）。そのアミノ酸配列は、図３２において配 列認識番号１４８によって示され、図３２において配列認識番号１４８によって 示されるウシＤＮＡ配列によってコード化される。 上述の新規なヒトペプチド配列は、図３１，３２，３３，３４において、それ ぞれ配列認識番号１３６−１５０として示され、これらは、天然ソース（適当な 繊維組織から得られるｃＤＮＡライブラリ）からの完全長の相補性ＤＮＡ（ｃＤ ＮＡ）として分離可能であり、あるいは、当業者によって、個々のエクソン（例 えば、分離エクソンとして得られる）とのＤＮＡ構造物として組立可能である。 ｐ１８５^erbB2レセプタに特異的に結合する他の化合物、特に、ペプチドも、 本発明においては、グリア細胞細胞分裂誘発物質として利用可能である。候補化 合物は、ｐ１８５^erbB2結合によりルーチン的にスクリーニングすることが出来 、もしも結合する場合には、ここに記載の方法を使用してグリア細胞細胞分裂誘 発活性のスクリーニングを行うことができる。 本発明は、活性が大幅に減少したものでない、上記ポリペプチド因子のすべて の変成物質及び等価物質も含む。例えば、その活性に大きな悪影響を与えること なくアミノ酸内容又は配列を変化させた変形物質が含まれる。例として、天然タ ンパク質のＥＰ−Ａ１０９７４８に於け る突然変異が開示され、ここでは、生物学的反応には必要の無い該天然の配列中 のシステインを中性アミノ酸に置換することによって、不要な二硫化物結合の可 能性を避けている。従ってここに含まれる効果及び使用方法の記載は、このよう な変形物質及び同等物質の効果及び使用方法をも含むものであると理解される。 本発明の新規な配列は、組替え技術の利点を新たに開くものである。従って、 本発明は、以下の態様を含む。 （ａ）前記構築物による形質転換後の選択されたホスト細胞のベクター（前記 配列の発現を許容すべく制御配列に対して位置決めされている）内の作動読み取 り枠に於ける前述のＤＮＡ配列からなるＤＮＡ構築物（好ましくは、前記制御配 列は、例えばＴｒｐ等の調節可能プロモータを有している）。尚、プロモータと 調節配列（あるとすれば）の選択は当業者に於ける選択事項である。 （ｂ）前記ＤＮＡ配列が前記ホスト細胞において発現できるように上記（ａ） に定義された構築物を組 ストの選択は重要でなく、選択される細胞は、原核生物あるいは真核生物のいず れであってもよく、公知の方法によって遺伝子的に変形して前記構築物を組み込 むことが可能である。そして （ｃ）ＤＮＡ配列の発現を許容する条件下において、変成されたホスト細胞を 培養することからなる上記因子の合成方法。前記条件は、ＤＮＡ組替え技術の当 業者によって実施態様に応じて容易に決定することが可能である。本発明は、こ の手段によって合成されたグリア細胞細胞分裂誘発物質を含む。 該技術において記載されているいずれの因子も、本発明の新規なポリペプチド 因子が有する組合せの特性を有していない。 前述したように、本発明の因子を特徴付けるシュワン細胞分析は、バックグラ ンドとして胎児子ウシプラズマを使用する。その他すべての点においては、この 分析は、ブロックス（Ｂｒｏｃｋｅｓ）他，ｉｎ Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．，ｓｕｐ ｒａと同じであってよいが、但し、 １０％のＦＣＳを１０％のＦＣＰで置き換える。この分析技術の違いは重要であ る。というのは、胎児子ウシプラズマにおいて血清由来の因子が不在にであるこ とによって（血清に対抗するように）、その他のいくつかの因子からの疑似効果 を除去することにより、シュワン細胞に於ける活性を厳密に定義することが可能 になるからである。 本発明は、更に、上述のポリペプチドを調製する方法を含み、該方法は、タン パク質を得るために脊椎類の脳物質を抽出し、この抽出物をハイドロキシアパタ イトＨＰＬＣによってクロマトグラフィ精製し、次に、これらのフラクションを ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけることよりなる。約３０ｋＤの 分子量が観察されたフラクション及び／又は約５５ｋＤないし６３ｋＤの分子量 が観察されたフラクションを採取する。いずれの場合においても、このフラクシ ョンを、下記の分子量標準を使用してＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動 にかける。 リゾチーム（鶏卵白） １４，４００ 大豆トリプシン インヒビター ２１，５００ カルボニックアンヒドラーゼ（ウシ） ３１，０００ 卵アルブミン（鶏卵白） ４５，０００ ウシ血清アルブミン ６６，２００ フォスフォリラーゼ Ｂ（ラビット筋肉） ９７，４００ 分子量の小さなフラクションの場合には、前記ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲ ルを、非還元条件下、あるいは還元条件下のいずれかでランさせ、分子量の大き なフラクションの場合には、該ゲルを非還元条件下でランさせる。次に、これら のフラクションの、胎児子ウシプラズマのバックグラウンド下でラットシュワン 細胞の分裂を刺激する活性についてテストする。 好ましくは、上記方法は、例えば、ウシ下垂体物質からのカルボキシルメチル セルロースクロマトグラフィによって得られた関連フラクションを分離すること によって始める。又、好ましくは、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動の 前に、ハイドロキシアパタイトＨＰＬＣ、陽イオン交換クロマトグラフィ、ゲル 濾過、及び／または逆相ＨＰＬＣを使用する。この方法の各段階において、 ブロックス（Ｂｒｏｃｋｅｓ）ｉｎ Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．，ｓｕｐｒａに一般的 手段として記載されている分析、但し、１０％ＦＣＰを１０％ＦＣＳに代えた分 析、により、放射性ヨウ化デオキシウリジンを標準として組み入れシュワン細胞 を使用することによって活性を測定することができる。 従って、本発明は、更に、分析対象の物質によって刺激された（もしあれば） グリア細胞におけるＤＮＡ合成を評価することに対して、バックグランドとして 胎児子ウシプラズマを使用するグリア細胞細胞分裂誘発活性の分析方法を含む。 本発明の更に別の態様は、オプションとして、許容可能な希釈液、キャリア又 は補形薬との併用で、及び／又は単位投与として使用される、薬用又は獣医用と して調合された前述のすべての因子からなる薬用又は獣医療用調合物質に関する 。本発明の因子の使用においては、適当な調合又は組成を提供するべく従来の薬 学的又は獣医学的慣用手段を利用することが出来る。 従って、本発明は、例えば、静脈内、皮下内、筋肉内、 眼窩内、眼用、心室内、頭蓋内、嚢内、髄腔内 槽内、腹膜内、鼻腔内、噴霧状 、乱切の各投与そして又、経口、口内、直腸、又は膣への投与等の非経口投与法 に適用可能である。 本発明の調合物は、更に、本発明のＤＮＡを発現するホスト細胞の患者への移 植、あるいはこれら調合物を放出する外科移植によって投与することも可能であ る。 非経口調合物の形態は、溶液や懸濁液であってよく、又、経口投与調合物の形 態は、錠剤、カプセル等であり、鼻腔内投与調合物の形態は、粉末、鼻腔点滴薬 、エアロゾル等とすることができる。 公知の調合方法は、例えば、”Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕ ｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”に記載されている。非経口投与用調合物は、補 形薬として、例えば、滅菌した水または塩水、ポリエチレングリコール等のポリ アルキレングリコール、植物性オイル、水素化ナフタレン、生物学的適合性、生 物分解性ラクチドポリマ、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンコポリマ ー等を使用して本発明の因子の放出を調節すること が可能である。他のこれら因子の非経口投与システムとして可能なものとしては 、エチレン−ビニルアセテートコポリマー粒子、浸透ポンプ、移植可能注入シス テムやリポソーム等がある。吸引用の調合物は、補形薬として、例えば、ラクト ースを含有することが可能であり、又は、例えば、ポリオキシエチレン−９−ラ ウリルエーテル、グリココール酸塩やデオキシコール酸塩等を含有する水溶液に したり、鼻腔点滴液投与用としては油性溶液としたり、あるいは、ゲル状にした りすることができる。非経口投与用調合物としては、更に、口内投与用にはグリ ココール酸塩、直腸投与にはメトキシサリチル酸塩、または膣投与用にはクエン 酸等がある。 本発明の因子は、単独の活性薬剤として使用したり、あるいは他の活性成分、 例えば、神経疾患における神経生存を容易にする他の成長因子や、ペプチダーゼ 又はプロテアーゼインヒビタ等と組み合わせて使用することができる。 本発明の調合物における本発明の因子の濃度は、投与される量な投与経路等の 多くの要因に応じて変化する。 一般に、本発明の因子は、非経口投与用としては水性生理バッファ溶液中に約 ０．１ないし１０％ｗ／ｖ化合物を入れて提供することができる。一般的な投与 量は、体重当り、一日につき、約１ｍｇ／ｋｇないし約１ｇ／ｋｇの範囲である 。好ましい投与量範囲は、体重当り、一日につき、約０．０１ｍｇ／ｋｇないし １００ｍｇ／ｋｇである。この好ましい投与量は、治療対象の病理状態の種類と 程度、患者の全体的健康状態、調合物の形態及び投与経路によって異なったもの になる。 前述のように、シュワン細胞（末梢神経系のグリア細胞）は、本発明の因子が 存在することによって刺激され分裂する。末梢神経のシュワン細胞は、ニューロ ンの支持と、個々の神経線維の周りの髄鞘（ミエリン鞘）の形成に関連している 。この鞘は、筋肉への電気パルスと知覚レセプタからの電気パルスの適当な伝達 にとって重要である。 一次的又は二次的にシュワン細胞と神経線維が損傷を受ける数多くの種類の末 梢神経障害が存在する。又、知覚神経と運動神経の双方の神経障害も数多くのも のがある（アダムズ（Ａｄａｍｓ）およびヴィクター （Ｖｉｃｔｏｒ），Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ）。これ らの神経障害のなかで最も重要なものは、恐らく、糖尿病、多発性硬化症、Ｌａ ｎｄｒｙ−Ｇｕｉｌｌｉａｎ−Ｂａｒｒ症候群、腫瘍によって発生する神経障害 、及び毒物によって生じる神経障害（これらの内のいくつかは腫瘍の治療に利用 される）である。 しかしながら、本発明は、神経システムの損傷が、例えば、感染又は怪我等い かなる原因によって生じた場合においても使用できる治療方法と予防方法とを提 供するものである。従って、脱髄又はシュワン細胞の損失が存在する神経システ ムの障害又疾患の治療において本発明の因子を使用することに加えて、これらの グリア細胞成長因子は、末梢神経に対する損傷によって生じた神経系の障害の治 療においても有効である。末梢神経に対する損傷の後、シュワン細胞の成長又は 再形成によって再生プロセスが誘発され、その後、神経線維がその目標に向かっ て再成長する。シュワン細胞の分裂を加速することによって、損傷後の再生プロ セスを促進することができる。 中枢神経系（脳及び脊髄）の損傷又は神経退化疾患の治療にも類似の方法を使 用することができる。 更に、様々なグリア細胞の腫瘍があるが、それらの内で最も一般的なものは、 恐らく、神経線維腫であり、これはグリア細胞の過剰成長によって生じる斑状小 腫瘍である。又、いくつかのシュワン細胞腫瘍においてＧＧＦに非常に類似した 活性物質が見られることも知られており、従って、それらのレセプタに対する本 発明のインヒビタ活動によってグリア腫瘍を治療することが出来、これは前述よ うに、因子のレセプタへの結合を阻害するのに有効量の物質を投与することから なる。 一般に、本発明は、因子−敏感性又は因子−反応性細胞が関連する神経系の病 態生理学的症状の予防又は治療に本発明のポリペプチド因子を使用することを含 む。 本発明のポリペプチド因子は、更に、標準的技術に従って、モノクローナル抗 体等の抗体を作る免疫源としても利用可能である。このような抗体も本発明の範 囲に含まれる。又、これらの抗体を、治療や診断の目的の為に利用することも可 能である。従って、恐らく因子が異常 なレベルであることに関連する状態を、このような抗体を利用して追求すること ができる。標準的方法により単離されたサンプルの分析を利用し、生体外技術が 使用できる。又、腫瘍画像化技術を利用して抗体を、例えば、放射性アイソトー プで標識化し、体外から画像化できる画像化方法も、使用可能である。 本発明は、更に、前記因子を生体内（in vivo）又は生体外（in vitro）でグ リア細胞細胞分裂誘発物質として使用することと、そのような用途としての因子 とを含む。従って一つの具体的実施例は、有効量の本発明の因子を投与すること によって、脊椎類においてグリア細胞細胞分裂誘発効果を生成する方法に関する 。そのような方法の好適な実施例は、神経システム疾患又は障害の治療方法又は 予防方法である。 本発明の更に別の態様は、本発明の因子を、薬品の製造、好ましくは、神経疾 患又は障害、あるいは神経再生又は修復のための薬品の製造に使用することであ る。 更に、本発明は、本発明の因子の、前記ポリペプチドに対応のレセプタ結合特 性を有する分子を同定、あるい は定量する競合アッセイへの利用も含む。これらのポリペプチドは、ラジアイソ トープによって標識化してもよい。競合アッセイは、関連するレセプタの拮抗薬 と作用薬の両方を同定することができる。 別の態様において、本発明は、それぞれの対応レセプタを分離するために、例 えばアフィニティークロマトグラフィ等のアフィニティー分離プロセスにおける 本発明の因子の使用を提供する。このような特定のタンパク質に対応するレセプ タの分離のためのプロセスは、当該技術において公知であり、本発明の因子にお いても数多くの技術が適用可能である。例えば、ＩＬ−６とＩＦＮとに関して、 ノヴィック，ディ（Ｎｏｖｉｃｋ，Ｄ．）他，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．（１ ９９０）５１０：３３１−７が挙げられる。ゴナドトロピン放出ホルモンに関し ては文献は以下のものである：ハザム，イー（Ｈａｚｕｍ，Ｅ．），Ｊ．Ｃｈｒ ｏｍａｔｏｇｒ．（１９９０）５１０：２３３−８。またＧ−ＣＳＦに関しては 、フクナガ，アール（Ｆｕｋｕｎａｇａ，Ｒ．）他，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ，２６５：１３３８６−９０がある。ＩＬ−２に関しては、スマート，ジェイ， イー（Ｓｍａｒｔ，Ｊ．Ｅ．）他，（１９９０）Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ． Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，９４：１５８Ｓ−１６３Ｓがあり、ヒトＩＦＮ−ガンマに 関しては、ステファノス，エス（Ｓｔｅｆａｎｏｓ，Ｓ．）他，（１９８９）Ｊ ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｒｅｓ．，９：７１９−３０がある。 図面の簡単な説明 先ず、図面について説明する。 図面 図１ないし８は例１に関し、これらについて簡単に説明する。 図１は、カルボキシルメチルセルロースクロマトグラフィからの生成物のプロ フィール、 図２は、ハイドロキシアパタイトＨＰＬＣからの生成物のプロフィール、 図３は、モノ Ｓ ＦＰＬＣからの生成物のプロフィール、 図４は、ゲル濾過処理ＦＰＬＣの生成物のプロフィール、 図５及び６は、逆相ＨＰＬＣからの二つの部分的に精製されたポリペプチド生 成物のプロフィールを示す、 図７及び８は、胎児子ウシ血清又は胎児子ウシプラズマのバックグランドを使 用した逆相ＨＰＬＣからのＧＣＦ−ＩＩ及びＧＣＦ−ＩＩの投与量−反応曲線を 示す、 図９ないし１２は、ＧＣＦ−ＩとＧＣＦ−ＩＩ，配列認識番号１−２０，２２ −２９，３２−５３及び１６９から由来のペプチド配列を示し（後記の例２参照 ）、図１０及び１２は、特に、新規な配列を示す、 図１０において、パネルＡは、退化オリゴヌクレオチドプローブと退化ＰＣＲ プライマとを構成するのに使用するＧＣＦ−Ｉペプチドの配列がリストされてい る（配列認識番号２０，１，２２−２９及び１７）。パネルＡのこれらの配列の 内のいくつかは、合成ペプチドの構成にも使用された。パネルＢは、退化プロー ブと退化ＰＣＲプライマの構成には短すぎた（６アミノ酸以下）新規な ペプチドの配列のリストである（配列認識番号１７及び５２）、 図１２において、パネルＡは、退化オリゴヌクレオチドプローブと退化ＰＣＲ プライマとを構成するのに使用するＧＣＦ−ＩＩペプチドの配列がリストされて いる（配列認識番号４５−５２）。パネルＡのこれらの配列の内のいくつかは、 合成ペプチドの構成に使用された。パネルＢは、退化プローブと退化ＰＣＲプラ イマの構成には短すぎた（６アミノ酸以下）新規なペプチドの配列のリストであ る（配列認識番号５３）、 図１３ないし２０は後記の例３に関し、本発明の因子の細胞分裂誘発活性を示 し、 図２１ないし２８（ａ，ｂ及びｃ）は後記の例４に関し、これらについて以下 簡単に説明する、 図２１は、図１０のパネルＡ及び図１２のパネルＡに示された新規なペプチド 配列から構成された退化オリゴヌクレオチド（配列認識番号５４−８８）のリス トである、 図２２（配列認識番号８９）は、退化オリゴヌクレオチドプローブ６０９，６ ５０（それぞれ図２１，配列認識番号６９及び７２参照）の結合サイトを含有す る組替えウシゲノムファーゼＧＣＦ２ＢＧ１からの推定ゲノムファーゼＧＧＦ２ ＢＧ１のストレッチを示す。同図は、ＤＮＡ配列のコード化ストランドと第３読 み取り枠の推定されたアミノ酸配列である。因子２（太字）からのペプチド１２ の配列は、６６アミノ酸転写解読枠（ヌクレオチド７５２７２）の一部である、 図２３は、後部下垂体からのＲＮＡに存在するウシＧＧＦ−ＩＩコード下配列 のセグメントを分離する実験に使用された退化ＰＣＲプライマ（パネルＡ，配列 認識番号９０−１０８）とユニークなＰＣＲプライマ（パネルＢ，配列認識番号 １０９−１１９）である、 図２４は、図７のパネルＡ，Ｂのプライマのリストを使用したＰＣＲ増幅実験 において得られた９つの別々の隣接したウシＧＧＦ−ＩＩ ｃＤＮＡ構造体と配 列、及び後部下垂体からのＲＮＡを示す。同図の最上ラインは、特徴付けられた ｃＤＮＡ構造体に寄与するコード化配列の略図である、 図２５は、ＧＧＦ２ＢＧ１のウシ組替えファーゼの物理的地図である。前記ウ シフラグメントは、長さが約２０ｋｂであり、ウシＧＧＦ−ＩＩ遺伝子の二つの エクソン（太字）を有している。酵素Ｘｂａｌ，ＳｐｅＩ，Ｎｄｅｌ，ＥｃｏＲ Ｉ，Ｋｐｎｌ，ＳｓｔＩの制限サイトがこの物理的地図上に示されている。斜線 部分は、配列のためにサブクローンされたフラグメントに対応する、 図２６は、前記推定ウシＧＧＦ−ＩＩ遺伝子の三つの別の遺伝子生成物の構造 の略図である。エクソンはその発見の順番にＡないしＥとしてリストされている 。別のスプライシングパターン１，２及び３は、三つのオーバラップする推定タ ンパク質構造体（ＧＧＦ２ＢＰＰ１，２，３）を生成し、これらはそれぞれ別の 図２８ａ，ｂ，ｃ（下記）に示されている、 図２７（配列認識番号１２０−１３２）は、図２８ａ，２８ｂ，２８ｃ（下記 ）に示された推定タンパク質配列において同定されたＧＧＦ−Ｉ及びＧＧＦ−Ｉ Ｉと、図１０及び１２にリストされた新規なペプチド配列との比較である。同図 は、９つの新規なＧＧＦ−ＩＩペプチド配列の内の６つが、これらの推定タンパ ク質配列に見ら れることを示している。ＧＧＦ−Ｉ配列に類似の二つのペプチド配列も見られる 、 図２８ａ（配列認識番号１３３）は、図２６のスプライシングパターンＮｏ． １から得られるコード化トスランドＤＮＡと推定アミノ酸配列のリストである。 前記推定ウシＧＧＦ−ＩＩ遺伝子のこの部分ｃＤＮＡは、２０６アミノ酸のタン パク質をコード化する。太字のペプチドは、図１０及び１２に示したリストから 同定されたペプチドである。潜在的グリコシル化サイトがアンダーラインされて いる（ポリアデニル化信号ＡＡＴＡＡＡとともに）。 図２８ｂ（配列認識番号１３４）は、図２６のスプライシングパターンＮｏ． ２から得られるコード化トスランドＤＮＡと推定アミノ酸配列のリストである。 前記推定ウシＧＧＦ−ＩＩ遺伝子のこの部分ｃＤＮＡは、２８１アミノ酸のタン パク質をコード化する。太字のペプチドは、図１０及び１２に示したリストから 同定されたペプチドである。潜在的グリコシル化サイトがアンダーラインされて いる（ポリアデニル化信号ＡＡＴＡＡＡとともに）。 図２８ｃ（配列認識番号１３５）は、図２６のスプライシングパターンＮｏ． ３から得られるコード化トスランドＤＮＡと推定アミノ酸配列のリストである。 前記推定ウシＧＧＦ−ＩＩ遺伝子のこの部分ｃＤＮＡは、２５７アミノ酸のタン パク質をコード化する。太字のペプチドは、図１０及び１２に示したリストから 同定されたペプチドである。潜在的グリコシル化サイトがアンダーラインされて いる（ポリアデニル化信号ＡＡＴＡＡＡとともに）。 図２９は、下記の例６に関し、サザンブロット上の様々なほ乳類ＤＮＡに対す る推定ウシＧＧＦ−ＩＩ遺伝子配列のクロスハイブリッド化分析のオートラジオ グラムである。前記フィルタは、同図にリストされた種からのＥｃｏＲＩ−消化 ＤＮＡ（各レーンにつき５μｇ）を含有する。前記プローブは、図２５の物理的 地図によって予測されるウシＤＮＡの４キロベースのフラグメントを含んで、各 ＤＮＡサンプルにおける単一の強力なバンドを検出する。より力の小さいバンド も観察され、これらは関連ＤＮＡ配列を示す。他のほ乳類ＤＮＡサンプルからの 強いハイブリッド化バンドは、これらの種のＧＧＦ−ＩＩ相同体を示すものと考 えられる。 図３０は、さまざまなスプライシング変異体を示す図である。コード化セグメ ントは、Ｆ，Ｅ，Ｂ，Ａ，Ｇ，Ｃ，Ｃ／Ｄ，Ｃ／Ｄ’，Ｄ，Ｄ’，Ｈ，Ｋ及びＬ によって示されている。精製タンパク質からのペプチド配列の位置は、”０”に よって示されている。 図３１（配列認識番号１３６−１４７，１６０，１６１）はＧＧＦのコード化 セグメントのＤＮＡ配列と予想ペプチド配列のリストである。ライン１は、ウシ ＧＧＦの予想アミノ酸配列のリストであり、ライン２は、ウシＧＧＦのヌクレオ チド配列のリストであり、ライン３は、ヒトＧＧＦ（ヘレグリン）のヌクレオチ ド配列のリストであり（ヌクレオチドベースのマッチングは縦線にて示してある ）、ライン４は、前記予想ウシ配列とは異なる場合におけるヒトＧＧＦ／ｈｅｒ ｅｇｕｌｉｎの予想アミノ酸配列のリストである。コード化セグメントＥ、Ａ’ 及びＫは、ウシ配列のみを表す。コード化セグメントＤ’は、ヒト（ヘレグリン ）配列のみを表す。 図３２（配列認識番号１４８）は、ＢＰＰ５の予想ＧＧＦ２アミノ酸配列とヌ クレオチド配列である。上方ラインは、ヌクレオチド配列であり、下方ラインは 、予 想アミノ酸配列である。 図３３（配列認識番号１４９）は、ＧＧＦ２ＢＰＰ２の予想アミノ酸配列とヌ クレオチド配列である。上方ラインは、ヌクレオチド配列であり、下方ラインは 、予想アミノ酸配列である。 図３４（配列認識番号１５０）は、ＧＧＦ２ＢＰＰ４の予想アミノ酸配列とヌ クレオチド配列である。上方ラインは、ヌクレオチド配列であり、下方ラインは 、予想アミノ酸配列である。 図３５（配列認識番号１５１−１５２）は、二つのＧＧＦペプチド配列（ＧＧ Ｆ２ｐｐ４とＧＧＦ２ｐｐ５）のヒトＥＧＦ（ｈＥＧＦ）との整合を示す。星印 は、保存されたシステインを示す。 図３６は、ＧＧＦの増加に対する、約２００ｋＤ（アンチ燐酸化ポリクローナ ル抗体とともに現像したウエスタンブロット上における２００ｋＤバンドの強度 ）のタンパク質のＧＧＦ活性のレベル（シュワン細胞細胞分裂誘発分析）と、チ ロシン燐酸化を示す。 図３７は、図３１の配列からのスプライシング変異体のリスト、 図３８は、ＥＧＦＬ１（配列認識番号１５４）の、予想アミノ酸配列を下部に 、核酸配列を上部に示す、 図３９は、ＥＧＦＬ２（配列認識番号１５５）の、予想アミノ酸配列を下部に 、核酸配列を上部に示す、 図４０は、ＥＧＦＬ３（配列認識番号１５６）の、予想アミノ酸配列を下部に 、核酸配列を上部に示す、 図４１は、ＥＧＦＬ４（配列認識番号１５７）の、予想アミノ酸配列を下部に 、核酸配列を上部に示す、 図４２は、ＥＧＦＬ５（配列認識番号１５８）の、予想アミノ酸配列を下部に 、核酸配列を上部に示す、 図４３は、ＥＧＦＬ６（配列認識番号１５９）の、予想アミノ酸配列を下部に 、核酸配列を上部に示す、 図４４は、クローンのスケールコード化セグメントマ ップである。Ｔ３は、前記クローンからｍＲＮＡを生成するのに使用するバクテ リオファージプロモータを示す。Ｒ＝隣接のＥｃｏＲＩ制限酵素サイト。５’Ｕ Ｔは、５’非翻訳領域を示す。Ｅ，Ｂ，Ａ，Ｃ，Ｃ／Ｄ’及びＤは、コード化セ グメントを示す。０＝翻訳開始サイト。Λ＝ウシＥセグメントに対して相同の領 域の５’限界（例６参照）、そして、３’ＵＴは３’非翻訳領域を示す。 図４５は、ＧＧＦ２ＨＢＳ５（配列認識番号１６７）の予想アミノ酸配列（中 間部）と、核酸配列（上部）とを示す。下部（中間）配列は、ＧＧＦ−ＩＩ調製 物（図１１及び１２参照）からのペプチド配列を示す。 図４６は、組替えヒト及びウシグリア成長因子のシュワン細胞細胞分裂誘発活 性を示すグラフ。 図４７は、ＣＨＯ細胞のならし培地の大きさの異なる部分標本（ａｌｉｑｕｏ ｔｓ）の投与から生じたシュワン細胞増殖活性物質の投与量−反応曲線である。 図４８は、ＧＧＦ２ＨＢＳ５ｃＤＮＡクローンを含有するバクロビールスによ って感染したＳＦ９昆虫細胞に よって細胞外培地中に分泌されたシュワン細胞細胞分裂誘発活性物質の投与量− 反応曲線、 図４９は、ＧＧＦペプチド抗体を使用した組替えＣＨＯ細胞のならし培地のウ ェスタンブロット、 図５０（Ａ）は、陽イオン交換カラムから溶出した組替え（ＣＯＳ細胞が生成 ）ヒトＧＧＦ−ＩＩ（ｒｈＧＧＦ−ＩＩ）ピークのシュワン細胞増殖活性のグラ フであり、（Ｂ）は、ｒｈＧＧＦＩＩの特定のペプチドに対して生成されたポリ クローナル抗体を使用した組替えＧＧＦＩＩピークに対する免疫ブロットである 、 図５１（Ａ）は、フラクションごとの陽イオン交換カラムでのｒｈＧＧＦ−Ｉ Ｉ（ＣＨＯ細胞が生成）の精製を示すグラフ、（Ｂ）は、（Ａ）に示されたフラ クションとｒｈＧＧＦ−ＩＩ特異抗体を使用したウエスタンブロットの写真であ る、 図５２は、組替えグリア成長因子で処理したシュワン細胞におけるチロシン燐 酸化を示すゲルの写真、 図５３は、ＧＧＦＨＢＳ５，ＧＧＦＨＦＢ１及びＧＧＦＢＰＰ５ポリペプチド （配列認識番号１７０，１７１，１７２）の配列、 図５４は、前記ＣＨＯ細胞−発現ベクトルｐｃＤＨＦＲｐｏｌｙＡのマップで ある。 詳細な説明 本発明は、新規なグリア成長因子の分離と精製、及び、これら因子をコード化 するＤＮＡ配列のクローニングとに関する。本発明の他の組成物は、一連のグリ ア成長因子を潜在的にコード化できるいくつかの遺伝子スプライシング変異体、 特に、ＧＧＦ２ＨＢＳ５、特にウシＧＧＦ−ＩＩのヒト等価物をコード化する変 異体である。ＧＧＦ’ｓ及びｐ１８５^erbB2結合タンパク質をコード化する遺伝 子が、長さが異なりいくつかの共通のペプチド配列といくつかのユニークなペプ チド配列とを有する一連のタンパク質を生み出すＲＮＡ転写体であって、様々な 大きさとスプライス状態の異なったＲＮＡ転写体を生成することは明らかである 。これは、ウシ後方下垂体ＲＮＡ（ここに開示される）、ヒトの乳ガン（ＭＤＡ −ＭＢ−２３１）（ホルムズ（Ｈｏｌｍｅｓ）他， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６： １２０５（１９９２））や鶏の脳のＲＮＡ（フォールズ（Ｆａｌｌｓ）他，Ｃｅ ｌｌ ７２：１−２０（１９９３））から回収可能なスプライシングの異なる諸 配列によって証拠付けられている。又、シュワン細胞に対する細胞分裂誘発物質 （ここに開示）として、また、前記ｐ１８５^erbB2レセプタ（下記参照）のため のリガンドの両方として作用する広範囲のタンパク質によっても証拠付けられて いる。 前記ＧＧＦとｐ１８５^erbB2をコード化する遺伝子が相同であるという事実の 更なる証拠は、ヌクレオチド配列の比較から得られる。Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５６ （１９９２），（１２０５−１２１０）ホルムズ（Ｈｏｌｍｅｓ）他，は、前記 レセプタタンパク質ｐ１８５^erbB2に特異的に反応し、いくつかのヒトの悪性腫 瘍に関連する４５−キロダルトンのヒトタンパク質（ヘレグリンーα）の精製に ついて記載している。ヘレグリンーαをコード化するいくつかの補足性ＤＮＡク ローンが分離された。ペレス（Ｐｅｌｅｓ）他（Ｃｅｌｌ ６９：２０５（１９ ９２））及びウェン（Ｗｅｎ）他（Ｃｅｌｌ ６９：５５９（１９９２））は、 「ｎｅｕ分化因子」（ＮＤＦ）と称するタンパク質をコード化す るラット細胞から分離された補足性ＤＮＡについて記載している。前記ＮＤＦｃ ＤＮＡのトランスレーション生成物は、ｐ１８５^erbB2結合活性を有する。アス ディン（Ｕｓｄｉｎ）及びフィッシュバック，ジェイ（Ｆｉｓｃｈｂａｃｈ，Ｊ ．）Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０３：４９３−５０７（１９８６）；フォールズ（ Ｆａｌｌｓ）他，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎ ｔ．Ｂｉｏｌ．５５：３９７−４０６（１９９０）；ハリス（Ｈａｒｒｉｓ）他 ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：７６６４−７６６８ （１９９１）；及びフォールズ（Ｆａｌｌｓ）他，Ｃｅｌｌ ７２：８０１−８ １５（１９９３）は、レセプタタンパク質ｐ１８５^erbB2と作用する４２Ｋｄの グリコプロテインの精製されたこと、また、いくつかの補足性ｃＤＮＡが分離さ れたこと（フォールズ（Ｆａｌｌｓ）他Ｃｅｌｌ ７２：８０１：８１５（１９ ９３））を示している。その他のグループとしては、ルプ（Ｌｕｐｕ）他（１９ ９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：２２８７；ヤー デン（Ｙａｒｄｅｎ）とペレス（Ｐｅｌｅｓ）（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ ｔｒｙ ３０：３５４３；ルプ（Ｌｕｐｕ）他（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２ ４９ ： １５５２；ドバシ（Ｄｏｂａｓｈｉ）他（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐ ｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１７９：１５３６；そしてフアング（Ｈｕａｎｇ） 他（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：１１５０８−１１５１２等が 含まれる。 他の実施例 本発明は、図３１のコード化セグメント（配列認識番号１３６−１４７，１６ ０及び１６１）にほぼ相同のすべてのタンパク質と、自然発生ＧＧＦポリペプチ ドとを含む。更に、対立遺伝子変異体、自然突然変異体、誘発突然変異体、自然 発生の核酸に対する高厳密（ｈｉｇｈｓｔｒｉｎｇｅｎｔ）条件又は低厳密条件 下においてハイブリッド化したＤＮＡによってコード化されたタンパク質（高厳 密条件及び低厳密条件の定義に関しては、ここに参照文献として添付するＣｕｒ ｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９，６．３． １−６．３．６を参照）、そして、抗血清によってＧＧＦポリペプチドに特異的 に結合したポリペプチド又はタンパク質も含まれる。又、この用語は、図３１か らの配列を有するＧＧＦ ポリペプチドを含むキメラポリペプチドも含む。 以下の例は、本発明を限定するものではなく、本発明を有用に例示する目的で 提供されるものであり、有効な調製技術に関するガイダンスを提供するものであ る。 下記の例３から理解されるように、本発明の因子は、ある範囲のタイプの細胞 に細胞分裂誘発活性を示す。線維芽細胞に関する活性は、傷修復能力があること を示し、本発明は、この利用方法も含むものである。上述の調合物及び／又は薬 品、及びその製造方法に関連の本発明の一般的記載は、適当な製造物とその使用 方法を含むものであると理解されるべきである。これは、線維芽成長因子（ＦＧ Ｆｓ）に対する類似の活性に関する報告に鑑みて、本発明に対し合理的に期待さ れるものである。例えば、Ｓｐｏｒｎ ｅｔ ａｌ．，「ペプチド成長因子とそ のレセプタＩ」３９６頁（Ｂａｉｒｄ ａｎｄ Ｂｏｈｌｅｎ）の「傷の治癒と 繊維組織の修復におけるＦＧＦｓ」というタイトルを付けられた章を参照。 例１ ウシ下垂体からのＧＧＦ−ＩとＧＧＦ−ＩＩとの精製 Ｉ．因子−ＣＭフラクションの調製 ４，０００の冷凍全ウシ下垂体（約１２ｋｇ）を一晩解凍し、先ず水で簡単 に洗浄し、次に、Ｗａｒｉｎｇ Ｂｌｅｎｄｅｒによって各々同量の０．１５Ｍ 硫酸アンモニウムでバッチ処理によりホモジナイズした。このホモジナイズ化物 を１．０ＭのＨＣｌでｐＨ４．５に調節し、４，９００ｇで８０分間遠心分離機 にかけた。上澄液中のすべての脂肪分を、グラスウールを通過させることによっ て除去した。前記上澄液のｐＨを１．０ＭのＮａＯＨを使用して６．５に調整し た後、固体の硫酸アンモニウムを添加して３６％の飽和溶液となるようにした。 数時間の攪拌後、その縣濁液を４，９００ｇで８０分間遠心分離機にかけ、沈澱 物を取り除いた。グラスウールでのフィルタ処理後、更に前記上澄液に固体硫酸 アンモニウムを追加し、７５％の飽和溶液となるようにし、数時間の攪拌後、こ れを再び４，９００ｇで８０分間遠心分離機にかけた。そのペレットを、約２リ ットルのｐＨ６．０の０．１Ｍ燐酸ナトリウム中にて再縣濁し、３×４０Ｌの同 じバッファで透析した。透析物の導電性が２０．０μジーメンス以下であること を確認した後、毎分２ｍｌの流量で、カルボキシルセルロース（ＣＭ−５２， Ｗｈａｔｍａｎ）でパックしたバイオプロセスカラム（１２０×１１３ｍｍ，Ｐ ｈａｒａｃｉａ）に負荷した。このカラムを、先ず、２倍量のｐＨ６．０の０． １Ｍ燐酸ナトリウムで、次に、２倍量の５０ｍＭＮａＣｌで、そして最後に２倍 量の０．２Ｍ ＮａＣｌで、同じバッファ中にて洗浄した。最終工程中において 、１０ｍＬ（５分間）のフラクションが収集された。フラクション７３−１１８ までをプールし、１０倍量のｐＨ６．．０の１０ｍＭ燐酸ナトリウムで２度、透 析し、１００，０００ｇで６０分間の遠心分離によって浄化した。ＩＩ．ハイドロキシアパタイトＨＰＬＣ ハイドロキシアパタイトＨＰＬＣは、グリア成長因子の分離において従来使 用された技術ではないが、本発明において特に有効であることが判った。 前記ＣＭ−セルロースクロマトグラフィによって得られた物質を、０．０２ μｍのフィルタ（Ｎａｌｇｅｎｅ）によって濾過し、室温にて、ガードカラム（ １５×２５ｍｍ，Ｂｉｏｒａｄ）を備えた高性能ハイドロキシアパタイトカラム （５０×５０ｍｍ，Ｂｉｏｒａｄ） に負荷し、ｐＨ６．０の１０ｍＭの燐酸カリウムで平衡させた。室温での抽出を 、下記のプログラムされたリニアグラジエントを使用して毎分２ｍｌの流量で行 った。 ６．０ｍＬ（３分間）フラクションを、前記グラジエント溶出中に採取した 。フラクション３９−４５をプールし、１０分量の５０ｍＭ燐酸ナトリウムｐＨ ６．０で透析した。ＩＩＩ．モノ Ｓ ＦＰＬＣ モノ Ｓ ＦＰＬＣにより、後のゲル濾過のためにより高濃度の物質を作る ことが可能となった。 前記ハイドロキシアパタイトカラムからのプールされた物質のすべての粒状 成分を、調製ＨＲ１０／１０モノ Ｓ 陽イオン交換カラム（１００ｘ１０ｍｍ ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にかける前に、１０，０００ｇでの浄化スピンによって 、６０分間で除去し、次に、これを室温下で、毎分１．０ｍｌの流量でｐＨ６． ０の５０ｍＭ燐酸ナトリウムに再平衡させた。これらの条件下において、結合し たタンパク質を、下記のプログラムされた一次グラジエントを使用して溶出した 。 １．０ｍＬ（１分間）フラクションを、このグラジエントプログラム中に採 取した。フラクション９９−１１５までをプールした。ＩＶ．ゲル濾過 ＦＰＬＣ この工程は、最終精製処理の前に、本発明の二つの因子の分離より始め、濃 縮フラクションを作った。 この実験の目的のため、調製スペローズ（Ｓｕｐｅｒｏｓｅ）１２ ＦＰＬ Ｃ カラム（５１０×２０ｍｍ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を、その製造会社の指示 に従って充填した。このカラムを標準化するために、製造会社の指示に従って、 理論段数測定を行い、９，７００理論段数という値を得た。 モノ Ｓ 溶出物質のプールを、室温において、２．５Ｍｌの部分標本ごと に、予めＣ１８逆相カラム（Ｓｅｐ−ｐａｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に通過させ た５０ｍＭ燐酸ナトリウム、０．７５ ＮａＣｌ ｐＨ６．０中で毎分１．０ｍ Ｌの流量でこのカラムに適用した。各サンプルが該カラムに適用された後、３５ 分後から１ｍＬ（０．５分間）のフラクションが採取された。各実行（ラン）か らフラクション２７ないし４１（ＧＧＦ−ＩＩ）及び４２−５７（ＧＧＦ−Ｉ） までがプールされた。Ｖ．逆相ＨＰＬＣ 上記スペローズの１２回のランから得られたＧＧＦ−１とＧＧＦ−ＩＩとを 、それぞれ、三つの等しい部分標本に分割した。各部分を、ガードカートリッジ （ＲＰ−８，１５ｘ３．２ｍｍ，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によ って保護され、４０℃に平衡させた、Ｃ８逆相カラム（Ａｑｕａｐｏｒｅ ＲＰ −３００ ７μ Ｃ８ ２２０ｘ４．６ｍｍ，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔ ｅｍｓ）にて、毎分０．５ｍＬの流量で通過させた。これらの条件下において、 下記のプログラムによるリニアグラジエントを使用してタンパク質を溶出した。 ２００μＬ（０．４分間）のフラクションを前記プログラムグラジエントの 開始後からの１５．２分間で シリコン化チューブ（Ｍｕｌｔｉｌｕｂｅチューブ、Ｂｉｏｑｕｏｔｅ）内に採 取した。ＶＩ．ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動 この工程においては、Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏ−ｒａｔｏｒｉｅｓ Ｌｉ ｍｉｔｅｄ，Ｗａｔｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄのタンパク質分子量標準、低レン ジ、カタログＮｏ．１６１−０３０４を使用した。実際に使用されたタンパク質 とその分子量標準は、前述の通りであった。 前記逆相プログラムのランから得たフラクション４７−５３（ＧＧＦ−Ｉ） とフラクション６１−６７（ＧＧＦ−ＩＩ）を、個別にプールした。このプール した物質の７μＬを、０．０１２５Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ，４％ＳＤＳ，２０％グ リセロール、及びＧＧＦ−Ｉに対しては１０％のβ−メルカプトエタノールの等 量混合液中で、５分間沸騰させ、４％のスタッキングゲルを有する１１％ポリア クリルアミドＬａｅｍｍｌｉゲル中に充填し、５０Ｖの定電圧を１６時間かけた 。このゲルを、次に、固定し、銀着色キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用して着 色した。これらの 条件下において、前記因子は、分子量マーカを基準として、相対分子量が３０， ０００ないし３６，０００ダルトン（ＧＧＦ−Ｉ）と５５，０００ないし６３， ０００ダルトン（ＧＧＦ−ＩＩ）の、幾分拡散したバンドとして観察される。前 記ゲル着色から、前記逆相プログラム実行からプールされた物質において前記Ｇ ＧＦ−Ｉ（５ＧＧＦ−ＩＩと同等のレベルで、他のタンパク質が存在することが 明らかである。ＶＩＩ．トリフルオロ酢酸中における安定性 トリフルオロ酢酸存在下における、本発明の因子の安定性に関して得られた データは以下の通りである。 ＧＧＦ−Ｉ：０．１％ＴＦＡとアセトニトリルの存在下において、前記逆相 ＨＰＬＣから得た物質を、カラムランの完了後１２時間以内と、その４０℃での １０週間の培養後とにおいて分析した。培養後、ＧＧＦ−Ｉは、カラム流出後、 直接にとって分析した物質の活性の少なくとも５０％を保持していた。 ＧＧＦ−ＩＩ：０．１％ＴＦＡとアセトニトリルの存在下において、前記逆 相ＨＰＬＣから得て、−２０℃ て保存しておいて物質を、解凍後と、４０℃で４日間の培養後とにおいて分析し た。培養後、ＧＧＦ−ＩＩは、解凍直後の物質の活性の少なくとも５０％を保持 していた。 尚、上記研究において使用されたトリフルオロ酢酸濃度は、逆相クロマトグ ラフィにおいて最も一般的に使用されるものである。ＶＩＩＩ．活性分析条件 特に明記の無い限り、すべての作業は３７℃で行った。そして図１ないし６ に示されるように、各工程での活性は、下記の変更以外には、ブロックス（Ｂｒ ｏｃｋｅｓ）（Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．，ｓｕｐｒａ）の技術を使用して測定された 。従って、シュワン細胞の調製において、５μＭのフォルスコリン（ｆｏｒｓｋ ｏｌｉｎ）を、ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌ ｅ’ｓ ｍｅｄｉｕｍ）、ＦＣＳ及びＧＧＦ以外に添加した。分析に使用した細 胞は、パッセージ番号が１０以内の無線維芽細胞シュワン細胞であり、これらの 細胞は、トリプシンとともにフラスコから除去され、１ミクロ・ウェル当り３． ３ 千細胞の割合で平底９６−ウェル・プレートにプレート化した。 ［¹²⁵Ｉ］ＩＵｄＲを、テスト溶液の添加後の最後の２４時間後に添加した 。バックグラウンド（非刺激）の各分析に対する関与は、１００ｃｐｍ以下であ り、最大の組込みは、シュワン細胞のバッチとパッセージ番号（ｐａｓｓａｇｅ ｎｕｍｂｅｒ）とに応じて、２０ないし２００倍（ｆｏｌｄ）であった。 上述の逆相ＨＰＬＣから得られるＧＧＦ−Ｉ及びＧＧＦ−ＩＩフラクション の場合、各因子に対する一本の曲線について、全く同じ前述の方法を使用して、 二本の投与量−反応曲線が得られた。そして、この分析実験において上記方法は 、各因子についての他の曲線を得るために、胎児子ウシプラズマを胎児子ウシ血 清に代えた点のみ変更された。その結果は図７及び８に示されている。 例２ 製ＧＧＦ−ＩとＧＧＦ−ＩＩのアミノ酸配列 高度に精製したウシ下垂体ＧＧＦ−Ｉ及びＧＧＦ−ＩＩを使用してアミノ酸配 列分析研究を行った。これらの配列の記載には従来式の単一文字コードを使用し た。ペプチドは、還元されそしてカルボキシメチル化されたサンプルについて、 リシルエンドペプチダーゼとプロテアーゼＶ８による消化物として得られた。特 に前記ＧＧＦ−ＩＩのリシルエンドペプチダーゼの消化は、１１％ＳＤＳ−ＰＡ ＧＥ（前記マーカに対するＭＷ）の５５−６５ＲＤ領域において行った。 ＧＧＦ−Ｉに関して全部で２１のペプチド配列（図９、配列認識番号１−２０ ，１６９参照）が得られ、その内の１２のペプチド（図１０、配列認識番号１， ２２−２９，１７，１９及び３２）は現在のタンパク質データベースには存在し ないものであり、従って、新規な配列である。ＧＧＦ−ＩＩに関して全部で１２ のペプチド配列（図１１）配列認識番号３３−４４参照）が得られ、その内の１ ０のペプチド（図１２、配列認識番号４５−５３）は現在のタンパク質データベ ースには存在しないものであり、従って、新規な配列である（例外は、ペプチド ＧＧＦ−ＩＩ ０６であり、これは多くのタンパク質においても同じ配列を示し ているが、これらはその残基の数が小さ いことから恐らく重要ではない）。これらの新規な配列が、ＧＧＦ−ＩとＩＩの 真のアミノ酸配列の部分に対応するものである可能性は極めて高い。 特に注目されるのはＧＧＦ−Ｉ ０７とＧＧＦ−ＩＩ １２とであって、これ らは明らかに互いに密接に関連している。その類似性は、これらのペプチドの配 列がほぼ確実に指定されたＧＧＦ類のそれであることと、汚染タンパク質由来で ある可能性が非常に低いこととを示すものである。 更に、ペプチドＧＧＦ−ＩＩ ０２において、配列Ｘ Ｓ Ｓは、Ｘによって 示す位置におけるアスパラギンのＮ−結合の炭水化物部分（ｍｏｉｅｔｙ）の存 在と一致している。 一般に、図９及び１１において、Ｘは、サイクル中に同じ大きさの信号が一つ 以上存在したか、あるいは、全く信号が無かったことによって一つの位置も確実 に呼び出すことができなかったシーケンスサイクルを表す未知の残基を示してい る。星印は、最後に呼び出したアミノ酸が、そのペプチドに存在する最後のアミ ノ酸に対応す るペプチドを示す。その他のタンパク質において、最後に呼び出したアミノ酸の 後の信号強度では、そのペプチドの末端まで呼び出しを継続するのには不十分で あった。右側のカラムは、ＮＢＲＦとＥＭＢＬ配列データベースを分析するため にＧＣＧパッケージＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡプログラムを使用して行ったコ ンピュータデータベースサーチの結果を示している。このカラムのタンパク質の 名称は、その配列の一部の一致を示し、呼び出されたペプチドアミノ酸配列は最 大２つのミスマッチを許容するものであった。疑問符（？）は、許容された３つ のミスマッチを示している。使用された略記は以下の通りである。 ＨＭＧ−１ 高移動性グループタンパク質−１ ＨＭＧ−２ 高移動性グループタンパク質−２ ＬＨ−アルファ 黄体形成ホルモンアルファサブユニット ＬＨ−ベータ 黄体形成ホルモンベータサブユニット 例３ 精製ＧＣＦ−ＩとＧＣＦ−ＩＩの細胞分裂誘発活性 ＧＣＦ−ＩとＧＣＦ−ＩＩとの両方を含有する高度に精製したサンプルの細胞 分裂誘発活性の研究を、定量方 法により行った。この方法は、単一のミクロ培養による、ＤＮＡ合成、細胞組織 形態、細胞数、細胞アンチゲンの発現の評価を可能にするものである。この技術 は、以前にミュール（Ｍｕｉｒ）他，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉ ｓｔｒｙ １８５，３７７−３８２，１９９０によって報告された方法を変更し たものである。主な変更点は、１）非被覆ミクロタイター（ｍｉｃｒｏｔｉｔｅ ｒ）プレートの使用、２）一ウェル当りの細胞数、３）１０％胎児子ウシ血清（ ＦＣＳ）に代えての５％の胎児ウシプラズマ（ＦＢＰ）の使用、そして４）培養 に同時に添加された細胞分裂誘発物質と臭化デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）の存 在下における培養時間、である。更に、細胞の損失を避けるために、前記細胞の 単層は、固定前において洗浄しなかった。そして、モノクローナル・マウス ア ンチ−ＢｒｄＵ抗体とペロキシダーゼ接合ヤギ アンチ−マウス免疫グロブリン （ＩｇＧ）抗体とを、分析の感度を高めるために、２倍にした。ラットの座骨神 経シュワン細胞ように最適化した分析も、前記細胞培養条件に対して適当な変更 を施した後に、いくつかの細胞系に使用した。Ｉ．細胞分裂誘発テスト 第１日目に、精製したシュワン細胞を、５％ＥＢＰ／Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）（５，０００細胞 ／ウェル）中で、非被覆の９６ウェルのプレートにプレート化した。第２日目に 、ＧＧＦ又はその他のテスト因子を、１０μｍの最終濃度のＢｒｄＵとともに、 前記培養物に添加した。４８時間後（第４日目）、ＢｒｄＵ組み込みを、前記培 地を吸引することによって終わらせ、室温で２０分間、７０％エタノールを２０ ０μｌ／ウェル添加し、細胞を固定した。次に、これらの細胞を、水及び３７℃ で１０分間、１００μｌの２Ｎ ＨＣｌでの培養によって変質させたＤＮＡで洗 浄した。吸引後、残りの酸を、前記ウェルを０．１Ｍホウ酸塩バッファｐＨ９． ０で満たすことによって中和し、細胞を燐酸バッファ塩水（ＰＢＳ）で洗浄した 。次に、細胞を、５０μｌのブロッキングバッファ（０．１％のトリトンＸ１０ ０と２％の正常ヤギ血清とを含有するＰＢＳ）で３７℃にて１５分間処理した。 吸引後、モノクローナル・マウス アンチ−ＢｒｄＵ抗体（ダコ・コーポレイシ ョン（Ｄａｋｏ Ｃｏｒｐ．），カリフォルニア州，サンタ・バーバラ）（５０ μｌ／ウェル，ブロッキングバッファ中で１．４μｇ／ｍｌに希釈） を添加し、３７℃で２時間培養した。非結合抗体を、０．１％トリトンＸ−１０ ０を含有のＰＢＳ中において３回の洗浄して除去し、ペロキシダーゼ−結合ヤギ ・アンチーマウスＩｇＧ抗体（ダコ・コーポレイション（Ｄａｋｏ Ｃｏｒｐ． ），カリフォルニア州，サンタ・バーバラ）（５０μｌ／ウェル，ブロッキング バッファ中で２μｇ／ｍｌに希釈）を添加し、３７℃で１時間培養した。ＰＢＳ ／トリトンでの３回の洗浄と、ＰＢＳ中での最終すすぎ後、ウェルは、０．０５ ％の溶解性クロモゲンＯ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）と、０．０２％のＨ₂ Ｏ₂とを含有する１００μｌ／ウェルの５０ｍＭのｐＨ５．０燐酸／クエン酸塩 バッファを受けた。室温で５−２０分後、各ウェルから８０μｌを、２Ｎ硫酸を ４０μｌ／ウェル含有するクリーンなプレートにピペットで移すことによって、 前記反応をに終結させた。４９０ｎｍにおける吸光はプレートリーダ（Ｄｙｎａ ｔｅｃｈ Ｌａｂｓ）を使用して記録した。前記細胞単層を含有する分析プレー トを、ＰＢＳで２回洗浄し、１００μｌ／ウェルの基質ジアミノベンジジン（Ｄ ＡＢ）を加えてＢｒＤＵ−ＤＮＡについて免疫細胞化学的に染色し、０．０２％ のＨ₂Ｏ₂とを添加することによって溶解不能生成物と した。１０〜２０分後、前記染色反応を、水で洗浄することによって終結させ、 倒立顕微鏡（ｉｎｖｅｒｓｅｄ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ）を使用してＢｒｄＵ− ポジティブ細胞核を観察計数した。場合により、ネガティブ核を０．００１％の トルイジンブルーで対比染色し、上述と同じように計数した。ＩＩ．細胞分裂誘発分析に使用した細胞系 Ｓｗｉｓｓ ３Ｔ３ 線維芽細胞：Ｆｌｏｗ Ｌａｂｓからの細胞を、１０ ％ＣＯ₂の空気中で、加湿雰囲気下、３７℃で、１０％のＦＣＳ、ペニシリン、 ストレプトマイシンを補足したＤＭＥＭ中に保持した。細胞を、２日毎に供給又 は二次培養した。細胞分裂誘発分析のために、細胞を、完全培地にて５，０００ 細胞／ウェルの濃度でプレート化し、細胞が融合性を得て、鎮静状態になるまで １週間培養した。血清を含有する培地を除去し、細胞単層を、無血清培地で２回 洗浄した。細胞分裂誘発物質を含有する１００μｌの無血清培地と、１０μＭの ＢｒｄＵとを各ウェルに添加し、４８時間培養した。ＧＧＦと血清又はＰＤＧＦ （ホジティブコントロールとして）に対する投与量反応を行った。 ＢＨＫ（ベビーハムスター腎臓）２１ Ｃ１３線維芽細胞：Ｅｕｒｏｐｅａ ｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ （ＥＣＡＣＣ）からの細胞を、５％ＣＯ₂空気中、加湿雰囲気下、３７℃で、５ ％のＦＣＳ、ペニシリン、ストレプトマイシンを補足したＧｌａｓｇｏｗ Ｍｏ ｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ（ＧＭＥＭ）中で保持した。細胞を、 ２ないし３日毎に供給又は二次培養した。細胞分裂誘発分析のために、細胞を、 完全培地にて、２，０００細胞／ウェルの濃度で、２４時間プレート化した。血 清を含有する培地を除去し、無血清培地で２回洗浄した後、１００μｌの、０． １％のＦＣＳを含有するＧＭＥＭあるいはＧＭＥＭのみで、置換した。。ホジテ ィブコントロールとしてＧＧＦとＦＣＳ又はｂＦＧＦとを、１０μＭのＢｒｄＵ とともに、添加し、４８時間培養した。次に、細胞培養のシュワン細胞を、前述 の方法で処理した。 Ｃ６ ラット グリオマ細胞系：パッセージ３９から得た細胞を、１０％Ｃ Ｏ₂空気中、加湿雰囲気下、３７℃で、５％のＦＣＳ、ウマ血清（ＨＳ）、ペニ シリン、ストレプトマイシンを含有したＤＭＥＭ中で保 持した。細胞を、３日毎に供給又は二次培養した。細胞分裂誘発分析のために、 細胞を、完全培地にて２，０００細胞／ウェルの濃度でプレート化し、２４時間 培養した。次に、培地を、無血清培地中にて洗浄した後、ＤＭＥＭと０．１％の ＦＣＳを含有するＦ１２の１：１の混合物にて置換した。次に、ＧＧＦ，ＦＣＳ 及びαＦＧＦに対する投与量反応を行い、細胞を、他のタイプの細胞に関して前 述した方法でＥＬＩＳＡを通じて処理した。 ＰＣ１２（Ｒａｔ Ａｄｒｅｎａｌ Ｐｈｅｏ−ｃｈｒｏｍｏｃｙｔｏｍａ 細胞）：ＥＣＡＣＣからの細胞を、５％ＣＯ₂空気中、加湿雰囲気下で３７℃ でコラーゲン被覆フラスコ内にて、１０％のＦＣＳ、ペニシリン、ストレプトマ イシンを補足したＲＰＭＩ１６４０中で維持した。細胞を、３日毎に培地の８０ ％を置換することによって、供給した。細胞分裂誘発分析のために、細胞を、完 全培地にて３，０００細胞／ウェルの濃度でコラーゲン被覆プレート（５０μｌ ／ウェル コラーゲン、ヴィトロゲン・コラーゲン・コーポレイション（Ｖｉｔ ｒｏｇｅｎ Ｃｏｌｌａｇｅｎ Ｃｏｒｐ．）、１：５０に希釈、 ３７℃で３０分間）にプレート化し、２４時間培養した。次に、前記培地を、新 たなＲＰＭＩのみか、あるいは、１ｍＭのインシュリンを含有したもの、あるい は、１％のＦＣＳによって置換した。ポジィティブコントロールとしてのＦＣＳ ／ＨＳ（１：２）及びＧＧＦとに対する投与量反応を前述のように行った。４８ 時間後、細胞を固定して、ＥＬＩＳＡを前述したように行った。ＩＩＩ．細胞分裂誘発分析の結果： この例におけるすべての実験は、セファローズ１２クロマトグラフィ精製工 程（例１のセクションＤ参照）からの、ＧＧＦ−１とＧＧＦ−ＩＩ（ＧＧＦｓ） との混合物を含有する高度に精製したサンプルを使用して行った。 先ず、ＢｒｄＵ組み込み分析によって得られた結果を、Ｊ．Ｐ．Ｂｒｏｃｋ ｅｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１４７：２１７，１９８７）に記載の 、分裂細胞のＤＮＡへの［１２５］Ｉ−ＵｄＲ組み込みに基づくシュワン細胞の 古典的な細胞分裂誘発分析と比較した。 図１３は、同じ細胞培養条件（５，０００細胞／ウェル５％ＦＢＰ／ＤＭＥ Ｍ中、ＧＧＦｓ又の存在下で４８時間培養）で行われた二つの分析によって得ら れた結果を比較して示したものである。同図に明らかに示されているように、こ れらの結果は比較可能であるが、ＢｒｄＵ組み込み分析の方が、グラフにおいて 曲線が左側、即ち、ＧＧＦＳの低い濃度の方へシフトしていることに示されるよ うに、僅かに感度が高い。 「細胞分裂誘発テスト方法」と題された章に記載されているように、免疫反 応性ＢｒｄＵ−ＤＮＡを、前記ＯＰＤペロキシダーゼ反応の溶解生成物強度を読 み取ることによって定量化した後、細胞単層を含有する元の分析プレートを、第 ２の反応をさせて、非溶解性ＤＡＢ生成物を得ることができ、これはＢｒｄＵポ ジティブ細胞核を染色する。前記マイクロ培養を、次に倒立顕微鏡で調べ、細胞 の形態と、ＢｒｄＵ−ポジティブ及びネガティブ細胞核の数を観察することがで きる。 図１４ａ及び図１４ｂにおいて、４９０ｎｍでの吸収の読み取りによって評 価されたＢｒｄＵ−ＤＮＡの 免疫活性が、同じ培養内における、ＢｒｄＵ−ポジティブ細胞核の数と、ウェル 当りのＢｒｄＵ−ポジティブ細胞核の百分率と比較されている。標準偏差は、１ ０％以内であった。二つの評価方法は、ＧＧＦｓの最大投与量における値の間の 非常に良好な相関関係と不一致とが、ＢｒｄＵ−ポジティブとして検出された細 胞におけるＤＮＡ合成の程度の違いによって説明可能であることを示している。 従って、ＢｒｄＵ組み込み分析は、前記（１２５）Ｉ−ＵｄＲ組み込み分析 との比較した場合、シュワン細胞に対するポリペプチドの生物学的活性について の別の有用な情報を提供するものである。例えば、図１５に報告されるデータは 、ＧＧＦｓがシュワン細胞に作用して、ＤＮＡ合成を誘発することができるが、 より少ない投与量においては、４８時間後においてマイクロ培養中に存在するネ ガティブ細胞の数を増やすことを示している。 次に、前記分析を、起源の異なるいくつかの細胞系に使用した。図１６にお いて、ＧＧＦｓに対する、シュワン細胞とＳｗｉｓｓ線維芽細胞との細胞分裂誘 発 反応が比較されており、３Ｔ３線維芽細胞においては弱い反応しか得られなかっ たにもかかわらず、これらの培養中においていくつかのはっきりとしたＢｒｄＵ −ポジティブ細胞核が検出された。コントロール培養を、ＦＣＳ又はヒト組替え ＰＤＧＦの複数の投与量の存在下において平行に実行したところ、これら細胞が 適当な刺激に対して反応可能であることが判った（図示せず）。 線維芽細胞のＧＧＦｓに対する反応性を、更に、ＢＨＫ ２１ Ｃ１３細胞 系を使用して調べた。これらの腎臓から得た線維芽細胞は、接触阻止反応を示さ ず、あるいは、融合性状態の場合に鎮静状態には到らない。従って、細胞の生存 力を損なわない範囲で、バックグラウンドの増殖が非常に低くなるように実験条 件を調節した。ＧＧＦｓは、図１７及び１８に示すように、ＢＨＫ２１Ｃ１３細 胞において非常に顕著な細胞分裂誘発活性を有する。図１７は、０．１％のＦＣ Ｓの存在下においてＧＧＦＳによって刺激されたＢＨＫ２１ Ｃ１３細胞による 、ＢｒｄＵのＤＮＡへの組み込みを示している。ＦＣＳに対する良好な応答は、 細胞培養条件が限定的でなかったことを示してい る。図１８において、ＧＧＦｓの細胞分裂誘発効果が、１ウェル当りに計測され たＢｒｄＵ−ポジティブ及びＢｒｄＵ−ネガティブ細胞の数として表されている 。データは、全く同一条件で実行された２つの実験を示すものであり、少なくと も一つのウェル毎に３つのフィールドが数えられた。シュワン細胞の観察におい て、低投与量における増殖性効果に加えて、ＧＧＦｓは、非反応性細胞の生存数 も増加させる。ＢｒｄＵ−ポジティブ細胞の率は、前記培養に添加されたＧＧＦ ｓの増加量に比例する。高投与量のＧＧＦｓの存在下における４８時間後の細胞 の総数は、少なくとも２倍に増加し、これはＧＧＦｓがＢＨＫ２１ Ｃ１３細胞 におけるＤＮＡ合成と増殖とを誘発することを確証するものである。同じ条件下 において、２％のＦＣＳの存在下において４８時間維持した細胞は、約６倍の増 加を示した（図示せず）。 Ｃ６グリオマ細胞は、グリア細胞の特性の研究のための有用なモデルを提供 した。発現した表現型は、細胞パッセージに依存し、細胞は、初期段階において は星状膠細胞表現型に類似し、後期段階（パッセージ７０以降）においては乏突 起膠細胞表現型に類似するよう である。これらの実験において使用されたＣ６細胞は、パッセージ３９からパッ セージ５２からのものであった。Ｃ６細胞はきわめて増殖性の高い個体群である ので、ＢｒｄＵ組み込みのバックグランドを非常に低くするように実験条件を最 適化した。ＦＣＳに対する投与量反応に示されるように、細胞分裂誘発反応に大 きく影響することなく細胞の生存力を維持するのに、０．１％の血清の存在が必 要であった（図１９）。 図２０において、ａＦＧＦ（酸性線維芽細胞成長因子）とＧＧＦｓとに対す る細胞分裂誘発反応が、ＦＣＳ（８％）の存在下において得られた最大のＢｒｄ Ｕ組み込みの百分率として表されている。値は、全く同一の条件で実行された二 つの実験の平均値である。ＧＧＦの効果は、ａＦＧＦの純粋調合物の効果と等価 である。Ｃ６細胞の独特の成長因子としてａＦＧＦが既に記載されており（Ｌｉ ｍ Ｒ ｅｔ ａｌ．，１：７４１−７４６，１９９０）、その理由で、これは ポジティブコントロールとして使用された。ＢｒｄＵポジティブ及びネガティブ 細胞を直接に数えることは、マイクロ培養の細胞濃度が高かったために不可能で あった。これまでに報告された細胞系とは対照的に、ＰＣ１２細 胞は、このＰＣ１２が血清に対して反応可能な培養条件下（細胞の維持において 通常に使用されるＦＣＳとＨＳとの混合物）において処理された場合ＧＧＦ２に 対してはっきりとした反応を示さない。しかしながら、各ウェル毎のプレート化 された細胞の数は、ＰＣ１２細胞の挙動に影響するようである。従って、更に実 験が必要である。 例４ ＧＧＦ−Ｉ及びＧＧＦ−ＩＩペプチドを含有するタンパク質をコード化するヌク レオチド配列の分離とクローン化 ＧＧＦ−ＩＩヌクレオチド配列の分離とクローン化とを、ペプチド配列情報と ライブラリスクリーニングとを使用した結果を外観し、そして以下に記載の方法 によって実際に行った。尚、図４及び５のペプチドは、下記の技術に従ってＧＧ Ｆ−Ｉ配列を分離及びクローン化する出発点として利用することができることは 評価されるであろう。即ち、図２１（配列認識番号５４−８８）は、この目的の ために利用可能な退化オリゴヌクレオチドプローブを示し、図２３（配列認識番 号９０−１１９）は、 利用可能なＰＣＲプライマをリストアップしている。ＤＮＡ配列とポリペプチド 配列とは、ＧＧＦ−ＩＩと同様にこの手段によって入手されるべきであり、更に 、このようなＤＮＡ配列を組み込んだＤＮＡ構築体と発現ベクトル、このような 構築体／ベクターを組み込むことによって遺伝子的に変成されたホスト細胞、ま た、このようなホスト細胞を培養することによって得られるタンパク質も同じで ある。本発明は、更に、これらの物質をも含む。Ｉ．オリゴヌクレオチドプローブ及びプライマの構成と分析 前記アミノ酸配列（精製ＧＧＦタンパク質からのペプチド由来のもの）をヌ クレオチド配列に逆転写（ｂａｃｋｔｒａｎｓｌａｔｅ）することによって退化 ＤＮＡオリゴマプローブを構成した。オリゴマは、前記ＤＮＡ配列のコード化ス トランド又は非コード化ストランドを表した。オリゴマ構成にセリン、アルギニ ン又はロイシンが含まれていた場合には、曖昧さをなくすために二つの別の合成 物を作った。例えば、セリンは、５３７及び５３８又は６０９及び６１０のＴＣ Ｎ又はＡＧＹのいずれかによってコード化された。 アルギニン又はロイシン（例えば、５４４，５４５）について類似のコドン分割 を行った。ＤＮＡオリゴマを、０．２マイクロモルスケールでのβ−シアノエチ ル化学反応を使用してＢｉｏｓｅａｒｃｈ８７５０４−カラムＤＮＡシンセサイ ザーで合成した。オリゴマを、前記カラム（５００オングストロームＣｐＧ樹脂 ）から切り離し、濃い水酸化アンモニウム中において５５〜６０℃で６〜２４時 間保護解除（ｄｅ−ｐｒｏｔｅｃｔｅｄ）した。これら保護解除オリゴマを真空 下で乾燥させ（Ｓｐｅｅｄｖａｃ）、７Ｍの尿素を含有する、１５％アクリルア ミド（２０モノ：１ビス）５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ほう酸−ＥＤＴＡバッファのゲ ル中での電気泳動によって精製した。ＵＶ シャドウイング（ｓｈａｄｏｗｉｎ ｇ）によって、前記ゲル中に全長オリゴマが検出され、次に、前記バンドを摘出 し、ＤＮＡオリゴマを４〜１６時間のシェイキングによって、１．５ ｍｌｓ Ｈ２０に溶出した。この溶出液を乾燥し、０．１ｍｌ Ｈ₂Ｏ中に再溶解し、光 吸収測定を２６０ｎｍで行った。 濃度は次の式に基づいて測定した。 （Ａ ２６０ × 単位／ｍｌ）（６０．６／長さ＝ｘμＭ） すべてのオリゴマを、Ｈ₂Ｏの添加によって、５０μＭの濃度に調節した。 上記構成の退化プローブが、図２１，配列認識番号５４−８８に示されてい る。 下記の変更を加えたうえでプローブに対して使用したものと実質的に同じ手 順によってＰＣＲプライマを作った。１３のヌクレオチド含有制限サイトのリン カーが、ベクトルへのクローン化用の前記退化オリゴマの５’末端に含まれてい た。ＤＮＡ合成を、１，０００オングストロームＣｐＧ樹脂を使用した１マイク ロモルスケールで行い、すべての４つのヌクレオチドが退化プローブに正常に取 り込まれた位置においてはイノシンを使用した。ＰＣＲプライマの精製には、前 記ゲル電気泳動精製後にエタノール沈澱することを含んでいた。ＩＩ．ライブラリ構築及びスクリーニング ウシゲノムＤＮＡライブラリを、Ｓｔｒａｇａｇｅｎｅ（Ｃａｔａｌｏｇｕ ｅ Ｎｕｍｂｅｒ：９４５７０１）から購入した。このライブラリは、ベクトル ラムダダッシュＩＩにクローン化された、２ｘ１０⁶の１５−２０ｋｂ Ｓａ ｕ３Ａｌ 部分ウシＤＮＡ２フラグメントを含有していた。ウシの全脳ＣＤＮＡ ライブラリを、Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ（Ｃａｔａｌｏｇｕｅ Ｎｕｍｂｅｒ：ＢＬ １０１３９）から購入した。全脳と、ウシ下垂体と、ウシ後部下垂体とから、調 製したｍＲＮＡから補足性ＤＮＡライブラリを構成した（Ｉｎ Ｖｉｔｒｏｇｅ ｎ；Ｓｔｒａｇｅｎｅ）。Ｖｉｔｒｏｇｅｎは２つのｃＤＮＡライブラリからな る：一つのライブラリは、ベクトル ラムダ ｇ１０であり、他方はベクトル ｐｃＤＮＡＩである（プラシミドライブラリ）。前記Ｓｔｒａｔａｇｅｎライブ ラリは、ベクトルラムダ ユニザップ（ｕｎｉｚａｐ）よりなる。全体として、 前記ｃＤＮＡライブラリは、１，４００万の一次組替えファージを含有していた 。 前記ウシゲノムライブラリを、各プレートにつき、１５０，０００ないし２ ００，０００のファージプレークで、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ホスト株ＬＥ３９２ で ２３ｘ２３ｃｍのプレート（Ｎｕｎｃ）にプレート化した。各プレートは、約一 つのウシゲノム等価物を表した。３７℃での一晩の培養後、前記プレートを冷却 して、マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）他（１：６０−８１）の手法に従って 、複製フィルタを作った。４つのプレークリフトを、各プレートから非チャージ ナイロン膜に作った（Ｐａｌｌ Ｂｉｏｄｙｎｅ Ａ又はＭＳＩ Ｎｉｔｒｏｐ ｕｒｅ）。前記ＤＮＡを、紫外線下で５分間のクロスリンキングによって、又は 、８０℃の真空下において２時間のベーキングで、前記膜上に固定した。ＤＮＡ プローブを、製造会社の指示に従って、ガンマ３２Ｐ ＡＴＰ（Ｎｅｗ Ｅｎｇ ｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ；６５００ Ｃｉ／ｍｍｏｌ）とともにＴ４ ポリヌ クレオチドキナーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用して標 識化した。簡単に説明すると、５０ｐｍｏｌｓの退化ＤＮＡオリゴマを、３７℃ で３０分間、６００μＣｉ ガンマ³²Ｐ−ＡＴＰと５単位のＴ４ ポリヌクレオ チドキナーゼの存在下において培養した。反応を終結させ、ゲル電気泳動負荷バ ッファを添加し、次に、放射能標識化プローブを、電気泳動によって精製した。 ３２Ｐ標識化プローブを、ゲルスライスから摘出し、水に溶出した。別の方法と して、ＤＮＡプローブを、ショウォルター（Ｓｃｈｏｗａｌｔｅｒ）及びソマー （Ｓｏｍｍｅｒ），Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｅｍ １７７：９０−９４（１９８９） の実験記録に従って、α−３２Ｐ−ｄＡＴＰ又はα−３２Ｐ ｄＣＴＰを組み込 むことにより、ＰＣＲ増幅で標識化した。ＰＣＲ反応において標識化したプロー ブを、セファーデックス Ｇ−１５０カラムでの脱塩によって精製した。 プレハイブリダイゼーションとハイブリダイゼーションを、ＧＭＣバッファ （０．５２ Ｍ ＮａＰｉ，７％ ＳＤＳ，１％ ＢＳＡ，１．５ｍＭ ＥＤＴ Ａ，０．１Ｎ ＮａＣｌ １０ｍｇ／ｍｌ ｔＲＮＡ）中で行った。洗浄は、オ リゴウォシュ（１６０ｍｌ １ＭＮａ₂ＨＰＯ₄，２００ｍｌ ２０％ ＳＤＳ， ８．０ｍｌ ０．５ Ｍ ＥＤＴＡ，１００ｍｌ ５Ｍ ＮａＣｌ，３６３２ ｍｌ Ｈ₂Ｏ）。通常は、１０のウシゲノム等価物の複写コピーを表す２０のフ ィルタ（それぞれ４００平方センチ）を、１００ｐｍｏｌｓの退化オリゴヌクレ オチドプローブ（１２８−５１２倍の退化）とともに２００ｍｌのハイブリッド 化溶液中において培養した。ハイブリッド 化は、前記退化プローブに対し算出された最低溶融温度以下の５℃で、一晩、進 行させるようにした。尚、最低溶融温度の計算においては、ＡＴペアに対して２ ℃、ＧＣペアに対して４℃と仮定した。 フィルタを、そのハイブリダイゼーション温度において、オリゴウォシュを 繰り返し交換して、４ないし５時間にわたり洗浄し、最後に、ＤＮＡプローブの 長さに依存した温度において３０分間、３．２Ｍテトラメチルアンモニウムクロ ライド、１％ＳＤＳで２度洗浄した。２０ｍｅｒｓの場合、最終洗浄温度は６０ ℃であった。フィルタを取り付け、次に、強化スクリーン（デュポン社、Ｃｒｏ ｎｅｘ Ｌｉｇｈｔｅｎｉｎｇ Ｐｌｕｓ）を使用してＸ線フィルム（コダック 社ＸＡＲ５）に露光した。通常は、−８０℃において３ないし５日間の露光で、 これらのライブラリスクリーン中の複製信号を検出するのに十分であった。その 結果の分析後、フィルタを取り外して、再プローブすることができた。フィルタ の取り外しは、１０ｍＭのＥＤＴＡ ｐＨ８を含有する１％ＳＤＳの溶液中で、 フルパワー状態のマイクロウェーブオーブンで１５分間のサイクルを２回行って 培養することによって行わ れた。フィルタは、最低３ないし４回のサイクルを通じて取られ、様々なプロー ブで再プローブした。ＩＩＩ．組替えファージの分離、成長及びＤＮＡ調製 これらの手法は、組替え ＤＮＡ（マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）他 ２：６０−２：８１）に記載の標準実験記録に基づいて行われた。ＩＶ．ＤＮＡ消化とサザンブロットとを使用した分離クローンの分析 組替えファージＤＮＡサンプル（２マイクログラム）を、制限エンドヌクレ アーゼ製造会社（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）によって推奨され た条件に従って消化した。３７℃に於ける４時間の培養後、反応生成物を、０． １Ｍ酢酸ナトリウムと３倍量のエタノールとの存在下において沈澱させた。沈澱 ＤＮＡを、遠心分離によって採取し、７５％のエタノールですすぎ、乾燥させた 。すべての再懸濁サンプルを、アガロースゲル（通常、ＴＡＥバッファにおいて １％０．０４Ｍ Ｔｒｉｓアセテート、０．００２Ｍ ＥＤＴＡ）にかけた。ゲ ルのランは、１センチメートル当り１ボルトで４ないし２０時間行った。マーカ ーには、ラムダ Ｈｉｎｄ ＩＩＩ ＤＮＡフラグメント及び／又はΦＸ１７４ＨａｅＩＩＩ Ｄ ＮＡフラグメント（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）が含まれていた 。前記ゲルを、０．５マイクログラム／ｍｌの臭化エチディウムによって染色し 、撮影した。サザンブロッティングのために、ＤＮＡを、先ず０．１２５Ｎ Ｈ Ｃｌでの処理によって、前記ゲル中にて脱プリンし、０．５Ｎ ＮａＯＨで変成 し、そして２０ｘＳＳＣ（３Ｍ 塩化ナトリウム、０．０３Ｍ クエン酸塩ナト リウム）で非チャージナイロン膜に移した。ブロッティングを、６時間から２４ 時間かけて行い、次に、フィルタを、０．５Ｔｒｉｓ ＨＣｌ ｐＨ７．５，０ ．１５Ｍ塩化ナトリウム中で中和し、次に、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ほう酸 ＥＤ ＴＡ中で簡単にすすいだ。 架橋するのために、前記フィルタを、先ず、透明プラスチックラップに包み 、次に、ＤＮＡ側を紫外線に５分間露光した。ハイブリッド化と洗浄を、ライブ ラリスクリーニングに関して説明したように行った（この実施例の第２節参照） 。類似の遺伝子が他の種に存在するか否かを調べるたハイブリッド分析において 、僅かな変更を行った。前記ＤＮＡフィルタは、 Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ（Ｃａｔａｌｏｇｕｅ Ｎｕｍｂｅｒ７７５３−１）から購 入したもので、各レーン当り様々な種に関しての５マイクログラムのＥｃｏＲＩ 消化ＤＮＡを含有している。前記プローブを、前記セクション２に記載の方法で 、ＰＣＲ増幅反応によって標識化し、ハイブリッド化を、硫酸デキストランを１ ０％を含有する８０％バッファＢ（２ｇのポリビニルピロロリジン、２ｇのＦｉ ｃｏＩＩ−４００、２ｇのウシ血清アルブミン、５０ｍｌ １Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｈ Ｃｌ（ｐＨ７．５）５８ｇ ＮａＣｌ，１ｇピロ燐酸ナトリウム、１０ｇのドデ シル硫酸ナトリウム、９５０ｍｌの水）中で行った。前記プローブを、１０分間 の沸騰で変成させ、次に、氷水中にて急冷させた。このプローブを、ミリリット ル当り１０⁶ｄｐｍ ³²Ｐで前記ハイブリッド化バッファに添加し、６０℃で一 晩培養した。前記フィルタを６０℃にて、先ずバッファＢ中で、次に２Ｘ ＳＳ Ｃ、０．１％ＳＤＳで、その後、１ｘ ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳで洗浄した。厳 密度を高くするために、実験、最終洗浄は、０．１ｘ ＳＳＣ、１％ＳＤＳで、 温度を６５℃に上げて行った。 前記ゲノムクローンの制限マップを作り、どのサブ フラグメントが前記ＧＧＦプローブ（サブクローニングの候補）にハイブリッド したかを示すためにサザンブロットを使用した。Ｖ．ＤＮＡ相同体のセグメントのハイブリッド化プローブへのサブクローニング ＤＮＡ消化物（例えば、５マイクログラム）を、１％のアガロースゲルに投 入し、次に、適当なフラグメントを染色後、ゲルから摘出した。前記ＤＮＡを、 ガラスビーズへの吸着によって精製し、その後、製造会社（Ｂｉｏ １０１）に よって記載された実験記録を使用して溶出した。回収したＤＮＡフラグメント（ ００−２００ｎｇ）を、Ｔ４リガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ ｓ）を使用して、例えば、ｐＵＣ１８の派生物であるｐＴ３Ｔ７（Ａｍｂｉｏｎ ）等のリニア化された脱燐酸化ベクター中に結合した。このベクターは、Ｅ．ｃ ｏｌｉ ．βラクタマーゼ遺伝子を有しているので、形質転換物質を、アンピシリ ンを含むプレート上で選別することが可能である。前記ベクターは、更に、ホス ト細胞へβ−グラクトシダーゼ相補性を与えるので、非−組替え（ブルー）を、 イソプロピルチオガラクトシドとブルオーグ（Ｂｌｕｏｇ）他 （Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｓ）とを使用して検出する ことができる。前記結合（ｌｉｇａｔｉｏｎ）反応物の一部を、使用して、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ１２ ＸＬ１ブルー競合細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃａｔａｌ ｏｇｕｅ Ｎｕｍｂｅｒ ２００２３６）を形質転換し、次に、これらの形質転 換物質をアンピシリン１ｍｌ当り５０マイクログラムを含有するＬＢプレート上 にて選別した。ホワイトコロニーを選別し、プラスミドミニプレップをＤＮＡ消 化及びＤＮＡ配列分析のために調製した。選別したクローンを、それらの挿入Ｄ ＮＡが前記ＧＧＦプローブとハイブリッド化したか否かを確認するために再テス トした。ＶＩ．ＤＮＡ配列決定 ２重ストランドプラスミドＤＮＡテンプレートを、標準実験記録に従って、 ５ｍｌの培養から調製した。製造業者の実験記録に従い、シーケナーゼ２．０と ジデオキシヌクレオチド配列キット（ＵＳ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ）とを使用 したジデキシチエーン終結法によって、配列決定を行った（サンガー（Ｓａｎｇ ｅｒ）他ＰＮＡＳ；ＵＳＡ ７４： ５４６３（１９７７）の変形）。あるいは、配列決定を、サイクル配列決定キッ ト（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ；Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａ ｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用した熱サイクラー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，ｍｏｄｅｌ ４８００）中において行い、５’−末端標識化プライ マを使用した製造業者の指示に従って行った。配列プライマは、前記配列決定キ ットで供給されたものか、あるいは、前記クローンから決められた配列によって 合成されたものであった。配列決定用反応物を、６％ポリアクリルアミドの０． ４ｍｍ厚さ配列決定用ゲル上に負荷（ｌｏａｄ）し、溶解した。ゲルを乾燥し、 Ｘ線フィルムに露光した。通常、標準配列決定キットが使用された時は３５Ｓが 組み込まれ、３２Ｐ末端標識化プライマをサイクル配列決定反応に使用した。配 列は、ゲルの底部から頂部の方向（５’より３’の方向に向かって）にＤＮＡ配 列エディタに読み込まれ、データを、ジェネティクス・コンピューター・グルー プ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ）（ＧＣＧ，ウィスコン シン大学）によって供給されているプログラムを使用して解析した。ＶＩＩ．ＲＮＡの調製とＰＣＲの増幅 ゲノムＤＮＡ中に検出され、ＧＧＦペプチドをコード化する配列を含む転写 解読枠を、下垂体ＲＮＡのＰＣＲ増幅によって拡張した。ＲＮＡは、グアニジン 中性−ＣｓＣｌ手法（チャーグウィン（Ｃｈｉｒｇｗｉｎ）他Ｂｉｏｃｈｅｍｉ ｓｔｒｙ １８：５２９４（１９７９））に従って冷凍ウシ繊維組織（Ｐｅｌｆ ｒｅｅｚｅ）から調製した。ポリアデニール化ＲＮＡは、オリゴ−ｄＴセルロー スカラムクロマトグラフィによって選別した（Ａｖｉｖ ａｎｄ Ｌｅｄｅｒ ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）６９：１４０８（１９７２））。 特定のＤＮＡ目標配列を、全ＲＮＡ、もしくは、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ ＰＣＲ／ＲＮＡキットＮｏ．Ｎ８−８−００１７を使用してｃＤＮＡから変換 しておいたポリアデニール化ＲＮＡサンプルから始めて増幅した。第１ストラン ド逆転写反応は、１μｇのテンプレートＲＮＡ及び、制限酵素認識サイトリンカ ーを結合したオリゴｄＴのプライマーか、又は、制限サイトを結合したクローン 化配列から決められた特定のアンチセンスプライマのいずれかを使用した。第 ２ストランドを作るために、前記プライマは、３’ＲＡＣＥ反応（フローマン（ Ｆｒｏｈｍａｎ）他ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）８５：８９９８（１９８８））において 使用されるプラスストランド特徴配列か、あるいは、第２目標サイトが、予め、 ｄＡＴＰを備えた第１ストランド反応生成物の後の終端トランスフェラーゼによ って添加された場合（例えば、５’のレース反応、フローマン（Ｆｒｏｈｍａｎ ）他 ｉｂｉｄ）には制限サイトを取り付けたオリゴｄＴプライマのいずれかで あった。あるいは、固定されたＰＣＲ反応物と同様に、前記第２ストランドプラ イマは分解物であって、従って特定のペプチド配列を示すものであった。 増幅プロフィールは、次の一般的手法に従った。 １）９５℃で５分間の浸漬ファイル；２）９５℃、１分間の熱サイクルファイ ル、１分間で４５℃、５０℃又は５５℃のアニーリング温度にまで下げ、このア ニーリング温度を１分間維持：１分間以上で７２℃にまで温度を上げる；７２℃ で拡張するか、あるいは、１分１０秒で自動拡張、３）７２℃での５分間の拡張 サイクル、及び４）４℃で不定時間の浸漬ファイル。熱サイクルファイル（＃２ ）は、通常、３０サイクルだ け実行した。各１００μｌの増幅反応の１６μｌサンプルを３時間、１センチメ ータ当り４ボルトの条件で、ＴＡＥバッファ中において２％Ｎｕｓｉｅｖｅ、１ ％アガロースゲルでの電気泳動実行によって分析した。これらゲルを染色し、次 に、前記プライマの内部の標識化ＤＮＡプローブでプローブした非チャージナイ ロン膜にブロットした。 このブロッチング実験において、特定のセットのＤＮＡ増幅生成物を同定す ることができた。そして、その位置を、精製と再増幅のためのガイドとして使用 した。適当な場合、選別されたサンプルの残りの部分を、調製ゲルに負荷し、次 に、電気泳動を行い、前記ゲルから０．５ｍｍ厚さの４ないし５のスライス（特 定生成物の予想位置をブラケット化する）を取り出した。前記アガロースを粉砕 し、次に、４０℃で２〜１６時間、０．５ｍｌの電気泳動バッファ中に浸漬した 。粉砕したアガロースを２分間遠心分離し、水相を新しい試験管に移した。 最初の反応と同じセットのプライマと反応プロフィールとを使用し、５μｌ （生成物の約１％）の溶出物 質に対して再増幅を行った。再増幅反応が完了したとき、サンプルを、クロロフ ォルムで抽出し、新しい試験管に移した。リンカー中に存在する制限サイトで切 り離すために、濃縮制限酵素バッファと酵素とを、反応物に添加した。消化ＰＣ Ｒ生成物を、ゲル電気泳動によって精製し、次に、前述のサブクローン化の章に 記載のようにベクターにサブクローン化した。ＤＮＡ配列決定は、前述のように 行った。ＶＩＩＩ．ＤＮＡ配列分析 フラグメントアセンブリプログラムを使用してＤＮＡ配列をアセンブルし、 アミノ酸配列を、ＧＣＧプログラムＧｅｌ Ａｓｓｅｍｂｌｅ，Ｍａｐ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｅによって推定した。これらの推定タンパク質配列を、質問 配列（ｑｕｅｒｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）として使用して、ワード・サーチ（Ｗｏ ｒｄ Ｓｅａｒｃｈ）を使用してタンパク質配列データベースを検索した。分析 は、ＶＭＳ５．１で作動するＶＡＸステーション３１００ワークステーションに て行った。前記データベース検索は、ＧＣＧバージョン７．０を使用したＳｗｉ ｓｓ Ｐｒｏｔ ｒｅｌｅａｓｅ Ｎｏ．２１にて行った。ＩＸ．ＧＧＦ−Ｉ及びＧＧＦ−ＩＩをコード化する遺伝子のクローン化と配列決 定の結果 前述のように、ウシＧＧＦ−ＩＩをコード化するＤＮＡ配列を同定するため に、分解オリゴヌクレオチドプローブを、ＧＧＦ−ＩＩペプチド配列から構成し た。リシルエンドペプチダーゼによって消化された、精製ＧＧＦ−ＩＩ調合物の ペプチドであるＧＧＦ−ＩＩ１２（配列認識番号４４）（図１１及び１２参照） は、精製ＧＧＦ−Ｉ調製物から調製されたトリプシンペプチドであるＧＧＦ−Ｉ ０７（配列認識番号３９）と強いアミノ酸配列相同性を示した。従って、１０ 個の退化オリゴヌクレオチドプローブを作るためにＧＧＦ−１1１２を使用した （図２１の配列認識番号６９，７０，７１，７９としてそれぞれ示されているオ リゴ６０９，６１０，６４９−６５６参照）。フィルタの複製セットを、ＧＧＦ −ＩＩ １２の二つのオーバーラップする部分をコード化する２セットのプロー ブ（セット１＝６０９，セット２＝６４９−５６５６）でプローブした。ハイブ リッド化信号が観察されたが、両方のプローブセットにハイブリッドしたクロー ンは一つだけであった。このクローン（ＧＧＦ２ＢＧ１として指定）を精製した 。 前記ファージクローンＧＧＦ２ＢＧ１からのＤＮＡのサザンブロッチング分 析によって、両方のプローブセットが前記ウシＤＮＡ配列とハイブリッドしたこ とが確認されるとともに、更に、両方のプローブが、該クローン中において、同 じセットのＤＮＡフラグメントと反応していることが判った。これらの実験に基 づき、元のクローンの４ｋｂ Ｅｃｏ ＲＩサブ−フラグメントが同定され、サ ブクローン化され、部分的に配列決定された。図２２は、前記ヌクレオチド配列 配列認識番号８９とプローブ６０９及び６５０のハイブリダイゼーションサイト を含む初期ＤＮＡ配列解読の推定アミノ酸配列を示し、更に、このウシゲノムＤ ＮＡの部分がペプチド１２（ＫＡＳＬＡＤＳＧＥＹＭ）をコード化したことを立 証している。 更に配列分析をしたところ、前記ＧＧＦ−ＩＩ １２が、ウシＧＧＦ−ＩＩ 遺伝子とｃＤＮＡとを表すオーバーラップ配列の分離の開始点になった６６アミ ノ酸転写解読枠（下記参照）に位置することが判った。 いくつかのＰＣＲ手法を使用して、推定ウシＧＧＦ−ＩＩ遺伝子の、更に別 のコード化配列を得た。全部の ＲＮＡ及びオリゴｄＴ−選択（ポリＡ含有）ＲＮＡサンプルを、ウシの全下垂体 、前方下垂体、後方下垂体、及び視床下部から調製した。図２３、配列認識番号 １０９−１１９に示すリストからのプライマを使用して、片側（ｏｎｅ−ｓｉｄ ｅｄ）ＰＣＲ反応によって、３’と５’との両方の方向においてｃＤＮＡ末端を 増幅し、固定ＰＣＲ反応を、別のＧＧＦ−ＩＩペプチドを表す退化オリゴヌクレ オチドプライマにて行った。図２４は、これらの実験において得られた隣接する ＤＮＡ構造体と、配列とをまとめて示している。３’レース（ＲＡＣＥ）反応か ら、三つの交互にスプライスされたｃＤＮＡ配列が生成され、これらをクローン 化し配列決定した。５’レース反応によって、少なくとも５２のアミノ酸のコー ド化配列を含む別のエクソンが発見された。この推定アミノ酸配列の分析によっ て、ペプチドＧＧＦ−ＩＩ−６と、ＧＧＦ−Ｉ−１８に類似した配列とが明らか になった（下記参照）。固定化ＰＣＲ反応によって、３００ｂｐの別のｃＤＮＡ セグメント中に含有されるペプチドＧＧＦ−ＩＩ−１，２，３及び１０の（ｃＤ ＮＡ）コード化配列が同定された。このセグメントの５’境界（即ち、図３１の セグメントＥ）は、ペプチドＧＧＦ−ＩＩ−１をコード 化するとともに、前記ＰＣＲ反応において使用されたオリゴヌクレオチドによっ て規定されている（例６のヒトクローンに関して記載されているように別の５’ 配列データが存在する）。従って、このクローンは、既存の全部で９つの新規な ＧＧＦ−ＩＩペプチド配列の内の６つをコード化するヌクレオチド配列を有する 。 前記クローン化遺伝子は、先ず、前記コード化配列を、それらが見出された 状態（図２５参照）において位置決めすることを可能にするＧＣＦ２ＢＧ１の物 理的地図を構成することによって特徴付けられる。上述のコード化配列からのＤ ＮＡプローブを使用して、このファージクローンにおいて前記エクソンを含有す る更に別のＤＮＡフラグメントを同定するとともに、両方の方向においてオーバ ラップするクローンを同定した。前記推定ウシＧＧＦ−ＩＩ遺伝子は、少なくと も５つのコード化セグメントに分割される。コード化セグメントは、ユニバーサ ルな遺伝子コードを使用してポリペプチド配列に翻訳可能な、個々の長さのＤＮ Ａ配列であると定義される。図３１に示し、本出願において言及されるこれらコ ード化セグメントは以下の通りである。１）ＧＧＦ遺伝子内に存在する特定のエ ク ソン（例えば、コード化セグメントａ）、あるいは、２）各セットが図示の遺伝 子生成物と同様に特定のポリペプチドセグメントに翻訳可能な場合において、ｍ ＲＮＡｓの特定のサブーグループ中に現れる２つ又はそれ以上のエクソンのセッ トから派生するもの。クレームにおいて言及されているポリペプチドセグメント は、前記相同ＤＮＡコード化セグメントの翻訳生成物である。これまで、コード 化セグメントＡ及びＢのみが、エクソンとして定義され、配列決定されマップ化 された。図２６は、同定された隣接コード化配列をまとめて示している。エクソ ンは、その発見の順序（アルファベット順）でリストされている。そのイントロ ン／エクソン境界から、エクソンＢを、コード化セグメントＥとコード化セグメ ントＡとを接続するｃＤＮＡｓに含めることが出来ることが明らかである。即ち 、エクソンＢは、その読み取り枠を損なうことなく、スプライスすることは出来 ない。従って、我々は、三つのスプライシングパターンが、推定ウシＧＧＦ−Ｉ Ｉ ｃＤＮＡ配列１，２及び３を生成することが出来ると示唆する。それぞれ、 ＧＧＦ２ＢＰＰ１．ＣＤＳ、ＧＧＦ２ＢＰＰ２．ＣＤＳ及びＧＧＦ２ＢＰＰ３． ＣＤＳとされるこれらのコード化配列は、図２８ａ（配列認 識番号１３３）、２８ｂ（配列認識番号１３４）及び２８ｃ（配列認識番号１３ ５）にそれぞれ示されている。これら三つのｃＤＮＡの推定アミノ酸配列も、図 ２８ａ（配列認識番号１３３）、２８ｂ（配列認識番号１３４）及び２８ｃ（配 列認識番号１３５）にそれぞれ示されている。 これら三つの推定構造体は、アミノ酸長さが２０６，２８１，２５７である タンパク質をコード化する。推定されたタンパク質配列の最初の１８３残基は３ つの遺伝子生成物において同一である。位置１８４において、前記クローンは大 幅に異なっている。ＧＧＦ２ＢＰＰ１におけるグリシンＧＧＴ用に対するコドン は、又、ＧＧＦ２ＢＰＰ２とＧＧＦ２ＢＰＰ３に対するスプライスドナーとして も作用し、これらは、それぞれ交互に、エクソンＣ，Ｃ／Ｄ，Ｃ／Ｄ’及びＤ又 はＣ，Ｃ／Ｄ及びＤに加わるものであり、図３３において、配列認識番号１４９ として示されている。ＧＧＦＩＩＢＰＰ１は、前記コード化セグメントＡスプラ イス接合部を越えて次の介在配列（イントロン）への読み取りによって生成され る裁頭遺伝子生成物である。これは、図３１におけるコード化セグメントＡ’ を示す（配列認識番号１４０）。前記転写体は、標準型ＡＡＴＡＡＡポリアデニ ール化配列の隣で終端し、我々は、この裁頭遺伝子生成物が、真性成熟転写体を 表すものであると提案する。他の二つのより長い遺伝子生成物は、同じ３’非翻 訳配列とポリアデニリン化配列を共有する。 これらの三つの分子は、すべて、９つの新規なＧＧＦ−ＩＩペプチド配列の 内の６つを有し（図１２参照）、もう一つのペプチドがＧＧＦ−Ｉ−１８に対し てきわめて高い相同性を有している（図２７参照）。この発見は、この組替え分 子が、ウシＧＧＦ−ＩＩの少なくとも一部分をコード化している可能性がきわめ て高いことを示している。更に、三つのペプチドの計算上の等電点は、ＧＧＦ− ＩとＩＩの物理的特性と一致している。ＧＧＦ−ＩＩの分子の大きさはおよそ６ ０ｋＤであるので、これら三つのｃＤＮＡの最も長いものが、予想数のアミノ酸 の１／２近くをコード化しているはずである。 Ｂ及びＡエクソンを含むプローブを、ＰＣＲ増幅によって標識化し、ウシ後 部下垂体から分離されたＲＮＡ から作られたｃＤＮＡライブラリのスクリーニングに使用した。一つのクローン （ＧＧＦ２ＢＰＰ５）は、図３０に示すパターンを示し、コード化セグメントＡ とＣとの間にもう一つのＤＮＡコード化セグメント（Ｇ）を有していた。核酸配 列の全体が図３２に示されている（配列認識番号１４８）。最長転写解読枠から の予想翻訳生成物は、２４１のアミノ酸である。第２のｃＤＮＡの一部（ＧＧＦ ２ＢＰＰ４）も、上述のプローブを使用してウシ後部下垂体ライブラリから分離 された。このクローンは、図３０に示すパターンを示した。このクローンは、５ ’の部分において不完全であるが、コード化セグメントＧ及びＤを欠いていると いう意味においてこれはスプライシング変異体である。ＢＰＰ４も、領域Ｃ／Ｄ 以降において領域Ｈ，Ｋ及びＬを備えた新規な３’末端を示す。ＢＰＰ４の配列 は、図３４に示されている（配列認識番号１５０）。 例５ 様々な種に於けるＧＧＦ配列 データベース検索によっては、予想ＧＧＦ翻訳生成物と公知のタンパク質配列 との間になんら有義な類似性は 見つからなかった。これは、ＧＧＦ−ＩＩが、タンパク質の新規なファミリ又は スーパーファミリの最初のメンバであることを示唆している。これまでに我々が 示した、他のほ乳類ＤＮＡとの高厳密度のクロスハイブリッド研究（ＤＮＡブロ ッチング実験）においては、はっきりと、このウシ組替え分子からのＤＮＡプロ ーブによって、テストされた様々なサンプルにおいて特定の配列が容易に検出さ れる。相同性の高い配列は、ヒトゲノムＤＮＡにも検出された。そのオートラジ オグラムを図２９に示す。ラットとヒトのＤＮＡを含むレーンの信号は、ＧＧＦ 遺伝子のラット及びヒト同等物を表し、この遺伝子によってコード化された複数 のｃＤＮＡの配列が、最近、ホルムズ（Ｈｏｌｍｅｓ）他（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２ ５６ ：１２０５（１９９２））とウェン（Ｗｅｎ）他（Ｃｅｌｌ ６９：５５９ （１９９２））とによって報告されている。 例６ ヒト配列コード化ヒトＧＧＦ２の分離 ウシＧＧＦＩＩコード化セグメントＥをからの配列を含む複数のヒトクローン を、脳幹から調製されたヒトｃＤＮＡライブラリをスクリーニングすることによ って 分離した（Ｓｔｒａｔａｇｎｅｎｅ ｃａｔａｌｏｇ＃９３５２０６）。このス トラテジーを、大半のＧＧＦ２ペプチド（ＧＧＦ２に特有）と、前記ウシＥセグ メントを含むクローンからの予想ペプチド配列との間の強い関連性に基づき、追 求した。このライブラリは、次にリストするオリゴヌクレオチドプローブ９１４ −９１９を使用した前述の例４、第１１章で記載したものと同様にスクリーニン グした。 ９１４ＴＣＧＧＧＣＴＣＣＡＴＧＡＡＧＡＡＧＡＴＧＴＡ ９１５ＴＣＣＡＴＧＡＡＧＡＡＧＡＴＧＴＡＣＣＴＧＣＴ ９１６ＡＴＧＴＡＣＣＴＧＣＴＧＴＣＣＴＣＣＴＴＧＡ ９１７ＴＴＧＡＡＧＡＡＧＧＡＣＴＣＧＣＴＧＣＴＣＡ ９１８ＡＡＡＧＣＣＧＧＧＧＧＣＴＴＧＡＡＧＡＡ ９１９ＡＴＧＡＲＧＴＧＴＧＧＧＣＧＧＣＧＡＡＡ これらのプローブで検出されたクローンを、ハイブリッド化によって更に分析 した。セグメントＡからのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）生成物を標識化する ことによって生成された、コード化セグメントＡからのプローブ（図２１参照） は、一次ライブラリをスクリーニングするのにも利用した。Ａ及びＥ由来のプロ ーブとハイブ リッド化した複数のクローンを選別し、一つの特定のクローン、ＧＧＦ２ＨＢＳ ５、を選別して更に分析した。このクローンは、コード化セグメントのパターン （図３１に示すＥＢＡＣＣ／Ｄ’Ｄ）によって表されている。このクローン中の Ｅセグメントは、図３７に示されるＥの裁頭化ウシ・バージョンのヒト等価物で ある。ＧＧＦ２ＨＢＳ５は、前述のすべての「推定」ＧＧＦ−ＩＩ候補の内で最 も可能性の高い候補である。コード化配列セグメントＥの長さは、７８６のヌク レオチドと２６４の非翻訳配列のベースとである。ＧＧＦ２ＨＢＳ５によってコ ード化されるタンパク質の予想サイズは、約４２３アミノ酸であり（約４５キロ ダルトン、図４５，配列認識番号１６７参照）、これはデグリコシル化状態のＧ ＧＦ−ＩＩ（例１６参照）のサイズに類似している。更に、図２７にリストした ＧＧＦ−ＩＩペプチドのうちの７つは、領域Ｅから予想されるタンパク質配列内 に属する同等配列を有している。ペプチドＩＩ−６とＩＩ−１２は例外であって 、それぞれコード化セグメントＢ及びコード化セグメントＡに属する。ＧＦ２Ｈ ＢＳ５タンパク質をコード化するＲＮＡを、ＧＧＦ２ＨＢＳ５挿入部を有するベ クトル（Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ［Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｉｎｃ．］図４ ４参照）にあ るバクテリオファージＴ７プロモータによってドライブされた生体外転写システ ム中において生成した。このＲＮＡは、無細胞（ラビット網状赤血球）翻訳シス テムに翻訳され、そのタンパク質生成物のサイズは４５ｋｄであった。 更に、前記無細胞生成物を、シュワン細胞細胞分裂誘発分析において分離し、 生物学的活性を確認した。調整培地によって処理されたシュワン細胞は、¹²⁵Ｉ −ウリジンの組み込みによって測定した増殖度の増加と、１８５キロダイン領域 のタンパク質のチロシンの燐酸化との両方を示した。従って、ＧＧＦ２ＨＢＳ５ によってコード化された生成物のサイズと、図１２に示したウシペプチドに対す る相同性の高いヒトペプチドをコード化するＤＮＡ配列の存在とは、ＧＧＦ２Ｈ ＢＳ５が、ウシＧＧＦ２のヒト等価物をコード化することを裏付けるものである 。このクローンと形質変換した細胞から作られた調整培地が、シュワン細胞細胞 分裂誘発活性を顕在化させるという事実から、ＧＧＦＩＩＨＢＳ５遺伝子生成物 （前記ＢＰＰ５遺伝子生成物とは違って）が分泌されるということが確かめられ た。更に、ＧＧＦＩＩＢＰＰ５遺伝子生成物は、ｐ１８５^erbB2等のレセプタチ ロシンキナー ゼや、あるいは、密接に関連したレセプタ（図１４参照）を介してシュワン細胞 増殖反応を仲介すると考えられる。 例７ ほ乳類及び昆虫細胞におけるヒト組替えＧＧＦ２の発現 ヒトＧＧＦ２をコード化する前記ＧＧＦ２ＨＢＳ５ｃＤＮＡ（例６において記 載され、ここでＨＢＳ５と称される）を、ベクトルｐｃＤＬ−ＳＲα２９６にク ローン化し（タケベ（Ｔａｋｅｂｅ）他Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：４６ ６−４７２（１９８８））、ＣＯＳ−７細胞を、ＤＥＡＥ−デクストラン法（サ ムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）他Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ ｅｄ．ＣＳＨ Ｌａｂｏｒａｔ ｏｒｙ ＮＹ（１９８９））によって、１００ｍｍディシュにおいて移入させた 。細胞溶解物又は一過的発現ＣＯＳ細胞からの調整培地を、移入の３又は４日後 に収穫した。溶解物を調製するために、細胞単層を、ＰＢＳによって洗浄し、１ ５０μｌの０．２５Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８中での三回の冷凍／解凍サイ クルによって溶解したディシュから掻き取った。細胞堆積物をペレットで取り、 上澄 を回収した。調整培地サンプル（７ｍｌ）を収集し、次に、濃縮し、製造業者（ アミコン（Ａｍｉｃｏｎ），マサチューセッツ州，ビヴァリー）によって記載さ れたようにＣｅｎｔｉｐｒｅｐ−１０とＣｅｎｔｒｉｃｏｎ−１０ユニットを使 用して、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．４とバッファ交換した。前述したように （例３参照）、ラットの神経シュワン細胞のＤＮＡ合成先駆体の組み込みを分析 した。調整培地又は細胞溶解物サンプルを、例３において記載した方法で、シュ ワン細胞増殖分析においてテストした。その細胞分裂誘発活性データは、図４６ に示されている。ＧＧＦ２をコード化する、ｃＤＮＡ、ＧＧＦ２ＨＢＳ５は、タ ンパク質生成物の分泌を前記培地に振り向けた。全活性の極く一部分が、細胞分 解物を使用した分析によって、細胞内に検出可能であった。ＧＧＦ２ＨＦＢ１と ＧＧＦＢＰＰ５ ｃＤＮＡでは、生成物の分泌を細胞外培地に振り向けることが 出来なかった。これらのクローンからのＧＧＦ活性物質は、細胞分解物において のみ検出可能であった（図４６）。 組替えＧＧＦ２も、ＣＨＯ細胞に発現された。ＧＧＦ２をコード化するＧＧＦ ２ＨＢＳ５ ｃＤＮＡを、ベクトルｐｃｄｈｆｒｐｏｌｙＡのＥｃｏＲＩサイト にクロー ン化し（図５４）、燐酸カルシウム共沈法（Ｇｒａｈａｍ ａｎｄ Ｖａｎ Ｄ ｅｒ Ｅｂ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２：４５６−４６７（１９７３））によって ＤＨＦＲネガティブＣＨＯ細胞に移入した。クローンを、９６−ウェルプレート 中のヌクレオチド及び無ヌクレオチドα媒体（Ｇｉｂｃｏ）内で選別した。３週 間後、個々のクローンの調整培地を、例３で記載したシュワン細胞増殖分析によ って、ＧＧＦ発現のためにスクリーニングした。前記培地へかなり高いレベルの ＧＧＦ活性物質を分泌した安定したクローンが同定された。ＣＨＯ細胞調整培地 の異なった分量の部分標本から得られたシュワン細胞増殖活動データを使用して 、図４７に示す投与量反応曲線を得た（Ｇｒａｈａｍ ａｎｄ Ｖａｎ Ｄｅｒ Ｅｂ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ５２：４５６，１９７３））。この物質を、ＧＧＦ ２特定ペプチドに対して生成したポリクローナル抗血清によってプローブしたウ ェスタンブロッチングにて分析した。約６９−９０ｋｄ（下垂体及び高分子量グ リコフォームから抽出されたＧＧＦ２の予想サイズ）の広い範囲のバンドが特異 的に標識化されている（図４９，レーン１２）。 組替えＧＧＦ２は、バクロビールス発現を使用して昆 虫細胞にも発現した。Ｓｆ昆虫細胞を、ＧＧＦ２ＨＢＳ５ｃＤＮＡクローンを含 有するバクロビールスに、３〜５の多重度（１０⁶細胞／ｍｌ）で感染させ、そ してＳｆ９００−ＩＩ媒体（Ｇｉｂｃｏ）中で培養した。シュワン細胞細胞分裂 誘発活性物質を、前記細胞外媒体中に分泌させた（図４８）。異なった分量の昆 虫細胞調整培地を、フォルスクリン不存在の状態で、シュワン細胞増殖分析でテ ストし、そのデータを使用して図４８に示す投与量反応曲線を得た。 この物質は、更に、前述のＧＧＦ ＩＩ特異性抗体でプローブしたウェスタン ブロッチング（図４７）でも分析した。４５ｋｄのバンド、デグリコシル化ＧＧ Ｆ−ＩＩ（例１６）のサイズが示されている。 この例で使用された方法は、次の通りである。 組替えヒト及びウシ・グリア成長因子のシュワン細胞細胞分裂誘発活性を以下 のように測定した。培養シュワン細胞の細胞分裂誘発反応を、短命ほ乳類発現実 験から得た粗組替えＧＧＦ生成物を使用して、５μＭのフォルスクリンの存在下 において測定した。［¹²⁵Ｉ］− ウリジンの組み込みを、前述の方法に記載の移入した、あるいは疑似移入したＣ ＯＳ細胞から得た物質にたいして１８〜２４時間さらした後に行った。４セット のデータの平均及び標準偏差が図示されている。部分的に精製された天然ウシ下 垂体ＧＧＦ（カルボキシルメチル セルロース フラクション：グッドアール（ Ｇｏｏｄｅａｒｌ）他、提出）に対する細胞分裂誘発反応が、１００パーセント の活性の標準として図示（ＧＧＦ）されている。 ｃＤＮＡ（図５３）を、ｐｃＤＬ−ＳＲα２９６にクローン化し（タケベ（Ｔ ａｋｅｂｅ）他，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ ｂｉｏｌ．８：４６６−４７２（１９８８ ））、ＣＯＳ−７細胞を、ＤＥＡＥ−デキストラン法（サムブルック（Ｓａｍｂ ｒｏｏｋ）他，Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ．Ａ Ｌａｂｏｒａ ｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ．ｅｄ．（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ ｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ ｏｒ，ＮＹ，１９８９））によって１００ｍｍディシュ中で移入した。細胞溶解 物又は調整培地を転写の３又は４日後に収穫した。溶解物を調製するために、細 胞単層をＰＢＳによって洗浄し、ディシュから掻き取り、１５０μｌの０．２５ Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８中での３回の冷凍／解凍サイクルによって溶解した。 細胞堆積物をペレットとし、上澄を回収した。調整培地サンプル（７ｍｌｓ）を 採取し、次に、濃縮し、製造業者（アミコン（Ａｍｉｃｏｎ），マサチューセッ ツ州，ビヴァリー）によって記載されたようにＣｅｎｔｉｐｒｅｐ−１０とＣｅ ｎｔｒｉｃｏｎ−１０ユニットを使用して、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．４と バッファ交換した。前述したように（デイヴィス（Ｄａｖｉｓ）およびストロー バント（Ｓｔｒｏｏｂａｎｔ），Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１１０：１３５３− １３６０（１９９０）；ブロックス（Ｂｒｏｃｋｅｓ）他，Ｂｒａｉｎ Ｒｅｓ ．１６５：１０５−１１８（１９７９））、ラットの座骨神経シュワン細胞はＤ ＮＡ合成先駆体の組み込みについて分析した。 組替えＣＨＯ細胞調整培地のウェスタンブロッチングは、以下のように行った 。一つのＣＨＯクローンを、７ｍｌのＭＣＤＢ３０２無タンパク質媒体中で３日 間、培養した。２ｍｌの調整培地を濃縮し、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ ７．４に対してバッファ交換し、凍結乾燥させた。そのペレットをＳＤＳ−ＰＡ ＧＥサンプルバッファ中で再懸濁し、還元性ＳＤＳゲル電気泳動 にかけ、ＧＧＦペプチド抗体でのウェスタンブロッチングによって分析した。Ｃ ＨＯコントロールを、非移入ＣＨＯ−ＤＧ４４ホストからの調整培地を使用して 行い、ＣＨＯ ＨＢＳ５レベルを、組替えクローンからの調整培地を使用して分 析した。 例８ ウシＧＧＦに関連する他のヒト配列の分離 例５及び６の結果は、ヒトのソースからのＧＧＦ関連配列が、ウシＧＧＦ配列 由来のＤＮＡプローブを使用することによっても容易に分離可能であることを示 している。これに代えて、ホルムズ（Ｈｏｌｍｅｓ）他（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５ ６ ：１２０５（１９９２））によって記載された方法も利用可能である。この例 において、前記ｐ１８５^erbB2レセプタに結合し、これを活性化する（そしてＧ ＧＦに関係する）ヒトタンパク質（ヘレグリンα）が、腫瘍細胞系から精製され 、派生したペプチド配列を使用して、ｃＤＮＡコード化ヘレグリンをクローン化 するのに使用されたオリゴヌクレオチドプローブを生成する。ｐ１８５^erbB2レ セプタ活性の生化学的分析は、シュワン細胞の増幅とは異なる。これは、 下垂体ｃＤＮＡからＧＧＦ配列をクローン化するために例１〜４において使用し た方法に類似している。ヘレグリンタンパク質と補足性ＤＮＡとは、次の手法に 従って腫瘍細胞系から分離した。 ヘレグリンは、Ｐｅｒｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｙｔｉｃａミロキャリア ビーズ（ Ｈｙｃｌｏｎｅ Ｌａｂｓ）上で成長したＭＤＡ−ＭＢ−２３１乳ガン細胞（Ａ ＴＣＣ ＃ＨＴＢ２６）によって調整した培地から精製した。前記培地（１０リ ットル）は、膜（１０−ｋＤカットオフ）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）によるフィル タ処理によって〜２５倍に濃縮し、遠心分離処理と、フィルター（０．２２ｕｍ ）を通す濾過処理とによって清浄化した。濾過物を、ヘパリンセファローズカラ ム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にかけ、そのタンパク質を、燐酸−バッファ化塩水中 にて０．３、０．６及び０．９ＭのＮａＣｌステップで溶出した。種々のクロマ トグラフィック・フラクション中の活性を、ＭＣＦ−７乳ガン細胞（ＡＴＣＣ＃ ＨＴＢ２２）中におけるｐ１８５^erbB2のチロシン燐酸化の増加を定量化するこ とによって測定した。ＭＣＦ−７細胞を、血清（１０％）を含有した（ウェル当 り１０⁵の細胞）、Ｆ１２（５０％）のＤｕｌｂｅｃｃｏの最小必須培地 （５０％）中にて２４−ウェルＣｏｓｔａｒプレートにプレート化し、少なくと も２４時間付着させた。分析の前に、細胞を、少なくとも１時間、血清を含まな い培地中に移した。カラムフラクション（１０ないし１００μｌ）を、３７℃で ３０分間、培養した。次に上澄を吸引して、ＳＰＤ−ＰＡＧＥサンプルバッファ （１００μｌ）を添加することによって反応を終わらせた。サンプルを１００℃ で５分間加熱し、一部分（１０ないし１５μｌ）を、ｔｒｉｓ−グリシンゲル（ ４ないし２０％）（Ｎｏｖｅｘ）にかけた。電気泳動後、タンパク質を、ポリフ ッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜上に電子ブロッチングし、次に、ツイーン（Ｔｗ ｅｅｎ）−２０を含有する（０．０５％）ｔｒｉｓ−バッファ化塩水（ＴＢＳＴ ）中にてウシ血清アルブミン（５％）でブロックした。ブロットを、ホスホチロ シン（Ｕｐｓｔａｔｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）に対するモノクローナル 抗体（１：１０００希釈）で、室温で最低１時間、プローブした。ブロットをＴ ＢＳＴで洗浄し、室温で最低３０分間、アルカリフォスファターゼと結合したマ ウスの免疫グロブリンＧに対する抗体（Ｐｒｏｍｅｇａ）（１：７５００に希釈 ）でプローブした。反応性バンドは、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドイル −１−フォスフェートとニトロ−ブルー テ トラゾリウムによって可視化された。免疫ブロットを、Ｓｃａｎ Ｊｅｔ Ｐｌ ｕｓ（ヒューレットパーカード）濃度計によって走査した。非刺激ＭＣＦ−７細 胞の信号強度は、２０ないし３０ユニットであった。完全に刺激したｐ１８５^{er bB2} は、１８０ないし２００ユニットであった。活性のほとんどを有する０．６ Ｍ ＮａＣｌプールを、エタノール（３０％）を含有する１７ｍＭの燐酸ナトリ ウム（ｐＨ６．８）中で平衡されたポリアスパルテン酸（ＰｏｌｙＬＣ）カラム に適用した。前記平衡バッファ中で、０．３から０．６Ｍ ＮａＣｌまでのリニ アグラジエント使用して、結合タンパク質を溶出した。活性のピーク（０．４５ Ｍ ＮａＣｌに於ける）を、ＴＦＡ（０．１％）とアセトニトリル（１５％）と を含有するバッファで平衡させたＣ４逆相カラム（ＳｙｎＣｈｒｏｐａｃｋ Ｒ Ｐ−４）にて更にフラクション化した。このカラムから、２５から４０％のアセ トニトリル・グラジエント範囲にて、６０分間にわたり、タンパク質が溶出した 。フラクション（１ｍｌ）を採取し、その活性を分析し、ｔｒｉｓ−グリシンゲ ル（４〜２０％，Ｎｏｖｅｘ）上でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。ＨＰＬ Ｃ−精製したＨＲＧ−αを、ＳＤＳ（０．１％）、１０ｍＭジチオトレイトール 、０．１Ｍ ＮＨ₄ＨＣＯ₃（ｐＨ８．０）中で、リシンＣにて、３７℃で２０時間に渡って消 化させ、その結果得られたフラメントを、Ｓｙｎｃｈｒｏｍ Ｃ４カラム（４０ ００Å，０．２ｂｙ１０ｃｍ）上で溶解させた。このカラムを、０．１％のＴＦ Ａ中で平衡させ、次いで０．１％ＴＦＡ中で１−プロパノール使用グラジエント で溶出した（ダブリュ・ジェイ・ヘンゼル（Ｗ．Ｊ．Ｈｅｎｚｅｌ），ジェイ・ ティ・スタルツ（Ｊ．Ｔ．Ｓｔｕｌｔｓ），シー・スー（Ｃ．Ｈｓｕ），ディ・ ダブリュ・アシュワド（Ｄ．Ｗ．Ａｓｗａｄ），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６ ４ ，１５９０５（１９８９））。クロマトログラフ・ランのピークを真空下にお いて乾燥し、配列決定した。これらのペプチドの一つ（〜２４％１−プロパノー ルで溶出）の配列は、［Ａ］ＡＥＫＥＫＴＦ［Ｃ］ＶＮＧＧＥＸＦＭＶＫＤＬＸ ＮＰ（配列認識番号１６２）であった。括弧内の残基は、不確定であり、Ｘは、 アミノ酸の同定が不可能であったサイクルを示している。最初の収量は、８．５ ｐｍｏｌであり、その配列はいずれの公知のタンパク質にも対応していなかった 。残基１，９，１５及び２２は、後に、ｃＤＮＡ配列中においてシステインとし て同定された。これまで過負荷され（ｏｖｅｒ−ｌｏａｄｅｄ）、そしてＰＶＤ Ｆにブロットされたゲ ルから得られた〜４５ｋＤバンドの直接的配列決定は、初期収量が極めて低い（ ０．２ｐｍｏｌ）、低量（ｌｏｗａｂｕｎｄａｎｃｅ）の配列、ＸＥＸＫＥ［Ｇ ］［Ｒ］ＧＫ［Ｇ］Ｋ［Ｇ］ＫＫＫＥＸＧＸＧ［Ｋ］（配列認識番号１６３）を 示した。これは、ヘレグリン−α（図３１）のアミノ酸残基２ないし２２に対応 し、セリン２がｐｒｏＨＲＧ−αのＮＨ₂末端であることを示唆している。ＮＨ₂ 末端はブロックされているが、時として小量の自然にブロックされたタンパク質 は、翻訳後に変成されないこともあることが観察された。前記ＮＨ₂末端指定は 、臭化シアンとの消化後のタンパク質のマススペクトル分析によって確かめられ た。前記分離タンパク質のＣＯＯＨ−末端は、はっきりとは同定されていなかっ たが、タンパク質分解消化物の混合配列決定によって、成熟した配列は、残基２ ４１を越えて拡張しないようである。アミノ酸残基の略称は以下の通りである。 Ａ，Ａｌａ；Ｃ，Ｃｙｓ；Ｄ，Ａｓｐ；Ｅ，Ｇｌｕ；Ｆ，Ｐｈｅ；Ｇ，Ｇｌｙ； Ｈ，Ｈｉｓ；Ｉ，Ｉｌｅ；Ｋ，Ｌｙｓ；Ｌ，Ｌｅｕ；Ｍ，Ｍｅｔ；Ｎ，Ａｓｎ； Ｐ，Ｐｒｏ；Ｑ，Ｇｌｎ；Ｒ，Ａｒｇ；Ｓ，Ｓｅｒ；Ｔ，Ｔｈｒ；Ｖ，Ｖａｌ； Ｗ，Ｔｒｐ；そしてＹ，Ｔｙｒ。 ｃＤＮＡクローンの源として、オリゴ（ｄＴ）−開始λｇｔ１０（ティ・ヴィ ・ハイン（Ｔ．Ｖ．Ｈｕｙｎｎ），アール・エイ・ヤング（Ｒ．Ａ．Ｙｏｕｎｇ ），アール・ダブリュ・デイヴィス（Ｒ．Ｗ．Ｄａｖｉｓ），λｇｔ１０及びλ ｇｔ１１ＤＮＡクローン化技術：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ， Ｄ．Ｇｌｏｖｅｒ，Ｅｄ．（ＩＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，（１９８４） ）ｃＤＮＡライブラリを、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞からの、ｍＲＮＡ精製（ジ ェイ・エム・クルウィン（Ｊ．Ｍ．Ｃｈｒｗｉｎ），エイ・イー・プルズビラ（ Ａ．Ｅ．Ｐｒｚｂｙｌａ），アール・ジェイ・マクドーランド（Ｒ．Ｊ．Ｍａｃ Ｄｏｌａｎｄ），ダブリュ・ジェイ・ラッター（Ｗ．Ｊ．Ｒｕｔｔｅｒ），Ｂｉ ｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １８，５２９４（１９７９）によって構成した（ユー・ ガブラー（Ｕ．Ｇｕｂｌｅｒ）およびビー・ジェイ・ホフマン（Ｂ．Ｊ．Ｈｏｆ ｆｍａｎ），Ｇｅｎｅ ２５，２６３（１９８３））。１３−アミノ酸配列ＡＥ ＫＥＫＴＦＣＶＮＧＧＥ（配列識別番号１６４）（１３）をコード化する下記の ８重の退化アンチセンスデオキシオリゴヌクレオチドを、ヒトコドン周波数最適 値（ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｏｐｔｉｍａ）（アール・ラテ（Ｒ．Ｌａｔｈｅ）， Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８３， １（１９８５））のベースに構成し、化学的に合成した。即ち、５’−ＣＴＣＧ ＣＣ（Ｇ ＯＲ Ｔ）ＣＣ（Ａ ＯＲ Ｇ）ＴＴＡＣ（Ａ ＯＲ Ｇ）ＣＡＧＡ ＡＧＧＴＣＴＴＣＴＣＣＴＴＣＴＣＡＧＣ−３’（配列識別番号１６５）。プロ ーブ構成の目的のため、システインを前記アミノ酸配列中の未知の残基に指定し た。このプローブを燐酸化により標識化し、低−厳密度条件下におけるｃＤＮＡ ライブラリへのハイブリッド化した。前記ｐｒｏＨＲＧ−αタンパク質を、この ライブラリ中において同定した。ＨＲＢ−β１ ｃＤＮＡは、ｐｒｏＨＲＧ−α の５’と３’との両方の末端からの配列とともに、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞ｍ ＲＮＡから作られた第２オリゴ（ｄＴ）−開始λｇｔ１０ライブラリのプローブ 化によって同定された。クローン１３（図２Ａ）は、プライム化（５’−ＣＣＴ ＣＧＣＴＣＣＴＴＣＴＴＣＴＴＧＣＣＣＴＴＣ−３’プライマ（配列識別番号１ ６６）；ｐｒｏＨＲＧ−αアンチセンスヌクレオチド３３ないし５６）ＭＤＡ− ＭＢ−２３１ λｇｔ１０ライブラリを５’ＨＲＧ−α配列によってスクリーニ ングすることによって得られた生成物であった。前記プローブとしてのクローン １３の５’末端に対応する配列を使用してＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞ｍＲＮＡか らの第３のオリゴ（ｄＴ）− 開始λｇｔ１０ライブラリ中におけるｐｒｏＨＲＧβ２とｐｒｏＨＲＧβ３とを 同定した。４つのＨＲＧのそれぞれをコード化する二つのｃＤＮＡクローンを配 列決定した（エフ・サンガー（Ｆ．Ｓａｎｇｅｒ），エス・ミルケン（Ｓ．Ｍｉ ｌｋｅｎ），エイ・アール・カルソン（Ａ．Ｒ．Ｃｏｕｌｓｏｎ），Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７４，５４６３ １９７７））。別 のｃＤＮＡ指定クローン８４は、アミノ酸数４２０を通じてｐｒｏＨＲＧβ２と 同一のアミノ酸配列を有している。位置４２１の終止コドンの後には、異なった ３’−非翻訳配列が続く。 例９ 別のスプライシング変異体の分離 例６の方法によって、スプライシング変異の結果として４つの密接に関連した 配列（ヘレグリンα，β１，β２，β３）が作り出された。ペレス（Ｐｅｌｅｓ ）他（Ｃｅｌｌ ６９，２０５（１９９２））及びウェン（Ｗｅｎｎ）他（Ｃｅ ｌｌ ６９，５５９（１９９２））は、ｐ１８５^erbBに結合するタンパク質に関 する例１〜４及び６に記載の方法に類似の精製方法とクローン化方 法を使用して別のスプライシング変異体を分離した（ラットから）。ｃＤＮＡク ローンは次にようにして得られた（形質転換ラット線維芽細胞系からのｐ１８５^erbB2 結合タンパク質の精製と配列決定による）。 ｐ１８５^erbB結合タンパク質は、以下のようにして調整培地から精製された。 ５００のローラボトル（全部で１２０リットル）の３回の収穫からのプールされ た調整培地を、０．２μのフィルタによる濾過によって浄化し、２０ｋｄ分子径 カットオフの膜によるＰｅｌｉｃｏｎ限外濾過システムによって３１倍に濃縮し た。すべての精製工程は、Ｐｈａｒｍａｃｉａ ｆａｓｔタンパク質液体クロマ トログラフィーシステムを使用して行われた。前記濃縮物を、直接、ヘパリン− セファローズ（１５０ｍｌ，燐酸塩−バッファ化塩水（ＰＢＳ）によって予め平 衡化しておいたもの）に負荷した。カラムを、２８０ｎｍの波長において全く吸 収が検出されなくなるまで、０．２Ｍ ＮａＣｌを含有のＰＢＳで洗浄した。結 合タンパク質を、次に、ＮａＣｌ（２５０ｍｌ）の連続グラジエント（０．２Ｍ から１．０Ｍ）で溶出し、５ｍｌのフラクションを採取した。サンプル（前記採 取フラクションの０．０１ｍｌ）を使用して、キナーゼ刺激活性の定量分 析を行った。三つのカラム・ラン（全容量＝３６０ｍｌ）からの活性フラクショ ンを、プールし、ＹＭ１０限外濾過膜（アミコン（Ａｍｉｃｏｎ），マサチュー セッツ州，ダンヴァース）を使用して２５ｍｌに濃縮し、１．７Ｍの濃度となる ように硫酸アンモニウムを添加した。遠心分離処理（１０，０００ｘｇ，１５分 間）による浄化後、プールされた物質をフェニール・スペローズカラム（ＨＲ１ ０／１０，Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上に負荷した。前記カラムを、０．１ＭのＮａ₂ ＰＯ₄（ｐＨ７．４）中で（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄の４５ｍｌグラジエント（１．７Ｍ から無塩状態まで）で展開し、２ｍｌのフラクションを採取してそのキナーゼ刺 激を分析（一サンプルにつき０．００２ｍｌ）した（例６に記載のように）。活 性の主なピークをプールし、５０ｍＭの燐酸ナトリウムバッファ（ｐＨ７．３） に対して透析した。一つのモノ−Ｓ陽イオン交換カラム（ＨＲ５／５，Ｐｈａｒ ｍａｃｉａ）を、５０ｍＭの燐酸ナトリウムで予め平衡させた。活性物質（タン パク質の０．８８４ｍｇ；３５ｍｌ）の負荷後、前記カラムを、開始バッファで 洗浄し、次に、ＮａＣｌのグラジエントで１ｍｌ／分の速度で展開した。キナー ゼ刺激活性は、０．４５−０．５５Ｍ塩で回復され、それぞれ２ｍｌづつの４つ のフラクションに渡っていた。 これらをプールし、Ｃｕ⁺²キレート化カラムに直接負荷した（１．６ｍｌ，ＨＲ ２／５キレート化スペローズ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。大半のタンパク質は樹脂 に吸着されたが、これらは徐々に塩化アンモニウムの３０ｍｌのリニアグラジエ ント（０−１Ｍ）によって溶出した。前記活性物質は、０．０５ないし０．２Ｍ ＮＨ₄Ｃｌの範囲の一つのタンパク質ピークで溶出した。様々な精製工程から 得られたサンプルを、ゲル電気泳動によって分離し、ＩＣＮ（カリフォルニア州 ，コスタ・メサ）のキットを使用した銀着色後、それらのタンパク質内容を、Ｂ ｉｏ−Ｒｅｄ（カリフォルニア州，リッチモンド）のキットを使用したコマーシ ブルー染色結合分析によって調べた。 前記ｐ４４タンパク質（１０μｇ）を、０．１Ｍアンモニウム重炭酸塩バッフ ァ（ｐＨ７．８）２００μｌ中で再構築した。Ｌ−１−トシル−アミド ２−フ ェニールエチル クロロメチル ケトン処理トリプシン（Ｓｅｒｖａ）による消 化を、１：１０の酵素対基質比で、３７℃で１８時間かけて行った。その結果得 られたペプチド混合物を、Ｖｙｄａｃ Ｃ４マイクロカラム（２．１ｍｍ ｉ． ｄ．ｘ１５ｃｍ，３００Å）と、ダ イオードアレイ検出器とワークステーションとを備えたＨＰ１０９０液体クロマ トグラフィシステムとを使用し、２１５ｎｍでモニタしつつ、逆相ＨＰＬＣで分 離した。前記カラムを、０．１％トリフルオロ酢酸（移動相Ａ）で平衡させ、０ ％から５５％の移動相Ｂ（０．１％のトリフルオロ酢酸中に９０％のアセトニト リル）のリニアグラジエントで７０分間にわたり溶出を行った。その流量は０． ２ｍｌ／分で、カラム温度は、２５℃に制御された。前記ＨＰＬＣシステムから 手作業によって採取されたペプチドのピークの１／３部分は、Ｅｄｍａｎ分解に よるＮ−末端配列分析によって特徴付けられた。２７．７分後（Ｔ２７．７）に 溶出されたフラクションは、混合アミノ酸配列を有し、還元後、つぎのようにし て更に、再クロマトグラフされた。前記ペプチドフラクションの７０％の部分を 真空中で乾燥し、１００μｌの０．２Ｍ重炭酸塩アンモニウムバッファ（ｐＨ７ ．８）中で再構築した。前記溶液にＤＴＴ（最終濃度２ｍＭ）を添加し、これを 次に３７℃で３０分間培養した。次に還元したペプチド混合物を、Ｖｙｄａｃカ ラム（２．１ｍｍ ｉ．ｄｘ１５ｃｍ）を使用して逆相ＨＰＬＣによって分離し た。溶出条件と流量は、前述したものと同じであった。前記ペプチドのアミノ酸 配列の分析を、 オンライン・フェニルチオヒダントイン（ＰＴＨ）アミノ酸分析器を備えたモデ ル４７７タンパク質シーケンサ（アプライド・バイオシステムズ・インコーポレ イテッド（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．），カリフォルニ ア州，フォスター・シティ）と、モデル９００データ分析システム（フンカピラ ー（Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ）他（１９８６）Ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｐ ｒｏｔｅｉｎ Ｍｉｃｒｏｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，Ｊ．ｅ．Ｓｈｉ ｖｅｌｙ，ｅｄ．（ニュージャージー州，クリフトン：Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓ ｓ ｐ．２２３−２４７）とによって行った。前記タンパク質を、ポリブレンと ＮａＣｌとでプレサイクルしたトリフルオロ酢酸−処理グラスファイバーディス クに負荷した。ＰＴＨ−アミノ酸分析を、デュアルシュリンジポンプと逆相（Ｃ −１８）小口径カラムを使用したマイクロ液体クロマトグラフィシステム（モデ ル１２０）で行った（アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏ ｓｙｓｔｅｍｓ），２．１ｍｍ ｘ２５０ｍｍ）。 ＲＮＡを、標準手順（マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）他，Ｍｏｌｅｃｕｌ ａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８２））によってラット１−ＥＪ細胞から分離し、ポ リ（Ａ）⁺をｒＲＮＡ分離キット（クロンテック・ラボ・インコーポレイテッド ，カリフォルニア州，パロ・アルト）を使用して選別した。ｃＤＮＡをＳｕｐｅ ｒｓｃｒｉｐｔキット（ビー・アール・エル・ライフ・テクノロジーズ・インコ ーポレイテッド（ＢＲＬ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）， メリーランド州，ベテスダ）で合成した。カラム−細分化−二重ストランドｃＤ ＮＡをＳａｌ１及びＮｏｔ１−消化ｐＪＴ−２プラスミドベクター、ｐＣＤ−Ｘ ベクターの派生物に結合し（オカヤマ（Ｏｋａｙａｍａ）およびベルク（Ｂｅｒ ｇ），Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．３：２８０（１９８３））、電気泳動によ ってＤＨ１０Ｂ Ｅ．ｃｏｌｉ細胞に形質転換した（ダウアー（Ｄｏｗｅｒ）他 、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１６：６１２７（１９８８））。約５ｘ１０⁵ の一次形質転換物が、Ｎ−末端のＮＤＦ（残基５−２４）とＴ４０．４トリプ シンペプチド（残基７−１２）のタンパク質配列から由来の二つのオリゴヌクレ オチドプローブによってスクリーニングされた。これらのそれぞれの配列は以下 の通りであ る（Ｎはすべての４ｎｔを示す）： 前記合成オリゴヌクレオチドを、Ｔ４ヌクレオチドキナーゼにより、［γ−³² Ｐ］ＡＴＰによって末端標識化し、これらを使用してニトロセルロースフィルタ の複製セットをスクリーニングした。そのハイブリッド化溶液は、６ｘＳＳＣ， ５０ｍＭの燐酸ナトリウム（ｐＨ６．８）と、０．１％のピロ燐酸ナトリウム、 ２ｘＤｅｎｈａｒｄｔ’ｓ溶液、５０μｇ／ｍｌ鮭精子ＤＮＡと、２０％のフォ ルムアミドを含有（プローブ１について）又はフォルムアミド０％（プローブ２ について）を含んでいた。フィルタを、５０℃で０．５ｘＳＳＣ，０．２％ＡＳ Ａ，２ｍＭ ＥＤＴＡによって（プローブ１について）、又は３７℃で２ｘＳＳ Ｃ，０．２％ＳＤＳ，２ｍＭ ＥＤＴＡによ って（プローブ２について）、洗浄した。これらフィルタのオートラジオグラフ ィは、両方のプローブとハイブリッドした１０のクローンを示した。これらのク ローンを、前述のような再プレート化とプローブハイブリッドによって精製した 。アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）３ ７３Ａ自動ＤＮＡシーケンサとＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｔａｑ ＤｙｅＤｏｘｙ^TMターミネータサイクル配列決定キットとを、該製造業者の指 示に従って使用して、前記ｃＤＮＡクローンの配列決定をした。いくつかの場合 においては、配列は、［³⁵Ｓ］ｄＡＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）及びＵ．Ｓ．Ｂｉ ｏｃｈｅｍｉｃａｓのＳｅｑｕｅｎａｓｅ^TMキットを使用することによって得ら れた。ｃＤＮＡクローン４４の両方のストランドは、合成オリゴヌクレオチドを プライマとして使用することによって配列決定された。ほぼ５’３５０ｎｔの配 列が、７つの独立したｃＤＮＡクローンにおいて決定された。その結果得られた クローンは、図３０示すパターンを示した（ＮＤＦ）。 例１０ 他の可能なスプライシング変異体の検出戦略 ウシのｃＤＮＡクローンとＰＣＲ生成物の推定アミノ酸配列、及び公表されて いるヒト（図３１）とラット配列との整合性は、高いレベルの類似性を示して、 これはこれらの配列が三つの種の中の相同遺伝子由来のものであることを示して いる。ｃＤＮＡ／ＰＣＲ生成物レベルにおいて検出可能なメッセンジャＲＮＡ転 写体の数が変化するのは、恐らく、広範囲な組織−特異スプライシングに依るも のと思われる。得られた、そして図３０に示すパターンは、その他のスプライシ ング変異体が存在することを示唆している。可能なスプライシング変異体のリス トが図３７に示されている。これらの変異体の多くは、様々な組織から由来のｃ ＤＮＡライブラリのコード化セグメント特異なプローブ化と、特定のコード化セ グメントに特異的なプライマ対を使用したＰＣＲ実験とによって得ることが出来 る。あるいはこれに代えて、これら変異体は、当業者の公知の切断及びスプライ ス技術により、特異なｃＤＮＡクローン、ＰＣＲ生成物又はゲノムＤＮＡ領域か ら組み立てることも可能である。例えば、共通のコード化セグメント（例えば、 Ａ）中の稀な制限酵素切断サイトを使用して、ＧＧＦ２ＢＰＰ５のＦＢＡアミノ 末端を、ＧＧＦ２ＢＰＰ１、ＧＧＦＢＰＰ２、ＧＧＦＰＰ３、又はＧＧＦＰＰ４ のカルボキシ末端配列 に接続することができる。コード化セグメントＥ及び／又はＧの存在又は不在が 、目的とし、又既述の用途のために有利である場合には、これらのコード化セグ メントを、発現構築体に含ませることができる。これらの変異体配列は、組替え システム中に発現させることができ、その組替え生成物を分析して、そのシュワ ン細胞細胞分裂誘発活性のレベルと、そのｐ１８５^erbB2レセプタに結合しこれ を活性化する能力とを測定することができる。 例１１ ＧＧＦの機能要素の同定 ＧＧＦ配列のファミリの推定構造は、その最長の形状（ＧＧＦ２ＢＰＰ４によ って表される）が、細胞外部分が上皮細胞成長因子に類似するドメインを含む場 合に、経膜タンパク質をコード化することを示しているＣａｒｐｅｎｔｅｒ ａ ｎｄ Ｗａｈｌ ｉｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｇｒｏｗｔｈ Ｆａｃｔｏｒｓ ａｎ ｄ Ｔｈｅｉｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ I ｐｐ．６９−１３３，Ｓｐｒｉｎｇ ｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，ＮＹ １９９１参照）。コード化セグメントＣ及びＣ／Ｄ 又はＣ／Ｄ’ペプチド配列におけるシスチン残基の位置は、上皮細胞 成長因子（ＥＧＦ）ペプチド配列に於ける相同残基に対して保存されている（図 ３５、配列識別番号１５１−１５３参照）。これは、前記細胞外ドメインが、レ セプタ認識及び生物学的活性サイトとして機能することを示唆している。変異体 形状の内のいくつかは、Ｈ，Ｋ及びＬコード化セグメントを欠如しており、従っ て、分泌、拡散可能生物学的活性タンパク質として発現可能である。ＥＧＦ状ド メイン（ＥＧＦＬ）を含むポリペプチドをコード化するＧＧＦ ＤＮＡ配列は、 グリア細胞細胞分裂誘発活性を刺激するための十分な生物学的活性を有している 可能性がある。 このタンパク質の膜結合バージョンは、胚形成中又は、神経再生中（ニューロ ンの表面が増殖シュワン細胞の表面に密接に関連している場合）にニューロンの 表面に発現された場合、シュワン細胞の増殖を誘発する可能性がある。 分泌（非膜結合）ＧＧＦは、シュワン細胞とその分泌位置からいくらか離れた 位置において作用することが可能な分類上拡散可能な因子として作用する可能性 がある。他の形態も、細胞の損傷や細胞の破壊を通じた源から細 胞内から放出される可能性がある。分泌ＧＧＦの一例は、ＧＧＦ２ＨＢＳ５によ ってコード化されるタンパク質であり（例６参照）、これは細胞の外部に向けら れることが判った唯一のＧＧＦである（例７）。分泌は、恐らく、ＧＧＦ２ＨＢ Ｓ５によってコード化される組替えＧＧＦ−ＩＩ中に含まれるＮ−末端ドメイン であって、領域Ｅにおいてのみ見られるＮ−末端疎水性配列によって仲介される 。 他のＧＧＦは、分泌されるものではないように思える（例６参照）。これらの ＧＧＦは、組織の損傷の結果として放出される損傷反応形態であるのかもしれな い。 ＧＧＦ−ＩＩ（ＧＧＦ２ＨＢＳ５によってコード化される）の予想タンパク質 構造の他の領域と、領域Ｂ及びＡを含む他のタンパク質とは、ヒト基底膜ヘパラ ン硫酸プロテオグリカン核タンパク質（ｒｅｆ．）に対する類似性を示す。これ らのＧＧＦにおけるＣ２免疫グロブリンフォールドの第２システインの隣に位置 するペプチドＡＤＳＧＥＹは、基底薄膜タンパク質に見られる２２のＣ−２反復 の内の９つに発生する。この証拠は、これらのタンパク質が、ニューロンやグリ ア等に関連するマト リックスタンパク質に関連していることを強く示唆するものであり、その目標サ イトとしてのグリア成長因子の隔離の方法を示唆している可能性がある。 例１２ 組替え細胞からのＧＧＦの精製 その生物学的活性を分析するべく完全長ＧＦＦあるいはＧＧＦの部分を得るた めに、タンパク質を、クローン化ＤＮＡを使用して過剰生産することができる。 いくつかの方法が使用可能である。前述の配列を有する組替えＥ．ｃｏｌｉ細胞 を構築することができる。ｐＮＨ８ａやｐＨＨ１６ａ（ストラトジェン・インコ ーポレイテッド（Ｓｔｒａｔａｇｎｅ，Ｉｎｃ．））等の発現システムをその製 造業者の指示に従ってこの目的のために使用することができる。あるいはこの代 わりに、これらの配列を、ほ乳類発現ベクターに挿入して、過剰生産細胞系を構 築することができる。例えば、この目的のために、ＧＧＦをコード化するＤＮＡ 、クローンＧＧＦ２ＢＰＰ５を、ＣＯＳ細胞と、チャイニーズハムスタの卵巣細 胞との両方に発現させた（例７参照）（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３，３５ ２１−３５２７（１９８１））。 このＧＧＧＦ ＤＮＡを有するベクトルを、公知の手法を使用してホスト細胞に 移入することができる。 一過的発現を調べるか、もしくは、Ｇ４１８耐性クローンを、メトトレキセー トの存在下おいて成育させることにより、ｄｈｆｒ遺伝子（ｐＭＳＸＮＤベクタ ー上に含まれる）を増幅し、その過程において、隣接のＧＧＦタンパク質コード 化配列を共増幅する細胞を選別することができる。全く血清やタンパク質を含ま ない培地（ハミルトン（Ｈａｍｉｌｔｏｎ）およびハム（Ｈａｍ），Ｉｎ Ｖｉ ｔｒｏ １３，５３７−５４７（１９７７））中に、ＣＨＯ細胞維持することが できるので、所望のタンパク質は、その培地から精製することが可能である。例 ９において作られた抗血清を使用したウェスタン分析を使用して、前記過剰生産 細胞の調整培地中における所望のタンパク質の存在を検出することができる。 所望のタンパク質（ｒＧＧＦ−ＩＩ）を、次のようにして、ＣＯＳ細胞を一過 的に発現させることによって調整した培地から精製した。ｒＧＧＦ−ＩＩを、調 整培地から収穫し、陽イオン交換クロマトグラフィ（ＰＯＲＯＳ−ＨＳ）を使用 して部分精製した。前記カラムを、 ３３．３ｍＭ ＭＥＳ ｐＨ６．０で平衡化した。調整培地を、１０ｍｌ／分の 流量で負荷した。シュワン細胞増殖活性と免疫反応性（ポリクローナル抗血清を 上述のようにＧＧＦＩＩペプチドに対して使用した）とを有するピークを、５０ ｍＭ Ｔｒｉｓ，１Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ８．０で溶出した（それぞれ、図５０Ａ 及び５０Ｂ）。 ｒＧＧＦ−ＩＩも、安定したチャイニーズハムスタの卵巣細胞系を使用して発 現される。収穫された調整培地からのｒＧＧＦ−ＩＩを、陽イオン交換クロマト グラフィ（ＰＯＲＯＳ−ＨＳ）を使用して部分精製した。前記カラムを、ＰＢＳ ｐＨ７．４によって平衡化した。調整培地を、１０ｍｌ／分で負荷した。シュ ワン細胞増幅活性と免疫反応性（ＧＧＦ−ＩＩポリクローナル抗血清を使用）と を有するピークを、５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ，５００ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ８．０ で抽出した。増殖性と免疫反応性の両方を備えた別のピークが、５０ｍＭ Ｈｅ ｐｅｓ，１Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ８．０で観察された。 ｒＧＧＦ−ＩＩは、高分解能工程として疎水性反応クロマトグラフィ（陽イオ ン交換／リザーブフェーズクロマトグラフィ（必要な場合には第２高分解能工程 として）、 陰イオン交換クロマトログラフィのようなウィルス不活性化工程及びＤＮＡ除去 工程、を使用することによって更に精製することができる。 使用した手法の詳細な記述は以下の通りである。 前記陽イオン交換カラムから抽出した組替えＧＧＦ−ＩＩピークのシュワン細 胞増幅活性は、以下のようにして測定した。培養シュワン細胞の細胞分裂誘発反 応を、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ １Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ８．０によって抽出したピー クを使用して５Ｍフォルスコリンの存在下において測定した。前記ピークは、２ ０ １，１０ １（１：１０）１０ １及び（１：１００）１０ １で添加した 。¹²⁵Ｉ−ウリジンの組み込みを測定し、１８−２４時間の露光後に（ＣＰＭ） として表現した。 ＧＧＦ−ＩＩのペプチドに対して発育させたポリクローナル抗体を使用した免 疫ブロットを、次のようにして行った。１０μｌの異なったフラクションを、４ −１２％のグラジエントゲルでランさせた。これらのゲルを、ニトロセルロース 紙に移し、このニトロセルロースブロッ トを５％のＢＳＡでブロックし、ＧＧＦ−ＩＩ−特異抗体（１：２５０希釈）で プローブした。¹²⁵Ｉタンパク質Ａ（１：５００希釈、特異的活性＝９．０／Ｃ ｉ／ｇ）を、二次抗体として使用した。前記免疫ブロットを、コダック社Ｘ線フ ィルムに６時間露光した。１Ｍ ＮａＣｌで溶出したピークフラクションは、６ ５−９０Ｋｄにおいて、ＧＧＦ−ＩＩと高分子量グリコフォームの予想サイズ範 囲である，広い免疫反応性バンドを示した。 陽イオン交換カラムでのＧＧＦ−ＩＩ精製は以下のように行った。ｒＧＧＦＩ Ｉを発現するＣＨＯ細胞調整培地を、１０ｍｌ／分で前記陽イオン交換カラムに 負荷した。このカラムを、ＰＢＳ ｐＨ７．４で平衡化した。溶出は、それぞれ 、５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ ５００ｍＭ ＮａＣｌ ｐＨ８．０と５０ｍＭ Ｈｅ ｐｅｓ １Ｍ ＮａＣｌ ｐＨ８．０とで行った。すべてのフラクションを、こ こに記載のシュワン細胞増殖分析（ＣＰＭ）を使用して分析した。タンパク質濃 度（ｍｇ／ｍｌ）は、ＢＳＡを標準として使用したＢｒａｄｆｏｒｄ分析によっ て測定した。 １０μｌの各フラクションを使用したウェスタンブロ ットを行った。図５１Ａ及び５１Ｂに示すように、免疫反応性とシュワン細胞活 性とは相互移動する。 前述のシュワン細胞細胞分裂誘発分析を使用して、完全長クローン又はその全 ての物学的活性部分からの発現生成物の分析を行った。完全長クローンＧＧＦ２ ＢＰＰ５が、ＣＯＳ細胞に一過的に発現された。移入されたＣＯＳ細胞の細胞内 抽出物は、例１に記載したシュワン細胞増殖分析により分析した時に生物学的活 性を示す。更に、ＧＧＦ２ＨＢＳ５を発現する完全長に近いものが、ＣＨＯと昆 虫（例７）細胞とに一過的に発現された。この場合、細胞抽出物と調整培地との 両方が、例１に記載したシュワン細胞増殖分析において生物学的活性を示す。当 業者によって、ＧＧＦ（ヘレグリンを含む）からのスプライシング変異体補足性 ＤＮＡのファミリのすべてのメンバを、このようにして発現させ、シュワン細胞 増殖分析において分析することができる。 あるいは、組替え物質を、ＣＯＳ−７細胞においてスプライシング変異体Ｎｅ ｕ分化因子（ＮＤＦ）を発現させたウェン（Ｗｅｎ）他（Ｃｅｌｌ ６９，５５ ９（１９９２））に従って、他の変異体から分離すること ができる。ｐＪＴ−２真核生物プラスミドベクターに挿入したｃＤＮＡクローン は、ＳＶ４０初期プロモータのコントロール下にあり、ＳＶ４０終結及びポリア デニール化信号に３’で挟まれている。ＣＯＳ−７細胞は、以下のようにして、 電気ポレーションによって、ｐＪＴ−２プラスミドＤＮＡで移入された。即ち、 ６ｘ１０⁶の細胞を（０．８ｍｌのＤＭＥＭと１０％のＦＥＢＳにおいて）、０ ．４ｃｍのキュベットに移し、１０μｌのＴＥ溶液中（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈ Ｃｌ（ｐＨ８．０），１ｍＭ ＥＤＴＡ）にて２０μｇのプラスミドＤＮＡと混 合した。電気ポレーションは、パルスコントローラユニットを２００オームに設 定したＢｉｏ−Ｒａｄ Ｐｕｌｓｅｒ装置を使用して、室温で、１６００Ｖ、２ ４μＦで行った。次に、細胞を、２０ｍｌのＤＭＥＭ，１０％ＦＢＳ中に希釈し 、Ｔ７５フラスコ（Ｆａｌｃｏｎ）中に移した。３７℃における１４時間の培養 後、培地を、ＤＭＥＭ，１％ＦＢＳと置換し、培養を更に４８時間継続した。細 胞から収穫した組替えタンパク質を含む調整培地は、このタンパク質のレセプタ を発現する細胞系において生物学的活性を示した。この細胞系（ヒト乳ガン細胞 ラインＡＵ５６５）を、組替え物質で処理した。処理された細胞は、ｅｒｂＢ２ レセプタの活性化に特徴 的な形態変化を示した。このタイプの調整培地も、シュワン細胞増殖分析におい てテストすることが出来る。 例１３ ｐ１８５ レセプタに結合する他のタンパク質の精製と分析 Ｉ．ｇｐ３０とｐ７０との精製 ここに参考文献として添付するルプ（Ｌｕｐｕ）他（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４ ９，１５５２（１９９２））及びリップマン（Ｌｉｐｐｍａｎ）およびルプ（Ｌ ｕｐｕ）（特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９１／０３４４３（１９９０））は、以下 のようにして、ヒト乳ガン細胞ラインＭＤＡ−ＭＢ−２３１の調整培地からタン パク質を精製した。 調製培地採取を、周知の方法を使用して行った。培地を、Ａｍｉｃｏｎ限外 濾過フィルタセル（ＹＭ５膜）（Ａｍｉｏｎ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）中にて１ ００倍に濃縮した。浄化し濃縮した後、培地を、−２０℃で保存し、一方、連続 採取を以後数日の間に行った。濃縮培地を、４℃で２日間に渡り、１００容 量の０．１Ｍの酢酸に対して、Ｓｐｅｃｔｒａ／ｐｏｒ３チュービング（スペク トラム・メディカル・インダストリーズ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ），カリフォルニア州，ロス・アンジェルス）を使用して 透析した。透析中に沈澱した物質を、４℃で３０分間、４０００ｒｐｍでの遠心 分離処理によって除去し、プロテアーゼインヒビタを添加した。次に、浄化した サンプルを凍結乾燥した。 凍結乾燥した調整培地を、全タンパク質が約２５ｍｇ／ｍｌの最終濃度とな るように、１Ｍの酢酸中に、溶解させた。不溶性物質は、１０，０００ｒｐｍで １５分間の遠心分離処理によって除去した。次に、このサンプルをセファーデッ クスＧ−１００カラム（ＸＫ１６，Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ ，ＮＪ）に負荷し、平衡化し、更に、これに、４℃で１Ｍの酢酸を３０ｍｌ／時 間の流量で上方に流すことによる溶出を行った。４ｍｌの１００倍濃縮培地から 、１００ｎｇのタンパク質が処理された。３ｍｌの溶出物を含むフラクションを 、凍結乾燥させ、分析用に３００μｌのＰＢＳ中で再懸濁させ、更なる精製のた めの原料として利用した。 セファーデックスＧ−１００精製物を、逆相高圧液体クロマトグラフィ（Ｈ ＰＬＣ）でランした。第１の工程には、急勾配のアセトニトリルグラジエントを 使用した。急勾配アセトニトリルグラジエントと他のすべてのＨＰＣＬ工程とは 、Ｃ３−逆相カラムを、水中（ＨＰＬＣ−グレード）０で０．０５％のＴＦＡ（ トリフルオロ酢酸）によって平衡化した後に、室温で行った。これらのサンプル を負荷し、フラクションは、１ｍｌ／分の流量で３０分間に渡って、リニアグラ ジエント（０．０５％のＴＦＡ中で０−４５％のアセトニトリル）で溶出した。 ２８０ｎｍで吸収が観察された。１ｍｌのフラクションを採取し、ＥＧＦレセプ ター競合活性の分析の前に凍結乾燥させた。 第２のＨＰＬＣ工程には、緩勾配アセトニトリルグラジエントを使用した。 前のＨＰＬＣ工程からの活性フラクションのプールを、同じカラムに関して再び クロマトグラフィ分析した。０．０５％のＴＦＡ中で５分間の０−１８％アセト ニトリルグラジエント後に、０．０５％のＴＦＡ中で３０分間のリニアな１８− ４５％アセトニトリルグラジエントにて、溶出を行った。流量は１．０ｍｌ／分 で、１ｍｌのフラクション が採取された。ヒトＴＧＦα−状因子が、３０−３２％のアセトニトリル濃度で 、ＲＲＡによる検出可能な一つのピークとして溶出した。 ルプ（Ｌｕｐｕ）他（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８９，２２ ８７（１９９２））は、ｐ１８５^erbB2レセプタに結合する別のタンパク質を精 製した。この特定のタンパク質、ｐ７５、は、１０％の胎児ウシ血清（ＧＩＢＣ Ｏ）を補足した改良Ｅａｇｌｅ’ｓ培地（ＩＭＥＭ：ＧＩＢＣＯ）中で繁殖させ たＳＫＢｒ−３（ヒト乳ガン細胞系）の成長に使用される調整培地から精製され たものである。タンパク質ｐ７５は、ｐ１８５^erbB2アフィニティーカラムを使 用した濃縮（１００倍）調整培地から精製された。ｐ１８５^erbB2の９４キロダ ルトン細胞外ドメイン（ｐ７５に結合）を、組替え発現によって生成し、ポリア クリルアミドヒドラジド−セファローズアフィニテイークロマトグラフィマトリ ックスに結合させた。結合後、前記マトリックスを、氷冷した１．０Ｍ ＨＣｌ 中で十分に洗浄し、そのビーズを０．５Ｍ ＮａＮＯ₂で活性化させた。温度は ２０分間、０℃に維持し、その後に、濾過と、氷冷した０．１Ｍ ＨＣｌでの洗 浄を行った。 ５００ｍｌの濃縮調整培地を、重力によって前記ビーズに流した。カラムを洗浄 し、１．０Ｍのクエン酸で、４．０から２．０のｐＨ値で（ｅｒｂＢ２とｐ７５ を分離させるため）ステップ的に溶出させた。すべてのフラクションを、Ｐｈａ ｒｍａｃｉａ ＰＤ１０カラム上で脱塩させた。精製によって、３．０−３．５ 溶出ｐＨで７５ｋＤａの均−なポリペプチドが得られた（銀着色によるＳＤＳ／ ＰＡＧＥでの分析によって確認）。ＩＩ．ｇＰ３０のＰ１８５^erbB2Ｂ２への結合 精製ｇｐ３０タンパク質を、それがｐ１８５^erbB2に結合したか否かを調べ る分析においてテストした。ｐ１８５^erbB2に対するモノクローナル抗体を備え た競合アッセイ。ｇｐ３０タンパク質は、ＳＫ−ＢＲ−３及びＭＤＡ−ＭＢ−４ ５３細胞（ｐ１８５^erbB2レセプタを発現するヒト乳ガン細胞系）中でＰ１８５^{e rbB2} に結合する抗体を置換した。ｇｐ３０のシュワン細胞増殖活性は、更に、シ ュワン細胞培養物を、例１−３に記載の分析手法を使用して、精製ｐｇ３０によ って処理することによっても示すことができる。ＩＩＩ．ｐ７５のｐ１８５^erbB2への結合 ＳＫＢｒ−３調整培地から得た７５ｋＤａのポリペプチド（ｐ７５）が実際 に、ＳＫＢｒ−３細胞中のｅｒｂＢ２ガン・タンパク質のためのリガンドである のか否かを分析するために、ｇｐ３０のための前述の競合アッセイを使用した。 ｐ７５が結合活性を示すことが判ったが、これに対して、他のクロマトグラフィ フラクションからの物質はそのような活性を示さなかった（データは図示せず） 。通過物質は、いくらかの結合活性を示した。これは、抜け出たｅｒｂＢ２ Ｅ ＣＤの存在によるものであろう。ＩＶ．他のｐ１８５^erbB2リガンド ペレス（Ｐｅｌｅｓ）他（Ｃｅｌｌ ６９，２０５（１９９２））は、更に 、ラット細胞（ＮＤＦ，その方法については例８参照）からのｐ１８５^erbB2刺 激リガンドをも精製した。ホルムズ（Ｈｏｌｍｅｓ）他（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５ ６ ，１２０５（１９９２））は、ｐ１８５^erbB2に結合し、これを刺激する、ヒ ト細胞からのヘレグリンαを精製した（例６参照）。ここに参考として添付する 、タラコフスキー（Ｔａｒａｋｏｖｓｋｙ）他Ｏｎｃｏｇｅｎｅ６： ２１８（１９９１）は、活性化マクロファージから分離された２５ｋＤのポリペ プチドの、ｐ１８５^erbB2相同体である、Ｎｅｕレセプタへの結合を示した。ＶＩ．ＮＤＦの分離 ヤーデン（Ｙａｒｄｅｎ）およびペレス（Ｐｅｌｅｓ）（Ｂｉｏｃｈｅｍｉ ｓｔｒｙ ３０，３５４３（１９９１））は、ｐ１８５^erbB2レセプタを刺激す るであろう３５キロダルトンのグリコタンパク質を同定した。このタンパク質は 、次の手法に従って調整された培地中において同定された。ラットＩ−ＥＪ細胞 を、１７５−ｃｍ²フラスコ（Ｆａｌｃｏｎ）中で集合成長させた。単層を、Ｐ ＢＳで洗浄し、無血清培地中にて１０−１６時間放置した。前記培地を廃棄し、 新たな無血清培地によって置換し、３日間の培養後に採取した。調整培地を、低 速遠心分離によって浄化し、ＹＭ２膜（分子量２０００でカットオフ）を備えた Ａｍｉｃｏｎ限外濾過セル中で１００倍に濃縮した。調整培地におけるｎｅｕ刺 激活性の生化学的分析は、前記リガンドが、熱に対しては安定しているが還元に 対しては敏感な３５−ｋＤグリコタンパク質であることを示している。該因子は 、高い塩濃度か、酸性アル コールのいずれかによって沈澱させることができる。選択的沈澱、ヘパリン−ア ガロースクロマトグラフィ、及び希釈酸中でのゲル濾過によって前記分子を部分 精製することにより活性リガンドが得られ、これはがん原遺伝子のレセプタを刺 激することが出来るが、構造的に活性ながん遺伝子ｎｅｕタンパク質に対しては 無効果であった。しかしながら、この精製されたフラクションは、ＥＧＦのため の関連レセプタをも刺激する能力を保持しており、これはこれらの二つのレセプ タが、双方向メカニズムを介して機能的に結合していることを示唆するものであ る。あるいは、前記推定リガンドは、同時に二つのレセプタと反応する。該因子 の、提示された生化学的特徴を利用して、これらの可能性が探求される完全に精 製された因子を達成することができる。 他の出版物において、デイヴィス（Ｄａｖｉｓ）他（Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｂｉ ｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１７９，１５３６（１９９１），Ｐｒｏｃ ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８８，８５８２（１９９１）およびグリーン（ Ｇｒｅｅｎ）他，ＰＣＴ特許出願ＰＣＴ／ＵＳ９１／０２３３１（１９９０）） は、ヒトＴ−細胞（ＡＴＬ−２）系の調整培地からのタンパク質の精製について 記載している。 ＡＴＬ−２細胞系は、ＩＬ−２独立ＨＴＬＶ−１（＋）Ｔ細胞系である。無 マイコプラズムＡＴＬ−２細胞を、５％のＣＯ₂を含む加湿雰囲気中において３ ７℃で、培養培地として１０％のＦＣＢを含有するＲＰＭＩ １６４０（１０％ ＦＣＳ−ＲＰＭＩ １６４０）培地中に保持した。 タンパク質物質の精製のために、ＡＴＬ−２細胞を、１ｘＰＢＳで２回洗浄 し、７２時間、無血清ＲＰＭＩ １６４０培地／２ｍＭ Ｌ−グルタミン中で３ ｘ１０⁵ｍｌで培養し、その後、前記細胞をペレット化した。このように生成し た培養上澄を、「調整培地」（Ｃ．Ｍ．）と称する。 Ｃ．Ｍ．を１０００ｄカットオフのＹＭ−２Ｄｉａｆｌｏ膜（アミコン（Ａ ｍｉｃｏｎ），マサチューセッツ州，ボストン）を使用して、１リットルから１ ０ｍｌへと濃縮した。いくつかの分析用に、１０００ＭＷ以上の成分を含有する 濃縮Ｃ．Ｍ．を、ＲＰＭＩ培地によっ て、もとの容量に再希釈した。ポリアクリルアミドグラジエントゲル（インテグ レイテッド・セパレーション・システムズ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｓｅｐａｒ ａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ），メリーランド州，ハイド・パーク又はフォアキ ャスト・システム・バイ・アマーシャム（Ｐｈｏｒｅｃａｓｔ Ｓｙｓｔｅｍ ｂｙ Ａｍｅｒｓｃｈａｍ），イリノイ州，アーリントン・ハイツ）を使用して ゲル電気泳動にかけ、その後、前記１リットルの調合物からのこの２つのカラム 精製物資の幾らかを銀着色したところ、少なくとも４ないし５のバンドが現れ、 これらの内、１０ｋＤと２０ｋＤとのバンドがこの物質に特有のものであった。 通過した、１０００ＮＷいかのＣ．Ｍ．含有成分は希釈せずに使用した。 濃縮調整培地を、．４５μユニフロフィルタ（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ａｎ ｄ Ｓｃｈｕｅｌｌ，Ｋｅｅｎｅ，ＮＨ）でフィルタ殺菌し、次に、予め１０ｍ Ｍ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ，ｐＨ８．１で平衡化させておいたＤＥＡＥ−ＳＷ陰イオン 交換カラム（ウォーターズ・インコーポレイテッド（Ｗａｔｅｒｓ，Ｉｎｃ．） ，マサチューセッツ州，ミルフォード）へ の適用によって更に精製した。一ランのＨＰＬＣ当り１リットルの元のＡＴＬ− ２調整培地を表す濃縮Ｃ．Ｍ．タンパク質を、前記カラムに吸着させ、次に、４ ｍｌ／分の流量で、０ｍＭから４０ｍＭのＮａＣｌのリニアグラジエントで溶出 した。フラクションを、１０％の適当なＤＥＡＥフラクション（１カラム精製物 ）又は１％の適当なＣ１８フラクション（２カラム精製物）に対する生体外免疫 複合体キナーゼ分析を使用して、分析した。この生体外免疫複合体キナーゼ分析 を使用して投与量−依存的にｐ１８５ｃ−ｎｅｕのチロシンキナーゼ活性を増加 させた活性物質は、２２０ないし２４０ｍＭのＮａＣｌの近辺での４ないし５の フラクション（３６−４０）に渡って一つの主要ピークとして溶出した。ＨＰＬ Ｃ−ＤＥＡＥ精製後、前記活性フラクション中のタンパク質を、濃縮、プールし て、更に濃縮し、その後、Ｃ１８（百万マトリクス）逆相クロマトグラフィ分析 した（ウォーターズ・インコーポレイテッド（Ｗａｔｅｒｓ，Ｉｎｃ．），マサ チューセッツ州，ミルフォード）（Ｃ１８＋１工程または２カラム精製物と称す る）。溶出は、０．１％のＴＦＡに対する２−プロパノールのリニアグラジエン トで行った。すべてのフラクションを、ＲＰＭＩ１６４０培 地に対して透析して２−プロパノールを除去し、下記のように、前記生体外免疫 複合体キナーゼ分析と、適当なフラクションの１％濃縮物を使用して分析した。 ｐ１８５ｃ−ｎｅｕのチロシンキナーゼ活性を増加させる活性物質は、二つのピ ークで抽出された。一つはフラクション１１−１３において溶出し、第２番目の 僅かに低い活性の活性物質ピークは、フラクション２０−２３において溶出した 。これらの二つのピークは、それぞれ、約５ないし７％のイソプロパノールと約 １１ないし１４％のイソプロパノールとに対応している。Ｃ１８＃１発生フラク ション１１−１３を、特徴付け研究に使用した。第２クロマトグラフィ工程から 得られた活性フラクションをプールし、タンパク質物質サンプルに指定した。 ２０リットルの調合も同じ精製戦略を使用した。前記ＤＥＡＥ活性フラクシ ョン３５−４１をプールし、前述のようにしてｃ１８クロマトログラフィ分析に かけた。Ｃ１８＃１フラクション１１−１３と２１−２４との両方が、投与量− 依存活性を有していた。フラクション１１−１３のプールを、更にＣ１８クロマ トグラフィ分析工程にかけた（Ｃ１８＃２又は３カラム精 製物と称する）。ここでも再び、フラクション１１−１３と２１−２４とが活性 を有していた。例８で記載の生体外免疫複合体キナーゼ分析において測定された フラクション２３の投与量反応は、フラクション２３を容量で０．００５％、フ ラクション２３を容量で０．０５％添加することによって得られる。これは達成 された最も高い純度である。 分子量の範囲を、ゲル濾過クロマトグラフィ分析と限外濾過膜分析とに基づ いて測定した。ほぼ同じ量のチロシンキナーゼ活性を、保持し、１０，０００分 子量カットオフフィルタにより通過した。ほとんどすべての活性物質が、３０， ０００分子量カットオフフィルタを通過した。活性物質クロマトグラフフラクシ ョンの分子量範囲を、投与量−依存ｎｅｕ−活性化活性物質を含むフラクション を、同じ実行条件を使用して発生された一組のタンパク質分子量標準（シグマ・ ケミカル・カンパニー（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，ミズーリ州， セント・ルイス）の溶出プロフィールと比較することによって決定した。活性物 質の低分子量の領域が、７，０００と１４，０００ダルトンの間に見つかった。 活性物質の第２の範囲は、約 １４，０００から約２４，０００ダルトンの間であった。 ポリアクリルアミドグラジエントゲル（インテグレイテッド・セパレーショ ン・システムズ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ ｓ，メリーランド州，ハイド・パーク又はフォアキャスト・システム・バイ・ア マーシャム（Ｐｈｏｒｅｃａｓｔ Ｓｙｓｔｅｍ ｂｙ Ａｍｅｒｓｃｈａｍ） ，イリノイ州，アーリントン・ハイツ）を使用した電気泳動後、３−カラム精製 物質（ｃ１８＃２）の銀着色を、市販の銀着色キット（ＢｉｏＲａｄ，Ｒｏｃｋ ｖｉｌｌｅ Ｃｅｎｔｒｅ，ＮＹ）を使用して行った。２０リットルの調合物の ｃ１８＃２精製から得られたフラクション２１，２２，２３及び２４を、マーカ とともにランさせた。フラクション２２と２３とが、１８５^erbB2（ｎｅｕ）キ ナーゼ分析（下記参照）において最も強力な投与量反応を示した。選択された分 子量フラクションがｐ１８５^erbB2と作用するという事実が、免疫複合体キナー ゼ分析によって示された。 ここに参考文献として添付するフアング（Ｈｕａｎｇ）他（１９９２，Ｊ． Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：１１５０８−１１５１２）は、ウシの腎臓から別 のｎｅｕ／ｅｒｂ Ｂ２リガンド成長因子を分離した。２５ｋＤのポリペプチド 因子が、カラム分別の手法によって分離され、次いで、ＤＥＡＥ／セルロース（ ＤＥ５２）、Ｓｕｌｆａｄｅｘ（硫酸エステル化されたセファーデックスＧ−５ ０）、ヘパリン−セファローズ４Ｂ、そしてＳｕｐｅｒｄｅｘ７５（高速タンパ ク質液体クロマトグラフィ）で連続カラムクロマトグラフィ分析された。前記因 子、ＮＥＦ−ＧＦ、は、ｎｅｕ／ｅｒｂＢ２遺伝子生成物のチロシン−特異性自 己燐酸化を刺激する。ＶＩＩ．ｐ１８５^erbB2Ｂ２に結合するリガンドに対する免疫複合体分析ＮＤＦ この分析は、ＡＴＬ−２調整培地（Ｃ．Ｍ．）又はタンパク質物質を変量さ せながらＰＮ−ＮＲ６細胞溶解物の予備培養によって推進した、免疫沈降したｐ １８５の自己燐酸化活性物質における相違を示すものであって、これをここでｎ ｅｕ−活性化活性物質と称する。 免疫複合体キナーゼ分析において使用した細胞系は、ここにその全部を参考 文献として添付する、コカイ（Ｋｏｋａｉ）他，Ｃｅｌｌ ５５，２８７−２９ ２（Ｊｕｌｙ ２８，１９８９）と、これもその全部を参考文献として添付する 、マーク・アイ・グリーン（Ｍａｒｋ Ｉ．Ｇｒｅｅｎ）の名のもとに「アンチ −レセプタ抗体によってがん細胞を治療する方法」という名称で１９８９年７月 ２７に出願された米国出願第３８６，８２０号とに記載の方法によって、入手、 調合、培養したものである。 細胞ラインは、すべて、５％のＣＯ₂を有する加湿雰囲気中において、培養 培地として５％のＦＣＳを含有するＤＭＥＭ培地（５％ＦＣＳ−ＤＭＥＭ）中に 維持した。 １５０ｍｍディシュ中の細胞の濃縮培養物を、冷たいＰＢＳで２回洗浄し、 １０ｍｌの冷凍−解凍バッファ（１５０ｍＭ ＮａＣｌ，１ｍＭ ＭｇＣｌ₂， ２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ，ｐＨ７．２，１０％グリセロール，１ｍＭ ＥＤＴＡ， １％アプロチニン）中に掻き入れ、遠心分離（６００ｘ６，１０分間）した。細 胞ペレットを、１ｍｌの溶出（Ｌｙｓｉｓ）バッファ（５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ， ｐＨ７．５，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，３％Ｂｒｉｊ３５，１ｍＭ ＥＤＴＡ，１ ．５ｍＭ ＭｇＣｌ₂，１％アプロチニン，１ｍＭ ＥＧＴＡ，２０μｌＭ Ｎ ａ₃ＶＯ₄，１０％グリセロール）中で再懸濁させ、４℃で３０分間回転させた。 すべての化学物質は、特に明記の無い限り、シグマ・ケミカル・カンパニー（Ｓ ｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．），ミズーリ州，セント・ルイスからのも のであった。非溶解物質を、４０，０００ｘｇで３０分間の遠心分離によって除 去した。次に使用するクリアな上澄を、細胞溶出物と指定する。 前記細胞溶出物を、５０μｌの５０％（容量／容量）タンパク質Ａ−セファ ローズ（シグマ・ケミカル・カンパニー（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ ．），ミズーリ州，セント・ルイス）と、１５分間培養し、２分間の遠心分離で 、溶出物を予備浄化した。この予備浄化細胞溶出物の５０μｌ部分を、調整培地 、タンパク質物質、又は特定の他の因子とともに、溶出バッファと１ｍｌの最終 容量で、氷上で１５分間培養した。次に、サンプルを、ｐ１８５ｎｅｕ及びｐ１ ８５ｃ− ｎｅｕを認識する５μｇの７．１６．４モノクローナル抗体又は他の適当な抗体 と共に、氷上で２０分間培養し、その後４℃で回転させながら、５０μｌの５０ ％（容量／容量）タンパク質Ａ−セファローズで培養した。免疫複合体を、遠心 分離によって収集し、５００μｌの洗浄バッファ（５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ，ｐＨ ．７．５、０．１％，Ｂｒｉｊ３５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ 、１％アプロンチニン、３０μｍ Ｎａ₃ＶＯ₄）で４回洗浄し、更に、反応バッ ファ（２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）、３ｍＭ ＭｎＣｌ₂、及び０．１ ％Ｂｒｉｊ３５、３０μｍＮａ₃ＶＯ₄）で２回洗浄した。ペレットを、５０μｌ の反応バッファ中で再懸濁させ、（ガンマ−³²Ｐ）−ＡＴＰ（アマーシャム（Ａ ｍｅｒｓｈａｍ），イリノイ州，アーリントン・ハイツ）を添加して０．２μｍ の最終濃度を得た。これらのサンプルを、２７℃で２０分間、又は純粋サンプル とともに４℃で２５分間培養した。２ｍＭ ＡＴＰと２ｍＭ ＥＤＴＡとを含有 する３ｘＳＤＳサンプルバッファを添加することによって反応を終結させ、次に 、これらを１００℃で５分間培養した。これらのサンプルを、次に、１０％のア クリルアミドゲル上でＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析にかけた。 ゲルを着色、乾燥し、強化スクリーンを備えたＫｏｄａｋ ＸＡＲまたはＸＲＰ フィルムに露光した。ＶＩＩＩ．活動を有するアセチルコリンレセプタ（ＡＲＩＡ）の精製 ＡＲＩＡ、即ち、アセチルコリンレセプタの合成を刺激する４２ｋＤのタン パク質が、Ｇｅｒａｌｄ Ｆｉｓｃｈｂａｃｈ（フォールズ（Ｆａｌｌｓ）他Ｃ ｅｌｌ ７２：８０１−８１５（１９９３））の実験室にて分離された。ＡＲＩ Ａは、ｐ１８５^erbB2に類似の１８５Ｋｄａ筋肉経膜タンパク質のチロシン燐酸 化を誘発し、培養胚筋管内のアセチルコリンレセプタ合成を刺激する。ＡＲＩＡ をコード化するｃＤＮＡクローンの配列分析は、ＡＲＩＡが、タンパク質のＧＧ Ｆ／ｅｒｂＢ２リガンドグループのメンバであることを示しており、これは、グ リア細胞細胞分裂誘発を刺激や、ここに記載の例えばＧＧＦ２の適用に潜在的に 有効である可能性を有している。 例１４ シュワン細胞中のＧＧＦによって仲介されたタンパク質チロシン燐酸化 増殖を誘発するための十分なレベルのグリア成長因子での処理の後、ラットシ ュワン細胞は、タンパク質チロシンの燐酸化の刺激を示す（図３６）。様々な量 の部分精製ＧＧＦを、例３に概述した手法に従ってラットシュワン細胞の一次培 養に適用した。シュワン細胞を、ポリＤ−リジン被覆した２４のウェルプレート 内の、１ｍＬのＧＧＦ−ＣＭにつき（１ウェル当り０．５ｍＬ）ＤＭＥＭ／１０ ％胎児子ウシ血清／５μＭフォルスコリン／０．５μｇ中で発育させた。集合状 態において、前記細胞に、ウェル当り０．５ｍＬでＤＭＥＭ／１０％の胎児子ウ シ血清を供給し、培養器内に一晩放置して鎮静化させた。次の日、前記細胞に、 ０．２ｍＬのＤＭＥＭ／１０％胎児子ウシ血清を供給し、培養器内で１時間放置 した。次に、テストサンプルを、必要に応じて、様々な濃度と長さで、前記培地 に直接添加した。次に、細胞を、沸騰している溶解バッファ（燐酸ナトリウム、 ５ｍＭ，ｐＨ６．８；ＳＤＳ，２％，β−メルカプトエタノール、５％；ジチオ トレイトール、０．１Ｍ；グリセロール、１０％；ブロモフェノール ブルー， ０．４％；バナジウム酸ナトリウム，１０ｍＭ）中で溶解し、沸騰水浴中で１０ 分間培養し、次に、直接に分析するか、あるいは、−７０℃で冷凍した。サンプ ルは、 ７．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上でのランによって分析し、トウビン（Ｔｏｗｂ ｉｎ）他（１９７９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７６：４ ３５０−４３５４に記載の標準手法を使用してニトロセルロース上にエレクトロ ブロッチングした。ブロットされたニトロセルロースを、Ｋａｍｐｓ ａｎｄ Ｓｅｌｔｏｎ（１９８８）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ２：３０５−３１５に記載されてい る標準方法を使用して、アンチホスホチロシン抗体でプローブした。プローブさ れたブロットを、一晩オートラジオグラフィに露光し、標準実験室手法を使用し て現像した。濃度測定を、ウルトラスキャンＸＬ強化レーザ濃度計（ＬＫＢ）を 使用して行った。分子量指定は、予備染色高分子量標準（Ｓｉｇｍａ）に対して 行われた。タンパク質燐酸化とシュワン細胞増殖の投与量反応は非常に類似して いる（図３６）。燐酸化バンドの分子量は、ｐ１８５^erbB2の分子量に非常に近 い。シュワン細胞を、ＧＧＦ２ＨＢＳ５クローンによってＣＯＳ細胞翻訳物から 調整した培地によって処理した場合にも類似の結果が得られた。これらの結果は 、予想されていた、ＧＧＦｓとの相互作用および１８５^erbB2の活性化とよく相 関している。 この実験を組替えＧＧＦ−ＩＩで繰り返した。ＧＧＦ−ＩＩクローンで安定的 に形質転換したＣＨＯ細胞系（ＧＧＦ２ＨＢＳ５）からの調整培地は、上述の分 析を使用して、タンパク質チロシン燐酸化を刺激する。疑似移入されたＣＨＯ細 胞系ではこの活性を刺激することは出来なかった（図５２）。 例１５ ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞系からのタンパク質因子によるシュワン細胞増殖の分 析 シュワン細胞の増殖は、ヒト乳ガン細胞ラインＭＤＡ−ＭＢ−２３１由来の調 整培地によって媒介される。分析の第１日目、１０⁴個の一次ラットシュワン細 胞を、９６ウェル・ミクロタイター（ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ）プレート中に、ウ ェル当り５％の胎児ウシプラズマを補足した１００μｌのＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ’ｓ培地内にプレート化した。分析の第２日目 、１０μｌの調整培地（例６に記載のように培養された、ヒト乳ガン細胞ライン ＭＤＡ−ＭＢ−２３１からのもの）を、前記ミクロタイタープレートの各ウェル に添加した。第６日目、各プレート当りのシュワン細胞の 数を、酸ホスファターゼ分析（コノリー（Ｃｏｎｎｏｌｌｙ）他Ａｎａｌ．Ｂ ｉｏｃｈｅｍ．１５２：１３６（１９８６）の手法に従って）によって測定した 。前記プレートを、１００μｌの燐酸塩バッファ化塩水（ＰＢＳ）と１００μｌ の反応バッファ（０．１ｍ酢酸ナトリウム，（ｐＨ５．５））と０．１％のトリ トン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００で洗浄し、各ウェル毎に、１０ｍＭの燐酸ｐ− ニトロフェニルを添加した。プレートを３７℃で２時間培養し、１０μｌの１Ｎ ＮａＯＨを添加することによって反応を終結させた。各サンプルの光濃度を、 分光光度計で４１０ｎｍで読み取った。コントロール細胞系（ＨＳ−２９４Ｔ， ｅｒｂＢ−２リガンドの非プロデューサ）からの調整培地によって処理したシュ ワン細胞において細胞数の３８％の刺激が観察された。この結果は、ＭＤＡ−Ｍ Ｂ−２３１細胞ライン（ｐ１８５^erbB2結合活性を刺激する）によって分泌され たタンパク質が、シュワン細胞の増殖を刺激することを示すものである。 例１６ ＧＧＦのＮ−グリコシル化 ＧＧＦ−ＩＩ候補クローンＧＧＦ２ＢＰＰ１，２及び ３のｃＤＮＡ配列から予測されるタンパク質配列は、多数のコンセンサスＮ−グ リコシル化モチーフを有している。ＧＧＦＩＩ０２ペプチド配列におけるギャッ プは、これらのモチーフの一つにおけるアスパラギン残基に一致し、これは、こ のサイトにおいて恐らく炭水化物が結合していることを示している。 ＧＧＦのＮ−グリコシル化を、タンパク質中において炭水化物とアスパラギン 残基との間の共有結合を切断する酵素であるＮ−グリカナーゼとの培養後におい てＳＤＳ−ＰＡＧＥ上の移動度の変化を観察することによって調べた。 ＧＧＦ−ＩＩのＮ−グリカナーゼ処理によって、ＭＷ４０−４２ｋＤａの主要 なバンドと、４５−４８ｋＤａの副バンドとが得られた。非還元条件下における 活性物質溶出実験は、約４５−５０ｋＤａにおける一つの活性脱グリコシル化種 を示した。 ＧＧＦ−Ｉの活性物質溶出実験も、Ｎ−グリカナーゼによって処理された場合 に、ＭＷ２６−２８ｋＤａの活性種を生ずることにより、電気泳動的移動度の増 加を示 している。銀着色によって、移動度のシフトがあることが確認されたが、使用さ れたサンプルのバックグラウンドの着色によってＮ−脱グリコシル化バンドを指 定することが出来なかった。寄託 Ｔ７プロモータのコントロール下におけるプラシミドｐブルースクリプト５ｋ 中の核酸コード化ＧＧＦ−ＩＩ（ｃＤＮＡ，ＧＧＦ２ＨＢＳ５）タンパク質（例 ６）を、米国培養収集所（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏ ｌｌｅ ｃｔｉｏｎ），メリーランド州ロックスビルに寄託し、ＡＴＴＣ番号７ ５２９８を与えられた。本出願人は、もしもこのプラスミドが、本件が特許とな った時にこの特許の権利期間が終結するまでに生存不能となった場合には、これ を取り替える義務と、更に、そのような特許が発行されたことをＡＴＴＣに通知 し、その発行時にこの寄託物を公衆に利用可能とする義務があることを認識する ものである。それ以前においては、該寄託物は、３７ＣＦＲ １．１４及び３５ ＵＳＣ １１２の規定に従って特許庁長官に利用可能とされる。

【手続補正書】特許法第１８４条の８ 【提出日】１９９４年８月２９日 【補正内容】 るＤＮＡ配列。 ２０． 図３１に示すアミノ酸配列（配列認識番号１３６−１３９，１６３）を 備えたポリペプチドセグメントをコード化するコード化セグメント^5'ＦＥＢＡ^3' を有するＤＮＡ配列。 ２１． 図３１に示すアミノ酸配列（配列認識番号１３６−１３８，１４０，１ ６３）を備えたポリペプチドセグメントをコード化するコード化セグメント^5'Ｆ ＥＢＡ^3'を有するＤＮＡ配列。 ２２． ＧＧＦ２ＨＢＳ５をコード化する精製されたＤＮＡ。 ２３． 次の式で表される精製したポリペプチド、 ＷＹＢＡＺＣＸ ここで、ＷＹＢＡＺＣＸは、図３１に示されるポリペプチドセグメント（配 列認識番号１３６−１３９，１４１−１４７，１６０，１６１，及び１６３）で あり、ＷはポリペプチドセグメントＦ又はその不在、Ｙはポリペプチドセグメン トＥ又はその不在、Ｚはポリ ペプチドＧ又はその不在であり、 Ｘは、ポリペプチドセグメント Ｃ／Ｄ ＨＫＬ、Ｃ／Ｄ Ｈ、Ｃ／Ｄ ＨＬ、Ｃ／Ｄ Ｄ、Ｃ／Ｄ’ＨＬ、Ｃ ／Ｄ’ＨＫＬ、Ｃ／Ｄ’Ｈ、Ｃ／Ｄ’Ｄ、Ｃ／Ｄ Ｃ／Ｄ’ＨＫＬ、Ｃ／ＤＣ／ Ｄ’Ｈ、Ｃ／Ｄ Ｃ／Ｄ’ＨＬ、Ｃ／Ｄ Ｃ／Ｄ’Ｄ、Ｃ／Ｄ Ｄ’Ｈ、Ｃ／Ｄ Ｄ’ＨＬ、Ｃ／Ｄ Ｄ’ＨＫＬ、Ｃ／Ｄ’Ｄ’Ｈ、Ｃ／Ｄ’Ｄ’ＨＫＬ、Ｃ／ Ｄ Ｃ／Ｄ’Ｄ’Ｈ、Ｃ／Ｄ Ｃ／Ｄ’Ｄ’ＨＬ、Ｃ／Ｄ Ｃ／Ｄ’Ｄ’ＨＫＬ 、またはＣ／Ｄ’Ｄ’ＨＬであり、 ａ）Ｆ，Ｙ，Ｂ，Ａ，Ｚ，Ｃ又はＸの少なくとも一つがウシ由来であり、又 は ｂ）ＹはポリペプチドセグメントＥであり、又は ｃ）Ｘはポリペプチドセグメント Ｃ／Ｄ ＨＫＬ、Ｃ／Ｄ’ＨＫＬ、Ｃ／Ｄ Ｄ、Ｃ／Ｄ Ｃ／Ｄ’ＨＫＬ、Ｃ ／Ｄ Ｃ／Ｄ’Ｄ、Ｃ／Ｄ Ｄ’Ｈ、Ｃ／Ｄ Ｄ’ＨＬ、Ｃ／Ｄ Ｄ’ＨＫＬ、 Ｃ／Ｄ’Ｄ’Ｈ、Ｃ／Ｄ’Ｄ’ＨＫＬ、Ｃ／Ｄ Ｃ／Ｄ’Ｄ’Ｈ、Ｃ／Ｄ Ｃ／ Ｄ’Ｄ’ＨＬ、Ｃ／Ｄ Ｃ／Ｄ’Ｄ’ＨＫＬ、Ｃ／Ｄ’Ｈ、Ｃ／ＤＣ／Ｄ’Ｈ、 又はＣ／Ｄ Ｃ／Ｄ’であり、当該分離 ポリペプチドは、ウシグリア成長因子ではない。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ０７Ｈ 21/04 9452−4Ｂ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｈ Ｃ０７Ｋ 14/52 9358−4Ｂ 21/08 16/24 9453−4Ｂ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ｚ Ｃ１２Ｎ 5/10 8310−2Ｊ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ 15/02 8310−2Ｊ 33/566 Ｃ１２Ｐ 21/00 9284−4Ｃ Ａ６１Ｋ 39/395 Ｅ 21/02 9162−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ 21/08 9455−4Ｃ Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＡＡ Ｃ１２Ｑ 1/68 ＡＤＡ Ｇ０１Ｎ 33/53 ＡＤＳ 33/566 ＡＤＵ // Ａ６１Ｋ 39/395 9281−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (31)優先権主張番号 ０７／９６５，１７３ (32)優先日 1992年10月23日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号 ０８／０３６，５５５ (32)優先日 1993年３月24日 (33)優先権主張国 米国（ＵＳ） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＦＩ， ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＫ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，Ｎ Ｏ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ (72)発明者 グッドアール，アンドリュー イギリス国 ハートフォードシャー ダブ リュディ３ ５ピーワイ コーリーウッド ブラケッツ・ウッド・ドライブ 45 (72)発明者 ストローバント，ポール イギリス国 ロンドン エヌ８ ９エイエ ス クラウチ・エンド セシル・パーク 52エイ (72)発明者 ミンゲッティ，ルイザ イタリア国 イ‐48012 バナキャバッロ ヴィア・ストラデッロ 22 (72)発明者 ウォーターフィールド，マイケル イギリス国 バークシャー アールジー13 １アールエヌ ニューベリー スピーン スピーン・レーン シャンターマーク （無番地) (72)発明者 マルキオニ，マーク アメリカ合衆国 マサチューセッツ 02174 アーリントン トゥイン・サーク ル・ドライブ 24 (72)発明者 チェン，メイオー，スー アメリカ合衆国 マサチューセッツ 02174 アーリントン デカッター・スト リート 65 (72)発明者 ハイルズ，イアン イギリス国 ロンドン ダブリュ１ピー ８ビーティ ライディング・ハウス・スト リート 91

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． 次の式のポリペプチドをコード化するＤＮＡ配列、 ＷＹＢＡＺＣＸ ここで、ＷＹＢＡＺＣＸは、図３１に示されるポリペプチドセグメント（配 列認識番号１３６−１３９，１４１−１４７，１６０，１６１，及び１６３）で あり、ＷはポリペプチドセグメントＦ又はその不在、Ｙはポリペプチドセグメン トＥ又はその不在、ＺはポリペプチドＧ又はその不在であり、 Ｘは、ポリペプチドセグメント Ｃ／Ｄ ＨＫＬ、Ｃ／Ｄ Ｈ、Ｃ／Ｄ ＨＬ、Ｃ／Ｄ Ｄ、Ｃ／Ｄ’ＨＬ、Ｃ ／Ｄ’ＨＫＬ、Ｃ／Ｄ’Ｈ、Ｃ／Ｄ’Ｄ、Ｃ／Ｄ Ｃ／Ｄ’ＨＫＬ、Ｃ／Ｄ Ｃ ／Ｄ’Ｈ、Ｃ／Ｄ Ｃ／Ｄ’ＨＬ、Ｃ／Ｄ Ｃ／Ｄ’Ｄ、Ｃ／Ｄ Ｄ’Ｈ、Ｃ／ Ｄ Ｄ’ＨＬ、Ｃ／Ｄ Ｄ’ＨＫＬ、Ｃ／Ｄ’Ｄ’Ｈ、Ｃ／Ｄ’Ｄ’ＨＫＬ、Ｃ ／Ｄ Ｃ／Ｄ’Ｄ’Ｈ、Ｃ／Ｄ Ｃ／Ｄ’Ｄ’ＨＬ、Ｃ／Ｄ Ｃ／Ｄ’Ｄ’ＨＫ Ｌ、またはＣ／Ｄ’Ｄ’ＨＬであり、 ａ）Ｆ，Ｙ，Ｂ，Ａ，Ｚ，Ｃ又はＸの少なくとも一つがウシ由来であり、又 は ｂ）ＹはポリペプチドセグメントＥであり、又は ｃ）Ｘはポリペプチドセグメント Ｃ／Ｄ ＨＫＬ、Ｃ／Ｄ Ｄ、Ｃ／Ｄ’ＨＫＬ、Ｃ／Ｄ Ｃ／Ｄ’ＨＫＬ、Ｃ ／Ｄ Ｃ／Ｄ’Ｄ、Ｃ／Ｄ Ｄ’Ｈ、Ｃ／Ｄ Ｄ’ＨＬ、Ｃ／Ｄ Ｄ’ＨＫＬ、 Ｃ／Ｄ’Ｄ’Ｈ、Ｃ／Ｄ’Ｄ’ＨＫＬ、Ｃ／Ｄ Ｃ／Ｄ’Ｄ’Ｈ、Ｃ／Ｄ Ｃ／ Ｄ’Ｄ’ＨＬ、Ｃ／Ｄ Ｃ／Ｄ’Ｄ’ＨＫＬ、Ｃ／Ｄ’Ｈ、Ｃ／Ｄ Ｃ／Ｄ’Ｈ 、又はＣ／Ｄ Ｃ／Ｄ’ＨＬである。 ２． クレーム１に記載のＤＮＡ配列であって、Ｘは図３１に示すアミノ酸配 列（配列認識番号１３６−１３９，１４１−１４２，１４６，１４７，１６０， １６１）を有するポリペプチドセグメントＣ／Ｄ ＨＫＬである。 ３． クレーム１に記載のＤＮＡ配列であって、Ｘは図３１に示すアミノ酸配 列（配列認識番号１３６−１３９，１４１，１４３，１４６，１６０）を有する ポリペプチドセグメントＣ／Ｄ’Ｈである。 ４． クレーム１に記載のＤＮＡ配列であって、Ｘは図３１に示すアミノ酸配 列（配列認識番号１３６−１３９，１４１，１４２，１４４，１６０）を有する ポリペプチドセグメントＣ／Ｄ Ｄである。 ５． クレーム１に記載のＤＮＡ配列であって、Ｘは図３１に示すアミノ酸配 列（配列認識番号１３６−１３９，１４１，１４３，１４６，１４７，１６０， １６１）を有するポリペプチドセグメントＣ／Ｄ’ＨＫＬである。 ６． クレーム１に記載のＤＮＡ配列であって、Ｘは図３１に示すアミノ酸配 列（配列認識番号１３６−１３９，１４１−１４３，１４６，１４７，１６０， １６１）を有するポリペプチドセグメントＣ／Ｄ Ｃ／Ｄ’ＨＫＬである。 ７． クレーム１に記載のＤＮＡ配列であって、Ｘは図３１に示すアミノ酸配 列（配列認識番号１３６−１３９，１４１−１４３，１４６，１６０）を有する ポリペプチドセグメントＣ／Ｄ Ｃ／Ｄ’Ｈである。 ８． クレーム１に記載のＤＮＡ配列であって、Ｘは図３１に示すアミノ酸配 列（配列認識番号１３６−１３９，１４１−１４３，１４６，１４７，１６０） を有するポリペプチドセグメントＣ／Ｄ Ｃ／Ｄ’ＨＬである。 ９． クレーム１に記載のＤＮＡ配列であって、Ｘは図３１に示すアミノ酸配 列（配列認識番号１３６−１３９，１４１−１４４，１６０）を有するポリペプ チドセグメントＣ／Ｄ Ｃ／Ｄ’Ｄである。 １０． クレーム１に記載のＤＮＡ配列であって、Ｘは図３１に示すアミノ酸配 列（配列認識番号１３６−１３９，１４１−１４２，１４５，１４６，１６０） を有するポリペプチドセグメントＣ／Ｄ Ｄ’Ｈである。 １１． クレーム１に記載のＤＮＡ配列であって、Ｘは図３１に示すアミノ酸配 列（配列認識番号１３６−１３９，１４１−１４２，１４５，１４６，１４７， １６０）を有するポリペプチドセグメントＣ／Ｄ Ｄ’ＨＬである。 １２． クレーム１に記載のＤＮＡ配列であって、Ｘは図３１に示すアミノ酸配 列（配列認識番号１３６−１３９，１４１−１４２，１４５−１４７，１６０， １６１）を有するポリペプチドセグメントＣ／Ｄ Ｄ’ＨＫＬである。 １３． クレーム１に記載のＤＮＡ配列であって、Ｘは図３１に示すアミノ酸配 列（配列認識番号１３６−１３９，１４１，１４３，１４５，１４６，１６０） を有するポリペプチドセグメントＣ／Ｄ’Ｄ’Ｈである。 １４． クレーム１に記載のＤＮＡ配列であって、Ｘは図３１に示すアミノ酸配 列（配列認識番号１３６−１３９，１４１，１４３，１４５−１４７，１６０， １６１）を有するポリペプチドセグメントＣ／Ｄ’Ｄ’ＨＫＬである。 １５． クレーム１に記載のＤＮＡ配列であって、Ｘは図３１に示すアミノ酸配 列（配列認識番号１３６−１３９，１４１−１４３，１４５，１４６，１６０） を有するポリペプチドセグメントＣ／Ｄ Ｃ／Ｄ’ Ｄ’Ｈである。 １６． クレーム１に記載のＤＮＡ配列であって、Ｘは図３１に示すアミノ酸配 列（配列認識番号１３６−１３９，１４１−１４３，１４５−１４７，１６０） を有するポリペプチドセグメントＣ／Ｄ Ｃ／Ｄ’Ｄ’ＨＬである。 １７． クレーム１に記載のＤＮＡ配列であって、Ｘは図３１に示すアミノ酸配 列（配列認識番号１３６−１３９，１４１−１４３，１４５−１４７，１６０， １６１）を有するポリペプチドセグメントＣ／Ｄ Ｃ／Ｄ’Ｄ’ＨＫＬである。 １８． 図３１に示すアミノ酸配列（配列認識番号１３６，１３８，１３９）を 備えたポリペプチドセグメントをコード化するコード化セグメント^5'ＦＢＡ^3'を 有するＤＮＡ配列。 １９． 図３１に示すアミノ酸配列（配列認識番号１３６，１３８，１４０）を 備えたポリペプチドセグメントをコード化するコード化セグメント^5'ＦＢＡ’^3' を有す るＤＮＡ配列。 ２０． 図３１に示すアミノ酸配列（配列認識番号１３６−１３９，１６３）を 備えたポリペプチドセグメントをコード化するコード化セグメント^5'ＦＥＢＡ^3' を有するＤＮＡ配列。 ２１． 図３１に示すアミノ酸配列（配列認識番号１３６−１３８，１４０，１ ６３）を備えたポリペプチドセグメントをコード化するコード化セグメント^5'Ｆ ＥＢＡ’^3'を有するＤＮＡ配列。 ２２． ＧＧＦ２ＨＢＳ５をコード化する精製されたＤＮＡ。 ２３． 次の式で表されるポリペプチド、 ＷＹＢＡＺＣＸ ここで、ＷＹＢＡＺＣＸは、図３１に示されるポリペプチドセグメント（配 列認識番号１３６−１３９，１４１−１４７，１６０，１６１，及び１６３）で あり、ＷはポリペプチドセグメントＦ又はその不在、Ｙはポリペプチドセグメン トＥ又はその不在、Ｚはポリ ペプチドＧ又はその不在であり、 Ｘは、ポリペプチドセグメント Ｃ／Ｄ ＨＫＬ、Ｃ／Ｄ Ｈ、Ｃ／Ｄ ＨＬ、Ｃ／Ｄ Ｄ、Ｃ／Ｄ’ＨＬ、Ｃ ／Ｄ’ＨＫＬ、Ｃ／Ｄ’Ｈ、Ｃ／Ｄ’Ｄ、Ｃ／Ｄ Ｃ／Ｄ’ＨＫＬ、Ｃ／Ｄ Ｃ ／Ｄ’Ｈ、Ｃ／Ｄ Ｃ／Ｄ’ＨＬ、Ｃ／Ｄ Ｃ／Ｄ’Ｄ、Ｃ／Ｄ Ｄ’Ｈ、Ｃ／ Ｄ Ｄ’ＨＬ、Ｃ／Ｄ Ｄ’ＨＫＬ、Ｃ／Ｄ’Ｄ’Ｈ、Ｃ／Ｄ’Ｄ’ＨＫＬ、Ｃ ／Ｄ Ｃ／Ｄ’Ｄ’Ｈ、Ｃ／Ｄ Ｃ／Ｄ’Ｄ’ＨＬ、Ｃ／Ｄ Ｃ／Ｄ’Ｄ’ＨＫ Ｌ、またはＣ／Ｄ’Ｄ’ＨＬであり、 ａ）Ｆ，Ｙ，Ｂ，Ａ，Ｚ，Ｃ又はＸの少なくとも一つがウシ由来であり、又 は ｂ）ＹはポリペプチドセグメントＥであり、又は ｃ）Ｘはポリペプチドセグメント Ｃ／Ｄ ＨＫＬ、Ｃ／Ｄ’ＨＫＬ、Ｃ／Ｄ Ｄ、Ｃ／Ｄ Ｃ／Ｄ’ＨＫＬ、Ｃ ／Ｄ Ｃ／Ｄ’Ｄ、Ｃ／Ｄ Ｄ’Ｈ、Ｃ／Ｄ Ｄ’ＨＬ、Ｃ／Ｄ Ｄ’ＨＫＬ、 Ｃ／Ｄ’Ｄ’Ｈ、Ｃ／Ｄ’Ｄ’ＨＫＬ、Ｃ／Ｄ Ｃ／Ｄ’Ｄ’Ｈ、Ｃ／Ｄ Ｃ／ Ｄ’Ｄ’ＨＬ、Ｃ／Ｄ Ｃ／Ｄ’Ｄ’ＨＫＬ、Ｃ／Ｄ’Ｈ、Ｃ／Ｄ Ｃ／Ｄ’Ｈ 、又はＣ／Ｄ Ｃ／Ｄ’ＨＬである。 ２４． クレーム２３に記載のポリペプチドであって、Ｘは図３１に示すアミノ 酸配列（配列認識番号１３９，１４１−１４２，１４６，１４７，１６０，１６ １）を有するポリペプチドセグメントＣ／Ｄ ＨＫＬである。 ２５． クレーム２３に記載のポリペプチドであって、Ｘは図３１に示すアミノ 酸配列（配列認識番号１３６−１３９，１４１，１４２，１４４，１６０）を有 するポリペプチドセグメントＣ／Ｄ Ｄである。 ２６． クレーム２３に記載のポリペプチドであって、Ｘは図３１に示すアミノ 酸配列（配列認識番号１３６−１３９，１４１，１４３，１６０）を有するポリ ペプチドセグメントＣ／Ｄ’Ｈである。 ２７． クレーム２３に記載のポリペプチドであって、Ｘは図３１に示すアミノ 酸配列（配列認識番号１３６−１３９，１４１，１４３，１４６，１４７，１６ ０，１６１）を有するポリペプチドセグメントＣ／Ｄ’ＨＫＬである。 ２８． クレーム２３に記載のポリペプチドであって、Ｘは図３１に示すアミノ 酸配列（配列認識番号１３６−１３９，１４１−１４３，１４６，１４７，１６ ０，１６１）を有するポリペプチドセグメントＣ／Ｄ Ｃ／Ｄ’ＨＫＬである。 ２９． クレーム２３に記載のポリペプチドであって、Ｘは図３１に示すアミノ 酸配列（配列認識番号１３６−１３９，１４１−１４３，１４６，１６０）を有 するポリペプチドセグメントＣ／Ｄ Ｃ／Ｄ’Ｈである。 ３０． クレーム２３に記載のポリペプチドであって、Ｘは図３１に示すアミノ 酸配列（配列認識番号１３６−１３９，１４１−１４３，１４６，１４７，１６ ０）を有するポリペプチドセグメントＣ／Ｄ Ｃ／Ｄ’ＨＬである。 ３１． クレーム２３に記載のポリペプチドであって、Ｘは図３１に示すアミノ 酸配列（配列認識番号１３６−１３９，１４１−１４４，１６０）を有するポリ ペプチドセグメントＣ／Ｄ Ｃ／Ｄ’Ｄである。 ３２． クレーム２３に記載のポリペプチドであって、Ｘは図３１に示すアミノ 酸配列（配列認識番号１３６−１３９，１４１，１４２，１４５，１４６，１６ ０）を有するポリペプチドセグメントＣ／Ｄ Ｄ’Ｈである。 ３３． クレーム２３に記載のポリペプチドであって、Ｘは図３１に示すアミノ 酸配列（配列認識番号１３６−１３９，１４１，１４２，１４５−１４７，１６ ０）を有するポリペプチドセグメントＣ／Ｄ Ｄ’ＨＬである。 ３４． クレーム２３に記載のポリペプチドであって、Ｘは図３１に示すアミノ 酸配列（配列認識番号１３６−１３９，１４１，１４２，１４５−１４７，１６ ０，１６１）を有するポリペプチドセグメントＣ／Ｄ Ｄ’ＨＫＬである。 ３５． クレーム２３に記載のポリペプチドであって、Ｘは図３１に示すアミノ 酸配列（配列認識番号１３６−１３９，１４１，１４３，１４５，１４６，１６ ０）を有するポリペプチドセグメントＣ／Ｄ’Ｄ’Ｈであ る。 ３６． クレーム２３に記載のポリペプチドであって、Ｘは図３１に示すアミノ 酸配列（配列認識番号１３６−１３９，１４１，１４３，１４５−１４７，１６ ０，１６１）を有するポリペプチドセグメントＣ／Ｄ’Ｄ’ＨＫＬである。 ３７． クレーム２３に記載のポリペプチドであって、Ｘは図３１に示すアミノ 酸配列（配列認識番号１３６−１３９，１４１−１４３，１４５，１４６，１６ ０）を有するポリペプチドセグメントＣ／Ｄ Ｃ／Ｄ’Ｄ’Ｈである。 ３８． クレーム２３に記載のポリペプチドであって、Ｘは図３１に示すアミノ 酸配列（配列認識番号１３６−１３９，１４１−１４３，１４５−１４７，１６ ０）を有するポリペプチドセグメントＣ／Ｄ Ｃ／Ｄ’Ｄ’ＨＬである。 ３９． クレーム２３に記載のポリペプチドであって、Ｘは図３１に示すアミノ 酸配列（配列認識番号１３６− １３９，１４１−１４３，１４５−１４７，１６０，１６１）を有するポリペプ チドセグメントＣ／Ｄ Ｃ／Ｄ’Ｄ’ＨＫＬである。 ４０． 図３１に示すアミノ酸配列（配列認識番号１３６，１３８，１３９）を 備えたＦＢＡポリペプチドセグメントを有するポリペプチド。 ４１． 図３１に示すアミノ酸配列（配列認識番号１３６−１３９，１６３）を 備えたＦＥＢＡポリペプチドセグメントを有するポリペプチド。 ４２． 図３１に示すアミノ酸配列（配列認識番号１３６，１３９，１４０）を 備えたＦＢＡ’ポリペプチドセグメントを有するポリペプチド。 ４３． 図３１に示すアミノ酸配列（配列認識番号１３６−１３９，１４０，１ ６３）を備えたＦＥＢＡ’ポリペプチドセグメントを有するポリペプチド。 ４４． 精製されたＧＧＦ２ＨＢＳ５ポリペプチド。 ４５． グリア細胞の細胞分裂誘発を刺激する方法であって、グリア細胞を次の 式で表されるポリペプチドと接触させる工程を有する当該方法、 ＷＹＢＡＺＣＸ ここで、ＷＹＢＡＺＣＸは、図３１に示されるポリペプチドセグメント（配 列認識番号１３６−１３９，１４１−１４７，１６０，１６１，及び１６３）で あり、ＷはポリペプチドセグメントＦ又はその不在、Ｙはポリペプチドセグメン トＥ又はその不在、ＺはポリペプチドＧ又はその不在であり、 Ｘは、ポリペプチドセグメント Ｃ／Ｄ ＨＫＬ、Ｃ／Ｄ Ｈ、Ｃ／Ｄ ＨＬ、Ｃ／Ｄ Ｄ、Ｃ／Ｄ’ＨＬ、Ｃ ／Ｄ’ＨＫＬ、Ｃ／Ｄ’Ｈ、Ｃ／Ｄ’Ｄ、Ｃ／Ｄ Ｃ／Ｄ’ＨＫＬ、Ｃ／Ｄ Ｃ ／Ｄ’Ｈ、Ｃ／Ｄ Ｃ／Ｄ’ＨＬ、Ｃ／Ｄ Ｃ／Ｄ’ Ｄ、Ｃ／Ｄ Ｄ’Ｈ、Ｃ ／Ｄ Ｄ’ＨＬ、Ｃ／Ｄ Ｄ’ＨＫＬ、Ｃ／Ｄ’Ｄ’Ｈ、Ｃ／Ｄ’Ｄ’ＨＬ、Ｃ ／Ｄ’Ｄ’ＨＫＬ、Ｃ／Ｄ Ｃ／Ｄ’Ｄ’Ｈ、Ｃ／Ｄ Ｃ／Ｄ’Ｄ’ＨＬ、又は Ｃ／Ｄ Ｃ／Ｄ’Ｄ’ＨＫＬである。 ４６． グリア細胞の細胞分裂誘発を刺激する方法であ って、当該方法は前記グリア細胞を、図３１に示すアミノ酸配列（配列認識番号 １３６，１３８，１３９）を備えたＦＢＡポリペプチドセグメントを有するポリ ペプチドと接触させる工程を有する。 ４７． グリア細胞の細胞分裂誘発を刺激する方法であって、当該方法は当該グ リア細胞を、図３１に示すアミノ酸配列（配列認識番号１３６，１３８，１４０ ）を備えたＦＢＡ’ポリペプチドセグメントを有するポリペプチドと接触させる 工程を有する。 ４８． グリア細胞の細胞分裂誘発を刺激する方法であって、当該方法は前記グ リア細胞を、図３１に示すアミノ酸配列（配列認識番号１３６−１３９，１６３ ）を備えたＦＥＢＡポリペプチドセグメントを有するポリペプチドと接触させる 工程を有する。 ４９． グリア細胞の細胞分裂誘発を刺激する方法であって、当該方法は当該グ リア細胞を、図３１に示すアミノ酸配列（配列認識番号１３６−１３８，１４０ ，１６３）を備えたＦＥＢＡ’ポリペプチドセグメントを有するポリペプチドと 接触させる工程を有する。 ５０． グリア細胞の細胞分裂誘発を刺激する方法であって、当該方法は当該グ リア細胞を精製ＧＧＦ２ＨＢＳ５ポリペプチドと接触させる工程を有する。 ５１． グリア細胞の細胞分裂誘発を刺激する方法であって、当該方法は当該グ リア細胞を、特異的にグリア細胞のｐ１８５^erbB2レセプタを結合する化合物と 接触させる工程を有する。 ５２． グリア細胞の細胞分裂誘発を刺激する方法であって、当該方法は当該グ リア細胞を、図３８，配列認識番号１５４のアミノ酸配列を有するＥＧＦＬ１か らなるポリペプチドと接触させる工程を有する。 ５３． グリア細胞の細胞分裂誘発を刺激する方法であって、当該方法は当該グ リア細胞を、図３９，配列認識番号１５５のアミノ酸配列を有するＥＧＦＬ２か らなるポリペプチドと接触させる工程を有する。 ５４． グリア細胞の細胞分裂誘発を刺激する方法であって、当該方法は当該グ リア細胞を、図４０，配列認識番号１５６のアミノ酸配列を有するＥＧＦＬ３か ら なるポリペプチドと接触させる工程を有する。 ５５． グリア細胞の細胞分裂誘発を刺激する方法であって、当該方法は当該グ リア細胞を、図４１，配列認識番号１５７のアミノ酸配列を有するＥＧＦＬ４か らなるポリペプチドと接触させる工程を有する。 ５６． グリア細胞の細胞分裂誘発を刺激する方法であって、当該方法は当該グ リア細胞を、図４２，配列認識番号１５８のアミノ酸配列を有するＥＧＦＬ５か らなるポリペプチドと接触させる工程を有する。 ５７． グリア細胞の細胞分裂誘発を刺激する方法であって、当該方法は当該グ リア細胞を、図４３，配列認識番号１５９のアミノ酸配列を有するＥＧＦＬ６か らなるポリペプチドと接触させる工程を有する。 ５８． ほ乳類の神経系の生態病理学的症状の予防又は治療方法であって、当該 症状は、クレーム１，１８，１９，２０，２１又は２２のポリペプチドに対する 敏感性又は反応性を有するタイプの細胞に関連し、当該方法は、有効量の当該ポ リペプチドを当該ほ乳類に投 与する工程を有する。 ５９． クレーム５８に記載の方法であって、当該症状は末梢神経の損傷に関連 する。 ６０． クレーム５８に記載の方法であって、当該症状は中枢神経系のグリアに 関連する。 ６１． グリア細胞の細胞分裂誘発活性を刺激する方法であって、当該方法は、 ラットＩ−ＥＪ形質転換線維芽細胞系から分離された３５ｋＤのポリペプチド因 子を、当該グリア細胞に適用する工程を有する。 ６２． グリア細胞の細胞分裂誘発活性を刺激する方法であって、当該方法は、 ＳＫＢＲ−３ヒト胸細胞系から分離された７５ｋＤのポリペプチド因子を、当該 グリア細胞に適用する工程を有する。 ６３． グリア細胞の細胞分裂誘発活性を刺激する方法であって、当該方法は、 ラットＩ−ＥＪ形質転換線維芽細胞系から分離された４４ｋＤのポリペプチド因 子を、当該グリア細胞に適用する工程を有する。 ６４． グリア細胞の細胞分裂誘発活性を刺激する方法であって、当該方法は、 ＭＤＡ−ＭＢ２３１ヒト胸細胞系から分離された４５ｋＤのポリペプチド因子を 、当該グリア細胞に適用する工程を有する。 ６５． グリア細胞の細胞分裂誘発活性を刺激する方法であって、当該方法は、 ＡＴＬ−２ヒトＴ−細胞系から分離された７ないし１４ｋＤのポリペプチド因子 を、当該グリア細胞に適用する工程を有する。 ６６． グリア細胞の細胞分裂誘発活性を刺激する方法であって、当該方法は、 活性化マウス腹膜マクロファージから分離された２５ｋＤのポリペプチド因子を 、当該グリア細胞に適用する工程を有する。 ６７． グリア細胞の細胞分裂誘発活性を刺激する方法であって、当該方法は、 ウシ腎臓から分離された２５ｋＤのポリペプチド因子を、当該グリア細胞に適用 する工程を有する。 ６８． グリア細胞の細胞分裂誘発活性を刺激する方法であって、当該方法は、 ＡＲＩＡポリペプチドを、当 該グリア細胞に適用する工程を有する。 ６９． グリア細胞細胞分裂誘発活性を有するポリペプチドであって、当該ポリ ペプチドはクレーム１のＤＮＡ配列によってコード化されたものであり、当該ポ リペプチドは、当該ＤＮＡ配列の発現を許す条件下において変成ホスト細胞を培 養する工程を有する方法によって得られたものである。 ７０． グリア細胞細胞分裂誘発活性を有するポリペプチドであって、当該ポリ ペプチドはクレーム１８，１９，２０，２１又は２２のＤＮＡ配列によってコー ド化されたものであり、当該ポリペプチドは、当該ＤＮＡ配列の発現を許す条件 下において変成ホスト細胞を培養する工程を有する方法によって得られたもので ある。 ７１． サンプル中でクレーム２３，４０，４１，４２，４３，４４又は６９の ポリペプチドのためのレセプタの存在を決定する方法であって、当該サンプルを 当該ポリペプチドに接触させ、これらの間の結合を決定する工程を有し、当該結 合は当該レセプタの存在を示す ものである。 ７２． 患者のグリア細胞腫瘍を予防又は治療する方法であって、クレーム２３ ，４０，４１，４２，４３，４４又は６９のポリペプチドの、そのレセプタへの 結合を阻止する物質の有効量を当該患者に投与することを含む当該方法。 ７３． 許容可能な希釈物、キャリア又は補形剤とともに、そして／又は単位投 与形態で、それぞれ薬用又は獣医療用に調合されたクレーム２３，４０，４１， ４２，４３，４４又は６９のポリペプチドを有する薬剤用又は獣医療用調剤。 ７４． グリア細胞の細胞分裂誘発を刺激する方法であって、当該グリア細胞を 、クレーム２３，４０，４１，４２，４３，４４又は６９のポリペプチドに接触 させる工程を有する方法。 ７５． 脊椎類のグリア細胞の細胞分裂誘発を刺激する方法であって、当該グリ ア細胞を、有効量のクレーム２３，４０，４１，４２，４３，４４又は６９のポ リペプチドに接触させる工程を有する当該方法。 ７６． クレーム２３，４０，４１，４２，４３，４４又は６９のポリペプチド に対する敏感性又は反応性を有するタイプの細胞に関連する、ほ乳類の神経系の 病態生理学的症状の予防又は治療方法であって、有効量の当該ポリペプチドを当 該ほ乳類に投与する工程を含む当該方法。 ７７． ほ乳類の末梢神経損傷に関連する症状を治療する方法であって、当該末 梢神経を、有効量のクレーム２３，４０，４１，４２，４３，４４又は６９のポ リペプチドに接触させる工程を有する当該方法。 ７８． ほ乳類の、例えば、知覚または運動神経組織等の脱髄又は損傷又はシュ ワン細胞の損失に関連する症状を予防又は治療する方法であって、当該シュワン 細胞を、有効量のクレーム２３，４０，４１，４２，４３，４４又は６９のポリ ペプチドに接触させる工程を有する当該方法。 ７９． ほ乳類の神経退化障害の予防又は治療方法であ って、ほ乳類のグリア細胞を、有効量のクレーム２３，４０，４１，４２，４３ ，４４又は６９のポリペプチドに接触させる工程を有する当該方法。 ８０． ほ乳類の神経再生及び／又は修復を誘発する方法であって、ほ乳類のグ リア細胞を、有効量のクレーム２３，４０，４１，４２，４３，４４又は６９の ポリペプチドに接触させる工程を有する当該方法。 ８１． 線維芽細胞増殖を誘発する方法であって、当該線維芽細胞を、クレーム ２３，４０，４１，４２，４３，４４又は６９のポリペプチドに接触させる工程 を有する当該方法。 ８２． ほ乳類の傷を修復する方法であって、当該傷を、クレーム２３，４０， ４１，４２，４３，４４又は６９のポリペプチドに接触させる工程を有する当該 方法。 ８３． 薬品を製造する方法であって、クレーム２３，４０，４１，４２，４３ ，４４又は６９のポリペプチドを、薬剤的に許容可能なキャリアと混合する工程 を有する当該方法。 ８４． 抗体を生成する方法であって、ほ乳類を、クレーム２３，４０，４１， ４２，４３，４４又は６９のポリペプチドで免疫化する工程を有する当該方法。 ８５． クレーム２３，４０，４１，４２，４３，４４又は６９のポリペプチド に結合可能なレセプタを検出する方法であって、当該ペプチドを親和性リガンド として使用し、当記サンプル上において親和（アフィニティー）分離を行う工程 を有する当該方法。 ８６． 患者のグリア腫瘍を予防又は治療する方法であって、当該患者に、クレ ーム２３，４０，４１，４２，４３，４４又は６９のポリペプチドのそのレセプ タへの結合を阻止する物質の有効量を投与する工程を有する当該方法。 ８７． グリア細胞細胞分裂誘発物質または、当該グリア細胞細胞分裂誘発物質 をコード化する遺伝子を調査、分離又は調合する方法であって、組織調製物又は サンプルを、クレーム８４に記載の抗体と接触させる工程を有する当該方法。 ８８． グリア細胞細胞分裂誘発活性を有する分子をコード化する核酸配列を分 離する方法であって、サンプルを含む細胞を、グリア細胞細胞分裂誘発物質特異 抗体と接触させて、当該サンプル中における当該細胞分裂誘発物質の発現を測定 し、当該核酸配列を、当該発現を示す細胞から分離する工程を有する当該方法。 ８９． 図４５に示されるアミノ酸配列（配列認識番号１６７）を有する精製Ｇ ＧＦ２ポリペプチド。 ９０． その配列が図４５に示されるアミノ酸配列（配列認識番号１６７）であ るＧＧＦ２ポリペプチドをコード化する精製ＧＧＦ２ ＤＮＡ。 ９１． シュワン細胞によつて天然細胞のミエリン形成（髄鞘形成）を誘発する 方法であって、当該シュワン細胞を、クレーム２３，４０，４１，４２，４３， ４４又は６９のポリペプチドに接触させる工程を有する当該方法。 ９２． 細胞中においてアセチルコリンレセプタ合成を誘発する方法であって、 当該細胞を、クレーム２３， ４０，４１，４２，４３，４４又は６９のポリペプチドに接触させる工程を有す る当該方法。 ９３． クレーム２３に定義されるポリペプチドに対する抗体。 ９４． クレーム４０に定義されるポリペプチドに対する抗体。 ９５． クレーム４１に定義されるポリペプチドに対する抗体。 ９６． クレーム４２に定義されるポリペプチドに対する抗体。 ９７． クレーム４３に定義されるポリペプチドに対する抗体。 ９８． クレーム４４に定義されるポリペプチドに対する抗体。 ９９． クレーム６９に定義されるポリペプチドに対す る抗体。 １００．グリア細胞細胞分裂誘発活性を備えたタンパク質を精製する方法であっ て、細胞抽出物を、クレーム９３，９４，９５，９６，９７，９８又は９９の抗 体と接触させる工程を有する当該方法。 １０１．グリア細胞細胞分裂誘発活性を備えたタンパク質を精製する方法であっ て、当該方法が、細胞抽出物を、胎児ウシプラズマの存在下においてシュワン細 胞の分裂を刺激する細胞分裂誘発活性を備えたベーシックポリペプチド因子に対 する抗体と接触させる工程を有し、当該ポリペプチドが約３０ｋＤないし約３６ ｋＤの分子量を有し、かつ、該ポリペプチドが、そのアミノ酸配列内に、以下の ポリペプチド配列のうちの少なくとも一つを有する、 ＦＫＧＤＡＨＴＥ ＡＳＬＡＤＥＹＥＹＭＸＫ ＴＥＴＳＳＳＧＬＸＬＫ ＡＳＬＡＤＥＹＥＹＭＲＫ ＡＧＹＦＡＥＸＡＲ ＴＴＥＭＡＳＥＱＧＡ ＡＫＥＡＬＡＡＬＫ ＦＶＬＱＡＫＫ ＥＴＱＰＤＰＧＱＩＬＫＫＶＰＭＶＩＧＡＹＴ ＥＹＫＣＬＫＦＫＷＦＫＫＡＴＶＭ ＥＸＫＦＹＶＰ ＫＬＥＦＬＸＡＫ １０２．グリア細胞細胞分裂誘発活性を有するタンパク質を精製する方法であっ て、当該方法が、細胞抽出物を、胎児ウシプラズマの存在下においてシュワン細 胞の分裂を刺激する細胞分裂誘発活性を備えたベーシックポリペプチド因子に対 する抗体と接触させる工程を有し、当該ポリペプチドが約５５ｋＤないし約６３ ｋＤの分子量を有し、かつ、該ポリペプチドが、そのアミノ酸配列内に、以下の ポリペプチド配列のうちの少なくとも一つを有する、 ＶＨＱＶＷＡＡＫ ＹＩＦＦＭＥＰＥＡＸＳＳＧ ＬＧＡＷＧＰＰＡＦＰＶＸＹ ＷＦＶＶＩＥＧＫ ＡＳＰＶＳＶＧＳＶＱＥＬＶＱＲ ＶＣＬＬＴＶＡＡＬＰＰＴ ＫＶＨＱＶＷＡＡＫ ＫＡＳＬＡＤＳＧＥＹＭＸＫ ＤＬＬＬＸＶ ＥＧＫＶＨＰＱＲＲＧＡＬＤＲＫ ＰＳＣＧＲＬＫＥＤＳＲＹＩＦＦＭＥ ＥＬＮＲＫＮＫＰＱＮＩＫＩＱＫＫ １０３．グリア細胞細胞分裂誘発活性を有するタンパク質を精製する方法であっ て、当該方法が、細胞抽出物を、グリア細胞細胞分裂誘発活性を有し、かつ以下 のものによってコード化されるアミノ酸配列を備えたポリペプチド因子に対する 抗体と接触させる工程を有する、 （ａ）図２８ａ，２８ｂ，２８ｃ（それぞれ、配列認識番号１３３−１３５ ）に示すＤＮＡ配列、 （ｂ）図２２（配列認識番号８９）に示すＤＮＡ配列、 （ｃ）図２８ａに示す配列のヌクレオチド２８１−５５７によって表される ＤＮＡ配列、 （ｄ）（ａ），（ｂ）又は（ｃ）のＤＮＡ配列にハイブリッド化するＤＮＡ 配列。 １０４．グリア細胞細胞分裂誘発活性を備えたタンパク質を精製する方法であっ て、還元条件または非還元条件において、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気 泳動で約３０ｋＤないし約３６ｋＤの分子量を有し、かつ、胎児ウシプラズマの 存在下においてラットシュワン細胞の分裂を刺激する細胞分裂誘発活性を備え、 かつ、逆相ＨＰＬＣを使用して分離した場合に、４℃で の０．１％トリフルオロ酢酸中での１０週間の培養後において当該活性の少なく とも５０％を保持するベーシックポリペプチド因子に対する抗体に、細胞抽出物 を接触させる工程を有する当該方法。 １０５．グリア細胞細胞分裂誘発活性を備えたタンパク質を精製する方法であっ て、還元条件または非還元条件において、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気 泳動で約５５ｋＤないし約６３ｋＤの分子量を有し、かつ、胎児ウシプラズマの 存在下においてラットシュワン細胞の分裂を刺激する細胞分裂誘発活性を備え、 かつ、逆相ＨＰＬＣを使用して分離した場合に、４℃での０．１％トリフルオロ 酢酸中での４日間の培養後において前記活性の少なくとも５０％を保持するベー シックポリペプチド因子に対する抗体に、細胞抽出物を接触させる工程を有する 当該方法。 １０６．グリア細胞増殖の疾病を有するほ乳類を治療する方法であって、当該ほ 乳類に、クレーム９３，９４，９５，９６，９７，９８又は９９の抗体を投与す る工程を有する当該方法。 １０７．グリア細胞増殖の疾病を有するほ乳類を治療する方法であって、当該方 法が、当該ほ乳類に、胎児ウシプラズマの存在下においてシュワン細胞の分裂を 刺激する細胞分裂誘発活性を備えたベーシックポリペプチド因子に対する抗体と 接触させる工程を有し、当該ポリペプチドが約３０ｋＤないし約３６ｋＤの分子 量を有し、かつ、該ポリペプチドが、そのアミノ酸配列内に、以下のポリペプチ ド配列のうちの少なくとも一つを有する。 ＦＫＧＤＡＨＴＥ ＡＳＬＡＤＥＹＥＹＭＸＫ ＴＥＴＳＳＳＧＬＸＬＫ ＡＳＬＡＤＥＹＥＹＭＲＫ ＡＧＹＦＡＥＸＡＲ ＴＴＥＭＡＳＥＱＧＡ ＡＫＥＡＬＡＡＬＫ ＦＶＬＱＡＫＫ ＥＴＱＰＤＰＧＱＩＬＫＫＶＰＭＶＩＧＡＹＴ ＥＹＫＣＬＫＦＫＷＦＫＫＡＴＶＭ ＥＸＫＦＹＶＰ ＫＬＥＦＬＸＡＫ １０８．グリア細胞増殖の疾病を有するほ乳類を治療する方法であって、当該方 法が、当該ほ乳類に、胎児ウシプラズマの存在下においてシュワン細胞の分裂を 刺激する細胞分裂誘発活性を備えたベーシックポリペプチド因子に対する抗体と 接触させる工程を有し、当該ポリペプチドが約５５ｋＤないし約６３ｋＤの分子 量を有し、かつ、該ポリペプチドが、そのアミノ酸配列内に、以下のポリペプチ ド配列のうちの少なくとも一つを有する。 ＶＨＱＶＷＡＡＫ ＹＩＦＦＭＥＰＥＡＸＳＳＧ ＬＧＡＷＧＰＰＡＦＰＶＸＹ ＷＦＶＶＩＥＧＫ ＡＳＰＶＳＶＧＳＶＱＥＬＶＱＲ ＶＣＬＬＴＶＡＡＬＰＰＴ ＫＶＨＱＶＷＡＡＫ ＫＡＳＬＡＤＳＧＥＹＭＸＫ ＤＬＬＬＸＶ ＥＧＫＶＨＰＱＲＲＧＡＬＤＲＫ ＰＳＣＧＲＬＫＥＤＳＲＹＩＦＦＭＥ ＥＬＮＲＫＮＫＰＱＮＩＫＩＱＫＫ １０９．グリア細胞増殖の疾病を有するほ乳類を治療する方法であって、当該方 法が、当該ほ乳類に、グリア細胞細胞分裂誘発活性を有し、かつ以下のものによ ってコード化されるアミノ酸配列を備えたポリペプチド因子と接触させる工程を 有する、 （ａ）図２８ａ，２８ｂ，２８ｃ（それぞれ、配列認識番号１３３−１３５ ）に示すＤＮＡ配列、 （ｂ）図２２（配列認識番号８９）に示すＤＮＡ配列、 （ｃ）図２８ａに示す配列のヌクレオチド２８１−５５７によって表される ＤＮＡ配列、 （ｄ）（ａ），（ｂ）又は（ｃ）のＤＮＡ配列にハイブリッド化するＤＮＡ 配列。 １１０．グリア細胞増殖の疾病を有するほ乳類を治療する方法であって、当該方 法が、前記ほ乳類に、還元条件または非還元条件において、ＳＤＳ−ポリアクリ ルアミドゲル電気泳動で、約３０ｋＤないし約３６ｋＤの分子量を有するベーシ ックポリペプチド因子に対する抗体を投与することよりなり、当該ポリペプチド 因子が、胎児ウシプラズマの存在下においてラットシュワン細胞の分裂を刺激す る細胞分裂誘発活性を備え、 かつ、逆相ＨＰＬＣを使用して分離した場合に、４℃での０．１％トリフルオロ 酢酸中での１０週間の培養後において当該活性の少なくとも５０％を保持するも のである。 １１１．グリア細胞増殖の疾病を有するほ乳類を治療する方法であって、当該方 法が、当該ほ乳類に、還元条件または非還元条件において、ＳＤＳ−ポリアクリ ルアミドゲル電気泳動で、約５５ｋＤないし約６３ｋＤの分子量を有するベーシ ックポリペプチド因子に対する抗体を投与することよりなり、当該ポリペプチド 因子が、胎児ウシプラズマの存在下においてラットシュワン細胞の分裂を刺激す る細胞分裂誘発活性を備え、かつ、逆相ＨＰＬＣを使用して分離した場合に、４ ℃での０．１％トリフルオロ酢酸中での４日間の培養後において当該活性の少な くとも５０％を保持するものである。 １１２．クレーム１，１８，１９，２０，２１又は２２のＤＮＡ配列を有するベ クター。 １１３．グリア細胞細胞分裂誘発物質としてのクレーム ２３，４０，４１，４２，４３，４４又は６９のポリペプチド。