ES2237727T3 - Quimeras de gamma2-cd4 y igg2-cd4. - Google Patents
Quimeras de gamma2-cd4 y igg2-cd4.Info
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Abstract
Un heterotetrámero quimérico de IgG2-CD4 purificado capaz de neutralizar un virus HIV-1 de un individuo infectado con HIV-1, que comprende dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras, en el que las cadenas pesadas poseen la secuencia de aminoácidos expuesta en la Figura 4 ó están codificadas por un vector de expresión designado CD4-IgG2HC-pRcCMV (ATCC No. 75193) y las cadenas ligeras poseen la secuencia de aminoácidos expuesta en la Figura 5 ó están codificadas por un vector de expresión designado CD4-kLC-pRcCMV (ATCC No. 75194).
Description
Quimeras de gamma2-CD4 y
IgG2-CD4.
En toda esta solicitud, se hace referencia a
diversas publicaciones mediante números arábigos entre paréntesis.
Los títulos completos de estas publicaciones pueden encontrarse al
final de la memoria descriptiva inmediatamente antes de las
reivindicaciones. Las descripciones de estas publicaciones en su
totalidad se incorporan por referencia en esta solicitud con
objeto de describir más completamente el estado de la técnica,
según se conoce por los expertos en ella, así como el conocimiento
de la fecha de la invención descrita y reivindicada en esta
memoria.
El ciclo vital de los virus animales se
caracteriza por una serie de acontecimientos que son necesarios
para la infección productiva de la célula huésped. La etapa inicial
del ciclo de replicación es la unión del virus a la superficie de la
célula, lo que está mediado por la interacción específica de la
proteína de unión viral (VAP) a receptores situados sobre la
superficie de la célula diana. El modelo de expresión de estos
receptores es responsable en gran parte de la clase del hospedante
y de las propiedades trópicas de los virus. La interacción de la
VAP con los receptores celulares desempeña, por tanto, un papel
crítico en la infección y en la patogénesis de enfermedades virales
y representa un área importante para tener como objetivo el
desarrollo de tratamientos terapéuticos antivirales.
Los receptores celulares pueden comprender todos
los componentes de membranas, con inclusión de proteínas, hidratos
de carbono y lípidos. La identificación de las moléculas que median
en la unión de virus a la superficie de las células diana ha sido
realizada en unos pocos casos. La proteína del receptor viral
caracterizada más extensamente es la CD4 (T4) (1). La CD4 es una
glicoproteína no polimórfica de la superficie celular que se
expresa principalmente sobre la superficie de linfocitos y células T
helper del linaje de los monocitos/macrófagos. La CD4 se asocia
con las moléculas de clase II del complejo principal de
histocompatibilidad (MHC), sobre la superficie de células que
presentan antígeno mediando en interacciones eficaces de la
respuesta inmune celular. En el hombre, la CD4 es también la diana
de la interacción con el virus de la inmunodeficiencia humana
(HIV).
El HIV infecta principalmente linfocitos T helper
y monocitos/macrófagos, células que expresan CD4 en la superficie,
lo que lleva a una pérdida gradual de función inmune, que da por
resultado el desarrollo del síndrome de la deficiencia humana
adquirida (SIDA). La fase inicial del ciclo replicativo del HIV
implica la interacción de alta afinidad entre la glicoproteína
gp120 de la cubierta exterior del HIV y la CD4 de la superficie (4
x 10^{-9} M Kd aproximadamente) (2). Varias líneas de evidencia
demuestran la necesidad de esta interacción para la infectividad
viral. In vitro, la introducción de un cDNA funcional que
codifica la CD4 en células humanas que no expresan la CD4, es
suficiente para hacer, de otro modo, células resistentes
susceptibles a la infección por el HIV (3). In vivo, la
infección viral aparece restringida a células que expresan la CD4.
Después de la unión de la gp120 del HIV a la CD4 de la superficie
celular, las membranas viral y de la célula diana se fusionan,
dando por resultado la introducción de la cápsida viral en el
citoplasma de la célula diana.
La caracterización de la interacción entre la
gp120 del HIV y la CD4 ha sido facilitada por el aislamiento de
clones de cDNA que codifican ambas moléculas (4, 5). La CD4 es una
glicoproteína de la superficie celular de linaje restringido, no
polimórfica, que es un miembro de la superfamilia génica de las
inmunoglobulinas. La expresión de alto nivel de ambas versiones
solubles de CD4 (sCD4), CD4 de longitud total y truncada, ha sido
descrita en sistemas de expresión estables. La disponibilidad de
grandes cantidades de sCD4 purificada ha permitido un conocimiento
detallado de la estructura de esta glicoproteína compleja. La CD4
madura posee una masa molecular relativa (Mr) de 55 kilodaltons y
consiste en un dominio extracelular de 372 aminoácidos del extremo
amino terminal, que contiene cuatro regiones en tándem semejantes a
las de las inmunoglobulinas, denominadas V1-V4,
seguido de un dominio transmembranal de 23 aminoácidos y un segmento
citoplásmico de 38 aminoácidos. El dominio V1 semejante al de las
inmunoglobulinas, del extremo amino terminal, muestra una homología
de 32% con los dominios variables de la cadena ligera kappa. Tres
de los cuatro dominios semejantes a los de las inmunoglobulinas
contienen un puente disulfuro (V1, V2 y V4), y ambos sitios de
glicosilación enlazados con el N en la parte del extremo carboxilo
terminal de la molécula, son utilizados (4, 6).
Experimentos realizados usando proteínas sCD4
truncadas, demuestran que los determinantes de unión de alta
afinidad a la gp120 del HIV caen dentro del dominio V1 semejante al
de las inmunoglobulinas, del extremo amino terminal
(7-9). El análisis mutacional de V1 ha definido un
sitio de unión de la gp120 discreto (restos 38-52
de la proteína CD4 madura) que comprende una región estructuralmente
homóloga con la segunda región determinante de la complementaridad
(CDR2) de las inmunoglobulinas (9). La producción de grandes
cantidades de V1V2 ha permitió el análisis estructural de los dos
dominios semejantes a los de las inmunoglobulinas, del extremo amino
terminal. La estructura determinada en una resolución de 2,3
Angstroms, revela que la molécula posee dos dominios estrechamente
asociados que contienen el pliegue de las inmunoglobulinas
conectado mediante una cadena beta continua. Los sitios de unión
putativos para anticuerpos monoclonales, moléculas MEC de clase II y
gp120 del HIV (determinados por análisis mutacional,) mapean sobre
la superficie molecular (10, 11).
Ha sido descrita una versión soluble del segmento
extracelular completo de CD4 (V1-V4), denominado
sCD4) y aparece como un enfoque terapéutico potencial para el
tratamiento de la infección por HIV (12). Experimentos in
vitro realizados demuestran que: 1) el sCD4 actúa como un
"señuelo molecular"\cdot uniéndose a la gp120 del HIV e
inhibiendo la unión viral a células humanas y la infección
subsiguiente de las mismas; 2) el sCD4 "desnuda" la
glicoproteína gp120 de la cubierta viral desde la superficie viral;
y 3) el sCD4 bloquea la propagación intercelular de virus desde
células infectadas con HIV hasta células sin infectar, por
inhibición de la fusión celular que cursa con mediación del virus
(1, 13).
Además de los resultados in vitro, han
sido descritos experimentos realizados con sCD4 en monos Rhesus
infectados con el virus de la inmunodeficiencia en simios (SIV).
Estos estudios han demostrado que la administración de 2 miligramos
(intramuscular) de sCD4 durante 28 días a monos Rhesus conducía a
una capacidad disminuida para aislar virus desde los linfocitos de
la sangre periférica y la médula ósea. Además, el crecimiento de
colonias progenitoras de granulocitos-macrófagos y
eritrocitos en la médula ósea retornaba a niveles normales. Estos
resultados obtenidos sugieren que la administración de sCD4 a monos
Rhesus infectados con SIV conduce a una disminución del depósito
viral.
Ensayos clínicos de Fase I en el hombre han
demostrado que no hay toxicidad o inmunogenicidad importante
asociada con la administración de sCD4 a dosis tan altas como 30
mg/día. Estudios farmacocinéticos llevados a cabo han revelado que
la semivida sérica del sCD4 era 45 minutos después de la
administración intravenosa, 9,4 horas después de la administración
intramuscular y 10,3 horas después de haber administrado el fármaco
por vía subcutánea (14, 15). Estudios antivirales llevados a cabo
preliminarmente han sido no convincentes en lo que respecta al
recuento de células de CD4 y a los niveles de antígeno del HIV.
Debido a que no se alcanzó la dosis máxima tolerada, el efecto
antiviral del sCD4 puede haber sido subestimado, en especial a la
luz de resultados recientes obtenidos concernientes a diferencias
en cuanto a concentraciones de sCD4 requeridas para inhibir cepas
de laboratorio de HIV-1 en comparación con aislados
virales primarios (16).
Aun cuando estos estudios con sCD4 in
vitro y estudios clínicos en el hombre y en primates, han
producido resultados alentadores, han definido también diversas
limitaciones. En primer lugar, la semivida sérica medida de sCD4 es
relativamente corta. En segundo lugar, el sCD4 es monovalente con
respecto a la unión de gp120 en contraste con la CD4 de la
superficie celular y la gp120 de la superficie viral que son
polivalentes. En tercer lugar, el sCD4 no es citotóxico para
células infectadas con HIV. En cuarto lugar, el sCD4 no puede
atravesar la placenta en un grado significante. Por consiguiente,
han sido descritas moléculas quiméricas de CD4 que toman ventaja
de la naturaleza semejante a la de las inmunoglobulinas, de la CD4
y de varias propiedades beneficiosas de las propias inmunoglobulinas
(es decir, fusiones de inmunogolulinas-CD4).
Las inmunoglobulinas, o anticuerpos, son las
moléculas de unión con antígenos, producidas por linfocitos B que
comprenden la respuesta inmunitaria humoral. La unidad básica de
una molécula de inmunoglobulina consiste en dos cadenas pesadas
idénticas y dos cadenas ligeras idénticas. El extremo amino
terminal de cada una de las cadena contiene una región de secuencia
variable de aminoácidos (región variable). Las regiones variables
de las cadenas pesadas y ligeras interaccionan formando dos sitios
de unión antigénica. El extremo carboxilo terminal de cada cadena
contiene una región de secuencia constante de aminoácidos (región
constante). La cadena ligera contiene un único dominio constante,
mientras que el dominio constante de la cadena pesada está
subdividido en cuatro dominios separados (CH1, bisagra, CH2 y CH3).
Las cadenas pesadas de las moléculas de inmunoglobulinas son de
varios tipos, incluyendo mu (M), delta (D), gamma (G), alfa (A) y
épsilon (E). Las cadenas ligeras de las moléculas de las
inmunoglobulinas son de dos tipos, kappa o lambda. Dentro de los
tipos individuales de las cadenas pesadas y ligeras existen
subtipos que pueden diferir en la función efectora. Una molécula
de inmunoglobulina reunida deriva su nombre del tipo de cadena
pesada que posee.
El desarrollo de anticuerpos monoclonales ha
obviado la heterogeneidad inherente a los anticuerpos obtenidos de
suero de animales o del hombre. No obstante, la mayor parte de los
anticuerpos monoclonales están derivados de células de origen
murino y por consiguiente son inmunógenos cuando se administran al
hombre. Desarrollos más recientes que combinan las técnicas de
genéticas moleculares con la tecnología de los anticuerpos
monoclonales, han llevado a la producción de anticuerpos quiméricos
"humanizados" in vitro. En estos anticuerpos
quiméricos, los dominios variables de las cadenas pesadas y ligeras
de inmunoglobulinas humanas están reemplazados con dominios
variables específicos de cadenas pesadas y ligeras procedentes de
un anticuerpo monoclonal murino (17-19). El
resultado de esta manipulación genética es una molécula con
especificidad para un antígeno particular y las características de
inmunoglobulinas humanas.
Los análisis secuenciales y estructurales de la
CD4 indican que los cuatro dominios extracelulares son semejantes a
los de las inmunoglobulinas. Dado que la porción Fc de las
inmunoglobulinas regula el grado de catabolismo de las moléculas
(semivida sérica que varía desde 14 a 21 días) y proporciona
diversas funciones efectoras, varios informes describen el
reemplazo de dominios variables y constantes de inmunoglobulinas
con los dominios de CD4 semejantes a los de las inmunoglobulinas
(21-24).
Han sido descritas proteínas de fusión de las
cadenas pesadas de IgG1-CD4 que dan por resultado
dímeros quiméricos de la cadena pesada gamma1 (21). Estas moléculas
contienen el dominio CH1 de la cadena pesada gamma1 además de los
dominios de bisagra, CH2 y CH3. Sin embargo, el conjunto de las
cadenas pesadas y la secreción desde células de mamífero es menos
eficaz si el dominio CH1 es expresado en ausencia de cadenas
ligeras (25) Seguidamente, se ha descrito una proteína de fusión de
la cadena pesada de IgG1-CD4 que carece del dominio
CH1 y de los cinco primeros aminoácidos de la región de bisagra,
que era secretada en niveles altos (22). Estas proteínas de fusión
retienen varias funciones efectoras de las moléculas de
inmunoglobulinas, tales como unión del receptor Fc, citotoxicidad
mediada por células, dependiente de anticuerpos (ADCC) hacia
células infectadas con el HIV-1, y transferencia
placentaria por medio de un mecanismo dependiente del receptor Fc
(22). También han sido descritas proteínas de fusión de la cadena
pesada de IgM-CD4 (26). Además, han sido descritas
proteínas de fusión de IgG1-CD4, en las que los
dominios V1V2 de la CD4 están fusionados con los dominios CH1, de
bisagra, CH2 y CH3 de una cadena pesada gamma1, y en las que los
dominios V1V2 de la CD4 están fusionados con el dominio constante
de una cadena ligera kappa (29),
También han sido construidas proteínas de fusión
que ligan la CD4 a toxinas, y han sido ensayadas para determinar su
capacidad de matar células infectadas con HIV. En un estudio, se
copuló sCD4 a la cadena A desglicosilada de la ricina que inactiva
ribosomas, inhibiendo con ello la síntesis de proteínas y matando la
célula (27). Se ha indicado que esta proteína de fusión lisa
específicamente células infectadas con cinco aislados de HIV
diferentes, pero que no era tóxica para las células sin infectar. En
otro estudio, los dominios V1V2 de la CD4 fueron copulados a los
dominios II y III de la exotoxina A de Pseudomonas (28). Se ha
indicado que esta proteína de fusión se une específicamente e
inhibe la síntesis de proteínas en células que expresan la
glicoproteína gp120 de la cubierta del HIV (25).
Está bien establecido que los monocitos y
macrófagos (M/M) humanos que expresan CD4 de la superficie, pueden
ser infectados por el HIV y sirven de depósito de infección y de
vehículo para la propagación viral (29). Además, los M/M humanos
contienen también receptores Fc que son responsables de la unión a
moléculas específicas de IgG mediante su porción Fc (véase la Tabla
1). El receptor Fc de alta afinidad (FcRI) se une a IgG monómera e
IgG complejada (antígeno más anticuerpo). El orden de grado de
afinidad del FcRI para isotipos de IgG es IgG1 = IgG3 > IgG4, y
no interacciona con IgG2. El receptor Fc de baja afinidad (FcRII)
se une a IgG monómera con menor afinidad que a IgG en forma
complejada. El orden de grado de afinidad es que la unión de IgG1 e
IgG3 es mayor que el de IgG2 ó IgG4 (30).
| (Tabla abreviada según Gergely J. y Sarmay G. (1990) |
| FASEB J. 4:3275. |
Debido a la demostración reciente de que los
sueros de pacientes HIV+ contienen anticuerpos de título bajo que
reconocen la glicoproteína de la cubierta del HIV, se ha observado
que la infección de M/M es intensificada por anticuerpos
anti-HIV de título bajo, presumiblemente por unión
cruzada del HIV y el receptor Fc (31). La infección intensificada
de macrófagos por virus del dengue, el virus de la fiebre amarilla
y el virus de Sindbis, está bien documentada in vitro así
como también en los monos Rhesus (32). Se ha demostrado que tal
intensificación tiene lugar en presencia de anticuerpos
subneutralizantes para estos virus, lo que sirve para la
opsonización de los virus y fijarles a los FcRs (o receptores de
complemento) sobre la superficie de la célula. En el caso de HIV,
está unión cruzada sirve para concentrar el HIV sobre la superficie
de los M/M, después de lo cual el virus es capaz de utilizar la
CD4 para entrar en la célula, dado que el sCD4 es capaz de inhibir
la intensificación apreciada con anticuerpos de título bajo
(31).
Recientemente, Byrn et al. (22) han
producido una quimera de CD4-IgG del isotipo IgG1,
para aumentar la semivida plasmática del sCD4 así como para conferir
funciones efectoras a la molécula quimérica. Por consiguiente esta
molécula posee el potencial de unirse a los receptores Fc situados
sobre la superficie de los M/M, y ocasionar potencialmente un
aumento de la infección de estos tipos de células. Debido a que la
infección intensificada de estos tipos de células es una
consideración a tomar en cuenta en el desarrollo de nuevos
tratamientos terapéuticos, el objetivo de para diseñar una molécula
de IgG-CD4 fue usar el tipo IgG2, que posee una
aptitud disminuida grandemente para unirse a los receptores Fc de
M/M (30). Además, los anticuerpos de la IgG2 humana muestran carecer
de una variación alotípica importante, mientras que los
anticuerpos de la IgG1 humana contienen variaciones alotípicas
(33). Por tanto, para evitar respuestas inmunógenas potenciales
para moléculas recombinantes que contienen dominios de
inmunoglobulinas, se ha escogido una molécula que es al menos
polimórfica y posee una capacidad disminuida para concentrar el HIV
sobre la superficie del macrófago.
En segundo lugar, observaciones similares de
infección intensificada de niños todavía por nacer puede
demostrarse también para inmunoadhesiones de
IgG1-CD4 administradas a madres embarazadas. Por
ejemplo, está bien documentado que la membrana plasmática
sinctiotrofoblástica placentaria contiene receptores Fc (30).
Debido a que el transporte materno-fetal de
inmunoglobulinas está restringido principalmente a la clase de IgG,
se opina que puede conseguirse inmunidad pasiva mediante transporte
específico a través de la placenta por medio de un mecanismo
específico transcitótico del receptor Fc. Además, se muestra que
los receptores Fc situados sobre la membrana sincitiotrofoblástica
placentaria son selectivos ya que las inmunoglobulinas del tipo
IgG1 tienen una afinidad de unión para el receptor
10-20 veces superior. En efecto, de todos los
subtipos de la IgG, la IgG1 y 3 poseen la máxima afinidad para el
receptor, seguida de la IgG4, y finalmente la IgG2 (30). Estos
resultados son concordantes con los obtenidos de la clonación del
FcR procedente de una placenta humana, lo que indica que el
receptor es muy similar al tipo FcRII encontrado en M/M. Aun cuando
pudiera argumentarse que el transporte transplacentario de
inmunoglobulina puede ser beneficioso para el feto en el útero,
también pudiera argumentarse que la inmunoglobulina específica
materna generada frente a un agente patógeno específico (tal como
el HIV), podría facilitar el transporte a través de la placenta
mediante un mecanismo dependiente del Fc, incrementando la infección
del feto, de un modo similar al mecanismo que se ha desarrollado
para el transporte de IgA a través de los epitelios, mediante el
receptor poli Ig (34). Así pues, las proteínas de fusión de
IgG1-CD4 específicas, que se ha demostrado que
atraviesan la placenta y se concentran en la sangre fetal (22),
pueden ser perjudiciales para el feto, al proporcionar al HIV un
mecanismo nuevo para atravesar la barrera placentaria.
Se ha descubierto ahora que un homodímero
específico de las cadenas pesadas quiméricas
gamma2-CD4, proporciona ventajas relativas a las de
los homodímeros de las cadenas pesadas de IgG1-CD4,
descritos hace más de un año. Específicamente, se ha construido un
homodímero de las cadenas pesadas quiméricas
gamma2-CD4 que contiene los dominios V1V2 de la CD4
y que se ajusta de modo eficaz intracelularmente y es secretado
eficazmente desde células de mamífero como un homodímero,
permitiendo alta recuperación y purificación desde el medio de
células que expresan este homodímero de cadenas pesadas
quiméricas. Para construir este homodímero, se han utilizado los
dominios completos de bisagra, CH2 y CH3 procedentes de una cadena
pesada gamma2 humana, lo que da por resultado una molécula
quimérica que contiene los dominios constantes de una molécula de
IgG2 humana responsable de la dimerización y de la secreción eficaz.
Este hecho está en contraste con los dímeros de cadenas pesadas
descritos por Capon y Gregory (20) que incluyen el dominio CH1 en
el dímero de cadenas pesadas de IgG1-CD4, que da
por resultado mala secreción y recuperación desde el medio de
cultivo celular, de la molécula recombinante. También se ha
incluido el dominio de bisagra completo de las cadenas pesadas
gamma2 en el homodímero de las cadenas pesadas quiméricas
gamma2-CD4 de esta invención, para proporcionar una
dimerización eficiente, ya que los restos de cisteína contenidos en
este dominio son responsables de la formación de los puentes
disulfuro con la segunda cadena del homodímero, posicionando las dos
cadenas en la alineación espacial correcta y facilitando la
formación del sitio de combinación del antígeno.
Además, por inclusión del dominio de bisagra
completo, se ha mantenido la flexibilidad segmentaria de los dímeros
de las cadenas pesadas, permitiendo de este modo la modulación de
funciones biológicas tales como la activación de complemento y la
unión del receptor Fc (29).
Puesto que las inmunoglobulinas IgG2 poseen una
capacidad de unión a los receptores Fc sobre monocitos, macrófagos y
membranas placentarias grandemente disminuida, la construcción de
un homodímero de las cadenas pesadas quiméricas
gamma2-CD4 y un heterotetrámero quimérico de
IgG2-CD4 da por resultado proteínas quiméricas con
muchas ventajas que los homodímeros de las cadenas pesadas
quiméricas gamma1-CD4 ó los heterotetrámeros
quiméricos de IgG1-CD4 no pueden poseer (20, 23,
24, 26). Además, la IgG2 humana es significativamente menos
polimórfica que otros tipos de IgG y por tanto es menos probable
que sea inmunógena cuando se administra a seres humanos. Este hecho
está en contraste con la IgG1 humana que contiene muchos alotipos y
posee una mayor probabilidad de ser inmunógena cuando se administra
a seres humanos.
Además de los homodímeros de las cadenas pesadas
quiméricas gamma2-CD4, se han construido también
cadenas pesadas de IgG2-CD4, que contienen los
dominios V1V2 de CD4 fusionados a los dominios CH1, de bisagra, CH2
y CH3 de las cadenas pesadas gamma2 humanas. Estas moléculas
codifican un heterotetrámero quimérico de IgG2- CD4, y cuando son
co-expresadas en presencia de cadenas ligeras
quiméricas kappa-CD4 que contienen los dominios V1
y V2 de CD4 fusionados al dominio constante completo de cadenas
ligeras kappa humanas (o cadenas ligeras lambda), permiten la
producción de dicho heterotetrámero. Este heterotetrámero comprende
dos cadenas pesadas quiméricas de IgG2-CD4 y dos
cadenas ligeras quiméricas kappa-CD4. La producción
de cadenas pesadas que contienen el dominio CH1 permite la
asociación eficiente con las cadenas ligeras quiméricas
kappa-CD4, lo que da por resultado la secreción
eficiente de un heterotetrámero quimérico de
IgG2-CD4. Estos heterotetrámeros quiméricos de
IgG2-CD4 poseen semividas séricas aumentadas y
avidez incrementada para el HIV en comparación con los dímeros de
las cadenas pesadas.
Esta invención proporciona un vector de expresión
que codifica las cadenas pesadas de un heterotetrámero quimérico de
IgG2-CD4. Finalmente, esta invención proporciona un
vector de expresión que codifica las cadenas ligeras de un
heterotetrámero quimérico de IgG2-CD4.
Figura 1: A) Estructura del dominio del gen de la
cadena pesada quimérica gamma2-CD4- B) Estructura
de la proteína del homodímero de la cadena pesada quimérica
gamma2-CD4. La secuencia que se indica por debajo es
el código de aminoácidos de una sola letra de la unión entre la CD4
(phe179) y la región de bisagra de la cadena pesada gamma2 humana.
Nótese que la región de bisagra de una cadena pesada gamma2 contiene
cuatro cisteínas (véase el texto para una discusión). Abreviaturas:
L, secuencia conductora (señal) de CD4 humana; V1V2, dominios
semejantes a los de la región variable del extremo amino terminal
de CD4 humana; H, región de bisagra de la cadena pesada gamma2
humana; CH2 y CH3, segunda y tercera regiones constantes de la
cadena pesada gamma2 humana.
Figura 2: Estructura de los dominios de genes
quiméricos usados para expresar el heterotetrámero quimérico de
IgG2-CD4. Parte superior, gen de la cadena pesada
quimérica gamma2-CD4; parte inferior, gen de la
cadena ligera quimérica kappa-CD4. B) Estructura de
la proteína del heterotetrámero quimérico de
IgG2-CD4. Abreviaturas;
CH1-CH2-CH3, primera, segunda y
tercera regiones constantes de la cadena pesada gamma2 humana;
C-kappa, región constante de la cadena ligera kappa
humana.
Figura 3: DNA y secuencia proteínica predicha de
un homodímero de la cadena pesada quimérica gamma2- CD4 (una
cadena). Los números al final de cada línea indican las posiciones
de los nucleótidos. Los números por encima de cada línea indican las
posiciones de los aminoácidos (se dan en el código de una sola
letra). Los dominios de la proteína están indicados mediante
flechas por encima de las secuencias.
Figura 4: DNA y secuencia predicha de la proteína
de una cadena pesada quimérica IgG2-CD4 del
heterotetrámero quimérico de IgG2-CD4. Los números
al final de cada línea indican las posiciones de los nucleótidos.
Los números por encima de cada línea indican las posiciones de los
aminoácidos (se dan en el código de una sola letra). Los dominios
de la proteína se indican mediante flechas por encima de las
secuencias.
Figura 5: DNA y secuencia predicha de la proteína
de una cadena ligera quimérica kappa-CD4 del
heterotetrámero quimérico de IgG2-CD4. Los números
al final de cada línea indican las posiciones de los nucleótidos.
Los números por encima de cada línea indican las posiciones de los
aminoácidos (se dan en el código de una sola letra). Los dominios
de la proteína se indican mediante flechas por encima de las
secuencias.
Figura 6: Secreción de homodímero de las cadenas
pesadas quiméricas gamma2-CD4 procedente de células
transfectadas. Células Cos-M5 fueron transfectadas
de modo simulado, transfectadas con DNA del vector de expresión en
mamífero de las cadenas pesadas quiméricas
gamma1-CD4, o transfectadas con
CD4-IgG2-pcDNA1. Al cabo de
48-72 horas después de la transfección, las células
fueron radiomarcadas con ^{35}S-metionina. El
medio radiomarcado se precipitó con glóbulos de Proteína
A-Sepharose. Las proteínas precipitadas fueron
analizadas mediante SDS-PAGE en condiciones
reductoras o no reductoras y fueron visualizadas mediante
fluorografía. Calle M, medio procedente de células transfectadas de
modo simulado; Calle 1, medio procedente de células transfectadas
con DNA de vector de expresión en mamífero de las cadenas pesadas
quiméricas gamma1-CD4; Calle 2, medio procedente de
células transfectadas con DNA del CD4-
IgG2-pcDNA1.
Figura 7: Precipitación de gp120 de
HIV-1 con un homodímero de las cadenas pesadas
quiméricas gamma2-CD4. Células
Cos-M5 fueron transfectadas de modo simulado,
transfectadas con DNA del vector de expresión en mamífero de las
cadenas pesadas quiméricas gamma1-CD4, o
transfectadas con el
CD4-IgG2-pcDNA1. Al cabo de
48-72 horas después de la transfección, porciones
alícuotas sin marcar de medio se incubaron con una parte alícuota
de gp120 marcada con ^{35}S-metionina. Los
complejos fueron precipitados con glóbulos de Proteína
A-Sepharose. Los precipitados fueron analizados
después mediante SDS-PAGE seguida de fluorografía.
Calle M, medio procedente de células transfectadas de modo simulado;
Calle 1, medio procedente de células transfectadas con DNA del
vector de expresión en mamífero de las cadenas pesadas quiméricas
gamma1-CD4; Calle 2, medio procedente de células
transfectadas con DNA del
CD4-IgG2-pcDNA1.
Figura 8: Purificación del homodímero de las
cadenas pesadas quiméricas gamma2-CD4 procedente de
medio acondicionado con células CHO. Células CHO estables que
secretaban de modo constitutivo homodímero de las cadenas pesadas
quiméricas gamma1-CD4 u homodímero de las cadenas
pesadas quiméricas gamma2-CD4, fueron cultivadas
en frascos giratorios. Se hizo pasar el medio acondicionado sobre
una columna de Proteína A-Sepharose y el material
que se unió se sometió a elución desde la columna. Las fracciones de
los picos fueron identificadas mediante SDS-PAGE
seguida de tinción con plata y reunidas. Las proteínas purificadas
fueron analizadas luego mediante SDS-PAGE en
condiciones reductoras seguido de tinción con plata. Calle 1;
homodímero de las cadenas pesadas quiméricas
gamma1-CD4; Calle 2, homodímero de las cadenas
pesadas quiméricas gamma2-CD4.
Figura 9: Inhibición de la unión de HIV a células
CEM por moléculas a base de CD4. CD4 soluble (sCD4),
gamma1-CD4 parcialmente purificada o
gamma2-CD4 parcialmente purificada, se ensayaron
para determinar la inhibición de la unión del virus a células
CD4-positivas. El virus unido fue detectado mediante
inmunofluorescencia indirecta y citofluorografía. Los resultados se
expresan como tanto por ciento de inhibición frente a la
concentración del agente inhibidor.
Figura 10: Inhibición de la infección por HIV de
células CD4-positivas mediante moléculas a base de
CD4. sCD4, gamma1-CD4 parcialmente purificada o
gamma2-CD4 parcialmente purificada, se incubaron
con un inóculo de HIV-1 (100 TCID_{50}), y las
mezclas fueron añadidas a linfocitos estimulados con PHA e incubadas
a 37ºC durante la noche. Las células fueron lavadas y depositadas
en placas en microcultivo ( 1 x 10^{5} células/cultivo; 10
cultivos por dilución) y monitorizadas para determinar la
replicación viral reproductiva mediante detección de antígeno de
HIV en sobrenadantes de los cultivos, 8 y 12 días más tarde. Los
resultados se expresan como tanto por ciento de cultivos positivos a
una concentración dada del agente de inhibición.
Figura 11: Purificación del homodímero de las
cadenas pesadas quiméricas gamma2-CD4. Células CHO
estables que secretaban constitutivamente el homodímero de las
cadenas pesadas quiméricas gamma2-CD4, fueron
cultivadas en frascos giratorios. Se hizo pasar el medio
acondicionado sobre una columna de Proteína
A-Sepharose y el material fijado se sometió a
elución desde la columna (véase la Figura 8). Las fracciones de los
picos fueron reunidas después y hechas pasar sobre una columna de
S-Sepharose. Después de lavados extensos, el
homodímero de las cadenas pesadas quiméricas gamma2- CD4 se sometió
a elución con BES 50 mM, pH 7,0, NaCl 500 mM. Las fracciones de los
picos fueron identificadas mediante SDS-PAGE seguida
de tinción con plata, reunidas y concentradas. El homodímero de las
cadenas pesadas quiméricas gamma2-CD4 reunido,
concentrado, se aplicó luego a una columna de Sephacryl
S-300HR previamente equilibrada y se hizo correr
con PBS. La fracción del pico correspondiente al homodímero de
las cadenas pesadas quiméricas gamma2-CD4 se
identificó mediante SDS-PAGE seguida de tinción con
plata. Las fracciones de los picos fueron reunidas entonces y
concentradas. La proteína purificada se analizó luego mediante
SDS-PAGE en condiciones no reductoras y reductoras
seguida de tinción con plata. Calle 1: aproximadamente 1,5 \mug
de proteína analizados en condiciones no reductoras, Calle 2:
aproximadamente 1,5 \mug de proteína analizados en condiciones
reductoras.
Figura 12: Secreción del heterotetrámero
quimérico de IgG2-CD4 a partir de células
transfectadas de modo estable. Células CHO que expresaban de modo
estable tanto las cadenas pesadas quiméricas de
IgG2-CD4 como las cadenas ligeras quiméricas
kappa-CD4, fueron radiomarcadas con
^{35}S-metionina y cisteína. Se precipitó el medio
radiomarcado con glóbulos de Proteína A-Sepharose.
(A) Las proteínas precipitadas fueron analizadas mediante
SDS-PAGE en condiciones no reductoras y fueron
visualizadas mediante fluorografía. Calle 1: medio procedente de
células CHO sin transfectar, Calle 2: medio procedente de células
que expresan de modo estable tanto las cadenas pesadas quiméricas
IgG2-CD4 como las cadenas ligeras quiméricas
kappa-CD4. (B) Una muestra idéntica a la de la
calle 2 de (A) se ensayó sobre SDS-PAGE en
condiciones no reductoras. La calle procedente de este gel de
SDS-PAGE se cortó y las proteínas fueron reducidas
por incubación de la porción cortada del gel durante 45 minutos a
4ºC en solución tampón de equilibración (Tris-HCl
62,5 mM, pH 6,8, SDS al 2,3%, \beta-mercaptoetanol
al 5%, glicerina al 10%). Después de incubar la porción cortada del
gel en condiciones reductoras, las proteínas contenidas en el gel
fueron analizadas por SDS-PAGE y visualizadas
mediante fluorografía.
Cinco vectores de expresión y dos plásmidos
designados CD4-IgG2-Rf,
CD4-IgG1-Rf,
CD4-IgG1HC-pRcCMV,
CD4-IgG2HC-pRcCMV,
CD4-kLC-pRcCMV,
CD4-IgG1-pcDNA1 y
CD4-IgG2-pcDNA, respectivamente,
han sido depositados con la American Type Culture Collection,
Rockville, Maryland, U.S.A. 20852, con los Nos. de Catálogo 40949,
40950, 75192, 75193, 75194, 40951 y 40952, respectivamente. Estos
depósitos fueron hechos según las estipulaciones del Tratado de
Budapest sobre el Reconocimiento Internacional del Depósito de
Microorganismos con Fines de Procedimiento de Patentes (Tratado de
Budapest).
La solicitud describe una vector de expresión
designado CD4-IgG2-pcDNA1 (ATCC No.
40951) que codifica un homodímero de las cadenas pesadas quiméricas
gamma2-CD4, así como también un homodímero de las
cadenas pesadas quiméricas gamma2-CD4 codificado por
este vector de expresión o cualquier otro vector de expresión que
tenga la misma región codificadora de DNA insertada en el él.
Específicamente, la invención proporciona vectores de expresión
designados CD4-IgG2HC-pRcCMV (ATCC
No. 75193), y CD4-kLC-pRcCMV (ATCC
No. 75194), que codifican una cadena pesada quimérica de
IgG2-CD4 y una cadena ligera quimérica
kappa-CD4. La invención proporciona adicionalmente
un heterotetrámero quimérico de IgG2-CD4 codificado
por estos vectores de expresión o cualquier otro vector de expresión
que posea la misma región codificadora de DNA insertado en él.
Según la invención, pueden emplearse para la
expresión numerosos sistemas vectores. Por ejemplo, una clase de
vectores utiliza elementos de DNA que han sido derivados de virus
animales tales como el virus del papiloma bovino, Polyomavirus,
adenovirus, virus vaccinia, baculovirus, retrovirus (RSV, MMTV
o MOMLV) o virus SV40. Adicionalmente, células que han integrado de
modo estable el DNA en sus cromosomas pueden ser seleccionadas por
introducción de uno o más marcadores que permitan la selección de
células huésped transfectadas. El marcador puede proporcionar
prototrofía a un hospedante auxotrófico, resistencia a biocidas, por
ejemplo, antibióticos, o resistencia a los metales pesados tales
como el cobre o semejante. El gen del marcador seleccionable puede
o bien ser ligado directamente a las secuencias de DNA a ser
expresadas, o puede ser introducido en la misma célula mediante
cotransformación. También pueden necesitarse elementos adicionales
para una síntesis óptima de mRNA. Estos elementos pueden incluir
señales de corte y empalme, así como promotores de la
transcripción, intensificadores, y señales de la terminación. Los
vectores de expresión de cDNA que incorporan tales elementos
incluyen aquellos descritos por Okayama. (37).
Así pues, esta solicitud describe un método de
producción de un homodímero de la cadena pesada quimérica
gamma2-CD4. Este método comprende:
- (a)
- transfectar una célula de mamífero con un vector de expresión para producir el homodímero de la cadena pesada quimérica gamma2-CD4;
- (b)
- cultivar la célula de mamífero transfectada que resulta en condiciones tales que se produce el homodímero de la cadena pesada quimérica gamma2- CD4; y
- c)
- recuperar el homodímero de la cadena pesada quimérica gamma2-CD4 producido de este modo.
Una vez que el vector o secuencia de DNA que
contiene las construcciones, ha sido preparado para expresión, los
vectores de expresión pueden ser transfectados o introducidos en un
hospedante de célula de mamífero apropiado. Diversas técnicas
pueden ser empleadas tales como fusión de protoplastos,
precipitación con fosfato de calcio, electroporación u otras
técnicas convencionales. En el caso de fusión de protoplastos, las
células se hacen crecer en medios y se someten a una operación de
cribado para seleccionar la actividad apropiada. La expresión del
gen o genes da por resultado la producción de la proteína de fusión
que corresponde a una cadena del homodímero de la cadena pesada
quimérica gamma2-CD4. Esta proteína de fusión puede
tratarse después para formar el homodímero de la cadena pesada
quimérica.
Además, métodos y condiciones para cultivar las
células transfectadas que resultan y para recuperar el homodímero
de la cadena pesada quimérica, son bien conocidos por los expertos
en la técnica y pueden ser variados u optimizados dependiendo del
vector de expresión y de la célula huésped de mamífero, específicos,
empleados.
Las células huésped preferidas para expresar los
homodímeros de las cadenas pesadas quiméricas son líneas
celulares de mamífero, incluyendo, por ejemplo, la línea CV1 de
riñón de mono transformada por el SV40 (COS-7); la
línea 293 de riñón embrionario humano; las células de riñón de
hámster joven (BHK); las células de ovario de hámster
chino-DHFR (CHO); las células de riñón de mono
(CV1); las células de riñón de mono verde Africano
(VERO-76); las células del carcinoma cervical humano
(HELA); las células de riñón canino (MDCK); las células de pulmón
humano (W138); las células de hígado humano (Hep G2); el tumor
mamario del ratón (MMT 060562); la línea celular de ratón (C127) y
las líneas celulares de mielomas.
La solicitud describe además un método de
inhibición de la infección por HIV de una célula CD4+, que comprende
tratar la célula CD4+ con el homodímero de la cadena pesada
quimérica gamma2-CD4 en una cantidad que es eficaz
para inhibir la infección de la célula.
Adicionalmente, la solicitud describe un método
de prevenir que un sujeto sea infectado con HIV, que comprende
administrar al sujeto el homodímero de la cadena pesada quimérica
gamma2-CD4, en una cantidad que es eficaz para
prevenir que el sujeto sea infectado con HIV.
Aun cuando la solicitud describe la
administración del homodímero de la cadena pesada quimérica a varios
sujetos, son de interés particular los pacientes de SIDA. Además,
son bien conocidos en la técnica métodos de administración del
homodímero e incluyen, simplemente a título de ejemplo, la
inyección subcutánea, intramuscular e intravascular, sola o en
mezcla con otros agentes tales como la AZT o el DDI.
Además, se proporciona un método de tratamiento
de un sujeto infectado con HIV para bloquear así la propagación de
la infección por HIV, que comprende administrar al sujeto una
cantidad del homodímero de la cadena pesada quimérica
gamma2-CD4, en una cantidad que es eficaz para
bloquear la propagación de la infección por HIV.
Por ejemplo, el homodímero puede administrarse a
pacientes que tienen infección por HIV en una dosis capaz de
mantener una concentración de más de aproximadamente 100 ng de
homodímero de la cadena pesada quimérica
gamma2-CD4/ml de plasma. Para variantes del
homodímero de la cadena pesada quimérica gamma2-CD4
de pesos moleculares diferentes, se administran, aproximadamente, 2
picomoles de receptor soluble por ml de plasma, una cantidad
suficiente, por ejemplo, para establecer una equivalencia
estequiométrica con receptor nativo (unido a membranas) y receptor
soluble. Típicamente, la dosis de CD4 soluble es, aproximadamente,
100 \mug/kg de peso de paciente/día.
El método anterior puede usarse para ayudar a
prevenir la propagación del virus HIV dentro del cuerpo de un
paciente infectado con HIV. Adicionalmente, el homodímero de la
cadena pesada quimérica gamma2- CD4 puede ser administrado como una
medida profiláctica para hacer que la sangre de un sujeto sea menos
susceptible a la propagación del virus HIV. Tal administración
profiláctica incluye la administración tanto antes del contacto con
el HIV como poco después, o ambas.
Se proporciona, además, una composición
farmacéutica que comprende el homodímero de la cadena pesada
quimérica gamma2-CD4 en una cantidad eficaz para
inhibir la infección por HIV de una célula CD4+, y un vehículo
farmacéuticamente aceptable.
En la técnica a la que pertenece la presente
invención son bien conocidos vehículos farmacéuticamente
aceptables, e incluyen, aun cuando no se limitan a ellos, solución
tampón de fosfato 0,01-0,1M y, de preferencia,
0,05M, o solución salina al 0,8%. Adicionalmente, tales vehículos
farmacéuticamente aceptables pueden ser soluciones, suspensiones y
emulsiones, acuosas o no acuosas. Son ejemplos de disolventes no
acuosos propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales tales
como el aceite de oliva, y ésteres orgánicos inyectables tales como
oleato de etilo. Los vehículos acuosos incluyen agua, soluciones,
emulsiones o suspensiones hidroalcohólicas, incluyendo solución
salina y medios tamponados. Los vehículos parenterales incluyen
solución de cloruro de sodio, dextrosa de Ringer, dextrosa y
cloruro de sodio, lactado de Ringer o aceites fijos. Los
vehículos intravenosos incluyen rellenadores fluidos y nutrientes,
rellenadores electrolíticos tales como los basados en dextrosa de
Ringer, y semejantes. También pueden encontrarse presentes agentes
conservantes y otros aditivos, tales como, por ejemplo, agentes
antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes, gases inertes, y
semejantes. (38).
La solicitud proporciona, además, una composición
de materia que comprende un homodímero de la cadena pesada
quimérica gamma2-CD4 y una toxina ligada al
mismo.
Son algunos ejemplos de toxinas, la cadena A
desglicosilada de la ricina, los dominios II ó III de la exotoxina A
de Pseudomonas, la toxina diftérica o una citotoxina no
peptidílica. Estas toxinas pueden ser ligadas utilizando agentes
convencionales de reticulación de proteínas in vitro (39
-41), Adicionalmente, las toxinas pueden ser ligadas mediante
síntesis recombinante tal como una proteína de fusión (véase, por
ejemplo, la patente de EE.UU. 4.765.382).
La solicitud proporciona también un reactivo de
diagnóstico que comprende un homodímero de las cadenas pesadas
quiméricas gamma2-CD4 y un marcador detectable
ligado al mismo. Empleando una molécula que se una al virus HIV y
adicionalmente tenga fijado a ésta un marcador detectable, pueden
identificarse células n infectadas con HIV. Los ejemplos de
marcadores convencionales detectables incluyen radioisótopos tales
como I125, cromóforos y fluoróforos.
Así pues, el homodímero de la cadena pesada
quimérica puede ser utilizado en un ensayo para detectar infección
viral de HIV o SIV en una muestra biológica, poniendo en contacto
una muestra procedente de un animal sospechoso de padecer infección
por HIV o SIV, con el homodímero de la invención, y detectando si
se forma un complejo con la gp120, o bien solo o sobre la
superficie de una célula infectada con HIV. Para este fin el
homodímero puede ser marcado con un marcador detectable o puede
estar sin marcar y ser detectado luego con otro reactivo que esté
marcado detectablemente y que este dirigido específicamente al
homodímero o a un complejo entre éste y la gp120.
Por ejemplo, una muestra biológica puede ser
tratada con nitrocelulosa u otro soporte sólido que sea capaz de
inmovilizar células, partículas de células o una proteína soluble.
El soporte puede lavarse después con soluciones tampón adecuadas
seguido de tratamiento con el homodímero de la cadena pesada
quimérica que puede estar marcado detectablemente. El soporte de la
fase sólida puede lavarse luego con solución tampón por segunda vez
para separar la proteína de fusión que no ha sido unida y detectarse
el homodímero marcado.
Para llevar a cabo el ensayo pueden emplearse las
etapas siguientes:
- a)
- poner en contacto con un soporte sólido una muestra sospechosa de contener gp120, para efectuar la inmovilización sobre su superficie de la gp120, o de células que expresan gp120;
- b)
- poner en contacto dicho soporte sólido con el homodímero de la cadena pesada quimérica marcado detectablemente;
- c)
- incubar dicho homodímero marcado detectablemente con dicho soporte durante un período de tiempo suficiente para permitir que el homodímero se una a la gp120 o la célula inmovilizada que expresa gp120 sobre su superficie;
- d)
- separar el soporte de la fase sólida de la mezcla de incubación obtenida en la etapa c); y
- e)
- detectar el homodímero marcado, unido, detectando con ello la gp120.
Tal método puede tomar la forma de un ensayo
cualitativo o cuantitativo usando métodos conocidos en la
técnica.
Alternativamente, el complejo marcado de
homodímero-gp120 puede ser separado de una mezcla de
reacción poniendo en contacto el complejo con un anticuerpo
inmovilizado o una proteína inmovilizada que sea específico para una
inmunoglobulina o, por ejemplo, proteína A, proteína G, o
anticuerpos anti-IgG. Tales anticuerpos
anti-inmunoglobulina pueden ser monoclonales o
policlonales. Luego el soporte sólido puede ser lavado con
soluciones tampón adecuadas obteniendo un complejo inmovilizado de
gp120-homodímero marcado-anticuerpo.
La marca sobre el homodímero puede detectarse entonces midiendo de
este modo la gp120 endógena, y detectando con ello la presencia de
HIV.
Asimismo se describe un método para detectar en
una muestra una infección viral por HIV o SIV, que comprende:
- a)
- poner en contacto una muestra sospechosa de contener gp120, con un homodímero de las cadenas pesadas quiméricas gamma2- CD4, descrito en esta memoria, y la porción Fc de una cadena de una inmunoglobulina; y
- b)
- detectar si se ha formado un complejo.
La solicitud proporciona también un método de
detectar gp120 en una muestra, que comprende:
- a)
- poner en contacto una muestra obtenida poniendo en contacto una muestra sospechosa de contener gp120 con un homodímero de esta invención, y la porción Fc de una cadena de una inmunoglobulina, con una molécula de unión de Fc, tal como un anticuerpo, una proteína A o una proteína G, inmovilizada sobre un soporte de fase sólida y que es específico del homodímero, obteniendo un complejo de anticuerpo inmovilizado gp120-homodímero,
- b)
- lavar el soporte de fase sólida obtenido en la etapa (a) para separar el homodímero sin unir; y
- c)
- detectar el homodímero.
Como es natural, las concentraciones específicas
de homodímero sin marcar o marcado detectablemente y de gp120, la
temperatura y el tiempo de incubación, así como otras condiciones
del ensayo, pueden ser variadas dependiendo de diversos factores
que incluyen la concentración de gp120 en la muestra, la naturaleza
de la muestra y factores semejantes. Los expertos en la técnica son
capaces, con facilidad, de determinar las condiciones del ensayo
operativas y óptimas para cada determinación.
También se proporciona un ensayo inmunoadsorbente
con enzimas ligadas (ELISA) para detectar y cuantificar CD4 soluble
(sCD4) o proteínas quiméricas de CD4. Para llevar a cabo el
ensayo, el proceso comprende:
- a)
- poner en contacto con un soporte sólido una muestra que contienen sCD4, para inmovilizar la sCD4 soluble;
- b)
- poner en contacto dicho soporte sólido con el anticuerpo monoclonal marcado detectablemente OKT4a solo, o con una muestra que contiene sCD4 o proteínas quiméricas de CD4 y OKT4a;
- c)
- incubar dicho medio que contiene OKT4a marcado detectablemente durante un período de tiempo suficiente para permitir la unión a la sCD4 inmovilizada;
- d)
- separar el soporte de fase sólida de la mezcla de incubación de la etapa (c);
- e)
- detectar el OKT4a unido, cuantificando con ello la cantidad de CD4 que contiene la muestra.
La invención proporciona un vector de expresión
que codifica las cadenas pesadas de un heterotetrámero quimérico de
IgG2-CD4, designado
CD4-IgG2HC-pRcCMV (ATTC No. 75193).
La invención proporciona también un heterotetrámero quimérico de
IgG2-CD4 cuyas cadenas pesadas están codificadas por
este vector de expresión u otro vector que contenga la misma
secuencia codificadora.
Adicionalmente, la invención proporciona un
vector de expresión que codifica las cadenas ligeras de un
heterotetrámero quimérico de IgG2-CD4, designado
CD4-kLC-pRcCMV (ATCC No. 75194).
Finalmente, la invención proporciona un heterotetrámero quimérico
de IgG2-CD4, cuyas cadenas ligeras están codificadas
por el vector de expresión
CD4-kLC-pRcCMV u otro vector que
contenga la misma secuencia codificadora.
Además, la invención proporciona un
heterotetrámero quimérico de IgG2-CD4 ambas de cuyas
cadenas pesadas y ligeras están codificadas por los vectores de
expresión antes citados.
La invención proporciona, además, un método de
producción de un heterotetrámero quimérico de
IgG2-CD4 tal. Este método comprende:
- a)
- cotransfectar una célula de mamífero con el vector de expresión para producir las cadenas ligeras de un heterotetrámero quimérico de IgG2-CD4 y un vector de expresión que codifica una cadena ligera;
- b)
- cultivar la célula de mamífero cotransfectada que resulta, en condiciones tales que se produce el heterotetrámero quimérico de IgG2-CD4; y
- c)
- recuperar el heterotetrámero quimérico de IgG2-CD4 producido de este modo.
Son bien conocidos en la técnica métodos de
cotransfección de células de mamífero, e incluyen los discutidos
anteriormente en esta memoria. De modo semejante, son bien
conocidos en la técnica vectores de expresión que codifican cadenas
ligeras.
\newpage
La invención proporciona adicionalmente, un
método para producir un heterotetrámero quimérico de
IgG2-CD4, que comprende:
- a)
- cotransfectar una célula de mamífero con el vector de expresión para producir las cadenas ligeras de un heterotetrámero quimérico de IgG2-CD4 y con un vector de expresión que codifica una cadena pesada de la IgG1;
- b)
- cultivar la célula de mamífero cotransfectada que resulta, en condiciones tales que se produce un heterotetrámero quimérico de IgG2-CD4; y
- c)
- recuperar el heterotetrámero quimérico de IgG2-CD4 producido de este modo.
Además, la invención proporciona un método de
producir un heterotetrámero quimérico de IgG2-CD4,
que comprende:
- a)
- cotransfectar una célula de mamífero con el vector de expresión para producir las cadenas pesadas de un heterotetrámero quimérico de IgG2-CD4 y un vector de expresión para producir las cadenas ligeras de un heterotetrámero quimérico de IgG2-CD4;
- b)
- cultivar la célula de mamífero cotransfectada que resulta, en condiciones tales que se produce el heterotetrámero quimérico de IgG2-CD4; y
- c)
- recuperar el heterotetrámero quimérico de IgG2-CD4 producido de este modo.
La invención incluye también un método de inhibir
la infección por HIV de una célula CD4+, que comprende tratar la
célula CD4+ o bien con un heterotetrámero quimérico de
IgG2-CD4 cuyas cadenas pesadas está codificadas por
el vector de expresión designado
CD4-IgG2HC-pRcCMV, un
heterotetrámero quimérico de IgG2-CD4 cuyas cadenas
ligeras están codificadas por el vector de expresión designado
CD4-kLC-pRcCMV; o bien un
heterotetrámero quimérico de IgG2-CD4 ambas de cuyas
cadenas pesadas y ligeras están codificadas por ambos de los
vectores de expresión anteriores, en una cantidad eficaz para
inhibir la infección de la célula.
La invención proporciona, además, un método de
evitar que un sujeto sea infectado con el HIV. Este método
comprende administrar al sujeto o bien un heterotetrámero quimérico
de IgG2-CD4, cuyas cadenas pesadas están codificadas
por el vector de expresión designado
CD4-IgG2HC-pRcCMV, un
heterotetrámero quimérico de IgG2-CD4 cuyas cadenas
ligeras están codificadas por el vector de expresión designado
CD4-kLC-pRcCMV, o bien un
heterotetrámero quimérico de IgG2-CD4, ambas de
cuyas cadenas pesadas y ligeras están codificadas por los vectores
de expresión anteriores, en una cantidad que es eficaz para evitar
que el sujeto sea infectado con HIV.
La invención proporciona también un método de
tratamiento de un sujeto infectado con HIV, para bloquear de este
modo la propagación de la infección por HIV. Este método comprende
administrar al sujeto o bien un heterotetrámero quimérico de
IgG2-CD4, cuyas cadenas pesadas están codificadas
por el vector de expresión designado
CD4-IgG2HC-pRcCMV; un
heterotetrámero quimérico de IgG2-CD4 cuyas cadenas
ligeras están codificadas por el vector de expresión designado
CD4-kLC-pRcCMV; o bien un
heterotetrámero quimérico de IgG2-CD4, ambas de
cuyas cadenas ligeras y pesadas están codificadas por los vectores
de expresión antes descritos, en una cantidad eficaz para bloquear
la propagación de la infección por el HIV, por ejemplo, dentro del
sujeto o el cuerpo de un paciente con SIDA.
La invención proporciona también una composición
farmacéutica que comprende o bien un heterotetrámero quimérico de
IgG2-CD4 cuyas cadenas pesadas están codificadas
por el vector de expresión designado
CD4-IgG2HC-pRcCMV; un
heterotetrámero quimérico de IgG2-CD4 cuyas cadenas
ligeras están codificadas por el vector de expresión designado
CD4-kLC-pRcCMV, o bien un
heterotetrámero quimérico de IgG2-CD4 ambas de cuyas
cadenas pesadas y ligeras están codificadas por los vectores de
expresión antes descritos, en una cantidad eficaz para inhibir la
infección por HIV de una célula CD4+, y un vehículo
farmacéuticamente aceptable.
Se proporciona, además, por la invención, una
composición de materia que comprende o bien un heterotetrámero
quimérico de IgG2-CD4 cuyas cadenas pesadas están
codificadas por el vector de expresión designado
CD4-IgG2HC-pRcCMV; un
heterotetrámero quimérico de IgG2-CD4 cuyas cadenas
ligeras están codificadas por el vector de expresión designado
CD4-kLC-pRcCMV, o bien un
heterotetrámero quimérico de IgG2-CD4 ambas de
cuyas cadenas pesadas y ligeras están codificadas por los vectores
de expresión antes descritos, y una toxina ligada a ellos.
En una realización de la invención, la toxina es
la cadena A desglicosilada de la ricina, los dominios II ó III de
la exotoxina A de Pseudomonas, la toxina diftérica o una
citotoxina no peptidílica.
La invención proporciona además un reactivo de
diagnóstico que comprende o bien una heterotetrámero quimérico de
IgG2-CD4 cuyas cadenas pesadas están codificadas
por el vector de expresión designado
CD4-IgG2HC-pRcCMV, o un
heterotetrámero quimérico de IgG2-CD4 cuyas cadenas
ligeras están codificadas por el vector de expresión designado
CD4-kLC-pRcCMV, o bien un
heterotetrámero quimérico de IgG2-CD4 ambas de cuyas
cadenas pesadas y ligeras están codificadas por ambos de esos
vectores de expresión, y un marcador detectable ligado a ellos.
Son ejemplos de marcadores detectables adecuados, radioisótopos,
cromóforos o fluoróforos.
Con objeto de facilitar la comprensión de los
ejemplos que figuran a continuación, ciertos métodos y/o términos o
expresiones que se presentan con frecuencia, están descritos del
mejor modo en la publicación de Maniatis et al. (42).
Esta invención está ilustrada en la sección de
Detalles Experimentales que sigue. Estas secciones se exponen para
ayudar a la comprensión de la invención pero no están destinadas,
ni deben interpretarse en modo alguno, como límites a la invención
tal como se expone en las reivindicaciones que figuran después de
esta exposición.
El cDNA de CD4 humana fue escindido desde el
plásmido pSP6T4 (4) como un fragmento de restricción EcoRI/StuI. Se
aisló el fragmento de 0,70 kilobases y se clonó en M13mp18 digerido
con EcoRI/SmaI. Este vector intermedio (M13mp18(CD4)) fue
aislado después, linearizado con Pst1, purificado y tratado con
Fosfatasa Alcalina Bacteriana (BAP). El fragmento Pst1/Pst1 de 2,0
Kb procedente del plásmido pBr gamma2 que contenía el gen de la
cadena pesada gamma 2 humana (36) (conteniendo los exones de
bisagra, CH2 y CH3) fue aislado y clonado en el vector M13mp18/CD4
tratado con BAP. Los recombinantes resultantes fueron cribados luego
para determinar la orientación correcta del fragmento Pst1 (con
respecto a la secuencia de CD4) obteniendo un vector que contiene,
en tándem, CD4/EcoRI/StuI) - gamma2 (Pst1/Pst1). Para obtener un
gen de la cadena pesada quimérica gamma2- CD4 se llevó a cabo
mutagénesis dirigida al sitio, mediada por oligonucleótidos, para
yustaponer las secuencias de DNA de la cadena pesada gamma2 y CD4,
ligando la secuencia de CD4 en el marco de lectura al exón de
bisagra. La molécula de DNA quimérico que resulta codifica una
proteína que contiene los dominios V1V2 de la CD4 seguido por los
dominios de bisagra, CH2 y CH3 de la cadena pesada gamma2 (Figura 1
A). Se llevó a cabo mutagénesis sobre DNA de una sola cadena aislado
desde el fago recombinante procedente de células TG1 transformadas
(Amersham). En breve, DNA molde fue sometido a hibridación de
extremos complementarios con un oligonucleótido
34-mero
(5'-GACACAACATTTGCGCTCGAAAGCTAGCACCACG-3'),
que contenía secuencias que ligan el último codón que codifica
Phe(179) procedente de V1V2 de CD4 al primer codón de la
bisagra para IgG2 (que codifica Glu) (Figuras 1 A y 3). Después de
la síntesis de la segunda cadena, el DNA de doble cadena se
transformó en células TG1 competentes. Las placas aisladas se
hicieron crecer después en células TG1 de nueva aportación y el DNA
de una sola cadena se purificó para la secuenciación de DNA. Todas
las mutaciones fueron verificadas y confirmadas mediante
secuenciación didesoxi usando el sistema Sequanase (USB). Las placas
que contenían el gen quimérico con la secuencia correcta fueron
cultivados luego en células TG1, y se aisló DNA de Rf desde las
células (designado CD4-IgG2-Rf).
El gen de las cadenas pesadas quiméricas gamma
2-CD4 fue aislado del DNA de Rf recombinante
después de la linearización de Rf con EcoRI. Los sitios EcoRI del
DNA linearizado fueron rellenados con el fragmento de Klenow de DNA
polimerasa I.. El DNA de extremos romos fue ligado luego durante la
noche, a 15 grados Celsius con DNA ligasa T4 a un exceso molar de
100 veces de engarces HindIII. Después de inactivación por calor de
la DNA ligasa T4 durante 15 minutos a 70 grados Celsius, el DNA
engarzado a HindIII fue sometido a digestión, extensamente, con
HindIII para liberar un fragmento que contenía el gen de las cadenas
pesadas quiméricas gamma 2-CD4. Este fragmento de
HindIII fue purificado luego y ligado al vector de expresión
pcDNA-1 (Invitrogen), que previamente había sido
digerido don HindIII y tratado con BAP. El plásmido resultante fue
transformado después en células MC1061/P3. Se aisló DNA plasmídico
desde los clones recombinantes y se llevó a cabo la verificación de
la presencia de la inserción HindIII y la orientación de la
inserción con respecto al promotor de citomegalovirus (CMV)
en el plásmido, mediante análisis con enzima de restricción. El
plásmido de expresión en mamífero resultante que codifica un
homodímero de las cadenas pesadas quiméricas
gamma2-CD4 fue designado
CD4-IgG2-pcDNA1.
Células CosM5 cultivadas en medio DMEM que
contenía suero fetal de ternera al 10%, fueron divididas hasta una
confluencia de 75%. Al día siguiente, las células fueron
transfectadas durante 16-20 horas con 10 microgramos
de DNA del plásmido CD4-IgG2-pcDNA1
purificado con CsCl, mediante la técnica de precipitación estándar
con CaPO (4). Después de la transfección, se añadió a las células
medio de nueva aportación. El análisis de los productos sintetizados
48- 72 horas después de la transfección se llevó a cabo mediante
radiomarcado de los transfectantes con
^{35}S-metionina durante 12-18
horas, seguido de precipitación de los medios y de los lisados
celulares usando anticuerpos anti-CD4 o mediante
incubación con glóbulos de Proteína A-Sepharose
seguido de SDS-PAGE en condiciones reductoras o no
reductoras (Figura 6). Además, se llevó a cabo el análisis de los
medios y de los lisados celulares 48-72 horas
después de la transfección, mediante procedimientos estándar de
transferencia Western.
Células de ovario de hámster
chino-Dhfr (CHO) fueron transfectadas con 20
microgramos de DNA purificado con CdCl en una relación molar 1000:1
de CD4-IgG2-pcDNA1:p410. (el p410 es
un plásmido de expresión que contiene el gen dhfr), aun cuando
podrían emplearse también otras relaciones. Aproximadamente
3-5 días después de la transfección, las células
fueron colocadas en un medio selectivo ( MEM alfa sin nucleósidos
que contenía suero fetal de ternera dializado, al 10%).
Aproximadamente 10-15 días después de efectuar la
selección, clones celulares individuales fueron retirados y
analizados para determinar la expresión estable del homodímero de la
cadena pesada gamma2-CD4 mediante varias técnicas de
cribado, tales como ELISA y precipitación con glóbulos de Proteína
A-Sepharose, seguido de SDS-PAGE en
condiciones reductoras y no reductoras. Los clones que expresaban
los máximos niveles fueron sometidos a ciclos sucesivos de
amplificación de las secuencias de DNA introducidas nuevamente en
concentraciones crecientes de metotrexato. De este modo se generaron
líneas celulares de CHO estables, que secretan entre
10-100 microgramos/mililitro del homodímero de las
cadenas pesadas gamma2-CD4.
El homodímero de las cadenas pesadas quiméricas
gamma2-CD4 fue purificado en una sola etapa usando
cromatografía en columna de Proteína A-Sepharose.
Células CHO que secretaban el homodímero de las cadenas pesadas
quiméricas gamma2-CD4 fueron cultivadas hasta alta
densidad en frascos giratorios, en un medio que contenía alfa MEM
con suero fetal de ternera sin IgG, al 10%. Se recogió el medio
acondicionado, se clarificó por centrifugación y se diluyó 1:1 con
PBS con/o sin detergente (es decir, Tween) en este y las soluciones
tampón siguientes. El medio diluido se aplicó después a una columna
de 5 ml de Proteína A-Sepharoase, de flujo rápido,
equilibrada previamente con PBS, a un caudal de 60 ml/hora. Después
de un lavado extenso, el material unido específicamente se sometió a
elución con glicocola/HCl 100 mM, pH 3,5, directamente en una
alícuota de Tris.HCl 1M, pH 8,0, para neutralizar inmediatamente las
fracciones eluídas. Las fracciones se analizaron luego mediante
SDS-PAGE en condiciones reductoras y no reductoras,
seguida de tinción con plata y se agruparon (Figura 8).
Las fracciones agrupadas fueron aplicada después
a una columna de 10 ml de S-Sepharose de flujo
rápido, equilibrada previamente con BES 50 mM, pH 7,0, a un caudal
de 120 ml/hora. Después de la aplicación de la muestra, se empleó
un gradiente de elución por etapas (consistente en las 4 etapas
siguientes: 5 volúmenes de la columna, de BES 50 mM, pH 7,0, 4
volúmenes de la columna, de BES 50 mM, pH 7,0, NaCl 100 mM, 6
volúmenes de la columna, de BES 50 mM, pH 7,0 NaCl 225 mM, seguido
de 8 volúmenes de la columna, de BES 50 mM, pH 7,0. NaCl 500 mM).
para la elución específica del homodímero de las cadenas pesadas
quiméricas gamma2-CD4. El homodímero de las cadenas
pesadas quiméricas gamma2-CD4 eluyó desde la columna
con BES 50 mM, pH 7,0, NaCl 500 mM. Las fracciones de los picos
fueron agrupadas luego y concentradas obteniendo una concentración
final de proteína de al menos 1 mg/ml. Las fracciones agrupadas y
concentradas se aplicaron luego a una columna de 120 ml de Sephacryl
S-300HR equilibrada previamente con PBS, a un caudal
de 8 ml/hora. La fracción del homodímero de la cadena pesada
quimérica gamma2-CD4 se sometió a elución
específicamente con PBS y se concentró hasta por lo menos 1
mg/ml.
Transfectantes de CosM5 que expresan el
homodímero de las cadenas pesadas quiméricas
gamma2-CD4, fueron incubados durante 72 horas en
medio DMEM que contenía suero fetal de ternera, sin IgG, al10%. Se
recogió luego medio sin marcar y se usó para precipitar gp120 del
HIV radiomarcada con ^{35}S-metionina. Después
de incubación del medio que contenía el homodímero de las cadenas
pesadas quiméricas gamma2-CD4, conteniendo gp120
marcada con ^{35}S-metionina, los complejos fueron
adsorbidos en Proteína A-Sepharose. Los complejos de
Proteína A-Sepharose fueron recuperados por
centrifugación, y los precipitados fueron analizados mediante
SDS-PAGE en condiciones reductoras, seguida de
fluorografía (Figura 7). Alternativamente, alícuotas del homodímero
de las cadenas pesadas quiméricas gamma2-CD4
purificados procedente de células CHO fueron utilizados también para
precipitar la gp120 radiomarcada con ^{35}S usando el mismo
procedimiento operatorio.
La determinación de la semivida plasmática y de
la transferencia placentaria, se llevó a cabo mediante técnicas bien
establecidas. Brevemente, conejos o monos se inyectan por vía
intravenosa o intramuscular con homodímero de las cadenas pesadas
quiméricas gamma2-CD4. En varios periodos de tiempo
después de la inyección se toman muestras de plasma y se mide
mediante ELISA la cantidad de homodímero de las cadenas pesadas
quiméricas gamma2- CD4 presente en el suero. Además, a monas
preñadas se inyecta también por vía IV o IM homodímero de las
cadenas pesadas quiméricas gamma2-CD4 y se
determina la concentración en el cordón umbilical y en el suero del
mono recién nacido. La determinación y la comparación de la cantidad
del homodímero de las cadenas pesadas quiméricas
gamma2-CD4 existente en el suero de la madre así
como en la sangre del cordón umbilical y en el suero del recién
nacido, indica el grado relativo de transporte de estas moléculas a
través de la placenta.
La determinación de la unión del FcR y de la
infectividad de macrófagos del homodímero de las cadenas pesadas
quiméricas gamma2-CD4 se realiza mediante técnicas
bien establecidas. Para estos estudios se utilizan células U937
(una línea celular monocítica humana que expresa FcRI y FcRII),
poblaciones purificadas de monocitos/macrófagos procedentes de
sangre periférica humana, y células Hela que expresan
constitutivamente FcRs humanos, recombinantes. Además, pueden
obtenerse comercialmente anticuerpos monoclonales específicos para
FcRI y FcRII. En breve, homodímero de las cadenas pesadas quiméricas
gamma2-CD4, monómero o agregado, radiomarcado, se
incuba con las células anteriores y células testigo apropiadas, a 4
grados Celsius a lo largo de diversos períodos de tiempo. Al
término de cada incubación, las células son solubilizadas y se
determina la radiactividad asociada a las células para establecer la
cantidad de homodímero de las cadenas pesadas quiméricas
gamma2-CD4 unido específicamente a cada uno de los
tipos de células. Como testigos, se emplea IgG2 humana, monómera o
agregada, normal, radiomarcada, para determinar los niveles de unión
de anticuerpos específicos. Además, la competencia del componente
radiomarcado con la IgG2 humana normal, monómera o agregada, sin
marcar, o anticuerpos monoclonales para FcRI ó FcRII, establece la
eficacia y especificidad de la unión del homodímero de las cadenas
pesadas quiméricas gamma2-CD4 para cada tipo de
célula.
Para averiguar si el homodímero de las cadenas
pesadas gamma2-CD4 media la intensificación de la
infección por HIV de monocitos/macrófagos, se incuba
HIV-1 con medio solo o con homodímero de las cadenas
pesadas quiméricas gamma2-CD4, monómero o agregado,
en varias diluciones. Como testigos se emplean sueros procedentes de
individuos normales y de individuos infectados por HIV (31). Después
de incubación durante 1 hora a 4 grados Celsius, el virus
"opsonizado" se añade a los tipos de células descritos en el
párrafo anterior. En varios momentos después de la infección, el
medio es cosechado y analizado par averiguar la actividad de la
transcriptasa inversa viral, que determina el grado de infección
viral. Como testigos se incluyen durante la infección de las
células, sCD4, OKTa o Leu3a. Además, varias diluciones del
homodímero de las cadenas pesadas quiméricas
gamma2-CD4 y testigos apropiados se incuban en
primer lugar con las células, a 4 grados Celsius, para permitir la
unión. Después se añade el HIV y se analiza la infección mediante
la actividad de la transcriptasa inversa viral.
La unión del HIV se llevó a cabo según se ha
descrito previamente (43, 44). En resumen, preparaciones
concentradas de HIV-1 fueron incubadas con diversas
diluciones de sCD4, CD4-gamma2, o
CD4-gamma2, durante 30 minutos y luego se añadieron
a 5 x 10^{5} células CEM. El virus unido se detectó mediante
inmunofluorescencia indirecta y citofluorografía, según se ha
descrito anteriormente (44).
El ensayo de microcultivo para determinar la
replicación viral productiva, se llevó a cabo como se ha descrito
con anterioridad (43, 45). Brevemente, diluciones de sCD4,
gamma2-CD4, o gamma 2-CD4 fueron
incubadas durante 30 minutos con 100 TCID_{50} de
HIV-1 a temperatura ambiente. Las mezclas se
añadieron a linfocitos estimulados con PHA y se incubaron a 37ºC
durante la noche.. Después las células fueron lavadas y depositadas
en placas, en microcultivo, a 1 x 10^{5} células/cultivo, y 10
cultivos por dilución fueron monitorizados para determinar la
replicación viral reproductiva por detección de antígeno de HIV en
sobrenadantes de los cultivos, 8 y 12 días más tarde.
Esta invención describe un gen de las cadenas
pesadas quiméricas gamma2-CD4 que codifica un
homodímero de las cadenas pesadas quiméricas
gamma2-CD4 que es secretado eficazmente a partir de
células de mamífero transformadas. Esta molécula quimérica fue
diseñada para que contuviera secuencias de las cadenas pesadas de la
IgG2 humana que permiten un ajuste y una secreción eficientes del
homodímero. La región CH1 de las cadenas pesadas de la IgG es
responsable de la retención de las moléculas de las cadenas pesadas
intracelularmente y de la formación de heterotetrámeros con cadenas
ligeras (25). Con objeto de producir eficazmente homodímeros de las
cadenas pesadas quiméricas gamma2-CD4, el gen de las
cadenas pesadas quiméricas gamma2-CD4 anteriormente
descrito, carece, específicamente, del dominio CH1. El homodímero
que resulta contiene dos restos V1V2 de CD4 y por consiguiente posee
el potencial de ser bivalente con respecto a la unión de la gp120 y
de tener una avidez intensificada para el HIV en comparación con
sCD4.
Además de esto, esta invención describe la
construcción de heterotetrámeros quiméricos de
IgG2-CD4 que contienen dos cadenas pesadas y dos
cadenas ligeras. El heterotetrámero que resulta, contiene dos o
cuatro restos de V1-V2 de CD4, y posee el potencial
de ser tetravalente con respecto a la unión de la gp120 y tener
avidez intensificada para el HIV en comparación con sCD4. El gen de
las cadenas pesadas quiméricas de IgG2-CD4 usado
para producir el heterotetrámero quimérico de
IgG2-CD4, contiene la región constante completa de
las cadenas pesadas, que incluye el dominio CH1. La inclusión del
dominio CH1 facilita una asociación intracelular eficaz con las
cadenas ligeras, proporcionando el potencial para obtener
heteroterámeros unidos por puentes disulfuro, secretados. Ambos, el
gen de las cadenas pesadas quiméricas de IG2- CD4 y el gen de las
cadenas ligeras quiméricas kappa-CD4, contienen los
dominios V1V2 de CD4. Los esfuerzos realizados para expresar las
cadenas pesadas quiméricas de IgG2-CD4 o las cadenas
ligeras quiméricas kappa-CD4 (o bien solas o en
combinación) que contenían solamente el dominio V1 de la CD4, fueron
infructuosos.
La secuencia de cDNA de la CD4 humana se escinde
desde el plásmido pSP6T4 (4) en forma de un fragmento de restricción
EcoRI/StuI. El fragmento de 0,70 kilobases se aísla y se clona en
M13mp18 digerido con EcoRI/SmaI. El vector resultante
(M13mp18(CD4)) se aísla luego y se somete a digestión con
BamH1. Los sitios BamH1 del M13mp18(CD4) se hacen de extremos
romos con el fragmento de Klenow de DNA polimerasa 1. Después de
inactivación por calor de la polimerasa durante 15 minutos a 65
grados Celsius, el vector M13mp18(CD4) linearizado se somete
luego a digestión con Pst1 y se purifica.
Con objeto de cortar un fragmento que contiene el
exón CH1 del gen de las cadenas pesadas gamma2 humanas, el plásmido
pBr gamma2 (36) se somete a digestión con SacII, y los sitios SacII
se hacen después de extremos romos usando DNA polimerasa T4. Después
de inactivación por calor de la polimerasa, el fragmento se somete a
digestión con Pst1. El fragmento
SacII(romo)-Pst1 resultante, que contiene el
exón CH1 se purifica luego y se liga al vector M13mp18(CD4)
descrito en el párrafo anterior. Después de la transformación de
células TG1 competentes, los recombinantes resultantes son cribados
mediante análisis de restricción para determinar la presencia de
ambas secuencias, de CD4 y de CH1 que contienen, en tándem, CD4
(EcoRI/StuI) - CH1 (SacII(romo)/Pst1). Luego se lleva a cabo
mutagénesis dirigida al sitio, mediada por oligonucleótidos, para
yustaponer las secuencias de CD4 y CH1 en el marco de lectura. La
molécula de DNA quimérica que resulta contiene los dominios V1V2 de
la CD4 fusionados al dominio CH1 de la cadena pesada gamma2. La
mutagénesis se lleva a cabo sobre DNA de una sola cadena aislado de
un fago recombinante que procede de células TG1 (Amersham)
transformadas. DNA molde es sometido a hibridación de extremos
complementarios con un oligonucleótido 33-mero
(5'-GGGCCCTTGGTGG-AGGCGAAAGCTAGCAC
CACG-3') que contiene secuencias que unen el último codón que codifica Phe (179) procedente de V1V2 de CD4, al primer codón del domino CH1 para las cadenas pesadas gamma 2 (que codifica Ala). Después de la síntesis de la segunda cadena, se transforma el DNA de doble cadena en células TG1 competentes. Las placas aisladas se cultivan luego en células TG1 de nueva aportación y el DNA de una sola cadena se purifica por secuenciación de DNA. Todas las mutaciones son confirmadas mediante secuenciación didesoxi usando el sistema Sequenase (USB). Las placas que contenían los genes quiméricos con la secuencia correcta, determinado mediante análisis de restricción, se cultivan luego en células TG1, y se aísla el DNA del Rf desde las células.
CACG-3') que contiene secuencias que unen el último codón que codifica Phe (179) procedente de V1V2 de CD4, al primer codón del domino CH1 para las cadenas pesadas gamma 2 (que codifica Ala). Después de la síntesis de la segunda cadena, se transforma el DNA de doble cadena en células TG1 competentes. Las placas aisladas se cultivan luego en células TG1 de nueva aportación y el DNA de una sola cadena se purifica por secuenciación de DNA. Todas las mutaciones son confirmadas mediante secuenciación didesoxi usando el sistema Sequenase (USB). Las placas que contenían los genes quiméricos con la secuencia correcta, determinado mediante análisis de restricción, se cultivan luego en células TG1, y se aísla el DNA del Rf desde las células.
El DNA del Rf procedente del gen quimérico de
CD4-CH1 es linearizado luego por digestión con Pst1.
El vector linearizado con Pst1 se trata entonces con BAP y se liga
al fragmento de DNA Pst1-Pst1 del plásmido pBr
gamma2 que contiene los exones de las regiones de bisagra, CH2 y CH3
del gen de la cadena pesada gamma2 humana. La orientación correcta
del fragmento Pst1-Pst1 con respecto al fragmento
quimérico de CD4-CH1 se verifica luego mediante
análisis de restricción. El gen quimérico que resulta codifica una
proteína que contiene los dominios V1V2 de la CD4, seguidos por las
regiones CH1, bisagra, CH2 y CH3 de la cadena pesada gamma2 (Figuras
2 A, 2 B y 4). La molécula de DNA de la cadena pesada quimérica de
IgG2-CD4 se aísla desde el DNA del Rf recombinante
después de la linearización del Rf con EcoRI. Los sitios EcoRI
existentes en el DNA linearizado se llenan con el fragmento de
Klenow de DNA polimerasa I. El DNA de extremos romos es ligado
luego durante la noche a 15 grados Celsius con DNA ligada T4 a un
exceso molar de 100 veces de engarces HindIII. Después de inactivar
por calor la DNA ligasa T4 durante 15 minutos a 70 grados Celsis, el
DNA ligado a HindIII es sometido a digestión extensamente con
HindIII liberando un fragmento que contiene el gen de la cadena
pesada quimérica de IgG2-CD4. Este fragmento HindIII
se purifica después y se liga al vector de expresión
pcDNA-1 (Invitrogen), que previamente se había
sometido a digestión con HindII y tratado con BAP. El plásmido
resultante se transforma luego en células MC1061/P3. Se aísla DNA
plasmídico de los clones recombinantes, y se lleva a cabo la
verificación de la presencia de la inserción HindIII y la
orientación de la inserción con respecto al promotor de
citomegalovirus (CMV) en el plásmido, mediante análisis de
restricción. El plásmido de expresión en mamífero que resulta, que
codifica una cadena pesada quimérica de IgG2-CD4
es designado CD4-IgG2HC-RcCMV.
La región constante de las cadenas ligeras kappa
humanas se escinde desde el plásmido pCNkappa ligero como un
fragmento Mse1. El fragmento Mse1 purificado se hace después de
extremos romos usando el fragmento de Klenow de DNA polimerasa 1. El
Rf de M13mp18 es linearizado después con HincII y el fragmento de la
cadena ligera kappa MseI de extremos romos se liga a M13mp18 en el
sitio de extremo romo HincII del vector. Después de la
transformación de células TG1, los recombinantes son confirmados
por la presencia de la inserción y la orientación correcta dentro
del vector mediante análisis de restricción. El Rf es purificado a
partir de células TG1 infectadas y sometido a digestión con EcoRI y
SmaI. El vector purificado que contiene la región constante de las
cadenas ligeras kappa se liga luego al fragmento EcoRI/StuI del cDNA
de la CD4 humana anteriormente descrito. Los recombinantes que
resultan son verificados luego para determinar la presencia y
orientación de ambas inserciones que contienen, en tándem, CD4
(EcoRI/StuI) - Ckappa (MseI(romo)/MseI(romo)), y el
DNA de una sola cadena es purificado mediante mutagénesis dirigida
al sitio mediada por oligonucleótidos. El DNA de molde es sometido a
hibridación de extremos complementarios a un oligonucleotido
33-mero
(5'-GATGGTGCAGCCACAGTGAAAGCTAGCACCACG-3')
que contiene secuencias que unen el último codón que codifica Phe
(179) procedente de V1V2 de CD4, al primer codón del dominio
constante de las cadenas ligeras kappa (que codifica thr). Después
de la síntesis de la segunda cadena, el DNA de doble cadena es
transformado en células TG1 competentes, y placas aisladas se
cultivan en células TG1 de nueva aportación para la secuenciación de
DNA. La presencia de la mutación es confirmada mediante
secuenciación didesoxi. Las placas que contienen genes quiméricos
con la secuencia correcta son cultivados luego en células TG1 y se
aísla DNA del Rf desde las células. La molécula de DNA que resulta
codifica una proteína que contiene los dominios V1V2 de la CD4
seguidos de la región constante de las cadenas ligeras kappa
(Figuras 2 A, 2B
y 5).
y 5).
La molécula de DNA de las cadenas ligeras
quiméricas kappa-CD4 se aísla desde el DNA del Rf
recombinante después de la linearización del Rf con EcoRI. Los
sitios EcoRI en el DNA linearizado se llenan con el fragmento de
Klenow de DNA polimerasa I. El DNA de extremos romos se liga
después, durante la noche, a 15 grados Celsius, con DNA ligasa T4 a
un exceso molar de 100 veces de engarces HindIII. Después de
inactivar por calor la DNA ligasa T4 durante 15 minutos a 10 grados
Celsius, el DNA ligado con HindIII es sometido a digestión
extensamente con HindIII liberando un fragmento que contiene el gen
de la cadena ligera quimérica kappa-CD4. Este
fragmento de HindIII se purifica luego y se liga al vector de
expresión pcDNA-1 (Invitrogen), que previamente
había sido digerido con HindIII y tratado con BAP. El plásmido que
resulta se transforma entonces en células MC1061/P3. Se aísla DNA
plasmídico a partir de los clones recombinantes, y se efectúa la
verificación de la presencia de la inserción HindIII y de la
orientación de la inserción con respecto al promotor de
citomegalovirus (CMV) del plásmido, mediante análisis de
enzima de restricción. El plásmido de expresión en mamíferos que
resulta, que codifica una cadena ligera quimérica
kappa-CD4, se designa
CD4-kLC-pRcCMV.
Células CosM5 cultivadas en DMEM conteniendo
suero fetal de ternera al 10%, son divididas hasta una confluencia
de 75%. Al día siguiente, las células son transfectadas durante
16.20 horas con 5 microgramos de DNA del
CD4-IgG2HC-pRcCMV purificado con
CsCl y 5 microgramos de DNA plasmídico del
CD4-kLC-pRcCMV purificado con CsCl,
por la técnica estándar de precipitación con CaPO (4). Después de la
transfección, se añade a las células medio de nueva aportación. El
análisis de los productos sintetizados 48-72 horas
después de la transfección, se lleva a cabo mediante radiomarcado de
los transfectantes con ^{35}S-metionina durante
12-18 horas, seguido de precipitación de los medios
y los lisados celulares usando anticuerpos anti-CD4
o mediante incubación con glóbulos de Proteína
A-Sepharose solos seguido de
SDS-PAGE en condiciones reductoras o no reductoras.
Además, el análisis de los medios y de los lisados celulares se
lleva a cabo 48-72 horas después de la transfección
mediante procedimientos estándar de transferencia Western.
Células de ovario de hámster
chino-(CHO)-Dhfr, son transfectadas con 20
microgramos de DNA purificado con CsCl en una relación de
1000:1000:1 de
CD4-IgG2HC-pRcCMV:CD4-kLC-pRcCMV:p410
(p410 es un plásmido de expresión que contiene el gen dhfr), aun
cuando también pueden utilizarse otras relaciones. Aproximadamente
3-5 días después de la transfección las células se
colocan en medio selectivo (alfa MEM sin nucleósido que contiene
suero fetal de ternera dializado, al 10%). Aproximadamente
10-15 días después de la selección, se retiran
clones individuales de las células. Los clones se analizan luego
para determinar la expresión estable de los heterotetrámeros
quiméricos de IgG2-CD4 mediante diversas técnicas de
cribado, tales como ELISA y precipitación con glóbulos de Proteína
A-Sepharose seguido de SDS-PAGE, en
condiciones reductoras y no reductoras. Los clones que expresan los
niveles máximos son sometidos a ciclos sucesivos de amplificación de
las secuencias de DNA introducidas nuevamente, en concentraciones
crecientes de metotrexato. De este modo se generan líneas celulares
de CHO estables que secretan niveles altos de heterotetrámero
quimérico de IgG2-CD4.
Los heterotetrámeros quiméricos de
IgG2-CD4 se purifican usando cromatografía en
columna de Proteína A-Sepharose. Células CHO que
secretan heterotetrámeros quiméricos de IgG2-CD4 se
cultivan a alta densidad en frascos giratorios, en medio que
contiene alfa MEM con suero fetal de ternera sin IgG, al 10%. Se
recogen los medios acondicionados, se clarifican por centrifugación
y se diluye 1:1 con PBS con o sin detergente (es decir, Tween) en
estas soluciones tampón y subsiguientes. Los medios diluidos se
aplican luego a una columna de 5 ml de Proteína
A-Sepharose de flujo rápido, equilibrada previamente
con PBS, a un caudal de 60 ml/hora. Después de lavar extensamente,
el material unido eluye con glicocola/HCl 100 mM, pH 3,5,
directamente en una alícuota de Tris-HCl 1 M, pH
8,0, para neutralizar inmediatamente las fracciones eluídas. Las
fracciones son analizada luego mediante SDS-PAGE en
condiciones reductoras y no reductoras, seguida de tinción con plata
y agrupamiento (Figura 8).
Transfectantes de CosM5 que expresan
heterotetrámeros quiméricos de IgG2-CD4 son
incubados durante 72 horas en medio DMEM que contiene suero fetal de
ternera, sin IgG, al 10%. Se recoge luego el medio sin marcar y se
usa para precipitar la gp120 del HIV radiomarcada con
^{35}S-metionina. Después de incubar el medio que
contiene el heterotetrámero quimérico de IgG2-CD4
con gp120 marcada con ^{S}35-metionina, los
complejos son adsorbidos en Proteína A-Sepharose.
Se recuperan por centrifugación los complejos de Proteína
A-Sepharose y los precipitados se analizan mediante
SDS-PAGE seguida de fluorografía. Alternativamente,
alícuotas de heterotetrámeros quiméricos de
IgG2-CD4 procedentes de células CHO se usan también
para precipitar gp120 radiomarcada con ^{35}S, usando el mismo
procedimiento operatorio.
La determinación de la semivida plasmática y de
la transferencia placentaria, se llevan a cabo mediante técnicas
bien establecidas. Brevemente, conejos o monos son inyectados por
vía intravenosa o intramuscular con heterotetrámero quimérico de
IgG2-CD4 purificado. En varios puntos de tiempo
después de la inyección, se toman muestras de plasma y se mide
mediante ELISA la cantidad del heterotetrámero quimérico de
IgG2-CD4 presente en el suero. Además, monas
preñadas son inyectadas también o bien por vía IV o por vía IM con
heterotetrámero quimérico de IgG2-CD4 y se determina
la concentración en el cordón umbilical y en el suero del mono
recién nacido. La determinación y comparación de la cantidad del
heterotetrámero quimérico de IgG2-CD4 en el suero de
la madre así como en la sangre del cordón umbilical y en el suero
del recién nacido indica el grado relativo de transporte de esas
moléculas a través de la placenta.
La determinación de la unión de FcR y de la
infectividad de macrófagos del heterotetrámero quimérico de
IgG2-CD4, se llevan a cabo mediante técnicas bien
establecidas. Para estos estudios se utilizan células U937 (una
línea celular monocítica humana que expresa FcRI y FcRII),
poblaciones de monocitos/macrófagos purificadas procedentes de
sangre peroférica humana, y células Hela que expresan,
constitutivamente, FcRs humanos recombinantes. Además, anticuerpos
monoclonales específicos para el FcRI y el FcRII se encuentran
disponibles en el comercio. En resumen, heterotetrámero quimérico de
IgG2-CD4, monómero o agregado, radiomarcado, se
incuba con las células anteriores y células testigo apropiadas, a 4
grados Celsius, durante diversos períodos de tiempo. Al final de
cada incubación, las células son solubilizadas y se determina la
radiactividad asociada a las células para establecer la cantidad de
heterotetrámero quimérico de IgG2-CD4 unido
específicamente a cada tipo de célula. Como testigos se utilizan
IgG2 humana normal, monómera o agregada, radiomarcada para
determinar los niveles de unión de anticuerpos específicos. Además,
la competencia del componente radiomarcado con IgG2 humana normal,
monómera o agregada, sin marcar, o anticuerpos monoclonales para el
FcRI o el FcRII, establece la eficacia y la especificidad de unión
del heterotetrámero quimérico de IgG2-CD a cada tipo
de célula.
Para averiguar si el heterotetrámero quimérico de
IgG2-CD4 media en la intensificación de infección
por HIV de monocitos/macrófagos, se incuba HIV-1 con
medios solos o con heterotetrámero quimérico de
IgG2-CD4, monómero o agregado, en varias diluciones.
Como testigos se utilizan sueros procedentes de individuos normales
e individuos infectados con HIV (31). Después de incubar durante una
hora a 4 grados Celsius, el virus "opsonizado" se añade a los
tipos de células descritos en el párrafo anterior. En diversos
períodos de tiempo después de la infección, se cosechan los medios y
se analizan para comprobar la actividad de la transcriptasa inversa
viral y determinar el grado de infección viral. Como testigos se
incluyen durante la infección de las células sCD4, OKT4a o Leu3a.
Además, varias diluciones del heterotetrámero quimérico de
IgG2-CD4 y testigos apropiados se incuban
primeramente con las células, a 4 grados Celsius para permitir la
unión. Luego se añade HIV y se analiza la infección para determinar
la actividad de la transcriptasa inversa viral.
Se generó un gen de las cadenas pesadas
quiméricas gamma2-CD4 que codifica un homodímero de
las cadenas pesadas quiméricas gamma2-CD4, ligando
el segmento V1-V2 conductor del cDNA de CD4 humana
(4) al exón de bisagra del gen de las cadenas pesadas gamma2 humanas
(30) (Figura 1 A). La molécula de DNA recombinante que resulta
(designada CD4-IgG2-Rf) codifica la
secuencia señal y dos dominios semejantes a los de la
inmunoglobulina del extremo amino terminal, de la proteína CD4 (los
primeros 179 aminoácidos de la CD4 madura) seguido de las regiones
de bisagra (15 aminoácidos), CH2 (110 aminoácidos) y CH3 (107
aminoácidos), de la proteína de las cadenas pesadas gamma2 (Figura
3). Esta molécula de DNA recombinante contiene también dos intrones
presentes dentro del gen de la cadenas pesadas gamma2, entre los
dominios H y CH2, y entre los dominios CH2 y CH3. Este gen quimérico
de gamma2-CD4 fue diseñado para codificar un
homodímero de las cadenas pesadas quiméricas
gamma2-CD4 que carece específicamente del dominio
CH1 de las cadenas pesadas gamma2. La expresión del dominio CH1 sin
cadenas ligeras acompañantes impide la secreción eficaz de las
cadenas pesadas desde células de mamífero
(25).
(25).
En el homodímero de las cadenas pesadas
quiméricas gamma2-CD4, la región de bisagra de una
de las cadena contiene cuatro restos de cisteína, proporcionando el
potencial de cuatro puentes disulfuro entre las cadenas (figura
1B). De modo semejante, la IgG2 humana natural contiene cuatro
puentes disulfuro entre cadenas, entre las cadenas pesadas gamma
2.
El gen de las cadenas pesadas quiméricas
gamma2-CD4 fue subclonado en el vector pcDNA1 de
expresión en células de mamífero. Este vector contiene los
siguientes elementos de DNA: : el promotor primero inmediato de
citomegalovirus (CMV) y el intensificador que conduce la
transcripción del gen de las cadenas pesada quiméricas
gamma2-CD4; una secuencia de poliadenilación de
SV40; y un origen de replicación de SV40 que permite la replicación
del plásmido con alto número de copias en células CosM5. El vector
de expresión en células de mamífero de las cadenas pesadas gamma
2-CD4 que resulta (designado
CD4-IgG2-pcDNA1) fue transfectados
en células CosM5 que después fueron radiomarcadas con
^{35}S-metionina 48-72 horas
después de la transfección. El medio radiomarcado se analizó por
precipitación con glóbulos de Proteína A-Sepharose
y SDS-PAGE, seguido de fluorografía (Figura 6). En
condiciones reductoras, precipita una proteína que emigra en una
masa molecular relativa (Mr) de aproximadamente 47 kilodaltons.
Cuando el material precipitado se hizo correr sobre
SDS-PAGE en condiciones no reductoras, se observa
una proteína que emigra en un Mr de aproximadamente 94 kilodaltons,
lo que indica que las cadenas pesadas quiméricas
gamma2-CD4 se ajustan y son secretadas como
homodímeros. Además, estos resultados demuestran que los homodímeros
de las cadenas pesadas quiméricas gamma2-CD4
contienen un dominio Fc de inmunoglobulina intacto, dado que unen
Proteína A. Se llevó a cabo una caracterización adicional mediante
análisis de transferencia Western de las proteínas secretadas en el
medio 48-72 horas después de la transfección, usando
un antisuero policlonal de conejo producido contra la CD4 humana
soluble, purificada. De modo semejante a los resultados obtenidos
por precipitación, cuando el medio se sometió a a
SDS-PAGE en condiciones reductoras, seguida de
transferencia Western a nitrocelulosa, la proteína inmunorreactiva
principal emigra en un Mr de aproximadamente 47 kilodaltons. En
condiciones no reductoras, la proteína inmunorreactiva principal
emigra en un Mr de aproximadamente 94 kilodaltons. Tomados en su
conjunto, estos resultados demuestran que las cadenas pesadas
quiméricas gamma2-CD4 son producidas y secretadas
como un homodímero del peso molecular
pronosticado.
pronosticado.
Los resultados anteriores demuestran que la
porción Fc del homodímero de las cadenas pesadas quiméricas
gamma2-CD4, codificado por las regiones constantes
del gen de las cadenas pesadas gamma 2, fija Proteína A y, por
tanto, es activo desde el punto de vista funcional. Con objeto de
determinar si la parte de CD4 está funcionalmente intacta, se
analizaron homodímeros de las cadenas pesadas quiméricas
gamma2-CD4 para determinar su capacidad para unirse
a la glicoproteína gp120, de la cubierta externa del HIV (Figura
7). Medio sin marcar procedente de células CosM5 transfectadas con
DNA del CD4-IgG2-pcDNA1 fue incubado
con gp120 marcada con ^{35}S-metionina. Los
complejos de homodímero de las cadenas pesadas quiméricas
gamma2-CD4/gp120 fueron precipitados por incubación
con glóbulos de Proteína A-Sepharose, y los
precipitados fueron analizados mediante SDS-PAGE en
condiciones reductoras, seguida de fluorografía, Estos resultados
demuestran que el homodímero de las cadenas pesadas quiméricas
gamma2-CD4 reconoce eficientemente la gp120 del HIV
y se une con alta afinidad. Estas observaciones, tomadas juntamente
con los resultados descritos en el párrafo anterior, demuestran que
el homodímero de las cadenas pesadas quiméricas
gamma2-CD4 contiene regiones funcionalmente activas
tanto de la CD4 como de las cadenas pesadas
gamma2.
gamma2.
Con objeto de producir de modo estable grandes
cantidades de los homodímeros de las cadenas pesadas quiméricas
gamma2-CD4, el vector
CD4-IgG2-pcDNA1 fue cotransfectado
con el plásmido p410 (que codifica la enzima dihidrofolato reductasa
(dhfr)) en células de ovario de hámster chino
(CHO)-dhfr. Aproximadamente dos semanas después de
la transfección clones que crecían en medio alfa MEM sin nucleósidos
y suero fetal de ternera dializado, al 10% ( y por tanto dhfr+)
fueron aislados y analizados para determinar la
co-expresión de los homodímeros de las cadenas
pesadas quiméricas gamma2-CD4, por precipitación y
ELISA. Las líneas celulares de máxima producción fueron
identificadas y sometidas a concentraciones crecientes escalonadas
de metotrexato lo que selecciona la amplificación de las secuencias
de DNA introducidas nuevamente. Se usó una línea celular CHO que
expresaba 10 microgramos/mililitro de homodímero de las cadenas
pesadas quiméricas gamma2-CD4, para obtener una
producción constitutiva, estable, en frascos giratorios. Las células
se cultivaron hasta confluencia en medio alfa MEM que contenía suero
fetal de ternera, sin IgG, al 10%. Las células fueron nutridas
luego un día si y otro no, y se usó medio acondicionado de dos días
para purificar el homodímero de las cadenas pesadas quiméricas
gamma2-CD4. El medio acondicionado se diluyó 1:1 con
solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se aplicó a una
columna de 5 ml de Proteína A-Sepharose de flujo
rápido (Pharmacia) en un caudal de 60 mililitros/hora. La columna
se lavó luego con 10 volúmenes de la columna de PBS y el material
unido se sometió a elución con glicocola 100 mM, pH 3,5. El material
se recogió directamente en 50 \mul de Tris-HCl 1
M, pH 8,0 para neutralizar el eluyente. Las fracciones que tenían
una densidad óptica DO(280) mayor que 0,1 fueron analizadas
mediante SDS-PAGE seguida de tinción con plata o
análisis de transferencia Western, y las fracciones de los picos
fueron agrupadas. Una banda única eluyó específicamente desde la
columna de Proteína A-Sepharose en un Mr
correspondiente al homodímero de las cadenas pasadas quiméricas
gamma2-CD4 (Figura 8). El análisis de transferencia
Western confirma que la proteína eluída es inmunorreactiva con el
antisuero policlonal producido contra la CD4 soluble humana. Además,
la proteína purificada retiene la capacidad de unirse con alta
afinidad a la gp120 marcada con ^{35}S-metionina.
Estos resultados demuestran la producción estable, de alto nivel,
de homodímeros de las cadenas pesadas gamma2-CD4 en
células de mamífero, y la purificación del homodímero de las
cadenas pesadas quiméricas gamma 2-CD4 que
retiene la función
biológica.
biológica.
El homodímero de las cadenas pesadas
gamma2-CD4 parcialmente purificado, purificado
según se describe en la Figura 8, era eficaz para impedir la
fijación del HIV a las células de CD4 (Figura 9) y neutralizar la
infectividad de un inóculo de HIV fijado (Figura 10). En este último
ensayo, aproximadamente 10- 25 \mug/ml de
gamma2-CD4, así como sCD4 fueron necesarios para
evitar que el 50% de los cultivos llegaran a quedar infectados por
el HIV.
Se consiguió una purificación adicional del
homodímero de las cadenas pesadas gamma2-CD4
utilizando cromatografía de intercambio iónico. La fracción del
pico procedente de la columna de Proteína
A-Sepharose se aplicó a una columna de
S-Sepharose de flujo rápido, previamente equilibrada
con BES 50 mM, pH 7,0, con una caudal de 120 ml/hora. Después de
aplicar la muestra, la columna se lavó extensamente con BES 50 mM,
pH 7,0, con concentración creciente de sal (véanse Materiales y
Métodos).El homodímero de las cadenas pesadas
gamma2-CD4 eluyó específicamente desde la columna
con BES 50 mM, pH 7,0. que contenía NaCl 50 mM. Después de la
cromatografía de intercambio iónico, se encontró inesperadamente que
las fracciones de los picos que contenían el homodímero de las
cadenas pesadas quiméricas gamma 2-CD4 era todavía
impuro. Por consiguiente, las fracciones de los picos procedentes
de la columna de S-Sepharose fueron reunidas,
concentradas y aplicadas a una columna de Sephacryl
S-300HR de 120 ml, previamente equilibrada con PBS y
hecha funcionar en un caudal de 8 ml por hora. Las fracciones de
los picos del homodímero de las cadenas pesadas
gamma2-CD4 fueron analizadas mediante
SDS-PAGE y tinción con plata, en condiciones no
reductoras, y las fracciones purificadas fueron agrupadas y
analizadas mediante SDS-PAGE seguida de tinción con
plata, en condiciones no reductoras (Figura 11, calle 1), o
condiciones reductoras (Figura 11, calle 2). Cuando el homodímero
de las cadenas pesadas quiméricas gamma2-CD4
purificado se sometió a SDS-PAGE en condiciones
reductoras, se observó un doblete que parecía ser debido a
diferencias en la glicosilación del homodímero de las cadenas
pesadas quiméricas gamma2-CD4 (datos no
indicados).
indicados).
El gen de las cadenas pesadas quiméricas
IgG2HC-CD4 que codifica una cadena pesada quimérica
de IgG2-CD4 fue generado, ligando el segmento
V1-V2 conductor del cDNA de la CD4 humana al exón
CH1 del gen de las cadenas pesadas de IgG2 humana (Figura 2 A).
Además, se generó un gen de la cadena ligera quimérica
kappa-CD4 que codifica una cadena ligera
kappa-CD4 ligando el segmento V1-V2
conductor del cDNA de la CD4 humana al dominio constante del gen de
las cadenas ligeras kappa (Figura 2 A). Estos genes de las cadenas
pesadas quiméricas de IgG2-CD4 fueron destinados a
codificar un heterotetrámero quimérico de IgG2-CD4,
en el que la cadena pesada de IgG2-CD4 contiene un
dominio CH1 para obtener una asociación eficaz con las cadenas
ligeras
kappa.
kappa.
Ambos genes, de las cadenas pesadas quiméricas de
IgG2-CD4 y de las cadenas ligeras quiméricas
kappa-CD4 fueron subclonados en los vectores de
expresión en células de mamífero pRcCMV o pPPI-2.
Ambos vectores contienen el promotor anticipado inmediato de
citomegalovirus y el intensificador que conduce la
transcripción de los genes quiméricos. En el vector pRcCMV, se usa
una segunda "casete" transcripcional que contiene promotor RSV
e intensificador, para dirigir la transcripción del gen de
resistencia a la neomicina. En el pPPI-2 una
segunda "casete" de la transcripción que contiene el promotor
de \beta-globina dirige la transcripción del gen
dhfr (véase la indicación anterior). Con objeto de producir de modo
estable grandes cantidades del heterotetrámero quimérico de
IgG2-CD4, el vector de expresión de las cadenas
pesadas quiméricas de IgG2-CD4 y el vector de
expresión de las cadenas ligeras quiméricas
kappa-CD4, fueron transfectados simultáneamente
(típicamente se usó el gen de las cadenas pesadas quiméricas de
IgG2-CD4 clonado en el pRcCMV, y se uso el gen de
la cadenas ligeras kappa-CD4 clonado en el
pPPI-2, en una relación de 1:1). Aproximadamente dos
semanas después de la transfección, clones individuales que se
desarrollaban en medio alfa MEM sin nucleósidos, que contenían 1
mg/ml de G418 y suero fetal de ternera dializado, al 10%, fueron
aislados y analizados para determinar la
co-expresión de ambas cadenas pesadas quiméricas de
IgG2 y cadenas ligeras quiméricas kappa-CD4 mediante
inmunoprecipitación y ELISA. La Figura 12 muestra un clon que fue
seleccionado y analizado para determinar la expresión de ambas, las
cadenas pesadas quiméricas de IgG2-CD4 y las cadenas
ligeras quiméricas kappa-CD4. La línea celular CHO o
la línea CHO parental sin transfectar fueron radiomarcadas con
^{35}S-metionina y
^{35}S-cisteína, durante 16 horas. El medio
radiomarcado se analizó por precipitación con glóbulos de Proteína
A-Sepharose y SDS-PAGE en
condiciones no reductoras, seguido de fluorografía (Figura 12 A). En
condiciones no reductoras precipitan 2 proteínas que emigran en
masas moleculares relativas de aproximadamente 140 kilodaltons y 210
kilodaltons. Cuando el material precipitado se sometió a
SDS-PAGE en condiciones no reductoras, se observaron
2 proteínas que emigran en masas moleculares relativas de 69
kilodaltons y 35 kilodaltons, que son consistentes con las masas
moleculares relativas pronosticadas de las cadenas pesadas
quiméricas de IgG2-CD4 y de las cadenas ligeras
quiméricas kappa-CD4, respectivamente (no se
indican los datos). Una caracterización adicional ha mostrado que
la proteína que emigra en 210 kilodaltons en la
SDS-PAGE en condiciones no reductoras, contiene
ambas, las cadenas pesadas quiméricas de IgG2-CDA y
las cadenas ligeras quiméricas kappa-CD4 que están
asociadas covalentemente, mientras que la proteína que emigra en 140
kilodaltons en SDS-PSGE en condiciones no
reductoras, contiene solamente cadenas pesadas quiméricas de
IgG2-CD4 (Figura 12B). Estos resultados son
concordantes con el peso molecular pronosticado de la proteína de
210 kilodaltons que posee 2 cadenas pesadas quiméricas de
IgG2-CD4 y 2 cadenas ligeras quiméricas
kappa-CD4, asociadas covalentemente formando una
molécula con la estructura H_{2}L_{2} (H=cadena pesada, L=cadena
ligera). Además, la proteína de 140 kilodaltons que se aprecia en la
SDS-PAGE en condiciones no reductoras, es
concordante con el peso molecular pronosticado de un homodímero
quimérico de IgG2-CD4 que tiene la estructura
H_{2}. Tomados en conjunto, estos resultados indican que una
línea celular CHO que expresa ambas, las cadenas pesadas quiméricas
de IgG2-CD4 y las cadenas ligeras quiméricas
kappa-CD4, es capaz de juntar eficazmente y secretar
heterotetrámeros quiméricos de
IgG2-CD4.
IgG2-CD4.
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45. McDougal, J.S., et al.,
(1985) J. Immunol Methods 76,
171-183.
Claims (27)
1. Un heterotetrámero quimérico de
IgG2-CD4 purificado capaz de neutralizar un virus
HIV-1 de un individuo infectado con
HIV-1, que comprende dos cadenas pesadas y dos
cadenas ligeras, en el que las cadenas pesadas poseen la secuencia
de aminoácidos expuesta en la Figura 4 ó están codificadas por un
vector de expresión designado
CD4-IgG2HC-pRcCMV (ATCC No. 75193) y
las cadenas ligeras poseen la secuencia de aminoácidos expuesta en
la Figura 5 ó están codificadas por un vector de expresión designado
CD4-kLC-pRcCMV (ATCC No. 75194).
2. El heterotetrámero quimérico de
IgG2-CD4 purificado, según la reivindicación 1, en
el que las cadenas pesadas poseen la secuencia de aminoácidos
expuesta en la Figura 4 y las cadenas ligeras poseen la secuencia de
aminoácidos expuesta en la Figura 5.
3. El heterotetrámero quimérico de
IgG2-CD4 purificado, según la reivindicación 1, en
el que las cadenas pesadas están codificadas por el vector de
expresión designado
CD4-IgG2HC-pRcCMV (ATCC No. 75193) y
las cadenas ligeras están codificadas por el vector de expresión
designado CD4-kLC-pRcCMV (ATCC No.
75194).
4. Una composición que comprende el
heterotetrámero quimérico de IgG2-CD4 purificado,
según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en una cantidad
eficaz para neutralizar el virus HIV-1 de un
individuo infectado con HIV-1, y un excipiente
farmacéuticamente aceptable.
5. Una composición que comprende el
heterotetrámero quimérico de IgG2-CD4, según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, ligado a una toxina y un
excipiente farmacéuticamente aceptable.
6. La composición según la reivindicación 1, en
la que la toxina está seleccionada entre el grupo que consiste en la
cadena A desglicosilada de ricina, el dominio II de la exotoxina A
de Pseudomonas, el dominio III de exotoxina A de Pseudomonas y la
toxina diftérica.
7. Un reactivo de diagnóstico que comprende el
heterotetrámero quimérico de IgG2-CD4 según la
reivindicación 1, ligado a un marcador detectable.
8. El reactivo de diagnóstico según la
reivindicación 7, en el que el marcador detectable es un
radioisótopo, un cromóforo o un fluoróforo.
9. Un método de producción de un heterotetrámero
quimérico de IgG2-CD4 purificado capaz de
neutralizar el virus HIV-1 de un individuo infectado
con HIV-1, que comprende:
- a)
- cotransfectar una célula de mamífero con (A) un vector de expresión que codifica la secuencia de aminoácidos expuesta en la Figura 4 ó un vector de expresión designado CD4-IgG2HC-pRcCMV (ATCC No. 75193) y (B) un vector de expresión que codifica la secuencia de aminoácidos expuesta en la Figura 5 ó un vector de expresión designado CD4-kLC-pRcCMV (ATCC No. 75194);
- b)
- cultivar la célula de mamífero cotransfectada que resulta, en condiciones y en un medio tales que el heterotetrámero quimérico es secretado al medio; y
- c)
- recuperar y purificar el heterotetrámero quimérico de IgG2-CD4 secretado de este modo, produciendo así el heterotetrámero quimérico de IgG2-CD4 purificado, siendo capaz dicho heterotetrámero de neutralizar el virus HIV-1 de un individuo infectado con HIV-1.
10. El método según la reivindicación 9, en el
que el vector es designado
CD4-IgG2HC-pRcCMV (ATCC No.
75193).
11. El método según la reivindicación 9, en el
que el vector es designado
CD4-kLC-pRcCMV (ATCC No.
75194).
12. El método según la reivindicación 9, en el
que el vector codifica la secuencia de aminoácidos expuesta en la
Figura 4.
13. El método según la reivindicación 9, en el
que el vector codifica la secuencia de aminoácidos expuesta en la
Figura 5.
14. El método según la reivindicación 9, en el
que la célula de mamífero es una célula COS, una célula CHO o una
célula de mieloma.
15. Un método in vitro para inhibir la
infección de una célula CD4+ por un virus de la inmunodeficiencia
humana, que comprende poner en contacto el virus de la
inmunodeficiencia humana con una cantidad de un heterotetrámero
quimérico de IgG2-CD4, según la reivindicación 1,
eficaz para formar un complejo con tal virus de la inmunodeficiencia
humana en la presencia de la célula CD4+, inhibiendo con ello la
infección de la célula CD4+ por el virus.
16. El uso de un heterotetrámero según cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 3 ó una composición según una cualquiera
de las reivindicaciones 4 a 6, para fabricar un medicamento para
usar en un método de prevención de que células CD4+ de un sujeto
lleguen a quedar infectadas con virus de la inmunodeficiencia
humana.
17. El uso de un heterotetrámero según cualquiera
de las reivindicaciones 1 a 3 ó una composición según una cualquiera
de las reivindicaciones 4 a 6, para fabricar un medicamento para
usar en un método de tratamiento de un sujeto que tiene células CD4+
infectadas con virus de la inmunodeficiencia humana.
18. Una célula huésped transformada que
comprende al menos dos vectores, comprendiendo un vector DNA que
codifica las cadenas pesadas de un heterotetrámero quimérico de
IgG2-CD4 y comprendiendo otro vector DNA que
codifica las cadenas ligeras del heterotetrámero quimérico de
IgG2-CD4, en el que las cadenas pesadas poseen la
secuencia de aminoácidos expuesta en la Figura 4 ó están codificadas
por un vector de expresión designado
CD4-IgG2HC-pRcCMV (ATCC No. 75193),
y las cadenas ligeras poseen la secuencia de aminoácidos expuesta en
la Figura 5 ó están codificadas por un vector de expresión designado
CD4-kLC-pRcCMV (ATCC No.
75194).
19. La célula huésped transformada, según la
reivindicación 18, en la que la célula es una célula de
mamífero.
20. La célula huésped de mamífero transformada,
según la reivindicación 19, en la que la célula es una célula COS,
una célula CHO o una célula de mieloma.
21. La célula huésped transformada, según la
reivindicación 18, en la que la célula secreta el heterotetrámero
quimérico de IgG2-CD4.
22. La célula huésped transformada, según la
reivindicación 18, en la que el vector que codifica las cadenas
pesadas es designado
CD4-IgG2HC-pRcCMV (ATCC No.
75193).
23. La célula huésped transformada, según la
reivindicación 18, en la que el vector que codifica las cadenas
ligeras es designado CD4-kLC-pRcCMV
(ATCC No. 75194).
24. La célula huésped transformada, según la
reivindicación 18, en la que el vector que codifica las cadenas
pesadas es designado
CD4-IgG2HC-pRcCMV (ATCC No. 75193) y
el vector que codifica las cadenas ligeras es designado
CD4-kLC-pRcCMV (ATCC No.
75194).
25. La célula huésped transformada, según la
reivindicación 18, en la que el DNA que codifica las cadenas
pesadas codifica la secuencia de aminoácidos expuesta en la Figura
4.
26. La célula huésped transformada, según la
reivindicación 18, en la que el DNA que codifica las cadenas
ligeras codifica la secuencia de aminoácidos expuesta en la Figura
5.
27. Un procedimiento para la preparación de una
composición según una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, que
comprende combinar el heterotetrámero quimérico de
IgG2-CD4 purificado de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3 ligado opcionalmente a una toxina con un
excipiente farmacéuticamente aceptable.
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