ES2248849T3 - Generacion de moleculas replicantes "in vivo". - Google Patents
Generacion de moleculas replicantes "in vivo".Info
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Abstract
LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A MOLECULAS DE ADN CIRCULARES Y DE REPLICACION, UTILIZABLES EN TERAPIA GENICA, ASI COMO A UN METODO PARTICULARMENTE EFICAZ PARA SU GENERACION IN SITU A PARTIR DE UN VECTOR VIRAL.
Description
Generación de moléculas replicantes "in
vivo".
La presente invención se refiere a moléculas de
ADN circulares y replicantes, utilizables en terapia genética. La
invención describe igualmente un método particularmente eficaz para
su generación "in situ" a partir del vector vírico
correspondiente.
La terapia genética consiste en corregir una
deficiencia o una anomalía (mutación, expresión aberrante, etc.)
para introducir una información genética en la célula u órgano
afectado.
Esta información genética puede introducirse ya
sea "in vitro" en la molécula extraída del órgano,
después de lo cual se reintroduce en el organismo la célula
modificada, ya sea directamente "in vivo" en el tejido
apropiado. En este segundo caso existen diferentes técnicas, entre
ellas técnicas diversas de transfección que implican vectores de
diversas naturalezas. Puede tratarse por un lado de vectores
químicos y/o bioquímicos, naturales o sintéticos y por otro lado de
vectores víricos. A título ilustrativo de vectores víricos se pueden
citar por ejemplo los complejos de ADN y
DEAE-dextrano (Pagano y col., J. Virol. 1,
891, 1967); de ADN y proteínas nucleares (Kaneda y col., Science
243, 375, 1989); de ADN y lípidos (Felgner y col., PNAS
84, 7413, 1987); los liposomas (Fraley y col., J. Biol. Chem.
255, 10431, 1980), etc. En cualquier caso, su utilización
implica sobre todo la posibilidad de producir cantidades importantes
de ADN de una pureza farmacológica.
Los vectores víricos (retrovirus, adenovirus,
virus adeno-asociados,...) son muy eficaces si se
comparan con los vectores químicos y/o bioquímicos recién
mencionados, sobre todo para atravesar membranas. Entre estos virus,
los adenovirus presentan muy en particular propiedades interesantes
para su utilización en terapia genética. Por ejemplo, tienen un
espectro de hospedantes bastante amplio, son capaces de transducir
las células en división o bien células quiescentes y el genoma del
adenovirus persiste en forma extracromosómica, además no están
asociados actualmente con patologías importantes del hombre. Por
contra, la utilización del retrovirus, cuyo genoma se integra de
forma aleatoria en el genoma de la célula infectada, se limita a las
células en división. Se han utilizado también los adenovirus para
transferir genes de interés a células quiescentes musculares
(miotubos; Ragot y col., Nature 361, 647, 1993), hepáticas
(Jaffe y col., Nature genetics 1, 372, 1992), nerviosas (Akli
y col., Nature genetics 3, 224, 1993), epiteliales de
bronquios (Rosenfeld y col., 1992), etc. Sin embargo, en los tejidos
que se renuevan con rapidez se observa una pérdida progresiva de la
expresión del transgén por efecto de la dilución en el curso de las
divisiones celulares.
La mejora de los vectores adenovíricos y el
desarrollo de nuevas generaciones de vectores ha conducido a la
disminución de riesgos potenciales de potencia patológica residuales
y de potencia inmunogénica, asociados con la replicación del vector,
la recombinación de su genoma y la expresión de proteínas
víricas.
Para prevenir al máximo tales riesgos, se
modifican las construcciones de vectores víricos propuestas
actualmente de tal manera que dichos vectores se convierten en
incapaces de replicar de forma autónoma dentro de la célula diana.
Se denominan deficientes. En general, el genoma de los virus
deficientes está, pues, desprovisto por lo menos de las secuencias
necesarias para la replicación de dicho virus en la célula
infectada. Por ello, en el caso particular de los adenovirus, las
construcciones descritas en la técnica anterior son los adenovirus
que han sufrido deleción de las regiones E1 y eventualmente E3 en el
nivel en el que están insertadas las secuencias de ADN heterólogas
(Levrero y col., Gene 101, 195, 1991;
Gosh-Choudhury y col., Gene 50, 161, 1986).
Otras construcciones suponen una deleción en el nivel de la región
E1 y de una parte no esencial de la región E4 (WO 94/12649) o una
organización genómica modificada (FR 94 13355).
No obstante, en el momento de la producción de
estos vectores víricos deficientes, sigue habiendo el riesgo de
recombinación, la cual generaría partículas víricas replicantes o de
transcomplementación "in vivo" mediante funciones
celulares de tipo E1. Está claro que la utilización en terapia
genética de vectores contaminados de este tipo puede tener
consecuencias muy nefastas, por ejemplo la de inducir la propagación
vírica y provocar la diseminación incontrolada con riesgo de
reacción inflamatoria y de respuesta inmunológica dirigida contra
las proteínas víricas, etc.
Por otro lado, la mejora de la estabilidad de
expresión del transgén en las células transducidas por el vector
adenovírico, y más en particular en las células en división,
continúa siendo un problema importante sin resolver. Por
consiguiente, sigue habiendo actualmente en terapia genética una
demanda real de vectores de transferencia que manifiesten
esencialmente las ventajas de cada uno de los vectores mencionados
anteriormente, a saber buenas propiedades de transfección, calcadas
por ejemplo de las de vectores víricos y en particular de las de
adenovirus y una perfecta inocuidad que se traduzca en particular en
una ausencia de generación de partículas víricas replicantes
"in vivo", riesgo inexistente en el caso de los
plásmidos o vectores no víricos.
A este respecto, en la solicitud de patente
europea EP 704 534 se describe un vector adenovírico recombinante
para la transferencia de un transgén a células animales hospedantes,
el vector adenovírico empleado es capaz de replicarse de manera
autónoma en la célula animal transfectada y presenta una mejor
estabilidad de expresión del transgén. Más en particular, se
describe un vector adenovírico deficiente que contiene entre dos
secuencias, que permiten una recombinación específica de sitio, un
origen de replicación como por ejemplo el origen de replicación
SV40, un promotor, un gen heterólogo y una secuencia de
poliadenilación. Este vector adenovírico se mantiene de forma
estable en las células animales hospedantes y el transgén se activa
y se expresa independientemente del acontecimiento de recombinación
específico de sitio. Bergemann, J. y col. (Nucleic Acid Res. 11 de
noviembre de 1995; 23(21), 4451-6) describe
un sistema llamado "lox" retrovírico para la transferencia y la
expresión de transgenes en las células transfectadas. El vector
retrovírico contiene por ejemplo un cassette de ADN que puede
escindirse y que codifica a un transgén de interés rodeado de dos
sitios loxP que permiten en un primer tiempo la infección y la
integración del vector y la expresión de manera estable del gen así
transferido y en un segundo tiempo la inhibición del transgén por un
acontecimiento de escisión específica en presencia de la enzima de
recombinación Cre. Como alternativa, Logie y col. (PNAS, vol. 92,
pp. 5940-5944, junio de 1995) describen la
utilización de una enzima de recombinación inducible.
El objetivo de la presente invención es
precisamente el de proponer un nuevo concepto de transferencia de
genes que satisfagan las exigencias recién mencionadas. La presente
invención se refiere por ejemplo a la generación "in
situ" mediante un vector vírico de moléculas circulares de
ADN, replicantes, terapéuticas y ventajosas en el plano de la
estabilidad de la expresión del transgén y de la inocuidad. En
efecto, estas están desprovistas de cualquier secuencia del genoma
vírico que sea susceptible de inducir una respuesta inmunitaria de
tipo inflamatorio y una respuesta específica dirigida contra las
proteínas víricas que pudieran tener un efecto deletéreo en el
organismo y limitar la duración de la expresión del transgén.
La presente invención tiene, pues, por objeto un
vector vírico que contiene una región de ADN delimitada por dos
secuencias que permiten la recombinación específica de sitio y están
posicionadas en orientación directa, dicha región contiene
sucesivamente un promotor funcional en las células de mamíferos, la
secuencia oriP del virus EBV, un cassette de expresión que consta de
un gen de interés y un gen de la proteína EBNA1, separados por una
secuencia IRES derivada del virus ECMV, el promotor y el cassette de
expresión están orientados de tal manera que la expresión de los dos
genes solo es posible después de la recombinación específica de
sitio.
La presente invención desarrolla en particular la
puesta en práctica de un procedimiento y de construcciones
específicas, particularmente eficaces para la producción de
moléculas terapéuticas de ADN. Más en particular, el procedimiento
según la invención consiste en la producción de moléculas de ADN
terapéuticas definidas anteriormente a partir de un vector
vírico.
De manera inesperada, la empresa solicitante ha
puesto también de manifiesto que era posible generar "in
situ" a partir de un vector vírico, y ello por recombinación
específica de sitio, una molécula de ADN circular, de carácter
terapéutico y replicante. Además, en un modo ventajoso de ejecución,
el transgén y el origen de replicación son inactivos en el vector
vírico, su actividad es dependiente del acontecimiento de
recombinación específica de sitio. De modo más ventajoso todavía, el
acontecimiento de recombinación se induce de forma condicionada
mediante la expresión de la recombinasa, lo cual ofrece un gran
nivel de control de la expresión del gen de interés y de la
replicación de las moléculas episómicas producidas.
Tal protocolo es especialmente ventajoso en el
plano terapéutico:
- saca partido de la buena capacidad de
transfección manifestada de manera general por los vectores víricos,
si se comparan con los vectores no víricos,
- reduce considerablemente los riesgos de
contaminación vírica, de reacción inflamatoria local y de respuesta
inmunitaria antivírica, habida cuenta de la poca cantidad de
vectores víricos que se utilizan. Estos últimos no se introducen más
que en una proporción necesaria para la generación de la molécula
terapéutica de ADN,
- permite ampliar el campo de aplicación de
ciertos vectores víricos: por ejemplo, los vectores adenovíricos son
de aplicación limitada en las células proliferantes, por ejemplo las
células cepas hematopoyéticas. La presente invención permite
explotar su poder infeccioso para generar moléculas circulares
replicantes estables en las células proliferantes.
La molécula de ADN reivindicada posee, pues, la
facultad de asegurar eficazmente la transferencia a las células
deseadas el o los genes terapéuticos que contiene.
Para lograrlo, esta molécula contiene un origen
de replicación caracterizado sobre todo por el hecho de que funciona
en las células de mamíferos y de humanos. De modo ventajoso, el
origen de replicación utilizado es un origen de replicación
condicional, es decir, su actividad puede regularse. De manera
todavía más preferida, el origen de replicación se dispone de tal
manera que sea inactiva en el vector vírico y activa después de la
recombinación específica de sitio.
De modo ventajoso, el origen de la replicación
utilizado es de origen eucariota, vírico o mamífero.
Un ejemplo preferido de origen de replicación
susceptible de llevarse a la práctica en el marco de la presente
invención es más especialmente el origen de replicación del virus de
Epstein Barr (EBV). El virus EBV pertenece al grupo de los
herpesvirus. Su origen de replicación contiene dos elementos: la
secuencia oriP (1,7 kb), que causa la replicación y cuya actividad
es inducida por la proteína codificada por el gen EBNA1. Esta
secuencia puede realizarse en configuración trans. Estos elementos
permiten por ellos mismos a la vez la replicación, el mantenimiento
episómico y la segregación de 5 a 20 copias de vector plasmídico por
célula. La secuencia oriP se compone de una repetición de 20 motivos
de 30 pares de bases (bp), separada por 960 bp del origen de la
replicación, que está formado por un motivo repetido de 65 bp y
consta de 4 copias imperfectas del motivo de 30 bp. La proteína
EBNA1 se fija sobre los motivos de 30 bp en el nivel del origen de
la replicación y permite el reclutamiento de factores celulares en
el momento de la fase S y la replicación, síncrona con la división
celular, de un plásmido que posee la secuencia oriP en configuración
cis. Además, el EBNA1, probablemente por fijación simultánea a nivel
de motivos repetidos y de estructuras cromosómicas, permite el
mantenimiento intranuclear y la segregación del episoma en el
momento de la división celular. Los plásmidos que contienen el
origen de replicación oriP del genoma del EBV y que permiten la
expresión de la proteína vírica EBNA1 (641 aminoácidos) se mantienen
de forma episómica estable en las células humanas transfectadas y su
replicación se realiza de forma síncrona con la división celular
(Lupton y Levine, 1985).
El origen de replicación puede derivarse también
del papillomavirus. Los papillomavirus utilizan un sistema de
latencia vírica con mantenimiento episómico del genoma, análogo al
de los virus de Epstein Barr (EBV). Este sistema ha sido estudiado
en particular para el papillomavirus bovino de tipo 1
(BPV-1). El origen de replicación del BPV se activa
en presencia de proteínas E1 y E2. Igual que en el caso del EBV, el
mantenimiento episómico es independiente de la replicación y está
asegurado por fijación de la E2 a nivel de la secuencia MME
(minichromosome maintenance element), pero necesita también la
presencia de la E1. En contraposición, a diferencia del sistema
oriP/EBNA1 del EBV, la replicación del episoma no es síncrona con la
división celular (Piirsoo y col., 1996).
El origen de la replicación puede estar
constituido además por secuencias capaces de una replicación
autónoma o secuencias ARS (autonomously replicating sequences). Las
ARS se han aislado a partir de cromosomas de mamíferos, por ejemplo
del hombre y del ratón. A título preferencial, se puede citar la
secuencia ARS localizada en dirección ascendente del lugar
c-myc del hombre (Ariga y col., 1988) y el fragmento
de 4 kb del lugar del gen de la adenosina-desaminasa
del ratón (Virta-Pearlman y col., 1993).
En lo que concierne al gen de interés, puede
tratarse de un gen terapéutico, para vacunas, de interés agrícola o
veterinario. Contiene igualmente una región promotora de la
transcripción funcional en la célula o en el organismo diana y una
región situada en 3' y que especifica una señal de fin de
transcripción y de poliadenilación. En lo que respecta a la región
promotora, puede tratarse de una región promotora que causa de forma
natural la expresión del gen considerado, ya que es susceptible de
funcionar en la célula o en el organismo en cuestión. Puede tratarse
igualmente de regiones de origen diferente (que causan la expresión
de otras proteínas, o incluso sintéticas). Puede tratarse por
ejemplo de secuencias promotoras de genes eucariotas o víricos. Por
ejemplo, puede tratarse de secuencias promotoras surgidas del genoma
de la célula diana. Entre los promotores eucariotas se puede
utilizar cualquier promotor o secuencia derivada que estimule o
reprima la transcripción del gen de forma específica o no, inducible
o no, fuerte o débil. Puede tratarse en particular de promotores
ubiquitarios (promotor de los genes HPRT, PGK,
a-actina, tubulina, etc.), de promotores de
filamentos intermedios (promotores de los genes GFAP, desmina,
vimentina, neurofilamentos, queratina, etc.), de promotores de genes
terapéuticos (por ejemplo el promotor de los genes MDR, CFTR, factor
VIII, ApoAI, etc.), de promotores específicos de tejidos (promotor
del gen de piruvato-quinasa, vilina, proteína
intestinal relacionada con ácidos grasos,
alfa-actina de los músculos lisos, etc.) o incluso
de promotores que responden a un estímulo (receptor de hormonas
esteroides, receptor del ácido retinoico, etc.). Puede tratarse
incluso de secuencias promotoras surgidas del genoma de un virus,
por ejemplo los promotores de los genes ElA y MLP de adenovirus, el
promotor precoz del CMV o incluso el promotor del LTR del RSV, etc.
Además, las regiones promotoras pueden modificarse por adición de
secuencias de activación, de regulación o que permitan una expresión
específica de tejido o mayoritaria. Por otro lado, el gen de interés
puede conllevar además una secuencia de señal que dirija el producto
sintetizado a las vías de secreción de la célula diana. Esta
secuencia de señal puede ser la secuencia de señal natural del
producto sintetizado, pero puede ser también cualquier otra
secuencia de señal funcional o ser una secuencia de señal
artificial.
Se utiliza con ventaja un promotor de origen
vírico elegido entre el promotor precoz del CMV o el LTR de un
retrovirus o un promotor de mamífero.
Aparte de un origen de replicación y por lo menos
de un gen de interés, los vectores víricos de la invención contienen
una región delimitada por dos secuencias que permiten una
recombinación específica de sitio, obtenida a partir de diversos
sistemas que conllevan la recombinación específica de sitio entre
las secuencias.
El sistema de recombinación específico llevado a
la práctica en el marco de la presente invención con vistas a la
generación "in situ" de moléculas de ADN puede tener
diferentes orígenes. En particular, las secuencias específicas y las
recombinasas utilizadas pueden pertenecer a diferentes grupos
estructurales y sobre todo al grupo de la recombinasa del
bacteriófago P1.
Con mayor preferencia, la recombinación
específica de sitio utilizada según el procedimiento de la invención
se obtiene por medio de dos secuencias específicas que sean capaces
de recombinar entre ellas en presencia de una proteína específica,
denominada en general recombinasa. Por esta razón, las moléculas
circulares de ADN de la invención constan además de una secuencia
que resulta de esta recombinación específica de sitio. Las
secuencias que permiten la recombinación utilizadas en el marco de
la invención constan en general de 5 a 10 pares de bases y con mayor
preferencia por lo menos de 50 partes de bases.
Entre las recombinasas pertenecientes al grupo de
la integrasa del bacteriófago 1 cabe mencionar por ejemplo la
integrasa de fagos lambda (Landy y col., Science 197, 1147,
1977); P22 y F80 (Leong y col., J. Biol. Chem. 260, 4468,
1985); HP1 de Haemophilus influenzae (Hauser y col., J. Biol.
Chem. 267, 6859, 1992); la integrasa Cre del fago P1; la
integrasa del plásmido pSAM2 (EP 350 341) y también la recombinasa
FLP del plásmido 2m de la levadura Saccharomyces
cerevisiae. Cuando las moléculas de ADN según la invención se
preparan por recombinación mediante un sistema específico de sitio
del grupo de la integrasa del bacteriófago lambda, en general les
moléculas de ADN según la invención contienen además una secuencia
que resulta de la recombinación de dos secuencias de fijación att
del bacteriófago o del plásmido correspondiente.
Entre las recombinasas pertenecientes al grupo
del transposón Tn3 cabe citar por ejemplo la resolvasa del
transposón Tn3 o de los transposones gd, Tn21 y Tn522 (Stark y col.,
1992); la invertasa Gin del bacteriófago mu o incluso la resolvasa
de plásmidos, como la del fragmento par de RP4 (Abert y col., Mol.
Microbiol. 12, 131, 1994). Cuando se preparan las moléculas
de ADN según la invención por recombinación mediante un sistema
específico de sitio del grupo del transposón Tn3, en general las
moléculas de ADN según la invención contienen además una secuencia
que resulta de la recombinación de dos secuencias de reconocimiento
de la resolvasa o del transposón en cuestión.
Según un modo preferido de realización, en las
construcciones genéticas de la presente invención, las secuencias
que permiten la recombinación específica de sitio se derivan de un
bacteriófago. Con mayor preferencia, se trata de secuencias de
fijación (secuencias attP y attB) de un bacteriófago o secuencias
derivadas. Estas secuencias son capaces de recombinar
específicamente entre sí en presencia de una recombinasa llamada
integrasa. El término "secuencia derivada" incluye las
secuencias obtenidas por modificacion(es) de secuencias de
fijación de bacteriófagos, que conservan la capacidad de recombinar
específicamente en presencia de la recombinasa apropiada. Por
ejemplo, puede tratarse de fragmentos reducidos de estas secuencias
o, por el contrario, fragmentos ampliados por adición de otras
secuencias (sitios de restricción, etc.). Puede tratarse igualmente
de variantes obtenidas por mutacion(es), por ejemplo
mutacion(es) puntual(es). Según la invención se
entiende por secuencias attP y attB de un bacteriófago o de un
plásmido las secuencias del sistema de recombinación específica de
dicho bacteriófago o plásmido, es decir, la secuencia attP presente
en dicho fago o plásmido y la secuencia attB cromosómica
correspondiente.
A título de ejemplos preferidos cabe mencionar
sobre todo las secuencias de fijación de fagos lambda, P22, F80, P1,
HP1 de Haemophilus influenzae o incluso del plásmido pSAM2, o
2m.
Según un modo preferido de ejecución de la
invención, las secuencias que permiten la recombinación específica
de sitio se derivan del sistema de recombinación del fago P1. Este
fago P1 posee una recombinasa llamada Cre que reconoce
específicamente una secuencia de nucleótido de 34 pares de bases,
llamada site lox P. Esta secuencia se compone de dos secuencias
palindrómicas de 13 bp separadas por un secuencia conservada de 8
bp.
En una variante particular, la invención se
refiere, pues, a una molécula de ADN circular y replicante que
contiene (a) una secuencia surgida de la recombinación específica de
sitio de dos regiones loxP del bacteriófago P1, por lo menos un gen
de interés y un origen de replicación funcional de las células de
mamíferos y de humanos y que según un modo preferido posee una
funcionalidad condicional.
A este respecto, la presente invención
proporciona construcciones genéticas particulares apropiadas para la
producción de moléculas de ADN terapéuticas, definidas
anteriormente. Estas construcciones genéticas o recombinantes de ADN
según la invención contienen ante todo el o los genes de interés, el
origen de replicación y el gen de la proteína EGNA1, enmarcados
entre dos secuencias que permiten la recombinación específica de
sitio y que están posicionadas en orientación directa. Estas
secuencias pueden clonarse en forma de cassettes en plásmidos
bacterianos. El ADN de plásmido puede, en un primer momento,
transfectarse a células humanas con el fin de comprobar la
funcionalidad de las secuencias. Estos cassettes se utilizan
posteriormente para construir vectores víricos que poseen las mismas
secuencias integradas en su genoma.
Tal como se ha indicado anteriormente, otro
aspecto de la presente invención consiste en un procedimiento de
producción "in situ" de moléculas de ADN terapéuticas,
definidas anteriormente, a partir de un vector vírico por
recombinación específica de sitio. El empleo de un vector de este
tipo permite optimizar ventajosamente la administración de la
molécula de ADN reivindicada a las células a tratar.
A este respecto, la presente invención tiene
también por objeto un vector vírico que contiene, insertada en su
genoma, por lo menos una región de ADN enmarcada entre dos
secuencias que permiten una recombinación específica de sitio y,
posicionadas en orientación directa, dicha región de ADN que consta
por lo menos de un origen de replicación y un gen de interés.
Según una forma privilegiada de ejecución de la
invención, el origen de replicación y el gen de interés están
integrados en el vector vírico y están presentes en forma
inactivada, el promotor está clonado en orientación directa en uno
de los extremos del cassette de expresión (figura 1). Después de la
recombinación entre los dos sitios LoxP, el promotor se encuentra
delante del gen de interés y separado de este último por un sitio
LoxP, el primer ATG del transcrito correspondiente al codón de
iniciación del transgén. La secuencia oriP solo se activa en
presencia de la proteína EBNA1, esta se expresa bajo control del
mismo promotor del transgén, en forma de mensajero bicistrónico. La
traducción de la EBNA1 se inicia por un mecanismo de iniciación
interna a nivel de una secuencia IRES derivada del virus de la
encefalomiocarditis (ECMV), del grupo de los picornavirus. La
expresión del transgén y de la proteína EBNA1 y la replicación del
plásmido están, pues, directamente condicionados al acontecimiento
de recombinación de dos sitios LoxP.
Según otra variante de la invención, la región de
encapsidación del virus se incluye en el replicón (la región de ADN
enmarcada entre las secuencias que permiten la recombinación
específica de sitio). Este modo de ejecución ofrece una seguridad
suplementaria al sistema, tal como se explica más adelante.
El vector vírico empleado puede tener orígenes
diversos, desde el momento que es capaz de transducir células
animales y con preferencia células humanas. En un modo preferido de
ejecución de la invención se utilizan vectores derivados de
adenovirus, virus adenoasociados (AAV), virus del herpes (HSV) o
retrovirus. Es muy especialmente ventajoso el uso de un adenovirus
para una administración directa o para la modificación "ex
vivo" de células destinadas a implantarse, o de un retrovirus
para la implantación de células productoras.
Los virus según la invención son deficientes, es
decir, son incapaces de replicarse de modo autónomo en la célula
diana. En general, el genoma de los virus deficientes empleados en
el marco de la presente invención está, pues, desprovisto por lo
menos de las secuencias necesarias para la replicación de dicho
virus en la célula infectada. Estas regiones pueden eliminarse
(total o parcialmente), ya sea quedando reducidas a la inoperancia,
ya sea siendo sustituidas por otras secuencias y en especial por la
secuencia nucleica heteróloga de interés. Sin embargo, el virus
deficiente conserva con preferencia las secuencias de su genoma que
son necesarias para la encapsidación de las partículas víricas.
Por tratarse más en particular de adenovirus, en
el marco de la presente invención se prefiere el uso de adenovirus
humanos de tipo 2 ó 5 (Ad2 o Ad5) o de adenovirus de origen animal
(ver solicitud de patente WO 94/26914). Entre los adenovirus de
origen animal que pueden utilizarse en el marco de la presente
invención cabe mencionar los adenovirus de origen canino, bovino,
murino (por ejemplo: Mav1, Beard y col., Virology 75, 81, 1990),
ovino, porcino, aviario e incluso símico (ejemplo: SAV).
Los vectores víricos de la invención son con
preferencia adenovirus deficientes que llevan insertada en su genoma
una secuencia genética que contiene por lo menos un origen de
replicación y un gen de interés, que está enmarcada entre dos
secuencias posicionadas en orientación directa. Estas permiten
inducir una actividad condicional del origen de replicación y del
transgén mediante la recombinación específica de sitio, que depende
de la presencia de la recombinasa.
De forma ventajosa, en el genoma de estos
adenovirus de la invención, por lo menos la región E1 se ha
convertido en no funcional. De forma todavía más ventajosa, el gen
E1 y por lo menos uno de estos genes: E2, E4, L1-L5,
no son funcionales. Pueden modificarse igualmente otras regiones y
en especial la región E3 (WO 95/02697), E2 (WO 94/28938), E4 (WO
94/28152, WO 94/12649, WO 95/02697) y L5 (WO 95/02697).
Según un modo preferido de ejecución, el
adenovirus según la invención contiene una deleción en las regiones
E1 y E4 y la región de ADN enmarcada entre dos secuencias que
permite una recombinación específica de sitio está insertada en el
nivel de la región E1 inactivada. Según otro modo de ejecución
preferido, el adenovirus contiene una deleción en las regiones E1 y
E4 y la región de ADN enmarcada entre dos secuencias que permite la
recombinación específica de sitio está insertada en el nivel de la
región E4 inactivada. Como se indicará más adelante, según una forma
especial de ejecución de la invención, el adenovirus contiene
también un cassette de expresión del gen de la recombinasa.
Los vectores reivindicados se obtienen por
recombinación con plásmidos, por ejemplo los definidos
anteriormente, es decir, caracterizados porque contienen entre dos
regiones de recombinación específicas de sitio por lo menos un
origen de replicación y un gen de interés de actividad
condicional.
En lo que respecta más especialmente a las
definiciones de origen de replicación, de dos secuencias que
permiten una recombinación específica de sitio y del gen de interés,
presentes en la región de ADN integrada en el vector vírico
reivindicado, se remite a las definiciones mencionadas antes.
Los adenovirus recombinantes deficientes según la
invención pueden obtenerse por cualquier técnica ya conocida por los
expertos en la materia (Levrero y col., Gene 101, 195, 1991;
EP 185 573; Graham, EMBO J. 3, 2917, 1984). En particular,
pueden obtenerse por recombinación homóloga entre un adenovirus y un
plásmido que lleve entre otras las secuencias de ADN de la
invención, o por construcción de un genoma vírico en la E.
coli. La recombinación homóloga se produce después de la
co-transfección de dichos adenovirus y el plásmido
en una línea celular apropiada. La línea celular empleada (i) deberá
ser con preferencia transformable por dichos elementos e (ii) deberá
contener las secuencias capaces de complementar la parte del genoma
del adenovirus deficiente, con preferencia en forma integrada para
evitar los riesgos de recombinación. A título de ejemplo de línea
cabe mencionar la línea de riñón embrionario humano 293 (Graham y
col., J. Gen. Virol. 36, 59, 1977) que contiene integrada en
su genoma en especial la parte izquierda del genoma de un adenovirus
Ad5 (12%) o líneas capaces de complementar las funciones E1 y E4,
por ejemplo las descritas en particular en las solicitudes de
patente nº WO 94/26914 y WO 95/02697.
A continuación se recuperan los adenovirus que se
hayan multiplicado y se purifican con arreglo a técnicas clásicas de
la biología molecular, tal como se ilustra en los ejemplos.
En lo que respecta a los virus
adeno-asociados (AAV), se trata de virus que tienen
un ADN de tamaño relativamente reducido, que se integran en el
genoma de las células que infectan de manera estable y específica de
sitio. Son capaces de infectar un amplio espectro de células, sin
inducir ningún efecto sobre el crecimiento, la morfología o la
diferenciación celulares. Por otro lado, no parecen implicados en
las patologías del hombre. El genoma de los AVV se ha clonado,
secuenciado y caracterizado. Consta de unas 4700 bases y contiene en
cada extremo una región repetida inversa (ITR) de unas 145 bases,
que sirve de origen de replicación para el virus. El resto del
genoma se divide en 2 regiones esenciales que llevan las funciones
de encapsidación: la parte izquierda del genoma, que contiene el gen
rep implicado en la replicación vírica y la expresión de los genes
víricos; la parte derecha del genoma, que contiene el gen cap que
codifica a las proteínas de cápsida del virus.
La utilización de vectores derivados del AAV para
la transferencia de genes "in vitro" e "in
vivo" se ha descrito en la bibliografía técnica (ver en
especial WO 91/18088; WO 93/09239; US-4 797 368;
US-5 139 941; EP-488 528). En estas
solicitudes se describen diferentes construcciones derivadas de los
AAV, en las que los genes rep y/o cap sufren deleción y se
reemplazan por un gen de interés y su utilización para la
transferencia "in vitro" (a células de cultivo) o
"in vivo" (directamente a un organismo) de dicho gen de
interés. Los AAV recombinantes deficientes según la invención pueden
obtenerse por co-transfección a una línea celular
infectada par un virus auxiliar humano (por ejemplo un adenovirus)
de un plásmido que contenga las secuencias nucleicas de la invención
rodeadas por dos regiones repetidas inversas (ITR) de AAV y de un
plásmido que lleve los genes de encapsidación (genes rep y cap) de
AAV. Los AAV recombinantes producidos se purifican seguidamente por
técnicas clásicas.
En lo que respecta a los virus del herpes y a los
retrovirus, la construcción de vectores recombinantes se ha descrito
ampliamente en la bibliografía técnica: ver en especial Breakfield y
col., New Biologist 3, 203, 1991; EP-453 242,
EP-178 220; Bernstein y col., Genet. Eng. 7,
235, 1985; McCormick, BioTechnology 3, 689, 1985, etc.
Los retrovirus son en particular virus
integrantes, que infectan selectivamente las células en división.
Constituyen, pues, vectores de interés para las aplicaciones de tipo
cáncer. El genoma de los retrovirus consta esencialmente de dos LTR,
una secuencia de encapsidación y tres regiones codificadoras (gag,
pol y env). En los vectores recombinantes derivados de los
retrovirus, en general los genes gag, pol y env han sufrido
deleción, total o parcial, y se han reemplazado por una secuencia de
ácido nucleico heterólogo de interés. Estos vectores pueden
realizarse a partir de diferentes tipos de retrovirus, por ejemplo
el MoMuLV (Moloney murine leukemia virus; también llamado MoMLV), el
MSV (murine Moloney sarcoma virus), el HaSV (Harvey sarcoma virus),
el SNV (spleen necrosis virus), el RSV (Rous sarcoma virus) o
incluso el virus de Friend.
Para construir los retrovirus recombinantes según
la invención se construye en general un plásmido que contenga en
especial los LTR, la secuencia de encapsidación y las secuencias de
la invención, después se utiliza para transfectar una línea celular
llamada de encapsidación, capaz de aportar en trans las funciones
retrovíricas deficientes al plásmido. En general, las líneas de
encapsidación son, pues, capaces de expresar los genes gag, pol y
env. Tales líneas de encapsidación se han descrito en la técnica
anterior y en especial la línea PA317 (US-4 861
719); la línea PsiCRIP (WO 90/02806) y la línea
GP+envAm-12 (WO 89/07150). Por otro lado, los
retrovirus recombinantes pueden conllevar modificaciones a nivel de
los LTR para suprimir la actividad transcriptiva y secuencias de
encapsidación ampliadas, que conllevan una parte del gen gag (Bender
y col., J. Virol. 61, 1639, 1987). Los retrovirus
recombinantes producidos se purifican seguidamente por técnicas
clásicas.
A título de vectores preferidos según la
invención se puede proponer más en particular los adenovirus que
contienen en su genoma una región ADN según la invención, rodeada
por secuencias repetidas inversas del bacteriófago P1 (región loxP)
posicionadas en orientación directa.
A título ilustrativo de este tipo de vectores se
pueden mencionar más en particular las construcciones siguientes con
el gen de la b-galactosidasa (LacZ) o el gen de la
timidina-quinasa del virus del herpes (TK) (figura
1). El gen de interés puede ser cualquier gen (ADNc, ADNg, ARN,
ácido nucleico sintético o semisintético) que codifique a un ARN o
una proteína terapéutica o de tipo vacuna, por ejemplo enzimas,
derivados sanguíneos, hormonas, linfoquinas: interleucinas,
interferonas, TNF, etc. (FR-9 203 120), factores de
crecimiento, neurotransmisores o sus precursores o enzimas de
síntesis, factores tróficos: BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF,
NT3, NT5, etc.; apolipoproteínas: ApoAI, ApoAIV, ApoE, etc.
(FR-9 305 125), la distrofina o una minidistrofina
(FR-9 111 947), genes supresores de tumores: p53,
Rb, Rap1A, DOC, k-rev, etc. (FR-9
304 745), genes que codifican a factores implicados en la
coagulación: factores VII, VIII, IX, etc. o incluso la totalidad o
una parte de una inmunoglobulina natural o artificial (Fab, ScFv,
etc.), un ligando ARN (WO 91/19813), etc.
El gen de interés puede ser también una secuencia
antisentido, cuya expresión en la célula diana permite controlar la
expresión de genes o la transcripción de ARNm celulares. Este tipo
de secuencias pueden transcribirse por ejemplo en la célula diana,
en ARN complementarios de ARNm celulares y bloquear de este modo su
traducción en proteína, según la técnica descrita en la patente EP
140 308.
Los vectores de expresión se adaptan en especial
a la expresión de secuencias que codifican a factores tóxicos. Puede
tratarse en particular de tóxicos para células (toxina diftérica,
toxina de Pseudomonas, ricino A, etc.), de un producto que
induzca una sensibilidad a un agente externo (genes suicidas:
timidina-quinasa,
citosina-desaminasa, etc.) o incluso de genes
asesinos capaces de inducir la muerte celular
(Grb3-3 (PCT/FR 94/00542), ScFv
anti-ras(WO 94/29446), etc.). El sistema de
la invención permite producir en efecto vectores en especial víricos
que contienen secuencias sin toxicidad para las células de
producción y a continuación inducir la expresión de estas moléculas
tóxicas selectivamente en células diana después de una recombinación
específica de sitio. Este tipo de construcción es, pues,
particularmente indicado para estrategias de terapia antitumoral,
por ejemplo, en las que el objetivo consiste en destruir
selectivamente las células afectadas. Este sistema es también muy
interesante para la expresión de citoquinas, interferonas, TNF o
TGF, por ejemplo, cuya producción incontrolada puede tener efectos
secundarios muy marcados.
La presente invención se refiere además a
cualquier célula eucariota transfectada por lo menos por un vector
vírico o una molécula de ADN, según la invención una como la que se
ha definido anteriormente.
Otro objeto de la presente invención consiste en
un procedimiento de producción de una molécula de ADN, como la que
se ha definido anteriormente, según el cual se pone en contacto un
cultivo de células hospedantes que contienen un vector vírico según
la invención con la recombinasa que permite inducir la recombinación
específica de sitio.
Más exactamente, la presente invención se refiere
de manera general a cualquier procedimiento de obtención
caracterizado porque pone en contacto:
(i) células hospedantes modificadas que contienen
por lo menos un vector vírico, dicho vector contiene en su genoma
por lo menos una región de ADN enmarcada entre dos secuencias que
permiten una recombinación específica de sitio y están posicionadas
en orientación directa, dicha región contiene por lo menos un origen
de replicación y un gen de interés y
(ii) la recombinasa que permite inducir "in
situ" la recombinación específica de sitio,
con el fin de generar dichas moléculas de ADN
circulares y replicantes.
En el marco de la presente invención pueden
proponerse diferentes métodos (protocolos) para efectuar esta puesta
en contacto del vector vírico con la recombinasa específica. La
puesta en contacto puede realizarse en especial a nivel de la célula
hospedante, ya sea por co-transfección con un
plásmido o co-infección con un vector vírico que
contiene el gen de dicha recombinasa; ya sea por inducción de la
expresión del gen que codifica a dicha recombinasa directamente
presente en el genoma de dicha célula hospedante. El gen que
codifica a la recombinasa puede estar, pues, presente en la célula
hospedante en forma integrada al genoma, sobre un plásmido o incluso
sobre un vector vírico anexo de tipo adenovirus, por ejemplo. En
este caso, el vector vírico empleado con vistas a generar la
molécula de ADN según la invención es el que se ha definido
anteriormente.
Según otro método, el cassette de expresión del
gen se lleva al vector vírico que provoca además la expresión del
gen de interés.
En este caso particular, el procedimiento según
la invención proporciona un vector vírico que contiene en su genoma
un cassette de expresión del gen de la recombinasa, aparte de una
región de ADN delimitara por dos secuencias que codifican a los
sitios de recombinación específica y que contienen por lo menos un
origen de replicación y un gen de interés.
Tal vector constituye otro objeto de la presente
invención.
A esta respecto, según una variante particular,
la invención se refiere a un adenovirus que contiene una primera
deleción en la región E1, en la que está insertado el replicón (la
región de ADN enmarcada entre dos secuencias de recombinación
específica de sitio) y una deleción realizada en E4 y/o en E3 a
nivel de la cual está insertado el cassette de expresión de la
proteína-recombinasa.
De manera recíproca al modo de ejecución descrito
antes, el replicón puede insertarse en la parte que ha sufrido
deleción correspondiente a la región E3 o E4, mientras que el
cassette de expresión de la recombinasa está insertado a nivel de la
región E1 que ha sufrido deleción.
Según otra variante, el replicón y el cassette de
expresión de la recombinasa están insertados en el nivel de la
región E1 deficiente.
Más en particular, tal como se indicado antes,
las secuencias que permiten la recombinación específica de sitio son
las secuencias LoxP y la recombinasa es la proteína Cre, cuyo modo
de intervención en dichas secuencias de recombinación se ha descrito
anteriormente.
Según un modo preferido de la invención, sería
deseable además poder controlar y en particular inducir la expresión
de esta recombinasa en el seno de la célula hospedante. A tal fin se
propone ventajosamente en el marco de la presente invención
controlar la expresión del gen que codifica a la recombinasa. Para
ello se propone colocar la expresión de dicho gen bajo el control de
un elemento regulador. Puede tratarse en particular de un promotor
inducible, que permita controlar los niveles y/o los períodos de
expresión de este gen, por ejemplo el promotor del LTR de MMTV
(Pharmacia), que se induce con la dexametasona o un promotor
regulado por la tetraciclina (WO 94/29442; WO 94/04672). Está claro
que pueden utilizarse también otros promotores y en especial
variantes del LTR de MMTV que tengan por ejemplo regiones
heterólogas de regulación (regiones sobre todo ampliadoras
(enhancer)).
En otro modo de ejecución, la expresión del gen
que codifica a la recombinasa está controlado por promotores
regulados con el fin de evitar ya sea una acumulación constitutiva
de dicha proteína en la célula hospedante, ya sea para minimizar la
"fuga" hacia el compartimento nuclear y una cierta
citotoxicidad. Pueden tener asociados además elementos que funcionan
como dominios de transactivación de transcripción. A título
representativo de este tipo de elementos cabe mencionar sobre todo
los receptores de hormonas que incluyen a los receptores de
esteroides, de ácido retinoico y tiroides, entre los que cabe
mencionar en especial los de glucocorticoides, mineralocorticoides,
tiroides, estrógenos, aldosterona y ácido retinoico. Este tipo de
construcción entre la recombinasa Cre y el dominio de fijación del
ADN de un receptor al glucocorticoide se ha descrito por ejemplo en
Feil y col. (PNAS 93, 10887, 1996).
La posibilidad de regular la expresión de la
recombinasa es especialmente importante en el caso de vectores de la
invención que lleven a la vez el replicón y el cassette de expresión
de la recombinasa. En efecto, en este modo de realización, si la
recombinasa se expresa por ejemplo en el momento de la producción de
vectores víricos, el replicón se escindirá del genoma vírico antes
de su encapsidación. Por esta razón, es útil poder disponer de un
sistema en el que la expresión de la proteína recombinasa se reprima
en las células de producción de virus. Esto se logra del modo
indicado anteriormente, utilizando un promotor regulado (del tipo
tetraciclina o MMTV) y/o un elemento de tipo receptor de hormonas
que, asociado a la recombinasa, mantenga a esta en los
compartimentos extranucleares en ausencia de dicha hormona (figuras
6 y 7). A raíz de ello, en ausencia de la hormona, la recombinasa no
puede actuar y, en presencia de la hormona, esta es transportada
entonces al compartimento nuclear, lugar donde ejerce su
actividad.
Una estrategia interesante de control de la
expresión de la recombinasa consiste en utilizar una recombinasa
fusionada con un receptor hormonal (dominio de fijación al ADN) y a
pesar de ello inactiva en ausencia de dicha hormona, a continuación
en colocar dicho gen en el vector vírico de tal manera que esté bajo
control del promotor del replicón. Este modo de ejecución se
representa por ejemplo en la figura 6b.
Por otro lado, para aumentar la seguridad del
sistema es posible además, tal como se ha indicado antes, incluir en
el replicón la región de encapsidación del vector vírico (figura 7).
Esto permite evitar que se contaminen las existencias de virus
producido con vectores que hayan perdido el replicón. En efecto, si
a pesar de los sistemas de regulación mencionados anteriormente, una
expresión de la recombinasa activa interviniera durante la
producción del virus, esto podría acarrear la escisión del replicón
a partir del genoma vírico y, de este modo, la generación de genomas
víricos desprovistos de replicón. Si la región de encapsidación del
virus está contenida en dicho replicón, los genomas víricos
generados no estarán encapsidados. Por lo tanto, solo pueden
encapsidarse los genomas víricos que llevan a la vez el replicón y
el cassette de expresión de la recombinasa.
La presente invención tiene también como objeto
composiciones farmacéuticas que contienen por lo menos un vector
vírico según la invención o una molécula transfectada según la
invención. Estas composiciones pueden formularse con vistas a la
administración por vía tópica, oral, parenteral, intranasal,
intravenosa, intramuscular, subcutánea, intraocular, etc. La
composición según la invención contiene con preferencia vehículos
farmacéuticamente aceptables para la formulación inyectable. Puede
tratarse en particular de soluciones salinas (fosfato monosódico,
disódico, cloruro sódico, potásico, cálcico o magnésico, etc., o
mezcla de estas sales), estériles, isotónicas, o composiciones
secas, sobre todo liofilizadas, que, por adición según convenga de
agua esterilizada o de suero fisiológico, permitan la constitución
de soluciones inyectables. Tratándose de retrovirus, puede ser
ventajoso utilizar directamente células de encapsidación o células
infectadas "ex vivo" con vistas a su reimplantación
"in vivo", eventualmente en forma de órganos nuevos (WO
94/24298).
Las dosis de vectores utilizadas para la
inyección pueden adaptarse en función de diferentes parámetros y
sobre todo en función del modo de administración utilizado, de la
patología en cuestión y además de la duración del tratamiento
investigado. De manera general, los virus recombinantes de la
invención se formulan y se administran en forma de dosis de
comprendidas entre 10^{4} y 10^{14} pfu/ml. Para los AAV y los
adenovirus, pueden utilizarse también dosis entre 10^{6} y
10^{10} pfu/ml. El término pfu (plaque forming unit) equivale al
poder infeccioso de una suspensión de viriones y se determina por
infección de un cultivo celular apropiado y medición, por lo general
al cabo de 48 horas, del número de zonas de células infectadas. Las
técnicas de determinación del valor pfu de una solución vírica están
bien documentadas en la bibliografía técnica.
Según el gen de interés, presente en las
moléculas de ADN de la invención o en las regiones integradas en el
genoma de dichos vectores víricos, estos podrán utilizarse para el
tratamiento o la prevención de muchas patologías, incluidas las
enfermedades genéticas (miodistrofia, mucoviscidosis, etc.), las
enfermedades neurodegenerativas (Alzheimer, Parkinson, ALS, etc.),
los cánceres, las patologías asociadas a trastornos de la
coagulación o a dislipoproteinemias, las patologías asociadas a
infecciones víricas (hepatitis, SIDA, etc.) o en los ámbitos
agronómico y veterinario, etc.
La presente invención se describirá con mayor
detalle mediante los ejemplos que siguen, que deberán considerarse
como ilustrativos, pero no limitantes.
Tabla 1: origen de secuencias utilizadas para la
construcción del episoma.
Figura 1: esquema de construcción del
episoma.
Figura 2: representación de la estructura del
episoma.
Figura 3: secuencia entre el promotor
(P-RSV) y el cassette de expresión
(TK-CITE-EBNA1) del plásmido
pLoxP-ori-TK-EBNA1
(A) y del episoma después de la recombinación (B, C y D) - SEQ ID nº
3.
Figura 4: esquema de las etapas de clonación del
cassette
LoxP-ori-TK-EBNA1.
Figura 5: esquema de las etapas de clonación del
cassette
LoxP-ori-LacZ-EBNA1.
Figura 6: representación de un vector adenovírico
que lleva un replicón y un cassette de expresión de Cre regulado:
CRE_{R} : CRE regulado, ya sea a nivel de promotor, ya sea por una
fusión, ya sea por ambos. En (b), la orientación del replicón
permite colocar el cassette CRE_{R} bajo el control del promotor
que está presente en el replicón. El recuadro gris corresponde a los
sitios LoxP.
Figura 7: representación de un vector adenovírico
que lleva un replicón y un cassette de expresión de Cre regulado, la
región de encapsidación vírica psi (\Psi) está incluida dentro del
replicón. El recuadro gris corresponde a los sitios LoxP.
En la bibliografía técnica se describen los
métodos clásicos de biología molecular, por ejemplo la
centrifugación del ADN plasmídico en gradiente de cloruro de
cesio-bromuro de etidio, las digestiones con enzimas
de restricción, la electroforesis a través de gel, la electroelución
de los fragmentos de ADN a partir de geles de agarosa, la
transformación en E. coli, la precipitación de ácidos
nucleicos, etc. (Maniatis y col., 1989; Ausubel y col., 1987). Las
secuencias de nucleótidos se han determinado por el método de
terminación de cadenas con arreglo al protocolo ya presentado
(Ausubel y col., 1987).
Las enzimas de restricción se han adquirido en
los New-England Biolabs (Biolabs), Bethesda Research
Laboratorios (BRL) o en Amersham Ltd. (Amersham).
Para las ligaduras se separan fragmentos de ADN
según su tamaño a través de geles de agarosa al 0,7% o de acrilamida
al 8%, purificados por electroforesis y después electroelución, se
extraen con fenol, se precipitan con etanol y después se incuban en
un tampón Tris-HCl, de pH 7,4, 50 mM, MgCl_{2} 10
mM, DTT 10 mM, ATP 2 mM, en presencia de ADN-ligasa
del fago T4 (Biolabs). Se sintetizan los oligonucleótidos utilizando
la química de las fosforamiditas protegidas en b por el grupo
cianoetilo (Sinha y col., 1984; Giles, 1985) con el sintetizador
automático de ADN Biosearch 8600 siguiendo las recomendaciones del
fabricante.
Los ADN plasmídicos se purifican siguiendo la
técnica de la lisis alcalina (Maniatis y col., 1989).
En la figura 1 se describe la estructura general
de un vector según la invención y, más en concreto, de la región
comprendida entre las secuencias que permiten la recombinación
específica de sitio. Una construcción más detallada se presenta en
la figura 2.
La orientación del promotor (P) y del cassette de
expresión del transgén (TG) y de la proteína EBNA1 se indica con
flechas y solo permite la expresión de estos dos genes cuando se ha
realizado la recombinación en presencia de la recombinasa Cre. El
detalle de las secuencias entre el promotor (PO) y el gen después de
la recombinación se presenta en la figura 3. En esta figura, el
promotor es el LTR del virus RSV (P-RSV) y el gen es
el gen de la timidina-quinasa TK. Se ha subrayado el
primer ATG del ARN mensajero, correspondiente al del gen TK. Tal
como se ilustra en la figura 1, la expresión de la
EBNA-1 se obtiene a partir de un mensajero
policistrónico por iniciación interna de la traducción utilizando la
secuencia IRES (Internal Ribosome Entry Site), también llamada
secuencia CITE (Cap Independent Translation Entry) del virus de la
encefalomiocarditis (ECMV). La secuencia de señal de fin de
transcripción de poliadenilación del virus SV40 (pA) se introduce en
el extremo 3' de la secuencia codificadora de la EBNA1. La secuencia
oriP está situada entre el cassette de expresión
TK-EBNA-1 y el promotor RSV. Esta
secuencia solo está activa para la replicación en presencia de la
EBNA-1, por consiguiente, solo funciona después de
haberse realizado la recombinación y la formación del episoma.
Las etapas de construcción del plásmido se
presentan en las figuras 4 y 5 y el origen de las secuencias
utilizadas se resume en la tabla 1.
1. Se digiere el plásmido con las enzimas de
restricción HpaI y EcoRI y el fragmento obtenido de 1817 bp,
correspondiente a la secuencia de oriP, se clona entre los sitios
SmaI y EcoRI del plásmido pIC19H previamente desfosforilado, para
obtener el plásmido pIC-ori (figura 4A).
2. Se digiere el plásmido pIC-ori
en los sitios HindIII y BgIII, se desfosforila y se clona el
fragmento obtenido de 1900 bp entre los sitios HindIII (174) y BamHI
(208) del vector pBS246 para obtener el vector
pLox-ori (figura 4A).
3. Se repara el fragmento
BamHI-SaIlI de 399 bp del vector pCEP4,
correspondiente a la secuencia de la señal de paro de transcripción
y de poliadenilación del virus SV40, con la
ADN-polimerasa de Klenow y después se clona entre
los sitios SmaI y SalI (reparado con ADN-polimerasa
de Klenow) del vector pIC20R previamente desfosforilado, para
obtener el vector pICpA (figura 4A).
4. Se amplifica por PCR la secuencia IRES del
ECMV comprendida entre los nucleótidos 16 y 518 del vector
pCITE-2 mediante oligonucleótidos sintéticos 1:
5'-GGCCTCTAGACAGCTGGTTATTTTCC-3'
(SEQ ID nº 1) y 2:
5'-GGCCGGATCCCATATTATCATCG-3'
(SEQ ID nº 2) que contienen los sitios XbaI y PvuII (óligo 1) y
BamHI (óligo 2) en su extremo 5'. Se digiere el producto obtenido
con las enzimas de restricción XbaI y BamHI y se clona entre los
sitios XbaI y PstI del vector pCMV-EBNA1 previamente
desfosforilado, para obtener el vector pCITE-EBNA1.
La secuencia comprendida entre el ATG12 del IRES, correspondiente al
codón de iniciación de la traducción y el codón serina posterior al
codón metionina de la proteína EBNA1, ha sufrido deleción por
mutagénesis dirigida mediante la técnica PCR
(ex-site PCR). Se ha secuenciado completamente la
secuencia completa del IRES y del EBNA1 obtenida después de la PCR
(figura 4A).
5. Se clona el fragmento
XbaI-PstI del vector pCITE-EBNA1
(2546 bp) entre los sitios XbaI y PstI del plásmido pICpA
previamente desfosforilado, para obtener el vector
pCITE-EBNA1-pA (figura 4A).
6. Se clona el fragmento
ClAI-EcoRI del vector
pCITE-EBNA1-pA (2945 bp) en el
vector pLox-ori, se difiere de forma parcial en el
sitio EcoRI situado en el extremo ori, después se digiere con ClaI y
se desfosforila, obteniéndose el vector
pLox-ori-CITE-EBNA1-pA
(figura 4B).
7. Se clona el fragmento
ClaI-BsaW1 (1270 bp) del vector
pCMV-TK, obtenido por digestión parcial con BsaW1 y
reparación del sitio BsaW1 con ADN-polimerasa de
Klenow, entre los sitios ClaI y PvuII del vector
pLox-ori-CITE-EBNA1-pA
para obtener el vector
pLox-ori-CITE-TK-EBNA1-pA
(figura 4B).
8. Se clona el fragmento
BamHI-SalI (600 bp) del plásmido
pRSV-TK, correspondiente a la secuencia del promotor
del LTR de RSV, entre los sitios BamHI y SalI del vector
pLox-ori-CITE-TK-EBNA1-pA
previamente desfosforilado, para obtener el plásmido
pLox-ori-pRSV-TK-CITE-EBNA1-pA
(figura 4B).
Las clonaciones 1-6 descritas en
el anterior ejemplo 2.1 e ilustradas en la figura 4A son comunes a
la construcción de vectores
pLox-ori-pRSV-TK-CITE-EBNA1-pA
y
pLox-ori-pRSV-LacZ-CITE-EBNA1-pA.
7. Se efectúa la clonación del promotor del LTR
de RSV según la etapa 7 del ejemplo 2.1 (figura 5).
8. Se clona el fragmento
BamHI-StuI (3205 bp) del vector
pRSV-GalIX, correspondiente al gen LacZ, precedido
por una señal de localización nuclear (NLS), entre los sitios SmaI y
BgIII del vector pIC20H, previamente desfosforilado, para obtener el
plásmido pICLacZ (figura 5).
9. Se clona el fragmento XbI-NruI
(3205 bp) del vector pICLacZ entre los sitios XbaI y PvuII del
vector
pLox-ori-pRSV-CITE-EBNA1-pA
para obtener el vector
pLox-ori-pRSV-LacZ-CITE-EBNA1-pA
(figura 5).
Se transfecta una línea de células Hela, que
expresan el gen EBNA1 de forma estable, con los plásmidos
pLoxP-oriP-LacZ-EBNA1
y un plásmido que expresa el gen de la recombinasa Cre bajo el
control del promotor del citomegalovirus (pBS185). Se evalúan la
eficacia de recombinación y la funcionalidad del cassette de
expresión del gen LacZ por la actividad de
b-galactosidasa en las células, observada únicamente
en presencia de la recombinasa Cre. Los resultados obtenidos
demuestran la eficacia de generación del replicón por acción de la
recombinasa Cre, puesta de manifiesto por la activación de la
expresión del gen LacZ después de la recombinación entre los sitios
LoxP y de la formación del episoma. Además, después de 3 semanas de
cultivo de las células co-transfectadas [pasaje una
vez por semana (dilución 1:10)], se observa que se mantiene la
proporción de células que expresan el gen LacZ, mientras que la
expresión del LacZ ha desaparecido en las células transfectadas con
el plásmido control que no posee el origen de replicación oriP, lo
cual demuestra el carácter funcional de oriP en la construcción.
De igual manera se co-transfecta
una línea de células TK- (143TK-) con los plásmidos
LoxP-ori-TK-EBNA1 y
pBS185. Se seleccionan las células transfectadas que expresan el gen
TK mediante el HAT. Se verifica la estabilidad de expresión del gen
TK en el curso de las divisiones celulares y, por tanto, la
actividad del sistema oriP-EBNA1 por
inmunofluorescencia mediante un anticuerpo monoclonal específico de
la proteína TK del virus del herpes. Se pone de manifiesto la
presencia del episoma y su replicación en el curso de las divisiones
celulares mediante la técnica de Hirt, seguida por la ampliación del
ADN episómico con la técnica PCR mediante cebadores específicos.
Se comprueba la actividad de estas construcciones
"in vivo" por inyección intratumoral (electroporación)
de ADN de los plásmidos
pLoxP-ori-TK-EBNA1 o
pLoxP-ori-LacZ-EBNA1
y pBS185 en los tumores inducidos por inyección subcutánea de
células Hela o Hela-EBNA1 en el ratón desnudo (= sin
pelo). En paralelo se efectúa la inyección de células previamente
co-transfectadas con los mismos plásmidos. Se
analiza por inmunohistoquímica el mantenimiento del transgén (TK o
LacZ) en los tumores transducidos por estas construcciones,
comparando los resultados con los de un plásmido de control que no
posea el origen de replicación.
El plásmido p-Cre contiene el gen
de la recombinasa Cre fusionado en 5' con la señal de localización
nuclear del antígeno T del virus SV40 y se expresa a partir del
promotor de la timidina-quinasa (TK) del virus del
herpes. Se realiza una construcción similar que, en lugar del
promotor TK, lleva un promotor regulado por la tetraciclina o el
promotor MMTV. Por otro lado se realiza también un cassette que
lleva una fusión Cre-ER.
Se construye del modo siguiente un plásmido
replicón (pRep) que contiene una fusión del gen de resistencia a la
fleomicina con el gen de la \beta-galactosidasa
(Zeo-LacZ), oriP y el promotor mayor precoz del
citomegalovirus (P.CMV), sin la proteína EBNA1.
Se clona el fragmento StuI-claI
(1149-4553) del plásmido
pRSV-Gal-IX, que contiene el gen
LacZ y el señal de poliadenilación del virus SV40, entre los sitios
ClaI y EcoRV (2029-2032) del
pLox-ori (ejemplo 2 y figura 4) para obtener el
plásmido pLox-ori-LacZ.
Se clona el fragmento BglII-BglII
(473-1226) del pCEP4, que contiene el promotor
precoz de CMV, en el sitio BamH1 del
pLox-ori-LacZ para obtener el
pLX2.
Se sustituye el extremo 5' del gen LacZ del pLX2
(fragmento Xba1-ClaI) por el fragmento
NcoI-claI del plásmido pUT651 (CAYLA, tabla 1). Para
facilitar la clonación se subclona previamente este fragmento entre
los sitios EcoRV y claI del plásmido pIC20RpA y después se digiere
con XbaI y claI y se clona entre los sitios XbaI y ClaI del
pLX2.
El plásmido de control contiene la misma
estructura que el pRep, pero desprovista del origen de replicación
(OriP).
Se construye el cassette que permite la expresión
del EBNA1 a partir del IRES del ECMV por mutagénesis dirigida a
partir del plásmido pCITE-EBNA1-pA y
se clona en el vector lanzadera del adenovirus pAdLX2
(5-2-2) para obtener el
pAdLX2-EBNA1 o el pRep-EBNA1. Se
secuencian completamente tanto el IRES como el principio del EBNA1.
Se analiza la expresión del EBNA 1 a partir del IRES mediante
Western-Blot en las células Hela transfectadas con
pRepEBNA1. Se utiliza como control el plásmido
pCMV-EBNA1 que se ha servido para la construcción
del pCITE-EBNA1pA.
En una primera etapa, los ensayos de transfección
de células Hela que expresan la proteína EBNA1 de forma constitutiva
(Hela-EBNA1) con pRep solo o con pCre han puesto de
manifiesto que la co-transfección de los dos
plásmidos permitía la escisión del replicón y la inducción de la
expresión del gen de la \beta-galactosidasa. Las
células de control, transfectadas solamente con el plásmido
replicón, presentan un ruido de fondo constante, pero casi
despreciable, de la actividad de la
\beta-galactosidasa. Se hace el seguimiento de la
expresión del transgén durante los pasajes sucesivos de las células,
a razón de 2 trasplantes por semana durante un mes, lo cual equivale
a 24 divisiones celulares. En las células transfectadas con
pRep-pCre, la expresión de la
\beta-galactosidasa se mantiene durante la
totalidad de la duración del ensayo, mientras que se pierde
rápidamente (después de algunas divisiones celulares) en las células
co-transfectadas con el plásmido de control que no
lleva el origen de replicación oriP.
En una segunda etapa se seleccionan las células,
co-transfectadas por (pRep+pCre), en presencia de
fleomicina. Se aísla el ADN episómico por la técnica de Hirt, se
linealiza o no por digestión a nivel del sitio único XhoI y después
se digiere eventualmente con MboI para demostrar que el ADN se ha
replicado bien en las células eucariotas. El análisis Southern Blot
de las muestras así obtenidas ha permitido poner de manifiesto la
presencia de un replicón del tamaño esperado. La estimación del
número de copias por célula es de 1 a 10. A continuación se
mantienen las células seleccionadas en presencia o en ausencia de
presión de selección. En las dos condiciones se observa un
mantenimiento similar de la expresión de la
\beta-galactosidasa con una disminución lenta y
constante en el curso de las divisiones celulares. Después de 27
divisiones se detecta todavía actividad de la
\beta-galactosidasa en el 25% de las células por
coloración directa "in vitro". Estos resultados
corresponden a una estabilidad segregativa del episoma del 97% por
división. Son acordes con los resultados publicados, ya se ha
descrito en efecto una cuota de pérdida del 1 al 5% por división
(Simpson y col., 1996).
Los ensayos de co-transfección de
las células Hela con pRep-EBNA1 y pCre permiten
comprobar que el EBNA1 se ha expresado correctamente a partir del
IRES y aseguran el mantenimiento de la expresión de la
\beta-galactosidasa en el curso de los pasajes
sucesivos. Se toman como controles las células
Hela-EBNA1 transfectadas con los mismos
plásmidos.
Las células Hela y Hela-EBNA1 son
cancerígenas en el ratón desnudo, la inyección subcutánea de
10^{6} células induce la formación de un tumor detectable al cabo
de 8 días, que crece con gran rapidez y que puede seguirse durante
un mes. En un primer ensayo se inyectan células
Hela-EBNA1 transfectadas con pRep y pCre y después
seleccionadas "in vitro" en presencia de fleomicina. El
análisis de los tumores (de 3 cm de diámetro) a los 21 días, después
de coloración con X-gal, demuestra el mantenimiento
del replicón "in vivo" en este modelo.
En un segundo ensayo se inyectan células
Hela-EBNA1 transfectadas con pRep y después
infectadas con AdCre (ver ejemplo 5.2). Se utilizan como controles
las células transfectadas con los dos plásmidos derivados de pRep
permiten la expresión del lacZ en ausencia de recombinación y que
llevan oriP o no, inyectadas simultáneamente. El análisis de los
tumores al cabo de 21 días demuestras que el adenovirus Cre de
tercera generación permite la escisión del replicón y que su
presencia no altera ni la viabilidad celular ni las primeras etapas
de establecimiento del episoma. Hay que resaltar que no se detecta
actividad alguna de \beta-galactosidasa en las
células transfectadas con el plásmido de control que no lleva oriP.
Estos resultados ponen claramente de manifiesto que las
construcciones según la invención son funcionales "in
vivo" en células tumorales, se observa igualmente estabilidad
de los episomas después de
21 días.
21 días.
Este ejemplo describe la construcción de vectores
víricos según la invención, que contienen una región que puede
generar por recombinación específica de sitio una molécula circular
y replicante "in vivo". Estos vectores víricos
comprenden además una secuencia que codifica a la recombinasa que
permite la recombinación.
Se clonan el cassette de expresión de la
recombinasa Cre y la secuencia completa del replicón, incluidos los
sitios LoxP, a partir de los vectores pBS185 y
pLox-oriP-TK-EBNA1 o
pLoxP-oriP-LacZ-EBNA1
en la región E1 de vectores adenovíricos que contienen una deleción
de la totalidad o de una parte de la región E1 (Add1327;
\DeltaE1-\DeltaE3). Los adenovirus recombinantes
se aíslan por técnicas clásicas de recombinación homóloga en células
293. Los vectores víricos pueden obtenerse también por doble
recombinación en E. coli mediante plásmidos que contengan el
genoma del adeno 5 \DeltaE1\DeltaE3, a continuación se encapsula
el genoma vírico en una partícula adenovírica en una línea
apropiada. Por razones de capacidad de clonación, el gen LacZ se
reemplaza con ventaja por un gen marcador más pequeño.
La utilización de adenovirus de la 3ª generación
presenta ciertas ventajas con respecto a los de la 1ª generación; no
solamente en el plano de la inocuidad, sino también por la
disminución de la respuesta inflamatoria y por el aumento de la
estabilidad de la expresión del transgén. Estos vectores presentan
además una capacidad de clonación aumentada y una ausencia de efecto
citopático directo "in vitro" e "in
vivo".
Los vectores de 3ª generación (Adl1007;
\DeltaE1\DeltaE3\DeltaE4) pueden obtenerse también por
técnicas clásicas de recombinación homóloga en células de
empaquetamiento apropiadas (WO 96/22378) o por doble recombinación
en E. coli después del empaquetamiento.
Se construyen los dos adenovirus por doble
recombinación mediante esqueletos de E. coli que contienen un
genoma de adenovirus de 3ª generación pXL 2811
(pRSV-bGal-\DeltaE1,\DeltaE3,\DeltaE4-dl1007-SspI)
y pXL278
(p\DeltaE1,\DeltaE3,\DeltaE4-dl1007-SspI)
y plásmidos suicidas (Kana-SacB) pMA37 o pXL3048,
destinados a modificar la región E1 según la estrategia descrita
antes (Crouzet y col., PNAS 94, 1414, 1997; WO 96/25506).
Se repara el fragmento XhoI-BamHI
(451-2057) del plásmido pMC-Cre
(tabla 1) con la técnica Klenow y se croma en el sitio EcoRV del
plásmido suicida pMA37.
Se linealiza el genoma del adenovirus obtenido
por doble recombinación con el plásmido pXL2811 por digestión con el
PacI y se transfecta a células IGRP2 (WO 96/22378) mediante la
lipofectamina (GIBCO). Se amplifica el Ad-Cre 3.0
así obtenido en las mismas células, después se purifica según
técnicas clásicas (cloruro de cesio) o por cromatografía (FR
96/08164).
Se confirma la estructura del genoma del
adenovirus Cre por digestión enzimática.
Se digiere el plásmido pLX2 por BamH1 y después
se recirculariza para eliminar la señal de poliadenilación de SV40
en 5' del gen LacZ. Se repara por Klenow el fragmento
NotI-NotI (1-6145) del plásmido así
obtenido, después se clona en el sitio EcoRV del vector suicida
pXL3048 previamente digerido por BamHl y SalI, se repara por Klenow,
después se recirculariza para destruir estos dos sitios,
obteniéndose el plásmido pAdLX2. Se clona el fragmento
XhoI-SalI (441-3457) del plásmido
pCITE-EBNA1pA mutagenizado en el sitio XhoI del
plásmido pAdLX2 obtenido anteriormente, de este modo se obtiene el
plásmido pAdLX2-EBNA1
(pRep-EBNA1).
Se obtiene el Ad-Rep por
recombinación con los plásmidos pAdLX2-EBNA1 y
pXL2789 por técnicas descritas anteriormente para el
Ad-Cre.
Se construye el adenovirus
Rep-Cre que lleva a la vez el replicón y el gen de
la recombinasa Cre. Esta estrategia permite aumentar la eficacia de
transferencia del replicón y muy especialmente "in
vivo". Se inserta el cassette de expresión del Cre en el
genoma del adenovirus en las regiones E1, E3 o E4. Se busca una
expresión perfectamente regulada de la recombinasa para impedir la
escisión del replicón a partir del genoma del adenovirus en el
momento de su propagación en las células IGRP2.
Se busca la regulación de la expresión de la
recombinasa a nivel transcripcional (promotor de tejido específico
activado "in vivo" o promotor inducible) o a nivel
postranscripcional (fusión del Cre con el dominio de fijación del
receptor de hormonas esteroideas Cre-ER).
Para construir estos adenovirus se introduce el
replicón en el plásmido pXL2789 del modo descrito en el ejemplo
anterior. A continuación se introduce el cassette de expresión de
Cre que lleva el promotor tet o MMTV o una fusión
Cre-ER por doble recombinación homóloga en la E.
coli en dicho plásmido para generar plásmidos
pRep-Cre1 (Rep y Cre en E1) y
pRep-Cre2 (Rep en E1 y Cre en E4). Seguidamente se
tratan estos plásmidos con PacI para extraer el genoma vírico
recombinante, que se introduce en las células EGRP2 para producir
los virus correspondientes.
Esta construcción permite evitar con ventaja la
contaminación del Ad-Rep-Cre con el
adenovirus que ha sufrido deleción del replicón en el caso en el que
no se pudiera obtener una regulación perfecta de la actividad del
Cre. La estrategia se basa en la inserción de la señal de
encapsidación Psi en el replicón. Se modifica el vector pXL3048 por
mutagénesis dirigida a nivel de la región ITR con el fin de efectuar
la deleción de la señal de encapsidación y de introducir un sitio
LoxP, obteniéndose el plásmido
pXL3048-\DeltaPsi-LoxP. Se aísla
la secuencia del replicón que ha sufrido deleción del sitio ''LoxP
izquierdo) por digestión enzimática a partir de los plásmidos pAdLX2
o pAdLX2-EBNA1 y se clona en el sitio EcoRV del
plásmido
pXL3048-\DeltaPsi-LoxP.
Se controla la funcionalidad de los vectores
víricos de la invención "in vitro" e "in
vivo".
Se demuestra "in vitro" la actividad
de recombinasa del adenovirus Cre en las células
Hela-EBNA1 transfectadas con pRep y en la línea de
células embrionarias de ratón (LoxP-bgal), en la que
puede activarse la expresión del lacZ por recombinación entre dos
sitios loxP.
Se ha estudiado la eficacia de la escisión del
replicón a partir del genoma adenovírico en células IGRP2
co-infectadas con el Ad-Rep y con el
Ad-Cre.
El análisis directo del ADN vírico aislado por la
técnica de Hirt y digerido por XhoI revela la desaparición total del
fragmento correspondiente al replicón no escindido del genoma del
Ad-Rep, lo cual demuestra la eficacia de la
recombinación entre los dos sitios LoxP. El análisis por Southern de
las mismas muestras ha permitido poner de manifiesto un fragmento de
9,2 kb correspondiente al replicón.
En las células Hela co-infectadas
con el Ad-Rep y Ad-Cre se observa al
cabo de 48 h una actividad de b-galactosidasa en el
50% de las células, mientras que en las células infectadas con el
adeno-Rep solo no se detecta actividad alguna de la
b-galactosidasa. Al cabo de 96 h, el número de
células que expresan el lacZ aumenta con la división celular.
Después del pasaje de las células de expresión del lacZ se mantiene
todavía durante por lo menos durante 20 días después de la
co-infección. Estos resultados demuestran que (i) el
replicón puede entregarse con eficacia a la célula por
co-infección con dos adenovirus, que (ii) la
recombinación libera el replicón y activa la expresión del transgén
y que (iii) el replicón permite asegurar la expresión estable del
transgén en el curso de las divisiones celulares.
Se ha demostrado la validación "in
vivo" con la transferencia de células humanas normales
(queratinocitos, células cepa hematopoyéticas (CD34+), células cepa
epiteliales de bronquios, mioblastos...) o cancerosas (MDA, HT29...)
previamente co-infectadas con Ad-Rep
y Ad-Cre en el ratón desnudo.
La expresión del transgén y la estabilidad del
episoma en el curso de las divisiones celulares se verifican con las
técnicas descritas anteriormente.
| Secuencia | Fragmento | Tamaño (bp) | Origen |
| LoxP | NotI (1-296) | 34 | pBS246 (GIBCO-BRL) |
| LTR de RSV | BamHI-SalI (478-1080) | 602 | pRSV-TK (WO 95/14101) |
| oriP | EcoRi-HpaI (5052-3235) | 1817 | pSLori (WO 95/14101) |
| SV40 polyA | BamHI-SalI (406-7) | 399 | pCEP-4 (Invitrogen) |
| EBNA-1 | BamHI-PstI (759-2803) | 2044 | pCMV-EBNA (Clontech) |
| IRES | (16-518) | 502 | pCITE 2a (Novagen) |
| TK | claI-BsawI (1721-556) | 1165 | pCMV-TK-E1 (Gene Therapy 3, 315, 1996) |
| pIC19H | 2700 | Marsh y col., Gene 32, 481, 1984 | |
| pIC20H | 2700 | ||
| pIC20R | 2700 | ||
| pBluescriptII-KS | 2850 | (Stratagene) | |
| hCMV | BglII-BglII (473-1226) | 753 | pCEP4 (Invitrogen) |
| LacZ | StuI-BamH1 (1149-4354) | 3205 | pRSVGalIX (L. Stratford- Perricaudet, J. Clin. |
| Invest. p. 626, 1992) | |||
| hCMV-Cre-MTpA | HindIII-HindIII (0-3400) | 3400 | pBS185 (GIBCO-BRL) |
| Zeo-Lac | NcoI-ClaI (750-1980) | 1230 | pUT641 (CAYLA) |
(1) INFORMACIONES GENERALES:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Rhone Poulenc Rorer SA
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 20, avenue Raymond Aron
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: ANTONY
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Francia
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 920165
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: GENERACIÓN DE MOLÉCULAS REPLICANTES "IN VIVO".
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 3
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- FORMA LEÍBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE SOPORTE: floppy disk
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA DE EXPLOTACIÓN: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- PROGRAMA INFORMÁTICO: PatentIn Release #1.0, versión #1.30 (OEB)
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES SOBRE LA SEQ ID NO: 1
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 26 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGCCTCTAGA CAGCTGGTTA TTTTCC
\hfill26
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES SOBRE LA SEQ ID NO: 2
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 23 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: simple
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGCCGGATCC CATATTATCA TCG
\hfill23
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIONES SOBRE LA SEQ ID NO: 3
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 147 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE HEBRAS: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3
Claims (26)
1. Vector vírico caracterizado porque
contiene una región de ADN delimitada por dos secuencias que
permiten una recombinación específica de sitio y posicionadas en
orientación directa, dicha región contiene sucesivamente un promotor
funcional en las células de mamíferos, la secuencia oriP del virus
EBV, un cassette de expresión que contiene un gen de interés y el
gen de la proteína EBNA1 separados por una secuencia IRES derivada
del virus ECMV, el promotor y el cassette de expresión están
orientados de tal manera que la expresión de los dos genes solamente
es posible después de la recombinación específica de sitio.
2. Vector vírico según la reivindicación 1,
caracterizado porque la expresión del gen de interés depende
de la recombinación específica de sitio.
3. Vector vírico según una de las
reivindicaciones 1 y 2, caracterizado porque las secuencias
que permiten la recombinación específica de sitio son secuencias
capaces de recombinar específicamente en presencia de una
recombinasa.
4. Vector vírico según la reivindicación 3,
caracterizado porque las secuencias que permiten la
recombinación específica de sitio se derivan de un bacteriófago.
5. Vector vírico según la reivindicación 4,
caracterizado porque las secuencias que permiten la
recombinación específica de sitio se derivan del bacteriófago
P1.
6. Vector vírico según la reivindicación 5,
caracterizado porque se trata de secuencias repetidas
inversas del bacteriófago P1 (región loxP), cuya recombinación se
induce con la recombinasa Cre.
7. Vector vírico según la reivindicación 3,
caracterizado porque contiene el gen que codifica la
recombinasa correspondiente, además de la región delimitada entre
las dos secuencias que permiten una recombinación específica de
sitio.
8. Vector vírico según la reivindicación 7,
caracterizado porque el gel que codifica a la recombinasa
está colocado bajo el control de un promotor inducible.
9. Vector vírico según la reivindicación 8,
caracterizado porque el promotor se elige entre el promotor
MMTV inducible por la dexametasona y un promotor inducible por la
tetraciclina.
10. Vector vírico según la reivindicación 8,
caracterizado porque el gen de la recombinasa contiene además
un elemento regulador que codifica al dominio de fijación de un
receptor de una hormona.
11. Vector vírico según la reivindicación 10,
caracterizado porque se trata de un receptor elegido entre
los receptores de glucocorticoides, de mineralocorticoides, de
tiroides, de estrógenos, de aldosterona y de ácido retinoico.
12. Vector vírico según una de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la región
de encapsidación del virus está incluida en la región de ADN
enmarcada entre las dos secuencias que permiten la recombinación
específica de sitio.
13. Vector vírico según una de las
reivindicaciones anteriores, caracterizado porque se trata de
un adenovirus recombinante deficiente.
14. Vector vírico según la reivindicación 13,
caracterizado porque se trata de un adenovirus que comprende
una deleción de la totalidad o de una parte de la región E1.
15. Vector vírico según la reivindicación 14,
caracterizado porque se trata de un adenovirus que comprende
además una deleción de la totalidad o de una parte de la región
E4.
16. Vector vírico según una de las
reivindicaciones de 1 a 12, caracterizado porque se trata de
un retrovirus recombinante deficiente.
17. Vector vírico según una de las
reivindicaciones de 1 a 12 caracterizado porque se trata de
un AAV recombinante deficiente.
18. Célula modificada por la inserción de un
vector vírico según una de las reivindicaciones de 1 a 17.
19. Célula según la reivindicación 18,
caracterizado porque se trata de una célula eucariota.
20. Composición farmacéutica que contiene por lo
menos un vector vírico según una de las reivindicaciones de 1 a 17 o
una célula según la reivindicación 18.
21. Procedimiento de obtención "in
vitro" de moléculas de ADN circulares replicantes,
caracterizado porque se pone en contacto una población de
células que contiene un vector vírico según la reivindicación 3 con
la recombinasa que permite inducir "in situ" la
recombinación específica de sitio.
22. Procedimiento según la reivindicación 21,
caracterizado porque la puesta en contacto con la recombinasa
se efectúa por transfección o infección de dichas células con un
plásmido o con un vector vírico que contenga el gen de dicha
recombinasa.
23. Procedimiento de obtención "in
vitro" de moléculas de ADN circulares replicantes, que
consiste en:
(i) la transformación de las células mediante un
vector vírico que contiene:
- una región de ADN delimitada por dos secuencias
que permiten una recombinación específica de sitio y posicionadas en
orientación directa, dicha región contiene sucesivamente un promotor
funcional en las células de mamíferos, la secuencia oriP del virus
EBV, un cassette de expresión que contiene un gen de interés y el
gen de la proteína EBNA1 separados por un secuencia IRES derivada
del virus ECMV; el promotor y el cassette de expresión están
orientados de tal manera que la expresión de los dos genes solamente
es posible después de la recombinación específica de sitio y
- el gen que codifica a dicha recombinasa bajo el
control de un promotor inducible y
(ii) la inducción de la expresión de la
recombinasa.
24. Utilización de un vector vírico según una
cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 17 para generar "in
vitro" moléculas de ADN circulares replicantes.
25. Vector vírico según una cualquiera de las
reivindicaciones de 1 a 17 como medicamento para la terapia
genética.
26. Utilización de un vector vírico según una
cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 17 para la fabricación de
un medicamento destinado a la terapia genética.
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