ES2237772T3 - Terapia genica usando vectores adenovirales ovinos. - Google Patents
Terapia genica usando vectores adenovirales ovinos.Info
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Abstract
SE DESCRIBE UN PROCEDIMIENTO DE TERAPIA GENICA EN UN SUJETO HUMANO, QUE INCLUYE ADMINISTRAR AL SUJETO UN VECTOR VIRICO FORMADO POR UNA MOLECULA DE ADN QUE INCLUYE UNA SECUENCIA DE ACIDO NUCLEICO QUE CODIFICA EL GENOMA DE UN ADENOVIRUS OVINO CAPAZ DE INFECTAR CELULAS HUMANAS, O UNA SECUENCIA DE ACIDO NUCLEICO O PORCION DE LA MISMA FUNCIONALMENTE EQUIVALENTE, Y AL MENOS UNA SECUENCIA DE ACIDO NUCLEICO QUE CODIFICA UN GEN QUE VA A SER EXPRESADO EN LA CELULA, DE FORMA QUE EL VECTOR VIRICO INFECTA AL MENOS UNA CELULA DEL SUJETO Y LA CELULA INFECTADA EXPRESA EL GEN.
Description
Terapia génica usando vectores adenovirales
ovinos.
La presente invención se refiere al uso de nuevos
vectores adenovirales ovinos para terapia génica en humanos. En
particular, la presente invención está dirigida a la introducción
de genes en células humanas usando estos vectores de forma que los
genes se expresen funcionalmente en las células.
Los defectos genéticos que causan enfermedades
tales como cáncer, fibrosis quística, distrofia muscular y muchos
otros trastornos contribuyen mucho al coste de la atención
sanitaria humana. En consecuencia, se están realizando grandes
esfuerzos de investigación en todo el mundo para desarrollar nuevas
estrategias que proporcionen una terapia génica eficaz a nivel de la
célula somática.
El fundamento de este trabajo es una diversidad
de vectores génicos derivados de virus tales como, retrovirus,
poxvirus, virus asociados a adeno y adenovirus. Los virus de los
que derivan estos vectores son de baja patogenicidad y los vectores
se diseñan para llevar genes terapéuticos al interior de la célula
hospedadora. En condiciones apropiadas, pueden producir productos
que pueden vacunar al hospedador, cambiar fenotipos celulares,
estimular las respuestas inmunes, suplementar defectos genéricos o
conducir a la muerte celular.
Ningún vector viral solo tiene todos los
atributos deseables para todas las situaciones terapéuticas.
Algunos vectores son más apropiados que otros para tareas
particulares debido a sus propiedades biológicas. Por ejemplo, como
los retrovirus pueden integrarse en el genoma del hospedador, estos
vectores parecen ser apropiados para suministrar genes a células en
división tales como las células madre en la estirpe de las células
hematopoyéticas. Por el contrario, los vectores de adenovirus,
normalmente no integran su ADN, pero son capaces de infectar con
eficacia a células que no se dividen. Se han usado vectores
adenovirales humanos para suministrar genes a una diversidad de
tejidos en seres humanos y en modelos animales, por ejemplo,
pulmones, músculo, hígado, células vasculares y cerebrales. Un
inconveniente principal del uso de adenovirus humanos es que como
estos virus infectan a humanos de forma natural, a menudo puede
ocurrir que la persona que va a tratarse con el vector adenoviral
humano tenga anticuerpos en circulación que pueden neutralizar al
vector antes de que éste alcance a la célula diana. La inmunidad
también tiene como resultado el aclaramiento eficaz del virus del
hospedador por el sistema inmune celular, disminuyendo así
rápidamente cualquier eficacia terapéutica debida a la expresión
génica. De esta manera, es necesario desarrollar vectores derivados
de virus que normalmente no infecten a humanos, solucionando así el
problema de la inmunidad preexistente. Como los adenovirus ovinos y
humanos son serológicamente diferentes, el uso de un adenoma ovino
(OAV) como vector puede conseguir este objetivo. También es
esencial desarrollar vectores cuya presencia en el hospedador esté
disimulada, de manera que la respuesta inmune sea menos severa y
sea más probable la persistencia de la expresión génica. Como el
adenovirus ovino no se replica de forma productiva, incluso en la
mayoría de las células animales no ovinas (1), se esperaba que se
replicara de forma abortiva en células humanas, siempre que pudiera
infectarlas. Un bloqueo de la replicación en una etapa temprana
conduciría a una mínima expresión de los productos virales en la
célula infectada, con un consiguiente bajo nivel de inducción de la
respuesta inmune celular.
Los presentes inventores han desarrollado un
vector adenoviral a partir del adenovirus ovino OAV287. En la
Solicitud de Patente Internacional Número WO 96/03508 presentada el
26 de julio de 1995 en nombre de la Commonwealth Scientific and
Industrial Research Organisation (a partir de ahora denominada en
este documento "la Solicitud PCT" e incorporada en este
documentos como referencia) se describen con detalle el virus y
vectores virales derivados del mismo. Según se usa en este
documento, se pretende que el término "OAV287" signifique un
adenovirus ovino que tiene la secuencia de nucleótidos de la figura
9 o una secuencia de nucleótidos funcionalmente equivalente. Se
descubrió que el vector adenoviral descrito en la Solicitud PCT era
adecuado para uso como un vector para introducir ADN extraño en
varias células no humanas, y en particular en células de oveja. La
secuencia del genoma y el ordenamiento de OAV287 son diferentes de
cualquier adenovirus humano, animal y de ave conocido, incluyendo
el adenovirus canino descrito en las Solicitudes de Patente
Internacional Números WO 91/11525 y WO 94/26914, el adenovirus
bovino descrito en la Solicitud de Patente Internacional Número WO
95/16048 y el aislado aviar CELO (2). OAV también es
serotípicamente distinto (1) y no se neutraliza por Ad5 de suero
humano. Esto concuerda con las distintas secuencias de aminoácidos
en los antígenos de hexona, pentona y fibra (3). También hay otras
diferencias principales en las proteínas de la cápsida de OAV en
comparación con otros adenovirus conocidos. OAV carece de homólogos
de las proteínas de la cápsida V y IX, pero contiene al menos otras
dos proteínas estructurales (3). Debido a la baja homología de
secuencia de nucleótidos entre OAV y otros adenovirus hay poca
probabilidad de que la recombinación entre OAV y otros adenovirus
durante la coinfección en el hospedador forme un virus recombinante
infeccioso.
Es crítico para el uso de vectores OAV para
terapia génica humana la cuestión de si OAV puede entrar realmente
en las células humanas. La entrada de adenovirus humanos en las
células humanas se realiza por medio de un proceso de dos etapas
que implica secuencias de aminoácidos concretas en las proteínas
base de fibra y pentona (4, 5). Primero, el virus se une a un
receptor de superficie no identificado por medio de la proteína
trimérica de fibra que sobresale de la superficie del virus. En
segundo lugar, se produce una interacción (principalmente) entre
las integrinas de clase \alpha_{v}\beta_{v} y un tripéptido
Arg/Gly/Asp (RGD) que forma parte del complejo proteico pentona en
la base de la punta de la fibra (6). Después, el virus entra en la
célula por endocitosis. El dominio de unión a la célula de la
proteína de fibra del adenovirus ovino OAV287 es más pequeño y
tiene una secuencia completamente diferente de la de sus adenovirus
homólogos humanos. Casi con toda certeza, se une a un receptor
primario diferente. En comparación con adenovirus humanos, la
proteína pentona de OAV también carece del motivo RGD crítico y de
las secuencias flanqueantes (3). De esta manera, no se sabía ni
podía predecirse si el OAV, incluyendo OAV287, podría infectar a
células humanas. Boyle et al, Veterinary Microbiology,
41(3):281-291, 1994 describen la
caracterización de aislados de adenovirus ovinos australianos.
Los presentes inventores han hecho el
sorprendente descubrimiento de que, a pesar de las importantes
diferencias en sus proteínas de unión a la célula, ciertos vectores
virales derivados del adenovirus OAV287 ovino pueden infectar a
diversas líneas celulares humanas, pero no a todas. Este
descubrimiento facilita el camino para el uso de OAV como un vector
para terapia génica en humanos.
En un primer aspecto, la presente invención
proporciona el uso de un vector viral que comprende una molécula de
ADN que incluye una secuencia de ácido nucleico que codifica el
genoma del adenovirus ovino OAV287; y al menos una secuencia de
ácido nucleico que comprende un gen a expresar en una célula humana,
donde el vector viral puede infectar a una célula humana de modo que
el vector viral entre en la célula y la célula exprese el gen, en
la fabricación de un medicamento para terapia génica humana.
Se prefiere que en la célula no tenga lugar la
replicación del virus. Es más preferible que no tenga lugar en la
célula la expresión de genes virales tempranos o tardíos.
Según se usa en este documento, la expresión
"secuencia de nucleótidos funcionalmente equivalente" pretende
incluir variaciones minoritarias en la secuencia del adenovirus
ovino que, debido a la degeneración del código del ADN, no tengan
como resultado un virus con actividades biológicas substancialmente
diferentes de las del adenovirus ovino nativo. Las proteínas
codificadas del adenovirus pueden tener alteradas las secuencias de
aminoácidos con respecto de las secuencias del virus nativo, pero
deben mantener substancialmente las mismas actividades biológicas
que las proteínas virales nativas. Esto puede conseguirse con
varios cambios en la secuencia, tales como inserciones, deleciones y
substituciones, conservativas o no conservativas, donde estos
cambios no alteran substancialmente al virus.
Un gen se define como cualquier secuencia de
ácido nucleico que codifica una molécula funcional. El gen puede
ser un oncogén, un gen supresor tumoral, puede codificar moléculas
terapéuticas incluyendo ARN antisentido o de ribozimas, un gen que
codifica un enzima, un gen que codifica una citoquina u otra
macromolécula inmunomoduladora, un gen que codifica un anticuerpo
recombinante, un gen que codifica un péptido lítico, un gen que
codifica un antígeno de vacuna, un gen que codifica una
macromolécula que complementa defectos genéticos en células
somáticas, o un gen que codifica una macromolécula que cataliza
procesos que conducen a la muerte celular. La muerte celular puede
darse directamente como resultado de la expresión génica o
indirectamente como resultado de una respuesta inmune contra una
macromolécula extraña expresada. Preferiblemente en gen codifica un
enzima tal como la timidina quinasa del herpesvirus o la citosina
desaminasa de animales no mamíferos que metaboliza un profármaco y,
más preferiblemente, el gen codifica una nucleósido de purina
fosforilasa procariótica y el profármaco es
6-metil-purina-2'-desoxirribonucleótido
(6MPPDR) o fludarabina. En presencia del profármaco apropiado, la
expresión del gen por la célula infectada y el metabolismo del
profármaco tienen como resultado un producto tóxico que conduce a la
muerte celular.
En una realización preferida adicional del primer
aspecto de la presente invención, el vector viral incluye un
promotor con especificidad celular unido de forma expresiva al gen
de modo que el gen se expresa sólo en una célula diana deseada.
Estos promotores son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, para
el tratamiento del cáncer de próstata, podría seleccionarse un
promotor entre el grupo que incluye, pero no de forma limitante,
promotores derivados de los genes de la probasina de rata, del
antígeno humano específico de próstata (PSA) o del antígeno de
membrana específico de próstata (PSMA). De manera similar, el
promotor de erbB-2 puede resultar útil para cánceres
de mama. Para otros cánceres tales como el cáncer de pulmón, podría
usarse el promotor del antígeno carcinoembrionario (CEA).
Una realización más preferida del primer aspecto
de la presente invención es el vector viral OAV211. El vector viral
puede comprender un cassette PSA/PNPasa/poliA de SV40.
El vector viral puede tener una o más regiones
codificantes del genoma del adenovirus modificadas o alteradas,
dando como resultado una proteína de la cubierta del virus alterada
o modificada. Más preferiblemente, la proteína de la cubierta
alterada o modificada se selecciona entre el grupo compuesto por las
proteínas base de la fibra, hexona y pentona.
La modificación preferiblemente implica la
substitución de regiones específicas del ADN adenoviral ovino por
regiones codificantes equivalentes de otro adenovirus animal o
humano.
Un adenovirus humano recombinante del tipo 5/lacZ
puede infectar a células CSL503. Por lo tanto, es posible
substituir los dominios de unión a la célula de las proteínas
pentona Ad5 y de la fibra por las regiones de las proteínas de OAV
mientras se retiene la capacidad del OAV híbrido para replicarse en
células CSL503. Este virus híbrido seguirá replicándose de forma
abortiva en células humanas. Por ejemplo, intercambiando el dominio
de unión a la célula de la proteína de la fibra del adenovirus
ovino por el dominio equivalente de un adenovirus humano o animal,
se permite que el OAV híbrido infecte a un espectro de células
diferente comparado con el OAV nativo. De manera similar, un
adenovirus ovino híbrido que porta el motivo RGD de la base de
pentona de un adenovirus humano o la región equivalente de un
adenovirus animal, podría entrar en una variedad más amplia de
células humanas y animales que el OAV de tipo silvestre. Un
adenovirus ovino híbrido que lleva ambas modificaciones de la
proteína de la fibra y de la pentona se uniría y entraría de forma
eficaz en el mismo especto de células que el adenovirus del cual se
obtuvieron las secuencias de unión a la célula, manteniéndose al
mismo tiempo las propiedades de replicación abortiva del adenovirus
ovino en células no ovinas. De esta manera, la modificación puede
tener como resultado el vector con especificidad de unión a una
célula diana deseada.
En un segundo aspecto, la invención proporciona
un vector viral que comprende el genoma del adenovirus ovino OAV287
modificado para incluir una molécula de ácido nucleico que
comprende un cassette PSA/ PNPasa/poliA de SV40.
En un tercer aspecto, la invención proporciona un
vector viral que comprende un genoma modificado del adenovirus
ovino OAV287 de modo que el vector viral expresa una proteína de la
fibra de adenovirus híbrido ovino/humano de tipo 5 Ad5f y no una
proteína de la fibra de adenovirus ovino de tipo silvestre.
En un cuarto aspecto, la invención proporciona un
vector viral que comprende un genoma modificado del adenovirus
ovino OAV287, de modo que el vector viral expresa una proteína
pentona de adenovirus de tipo 5 híbrido ovino/humano Adp5 y no una
proteína pentona de adenovirus ovino de tipo silvestre.
En un quinto aspecto, la presente proporciona un
vector viral que comprende un genoma modificado del adenovirus
ovino OAV287 de modo el vector viral expresa una proteína de la
fibra de adenovirus de tipo 5 híbrido ovino/humano Ad5f y una
proteína pentona Ad5p y no las proteínas de la fibra y pentona de
adenovirus ovino de tipo silvestre.
En un sexto aspecto, la invención proporciona un
método para producir un vector viral para la expresión de una
molécula de ácido nucleico en una célula humana, comprendiendo el
método:
construir un plásmido por clonación de una copia
de longitud completa del genoma del adenovirus ovino OAV287 en un
plásmido;
añadir al plásmido un cassette de expresión que
comprende una molécula de ácido nucleico a expresar en la célula
humana; transfectar una célula productora con el plásmido de modo
que la célula produzca el vector viral; y recuperar el vector
viral.
Los vectores virales de la presente invención
pueden administrarse a concentraciones de 10^{4} a 10^{14},
preferiblemente de 10^{6} a 10^{10} unidades formadoras de
placas por ml por vía tópica, oral o por inyección. Se apreciará que
la cantidad administrada y la vía de administración dependen del
tratamiento o terapia deseados.
Para que la naturaleza de la presente invención
se entienda más claramente, se describirán formas preferidas
haciendo referencia a los siguientes ejemplos y dibujos.
La figura 1 muestra un mapa del plásmido pOAV206
y el correspondiente virus recombinante que expresa el antígeno
VP7sc a partir del promotor de HCMV.
La figura 2 investiga la expresión de la proteína
indicadora VP7sc a partir del promotor de HCMV tras la infección de
varios tipos de células con OAV206. (A) células de pulmón ovino
CSL503 y células de mama humanas MCF7 (B) células de próstata
humana PC3 y LNCaP y de mama humana T47D2 (C) células de melanoma
humano MM418E y células de pulmón humano MRC5. (U) e (I) indican
células no infectadas e infectadas, respectivamente. (M) indica
proteínas marcadoras de los tamaños indicados. En (D), se
infectaron células CSL503, PC3 y de riñón de conejo con OAV204 que
expresa VP7sc a partir del OAV MLP/TLS (véase "la solicitud
PCT").
La figura 3 muestra la secuencia de aminoácidos
de la proteína híbrida de la fibra en OAV206/Ad5f en el punto de
unión entre las secuencias de OAV (subrayadas) y el domino de unión
a la célula de Ad5.
La figura 4 muestra la secuencia de aminoácidos
de la proteína pentona modificada en OAV206/Ad5p seguida de la
inserción del motivo RGD de Ad5, los restos subrayados significan
las uniones entre las secuencias de OAV y Ad5.
La figura 5 muestra el efecto de la activación
metabólica de la infección con OAV211 usando células (A) T47D2 y
(B) células de cáncer de mama McF7 in vitro en presencia del
profármaco 6MPDR.
La figura 6 investiga la expresión de VP7sc en
células LNCaP y MCF7 tras la infección con OAV206 u
OAV206Ad5f. (U) indica células no infectadas. Tiempo se refiere a horas desde la infección.
OAV206Ad5f. (U) indica células no infectadas. Tiempo se refiere a horas desde la infección.
La figura 7 muestra el análisis por
RT-PCR de los transcritos de ARN de los genes de
(A) pentona, (B) hexona y (C) GAPDH. Se prepararon muestras de ARN a
los tiempos indicados a partir de células no infectadas (mostradas
por los puntos) e infectadas. Los transcritos de pentona se
analizaron a las 24 y 48 h para todos los tipos de células. Los
transcritos de hexona se analizaron a los tiempos mostrados.
La figura 8 muestra un análisis por
RT-PCR de los transcritos derivados de un promotor
localizado en el extremo derecho del genoma de OAV en varios tipos
de células. El ARN se recogió a los tiempos mostrados.
La figura 9 es la secuencia de ácido nucleico del
genoma de OAV287 empezando por la base 1 del ITC a la
izquierda:
Las técnicas para la manipulación de secuencias
de ADN y la modificación de plásmidos son bien conocidas en la
técnica y se describen en publicaciones tales como Sambrook et
al. (7). El plásmido pOAV100 se construyó clonando una copia de
longitud completa del genoma de OAV287 en el sitio KpnI del M13
Bluescribe (Stratagene) que se había modificado para eliminar
secuencias entre sus sitios HindIII y SmaI, como se ha descrito
previamente (la Solicitud PCT). pOAV100 carece del sitio SphI que
estaba presente en la secuencia de tipo silvestre de OAV287 en la
posición 8292. pOAV100 se modificó posteriormente, usando kits de
mutagénesis Muta-gene Phagemid (Biorad Labs, CA) o
sitios Alterados II (Promega, Wi), por la incorporación de una
secuencia de veinte nucleótidos que contenía los sitios ApaI y NotI
entre los nucleótidos 22.129 y 22.130 del genoma, una localización
entre los genes pVIII y de la fibra. El plásmido resultante,
pOAV200, era el aceptor de los cassettes de expresión génica que se
insertaron en el genoma de OAV287 usando los sitios ApaI/Notl (la
Solicitud PCT). Por ejemplo, el cassette gen/promotor HCMV/VP7sc se
ensambló en un plásmido distinto y se incorporó en pOAV200 usando
los sitios flanqueantes ApaI/Notl, formando el plásmido
pOAV206.
El virus OAV206/Ad5f que llevaba una proteína de
fibra modificada, se construyó como se indica a continuación. Para
modificar el dominio de unión celular propuesto en el extremo
C-terminal de la proteína de la fibra de OAV, se
subclonó el fragmento SphI/SalI derivado de las bases
21.527-28.644 de la secuencia genómica de OAV287 en
un plásmido pAlter-1 (Promega) cortado con
SphI/SalI. Se usaron oligonucleótidos mutagénicos y el kit de
mutagénesis Altered sites II (Promega Wi) para introducir sitios
NcoI y CelII en las posiciones 23.454 y 23.894 de la secuencia,
respectivamente. Se usaron cebadores oligonucleotídicos que
incorporaban sitios NcoI y CelII para amplificar por PCR la porción
equivalente del genoma del adenovirus humano de tipo 5 entre los
nucleótidos de las posiciones 32.156 y 32.776, que codificaban el
dominio de unión celular Ad5 (5). Este fragmento de PCR se digirió
con NcoI y CelII y se clonó en el plásmido pAlter-1
recombinante cortado con NcoI/CelII para reemplazar las secuencias
de OAV. Después se subclonó un fragmento AgeI/SalI que contenía el
gen de la fibra modificado en el plásmido pOAV206 cortado con
AgeI/SalI para crear el plásmido pOAV206/Ad5f. La secuencia de la
proteína modificada creada se muestra en la figura 3.
Para modificar la proteína pentona, el fragmento
XmaI/SphI de OAV287 de 13 kb (bases 9.224-21.537)
que contenía el gen de la pentona se subclonó en
pAlter-1 cortado con XmaI/SphI y se mutó por la
introducción de sitios AatII y XhoI en las posiciones 12.654 y
12.674, respectivamente. Se usaron cebadores oligonucleotídicos de
mutagénesis que contenían estos sitios de restricción para
amplificar por PCR la porción equivalente del gen de la pentona
humana Ad5 que contenía el motivo PGD
hélice-bucle-hélice (8). Podrían
usarse secuencias similares de otros adenovirus. Este fragmento
(279 pb) se subclonó en el plásmido pAlter-1
cortado con AatII/XhoI mutado para reemplazar las secuencias de
OAV. Después se subclonó el fragmento XmaI/SphI en pOAV206 cortado
con XmaI/SphI para construir un plásmido potencialmente infeccioso,
pOAV206/Ad5p. Este plásmido puede usarse para recuperar un virus
(OAV206/Ad5p) que porta una proteína pentona modificada. La
derivación de la secuencia de la proteína peptona híbrida se
muestra en la figura 4.
El virus recombinante, OAV211, que contenía un
cassette PSA/PNPasa/poli A se construyó como se indica a
continuación. Se aisló un fragmento con el promotor de PSA de 620
pb a partir del ADN de leucocitos de la sangre por amplificación
por PCR y se subclonó en el vector pGerm-T (Promega
Corp. Madison, WI). De manera similar, el gen DeoD de E.
coli (Número de Acceso del Genbank M60917) se amplificó a
partir del ADN genómico usando cebadores para PCR que introdujeron
sitios SpeI y BamHI en las bases 105 y 849, respectivamente, de la
secuencia del Genbank, y se digirió con esos enzimas. Se preparó un
fragmento de 513 pb que contenía una señal de poliadenilación de
SV40 por digestión de pJC119 (9) con BamHI y SalI. Este fragmento
se clonó en una ligación de tres vías con el fragmento de PCR DeoD
en un vector pGem/PSA cortado con SpeI y SalI. El cassette
PSA/PNPasa después se cortó con XbaI y SalI y se subclonó en un
plásmido pXCX3 basado en el adenovirus de tipo 5 cortado con SpeI y
SalI. (pXCX3 se obtuvo a partir de pXCX2 (10) clonando en su sitio
XbaI un polienlazador que contenía sitios KpnI, SpeI, EcoRV, BglII
y SalI). A partir de aquí se subclonó el cassette por medio de
pGem11zf+ en los sitios ApaI/NotI de pOAV200, formando pOAV211.
La digestión de los plásmidos pOAV100, pOAV200 y
pOAV206/Ad5f con KpnI liberaba el OAV287 lineal o genomas virales
modificados. Éstos se introdujeron por transfección en células
CSL503 usando lipofectamina (Gibco BRL) y procedimientos
previamente descritos (la Solicitud PCT). Los genomas viables son
infecciosos en células CSL503 en estas condiciones y se produce el
virus, causando un efecto citopático en las células. Sin embargo,
pOAV206 y pOAV211 se recuperaron sin digestión por KpnI. Esto fue
hasta cierto punto sorprendente, ya que generalmente se considera
que para la recuperación se requiere un extremo genómico libre
(11,12). Los virus recuperados se caracterizaron por digestión con
enzimas de restricción para confirmar que sus estructuras genómicas
eran correctas. Alternativamente, el complejo de proteína
terminal-ADN de OAV se preparó por centrifugación
en gradientes que contenían guanidina-HCl 4 M/ CsCl
2,5 M a 40.000 rpm durante 20-22 h en un rotor Ti80
como se describe para la Ad5 humana (13). La recuperación de
plásmidos grandes como virus infecciosos puede mejorarse
cotransfectando éstos en células CSL503 junto con un fragmento del
complejo proteína terminal-ADN de OAV, por ejemplo,
tras la digestión con BglI/StuI.
Se infectaron líneas celulares de pulmón ovino
CSL503, de riñón de conejo y humanas de forma simulada o real con
virus a una multiplicidad de infección de 20 pfu/célula como se ha
descrito previamente (14). Se dejó que la infección siguiera
durante 12-96 horas, dependiendo de la línea
celular. Se preparó ARN poliadenilado a partir de \sim10^{7}
células usando técnicas estándar. Se sintetizó el ADNc total usando
una transcriptasa inversa de AMV cebada con oligo(dT) o un
cebador específico. Los ADNc se amplificaron por PCR usando
cebadores específicos para el gen de interés y se analizaron en
geles de agarosa. Para analizar la expresión de proteínas, las
células se incubaron en medio sin metionina en presencia de
35S-metionina para marcar las proteínas recién
sintetizadas. La proteína de interés se recuperó de los lisados
celulares por inmunoprecipitación usando un antisuero específico
contra la proteína expresada (14). Las proteínas recuperadas se
analizaron por electroforesis en geles de
poliacrilamida-SDS y se detectaron por
autorradiografía o usando un Phosphorimager (Molecular
Dynamics).
La gama de hospedadores del virus OAV287 es
desconocida pero se piensa que está ampliamente restringida a
células ovinas, ya que el virus no podía crecer en células de riñón
de conejo, bovinas (MDBK) y de simio (CV-1) (1). Los
presentes inventores sólo han observado infección productiva del
virus en células de pulmón de oveja (línea CSL503) y en mucha menos
extensión en una línea celular del cornete nasal ovino.
Como los adenovirus ovinos no se replican de
forma productiva en células heterólogas, no es una cuestión
sencilla determinar si el virus entra en las células pero se
bloquea en un estadio de replicación temprano, o si no puede entrar
de ninguna manera. Para investigar este problema y para determinar
la gama de hospedadores del adenovirus ovino, los presentes
inventores han usado el virus recombinante OAV206 que porta el
elemento promotor/potenciador del citomegalovirus humano IE94
(HCMV) unido funcionalmente al gen del antígeno de rotavirus VP7sc
y a una señal de poliadenilación (la Solicitud PCT). El cassette de
expresión se inserta en el genoma del adenovirus ovino entre los
genes que codifican las proteínas pVIII y de la fibra (figura 1).
Este virus se usó para infectar varios tipos de células humanas y
se controló la expresión de la proteína VP7sc por
inmunoprecipitación de la proteína radiomarcada. Está claro que
(figuras 2A, B y C) la expresión de VP7sc se detectaba en dos líneas
celulares humanas de mama (T47D2 y McF7), una línea de cáncer de
próstata (PC3) y la línea de fibroblastos de pulmón humanos MRC5.
De esta manera, OAV206 infectaba a estas células, a pesar de sus
proteínas únicas de unión a la célula. La infección también era
eficaz. En células McF7, por ejemplo, a una MOI (multiplicidad de
infección) de sólo 20, \sim30-50% de las células
expresaban VP7sc como se muestra en los estudios de
inmunofluorescencia. Sin embargo, no se infectaban todas las líneas
celulares humanas, la expresión de VP7sc no se detectó en la línea
celular humana de melanoma MM418E o en la línea celular de próstata
LNCaP. Este último resultado fue sorprendente, ya que la línea
celular de próstata PC3 se infectaba de forma eficaz.
OAV211 contiene el cassette PSA/PNPasa/poli A de
SV40. Este fragmento promotor de PSA no se expresa de manera
específica de tejido y tiene una actividad relativamente baja en
varios tipos de células, según muestran ensayos que usan el gen
indicador CAT. PNPasa es un enzima que metaboliza el profármaco
6-metilpurina-2'-desoxirribonucleósido
(6MPDR) para dar el producto tóxico 6MP, que es tóxico para las
células (15). La línea celular humana de próstata PC3 y las líneas
de cáncer de mama McF7 y T47D2 se infectaron con OAV211 a una MOI de
10. Otras células se dejaron sin infectar. Tanto las células
infectadas como las no infectadas se incubaron en presencia de 6MPDR
0-100 \muM durante periodos de hasta 20 días. La
actividad metabólica de las células se controló usando Azul de
Alamar (Alamar Biosciences Inc., Sacramento, CA). La infección de
OAV no tuvo efecto detectable en células PC-3, McF7
o T47D2 a los 13 días p.i. El profármaco (0-100
\muM) no tuvo efecto sobre las células T47D2 (figura 5A). Las
células McF7 mostraron alguna reducción en la actividad metabólica
(figura 5B), aunque la mayoría de las células se recuperaron cuando
se retiró el fármaco. Sin embargo, tras la infección con OAV211 en
presencia de 6MPDR 50-100 \muM, las dos líneas
celulares de cáncer de mama se destruían después de 13 días p.i., a
pesar del hecho de que nuestro reciente trabajo reveló que el
fragmento promotor de PSA sólo tiene un bajo nivel de actividad en
estas células. Se obtuvieron resultados similares con la línea
celular de próstata PC3. La demostración de que los vectores OAV
pueden infectar ciertas células cancerosas humanas los hace útiles
para el suministro de terapias de
enzima-profármaco. Podría esperarse una mejora
considerable de la muerte celular con un promotor más activo. Otros
compuestos tales como
arabinofuranosil-2-fluoroadenina
(Fludarabina) también podrían usarse como substratos de la
PNPasa.
El dominio de unión celular en el ápice de la
proteína de la fibra es el principal sitio de unión de adenovirus
con receptores desconocidos en la superficie celular (5). Cambiando
este dominio, sería posible alterar el tropismo celular de un
adenovirus, siempre que se mantenga la integridad de la proteína
trimérica de la fibra. El dominio de unión celular de la proteína de
la fibra de OAV se intercambió por la región equivalente del
adenovirus humano de tipo 5 como se describe en la figura 3. El
virus, OAV206/Ad5f, se recuperó tras la transfección del
correspondiente plásmido en células CSL503. Se usaron virus OAV206
y OAV206/Ad5f para infectar células humanas LNCaP y McF7. Se
controló la expresión de VP7sc en estas células a las 12, 24 y 48
horas después de la infección como indicador de si el virus entraba
en las células. Las células infectadas de forma simulada se
controlaron a las 24 horas p.i. De acuerdo con los datos de las
figuras 2A y 2B, OAV206 fue capaz de infectar las células McF7,
pero no LNCaP, como muestra la expresión de VP7sc (figura 6, calles
2-4 y calles 8, 10 y 11). Sin embargo, OAV206/Ad5f
infectaba tanto a las células LNCaP como a McF7 y expresaban VP7sc
de forma eficaz (figura 6, calles 5-7 y calles
12-14). El tamaño diferente de VP7sc en estos tipos
celulares refleja las diferencias en los carbohidratos unidos a la
proteína (14). De este modo, cambiando el dominio de unión celular
de la proteína de la fibra de OAV por el de Ad5 se permitía que
OAV206/Ad5f infectara a las células humanas LNCaP que no se
infectaban con OAV. Seleccionando los dominios de unión a las
células de otros adenovirus, será posible cambiar la capacidad de
OAV para infectar determinados tipos de células. También cambiando
la secuencia de la proteína pentona como se describe en la figura
4, será posible definir además el tropismo celular de OAV. Los virus
híbridos retendrían sus propiedades de replicación abortiva.
Estos datos demuestran claramente que el
adenovirus ovino puede entrar en algunos, pero no en todos, los
tipos de células humanas y expresar un gen extraño a partir de un
promotor activo. Es posible variar el promotor y el gen en el
cassette de expresión portado por el virus. Por ejemplo, podrían
usarse promotores específicos de tejido de próstata tales como
probasina (15) o PSMA (17), el promotor de erbB-2
que es específicamente activo en algunos cánceres de mama (18) o el
promotor CEA específico de tumor (19), para conseguir especificidad
de muerte celular por sistemas enzima-profármaco.
Cuando sea apropiado, deben usarse promotores adecuadamente activos
en otros tejidos. Entre los genes que podrían suministrarse se
incluyen oncogenes o genes supresores de tumores u otros genes
terapéuticos que codifican ARN antisentido o de ribozima
(catalítico), citoquinas y otras proteínas inmunomoduladoras,
antígenos para vacunas, proteínas cuyos procesos catalíticos
conducen a la muerte celular y otros que complementan defectos
genéticos en células somáticas. Como OAV y sus derivados
recombinantes no se replican de forma productiva en células
heterólogas, permiten el suministro y la expresión de genes sin el
riesgo de expansión viral en hospedadores no diana y con efectos
secundarios mínimos para el hospedador.
Tras la infección, el genoma de OAV puede
persistir en algunas células humanas durante un tiempo considerable
con un efecto detectable pequeño. Por ejemplo, se infectaron
células PC3 con OAV a una MOI de 20 y se mantuvieron en cultivo
durante periodos de hasta 3 semanas. Durante este tiempo, las
células mostraron cambios fenotípicos mínimos en comparación con
células PC3 no infectadas. Tres semanas después de la infección, se
extrajo el ADN de las células PC3 y se amplificó una porción de
éste por PCR. El genoma viral seguía siendo detectable, demostrando
que éste persistía. Por el contrario, cuando se usaron células
LNCaP, el genoma viral ya era indetectable a 2-5
días p.i. Como OAV no infecta a las células LNCaP, este resultado
demuestra que el genoma ha tenido que persistir dentro de las
células PC3 y confirma que la infección tiene un efecto pequeño. La
persistencia del genoma y la supervivencia celular puede deberse a
la inactividad de los promotores de OAV y a la consecuente pérdida
de la síntesis de proteína viral. Esto podría ser ventajoso para
terapia génica, ya que en vectores de adenovirus humanos, la
función residual de MLP tiene como resultado un bajo nivel de
síntesis de proteínas de la cápsida viral altamente inmunogénicas
que estimulan una respuesta inmune. Esto no es deseable, ya que
tiene como resultado el aclaramiento del virus por el sistema inmune
celular (20). La persistencia de los genomas de OAV en células no
permisivas debe permitir que continúe la expresión génica
terapéutica.
La actividad del promotor en células infectadas
por OAV se examinó primero indirectamente incubando células con
^{35}[S]metionina para marcar las proteínas. El
virus recombinante (OAV204), que lleva el cassette MLP/TLS/VP7sc
expresaba rápidamente VP7sc en células CSL503 (la solicitud PCT),
pero no lo expresaba en células de riñón de conejo o en células de
próstata humana PC3 (figura 2D). También fue indetectable la
síntesis de proteínas virales tardías tales como hexona, de la
fibra y pentona en estas células por radiomarcaje, aunque eran
fácilmente detectables en las CSL503 permisivas.
Se realizó un estudio más sensible de la función
del promotor en CSL503 y en células no ovinas usando transcripción
inversa y PCR para buscar transcritos de ARN. Se preparó ARN
poliadenilado total a partir de células CSL503, PC3,
MRC-5, McF7, T47D2, RK15 y LNCaP a diversos tiempos
después de la infección con OAV206 (MOI 20 pfu/célula). Se
sintetizó ADNc usando la transcriptasa inversa cebada con
oligo(dT). Los ADNc seleccionados se amplificaron después
usando un cebador 5' del exón 2 del TLS (la solicitud PCT) y un
cebador 3' complementario al transcrito de interés. Los productos
de PCR de la pentona y la hexona (tamaños esperados de 606 y 740
pb, respectivamente) se amplificaron a partir del ARN de células
CSL503 infectadas con OAV206 pero no desinfectadas recolectadas a 24
y 48 horas p.i. (figura 7). También se amplificaron productos del
tamaño esperado a partir de los transcritos de la fibra y de IIIa.
Sin embargo, no se amplificaron de forma detectable productos de
PCR de la hexona y la pentona cuando se analizaron por
RT-PCR los ARN de cualquier línea celular humana o
animal (figura 7). El producto previsto se amplificó para el enzima
GAPDH interna en todas las muestras. De esta manera, el OAV MLP no
funciona de forma detectable en células no ovinas. Esto es
suficiente para explicar por qué la replicación es abortiva en
estos tipos de células.
Se hicieron observaciones similares para los
transcritos derivados de un promotor temprano. En el extremo
derecho del genoma se localiza un grupo de fases de lectura abierta
de función desconocida (denominadas provisionalmente como la región
E3? en la solicitud PCT). Usando RT-PCR y cebadores
que empiezan en las posiciones 26.700 y 29.220, se amplificaron
productos de \sim750 y \sim550 pb a partir de ARN
poliadenilados aislados de células CDL503 infectadas con OAV pero
no desinfectadas (figura 8). También se detectó un producto de
\sim2.500 pb a las 48 horas p.i. Éste se amplificó a partir del
ADN genómico replicado. La secuenciación de nucleótidos demostró que
los productos de 750 y 550 pb se producían por ayuste en diferentes
localizaciones. Por lo tanto, estos ARN se transcriben en dirección
de derecha a izquierda a partir de un promotor no identificado que
tiene que estar localizado entre el primer codón de metionina de
esta cadena (bases 29.425-29.427) y el final del
genoma. Los transcritos pueden detectarse por RT-PCR
ya a las doce horas p.i. y destacan más a las 24 horas p.i. (figura
8). Usando los mismos cebadores, se llevó a cabo una
RT-PCR sobre ARN preparado a partir de las células
de conejo y humanas infectadas y no infectadas descritas en la
figura 7. Los productos de PCR detectados en las células CSL503 no
se detectaron en ninguna otra de las células infectadas con OAV
(figura 8), demostrando que este promotor temprano no funciona de
forma detectable en varias células humanas y no ovinas. Los
productos más pequeños de PCR se detectaron en células MRC5 a las 96
horas p.i., lo que indica que el promotor estaba activo en este
momento (figura 8). También se vio un producto de \sim900 pb
derivado del ARN celular. Sin embargo, la ausencia del producto de
2,5 kb demostraba que en estas células no tenía lugar replicación
del ADN. Los datos demuestran que en la mayoría de las células no
ovinas, no era detectable la función promotora temprana y tardía.
OAV parece ser un vector benigno en algunas células aunque sigue
siendo capaz de suministrar un gen expresado a partir de un
promotor extraño.
En la Solicitud PCT se ha demostrado que ciertos
vectores recombinantes de OAV287 pueden infectar a animales y
suministrar genes extraños a células de esos animales. Además, en
la presente memoria descriptiva se ha demostrado que los vectores
virales derivados de OAV287 pueden infectar células humanas y
suministrar genes terapéuticos a esas células. Por estos resultados
se apreciará que ciertos vectores virales derivados de adenovirus
ovinos y especialmente ciertos vectores derivados de OAV287
funcionarían como se describe para suministrar genes a humanos.
En resumen, la replicación del adenovirus OAV287
en varias líneas celulares humanas es abortiva y no se producen
virus detectables. Se considera una replicación abortiva por la
falta de función promotora temprana y tardía. Puede conseguirse una
reducción adicional de la actividad promotora viral en algunos
tipos de células introduciendo una mutación en el gen de la proteína
de unión al ADN, como se muestra para los vectores de adenovirus
humanos (21). Los vectores de adenovirus ovinos que infectan de
forma abortiva a células humanas y expresan funcionalmente un gen
terapéutico serían ventajosos para uso en terapia génica,
particularmente porque no se neutralizarían por anticuerpos contra
adenovirus humanos. Debido a su secuencia de nucleótidos única, es
poco probable que los vectores OAV sufran recombinación homóloga
con adenovirus humanos circulantes.
El uso de la presente invención tiene las
siguientes ventajas con respecto al uso de adenovirus humanos o no
humanos en terapia génica:
- vector viral capaz de infectar células
humanas;
- vector viral que se replica deficientemente en
células humanas;
- baja expresión génica residual del vector viral
en células humanas:
- recombinación del vector viral con otros
adenovirus no ovinos poco probable:
- baja probabilidad de exposición previa a
adenovirus bovinos y, por lo tanto, sin que se formen anticuerpos
contra el virus vector.
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Proc Natl Acad Sci USA 91, 6196-6200
(1994).
Claims (19)
1. El uso de un vector viral que comprende una
molécula de ADN que incluye una secuencia de ácido nucleico
codificante del genoma del adenovirus ovino OAV287; que tiene la
secuencia de nucleótidos mostrada en la figura 9 y al menos una
secuencia de ácido nucleico que comprende un gen a expresar en una
célula humana, donde el vector viral puede infectar a un célula
humana de manera que el vector viral entra en la célula y la célula
expresa el gen, en la fabricación de un medicamento para terapia
génica humana.
2. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, en
el que no tiene lugar la replicación del virus en la célula.
3. El uso de acuerdo con la reivindicación 1, en
el que no tiene lugar la expresión génica viral temprana o tardía
en la célula.
4. El uso de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que el gen se selecciona entre el
grupo compuesto por oncogenes, genes supresores de tumores, ARN
antisentido y ribozimas, genes codificantes de enzimas, genes
codificantes de citoquinas y de otras moléculas inmunomoduladoras,
genes codificantes de anticuerpos recombinantes, genes codificantes
de péptidos líticos, genes codificantes de antígenos para vacunas,
genes codificantes de macromoléculas que complementan defectos
genéticos en células somáticas, y genes codificantes de
macromoléculas que catalizan procesos que conducen a la muerte
celular.
5. El uso de acuerdo con la reivindicación 4, en
el que la molécula de ácido nucleico codifica un enzima que
metaboliza un profármaco.
6. El uso de acuerdo con la reivindicación 5, en
el que el gen codifica la nucleósido de purina fosforilasa
procariótica (PNPasa) y el profármaco es
6-metil-purina-2'-desoxirribonucleósido
(6MPDR) o fludarabina.
7. El uso de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, en el que el vector viral incluye un
promotor con especificidad celular unido de forma operativa al gen
de modo que el gen se expresa sólo en una célula diana deseada.
8. El uso de acuerdo con la reivindicación 7, en
el que el promotor con especificidad celular se selecciona entre el
grupo compuesto por los promotores de la probasina de rata, el
antígeno humano específico de próstata (PSA), el antígeno de
membrana específico de próstata (PSMA), erbB-2 y
antígeno carcinoembrionario (CEA).
9. El uso de acuerdo con la reivindicación 8, en
el que la célula diana es una célula cancerosa humana de próstata o
de mama.
10. El uso de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9, en el que el vector viral comprende un
cassette de antígeno específico de próstata (PSA)/nucleósido de
purina fosforilasa procariótica (PNPasa)/poli A de SV40.
11. El uso de acuerdo con una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 10, en el que el vector viral tiene una o más
regiones codificantes del genoma del adenovirus modificado o
alterado para dar como resultado una proteína de la cubierta del
virus modificada o alterada.
12. El uso de acuerdo con la reivindicación 11,
en el que la proteína de la cubierta modificada o alterada se
selecciona entre el grupo compuesto por las proteínas base de la
fibra, hexona o pentona.
13. El uso de acuerdo con la reivindicación 11 o
la reivindicación 12, en el que la modificación implica la
substitución de regiones específicas del ADN adenoviral ovino por
las regiones codificantes equivalentes de otros adenovirus animales
o humanos.
14. El uso de acuerdo con la reivindicación 11,
de modo que la modificación da como resultado el vector que tiene
especificidad de unión a una célula diana deseada.
15. Un vector viral que comprende el genoma del
adenovirus ovino OAV287 que tiene la secuencia de nucleótidos
mostrada en la figura 9 modificada para incluir una molécula de
ácido nucleico que comprende un cassette del antígeno específico de
próstata (PSA)/nucleósido de purina fosforilasa procariótica
(PNPasa)/poli A de SV40.
16. Un vector viral que comprende un genoma del
adenovirus ovino OAV287 que tiene la secuencia de nucleótidos
mostrada en la figura 9 modificada de modo que el vector viral
expresa una proteína de la fibra de adenovirus híbrido ovino/humano
de tipo 5 Ad5f y no una proteína de la fibra de adenovirus ovino de
tipo silvestre.
17. Un vector viral que comprende un genoma del
adenovirus ovino OAV287 que tiene la secuencia de nucleótidos
mostrada en la figura 9 modificada de modo que el vector viral
expresa una proteína pentona de adenovirus híbrido ovino/humano de
tipo 5 Ad5p y no una proteína pentona de adenovirus ovino de tipo
silvestre.
18. Un vector viral que comprende un genoma del
adenovirus ovino OAV287 que tiene la secuencia de nucleótidos
mostrada en la figura 9 modificada de modo que el vector viral
expresa una proteína de la fibra de adenovirus híbrido humano/ovino
de tipo 5 Ad5f y una proteína pentona de adenovirus híbrido
humano/ovino de tipo 5 Ad5p y no las proteínas de la fibra y pentona
del adenovirus ovino de tipo silvestre.
19. Un método de producción de un vector viral
para la expresión de una molécula de ácido nucleico en una célula
humana, comprendiendo el método:
construir un plásmido por clonación de una copia
de longitud completa del genoma del adenovirus ovino OAV287 que
tiene la secuencia de nucleótidos mostrada en la figura 9 dentro de
un plásmido;
añadir al plásmido un cassette de expresión que
comprende una molécula de ácido nucleico a expresar en la célula
humana;
transfectar una célula productora con el plásmido
de modo que el vector viral se produzca en la célula;
y recuperar el vector viral.
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