ES2238678T3 - Inmunodosificados relativos al antigeno especifico de la prostata. - Google Patents
Inmunodosificados relativos al antigeno especifico de la prostata.Info
- Publication number
- ES2238678T3 ES2238678T3 ES95906713T ES95906713T ES2238678T3 ES 2238678 T3 ES2238678 T3 ES 2238678T3 ES 95906713 T ES95906713 T ES 95906713T ES 95906713 T ES95906713 T ES 95906713T ES 2238678 T3 ES2238678 T3 ES 2238678T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- analyte
- psa
- antibody
- antibodies
- complex
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/689—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to pregnancy or the gonads
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/575—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57555—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer of the prostate
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/81—Protease inhibitors
- G01N2333/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
- G01N2333/811—Serine protease (E.C. 3.4.21) inhibitors
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/81—Protease inhibitors
- G01N2333/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
- G01N2333/811—Serine protease (E.C. 3.4.21) inhibitors
- G01N2333/8121—Serpins
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/34—Genitourinary disorders
- G01N2800/342—Prostate diseases, e.g. BPH, prostatitis
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/962—Prevention or removal of interfering materials or reactants or other treatment to enhance results, e.g. determining or preventing nonspecific binding
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/967—Standards, controls, materials, e.g. validation studies, buffer systems
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/975—Kit
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
- Y10S436/811—Test for named disease, body condition or organ function
- Y10S436/813—Cancer
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Gynecology & Obstetrics (AREA)
- Pregnancy & Childbirth (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE AL CAMPO DE LOS INMUNOENSAYOS DE CANCER. ESPECIFICAMENTE, UN NUEVO METODO DE INMUNOENSAYO PARA EL ANTIGENO ESPECIFICO DE LA PROSTATA (PSA). TAMBIEN SE PRESENTA UN COMPLEJO QUE SE ASEMEJA A UN COMPLEJO DE PSA Y {AL}ANTIQUIMOTRIPSINA (ACT) QUE PUEDE UTILIZARSE COMO CALIBRADOR O CONTROL EN UN INMUNOENSAYO PARA PSA. SE PRESENTE ADEMAS UN METODO PARA EL FRACCIONAMIENTO DE ANTICUERPOS POLICLONALES, A PSA, EN AQUELLOS QUE AGLOMERAN EPITOPES QUE SE ENMASCARAN POR LA FIJACION DE PSA A ACT, Y AQUELLOS QUE NO SE FIJAN A TALES EPITOPES.
Description
Inmunoensayos para el antígeno específico de
próstata.
La presente invención se refiere al campo de
inmunoensayos de cáncer. Específicamente, se presenta un nuevo
método de inmunoensayo para el antígeno específico de próstata
(PSA). También se presenta un complejo
PSA-anti-PSA que se parece a un
complejo de PSA y \alpha_{1}-antiquimiotripsina
(ACT) que puede usarse como un calibrador y/o control en un
inmunoensayo de PSA.
El antígeno específico de próstata (PSA) se
describió por primera vez por Wang, M. C., et al., Invest
Urol. 17:159 (1979). Es una secreción del epitelio de la
próstata y también se produce por células cancerígenas de la
próstata. PSA se caracterizó como una glicoproteína monomérica de
33-34.000 dalton de peso molecular con actividad
proteasa (Wang, M. C., et al., supra y Ban, Y, et
al., Biochem Biophys Res Commun, 123:482 (1984)).
Más recientemente, se ha informado de la secuencia de aminoácidos
del antígeno (Watt, W. K., et al., Proc Natl Acad Sci
USA, 83:3166 (1986)) y se ha clonado el gen de PSA
(Lundwall, A., Biochem Biophys Res Commun, 161:1151
(1989)). El desarrollo de un inmunoensayo de enzimas por Kuriyama,
et al., hizo posible detectar bajas concentraciones de PSA en
sangre de pacientes con una enfermedad de próstata maligna o benigna
y de una proporción significativa de varones normales (Kuriyama, M.
et al., Cancer Res. 40:4658 (1980)).
Ensayar PSA puede tener un valor significativo en
la detección de una enfermedad metastásica o persistente en
pacientes después de tratamiento quirúrgico o médico de cáncer de
próstata (Lange, P. H., et al., Urology 33(6
supl):13, (junio, 1989); y Killian, C. S., et al.,
Cancer Res 45:886 (1985)). La elevación persistente de
PSA después de tratamiento o una aumento en el nivel basal de PSA
después del tratamiento es indicativo de una enfermedad recurrente o
residual (Brawer, M. K., et al., Urology, 33 (5
supl):11 (mayo, 1989); Siddal, J. K., et al., Eur
Urol 12:1:3 (1986); Stamey, T. A., et al., N
Engl J Med 317:909 (1987); Lange, P. H. et al.,
J Urol. 141:873 (1989); Stamey, T. A., et al.,
J Urol, 141:1076 (1989); Stamey, T. A., et al.,
J Urol 141:1084, (1989); Stamey, T. A., et al.,
J Urol 141:1088 (1989); y Chan, D. W., et al.,
Clin Chem 33:1916 (1987)).
No se recomienda sólo ensayar PSA como
procedimiento de búsqueda en la población general ni como guía en
determinar el estado de una enfermedad. Sin embargo, está
ampliamente aceptado como ensayo auxiliar en el manejo de pacientes
de cáncer de próstata (Kuriyama, M. et al., J Natl Cancer
Inst 68:99 (1982); Stamey, T. A., et al., N
Engl J Med 317:909 (1987); Lange, P. H. et al.,
J Urol. 141:873 (1989); Stamey, T. A., et al.,
J Urol. 141:1076 (1989); Stamey, T. A., et al.,
J Urol. 141:1084 (1989); Stamey, T. A., et al.,
J Urol. 141:1088 (1989); Chan, D. W., et al.,
Clin Chem 33:1916 (1987); y Oesterling, J. E., et
al., J Urol. 139:766 (1988)).
Ahora se ha encontrado un uso generalizado de las
medidas de la concentración en suero de PSA en controlar a los
pacientes con cáncer de próstata, aunque también se ha informado de
concentraciones en suero de PSA aumentadas en hiperplasia prostática
benigna y como efecto secundario al trauma quirúrgico de la próstata
(Duffy, Ann Clin Biochem, (1989); Brawer, et al.,
Urology Suppl. (1989)).
La Solicitud de Patente PCT Nº WO 92/01936,
"Assay of Free and Complexed Prostate
Specific-Antigen (PSA)" para Lilja, H. et
al., publicada el 6 de febrero de 1992, describe inmunoensayos
de PSA libre así como PSA como un complejo inhibidor de proteinasa.
El PSA libre y el complejo de PSA se miden por un inmunoensayo no
competitivo empleando al menos dos anticuerpos monoclonales
diferentes. La invención también se caracteriza porque el complejo
PSA-inhibidor de proteinasa de interés se forma con
\alpha_{1}-antiquimiotripsina (ACT), inhibidor
de \alpha_{1}-proteasa (API) o
\alpha_{2}-macroglobulina. Además, la invención
se caracteriza en que el PSA libre, el complejo
PSA-inhibidor de proteinasa y sus proporciones para
PSA total se aplican en el diagnóstico de pacientes con cáncer de
próstata.
La Solicitud de Patente describe tres anticuerpos
monoclonales ("MAB"). Se identificaron PSA complejado con ACT
("complejo PSA-ACT") y PSA libre por MAB 2E9 y
2H11. MAB 5A10 reconoce PSA libre pero no el complejo
PSA-ACT. MAB 2E9 es el único MAB
anti-PSA que identifica PSA libre y el complejo
PSA-ACT en inmunotransferencias. Ninguno de los MAB
E29, 2H11 o 5A10 anti-PSA bloquearon de manera
significativa la unión entre sí al PSA unido a la fase sólida.
Usando diferentes combinaciones de los MAB en
inmunoensayos no competitivos de suero humano, la solicitud
descubrió que se consigue una especificidad clínica aumentada
midiendo tanto el PSA libre como el complejo PSA-ACT
y que las proporciones entre PSA libre/PSA total y PSA
libre/complejo PSA-ACT son significativamente
diferentes entre pacientes de hiperplasia prostática benigna y
pacientes de cáncer de próstata.
Están disponibles en el mercado MAB específicos
para PSA libre y los reactivos con el complejo
PSA-ACT, por ejemplo, de CanAg Diagnostics AB,
Gothenburg, Suecia. A través de estudios de inhibición y análisis de
respuesta a dosis de diferentes combinaciones de sus MAB, CanAg
Diagnostics AB descubrió al menos 9 grupos determinantes antigénicos
principales en la molécula PSA. Un grupo de sus epítopos definidos
por MAB se expusieron tanto en PSA no complejado como en el complejo
PSA-ACT, y otro grupo de sus epítopos definidos por
MAB se expuso solo en PSA libre. (CanAg Diagnostics AB, Nilsson
et al., Epitope mapping of PSA, and development of assays
for determination of different isoforms of PSA, y el resumen del
mismo título, Abstract P 38, J. Tumor Marker Oncology, 10ª
Int'I Conference on Human Tumor Markers, 8-11 de
septiembre de 1993, Bonn, Alemania).
Los radioinmunoensayos competitivos de PSA están
disponibles en el mercado (por ejemplo, de
PROS-CHECK PSA, Yang Laboratories, Inc., Bellevue,
Washington). PROS-CHECK PSA usa anticuerpos
policlonales de conejo frente a PSA, y PSA marcado con
yodo^{125}.
Actualmente, hay dos tipos de inmunoensayos tipo
sándwich no competitivo de PSA en el mercado. El primer tipo son
ensayos tipo sándwich que usan dos conjuntos de MAB específicos para
PSA: (1) un conjunto de MAB ("anticuerpos de captura") se une a
una fase sólida para capturar PSA en una muestra, y (2) el otro
conjunto de MAB ("anticuerpos sonda") está marcado y en
solución libre se une al PSA capturado para su detección. Estos
ensayos se mencionan en este documento como "ensayos tipo
MONO". Generalmente, la unión de estos MAB a PSA no se evita por
la unión de ACT a PSA. Es decir, generalmente, estos MAB pueden
unirse tanto a PSA libre como al complejo PSA-ACT.
Los ejemplos de dichos ensayos son los ensayos de PSA
Tandem-E y Tandem-R Hybritech
(Hybritech, La Jolla, CA).
El segundo tipo de ensayos tipo sándwich usa MAB
específico para PSA en la fase sólida, y anticuerpos policlonales
para PSA como anticuerpos sonda. Generalmente, en estos ensayos, el
MAB puede unirse tanto a PSA libre como al complejo
PSA-ACT. En contraste, la combinación de anticuerpos
policlonales contiene anticuerpos que pueden unirse tanto a PSA
libre como al complejo PSA-ACT, y anticuerpos que
pueden unirse a PSA libre pero no al complejo
PSA-ACT. En el último caso, los epítopos unidos por
estos anticuerpos se bloquean por la unión de ACT a PSA. Los
ejemplos de estos ensayos son el ensayo de PSA Abbott IMx® (Abbott
Laboratories, Abbott Park, IL), y el ensayo de PSA ACS^{TM}
(Ciba-Corning Diagnostics Corporation, East Walpole,
MA).
Se ha descubierto que el segundo tipo de ensayos
tipo sándwich detecta preferentemente PSA libre por encima del de
complejo PSA-ACT (este fenómeno se menciona en este
documento como "bias"). Por otro lado, algunos ensayos tipo
MONO no muestran dicho bias. Véase Bluestein, B., et al.,
J. Tumor Marker Oncology, 7(4) 41 (1992).
Se ha descubierto que en suero de pacientes con
hiperplasia protática benigna (BPH), hay más PSA libre que complejos
PSA-ACT. Por otro lado, en el suero de pacientes de
cáncer de próstata, hay más complejos PSA-ACT que
PSA libre. (Lilja, H., et al., Clin. Chem.,
37:1618 (1991); Stenman, U., et al., Cancer
Res., 51:222 (1991); Lilja, H., et al., Cancer
Suppl., 70:230 (1992); Christensson, A., et al.,
J. Urology, 150:100 (1993)).
La Patente de EEUU Nº 5.223.441 describe
receptores que son anticuerpos que muestran una afinidad de unión
para un complejo inmune de un antígeno de un solo epítopo y un
anticuerpo para dicho antígeno que es sustancialmente mayor que la
afinidad de unión para el antígeno de un solo epítopo o para el
anticuerpo para el antígeno de un solo epítopo de forma separada del
complejo inmune.
De acuerdo con la reivindicación 1, un aspecto de
la invención presenta nuevos ensayos tipo MOLY o MONO para detectar
y cuantificar PSA en una muestra, donde la muestra se trata con
Anticuerpos HE_{PSA} que se unen a PSA libre pero no a un complejo
de PSA y ACT ("complejo PSA-ACT"). La adición
de Anticuerpos HE_{PSA} a los ensayos reduce o elimina el bias en
estos ensayos. También se presentan kits para realizar estos ensayos
de acuerdo con la reivindicación 10.
De acuerdo con la reivindicación 13, otro aspecto
de la invención presenta un complejo de PSA y Anticuerpos HE_{PSA}
("complejo PSA-Anticuerpos HE_{PSA}"), que se
parece al complejo PSA-ACT. Este complejo es útil
como calibrador y/o control para inmunoensayos de PSA.
Los aspectos anteriores de la invención pueden
aplicarse generalmente a cualquier analito que pueda existir en un
estado libre o complejado con una molécula de unión.
La Figura 1 compara el método convencional (Parte
A) y el método de la presente invención (Parte B) para ensayar PSA y
muestra cómo los Anticuerpos HE_{PSA} modifican la especificidad
de ensayo para PSA libre y el complejo PSA-ACT.
La Figura 2 ilustra el método para obtener
anticuerpos policlonales frente a epítopos ocultos y no ocultos en
PSA.
Como se usa en este documento, el término
"anticuerpos" incluye tanto anticuerpos policlonales como
monoclonales, inmunoglobulinas completas y fragmentos de unión a
antígeno de las inmunoglobulinas. Los ejemplos de estos fragmentos
son Fab, F(ab')_{2} y Fv. Dichos fragmentos pueden
producirse por métodos conocidos en la técnica.
Como se usa en este documento, el término
"Anticuerpos HE" o "\alphaHE" indica anticuerpos cuya
unión a su antígeno diana ("Analito") podría evitarse por la
unión de otra molécula ("Molécula de Unión") al Analito. El
término "Anticuerpos no HE" o "\alphanHE" indica
anticuerpos cuya unión al Analito no se evita por la unión de la
Molécula de Unión al Analito. El epítopo del Analito que se oculta
por la unión de la Molécula de Unión al Analito se llama "epítopo
oculto" ("HE"). De manera similar, el epítopo del Analito
que no se oculta por la unión de la Molécula de Unión al Analito se
llama "epítopo no oculto" ("nHE"). El término
"\alphaAnalito" o "\alphaA" indica cualquier
anticuerpo que está dirigido frente al Analito sea un \alphaHE o
\alphanHE.
El Analito preferiblemente es un antígeno
encontrado en una muestra biológica, y preferiblemente es endógena a
la muestra. La Molécula de Unión preferiblemente es endógena a la
muestra y a menudo está asociada con el Analito. Preferiblemente, la
Molécula de Unión y el Analito son proteínas. Los ejemplos de
Analitos son proteasas de suero y sus Moléculas de Unión son
inhibidores de proteasas de suero. Algunas de estas proteasas de
suero y sus inhibidores (entre paréntesis) son: proteína C
(inhibidor de proteína C); elastasa (anti-tripsina);
catepsina G (ACT); PSA (ACT); PSA
(\alpha_{2}-macroglobulina); trombina
(anti-trombina III);
C_{1}-esterasa
(C_{1}-inhibidor); t-PA
(PAI-1); uPA (PAI-1); plasmina
(\alpha_{2}-antiplasmina); PSA (inhibidor de
\alpha_{1}-proteasa); y PSA (inhibidor de
proteína C). "PAI-1" indica inhibidor del
activador plasminógenos Tipo 1. "t-PA" indica
activador de plasminógeno tisular. "uPA" indica activador de
plasminógeno urinario. Un especialista en la técnica se daría cuenta
de que la Molécula de Unión pueden ser proteasas de suero y el
Analito pueden ser inhibidores de proteasas de suero.
El término "ensayo tipo MOLY" describe un
inmunoensayo en el que los anticuerpos de captura son MAB y los
anticuerpos sonda son anticuerpos policlonales, o viceversa.
La presente invención describe un inmunoensayo
para un Analito en una muestra de ensayo. La muestra generalmente es
una muestra biológica. La muestra biológica puede ser fluidos
biológicos tales como sangre, suero, plasma, fluido prostático,
fluido seminal, orina, linfa y fluido vertebral.
Si una muestra contiene Analitos que no se unen a
la Molécula de Unión (estos Analitos no unidos también se mencionan
en este documento como "Analitos libres") y Analitos que forman
complejos con las Moléculas de Unión ("Analitos complejados" o
"complejos Analito-Molécula de Unión"), los
ensayos tipo MOLY y algún ensayo tipo MONO para los Analitos podría
mostrar un bias de modo que una muestra sin Analitos complejados
tuviera una lectura más alta que una muestra con Analitos
complejados. Esto puede suceder si, por ejemplo, algunos miembros de
los anticuerpos policlonales usados para detectar el Analito pueden
unirse a Analito libre pero no a Analito complejado.
La presente invención descubre que el bias
encontrado en ensayos tipo MOLY y algunos ensayos tipo MONO para
Analitos puede corregirse añadiendo Anticuerpos HE libres en la
mezcla de reacción. A parte de la adición de Anticuerpos HE libres,
los ensayos tipo MOLY y tipo MONO para un Analito particular puede
realizarse de acuerdo con métodos conocidos en la técnica para
dichos ensayos. Además, si el Analito en una muestra es capaz de
unirse directamente a una fase sólida cuando se incuba la muestra
con la fase sólida, entonces no es necesario un anticuerpo de
captura. Los anticuerpos sonda y de captura pueden producirse de
acuerdo con métodos conocidos en la técnica. Los anticuerpos sonda
pueden marcarse de acuerdo con métodos conocidos en la técnica con
marcadores tales como marcadores quimioluminiscentes, fluorescentes,
enzimáticos y radiactivos, y por consiguiente los ensayos se pueden
adaptar a los marcadores implicados. Un ejemplo de ensayos
inmunométricos marcados de manera luminiscente está en Word, W. G.,
et al., Eur. J. Clin. Chem. Clim. Biochem.,
29:787 (1991). Los Anticuerpos HE y no HE pueden producirse
usando métodos conocidos, tales como los usados para producir
Anticuerpos HE_{PSA} y no HE_{PSA} analizados a continuación.
Los Anticuerpos HE preferiblemente son anticuerpos monoclonales o
Anticuerpos HE policlonales específicos como se describe a
continuación.
Un aspecto de esta invención, por tanto, presenta
un inmunoensayo no competitivo tipo sándwich para un Analito en una
muestra biológica. Un anticuerpo de captura ("\alphanHE") que
se dirige frente a un epítopo no oculto del Analito, se acopla a una
fase sólida para capturar cualquier Analito que pueda estar presente
en la muestra biológica. El anticuerpo de captura se incuba con
Anticuerpos HE ("\alphaHE") de manera simultánea con o
después de la adición de la muestra biológica. Como alternativa,
también puede incubarse \alphaHE con la mezcla antes de exponerla
al anticuerpo de captura. Preferiblemente, el \alphaHE es un MAB.
La incubación dura un tiempo suficiente para permitir que se forme
el complejo de {(\alphaHE)(Analito)(\alphaHE)}. A continuación,
se retira de la mezcla de reacción cualquier reactivo que no se haya
unido a la fase sólida. Esto puede hacerse mediante una etapa de
lavado conocida para los especialistas en la técnica. Por ejemplo,
los reactivos no unidos se disuelven en un medio acuoso y se retiran
por lavado de la fase sólida, dejando el complejo de
{(\alphaHE)(Analito)(\alphaHE)} en la fase sólida.
A continuación, se añaden los anticuerpos
policlonales anti-Analito ("\alphaAnalito*").
Los \alpha-Analitos* preferiblemente están
marcados para la detección con, por ejemplo, marcadores enzimáticos,
radiactivos, fluorescentes, o quimioluminiscentes.
La mezcla de reacción se incuba durante un tiempo
suficiente para la formación del complejo
{(\alphanHE)(Analito)
(\alphaHE)(\alphaAnalito*)} y el complejo {(\alphanHE)(Analito)(Molécula de Unión)(\alphaAnalito*)}. Obsérvese que en el complejo de {(\alphanHE)(Analito)(\alphaHE)(\alphaAnalito*)}, tanto \alphaHE como \alphaAnalito* están unidos al Analito en el complejo. Obsérvese que si está presente en la muestra una Molécula de Unión, puede también formarse otro complejo, es decir, el complejo de {(\alphanHE)(Analito)(Molécula de Unión)(\alphaAnalito*)}.
(\alphaHE)(\alphaAnalito*)} y el complejo {(\alphanHE)(Analito)(Molécula de Unión)(\alphaAnalito*)}. Obsérvese que en el complejo de {(\alphanHE)(Analito)(\alphaHE)(\alphaAnalito*)}, tanto \alphaHE como \alphaAnalito* están unidos al Analito en el complejo. Obsérvese que si está presente en la muestra una Molécula de Unión, puede también formarse otro complejo, es decir, el complejo de {(\alphanHE)(Analito)(Molécula de Unión)(\alphaAnalito*)}.
A continuación, se separan los reactivos no
unidos. Las formaciones de los complejos de
{(\alphanHE)(Analito)(\alphaHE)
(\alphaAnalito*)} y {(\alphanHE)(Analito)(Molécula de Unión)(\alphaAnalito*)} en la fase sólida se detectan detectando el \alphaAnali-
to* marcado. Si el Analito no está presente en la muestra, estos complejos no estarán presentes. La presencia de estos complejos es directamente proporcional a la concentración de Analito en la muestra. Como alternativa, se puede ensayar la presencia de \alphaAnalito* marcado no unido que queda, la cantidad del cual es inversamente proporcional a la presencia del Analito en la muestra.
(\alphaAnalito*)} y {(\alphanHE)(Analito)(Molécula de Unión)(\alphaAnalito*)} en la fase sólida se detectan detectando el \alphaAnali-
to* marcado. Si el Analito no está presente en la muestra, estos complejos no estarán presentes. La presencia de estos complejos es directamente proporcional a la concentración de Analito en la muestra. Como alternativa, se puede ensayar la presencia de \alphaAnalito* marcado no unido que queda, la cantidad del cual es inversamente proporcional a la presencia del Analito en la muestra.
El formato de ensayo anterior también puede
usarse en ensayos tipo MONO que muestran bias. En un ensayo tipo
MONO, se aplicará el análisis anterior, excepto en que el
\alphaAnalito* es \alphanHE marcado (es decir, "nHE*").
En el caso en el que el anticuerpo de captura es
un anticuerpo policlonal y el anticuerpo sonda es un MAB, se
aplicará el anterior análisis excepto en que el anticuerpo de
captura es \alphaAnalito o \alphanHE (\alphanHE puede
fraccionarse de anticuerpos policlonales, por ejemplo, por métodos
de fraccionamiento descritos posteriormente), y el anticuerpo sonda
es \alphanHE*. Si los anticuerpos de captura, \alphaAnalito,
contienen una subpoblación de \alphaHE, habrá también un complejo
adicional de {(\alphaHE)(Analito)(\alphanHE*)} como resultado de
las etapas de ensayo anteriores.
El análisis anterior supone que sólo hay un HE en
el Analito. Sin embargo, se observará que si un \alphaHE
particular no oculta todo el HE en el Analito, entonces se tienen
que usar Anticuerpos HE adicionales dirigidos frente a otros sitios
HE del Analito.
Un especialista en la técnica se daría cuenta de
que no se necesita marcar un anticuerpo sonda si puede unirse de
manera específica por otra molécula que está marcada. Además, si el
Analito puede unirse directamente a la fase sólida, entonces no se
necesita usar un anticuerpo de captura.
En esta solicitud también se presentan kits de
ensayo para realizar los ensayos anteriores. Preferiblemente, el kit
de ensayo tiene un recipiente que contiene Anticuerpos HE no
marcados; y otro recipiente que contiene anticuerpos de captura
dirigidos frente el Analito, preferiblemente, estos anticuerpos
están dirigidos frente a no HE, más preferiblemente, son MAB, mucho
más preferiblemente, se unen a una fase sólida. Los Anticuerpos HE
no marcados pueden estar en un recipiente separado o en el mismo
recipiente que los anticuerpos de captura o los anticuerpos sonda.
Para un Ensayo tipo MOLY, el kit puede tener adicionalmente: un
recipiente que contiene anticuerpos policlonales sonda frente al
Analito y preferiblemente los anticuerpos están marcados para la
detección; y otro recipiente que contiene reactivos que podrían
reaccionar con los marcadores en los anticuerpos para emitir una
señal. Por ejemplo, los anticuerpos policlonales pueden estar
marcados con una enzima tal como fosfatasa alcalina y el reactivo
que podría reaccionar con él sería el sustrato enzimático. En el
caso de fosfatasa alcalina, se ha descubierto que
4-metilumbeliferil fosfato (MUP) es adecuado y la
reacción se describe en el Ejemplo II posterior. Como alternativa,
los anticuerpos sonda pueden ser anticuerpos monoclonales, y los
anticuerpos de captura pueden ser anticuerpos policlonales. En dicho
caso, los anticuerpos sonda monoclonales preferiblemente son
Anticuerpos no HE. Para un ensayo tipo MONO, los anticuerpos sonda y
de captura son MAB dirigidos frente al Analito. Preferiblemente, los
MAB sonda y de captura son Anticuerpos no HE. En los kits
anteriores, los anticuerpos están preferiblemente en solución, tal
como un tampón, que no tiene efectos adversos en inmunoensayo. Los
kits anteriores pueden tener adicionalmente un recipiente o
recipientes que contienen calibrador o calibradores y/o un
recipiente o recipientes que contienen control o controles. Para un
Ensayo de Analito, el calibrador y el control preferidos contienen
Analito libre, el complejo de Analito-Anticuerpos
HE, o el complejo de Analito-Molécula de Unión
descritos posteriormente.
En la invención preferida, el Analito es PSA, y
la Molécula de Unión es ACT. Los Anticuerpos HE frente a PSA son los
que se unen a PSA libre pero no al complejo PSA-ACT.
Estos anticuerpos también se mencionan en este documento como
"Anticuerpos HE_{PSA}". Los Anticuerpos no HE
correspondientes también se mencionan como "Anticuerpos no
HE_{PSA}".
Los métodos para obtener Anticuerpos HE_{PSA}
(y Anticuerpos no HE_{PSA}) son conocidos en la técnica. Por
ejemplo, se describen en la Solicitud de Patente PCT Nº WO 92/01936,
para Lilja et al., supra. y CanAg Diagnostics AB,
Nilsson et al., Epitope mapping of PSA, and development of
assays for determination of different isoforms of PSA (1993) y
su Resumen del mismo título, supra. Los ejemplos de
Anticuerpos HE_{PSA} son: (1) MAB 5A10 descrito en el documento WO
92/01936; (2) MAB 9B10 que se describe en K. Pettersson et
al., Development of Immunofluorometric Methods for PSA to
Improve the Discrimination Between Early Prostate and Benign
Prostatic Hyperplasia, XV Intenational Congress of Clinical
Chemistry, Melbourne, Australia, 14-19 de noviembre
(1993) que también describe MAB H117 y H50; y (3) MAB PSA6, PSA30,
PSA17, PSA19, PSA20, y PSA25 que están disponibles en el mercado por
CanAg Diagnostics AB, Gothenburg, Suecia. La Solicitud de Patente Nº
de Serie 08/094.901, presentada el 22 de julio de 1993, pata
Matikainen, M., et al. describe tanto MAB 5A10 como 9B10, su
producción y características; los hibridomas que secretan estos MAB
se denominan en ella 5A10E7F11H4 y 9B10A9H3, respectivamente. Estos
hibridomas se depositaron en la European Collection of Animal Cell
Cultures (ECACC), Public Health Laboratory Service, Centre for
Applied Microbiology and Research, Proton Down, Salisbury, Wiltshire
SP4 OJG, Gran Bretaña el 12 de marzo de 1993, y los números de
acceso ECACC dados 93031201 y 93031202, respectivamente.
Por tanto, en particular, la presente invención
presenta dos invenciones útiles para ensayos de PSA: nuevos ensayos
de PSA que usan Anticuerpos HE_{PSA} y complejo
PSA-Anticuerpo HE_{PSA} que se parece al complejo
PSA-ACT. La primera invención evita o reduce el bias
presente en los ensayos tipo MOLY de la técnica anterior. La última
invención es útil como calibrador y/o control tanto para los ensayos
de PSA tipo MONO como tipo MOLY. Los Anticuerpos no HE_{PSA}
policlonales específicos seleccionados por el método descrito
también pueden usarse tanto en inmunoensayos tipo MOLY (como
anticuerpos sonda o de captura, o ambos) como competitivos (como
anticuerpos de captura) de PSA. Por otro lado, los Anticuerpos
HE_{PSA} podrían usarse en ensayos específicos de PSA libre o
podrían usarse en inmunoensayos de PSA (MOLY o MONO) que sufren de
bias, para aliviar o eliminar dicho bias, como se ha descrito
anteriormente.
Las presente solicitud usa PSA, ACT, y
Anticuerpos HE_{PSA} y Anticuerpos no HE_{PSA} para ilustrar la
invención. Sin embargo, un especialista en la técnica podría
entender que la invención puede aplicarse a cualquier Analito,
Molécula de Unión, y Anticuerpos HE y Anticuerpos no HE,
respectivamente.
La Figura 1 compara el ensayo tipo MOLY de PSA
convencional (Parte A) y el ensayo tipo MOLY de PSA de la presente
invención (Parte B) para ilustrar como los Anticuerpos HE_{PSA}
modifican la especificidad de ensayo para PSA libre y el complejo
PSA-ACT.
La parte A presenta el ensayo tipo MOLY
convencional que sufre de bias. Las etapas del procedimiento en la
Parte A son las mismas que las de la Parte B excepto en que la Parte
B tiene la etapa adicional de la Etapa B1.
Las etapas de la Parte A son las siguientes:
Etapa
A1
Un Anticuerpo no HE (\alphanHE1) que es
específico para un epítopo no oculto (denominado nHE1) en la
molécula PSA se une a una fase sólida. Cuando se deja reaccionar una
muestra que contiene PSA libre o complejo PSA-ACT
con \alphanHE1 unido a la fase sólida, tanto el PSA libre como el
complejo PSA-ACT pueden unirse exclusivamente a
través del epítopo nHE1. Por otro lado, el HE aún está disponible en
PSA libre para reacción posterior con otros anticuerpos.
Etapa
A2
La adición posterior de anticuerpos policlonales
marcados frente a PSA ("policlonales marcados"), que contienen
tanto anticuerpos específicos para HE (\alphaHE*) como anticuerpos
específicos para no HE2 (\alphanHE2*) marcados, dará como
resultado la unión de ambos tipos de anticuerpos al PSA libre. En
contraste, como HE está oculto por ACT en el complejo
PSA-ACT, los mismos policlonales marcados sólo
pueden unirse al epítopo no oculto nHE2. Estos policlonales marcados
están conjugados con un marcador para el propósito de detección. Los
ejemplos de marcadores son: marcadores quimioluminiscentes,
marcadores radiactivos, y marcadores enzimáticos que se conocen en
la técnica. En este ejemplo, el marcador es una enzima. Los
reactivos no unidos se retiran de la fase sólida, por ejemplo,
lavando la fase sólida usando métodos conocidos en la técnica.
Etapa
A3
Después el sustrato enzimático se añade a la fase
sólida y el producto enzimático genera una señal que se controla. El
PSA libre que ha unido dos policlonales marcados genera el doble de
señal que el complejo PSA-ACT, que sólo ha unido un
policlonal marcado dando como resultado un bias positivo para la
forma libre de PSA.
La Parte B presenta el ensayo de la presente
invención en el que los Anticuerpos HE_{PSA} no marcados se añaden
(en la Etapa B1) al ensayo descrito en la Parte A y esto da como
resultado un ensayo sin bias.
Las etapas en la Parte B son las siguientes:
Etapa
B1
La muestra se pre-trata con un
Anticuerpo HE_{PSA} no marcado (\alphaHE). Este anticuerpo
reacciona con HE en el PSA libre, pero no se une al complejo
PSA-ACT. Como alternativa, el \alphaHE no marcado
puede añadirse en la Etapa B2 o Etapa B3, respectivamente.
Etapa
B2
La muestra se añade al anticuerpo \alphanHE1
unido a la fase sólida como en la Parte A.
Etapa
B3
La adición posterior de policlonales marcados que
contienen anticuerpos marcados que reconocen He (\alphaHE*) y
anticuerpos que reconocen no HE (\alphanHE2*) dará como resultado
la unión de \alphaHE2* tanto al PSA libre como al complejo
PSA-ACT. \alphaHE* no puede unirse a PSA libre ni
al complejo PSA-ACT, porque HE está oculto por
\alphaHE no marcado en el PSA libre y por ACT en el complejo
PSA-ACT.
Etapa
B4
Se añade el sustrato y se controla la señal.
Tanto PSA libre como el complejo PSA-ACT generan
señal equivalente, porque ambos sólo se han unido a \alphanHE2*.
Esto da como resultado un ensayo son bias para el PSA libre en
comparación con el complejo PSA-ACT.
Los materiales para la fase sólida pueden se
cualquiera de los usados para inmunoensayos. Pueden usarse
materiales de origen natural, sintético o naturales que están
modificados sintéticamente. Incluyen: polisacáridos, por ejemplo,
materiales de celulosa incluyendo papel, celulosa y derivados de
celulosa tales como acetato de celulosa y nitrocelulosa; sílice;
fibra de vidrio; materiales inorgánicos tales como aluminio
desactivado, tierra de diatomeas u otro material inorgánico
finamente dividido dispersado de manera uniforme en una matriz
polimérica porosa hecha de polímeros tales como cloruro de vinilo,
copolímero de cloruro de vinilo-propileno, y
copolímero de cloruro de vinilo-acetato de vinilo;
tela, de origen natural (por ejemplo, algodón) y sintético (por
ejemplo, nylon); geles porosos tales como gel de sílice, agarosa,
dextrano y gelatina; películas poliméricas tales como
poliacrilamida; partículas magnéticas; placas de microtitulación,
tubos de poliestireno; membranas de unión de proteínas; agarosa;
Sephadex (Pharmacia Fine Chemicals, Inc., Piscataway, N.J.);
Trisacryl (Pointet-Girard, Francia); partículas de
silicona; matrices fibrosas porosas, etc. La fase sólida
preferiblemente es micropartículas sintéticas hechas preferiblemente
de poliestireno, cloruro de vinilo o látex de 0,1 a 10 micrómetros
de diámetro.
Los métodos para fraccionar anticuerpos
policlonales frente a Analitos para producir fracciones que
contienen Anticuerpos HE y Anticuerpos no HE, respectivamente, se
describen en este documento. Los anticuerpos policlonales frente a
Analitos pueden producirse usando métodos conocidos en la técnica.
Por ejemplo, los anticuerpos pueden producirse inyectando un animal
hospedador tal como un conejo, rata, cabra, ratón, etc., con el
Analito o fragmentos del mismo, solo o conjugado con un vehículo
apropiado, si se requiere, para provocar la respuesta de
anticuerpo.
Este método comprende exponer los anticuerpos
policlonales frente a un Analito que tiene su sitio HE oculto
("Analito oculto") por una Molécula de Unión o un Anticuerpo
HE. Los anticuerpos que se unen al Analito oculto, y que pueden
eluirse, son Anticuerpos no HE que se unen tanto a Analito libre
como al complejo Analito-Molécula de Unión. Por
tanto, los inmunoensayos que usan Anticuerpos no HE para detectar el
Analito, que puede estar presente en forma libre o complejada, no
mostrará bias. Los Anticuerpos no HE obtenidos de este modo pueden
usarse tanto en inmunoensayos tipo MOLY (como anticuerpos sonda o de
captura, o ambos) como competitivos (como anticuerpos de captura).
Por otro lado, los anticuerpos policlonales que no se unen al
Analito oculto son Anticuerpos HE. Los anticuerpos HE podrían usarse
en ensayos específicos para Analito libre o como se ha descrito
anteriormente para la adición en ensayos de Analito (inmunoensayos
tipo MOLY o MONO) que sufren de un bias para aliviar o eliminar
dicho bias.
El fraccionamiento anterior preferiblemente se
realiza usando cromatografía de afinidad. Preferiblemente, el
Analito oculto se entrecruza con la Molécula de Unión, Anticuerpos
HE, o Anticuerpos no HE. El entrecruzamiento puede conseguirse por
métodos conocidos en la técnica o modificación de los que están en
el conocimiento de un especialista en la técnica. Los ejemplos de
publicaciones que describen métodos para entrecruzar moléculas son:
Ji, T. H., Methods in Enzymology, 91:580 (1983); Wong,
S. S., et al., en el Capítulo 22, 226-282 de
Biocatalyst Design for Stability and Specificity, Eds. M.E.
Himmel and G. Georgiou, American Chemical Society, Washington, DC
(1993); M. N. Gupta en el Capítulo 26, 307-326 de
Biocatalyst Design for Stability and Specificity, Eds. M.E.
Himmel and G. Georgiou, supra; Chemical Reagents for
Protein Modification, 2ª ed., R.L. Lundblad, CRC Press,
Boston.
Preferiblemente, el complejo resultante se une a
un sólido, directamente o por medio de un agente de unión tal como
un Anticuerpo HE que está inmovilizado en la fase sólida, y se usa
en cromatografía de afinidad para seleccionar los Anticuerpos HE.
Los métodos generales para cromatografía de afinidad, tales como las
preparaciones de los anticuerpos y fase sólida, y los procedimientos
se conocen en la técnica, véase, por ejemplo,
Bio-Rad Bulletin 1099, Immunoaffinity
Chromatography with Affinity Supports (1990); Pharmacia LKB
Biotechnology, Affinity Chromatography, Principles &
Methods (1993); y Methods In Molecular Biology, vol. 10,
"Immunochemical Protocols", ed. M. M. Manson, p.
89-91 (1992); Immunochemistry in Practice, A.
Johnstone, et al., Capítulo 101, 202-232,
Scientific Publications, Oxford (1982); y Current Opinión in
Biotechnology, vol. 2, "Affinity Chromatography for Protein
Isolation", W.H. Scouten, 37-43 (1991).
La Figura 2 ilustra los tres métodos para
fraccionar anticuerpos policlonales en Anticuerpos HE y Anticuerpos
no HE usando PSA, ACT y Anticuerpos HE_{PSA} como ejemplos. Los
métodos son los siguientes:
Parte
A
Se conjuga ACT con una fase sólida, tal como
Sepharose-4B activada con bromuro de cianógeno
(disponible en el mercado por Pharmacia LKB Biotechnology, Suecia).
El PSA purificado se deja reaccionar con el ACT para formar un
complejo PSA-ACT que oculta los epítopos ocultos
(HE). El complejo puede estabilizarse adicionalmente por
entrecruzamiento químico. Cuando se incuban los anticuerpos
policlonales frente a PSA con
PSA-ACT-fase sólida, se unirán los
Anticuerpos HE_{PSA} no. Los Anticuerpos no HE_{PSA} específicos
para epítopos no ocultos, tales como nHE1 y nHE2, no se unirán y
pueden eluirse con métodos convencionales, tales como pH bajo. Por
tanto, los anticuerpos policlonales anti-PSA se
separan en Anticuerpos HE_{PSA} y no HE_{PSA}.
Parte
B
Los Anticuerpos HE_{PSA} (\alphaHE) se
conjugan con una fase sólida, tal como Sepharose-4B
activada con bromuro de cianógeno. El PSA purificado se deja que
reaccione con el \alphaHE para formar un complejo
PSA-\alphaHE que oculta los epítopos ocultos (HE).
El complejo puede estabilizarse adicionalmente por entrecruzamiento
químico. Cuando se incuban los anticuerpos policlonales frente a PSA
con PSA-\alphaHE-fase sólida, no
se unirán los Anticuerpos HE_{PSA} policlonales a la fase sólida.
Por otro lado, los Anticuerpos no HE_{PSA} policlonales no se
unirán y pueden eluirse con métodos convencionales, tales como pH
bajo. Se observará que si un \alphaHE particular no oculta todos
los HE en el PSA, entonces pueden usarse Anticuerpos HE adicionales
dirigidos frente a otros sitios HE de manera simultánea o
preferiblemente, en columnas de fraccionamiento secuenciales.
Parte
C
Los Anticuerpos no HE_{PSA} (\alphanHE)
dirigidos frente al epítopo 1 no oculto (nHE1) se conjugan con una
fase sólida, tal como Sepharose-4B activada con
bromuro de cianógeno. El PSA purificado se deja que reaccione con el
\alphaHE1 para formar un complejo PSA-\alphaHE1.
Un Anticuerpo HE_{PSA} (\alphaHE) purificado se deja que
reaccione con el PSA-\alphaHE1 para formar un
complejo que oculta los epítopos ocultos (HE). El complejo puede
estabilizarse adicionalmente por entrecruzamiento químico. Cuando se
incuban los anticuerpos policlonales frente a PSA con fase
sólida-\alphanHE1-PSA-\alphaHE-,
no se unirán los Anticuerpos frente a HE y nHE1 a la fase sólida.
Los Anticuerpos no HE_{PSA} frente a epítopos no ocultos distintos
de nHE1 no se unirán a la fase sólida y pueden eluirse con métodos
convencionales, tales como pH bajo. Los anticuerpos que no se unen a
la fase sólida pueden separarse adicionalmente por los métodos A o
B. Por tanto, los anticuerpos anti-PSA policlonales
se separan en Anticuerpos HE_{PSA}, Anticuerpos frente a nHE1 y
nHE distintos de nHE1. Se observará que si un \alphaHE particular
no oculta todos los HE en el PSA, entonces pueden usarse Anticuerpos
HE adicionales dirigidos frente a otros sitios HE de manera
simultánea o en columnas de fraccionamiento secuenciales.
Otro aspecto de la invención presenta un complejo
de Analito-Anticuerpo HE que puede servir como
calibrador o control en un ensayo de Analitos. El complejo puede
formarse añadiendo un exceso de Anticuerpos HE al Analito. Los
Anticuerpos HE están, preferiblemente, en un exceso de 2 veces a 100
veces, y más preferiblemente, 10 veces con respecto al Analito. Como
alternativa, el Analito puede entrecruzarse con los Anticuerpos HE.
El método descrito anteriormente para entrecruzar Analito y Molécula
de Unión es aplicable de manera similar para el entrecruzamiento de
Analito y Anticuerpos HE. El complejo se almacena preferiblemente en
un tampón inerte tal como solución salina tamponada con fosfato,
Tris-HCl, o HEPES. La temperatura de almacenamiento
preferiblemente varía de 2ºC a 25ºC. El pH está preferiblemente
entre 5 y 9. Un complejo entrecruzado del Analito y su Molécula de
Unión útil como un calibrador o control en un ensayo para el Analito
también puede producirse de manera similar.
Los siguientes Ejemplos I y II ilustran la
presente invención y no son para interpretarlos como limitantes de
ella. El Ejemplo III no representa una realización de la invención
pero es útil para entender la tecnología de selección de anticuerpos
policlonales.
El siguiente experimento se realizó usando los
reactivos para Ensayo de PSA IMx® y se realizó en el instrumento
IMx® (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL) siguiendo el protocolo
del prospecto adjunto de Ensayo de PSA IMx®, excepto en que en esta
invención, el Diluyente de Ensayo contenía adicionalmente de 0 a 20
\mug/ml de MAB 9B10 o 5A10 (analizado anteriormente) que se une a
PSA libre pero no al complejo PSA-ACT. Los reactivos
del Ensayo de PSA IMx® incluyen lo siguiente: (1) micropartículas
recubiertas con anticuerpo MAB H50 de captura ("Micropartícuals
Recubiertas Anti-PSA") que se unen y capturan
tanto PSA libre como complejado (es decir, PSA complejado con ACT)
en las micropartículas; y (2) anticuerpos policlonales de cabra
frente a PSA (que sirven como anticuerpos sonda) que están marcados
con fosfatasa alcalina para la detección
("Anti-PSA policlonal de cabra: Conjugado
Fosfatasa Alcalina" o "anticuerpos policlonales sonda").
Las muestras ensayadas fueron muestras de suero
combinado de pacientes de cáncer de próstata.
Las instrucciones del instrumento IMx®, su
funcionamiento y protocolo general pueden encontrarse en Barnes
et al., J. Clin. Imm.,
14(2):115-119 (1991) y el documento
EP-A-288.793; Ludington et
al., Clin. Chem., 34(9), 1726-1732
(1988)). Los componentes de las células de reacción se muestran en
la Figura 2(a) de Clin. Chem., 34(9), en 1727.
En este caso, el esquema de reacción es el de un inmunoensayo
enzimático de micropartícula (MEIA), del siguiente modo:
(1) El ensamblaje sonda/electrodo del instrumento
IMx® libera la muestra, Micropartículas Recubiertas
Anti-PSA y Diluyente de Ensayo al pocillo de
incubación de la célula de reacción. Durante la incubación de esta
mezcla de reacción, el PSA libre y complejado en la muestra se une a
las Micropartículas Recubiertas Anti-PSA que forman
un complejo antígeno-anticuerpo. MAB 9B10 a su vez
se une a PSA (que no está complejado con ACT) que se une a las
Micropartículas Recubiertas Anti-PSA, para formar un
complejo
anticuerpo-antígeno-anticuerpo.
(2) Un alícuota de la mezcla de reacción se
transfiere a la matriz de fibra de vidrio del instrumento IMx®. Las
micropartículas se unen de manera irreversible a la matriz de fibra
de vidrio.
(3) La matriz se lava para retirar los materiales
no unidos, por ejemplo, proteínas de suero, Diluyente de Ensayo, y
MAB 9B10 que no está unido a las micropartículas.
(4) El Anti-PSA policlonal de
cabra: Conjugado Fosfatasa Alcalina se reparte en la matriz y se une
al complejo
anticuerpo-antígeno-anticuerpo.
(5) La matriz se lava para retirar los materiales
no unidos.
(6) El sustrato,
4-metilumbeliferil fosfato (MUP), se añade a la
matriz y la fosfatasa alcalina unida a la superficie convierte el
MUP no fluorogénico a 4-metilumbeliferona (MU), cuya
fluorescencia se mide por ensamblaje óptico MEIA del instrumento
IMx®.
Las etapas de ensayo anteriores se realizaron por
separado pero simultáneamente usando calibradores y controles que
contienen PSA libre, en lugar de muestras. Las lecturas para las
muestras (es decir, paneles) se dedujeron de los calibradores (de la
Tabla 1 a continuación) para llegar a los valores de PSA presentados
en las Tablas 2 y 3 a continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
Las lecturas se toman en c/s/s.
Las lecturas se dan en ng/ml.
Las lecturas se dan en ng/ml.
Las anteriores Tablas muestran que cantidades en
aumento de MAB 9B10 libre en el ensayo redujeron las señales de
curva de calibración y aumentaron los valores del panel de muestra.
El efecto de MAB 9B10 en los valores del panel parece estancarse a
aproximadamente 10 \mug/ml. Los experimentos anteriores se
repitieron usando MAB 5A10 en lugar de MAB 9B10 y los resultados
fueron similares.
En el siguiente experimento, se usó el nivel de
estancamiento anterior de 10 \mug/ml de MAB 9B10 en Diluyente de
Ensayo para demostrar bias entre PSA libre y complejado. Se mezcló
una muestra que contenía PSA libre con ACT purificado y se dejó que
formara complejos. PSA y ACT purificados se obtuvieron de Dr. Hans
Lilja, University of Malmo. La purificación de PSA y ACT y la
formación de complejos de PSA y ACT se han descrito previamente (A.
Christensson, et al., Eur. J. Biochem,
194:755-763, 1990). Se mezcló PSA de fluido
seminal purificado en tampón fosfato 0,1 M, pH 7,0 que contenía
albúmina de suero bovino al 7,5% y azida sódica al 0,05% con un
exceso 100 molar de ACT purificado. Se mezcló una muestra control de
PSA con tampón en lugar de ACT. Estas muestras se dejaron incubar
durante una noche a 35ºC.
Después de la incubación, estas muestras se
ensayaron en el Ensayo de PSA IMx® con las siguientes
modificaciones:
a. Ensayo de PSA Abbott IMx® (sin
modificaciones)
b. Ensayo de PSA Abbott IMx® con 9B10 en
Diluyente de Ensayo (es decir, con la adición de 10 \mug/ml de
9B10 al Diluyente de Ensayo)
c. Ensayo de PSA Abbott IMx® con anticuerpos MAB
H50 sonda y MAB H117 de captura (es decir, con el uso de
micropartículas recubiertas con H117 y H50 marcado)
Los ensayos se realizaron como se ha descrito
anteriormente. La Tabla 4 muestra las cantidades de PSA obtenidas
para las muestras de PSA libre y para las muestras de PSA que tienen
ACT añadido. Bias se indica por la reducción de la cantidad de PSA
detectada en la muestra que contiene ACT en comparación con el
control de PSA.
Las lecturas se tomaron en ng/ml
Los datos de la Tabla 4 muestran que el ensayo
tipo MONO (con MAB H50 como anticuerpos sonda y MAB H117 como
anticuerpos de captura) no tiene bias. En contraste, el ensayo tipo
MOLY (Ensayo de PSA Abbott IMx®) tiene un bias del 36,8% que se
reduce drásticamente por la adición de MAB 9B10 al ensayo.
Se repitió el anterior experimento, donde el
ensayo tipo MONO usó MAB H50 como anticuerpo de captura y MAB H117
como anticuerpo sonda. Se observó que dicho ensayo tipo MONO también
sufrió de bias que puede eliminarse por la adición de 9B10 libre en
el Diluyente de Ensayo.
La mezcla de Anticuerpos HE_{PSA} con PSA da
como resultado la formación de un complejo
PSA-Anticuerpos HE_{PSA} en el que los epítopos
ocultos se bloquean de manera similar al complejo
PSA-ACT. Este material puede usarse como calibrador
o control en ensayos de PSA.
Se mezcla PSA de fluido seminal en solución
salina tamponada con fosfato 0,01 M, pH 7,4 con 9B10 en un exceso de
10 veces y se incuba durante una noche a 2-8 grados
C. Después de incubación, el complejo
PSA-Anticuerpos HE_{PSA} se diluye en Diluyente de
Calibrador PSA IMx® a niveles de 0, 2, 10, 30, 60 y 100 ng/ml. Estos
calibradores pueden usarse en el ensayo de PSA IMx® y complejos
PSA-ACT miméticos ocultando el HE en PSA.
Este ejemplo describe la aplicación del método de
fraccionamiento mostrado en la Parte B de la Figura 2 analizada
anteriormente. Se usa MAB 5A10 para ilustrar el método aunque puede
usarse cualquier Anticuerpo HE_{PSA} en su lugar, tal como MAB
9B10.
En la etapa inicial, se entrecruza 5A10 con
Sepharose-4B activada con bromuro de cianógeno en
base a las recomendaciones del fabricante. (Affinity
Chromatography Principles and Methods, Pharmacia LKB
Biotechnology, Suecia, 23-30 (1993)).
El procedimiento es el siguiente:
El 5A10 para la Columna de Afinidad se mezcla con
fosfato sódico dibásico 0,1 M (Na_{2}HPO_{4}) y se ajusta el pH
a 9,0. Después, se mezcla 5A10 con gel de
Sepharose-4B activada con bromuro de cianógeno a una
proporción de 2 mg de 5A10 por ml de gel. La mezcla se incuba a
2-8ºC durante una noche con agitación suave.
Después de acoplar 5A10 al gel de Sepharose, el
gel se lava con Na_{2}HPO_{4} 0,1 M, pH 8,01, para retirar
cualquier ligando no unido, y después se mezcla con etanolamina 1 M,
pH 8,0, a 2-8ºC para bloquear cualquier grupo activo
que permanezca en el gel. El gel se lava con agua destilada o
desionizada seguido de dos ciclos alternantes de tampón acetato
sódico 0,1 M con NaCl 1 M pH 4,0 y Na_{2}HPO_{4} 0,1 M con NaCl
1 M, pH 8,0. Se vierte una columna, se lava con solución de PBS
(NaHPO_{4} 0,01 M, NaCl 0,15 M, pH 7,2) y después se eluye con
glicina 0,1 M, NaCl 0,1 M, pH 2,5. La columna después se lava con
PBS a pH 7,2 que contiene azida sódica al 0,1%. La columna de
afinidad 5A10 se almacena a 2-8ºC.
La siguiente etapa en el procedimiento implica la
unión de PSA a la Sepharose 4B-5A10 seguido de
entrecruzamiento químico para estabilizar el complejo
5A10-PSA. La unión de PSA a 5A10 bloquea el HE en el
PSA de modo que el HE no puede unirse a otros Anticuerpos
HE_{PSA}. El procedimiento para entrecruzar proteínas insolubles
con el agente entrecruzante, dimetilpaleimidato (DMP) se ha descrito
previamente. (C. Schneider, et al., J. Biol.Chem.
25, 10766-10769, (1982)).
El siguiente procedimiento es del siguiente
modo:
Se retira el gel de Sepharose
4B-5A10 de la columna y se coloca en un cilindro
graduado. Después de que el gel se ha estabilizado, se retira el
tampón residual. Para cada ml de gel empaquetado, se añaden 10 mg de
PSA purificado a una concentración inicial de 2 mg/ml en tampón
fosfato 0,01 M, pH 7,4. Se transfiere a un matraz Erlenmeyer y se
incuba a 2-8ºC durante una noche con agitación
suave.
Después de incubación durante una noche, se lava
el gel dos veces en 10 volúmenes de trietanolamina 0,2 M, pH 9,0
(TEA) en un embudo Buchner. El gel se transfiere a un vaso de
precipitación y se añaden 5 partes de DMP 40 mM en TEA, pH 9,0. Se
incuba con agitación durante 1 hora a temperatura ambiente. Usando
un embudo Buchner se lava con 10-20 volúmenes de
TEA, pH 9,0 y 10-20 volúmenes de solución salina
tamponada con fosfato 0,01 M, pH 7,4 con azida sódica al 0,02%. Se
transfiere el gel a la columna.
La etapa final del proceso es purificar los
anticuerpos policlonales frente a PSA en la columna de Sapharose
4B-5A10-PSA por procedimientos de
afinidad convencionales, del siguiente modo:
Se diluyen los anticuerpos policlonales
anti-PSA 1:1 con tampón de columna (solución salina
tamponada con fosfato 0,01 M, pH 7,4). (Los ejemplos de anticuerpos
policlonales son anticuerpos policlonales de cabra, conejo, oveja,
ratón, y rata.) Lentamente, se carga la muestra en la columna. Se
recoge la proteína que no se une a la columna. Esta fracción
contiene los anticuerpos HE. Se lava la columna con tampón de
columna y se controla la OD a 280 nm. Cuando la absorbancia cae a la
línea basal, se eluyen rápidamente los Anticuerpos no HE unidos con
glicina-HCl 0,1 M, pH 2,5. Se recogen las fracciones
en un volumen igual de Tris-HCl 0,1 M, pH 8,5 para
ajustar rápidamente el pH a neutralidad. Tanto los anticuerpos HE
como los no HE purificados pueden dializarse en el tampón deseado y
almacenarse a 2-8ºC después de filtración a través
de un filtro estéril de 0,2 micrómetros. Como alternativa, los
anticuerpos pueden congelarse.
Claims (15)
1. Un método de inmunoensayo para detectar o
cuantificar un analito ("A") en una muestra biológica, siendo
capaz el analito de existir en la muestra en forma libre ("analito
libre") o unido a una molécula de unión para formar un complejo
del analito y la Molécula de Unión ("{(A)(Molécula de
Unión)}"), comprendiendo el método las etapas de:
(a) hacer contactar el analito con un anticuerpo
("\alphaHE") que puede unirse al analito libre pero no a
{(A)(Molécula de Unión)}, un anticuerpo de captura
("\alphanHE") que puede unirse tanto al analito libre como a
{(A)(Molécula de Unión)}, y un anticuerpo sonda ("\alphaA*")
específico para el analito, a condición de que si el anticuerpo
sonda es un anticuerpo policlonal, entonces el analito se hace
contactar con el anticuerpo de captura antes del anticuerpo
sonda;
(b) correlacionar la presencia o cantidad de
\alphaA* que se une al analito, con la presencia o cantidad del
analito en la muestra, o correlacionar la cantidad de \alphaA* no
unido con la ausencia o cantidad del analito en la muestra.
2. El método de inmunoensayo de la reivindicación
1, donde el anticuerpo sonda es un anticuerpo policlonal.
3. El método de inmunoensayo de la reivindicación
1, donde el anticuerpo de captura es un anticuerpo monoclonal.
4. El método de inmunoensayo de la reivindicación
1, que también comprende la etapa de separar la muestra y \alphaHE
no unido de la fase sólida, antes de añadir \alphaA* a la fase
sólida, y después separar el \alphaA* no unido y detectar el
\alphaA* unido a la fase sólida.
5. El método de inmunoensayo de la reivindicación
2, donde el anticuerpo sonda es una población de anticuerpos
policlonales que comprende anticuerpos que se unen al analito libre
y no a {(A)(Molécula de Unión)}, y anticuerpos que se unen tanto al
analito libre como a {(A)(Molécula de Unión)}.
6. El método de inmunoensayo de la reivindicación
1, donde \alphaHE es un anticuerpo monoclonal.
7. El método de inmunoensayo de la reivindicación
1, donde el analito es PSA y la molécula de unión es ACT.
8. El método de inmunoensayo de la reivindicación
7, donde el \alphaHE se selecciona entre el grupo compuesto por
anticuerpos monoclonales que consta de: 9B10, 5A10, PSA6, PSA30,
PSA17, PSA19, PSA20, y PSA25.
9. El método de inmunoensayo de la reivindicación
7, donde el anticuerpo sonda es un anticuerpo H50 monoclonal y el
anticuerpo de captura es un anticuerpo H117 monoclonal.
10. Un kit para realizar un ensayo de analito en
una muestra de ensayo, donde el analito puede existir en la muestra
de ensayo como analito libre o unido a una molécula de unión para
formar un complejo de complejo analito-molécula de
unión, comprendiendo el kit lo siguiente:
(a) un anticuerpo (\alphaHE) que puede unirse
al analito libre pero no al complejo
analito-molécula de unión;
(b) un anticuerpo de captura (\alphanHE) que
puede unirse tanto al analito libre como al complejo
analito-molécula de unión; y
(c) un anticuerpo sonda (\alphaA) específico
para el analito.
11. El kit de la reivindicación 10, donde el
analito es PSA, la molécula de unión es ACT, el anticuerpo de
captura y \alphaHE son anticuerpos monoclonales, y el anticuerpo
sonda es un anticuerpo policlonal.
12. El kit de la reivindicación 10, que también
comprende un recipiente que contiene un calibrador o control que
comprende un complejo de analito unido a \alphaHE.
13. Un calibrador o control para usar en un
inmunoensayo que comprende un complejo que comprende un analito de
una muestra biológica entrecruzado con un anticuerpo \alphaHE,
donde el analito es capaz de existir como analito libre o unido a
una molécula de unión para formar un complejo
analito-molécula de unión, y donde el analito tiene
al menos un epítopo oculto y un epítopo no oculto, y donde el
anticuerpo \alphaHE se une al analito libre pero no al complejo
analito-molécula de unión.
14. El calibrador o control de la reivindicación
13, donde el analito es PSA.
15. Uso de un complejo de acuerdo con la
reivindicación 14 como calibrador y control en un ensayo de analitos
de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US174964 | 1993-12-29 | ||
| US08/174,964 US5599677A (en) | 1993-12-29 | 1993-12-29 | Immunoassays for prostate specific antigen |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2238678T3 true ES2238678T3 (es) | 2005-09-01 |
Family
ID=22638254
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES95906713T Expired - Lifetime ES2238678T3 (es) | 1993-12-29 | 1994-12-22 | Inmunodosificados relativos al antigeno especifico de la prostata. |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US5599677A (es) |
| EP (1) | EP0741868B1 (es) |
| JP (2) | JP3486413B2 (es) |
| AT (1) | ATE290212T1 (es) |
| AU (1) | AU1518795A (es) |
| DE (1) | DE69434286T2 (es) |
| ES (1) | ES2238678T3 (es) |
| WO (1) | WO1995018381A1 (es) |
Families Citing this family (129)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SE9002480D0 (sv) * | 1990-07-23 | 1990-07-23 | Hans Lilja | Assay of free and complexed prostate-specific antigen |
| US5723302A (en) * | 1993-05-14 | 1998-03-03 | Nordion International Inc. | Detection of prostate-specific antigen in breast tumors |
| US5654161A (en) * | 1995-05-12 | 1997-08-05 | Chiron Diagnostics Corporation | Method for diagnosing prostate cancer |
| EP0789032A2 (en) * | 1996-02-01 | 1997-08-13 | Bayer Corporation | Method for preparing a monoclonal antibody that provides an equimolar response to free and complexed analyte in a monoclonal/polyclonal sandwich immunoassay |
| US6136311A (en) | 1996-05-06 | 2000-10-24 | Cornell Research Foundation, Inc. | Treatment and diagnosis of cancer |
| US6107090A (en) | 1996-05-06 | 2000-08-22 | Cornell Research Foundation, Inc. | Treatment and diagnosis of prostate cancer with antibodies to extracellur PSMA domains |
| AU720802B2 (en) | 1996-07-03 | 2000-06-15 | Millenium Pharmaceuticals, Inc. | Detection of cancer by assaying for cancer-specific antigens having linked oligosaccharides which are at least triantennary |
| DE19641560A1 (de) * | 1996-10-09 | 1998-04-16 | Boehringer Mannheim Gmbh | Monoklonale Antikörper gegen einen Komplex aus humanem ACT und einer Serinprotease |
| IL121659A (en) * | 1996-10-25 | 2000-07-16 | Bayer Ag | Method for determining CPSA in a blood sample |
| US5840501A (en) * | 1996-10-25 | 1998-11-24 | Bayer Corporation | Determination of cPSA |
| US5856182A (en) * | 1996-11-18 | 1999-01-05 | Beckman Coulter, Inc. | Monoclonal antibodies specific for the PSA-ACT complex |
| US6548260B1 (en) * | 1997-01-21 | 2003-04-15 | Bayer Corporation | Detection of PSA-α2-macroglobulin complex in a biological fluid |
| US7288636B2 (en) * | 1997-04-30 | 2007-10-30 | Hybritech Incorporated | Forms of prostate specific antigens and methods for their detection |
| EP0983509B1 (en) * | 1997-05-14 | 2005-08-17 | Biosite Diagnostics Inc. | Rapid evaluation of the ratio of biological molecules |
| US6780598B1 (en) * | 1997-06-13 | 2004-08-24 | William J. Kokolus | Method of identifying and locating immunobiologically-active linear peptides |
| CA2243033A1 (en) * | 1997-07-31 | 1999-01-31 | Bayer Corporation | Determination of psa-act |
| US6194152B1 (en) | 1997-08-20 | 2001-02-27 | Dendreon Corporation | Prostate tumor polynucleotide compositions and methods of detection thereof |
| US5994085A (en) * | 1997-08-26 | 1999-11-30 | Cantor; Thomas L. | Methods and devices for detecting non-complexed prostate specific antigen |
| US6649420B1 (en) * | 1997-08-26 | 2003-11-18 | Thomas L. Cantor | Methods and devices for detecting no-complexed prostate specific I antigen |
| AU9374198A (en) | 1997-09-08 | 1999-03-29 | Idec Pharmaceuticals Corporation | Methods for producing human antibodies in scid mice using dendritic cells |
| US6300088B1 (en) | 1997-11-24 | 2001-10-09 | Duke University | Method of detecting prostate specific antigen |
| US6352834B1 (en) * | 1998-07-17 | 2002-03-05 | University Of Iowa Research Foundation | Prostate cancer assays and related methods |
| JP4495349B2 (ja) * | 1999-01-28 | 2010-07-07 | ジェン−プローブ・インコーポレーテッド | 癌の遺伝マーカーを生物学的サンプルにおいて検出するための核酸配列 |
| WO2000063683A1 (en) | 1999-04-20 | 2000-10-26 | Target Discovery, Inc. | Polypeptide fingerprinting methods, metabolic profiling, and bioinformatics database |
| DE19957065B4 (de) * | 1999-11-26 | 2005-01-05 | Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. | Screening-Verfahren für Arzneistoffe |
| FR2810114B1 (fr) * | 2000-06-13 | 2002-08-23 | Bio Merieux | Methode, procede, test immunologique et kit de diagnostic d'un adenocarcinome de la prostate ou d'une hypertrophie benigne de la prostate |
| ATE429643T1 (de) | 2000-07-12 | 2009-05-15 | Agensys Inc | Neues tumor antigen das für diagnose und therapie von blasen-, eierstock-, lungen- und nierenkrebs verwendet werden kann |
| US6379550B1 (en) | 2000-07-24 | 2002-04-30 | Health Research, Inc. | Method for detecting PSA and its molecular forms using thiophilic gel |
| EP1178317B1 (en) | 2000-07-24 | 2004-11-10 | Health Research, Inc. | Method for detection of prostate specific membrane antigen in serum |
| US8044259B2 (en) | 2000-08-03 | 2011-10-25 | The Regents Of The University Of Michigan | Determining the capability of a test compound to affect solid tumor stem cells |
| US6984522B2 (en) * | 2000-08-03 | 2006-01-10 | Regents Of The University Of Michigan | Isolation and use of solid tumor stem cells |
| US20080194022A1 (en) * | 2000-08-03 | 2008-08-14 | Clarke Michael F | Isolation and use of solid tumor stem cells |
| US6764825B1 (en) * | 2000-10-13 | 2004-07-20 | Tang J. Wang | Methods and device for detecting prostate specific antigen (PSA) |
| US6727104B2 (en) | 2001-02-05 | 2004-04-27 | The Board Of Regents Of The University Of Nebraska | Microcolumn chromatographic immunoassays |
| US6720193B2 (en) * | 2001-02-05 | 2004-04-13 | Board Of Regents Of The University Of Nebraska | Analysis of free analyte fractions by rapid affinity chromatography |
| US6500671B2 (en) | 2001-02-05 | 2002-12-31 | The Board Of Regents Of The University Of Nebraska | Loading microcolums for the separation of analytes from a sample in the millisecond time scale |
| US7811575B2 (en) * | 2001-04-10 | 2010-10-12 | Agensys, Inc. | Nucleic acids and corresponding proteins entitled 158P3D2 useful in treatment and detection of cancer |
| IL158293A0 (en) * | 2001-04-10 | 2004-05-12 | Agensys Inc | Nucleic acid and corresponding protein entitled 158p3d2 and pharmaceutical compositions containing the same |
| US20030007974A1 (en) * | 2001-05-30 | 2003-01-09 | Nanus David M. | Endopeptidase/anti-PSMA antibody fusion proteins for treatment of cancer |
| JP4619651B2 (ja) * | 2001-06-01 | 2011-01-26 | コーネル・リサーチ・ファンデーション・インコーポレイテッド | 前立腺特異的膜抗原に対する修飾抗体およびその使用 |
| US7514078B2 (en) * | 2001-06-01 | 2009-04-07 | Cornell Research Foundation, Inc. | Methods of treating prostate cancer with anti-prostate specific membrane antigen antibodies |
| US7666414B2 (en) * | 2001-06-01 | 2010-02-23 | Cornell Research Foundation, Inc. | Methods for treating prostate cancer using modified antibodies to prostate-specific membrane antigen |
| US7229774B2 (en) | 2001-08-02 | 2007-06-12 | Regents Of The University Of Michigan | Expression profile of prostate cancer |
| IL159422A0 (en) * | 2001-09-20 | 2004-06-01 | Cornell Res Foundation Inc | Methods and compositions for treating or preventing skin disorders using binding agents specific for prostate-specific membrane antigen |
| US7842498B2 (en) | 2001-11-08 | 2010-11-30 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Hydrophobic surface chip |
| WO2003057916A2 (en) | 2002-01-09 | 2003-07-17 | Riken | Cancer profiles |
| US7138230B2 (en) | 2002-12-06 | 2006-11-21 | Renovar, Inc. | Systems and methods for characterizing kidney diseases |
| US20040018577A1 (en) * | 2002-07-29 | 2004-01-29 | Emerson Campbell John Lewis | Multiple hybrid immunoassay |
| US20040136998A1 (en) * | 2002-10-30 | 2004-07-15 | Bander Neil H. | Methods and compositions for treating or preventing insulin-related disorders using binding agents specific for prostate specific membrane antigen |
| EP1563100B1 (en) * | 2002-11-01 | 2013-04-24 | Iris Molecular Diagnostics, Inc. | Displacement sandwich immuno-pcr |
| ATE408712T1 (de) * | 2003-01-10 | 2008-10-15 | Millennium Pharm Inc | Verfahren zur bestimmung des wiederauftretens von prostata krebs |
| US8003765B2 (en) * | 2003-04-09 | 2011-08-23 | Stony Brook Anaesthesiology, University Faculty Practice Corporation | Methods, antibodies and kits for detecting cerebrospinal fluid in a sample |
| US20070003992A1 (en) * | 2003-04-09 | 2007-01-04 | Pentyala Srinivas N | Methods and kits for detecting cerebrospinal fluid in a sample |
| US20040203079A1 (en) * | 2003-04-09 | 2004-10-14 | Research Foundation Of The State University Of New York | Methods and kits for detecting cerebrospinal fluid in a sample |
| CA2528669A1 (en) * | 2003-06-09 | 2005-01-20 | The Regents Of The University Of Michigan | Compositions and methods for treating and diagnosing cancer |
| US20050202020A1 (en) * | 2004-01-09 | 2005-09-15 | Jeffrey Ross | Diagnosing and treating cancer |
| CA2554779A1 (en) * | 2004-02-03 | 2005-08-18 | The Regents Of The University Of Michigan | Compositions and methods for characterizing, regulating, diagnosing, and treating cancer |
| WO2005094882A1 (en) * | 2004-03-03 | 2005-10-13 | Millennium Pharmaceuticals, Inc. | Modified antibodies to prostate-specific membrane antigen and uses thereof |
| US20050266503A1 (en) * | 2004-05-24 | 2005-12-01 | Esoterix, Inc. | Simultaneous assay of target and target-drug binding |
| WO2005118872A2 (en) * | 2004-06-01 | 2005-12-15 | The Regents Of The University Of Michigan | Methods and kits for diagnosing or monitoring autoimmune and chronic inflammatory diseases |
| US20060135455A1 (en) | 2004-06-01 | 2006-06-22 | Reza Sheikhnejad | Methods and compositions for the inhibition of gene expression |
| US7858323B2 (en) | 2004-06-09 | 2010-12-28 | The Regents Of The University Of Michigan | Phage microarray profiling of the humoral response to disease |
| EP1815028B1 (en) * | 2004-11-03 | 2011-10-26 | Iris Molecular Diagnostics, Inc. | Microbubbles for affinity separation |
| CN103146808A (zh) * | 2004-11-03 | 2013-06-12 | 意力速分子诊断股份有限公司 | 均相分析物检测 |
| US7439024B2 (en) | 2005-06-01 | 2008-10-21 | The United States Of America As Represented By The Department Of Veterans Affairs | Methods and kits for diagnosing or monitoring autoimmune and chronic inflammatory diseases |
| US20070099209A1 (en) * | 2005-06-13 | 2007-05-03 | The Regents Of The University Of Michigan | Compositions and methods for treating and diagnosing cancer |
| US20070105133A1 (en) * | 2005-06-13 | 2007-05-10 | The Regents Of The University Of Michigan | Compositions and methods for treating and diagnosing cancer |
| WO2007047907A2 (en) * | 2005-10-14 | 2007-04-26 | The Regents Of The University Of Michigan | Dek protein compositions and methods of using the same |
| US7794951B2 (en) * | 2005-10-18 | 2010-09-14 | University Of Massachusetts Medical School | SREBP2gc transcription factors and uses thereof |
| US7723112B2 (en) * | 2005-10-31 | 2010-05-25 | The Regents Of The University Of Michigan | Compositions and methods for treating and diagnosing cancer |
| US7723477B2 (en) | 2005-10-31 | 2010-05-25 | Oncomed Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and methods for inhibiting Wnt-dependent solid tumor cell growth |
| EP2511298B1 (en) | 2005-10-31 | 2019-01-16 | Oncomed Pharmaceuticals, Inc. | Compositions and Methods for Treating Cancer based on human FZD receptors |
| EP1998785A4 (en) * | 2006-02-21 | 2009-06-17 | Univ Michigan | TREATMENT OF CANCER BY AN ANTAGONIST OF THE HEDGEHOG SIGNALING PATH |
| JP2009540333A (ja) | 2006-06-12 | 2009-11-19 | プレジデント アンド フェロウズ オブ ハーバード カレッジ | ナノセンサーおよび関連技術 |
| US20080100279A1 (en) * | 2006-06-15 | 2008-05-01 | University Of South Florida | Nano-Based Device for Detection of Disease Biomarkers and Other Target Molecules |
| US8349604B2 (en) * | 2006-06-15 | 2013-01-08 | University Of South Florida | Nano-based device for detection of disease biomarkers and other target molecules |
| WO2008045952A2 (en) * | 2006-10-10 | 2008-04-17 | The Regents Of The University Of Michigan | Photoreceptor precursor cells |
| US20080125582A1 (en) * | 2006-10-13 | 2008-05-29 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Methods and compositions for stabilizing prostate specific antigen |
| WO2008127314A1 (en) | 2006-11-22 | 2008-10-23 | President And Fellows Of Harvard College | High-sensitivity nanoscale wire sensors |
| WO2008092002A2 (en) | 2007-01-24 | 2008-07-31 | The Regents Of The University Of Michigan | Compositions and methods for treating and diagnosing pancreatic cancer |
| EP2152417B1 (en) | 2007-05-04 | 2018-07-11 | Opko Diagnostics, LLC | Device and method for analyses in microfluidic systems |
| CA2681667A1 (en) * | 2007-05-18 | 2008-11-27 | Duke University | Serum biomarkers for the early detection of lung cancer |
| US20090324596A1 (en) * | 2008-06-30 | 2009-12-31 | The Trustees Of Princeton University | Methods of identifying and treating poor-prognosis cancers |
| US10745701B2 (en) | 2007-06-28 | 2020-08-18 | The Trustees Of Princeton University | Methods of identifying and treating poor-prognosis cancers |
| HRP20151261T1 (hr) | 2007-07-02 | 2016-01-01 | Oncomed Pharmaceuticals, Inc. | Sastavi i postupci za lijeäśenje i dijagnosticiranje raka |
| WO2009021190A2 (en) * | 2007-08-08 | 2009-02-12 | Renovar, Inc. | Systems and methods for characterizing lupus erythematosus |
| EP2201134B1 (en) * | 2007-09-19 | 2018-11-21 | The Research Foundation of State University of New York | Gene expression signatures in enriched tumor cell samples |
| WO2009091556A2 (en) * | 2008-01-17 | 2009-07-23 | The General Hospital Corporation | Diagnostic methods and kits using fibroblast growth factor-23 |
| EP2252893B1 (en) * | 2008-02-21 | 2013-10-23 | Iris International, Inc. | Method for early determination of recurrence after therapy for prostate cancer |
| US20110092452A1 (en) * | 2008-03-05 | 2011-04-21 | The Regents Of The University Of Michigan | Compositions and methods for diagnosing and treating pancreatic cancer |
| TWI506037B (zh) | 2008-09-26 | 2015-11-01 | Oncomed Pharm Inc | 捲曲結合劑類及彼等之用途 |
| EP3153862A1 (en) | 2008-11-11 | 2017-04-12 | The Regents of the University of Michigan | Anti-cxcr1 compositions and methods |
| US8362318B2 (en) | 2008-12-18 | 2013-01-29 | Board Of Trustees Of Michigan State University | Enzyme directed oil biosynthesis in microalgae |
| WO2010078554A1 (en) | 2009-01-05 | 2010-07-08 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Process design using mass spectrometry |
| WO2010087999A1 (en) | 2009-02-02 | 2010-08-05 | Claros Diagnostics, Inc. | Structures for controlling light interaction with microfluidic devices |
| US8481698B2 (en) * | 2009-03-19 | 2013-07-09 | The President And Fellows Of Harvard College | Parallel proximity ligation event analysis |
| CN102388064A (zh) | 2009-03-27 | 2012-03-21 | 高裘企业公司 | 用于筛选与使用拮抗孢子-表面交互作用的化合物的组合物与方法 |
| US20100272824A1 (en) * | 2009-04-16 | 2010-10-28 | The Texas A&M University System | Compositions and methods for preventing and monitoring disease |
| JP2013501919A (ja) | 2009-08-07 | 2013-01-17 | アフィニマーク テクノロジーズ，インコーポレイテッド | 脳脊髄液の免疫的識別のための装置および方法 |
| US9056114B2 (en) | 2009-08-28 | 2015-06-16 | Jeffrey P. Erickson | Chemical induction of lactation |
| WO2011038228A1 (en) | 2009-09-24 | 2011-03-31 | President And Fellows Of Harvard College | Bent nanowires and related probing of species |
| WO2011082253A2 (en) | 2009-12-30 | 2011-07-07 | Board Of Trustees Of Michigan State University | A method to produce acetyldiacylglycerols (ac-tags) by expression ofan acetyltransferase gene isolated from euonymus alatus (burning bush) |
| TWI535445B (zh) | 2010-01-12 | 2016-06-01 | 安可美德藥物股份有限公司 | Ｗｎｔ拮抗劑及治療和篩選方法 |
| US8574832B2 (en) | 2010-02-03 | 2013-11-05 | Massachusetts Institute Of Technology | Methods for preparing sequencing libraries |
| WO2011116209A2 (en) | 2010-03-17 | 2011-09-22 | The Regents Of The University Of Michigan | Using phage epitopes to profile the immune response |
| WO2011123785A2 (en) | 2010-04-01 | 2011-10-06 | Oncomed Pharmaceuticals, Inc. | Frizzled-binding agents and uses thereof |
| US9125931B2 (en) | 2010-04-06 | 2015-09-08 | Massachusetts Institute Of Technology | Post-transcriptional regulation of RNA-related processes using encoded protein-binding RNA aptamers |
| KR20130048217A (ko) | 2010-04-06 | 2013-05-09 | 메사추세츠 인스티튜트 오브 테크놀로지 | 적은 수의 전사체 측정치를 이용한 유전자 발현 프로파일링 |
| CN102947703A (zh) * | 2010-06-17 | 2013-02-27 | 皇家飞利浦电子股份有限公司 | 多表位测定 |
| EP2407242A1 (en) | 2010-07-13 | 2012-01-18 | Dublin City University | Direct clone analysis and selection technology |
| US9327023B2 (en) | 2011-10-25 | 2016-05-03 | The Regents Of The University Of Michigan | HER2 targeting agent treatment in non-HER2-amplified cancers having HER2 expressing cancer stem cells |
| US9352039B2 (en) | 2012-02-09 | 2016-05-31 | The Regents Of The University Of Michigan | Method of reducing the number of EMT and MET type breast cancer stem cells |
| CN108108590A (zh) | 2012-03-05 | 2018-06-01 | 阿克蒂克合伙公司 | 分析系统和方法 |
| WO2014005076A2 (en) | 2012-06-29 | 2014-01-03 | The Regents Of The University Of Michigan | Methods and biomarkers for detection of kidney disorders |
| EP2911691B1 (en) | 2012-10-23 | 2018-10-10 | OncoMed Pharmaceuticals, Inc. | Methods of treating neuroendocrine tumors using wnt pathway-binding agents |
| US10023638B2 (en) | 2012-12-26 | 2018-07-17 | Oncosynergy, Inc. | Anti-integrin β1 antibody compositions and methods of use thereof |
| JP2016510411A (ja) | 2013-02-04 | 2016-04-07 | オンコメッド ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド | Ｗｎｔ経路インヒビターによる処置の方法およびモニタリング |
| US9168300B2 (en) | 2013-03-14 | 2015-10-27 | Oncomed Pharmaceuticals, Inc. | MET-binding agents and uses thereof |
| US9907833B2 (en) | 2013-07-25 | 2018-03-06 | University Of Florida Research Foundation, Incorporated | Use of relaxin to treat placental syndromes |
| US10392629B2 (en) | 2014-01-17 | 2019-08-27 | Board Of Trustees Of Michigan State University | Increased caloric and nutritional content of plant biomass |
| WO2015143228A1 (en) | 2014-03-19 | 2015-09-24 | The University Of North Carolina At Chapel Hill | Bcl6 expression in eutopic endometrium as a marker for endometriosis and subfertility |
| MX392384B (es) | 2014-03-28 | 2025-03-24 | Opko Diagnostics Llc | Composiciones y metodos relacionados con el diagnostico de cancer de prostata. |
| US12326453B2 (en) | 2014-03-28 | 2025-06-10 | Opko Diagnostics, Llc | Compositions and methods for active surveillance of prostate cancer |
| KR102328327B1 (ko) | 2014-09-26 | 2021-11-22 | 소마로직, 인크. | 심혈관 위험 사건 예측 및 이의 용도 |
| EP3253800B1 (en) | 2015-03-27 | 2021-03-03 | Opko Diagnostics, LLC | Prostate antigen standards and uses thereof |
| JP6578119B2 (ja) * | 2015-03-31 | 2019-09-18 | 株式会社Ｌｓｉメディエンス | 前立腺特異抗原の測定方法及び測定キット |
| US11474105B2 (en) | 2016-03-31 | 2022-10-18 | The University Of North Carolina At Chapel Hill | Methods and compositions for SIRT1 expression as a marker for endometriosis and subfertility |
| EP3538558A4 (en) | 2016-11-09 | 2020-07-15 | North Carolina State University | TREATMENT OF ALLERGIC DISEASES USING CHIMERIC PROTEIN |
| US12060437B2 (en) | 2018-03-23 | 2024-08-13 | North Carolina State University | Methods and compositions for antibody to high affinity receptor for IgE |
Family Cites Families (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NL7602422A (nl) * | 1976-03-08 | 1977-09-12 | Leuven Res & Dev Vzw | Trombosetest. |
| US4849353A (en) * | 1980-09-30 | 1989-07-18 | Cornell Research Foundation, Inc. | Immunocapture of enzyme inhibitor, enzyme complexes and uses thereof |
| US4689323A (en) * | 1983-09-26 | 1987-08-25 | Miles Laboratories, Inc. | Covalently bound heparin--antithrombin-III complex |
| US5026653A (en) * | 1985-04-02 | 1991-06-25 | Leeco Diagnostic, Inc. | Scavenger antibody mixture and its use for immunometric assay |
| US4737456A (en) * | 1985-05-09 | 1988-04-12 | Syntex (U.S.A.) Inc. | Reducing interference in ligand-receptor binding assays |
| SE8601645D0 (sv) * | 1986-04-11 | 1986-04-11 | Ulf R Nilsson | Immunologiskt forfarande |
| US5114863A (en) * | 1986-09-30 | 1992-05-19 | Board Of Supervisors Of Louisiana State University & Agricultural & Mechanical College | Immunosorbant assay for α-1-antitrypsin, kit employing said assay, monoclonal antibody to α-1-antitrypsin, and hybridoma for producing said monoclonal antibody |
| US5223441A (en) * | 1986-10-09 | 1993-06-29 | Syntex (U.S.A.) Inc. | Receptors for immune complexes |
| US5187067A (en) * | 1986-12-15 | 1993-02-16 | Teijin Limited | Immunological determination of free human protein S and C4bp-protein S complex |
| EP0288793A3 (en) * | 1987-04-22 | 1990-04-25 | Abbott Laboratories | Cartridge and methods for performing a solid-phase immunoassay |
| DE3727238A1 (de) * | 1987-08-14 | 1989-02-23 | Henning Berlin Gmbh | Immunologisches bestimmungsverfahren zur bestimmung von hapteneigenschaften aufweisenden freien substanzen |
| SE9002480D0 (sv) * | 1990-07-23 | 1990-07-23 | Hans Lilja | Assay of free and complexed prostate-specific antigen |
| US5324634A (en) * | 1992-03-31 | 1994-06-28 | The Research Foundation Of State University Of New York | Diagnostic tests measuring gelatinase/inhibitor complexes for detection of aggressive and metastatic cancer |
-
1993
- 1993-12-29 US US08/174,964 patent/US5599677A/en not_active Expired - Lifetime
-
1994
- 1994-12-22 EP EP95906713A patent/EP0741868B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-12-22 ES ES95906713T patent/ES2238678T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1994-12-22 AT AT95906713T patent/ATE290212T1/de active
- 1994-12-22 JP JP51816495A patent/JP3486413B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1994-12-22 DE DE69434286T patent/DE69434286T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1994-12-22 WO PCT/US1994/014902 patent/WO1995018381A1/en not_active Ceased
- 1994-12-22 AU AU15187/95A patent/AU1518795A/en not_active Abandoned
-
1995
- 1995-05-23 US US08/447,576 patent/US5672480A/en not_active Expired - Lifetime
-
2003
- 2003-08-05 JP JP2003286450A patent/JP3833637B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ATE290212T1 (de) | 2005-03-15 |
| JP3486413B2 (ja) | 2004-01-13 |
| US5599677A (en) | 1997-02-04 |
| JPH09508969A (ja) | 1997-09-09 |
| DE69434286D1 (de) | 2005-04-07 |
| EP0741868B1 (en) | 2005-03-02 |
| DE69434286T2 (de) | 2005-12-29 |
| JP2004093563A (ja) | 2004-03-25 |
| AU1518795A (en) | 1995-07-17 |
| JP3833637B2 (ja) | 2006-10-18 |
| EP0741868A1 (en) | 1996-11-13 |
| US5672480A (en) | 1997-09-30 |
| WO1995018381A1 (en) | 1995-07-06 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5672480A (en) | Immunoassays for prostate specific antigen | |
| JP4274330B2 (ja) | ｃＰＳＡの測定方法 | |
| US20080293162A1 (en) | Methods and compositions for diagnosing neoplastic disease | |
| US6107103A (en) | Assay for PSP94 protein | |
| US6379550B1 (en) | Method for detecting PSA and its molecular forms using thiophilic gel | |
| US6692643B2 (en) | Method for detecting PSA and its molecular forms using thiophilic gel on magnetic beads | |
| US20040248216A1 (en) | Method of examining cancer by assaying autoantibody against mdm2 and reagent therefor | |
| Vihko et al. | Time-resolved immunofluorometric assay of human prostate-specific antigen | |
| ES2316911T3 (es) | Anticuerpos dirigidos contra el gragmento f1+2 de la protrombina, su preparacion y uso. | |
| KR19990035755A (ko) | 부갑상선 호르몬 유사 단백질과 관련된 화합물 및 이의 제조방법 | |
| US20050130241A1 (en) | Immunological detection of prostate diseases and prostasome-related conditions | |
| CA2178504C (en) | Immunoassays for prostate specific antigen | |
| JPH0690203B2 (ja) | 前立腺特異抗原とα▲下１▼−アンチトリプシン複合体の定量方法 | |
| Kaufmann et al. | Immunohistochemical differentiation of metastases of renal carcinomas versus other carcinomas with anti‐γGT monoclonal antibody 138H11 | |
| JP3995316B2 (ja) | ホルモンレセプターに対する自己抗体の測定による癌の検出方法 | |
| JP4451784B2 (ja) | 前立腺癌腫瘍マーカー | |
| WO2013031757A1 (ja) | 膵癌、乳癌、肺癌又は前立腺癌の検出用マーカー及び検査方法 | |
| JP2002000273A (ja) | プロテインｃインヒビターと肝細胞増殖因子アクチベーターとの複合体およびその測定方法並びに臓器障害の検出方法 | |
| CA2546529A1 (en) | Immunoassays for prostate specific antigen | |
| JPH0342572A (ja) | ラミニン測定試薬 | |
| JPS5938657A (ja) | 前立腺疾患診断用組成物 | |
| Wilson | Medical Laboratory Science | |
| JPS63215967A (ja) | ヒト前立腺特異抗原の定量法 | |
| JPH02114181A (ja) | ヒトプラスミン−α↓２−プラスミンインヒビター複合体測定用の免疫学的測定試薬 | |
| PL188200B1 (pl) | Oznaczanie cPSA |