ES2236746T3

ES2236746T3 - Composicion artificial estabilizada de fases de fosfato de calcio particularmente adaptada como soporte de la actividad de celulas oseas.

Info

Publication number: ES2236746T3
Application number: ES96928293T
Authority: ES
Inventors: Sydney M. Pugh; Timothy J. N. Smith; Michael Sayer; Sarah Dorthea Langstaff
Original assignee: Millenium Biologix Inc
Current assignee: Millenium Biologix Inc
Priority date: 1995-09-01
Filing date: 1996-08-30
Publication date: 2005-07-16
Anticipated expiration: 2016-08-30
Also published as: JP2010000367A; JPH11512069A; KR19990044355A; WO1997009286A1; JP4465046B2; USRE41251E1; CN1195336A; CA2230057A1; DE69634384D1; US6585992B2; BR9610357B1; BR9610357A; DE69634384T2; JP5172795B2; EP0847376B1; AU6783296A; EP0847376A1; US6323146B1; CN1183058C; KR100446642B1

Abstract

LA INVENCION TRATA DE UNA COMPOSICION SINTERIZADA ARTIFICIAL BIOACTIVA PARA SUMINISTRAR UNA MORFOLOGIA CAPAZ DE MANTENER DE FORMA CONSISTENTE LA ACTIVIDAD DE CELULAS OSEAS SOBRE ELLA. LA COMPOSICION INCLUYE FASES DE FOSFATO DE CALCIO ESTABILIZADAS DESARROLLADAS MEDIANTE LA CONVERSION DE UNA SUSTANCIA DE HIDROXIAPATITO EN PRESENCIA DE ENTIDADES ESTABILIZANTES A TEMPERATURAS DE SINTERIZACION, EN FOSFATO DE TRICALCIO ESTABILIZADO E INSOLUBLE. LA PRESENTE INVENCION POSEE NUMEROSAS APLICACIONES EN DIAGNOSTICOS MEDICOS PARA LA EVALUACION DE UNA ACTIVIDAD ANORMAL DE LAS CELULAS OSEAS, ASI COMO PARA TERAPEUTICA MEDICA, INCLUYENDO REPOSICION Y REPARACION DE TEJIDO DENTAL Y OSEO, ASI COMO PARA LA INGENIERIA DE TEJIDOS DE INJERTO OSEOS EX VIVO.

Description

Composición artificial estabilizada de fases de fosfato de calcio particularmente adaptada como soporte de la actividad de las células óseas.

Esta invención se refiere a composiciones sinterizadas estabilizadas artificiales bioactivas de fases de fosfato de calcio que son capaces de soportar actividad celular ósea en ellas. Esta invención tiene aplicaciones en diagnósticos médicos para la determinación de actividad celular ósea normal y anormal así como para usos terapéuticos médicos que incluyen reemplazo y reparación de tejido óseo y dental así como para ingeniería de tejidos injertados óseos ex vivo.

El hueso es un sistema mineralizante complejo compuesto de una fase inorgánica o mineral, una fase de matriz orgánica, y agua. La fase mineral inorgánica se compone de sales de fosfato de calcio cristalinos mientras que la fase de matriz orgánica consta principalmente de colágeno y otras proteínas no colágenas. La calcificación del hueso depende de la estrecha asociación entre las fases orgánica e inorgánica para producir un tejido mineralizado.

El proceso de crecimiento óseo está regulado para reunir tanto los requerimientos estructurales como funcionales. Las células implicadas en los procesos de formación, mantenimiento, y resorción ósea son los osteoblastos, osteocitos, y osteoclastos. Los osteoblastos sintetizan la matriz orgánica, osteoide, del hueso que después del desarrollo de cristal de fosfato de calcio y ensamblaje de colágeno se llega a mineralizar. Los osteocitos regulan el flujo de calcio y fosfato entre el mineral del hueso y el fluido extracelular. Los osteoclastos funcionan para resorber el hueso y son esenciales en el proceso de remodelación del hueso. La distorsión del equilibrio natural de la formación y resorción ósea conduce a diversos trastornos óseos. El aumento de actividad de osteoclastos se ha demostrado que conduce a enfermedad ósea caracterizada por un descenso en la densidad ósea tal como la observada en osteoporosis, osteitis fibrosa y enfermedad de Paget. Todas estas enfermedades son un resultado de un incremento en la resorción ósea.

Con el fin de entender los mecanismos implicados que regulan el funcionamiento celular óseo, es importante ser capaz de determinar la función normal de las células óseas y también el grado de perturbación de esta actividad en diversas enfermedades óseas. Esto conducirá a la identificación de fármacos dirigidos para reestablecer la actividad celular ósea regresando dentro de niveles normales. Junto con la identificación de la etiología de actividad celular ósea anormal y normal y la determinación de esta actividad, es el deseo y necesidad de desarrollar composiciones y procedimientos para el tratamiento de la actividad celular ósea anormal, como resultado de enfermedad, eliminación quirúrgica de los traumas fisiológicos todos los cuales conducen a la pérdida de tejido óseo. Se desean en gran medida los compuestos terapéuticos que proporcionan el reemplazo y reparación de tejido óseo, tal como con el uso de implantes óseos.

Diversos grupos de investigación han desarrollado procedimientos para observar directamente la actividad de osteoclastos aislados in vitro. Los osteoclastos, aislados a partir de poblaciones de células de médula ósea, se han cultivado sobre cortes finos de materiales naturales tal como dentina de cachalote (Boyde y col., Brit. Dent. J. 156, 216, 1984) o hueso (Chambers y col., J. Cell Sci. 66, 383, 1984). El último grupo ha sido capaz de mostrar que esta actividad resortiva no la poseen otras células de la serie de fagocitos mononucleares (Chambers y Horton, Calcif Tissue Int. 36, 556, 1984). Intentos más recientes para usar otras técnicas de cultivo celular para estudiar el linaje de osteoclastos han tenido todavía que depender del uso de los cortes óseos corticales (Amano y col., y Kerby y col., Bone & Min. Res. 7 (3)) para los que la cuantificación de la actividad resortiva depende bien de dos análisis dimensionales de las áreas de los hoyos de resorción de profundidad variable o mapeo estéreo del volumen de resorción. Tales técnicas proporcionan como mucho una exactitud de aproximadamente 50% cuando se determina la resorción de sustratos relativamente gruesos. Además estas técnicas analíticas son de larga duración y requieren equipo altamente especializado y entrenamiento. Además, la preparación y posterior examen de cortes de hueso o dentina no es un procedimiento fácil ni práctico para la determinación de actividad de osteoclastos.

También se ha encontrado con poco éxito el uso de preparaciones artificiales de fosfato de calcio como sustratos para cultivos de osteoclastos. Jones y col., (Anat. Embryol 170, 247, 1984) describieron que los osteoblastos reabsorben apatitas sintéticas in vitro pero fallan para proporcionar evidencia experimental que soporten esta observación. Shimizu y col., (Bone and Mineral 6, 261, 1989) han descrito que los osteocalstos aislados resorben solamente superficies óseas desvitalizadas y no hidrroxiapatita de calcio sintética. Estos resultados indicarían que los osteoclastos funcionales son difíciles de cultivar in vitro.

Varios grupos también han intentado proporcionar composiciones adecuadas para el reemplazo terapéutico de tejido óseo. La patente de Estados Unidos Nº 4.871.578 describe un procedimiento para la formación de un revestimiento liso no poroso de hidroxiapatita adecuado para uso en implante. La patente de Estados Unidos Nº 4.983.182 describe un implante cerámico que comprende un cuerpo sinterizado de zircona y un revestimiento de \alpha-TPC y zircona, o hidroxiapatita y zircona. La patente de Estados Unidos Nº 4.988.362 describe una composición para la fusión de un compuesto biocerámico a otro. La patente de Estados Unidos Nº 4.990.163 describe un revestimiento usado para la producción de materiales biocerámicos que constan de \alpha-TPC y \beta-TCP. Aunque estas diferentes composiciones se pueden usar como revestimientos biocompatibles para implantes y similares, ninguna de estas composiciones han demostrado que son adecuadas para el cultivo de tanto osteoclastos como osteoblastos activos de una manera segura y reproducible de forma que permita la determinación cuantitativa de la actividad específica de resorción de osteoclastos y secreción de osteoblastos de la matriz ósea. Además, ninguna de las composiciones anteriores desarrolladas, se pueden manipular para producir de manera segura una gama de películas, revestimientos gruesos y piezas de cerámica a granel que comparten una composición y morfología común que conduce a un comportamiento bioactivo similar in vivo e in vitro.

La solicitud de patente PCT internacional publicada WO 94/26872 de los solicitantes describe un procedimiento de sinterización para formar películas delgadas de fases de fosfato de calcio sobre las que se produce la función celular ósea. Esta es la primera capa delgada de material sintético sobre la que los osteoclastos pueden mostrar una actividad extendida y sobre la que los osteoblastos pueden secretar matriz ósea. Como se describe en esa solicitud, se deben considerar una diversidad de factores que proporcionan una película delgada con una relación deseada de hidroxiapatita a fosfato tricálcico. Tales parámetros incluyen:

1): cantidades de reactivos para preparar la sustancia de hidroxiapatita sol-gel;

2): velocidad de combinación de reactivos;

3): duración y velocidad de mezcla cuando se prepara la sol-gel;

4): velocidades y procedimientos de precipitación y separación;

5): condiciones ambientales del procedimiento durante la fabricación de la sol-gel;

6): velocidad de eliminación del sustrato de la sol-gel en el revestimiento por inmersión de una película sobre el mismo;

7): temperatura de sinterización;

8): sinterizar en una atmósfera controlada tal como gas inerte, un vacío o atmósfera con vapor de agua presente;

9): la naturaleza del sustrato, siendo el cuarzo una realización preferida para crear un sustrato transparente revestido con fases de fosfato de calcio estabilizadas.

En esta solicitud de patente PCT anterior se sugirió, que con el fin de obtener un amplio intervalo en las relaciones de hidroxiapatitas de fosfato tricálcico sobre sustratos de cuarzo, muchos de estos parámetros se necesitan considerar para lograr las relaciones de 10:90 hasta 90:10. Las temperaturas de sinterización sugeridas en una atmósfera de aire estaban entre aproximadamente 800ºC y aproximadamente 1100ºC. Se estableció que a 800ºC la película era predominantemente hidroxiapatita. Una temperatura de sinterización de aproximadamente 900ºC proporcionó relaciones de aproximadamente 70:30. A 1000ºC, la relación era aproximadamente 10:90 y a 1100ºC la película era predominantemente fosfato tricálcico. Se sugirió que la sinterización en un vacío a 1000ºC produjo una relación de aproximadamente 66:34. Ahora se ha encontrado que las relaciones preferidas están entre 50:50 y 20:80. La relación óptima es aproximadamente 333:666. Para lograr estas relaciones, se deben considerar varios de los factores anteriores. Sin embargo, es deseable minimizar la variabilidad en varios de los factores anteriores y lograr las relaciones deseadas para composiciones de películas óptimas de una manera reproducible exacta. Sorprendentemente, esta película es estable en presencia de diversos medios acuosos, incluso aunque se supone que el fosfato \alpha-tricálcico es soluble en agua.

Los solicitantes han descubierto que la presencia de entidades estabilizantes puede estabilizar la composición y prevenir su degradación en fluidos fisiológicos. Por lo tanto, la desaparición de entidades de fosfato de calcio a partir de una película, la pieza de revestimiento o de cerámica a granel de esta composición, se debe sustancialmente a la actividad de los osteoclastos y no se debe a un proceso de disolución. La composición bioactiva artificial estabilizada es la primera de tal composición que soporta tanto la actividad de los osteoclastos como de los osteoblastos y que permite la determinación fiable de las actividades fisiológicas de ambos tipos de células así como para el desarrollo de estrategias tanto diagnósticas como terapéuticas. Las entidades estabilizantes del fosfato \alpha-tricálcico dentro de las fases de fosfato de calcio formadas durante la sinterización para proporcionar una forma estable de fosfato \alpha-tricálcico que no se degrada en los fluidos fisiológicos y que forma fases de fosfato de calcio que tienen una morfología celular compatible que soporta y estimula la actividad celular ósea en las mismas.

La presente invención proporciona una composición estabilizada que proporciona una amplia diversidad de aplicaciones diagnósticas y terapéuticas. La composición estabilizada, de acuerdo a un aspecto de la presente invención, se puede usar para proporcionar una gama de películas delgadas, revestimientos, polvos y piezas de cerámica a granel que comparten una microporosidad globular superficial común y una microporosidad interna. Además, las cerámicas a granel también pueden tener una microporosidad dentro de la estructura con el fin de proporcionar un tejido óseo tridimensional artificial similar al encontrado in vivo. La composición, hecha de cualquier forma, estimula la actividad de las células óseas cultivadas en ella y también permite el desarrollo de los tejidos óseos artificiales modificados para usar como injertos óseos.

De acuerdo con un aspecto de la invención, se proporciona una composición sinterizada artificial bioactiva para soportar de manera consistente la actividad celular ósea, dicha composición comprendiendo: entidades estabilizadas de fosfato tricálcico estabilizado seleccionadas entre el grupo constituido por entidades de silicio, entidades de aluminio, entidades de circonio, entidades de bario, entidades de titanio, entidades de germanio, entidades de cromo, entidades de vanadio, entidades de niobio, entidades de boro, y las mezclas de las mismas, en las que dicho fosfato tricálcico estabilizado es insoluble en fluidos fisiológicos de pH de aproximadamente 6,4 a 7,3 dicha composición siendo obtenible mediante la conversión, mediante sinterización, de una sustancia sol-gel de hidroxiapatita dopada con dichas entidades estabilizantes.

En una realización, dicha composición es obtenible mediante la conversión de una sustancia de sol-gel de hidroxiapatita uniformemente dopada con una solución metaloorgánica de dichas soluciones estabilizantes mediante sinterización.

De acuerdo a otro aspecto de la invención, se proporciona un procedimiento para preparar una composición sinterizada artificial estabilizada de fases de fosfato de calcio que tienen una morfología adecuada para soportar la actividad celular ósea en ella, dicho procedimiento comprendiendo las etapas de: dopar una sustancia de hidroxiapatita con entidades estabilizantes seleccionadas entre el grupo constituido por entidades de silicio, entidades de aluminio, entidades de circonio, entidades de bario, entidades de titanio, entidades de germanio, entidades de cromo, entidades de vanadio, entidades de niobio, entidades de boro, y las mezclas de las mismas;

sinterizar dicha sustancia de hidroxiapatita dopada, en la que la sinterización convierte dicha sustancia de hidroxiapatita dopada en fosfato alfa tricálcico principalmente dentro de las fases de fosfato, en las que el fosfato alfa tricálcico es insoluble en fluidos fisiológicos de pH de aproximadamente 6,4 a 7,3, es resorbible por los osteoclastos y promueve la secreción de matriz de colágeno mineralizante por los osteoblastos, el procedimiento estando caracterizado porque dicha sustancia de hidroxiapatita está en la forma de una sol-gel, y porque dichas sol-gel de hidroxiapatita esta uniformemente dopada con dichas entidades estabilizantes.

También se describe en esta memoria descriptiva una estructura policristalina microporosa artificial sinterizada bioactiva para soportar consistentemente la actividad celular ósea en ella, la estructura comprendiendo fases de fosfato de calcio estabilizado uniforme y sustancialmente sinterizadas que tienen una morfología superficial globular de gránulos redondos interconectados débilmente con microporos interconectados en la estructura en la que dichas fases de fosfato de calcio estabilizado uniforme y sustancialmente se desarrollan mediante la conversión de una sustancia de hidroxiapatita, dopada uniforme y sustancialmente con entidades estabilizantes, a temperaturas de sinterización en fosfato tricálcico, en el que dicho fosfato alfa tricálcico uniforme y sustancialmente estabilizado es insoluble en fluidos fisiológicos y en el que dichas entidades estabilizantes se añaden a la hidroxiapatita antes de sinterizar.

La figura 1 es un diagrama de área predominante que muestra el efecto de la actividad de CaO sobre las estabilidades de hidroxiapatita y fosfato tricálcico.

La figura 2 es un gráfico que muestra las fases de entidades de fosfato de calcio formadas en presencia de entidades de silicio estabilizantes a partir de la conversión de la sustancia de hidroxiapatita de la presente invención.

La figura 3 es un gráfico que muestra el efecto de CaO/Al_{2}O_{3} sobre la actividad de CaO.

La figura 4 es un gráfico que muestra el efecto de las relaciones CaO/TiO_{2} y CaO/B_{2}O_{3} sobre la actividad de CaO.

La figura 5 comprende los gráficos (a), (b) y (c) que muestra resultados de espectroscopía por rayos X dispersiva por energía (a) en la interfase de la composición con el sustrato; (b) justo por encima de la interfase y (c) en la parte superior de una película producida por difusión de las entidades de sílice del sustrato.

La figura 6 es una sección transversal por microscopía electrónica de barrido de matriz ósea colágena mineralizada depositada sobre una composición de película delgada estabilizada de la presente invención mediante osteoblastos activos.

La figura 7 (a) es una fotografía que muestra la deposición de matriz ósea calcificada fluorescente producida mediante osteoblastos cultivados sobre la composición estabilizada.

La figura 7 (b) es una fotografía que muestra un control en el que no se cultivan osteoblastos sobre la composición de película delgada estabilizada y no se visualiza la matriz ósea calcificada fluorescente.

La figura 8 es una microscopía electrónica de barrido de hoyos de resorción de osteoclastos sobre los materiales cerámicos sólidos tridimensionales a granel de composiciones estabilizadas bioactivas artificiales.

La figura 9 es una microscopía electrónica de barrido de hoyos de resorción de osteoclastos sobre las películas delgadas de composiciones estabilizadas bioactivas artificiales.

La figura 10 es una sección transversal por microscopía electrónica de transición de la composición estabilizada artificial sobre un sustrato de cuarzo que muestra la morfología.

La figura 11 es una micrografía por microscopía electrónica de barrido de la composición estabilizada aplicada en forma de película delgada que muestra la estructura microporosa superficial.

La figura 12 (a) es una sección transversal por microscopía electrónica de barrido de una hidroxiapatita sinterizada comercial en la ausencia de entidades estabilizantes.

La figura 12 (b) es una sección transversal por microscopía electrónica de barrido de una hidroxiapatita sinterizada comercial en presencia de entidades estabilizantes de silicio.

La figura 13 es una microscopía electrónica de barrido de un osteoclasto sobre hueso natural que muestra un hoyo de resorción natural.

La figura 14 es una micrografía por microscopía electrónica de barrido que ilustra la morfología superficial globular de un material cerámico a granel hecho mediante el procedimiento de la presente invención.

La composición de la sustancia de fosfato de calcio es la que se proporciona de acuerdo con lo descrito en la solicitud PCT publicada WO 94/26872de los solicitantes. Este procedimiento proporciona una base consistente, una película delgada de fases de fosfato de calcio que están dentro del intervalo deseado de 50:50 a 20:80 para la relación de hidroxiapatita a fosfato \alpha-tricálcico. Ahora se ha encontrado que la presencia de entidades estabilizantes estabiliza significativamente y de manera no esperada el \alpha-TCP dentro de las fases de fosfato de calcio para proporcionar una composición bioactiva que soporta y estimula la actividad de tanto osteoblastos como osteoclastos y que permite la cuantificación de tal actividad de una manera reproducible, y proporciona el desarrollo de estrategias diagnósticas y terapéuticas para la pérdida de tejido óseo.

Se ha de entender que el término "estabilizado" se refiere a las fases de fosfato de calcio formadas tras la conversión de la hidroxiapatita que mantiene una estructura cristalográfica y química consistente cuando se coloca en condiciones ambientales o en un ambiente fisiológico in vivo o in vitro. También se ha de entender que el término "bioactivo" se refiere a la capacidad de soportar el crecimiento óseo osteoblástico sobre y en todas las estructuras sustancial o exclusivamente hechas de la presente composición y simultáneamente promueven resorción extracelular controlada natural de la composición por osteoclastos, mientras que evita la disolución y/o degradación química y/o celular no específica, en un procedimientos que se parece estrechamente al de recambio óseo normal. Tal bioactividad estando presente durante los usos in vivo o in vitro de los materiales donde las células óseas están presentes. Por la expresión "fases de fosfato de calcio", se propone incluir las diversas especies de fosfato de calcio en el producto sinterizado tal como \alpha-TCP, \beta-TCP, ortofosfato de calcio, fosfato tricálcico y fosfato dicálcico.

Se pensó inicialmente que para soportar la actividad celular ósea in vitro, el producto de fosfato de calcio adecuado iba a ser hidroxiapatita pura o esencialmente pura y se ha de entender que es la entidad de fosfato de calcio de elección en la realización de una película. Ahora se ha determinado que los materiales que son predominantemente de hidroxiapatita no estimulan la función normal de osteocalstos y osteoblastos y, de hecho, en presencia de osteoclastos, muy poca actividad se puede observar. Sin embargo, se encontró que proporcionando una mezcla de fases de fosfato de calcio que incluyen hidroxiapatita y fosfato de \alpha-tricálcico, el grado de resorción se estimula a través de un amplio intervalo donde la película predominantemente de fosfato \alpha-tricálcico proporciona el grado más alto de resorción, mientras que una película predominantemente de hidroxiapatita proporciona un grado insignificante de resorción. En esta realización, con respecto a la presencia de fosfato \alpha-tricálcico que parcialmente sugiere por qué los materiales de fosfato de calcio desarrollados actualmente estimulan las propiedades funcionales en células óseas que se cultivan sobre tales materiales. Este aspecto, proporcionando fases de calcio estabilizado en la forma de una película delgada que permite, por ejemplo, transmitancia de luz o reflexión de luz, permite que se lleven a cabo procedimientos diagnósticos para evaluar diversas propiedades funcionales de células óseas que se están cultivando sobre tales películas.

De manera sorprendente, se ha encontrado que la normalización de la preparación de la sustancia sol-gel de hidroxiapatita y la selección de un intervalo muy específico de temperaturas de sinterización, no solamente logra las relaciones deseadas sino que también revela que la composición óptima se forma mediante conversión de hidroxiapatita como se prepara mediante el procedimiento de sol-gel para el fosfato \alpha-tricálcico. Se ha detectado poco o ninguno fosfato \beta-tricálcico en estas composiciones de película optimizadas preferidas. No existe necesidad de preparar mezclas de preparaciones de hidroxiapatita y fosfato \alpha-tricálcico de las fases individuales. En cambio, la técnica como se describe en la solicitud PCT publicada WO 94/26872 es suficiente para preparar una sustancia de hidroxiapatita sol-gel. La reacción química para preparar tal sustancia de hidroxiapatita en un medio de pH elevado es como sigue:

5 Ca(NO_{3})_{2} + 3 NH_{4}H_{2}PO_{4} + 7 NH_{4}OH

\rightarrow Ca_{5}(PO_{4})_{3}OH + 10 NH_{4}NO_{3} + 6 H_{2}O

Las soluciones de partida constan de soluciones acuosas en los que los reactivos se disuelven completamente y que se pueden mezclar bien. La hidroxiapatita forma partículas finas en suspensión, el tamaño de las cuales se muestra mediante experimentos de dispersión de luz que se producen entre una media de aproximadamente 0,3 \mum a sobre 1 \mum cuando se envejece la sustancia sol-gel durante 24 horas después de la preparación.

La sustancia de hidroxiapatita es estable en medio neutro y/o alcalino. Preferiblemente el medio de reacción se lleva hasta un pH elevado usualmente en el intervalo de aproximadamente 12. Una primera solución de fosfato se añade gota a gota en una segunda solución de calcio para prevenir la formación de trifosfato monoácido tetracálcico por lo tanto obteniendo un producto deseado de la hidroxiapatita. La sustancia sol-gel se puede filtrar, secar en forma de polvo, calcinarse y quemarse en un crisol de alúmina a 1000ºC, para formar fases de hidroxiapatita de calcio que son estables en condiciones normales de humedad atmosférica. La conversión de esta fase a temperaturas de sinterización de sobre 1200ºC es en fosfato \alpha-tricálcico también formándose pequeñas cantidades de alguna otra fase tal como \beta-TCP, octofosfato de calcio, fosfato tetracálcico o fosfato dicálcico. Los expertos en la técnica entienden que otros materiales "contaminantes" también se pueden formar en las fases de fosfato de calcio estabilizado sinterizado. Tales materiales también se pueden añadir a la sustancia de hidroxiapatita antes de sinterización. La presencia o adición de tales contaminantes preferiblemente no afectan a la composición y a la morfología de la composición estabilizada de ninguna manera las cuales afectarán al soporte de la actividad celular ósea en la misma.

Con respecto al procedimiento de sinterización, también se ha encontrado que la sinterización de la película seca de sustancia de hidroxiapatita se puede llevar a cabo en un tipo habitual de horno a temperatura alta sin la necesidad de controlar la atmósfera en el horno. Cuando se usa un horno nuevo o un horno contaminado por el uso previo para otros propósitos, se prefiere ciclar el horno mediante el intervalo de temperatura de sinterización varias veces mientras el horno está vacío. Tal pre-acondicionamiento del horno elimina cualquier compuesto volátil y lo prepara para uso. No se requiere ninguna etapa adicional. El aire ambiental puede estar presente en el horno durante el período de interrupción y durante el uso normal para sinterizar sustratos revestidos donde la presencia de de aire ambiente no impide el proceso y da como resultado la producción de resultados consistentes para la relación deseada. En estas condiciones, la temperatura de sinterización puede variar entre 920ºC y 1100ºC proporcionando las relaciones deseadas de 50:50 hasta 20:80 en presencia de sustrato de cuarzo. Se ha encontrado que a medida que la temperatura aumenta, la conversión de hidroxiapatita en fosfato de \alpha-tricálcico también aumenta. A temperaturas de sinterización en el intervalo de 920ºC hasta 950ºC la relación puede variar entre 50:50 y 333:666. A las temperaturas de sinterización seleccionadas en el intervalo entre 950ºC y 1000ºC la relación es aproximadamente 333:666. El incremento por encima de 1000ºC y hasta 1100ºC además aumenta la conversión y produce las composiciones que tienen relaciones en el intervalo de 333:666 a 20:80. La temperatura de sinterización preferida es aproximadamente 975ºC donde se logra la relación de 333:666.

La conversión de la hidroxiapatita en fosfato tricálcico se produce mediante la reacción:

2 Ca_{5}(OH)(PO_{4}) \rightarrow + 3 Ca_{3}(PO_{4})_{2} + CaO + H_{2}O

el grado de conversión a cualquier temperatura que es sensible a la presión parcial de agua en la atmósfera circundante y a factores que modifican la concentración de CaO.

La naturaleza de fosfato tricálcico que se forma es significativa. Para la hidroxiapatita no estequiométrica con una relación de Ca/P de 1,5-1,60 (Nakamura, Thermochimica Acta, vol. 165, 1990), y para muchos polvos de hidroxiapatita proporcionados comercialmente (Aldrich Chem Co.), fosfato \beta-tricálcico se forma a menudo cuando el polvo se calienta hasta 1100ºC y después se enfría hasta temperaturas por debajo de 1000ºC. \beta-TCP es un compuesto estable, insoluble que aparece en la naturaleza en forma de Whitlockite mineral. En la conversión de la sustancia de hidroxiapatita derivada de sol-gel formada a partir de soluciones acuosas como se describe en esta memoria descriptiva, y en polvos de hidroxiapatita de calcio formados a partir de reacciones de precipitación alternativas, se encuentra que la formación de fosfato \alpha-tricálcico se potencia a temperaturas por debajo de 1000ºC en presencia de entidades estabilizantes. En el desarrollo de revestimientos basados en fosfato de calcio, \alpha-TCP no ha sido un gran sujeto de atención porque su degradación en fluidos fisiológicos se debe a su solubilidad relativamente alta y al hecho de que solamente se produce a partir de conversión a altas temperaturas de hidroxiapatita pura a temperaturas de sobre 1250ºC.

A partir de la ecuación de conversión, se espera que cualquier factor que controla la actividad de CaO en el sistema modifique tanto la temperatura como la reversibilidad de la conversión de hidroxiapatita. La adición de una entidad estabilizante tal como SiO_{2} se cree que reacciona con CaO mediante la reacción:

CaO + SiO_{2} \rightarrow CaSiO_{3}

por lo tanto conduciendo la conversión a temperaturas inferiores. Esta reacción se debe completar para 1 mol de SiO_{2} por mol de CaO producido en la reacción. Son posibles otras reacciones para formar silicatos diferentes con otras relaciones de CaO/SiO_{2}.

Cuando CaO se elimina mediante la acción de la sílice para formar silicatos de calcio, la temperatura a la que se forman las fases de TCP se reduce hasta temperaturas consistentes con los datos a partir de la conversión de la composición de hidroxiapatita preparada como se ve en la figura 1. La adición de entidades de silicio dirige la línea de conversión a la derecha, es decir, hasta temperaturas inferiores con la formación de \alpha-TCP principalmente.

El mecanismo propuesto mediante el que la sílice juega un papel directo en el estímulo de la formación del fosfato alfa tricálcico comparado con otras fases tales como fosfato beta tricálcico es que las entidades de silicio entran en la estructura cristalina de hidroxiapatita y estabiliza la fase alfa con respecto a beta. También se ha demostrado, de acuerdo con una realización preferida, que es de importancia la naturaleza de la sustancia de hidroxiapatita de partida y la manera en la que se añade la sílice. Cuando se añade la sílice en forma de un polvo a un polvo de hidroxiapatita pura comercial, y se muele conjuntamente para promover la mezcla, el producto de conversión observado a altas temperaturas de sinterización de sobre 1000ºC era \beta-TCP. Por el contrario, los polvos preparados según la presente invención con sílice añadida en forma de una solución metaloorgánica, se convertían principalmente en una fase de fosfato alfa tricálcico estabilizado que se mantenía a baja temperatura como se muestra en la figura 2 en la línea de 950ºC. Esta conversión no es reversible. A alta temperatura, los polvos dopados muestran una reducción en la temperatura de conversión entre sobre 1200ºC para polvos puros hasta aproximadamente 950ºC para polvos dopados por sílice. Como se ha indicado, este desarrollo se cree que es debido a la formación de silicatos de calcio, en los que la composición de fase resultante estabilizada se mantiene tras enfriamiento a baja temperatura.

Una razón por la que los polvos con entidades estabilizantes preparadas de acuerdo con la presente invención tienen composiciones de fase estable y reproducibles con una morfología superficial deseada y una estructura microporosa interna es que la sustancia de hidroxiapatita se prepara originalmente en el procedimiento de sol-gel en forma de partículas muy finas. La adición de entidades estabilizantes tales como entidades en la forma de una solución metaloorgánica permite que cada una de estas partículas se ponga en contacto íntimo con una capa de entidades de silicio dando como resultado la mezcla completa. Tras la sinterización, la sílice se pone en proximidad estrecha con el CaO liberado en la reacción de conversión. Se propone que la formación de entidades de silicato de calcio insolubles en la superficie de cada de partícula limita la reversibilidad de la reacción y juega un papel en la prevención de la solubilidad de fosfato alfa tricálcico en medio fisiológico acuoso.

De manera similar a sílice, titanio, aluminio y boro se predijeron que reducían la temperatura de conversión y por lo tanto se pueden usar como estabilizantes, es decir dopantes. Las figuras 3 y 4 ilustran la reducción de temperatura con la formación complejos CaO/Al/Ti/Ba. Estos metales se pueden usar para eliminar el CaO de la hidroxiapatita y dar como resultado un \alpha-TCP estabilizado. Los factores importantes para la selección de estabilizante (dopante) y del compuesto mediante el que se dispersa son: (a) necesita interactuar con CaO formado que forma un compuesto de calcio estable, (b) debe ser capaz de dispersarse uniformemente por toda la sustancia sol-gel preferiblemente de una manera que rodea las superficies de las partículas recién formadas, (c) no estabilizaría las fases indeseables dentro del sistema de fosfato de calcio, y (d) no debe ser tóxico cuando se integra para aplicaciones biológicas. Las entidades estabilizantes para uso en la presente invención son las que forman óxidos, preferiblemente óxidos metálicos. Los óxidos metálicos preferidos son los seleccionados que producen la composición y la morfología deseada y se seleccionan entre el grupo constituido por aluminio, circonio, germanio, cromo, vanadio y niobio, y más preferiblemente se seleccionan entre óxidos de silicio y titanio. También prueban que son útiles las mezclas de tales entidades estabilizantes.

La sinterización se hace en presencia de entidades estabilizantes. Las entidades estabilizantes se proporcionan en virtud de la adición de entidades estabilizantes a la sustancia de hidroxiapatita antes de la sinterización. Las entidades estabilizantes se proporcionan en una cantidad suficiente para estabilizar las fases de fosfato de calcio que están en la forma de películas, polvos, revestimientos gruesos, piezas de cerámica a granel y en piezas de cerámica a granel que tienen una microporosidad interna formada en ellas. Preferiblemente para el soporte y estímulo de la actividad celular ósea, es necesario que la morfología superficial bioactiva única resultante y estructura microporosa interna sean reproducibles y que sean una función de la presencia de entidades estabilizantes durante el proceso de sinterización.

Dependiendo de su uso propuesto, la composición se puede proporcionar en forma de diversas estructuras tales como en la forma de películas finas para diagnóstico o en forma de revestimientos gruesos a usar sobre implantes óseos o dentales. En esta memoria descriptiva, estas películas delgadas se pueden describir como las que tienen un espesor de 0,1 micrones a 5 micrones, los revestimientos más gruesos son los que tienen un espesor sobre 5 micrones diseñarse para aplicar a otros sustratos. Las piezas de cerámica a granel se refieren a estructuras tridimensionales mayores que son funcionalmente independientes de un sustrato, sinterizando una película de sustancia de hidroxiapatita en la cara de un sustrato de cuarzo.

Sinterizando una película de sustancia de hidroxiapatita en la cara de un sustrato de cuarzo, el sustrato de cuarzo proporciona una fuente suficiente de entidades de silicio que se puede difundir por todas las fases de fosfato de calcio y producir un contenido de entidad de silicio suficiente. Se observa en la figura 5 (a), la interfase de la composición con el sustrato, la figura 5 (b) justo por encima de la interfase, y la figura 5 (c) en la parte superior de la película, sin embargo, las entidades de silicio no se distribuyen uniformemente por toda la composición de la película. Durante el período de sinterización, las entidades de silicio se liberan de la superficie del cuarzo y se difunden a través de la superficie de la capa de sustancia de hidroxiapatita.

Las entidades estabilizantes de la presente invención se seleccionan entre óxidos metálicos y no metálicos de silicio, aluminio, circonio, boro, titanio, germanio, cromo, vanadio, niobio y las mezclas de los mismos. Los sustratos que contienen o están hechos de aluminio, circonio, boro, titanio y diversas mezclas de estos componentes pueden ser adecuados para proporcionar la fuente de entidades estabilizantes.

La película delgada proporcionada sobre un soporte adecuado, de acuerdo con esta invención, avanza significativamente el estudio y entendimiento de las propiedades funcionales celulares óseas. La composición de la película estabilizada, proporcionada de acuerdo a esta invención permite el cultivo de diversos tipos de células óseas en ella. La composición superficial se puede ajustar para estimular un grado significativo de resorción de las entidades de fosfato de calcio del material de la película hasta un grado insignificante de resorción de las entidades de fosfato de calcio en el estudio de actividad de osteoclastos, De manera similar, la actividad de los osteoclastos se puede estudiar detectando una construcción de matriz ósea calcificada. La capacidad de proporcionar el material en una película que es suficientemente delgada para que se pueda detectar la resorción de las entidades mediante osteoclastos se pueda detectar por la desaparición de entidades de fosfato de calcio resorbido proporciona un formato barato sencillo para análisis comparado con las técnicas anteriores. La composición de la película realizada de acuerdo a esta invención, soporta la función biológica de células óseas. El beneficio que proporciona la película sobre un sustrato de soporte transparente, tal como cuarzo o vidrio, se presta a técnicas de evaluación para el procedimiento de diagnóstico incluyendo lectura en máquina automática.

De manera ideal el espesor de la película es mayor que 0,1 micrones debido a que se ha encontrado que a espesores de película menores que 0,1 micrones es difícil de obtener una cobertura de película uniforme, libre de hoyos discretos. En cuanto al límite de espesor superior para la película, puede ser de cualquier espesor deseado dependiendo de su uso final. Como se describirá, el grado de resorción se puede detectar mediante transmitancia de luz, que preferiblemente requiere una película menor de 10 micrones de espesor. El sustrato es de cuarzo que fácilmente resiste las temperaturas de sinterización y tiene el grado deseado de transparencia para permitir ensayos de transmitancia de luz que determinen el grado de resorción de entidades de fosfato de calcio del material de la película.

Las películas delgadas desarrolladas se pueden usar en kits y similares para proporcionarla determinación de actividad celular ósea. La película se puede incorporar en forma de un "kit" que comprende sustratos de cuarzo, pre-revestidos con una película delgada de fosfato de calcio adherente, que se puede usar en un recipiente de cultivo de células (posiblemente una placa me pocillos múltiples esterilizada opcionalmente de 24 pocillos, es decir, de aproximadamente de 15 mm de diámetro) como un sistema adecuado para el cultivo de poblaciones de células óseas mezcladas. El dispositivo es sencillo y se basa en solamente equipo de laboratorio de rutina y técnicas para uso, es adecuado para análisis cuantitativo, y es barato de fabricar pero suficientemente fuerte para permitir niveles normales de manipulación y se puede envasar en lotes, de (por ejemplo) 24 muestras en una caja de de presentación de plástico. Las superficies de las películas tienen una química definida y reproducible y son mecánicamente suficientemente fuertes para resistir el transporte cuando se usan con un material apropiado de envasado.

En cada caso las condiciones de cultivo las condiciones de cultivo pueden ser tales que los osteoclastos, en forma bien mononuclear o multinucleada se puede esperar que sobrevivan en un estado funcional y resorban el fosfato de calcio artificial de la película. De manera similar, los osteoblastos son capaces de secretar activamente la matriz ósea calcificada en tales condiciones de cultivo.

Estos sustratos se pueden usar para determinar la actividad resortiva de osteoclastos y controlar el cambio en este nivel de actividad resortiva bien como resultado de un proceso patológico o la inclusión, en el medio de cultivo, de un agente tal como un fármaco que influenciaría, bien directa o indirectamente, la actividad resortiva osteoclástica. Los sustratos son también adecuados para el cultivo de osteoblastos activos con el fin de observar y dirigir la secreción de la matriz ósea en ella así como al uso de la matriz mineralizada depositada para transplante in vivo. Como se observa en la figura 6, la matriz colágena mineralizada 10 se deposita mediante osteoblastos cultivados sobre la superficie de la película delgada estabilizada 12 como se proporciona sobre un sustrato de cuarzo 14. Se muestra una capa limitante bien integrada 16 que parece una línea de cemento y que es similar al mismo tipo de líneas de cemento formadas por los osteoblastos in vivo a la interfase entre el hueso nuevo y el antiguo. Esto claramente sugiere que la composición estabilizada por presión permite la actividad fisiológica de osteoblastos soportando además el papel de la composición estabilizada como un importante producto de remodelación ósea.

El dispositivo se puede usar como un medio de cuantificar la actividad resortiva de osteoclastos o construcción de material de tipo óseo mediante la actividad de osteoblastos. Tal análisis de actividad se puede producir bajo control continuo a tiempo real, intervalos a intervalos de tiempo o determinación del punto final. Las etapas en la estabilización de la actividad celular ósea son comunes a cada uno de los programas de control anteriores ya que esas células óseas (bien animales o humanas) se cultivan, en condiciones específicas, sobre uno o más de los dispositivos. El período de cultivo está entre varias horas a muchos días y preferiblemente entre aproximadamente 2 a 10 días (el tiempo óptimo depende de las especies celulares y protocolo), tiempo durante el que el grado de actividad de osteoclastos se puede controlar continuamente, controlar periódicamente, o simplemente no controlar en una base en progreso a favor de la determinación de punto final. De manera similar, la actividad de osteoblastos se puede observar mediante la determinación del grado de la construcción de la matriz ósea calcificada. Como se muestra en la figura 7, un disco de cuarzo revestido con una película estabilizada de la presente invención y cultivado simultáneamente con osteoblastos (a), es altamente fluorescente indicando la presencia de matriz ósea desmineralizada. Por el contrario, una película estabilizada revestida sobre cuarzo en presencia de medio solo (b) no muestra fluorescencia. La cantidad de matriz ósea calcificada es directamente proporcional a la fluorescencia emitida medible. La tetraciclina es un material fluorescente de manera natural. A medida que las células captan tetraciclina, se metaboliza y sus metabolitos se secretan e incorporan en la matriz ósea recientemente formada. La tetraciclina solamente será fluorescente tras metabolizarse por los osteoblastos. Esto demuestra que los osteoblastos secretan activamente matriz ósea sobre la composición estabilizada.

Una vez que la sustancia de hidroxiapatita sol-gel se prepara, se puede aplicar en forma de una película delgada al sustrato deseado en una diversidad de técnicas. Por ejemplo, el procedimiento de revestimiento por inmersión (C. J. Brinker y col., Fundamentals of Sol Gel Dip Coating, Thin Solid Films, vol. 201, Nº 1, 97-108, 1991) consiste en una serie de procedimientos: retirar el sustrato de una sol o solución a una velocidad constante, secar la película líquida revestida a una temperatura adecuada, y quemar la película hasta una cerámica final.

En el revestimiento por giro el sol-gel se hace gotear sobre una placa que esta girando a una velocidad suficiente para distribuir la solución uniformemente mediante acción centrífuga. Los tratamientos posteriores son los mismos que el revestimiento por inmersión.

Se apreciara que existen otras diversas técnicas que se pueden usar para aplicar una película delgada de la sol-gel al sustrato. Otras técnicas incluyen una pulverización de la sol-gel, extensión de la sol-gel y pintado de la sol-gel.

Una alternativa para revestir discos discretos de un tamaño particular es revestir un sustrato aumentado con una película de la sol-gel. Después se sinteriza la película entera sobre el sustrato. Después se puede aplicar un dispositivo, tal como una rejilla, sobre la película para dividirla en una pluralidad de zonas de ensayo discretas.

En estas diversas técnicas de la aplicación de la sustancia sol-gel, el espesor y calidad (porosidad, microestructura, estado cristalino y uniformidad) o películas formadas están afectadas por diversos factores. Estos incluyen las propiedades físicas, composición y concentración del sol de partida, la limpieza de la superficie del sustrato, velocidad de retirada del sustrato y la temperatura de incineración. En general el espesor depende principalmente de la velocidad de retirada y viscosidad de sol para un procedimiento de revestimiento por inmersión. Ya que la heterogeneidad en la sol es responsable de la formación de macroporos y grietas, la operación de revestimiento se debe emprender en una habitación limpia para evitar la contaminación particular de la sol. En la fase de tratamiento por calor, se requieren altas temperaturas para desarrollar la microestructura requerida y conversión deseada de hidroxiapatita a fosfato \alpha-tricálcico.

El propósito de aplicar el procedimiento de revestimiento por inmersión para fabricar películas de fosfato de calcio es doble: (a) preparar películas con calidades requeridas (uniformidad, espesor, porosidad, etc); y (b) hacer películas de fosfato de calcio translúcidas sobre sustratos transparentes para experimentos biológicos.

También se ha encontrado que la composición artificial estabilizada de la presente invención es adecuada para la producción de no solamente las películas delgadas y revestimientos más gruesos, sino también polvos y materiales cerámicos a granel. Los materiales cerámicos se preparan a partir de polvos sinterizados preparados mediante el procedimiento sol-gel descrito en esta memoria descriptiva con la adición de sílice para crear una mezcla de fases de hidroxiapatita/fosfato tricálcico estabilizado. En una realización el polvo sinterizado se muele finamente en una cantidad suficiente para producir un disco de 0,5-1 mm de espesor, que después se mezcla con una gota de sustancia sol-gel retenida de la misma composición dopante para crear un polvo estabilizante que ayuda al mantenimiento de las partículas juntas. El polvo húmedo se prensa uniaxialmente en un molde de laboratorio a una presión de aproximadamente 5 toneladas/cm^{2}. El material a granel resultante muestra buena resistencia en verde y se incinera a 1000ºC durante 1 hora al aire. Tales materiales cerámicos mantienen todas las mismas características que la composición estabilizada usada como una película delgada, o revestimiento. Para las composiciones estabilizadas de SiO_{2}, la difracción por rayos X mostró un cambio pequeño en la composición de fases entre el polvo inicial y el material cerámico final. La topografía superficial como se muestra en la figura 8, en la vista de planta, es notablemente similar a la de la composición revestida sobre un sustrato de cuarzo ilustrado en la figura 9. La capacidad resortiva de los osteoclastos sobre películas delgadas y los materiales cerámicos a granel son muy similares. La resorción de osteoclastos se observa como la presencia de hoyos de resorción 18 sobre el compuesto cerámico a granel, y son similares a los hoyos de resorción 18 mostrados sobre las películas delgadas (figuras 8 y 9).

Como reconocen los expertos en la técnica, las piezas a granel grandes se pueden formar configurando el material cerámico para formar piezas a granel para uso en las aplicaciones deseadas. Las piezas a granel producidas mantienen la composición de fases de fosfato de calcio estabilizado deseadas así como la morfología superficie globular microporosa, y estructura microporosa interna las cuales facilitan la actividad celular ósea en ellas.

Un aspecto particular de la preparación de material cerámico para uso en aplicaciones biológicas es la fabricación de piezas cerámicas con una microporosidad superficial globular que conduce a bioactividad, y una gran macroestructura de poros de dimensiones entre 50 y 1000 \mum o más, dentro de la estructura interna. Esto estimula la remodelación ósea en un sistema que más estrechamente se parece a la remodelación ósea fisiológica in vivo. Tal macroporosidad en el extremo inferior del intervalo siendo particularmente adecuado a las aplicaciones que desean rápido crecimiento hacia dentro de la matriz ósea, aunque la macroporosidad en el extremo superior del intervalo permite que las células accedan al interior para usos tales como para la producción por ingeniería de injertos óseos. Usando polvos estabilizados con una entidad estabilizante tal como sílice y sinterizada antes de uso, compuestos cerámicos porosos hechos mediante la mezcla de tales polvos con bolas de estireno de un tamaño deseado. Después de prensar un polvo estabilizado humedecido con bolas de estireno, después a una temperatura requerida, el estireno después se elimina mediante pirólisis a temperaturas de entre aproximadamente 400ºC y 600ºC. El material cerámico poroso después se incinera a 1000ºC de una manera normal como se ha descrito previamente. Este procedimiento da como resultado la formación de un compuesto cerámico a granel que tiene una estructura microporosa externa, una estructura macroporosa interna que permite a las células migrar y funcionar a lo largo de toda la unidad de cerámica a granel completa.

Los expertos en la técnica entienden que los materiales similares a estireno se pueden usar para desarrollar macroporosidad dentro de la estructura cerámica. Otros materiales que son capaces de pirólisis a temperaturas por debajo de las temperaturas de sinterización normales son también útiles para formar la estructura macroporosa. Los materiales usados no deben liberar ningún residuo tóxico. También se entiende que se pueden usar otros procedimientos para formar la macroestructura tales como perforación de agujeros, el uso de láser o usos de de agentes espumantes.

Ya que el aspecto significativo de la presente invención es la mezcla de las fases de hidroxiapatita y fosfato alfa tricálcico acopladas con la morfología superficial creada por el polvo estabilizado formado a partir de la sustancia de hidroxiapatita sol-gel, los expertos en la técnica entenderán que también se pueden usar otros procedimientos de fabricación de películas, revestimientos y estructuras a granel a partir de este polvo de acuerdo con la presente invención. Esto incluye el uso de técnicas conocidas tales como pulverización de plasma o térmica o deposición electroforética.

Con referencia a la figura 10, una microfotografía de sección transversal por microscopía electrónica por transmisión muestra un gradiente de capas en la forma del sustrato de cuarzo (a), la capa de interfase (b), que comprende pequeños granos, y (c) la capa superior que incluye la superficie de la película que está comprendida por pequeños tipos de cristales embebidos en gránulos que proporcionan la estructura microporosa globular. Durante el proceso de sinterización, las entidades de silicio se liberan del cuarzo (a) y se difunden a través de la hidroxiapatita a medida que se convierte en fosfato \alpha-tricálcico formando la capa delgada sinterizada. La capa de interfase (b) tiene una estructura cristalina menor que la superficie que tiene gránulos policristalinos mayores de fases de fosfato de cal-
cio.

La morfología de la composición sinterizada artificial de la presente invención es única y no se ha reseñado o mostrado anteriormente. Los inventores ahora han descubierto una morfología superficial que presenta una estructura globular interconectada débilmente de gránulos redondos que tienen una estructura microporosa de poros interconectados. De acuerdo a un aspecto preferido de esta invención, la morfología soporta exitosamente cultivos de osteoclastos y osteoblastos funcionales.

La morfología superficial del revestimiento tiene una forma característica que implica una estructura globular interconectada débilmente que parece coral (figura 11). El tamaño de los gránulos varía entre aproximadamente 0,5-1 \mum en dimensión lateral. El revestimiento es poroso en la dirección perpendicular al sustrato con una gran densidad planar más cerca de la superficie que del sustrato. Esta morfología puede permitir la percolación de medio líquido y otros fluidos fisiológicos dentro del revestimiento. Por el contrario, la morfología superficial de al hidroxiapatita preparada a partir de procedimientos de coprecipitación, no da como resultado una estructura microporosa como se proporciona en la presente invención. Como se observa en las figuras 12 (a) y 12 (b), la morfología superficial de tales películas de hidroxiapatita preparadas en ausencia (a) y presencia de entidades estabilizantes no es microporosa comparada con la presente composición observada en la figura 11. Además, se ha indicado que la hidroxiapatita policristalina sintética no se resorbe por los osteoclastos (Shimizu, Bone and Minerology, vol. 6, 1989).

La morfología superficial globular está hecha de gránulos redondos comparables en tamaño a los depósitos agregados inicialmente hechos de una célula de osteoblasto en el proceso que conduce a la formación de hueso. La presente composición proporciona una morfología superficial compatible con el tipo de morfología de la célula que se espera encontrar in vivo. Un hoyo de resorción de de osteoclastos típico se muestra en la figura 13, en el cual la estructura es hueso. Como se demuestra en la figura 9, los hoyos de resorción 18 formados por los osteoclastos 20 sobre la composición artificial presente son extremadamente similares a los observados en el hueso natural de la figura 13 que sugiere los osteoclastos funcionan de manera similar en ambos sistemas. Esto implica que la morfología superficial de la composición sinterizada artificial es compatible con el tipo de morfología que se espera encontrar in vivo.

La microporosidad a granel de la composición estabilizada puede asegurar que las concentraciones de iones fosfato o calcio cerca de la superficie del material artificial están dentro de los límites esperados por la célula como se espera encontrar in vivo con el hueso natural que está hecho de hidroxiapatita, colágeno y otros tejido fibrosos. Durante los procesos de disolución extracelular mediados por osteoclastos que conducen a la resorción, este material complejo conduce a una concentración local particular de productos de disolución. Durante la disolución o resorción completa de hidroxiapatita artificial inorgánica o \alpha-TCP, los límites de concentración resultante para ciertas conductas celulares se definen estrechamente, para que la célula logre una actividad sobre las superficies artificiales comparables con la de hueso natural, deben estar disponibles medios para ajustar los niveles de concentración local de elementos tales como calcio. La porosidad de la composición permite que esto se produzca a través del flujo o difusión de medio.

La composición artificial bioactiva estabilizada de la presente invención proporciona una única composición química junto con una morfología superficial única y estructura microporosa interna que no se ha mostrado nunca previamente. No se han reseñado previamente composiciones que muestran bioactividad celular ósea consistente in vivo e in vitro y que in vitro se pueden cuantificar fácilmente, exactamente y repetitivamente. La naturaleza de la composición estabilizada es versátil porque se puede proporcionar en un polvo, película delgada, revestimiento grueso, pieza de material cerámico a granel o pieza de cerámica a granes macroporosa. En cada caso, la morfología superficial única y microporosidad interna se mantiene así como la composición de fases de fosfato de calcio estabilizada. Como se observa en la figura 14, la morfología superficial microporosa se mantiene sobre un material cerámico a granel preparado a partir de la presente composición estabilizada.

La composición estabilizada de la presente invención es ideal para diagnósticos in vitro con el fin de caracterizar célula ósea anormal que funciona a gran escala también es fácilmente aplicable en forma de un revestimiento para implantes óseos y dentales con el fin de promover la regeneración y reparación de tejidos. La estructura de la composición es tal que es muy similar y por lo tanto compatible con los tejidos óseos y células in vivo que evitarán los problemas de rechazo de materiales extraños.

La presente composición tiene las características físicas requeridas y afinidad/compatibilidad con tejido duro in vivo de manera que se puede usar para una amplia variedad de aplicaciones terapéuticas tales como para proporcionar implantes in vivo así como para la regeneración y reparación de tejido óseo in vivo como por ejemplo en reemplazos de cadera y rodilla, fracturas, e implantes dentales. La composición también se puede usar para diversas aplicaciones construidas por ingeniería de tejido realizadas ex vivo con el fin de proporcionar material óseo producido artificialmente que después se puede transplantar en forma de injertos óseos para reemplazo, regeneración y reparación de tejido óseo. Los pacientes pueden proporcionar el suministro de osteoclastos y osteoblastos usados para cultivar sobre la composición con el fin de disminuir las posibilidades de rechazo de tejido por lo tanto produciendo injertos óseos totalmente compatibles. Como alternativa, también se pueden usar para este propósito células óseas dadoras. Tales injertos se pueden preparar para el reemplazo del tejido en ausencia o presencia de células óseas usadas para producir el tejido óseo. Sin embargo, se prefiere que los injertos que contienen células sean de donantes autólogos con el fin de minimizar los problemas asociados al rechazo de tejidos. La composición estabilizada, en forma de polvo, también puede tener uso terapéutico médico. Los polvos estabilizados se pueden mezclar y suspender dentro de sustancias poliméricas, compatibles con tejidos y no tóxicos, y después aplicarse in vivo para el llenado de huecos dentro de tejidos óseos.

Todas las aplicaciones en las que la presente composición se puede usar tienen la ventaja de que tanto los osteoclastos como los osteoblastos funcionan activamente con la composición en cualquier forma proporcionando así pues un sistema de tejido óseo muy similar al encontrado in vivo. La composición bioactiva artificial de la presente invención promueve tanto la osteoconducción como la resorción de manera que se puede producir cicatrización y regeneración de tejido normal mientras que permite simultáneamente que el material artificial se resorba en el proceso de remodelación de tejido óseo normal.

Los siguientes procedimientos ejemplifican aspectos de la invención para proporcionar una composición sinterizada artificial bioactiva que tiene entidades de fosfato de calcio estabilizadas en ella y que también muestra una única morfología capaz de soportar actividad celular ósea en ellas.

Procedimiento 1

Preparación de sustancia sol-gel de hidroxiapatita

El siguiente procedimiento se basa en la preparación de suficiente hidroxiapatita sol-gel para propósitos de fabricación. La solución A comprende un tetrahidrato de nitrato de calcio y la solución B comprende un ortofosfato diácido de amonio (monobásico). La solución A se mezcla con la solución B para producir la sol-gel deseada, solución C. La solución A se prepara añadiendo 40 ml de agua doblemente destilada a 4,722 gramos de nitrato de calcio, (Ca(NO_{3})_{2}. La solución se agita a una velocidad moderada durante tiempo suficiente para disolver todo el nitrato de calcio que normalmente es en el intervalo de 3 minutos. A esta solución, se añaden 3 ml de hidróxido amónico (NH_{4}OH) y se agita durante aproximadamente otros 3 minutos. El pH de la solución se ensaya cuando se desea un pH 12. A esta solución se añaden 37 ml de agua doblemente destilada para proporcionar un volumen de solución total de aproximadamente 80 ml. La solución se agita durante otros 7 minutos y se cubre.

La solución B se prepara añadiendo 60 ml de agua doblemente destilada a un vaso de precipitados de 250 ml que contiene 1,382 gramos de NH_{4}H_{2}PO_{4}. El vaso de precipitados se cubre y se agita a una velocidad moderada durante 3 a 4 minutos hasta que se ha disuelto todo el NH_{4}H_{2}PO_{4}. A esta solución se añaden 71 ml de NH_{4}OH y después el vaso de precipitados se cubre y se continúa la agitación durante aproximadamente otros 7 minutos. El pH de al solución se ensaya cuando se desea un pH de aproximadamente 12. A esto se añaden otros 61 ml de agua doblemente destilada y el vaso de precipitados se cubre para proporcionar un volumen de solución total de aproximadamente 192 ml. Después la solución se agita durante otros 7 minutos adicionales y se cubre.

Después la sol-gel deseada se prepara combinando al solución B con la solución A. Toda la solución A se introduce en una botella de reactivo de 500 ml. La agitación se comienza a una velocidad moderada y al solución B se introduce en al botella de reactivo a una velocidad de aproximadamente 256 ml por hora hasta que todos los 192 ml de la solución B se distribuyen en la solución A. Se puede usar un exceso de solución B para compensar cualquier solución que pueda permanecer en el vaso de precipitados de 250 ml o cualquier tubo usado en el proceso de transferencia. Después de la finalización de esta adición y la combinación de la solución A con la solución B, la solución resultante se continua agitando a velocidad moderada durante a aproximadamente 23 a 24 horas. La sol - gel resultante se inspecciona para cualquier precipitación o aglomeración anormal. Si se produce cualquier precipitación o aglomeración anormal, la solución se debe desechar y comenzar la preparación de nuevo. La sol después se transfiere cuidadosamente a otra botella de reactivo de 500 ml se manera que se evite cualquier inclusión de aglomeraciones de partículas que puedan estar presentes en las paredes de la botella de reactivo original. Aproximadamente 240 ml de solución C, que es la sol-gel resultante, se administrana una botella de centrífuga y se centrifuga durante 20 minutos a aproximadamente 500 rpm a temperatura ambiente. Después de la centrifugación, se desechan 180 ml de sobrenadante sin alterar los sedimentos. Los sedimentos se vuelven a suspender poco a poco mezclando de una manera rotatoria suave durante aproximadamente 30 minutos. Después se mide la viscosidad de la sol-gel y preferiblemente está entre 20 a 60 cP. Después la sol-gel está lista para revestimiento por inmersión del sustrato seleccionado o para otras
aplicaciones.

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Procedimiento 2

Preparación de sustancia de hidroxiapatita dopada con sílice

Una solución de sílice se prepara como sigue. Las cantidades determinadas crean aproximadamente una solución de 0,168 g de SiO_{2}/4 ml. 4 ml de solución de sílice se añaden a 60 ml de sustancia sol-gel de hidroxiapatita centrifugada creada en el procedimiento 1 y reacciona con 0,168 g de CaO producido en al reacción de conversión.

Componentes de la solución de silicio

Ortosilicato de tetrapropilo Si(OC_{3}H_{7})_{4}	7,32 gramos
2-metoxietanol CH_{3}OCH_{2}CH_{2}OH	34,5 gramos

La solución de sílice se añade a la sustancia de hidroxiapatito preparada mediante el procedimiento 1, de manera que la concentración de SiO_{2} sea de la relación 1 M de SiO_{2}/l mol de CaO producida tras la conversión durante la sinterización.

Procedimiento 3

Preparación de formatos de película delgada

Antes de la aplicación de la película al sustrato, el sustrato necesita limpiarse completamente para asegurar el recubrimiento satisfactorio de la película. En caso de sustratos de cuarzo, la limpieza se logra colocando los discos en un vaso de precipitados vidrio y suministrando solución limpia de ácido crómico al vaso de precipitados para cubrir todos los discos. Después se cubre el vaso de precipitados. Después los discos se sonican en un baño de agua durante 1 hora. El ácido se lava usando agua corriente durante 20 minutos. El agua corriente residual se retira mediante tres cambios se agua doblemente destilada. Después del cambio final de agua doblemente destilada, cada disco individual se seca con una toalla exenta de hilos y se inspecciona para evaluar desperfectos en la superficie de cuarzo. Cualquier partícula residual sobre la superficie se retira según se necesite con nitrógeno comprimido o aire. Los discos se almacenar en bandejas cubiertas en un ambiente aséptico. Este procedimiento se puede usar para limpiar cualquier tipo de sustrato de cuarzo.

El sustrato de disco de cuarzo, u otro sustrato que tiene una composición apropiada, se sumerge en la sol-gel preparada mediante el procedimiento 2. El disco se sumerge agarra por los bordes para evitar que toque la superficie. El disco se sumerge en la sol, preferiblemente mediante máquina. El disco se retira de la sol a una velocidad de retirada prescrita. Se retira el revestimiento sobre un lado del disco. Después el sustrato revestido se coloca en una placa petri limpia u se cubre y se seca a temperatura ambiente. La película, según se ha formado antes de la sinterización, debe ser uniforme sin grietas, grumos o huecos. Se entiende que el proceso de revestimiento por inmersión como se aplica a una cara de un disco, se puede aplicar a cualquier otra forma de sustrato, tal como un sustrato en forma de rectángulo plano de cuarzo.

Procedimiento 4

Preparación de polvo de hidroxiapatita seco

La sustancia sol-gel preparada mediante el procedimiento 2 se seca a 100ºC durante aproximadamente 8 horas. La sustancia seca después de muele usando un mortero y mano de almirez o cualquier otro mecanismo que pueda moler y se produce un polvo fino. Después el polvo se puede sinterizar siguiendo el procedimiento de sinterización habitual, como se describe en el procedimiento 7, excepto que el polvo se sinteriza en un crisol y después se muele de nuevo después de enfriar. El mismo procedimiento se puede seguir para la preparación de una hidroxiapatita dopada o estabilizada.

Procedimiento 5

Producción de piezas de cerámica a granel

Los materiales cerámicos (piezas a granel tridimensionales) se han creado a partir de polvos de hidroxiapatita según el procedimiento 2. Parte de la sustancia sol-gel se guardó y el resto se filtró. El polvo se secó a 120ºC y se molió para producir un polvo fino. Aproximadamente 0,09 gramos de polvo se colocaron en una placa de plástico. Se usó un cuentagotas de vidrio para formar una gota de la sustancia sol-gel inicial, que pesó aproximadamente 0,055 gramos cuando se mezcló con el polvo. La sol se mezcló con el polvo para formar una pasta humedecida, pero no mojada. La pasta húmeda se introdujo en un molde de acero inoxidable de 6,25 mm de diámetro y se prensó a dos toneladas métricas durante 1 minuto. La pieza a granel se retiró de la prensa, se secó al aire, y se incineró en un crisol de alúmina cubierto según el procedimiento 7. La morfología superficial era muy similar al de las películas delgadas sinterizadas artificiales como se observa en la figura 14.

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Procedimiento 6

Preparación de piezas de cerámica a granel que tienen una macroestructura de poros

Los polvos preparados con hidroxiapatita que están dopados con una entidad estabilizante tal como sílice en el procedimiento 2 y sinterizados a 1000ºC, se mezclan con bolas de estireno de un tamaño deseado, humedeciendo el polvo con sustancia sol-gel adicional, y prensando a una presión de aproximadamente 1 tonelada/cm^{2} de manera que no se extruda el estireno. La resistencia en crudo potenciada se logra en tales compactos polvo/estireno usando una mezcla humedecida de sol retenida y solución al 2,5% en peso de alcohol polivinílico. El estireno se retira mediante pirólisis calentando en aire u oxígeno hasta 550ºC. Después el material cerámico macroporoso se incinera hasta 1000ºC de la manera descrita para la sinterización normal en el procedimiento 7.

Procedimiento 7

Sinterización de la sustancia de hidroxiapatita

El siguiente procedimiento de sinterización se puede llevar a cabo en muflas de laboratorio habituales de diversos tamaños, capaces de operar a temperaturas entre ambiente hasta al menos 1100ºC, y diseñadas para mantener temperaturas internas exactas y estables, particularmente entre 800ºC y 1100ºC, tales como modelos de Lindberg 51744 ó 894-Blue M. Los componentes preparados mediante los procedimientos 3, 4, 5 ó 6 se transfieren cuidadosamente en una placa de cerámica habitual (como es común en la práctica en el horno de Lindberg). La placa de cerámica se usa se usa como un vehículo durante el procedimiento de sinterización para facilitar la fácil carga y retirada de los múltiples sustratos de la mufla. La temperatura de la mufla se ajusta a la temperatura requerida para lograr las relaciones deseadas de HA:\alpha-TCP. Utilizando una mufla programable tal como el modelo de Lindberg 894-Blue M, la mufla se puede programar para mantener la temperatura deseada, que normalmente se seleccionará entre el intervalo de 920ºC a 1100ºC, durante un máximo de una hora para asegurar la difusión deseada de las entidades de silicio a través de las capas de gradiente desarrolladas de hidroxiapatita y fosfato \alpha-tricálcico. En el caso de muflas no programables, se puede usar un temporizador separado para advertir al operador que desconecte la mufla al final del tiempo de sinterización requerido a la temperatura seleccionada. La placa de cerámica que lleva los sustratos sinterizados se retira en cualquier momento después de que la temperatura del horno interna se haya enfriado hasta una temperatura de contacto aceptable y segura de aproximadamente 60ºC. Después los sustratos individuales se pueden almacenar o envasar para uso final.

De acuerdo con este procedimiento, las películas y revestimientos delgados de hidroxiapatita/fosfato \alpha-tricálcico se pueden producir sobre una base consistente que tiene la composición deseada en la que la variabilidad en los diversos parámetros de procesamiento se han minimizado para asegurar tal consistencia.

Aunque las realizaciones preferidas de la invención se describen en esta memoria descriptiva en detalle, los expertos en la técnica entenderán que se pueden hacer variaciones de las mismas sin salirse del ámbito de las reivindicaciones anexas.

Claims

1. Una composición sinterizada artificial bioactiva para soportar consistentemente la actividad celular ósea, dicha composición comprendiendo:

-: fosfato tricálcico estabilizado mediante entidades estabilizantes seleccionadas entre el grupo constituido por entidades de silicio, entidades de aluminio, entidades de circonio, entidades de bario, entidades de titanio, entidades de germanio, entidades de cromo, entidades de vanadio, entidades de niobio, entidades de boro, y las mezclas de las mismas, en la que dicho fosfato tricálcico estabilizado es insoluble en fluidos fisiológicos de pH de aproximadamente 6,4 a 7,3, dicha composición siendo obtenible mediante la conversión, mediante sinterización, de una sustancia sol-gel de hidroxiapatita uniformemente dopada con dichas entidades estabilizantes.

2. Una composición según la reivindicación 1, en la que la sinterización se lleva a cabo a una temperatura entre 900ºC y 1100ºC.

3. Una composición según la reivindicación 1 ó 2, en la que dicho fosfato tricálcico estabilizado es principalmente fosfato alfa tricálcico.

4. Una composición según la reivindicación 1, 2 ó 3, en la que dicha composición está en forma de un polvo, revestimiento o un material de volumen tridimensional.

5. Una composición según la reivindicación 1, 2, 3 ó 4, en la que dichas entidades estabilizantes se proporcionan en la forma de una solución metaloorgánica.

6. Una composición según cualquier reivindicación precedente, en la que dichas entidades estabilizantes son entidades de silicio.

7. Una composición según la reivindicación 6, en la que dichas entidades de silicio son ortosilicato de tetrapropilo.

8. Un procedimiento para preparar una composición sinterizada artificial estabilizada de fases de fosfato de calcio que tiene una morfología adecuada para soportar la actividad celular ósea en ella, dicho procedimiento comprendiendo las etapas de:

-: dopar una sustancia de hidroxiapatita con entidades estabilizantes seleccionadas entre el grupo constituido por entidades de silicio, entidades de aluminio, entidades de circonio, entidades de bario, entidades de titanio, entidades de germanio, entidades de cromo, entidades de vanadio, entidades de niobio, entidades de boro, y las mezclas de las mismas;

-: sinterizar dicha sustancia de hidroxiapatita dopada, en la que la sinteriración convierte dicha sustancia de hidroxiapatita dopada en fosfato alfa tricálcico principalmente dentro de las fases de fosfato, en la que dicho fosfato alfa tricálcico es insoluble en fluidos fisiológicos de pH de aproximadamente 6,4 a 7,3, es resorbible por osteoclastos y promueve la secreción de matriz de colágeno mineralizante por los osteoblastos, el procedimiento estando caracterizado porque dicha sustancia de hidroxiapatita está en la forma de una sol-gel, y porque dichas sol-gel de hidroxiapatita esta uniformemente dopada con dichas entidades estabilizantes.

9. Un procedimiento según la reivindicación 8, en el que dichas entidades estabilizantes están en la forma de una solución metaloorgánica.

10. Un procedimiento según la reivindicación 9, en el que la etapa dopante comprende la dispersión de dichas entidades estabilizantes en toda dicha sol-gel de manera que rodea las superficies exteriores de dichas fases de fosfato.

11. Un procedimiento según las reivindicaciones 8, 9 ó 10, en el que la sol-gel de hidroxiapatita se prepara mediante la mezcla de una solución de tetrahidrato de nitrato de calcio y una solución de ortofosfato diácido de amonio.

12. Un procedimiento según las reivindicaciones 8, 9, 10 u 11 en el que la composición formada es un polvo, revestimiento o material de volumen tridimensional.

13. Un procedimiento según las reivindicaciones 8, 9, 10, 11 ó 12, en el que dichas entidades de silicio son ortosilicato de tetrapropilo.

14. Un procedimiento según la reivindicación 13, en el que dicho ortosilicato de tetrapropilo está en solución con 2-metoxietanol.

15. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 14, en el que dichas fases de fosfato de calcio están en una relación de 50:50 a 20:80 para la relación de hidroxiapatita y fosfato alfa tricálcico.

16. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 15, en el que la sinterización de la sustancia de hidroxiapatita se realiza a temperaturas de aproximadamente 900ºC a 1100ºC.

17. Una estructura policristalina microporosa artificial sinterizada para soportar la actividad celular ósea, dicha estructura estando hecha mediante el procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 15.

18. Una estructura policristalina según la reivindicación 17, en la que dicha estructura es un implante.

19. Un procedimiento in vitro para el cultivo de células óseas funcionales, dicho procedimiento comprendiendo la aplicación de una suspensión de células óseas en un medio fisiológico a una composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 proporcionada sobre un sustrato.