ES2239352T3

ES2239352T3 - Receptores metabotropicos gaba(b), ligandos especificos para el receptor y sus usos.

Info

Publication number: ES2239352T3
Application number: ES97908260T
Authority: ES
Inventors: Klemens Kaupmann; Bernhard Bettler; Helmut Bittiger; Wolfgang Frostl; Stuart John Mickel
Original assignee: Novartis AG
Current assignee: Novartis AG
Priority date: 1996-05-30
Filing date: 1997-03-19
Publication date: 2005-09-16
Anticipated expiration: 2017-03-19
Also published as: WO1997046675A1; JP2008113662A; AU2028497A; PT907731E; DE69732631D1; CA2254862A1; EP0907731B1; JP4202403B2; EP0907731A1; JP2007289188A; JP2000515005A; JP4131568B2; ATE290079T1; DE69732631T2

Abstract

LA PRESENTE INVENCION PROPORCIONA RECEPTORES PURIFICADOS DE LA GABA B , Y PROTEINAS DE LOS RECEPTORES DERIVADAS DE FUENTES DE RATAS Y HUMANOS, ASI COMO LOS ACIDOS NUCLEICOS QUE CODIFICAN DICHAS PROTEINAS. LAS PROTEINAS Y ACIDOS NUCLEICOS DE LA INVENCION COMPARTEN UNA IMPORTANTE HOMOLOGIA CON EL RECEPTOR DE LA GABA B Y EL DNA QUE LA CODIFICA, TAL COMO AQUI SE EXPONE ESPECIFICAMENTE. LA INVENCION PROPORCIONA ADEMAS PROCEDIMIENTOS PARA AISLAR OTROS MIEMBROS DE LA FAMILIA DE RECEPTORES DE LA GABA B , UTILIZANDO LA TECNOLOGIA DE CLONACION DEL DNA Y SONDAS DERIVADAS DE LAS SECUENCIAS QUE AQUI SE PROPORCIONAN, ASI COMO NUEVOS MIEMBROS DE LA FAMILIA DE RECEPTORES DE LA GABA B AISLADA POR DICHOS METODOS. ADEMAS, LA INVENCION SE REFIERE AL USO DE LOS RECEPTORES DE LA GABA B Y DE LAS PROTEINAS Y CELULAS DE LOS RECEPTORES TRANSFORMADAS CON UN GEN QUE CODIFICA UNA PROTEINA DE LOS RECEPTORES DE LA GABA B EN UN PROCEDIMIENTO PARA IDENTIFICAR Y CARACTERIZAR COMPUESTOS QUE MODULEN LA ACTIVIDAD DEL RECEPTORDE LA GABA B , COMO POR EJEMPLO LOS AGONISTAS Y ANTAGONISTAS DE LOS RECEPTORES DE LA GABA B , QUE PUEDEN SER UTILES COMO AGENTES FARMACOLOGICOS PARA EL TRATAMIENTO DE TRASTORNOS ASOCIADOS A LOS SISTEMAS NERVIOSO CENTRAL Y PERIFERICO.

Description

Receptores metabotrópicos GABA_{(B)}, ligandos específicos para el receptor y sus usos.

La presente invención se relaciona con ácidos nucleicos que codifican proteínas de la familia del receptor para GABA_{B}, así como con las proteínas codificadas de ese modo, y el uso de tales proteínas para el desarrollo de agentes farmacológicos.

El ácido gama aminobutírico (GABA) es el principal neurotransmisor inhibitorio que se encuentra en el cerebro y en el sistema nervioso periférico. Los receptores para el GABA se han dividido en dos subfamilias, los receptores para GABA_{A} y para GABA_{B}. De estos, los receptores para GABA_{A} están involucrados en la transmisión rápida de la señal inhibitoria, mientras que los receptores para GABA_{B} parecen estar involucrados en la modulación de la neurotransmisión. Los receptores pre sinápticos para GABA_{B} influyen en la liberación de neurotransmisores y neuropéptidos tales como GABA, glutamato, noradrenalina, dopamina, 5-hidroxitriptamina, sustancia P, colecistoquinina y somatostatina, mientras que los receptores para GABA_{B} pos sinápticos se acoplan a los canales de potasio a través de las proteínas G y median la inhibición tardía de los potenciales pos sinápticos (IPSP). El efecto de la activación de ambos subtipos del receptor para GABA_{B} es el de modular la transmisión sináptica.

Los receptores para GABA_{B} se ubican a lo largo de los sistemas nerviosos central y periférico (ver Ong y Kerr, Life Sciences, (1990) 46, 1489-1501; Bowery y colaboradores, Drug Res. (1992) 42(1), 2a, 215-223), y se ven así involucrados en la regulación de una gran variedad de respuestas fisiológicas controladas neuralmente, desde la memoria y el aprendizaje hasta la contracción muscular. Esto convierte al receptor para GABA_{B} en un objetivo para los agentes farmacéuticos que tienen por objeto tratar los desordenes neurales central y periférico, y en realidad se conocen y han sido propuestos una variedad de agonistas y de antagonistas para GABA_{B} para ser usados en terapia (Bittiger y colaboradores, en GABA: Receptores, Transportadores y Metabolismo, Tanaka, C. Y Bowery, N.G. (Eds). Birkhäuser Verlag Basel/ Suiza (1996), 297-305; Bittiger y colaboradores, Trends Pharmacol. Sci., 14, 391-394, 1993; Froestl y colaboradores, J. Medical Chem., 38, 3297-3312, 1995; Froestl y colaboradores, Ibíd., 3313-3331). Por ejemplo, en la enfermedad de Alzheimer y otras demencias tales como el Deterioro de la Memoria Asociado con la Edad y la Demencia Vascular, la perdida de la función cognitiva se asocia con niveles reducidos de un cierto número de neurotransmisores en el cerebro. En particular, un déficit en L-glutamato, se espera que cause una perdida mayor de funciones cognitivas, ya que parece ser que el L-glutamato está crucialmente involucrado en los procesos que refuerzan la formación de la memoria y el aprendizaje. El GABA actúa directamente en muchas sinapsis para reducir la liberación de L-glutamato actuando sobre los heteroreceptores para GABA_{B}. Por lo tanto, los antagonistas del receptor para GABA_{B} son indicados para el tratamiento de las demencias, y en realidad han mostrado que mejoran las funciones cognitivas en estudios con animales. Además, se espera que los antagonistas del receptor para GABA_{B} sean activos en desordenes siquiátricos y neurológicos tales como depresión, ansiedad y epilepsia (Bittiger y colaboradores, 1993, 1996, Op. Cit.; Froestl y colaboradores, 1995, Op. Cit.). Los agonistas del receptor para GABA son conocidos como agentes antiespásticos, y en las aplicaciones del sistema nervioso periférico, se espera que los agonistas sean benéficos en la inflamación bronquial, asma y los accesos de tos (Bertrand y colaboradores, Am. J. Resp. Crit. Care Med. 149, A900, 1994). El GABA está asociado además con actividad en el intestino, el sistema cardiovascular, las vesículas biliar y urinaria, y una variedad de otros tejidos (Ong y Kerr, Op. Cit.).

Se sabe que la acción del GABA en cada uno de los anteriores casos es medida por los receptores para GABA_{B}, haciendo de los receptores, objetivos para los agentes farmacológicos diseñados para tratar varios desordenes.

A pesar del avanzado estado de la biología molecular y de la tecnología para la purificación de proteínas, y del evidente deseo de obtener un receptor para GABA_{B} purificado para estudios farmacológicos, éste no ha sido clonado o purificado hasta homogeneidad. Un reporte previo de su purificación parcial (Nakayasu y colaboradores, J. Biol.. Chem., 268, 8658-8664, 1993) parece haber sido inexacto, en relación con una proteína de 80 kD, que ahora sabemos que es muy pequeña. Con miras a ser capaces de clonar al receptor para GABA_{B}, hemos desarrollado una variedad de ligandos específicos del receptor para GABA_{B}. Por clonación de la expresión usando uno de tales ligandos del receptor altamente selectivos marcados para reactividad específica alta, hemos clonado ahora diferentes receptores para GABA_{B} de fuentes tanto humana como de rata, los hemos secuenciado y expresado los receptores recombinantes respectivos en cultivos de células de mamíferos.

Resumen de la invención

La presente invención provee receptores para GABA_{B} y proteínas receptoras para GABA_{B} aislados, así como ácidos nucleicos que codifican tales proteínas. Las proteínas y ácidos nucleicos de la invención comparten una homología significativa con los receptores para GABA_{B} y los ADN que los codifican como se describe específicamente aquí. En particular, se proveen dos proteínas receptoras para GABA_{B} designadas como GABA_{B}R1a y GABA_{B}R1b que son distintas variantes del GABA_{B} aislado de rata. El respectivo cADN y las secuencias derivadas de aminoácidos se presentan en las SEQ ID Nos. 1, 2 y 5, 6, respectivamente. Además, se proveen dos clones de receptor humano para GABA_{B} llamados GABA_{B}R1a/b (que representan un clon receptor parcial) y GABA_{B}R1b (que representa un clon de receptor de longitud completa) aislados de fuentes humanas. El cADN respectivo y las secuencias derivadas de aminoácidos se presentan en las SEQ ID Nos. 3, 4 y 7, 8, respectivamente.

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Los receptores para GABA_{B} y las proteínas receptoras para GABA_{B} de la invención, muestran un enlazamiento específico a uno o más de los antagonistas receptores para GABA_{B} de Fórmula I y de Fórmula II:

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Además, el enlazamiento de éstos antagonistas selectivos receptores para GABA_{B} puede competir con otros agonistas o antagonistas receptores para GABA_{B}, tal como el compuesto de Fórmula II y Fórmula IV:

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La invención además provee métodos para aislar a otros miembros de la familia del receptor para GABA_{B} usando tecnología de clonación ADN y sondas derivadas de las secuencias proveídas aquí, así como miembros nuevos de la familia del receptor para GABA_{B} aislados por tales métodos.

Además, la invención se relaciona con el uso de receptores para GABA_{B} y proteínas receptoras para GABA_{B} y células transformadas con un gene que codifica a tal receptor o proteína receptora para GABA_{B} en un método para identificar y caracterizar compuestos que modulan la actividad del(los) receptor(es) para GABA_{B}, tal como los agonistas y antagonistas de receptor para GABA_{B}, los cuales pueden ser útiles como agente farmacológicos para el tratamiento de desordenes asociados con los sistemas nerviosos periférico y central. En particular, los antagonistas de receptor para GABA_{B} pueden, por ejemplo, ser útiles como mejoradores de conocimiento, nootrópicos, antidepresivos y ansiolíticos para el tratamiento de insuficiencia cerebral, depresión, ansiedad, epilepsia del tipo pequeño mal, esquizofrenia y miopía, puesto que los agonistas de receptor para GABA_{B} pueden, por ejemplo, ser útiles en el tratamiento de desordenes tales como espasticidad, neuralgia trigeminal, asma, acceso de tos, vómito, úlceras, incontinencia urinaria y adicción a la cocaína.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 describe la expresión del receptor para GABA_{B}R1a recombinante en células COS1. Las membranas a partir de las membranas de corteza de rata (vía 1) y de las células transfectadas COS1 con el cADN de rata para GABA_{B}R1a (vías 2 y 3) se marcan con el ligando de fotoafinidad [^{125}I]CGP 71872. Se muestra la autoradiografía de un gel SDS al 6% con una carga de 25\mug de proteína por vía. Vías 1 y 2: enlazamiento específico con [^{125}I]CGP 71872 0,6nM. Vía 3: experimento de control en donde el enlazamiento específico con [^{125}I]CGP 71872 0,6nM, se completa con 1 \muM de CGP 54626ª no marcado (un antagonista específico para receptores para GABA_{B}). El peso molecular aparente de los receptores para GABA_{B} nativo y recombinante se estiman a partir de las movilidades en el gel, con relación a aquellas de los estándares SDS-PAGE (BioRad). La Figura 1b muestra adicionalmente los resultados para las células transfectadas COS1 con el cADN de rata para GABA_{B}R1b (vía 3).

La Figura 2 muestra la inhibición de [^{125}I]CGP 64213 que enlaza a los receptores para GABA_{B} en las membranas de la corteza cerebral de rata (símbolos abiertos) y receptores para GABA_{B}R1a recombinante en membranas de células COS1 (símbolos cerrados) por los antagonistas del receptor para GABA_{B}, CGP 54626A (\bullet), CGP 64213 (\blacktriangle) y CGP 35348 (\sqbullet).

La Figura 3 muestra la inhibición de [^{125}I]CGP 64213 que enlaza a los receptores para GABA_{B} en las membranas de la corteza cerebral de rata (símbolos abiertos) y receptores para GABA_{B}R1a recombinante en membranas de células COS1 (símbolos cerrados) por los agonistas del receptor para GABA_{B}, GABA (\bullet), L-baclofen (\blacktriangle) y APPA 3-(ácido aminopropil-fosfínico) (\sqbullet).

La Figura 4 muestra el enlace cruzado por fotoafinidad de las proteínas receptoras para GABA_{B}. Las membranas de las células de los tejidos indicados se marcan por fotoafinidad con [^{125}I]CGP 71872 y se someten a SDS-PAGE y autorradiografía. a, b, Selectividad del ligando de fotoafinidad [^{125}I]CGP 71872. a, Distribución diferencial de variantes del receptor para GABA_{B} de 130K y 100K en tejidos del sistema nervioso. El enlazamiento de [^{125}I]CGP 71872 se inhibe por la adición de 1\muM de CGP54626A, un antagonista selectivo del receptor para GABA_{B}. b, Competencia en la marcación de [^{125}I]CGP 71872 por diferentes ligandos. La incubación de los extractos de membrana con el ligando de afinidad, se lleva acabo en presencia de sustancias competidoras en la concentración indicada, c, los receptores para GABA_{B} están N-glicosilados. Las membranas celulares de corteza de rata marcadas por fotoafinidad, se incuban con 0,4 unidades de N-glicosidasa F, o 0,6 miliunidades de O-glicosidasa (Boehringer Mannheim). d, Fotomarcación de los receptores para GABA_{B} de diferentes especies. Los tejidos cerebrales de las especies indicadas se marcan como se describe abajo. En el caso de la Drosophila melanogaster y Haemonchus concortus, se analizan los animales completos.

La Figura 5 muestra los resultados de los análisis referentes a las propiedades farmacológicas de los receptores para GABA_{B} nativo y recombinante. El GABA_{B}R1a madia la inhibición de la ciclasa adenilato. Las células HEK293 que expresan en forma estable GABA_{B}R1a se tratan con 20 \muM de forskolin (Fsk) para estimular la formación de cAMP (100%). La acumulación de cAMP inducida por Fsk se reduce significativamente (2P<0,001; prueba t de Dunnett) con la adición simultanea de 300 \muM de L-baclofen. El efecto del L-baclofen se antagoniza en la presencia de 10 \muM de CGP54626A. La preincubación de las células con 10 ng/ml de toxina de tos ferina (PTX) durante 15-20 horas elimina completamente el efecto del L-baclofen. No se observa respuesta al L-baclofen en células HEK293 no transfectadas (inserto). Las barras representan los valores medios + S.E.M. de al menos tres experimentos independientes realizados por cuadruplicado.

Descripción detallada de la invención

La invención se relaciona con receptores para GABA_{B} y proteínas receptoras para GABA_{B} aislados, ácidos nucleicos que las codifican y diferentes aplicaciones de los mismos. Antes de la presente invención, el receptor para GABA_{B} no se encontraba disponible en forma purificada, sino solo como preparaciones de membrana cruda. En primer lugar, la presente invención permite la producción de receptores para GABA_{B} diferentes pero relacionados, en forma sustancialmente purificada por medio de tecnología ADN recombinante. En general, se espera que tales proteínas en forma glicosilada tendrán un peso molecular observado entre 100 y 130 kDa, mientras que las formas no glicosiladas tendrán un peso molecular observado entre 90 y 100 kDa, respectivamente.

Los receptores para GABA_{B} de acuerdo con la invención son moduladores acoplados a proteína G de actividad neurotransmisora la cual es responsable del GABA. Ellos pueden definirse por enlazamiento a ligandos marcados que son selectivos para los receptores para GABA_{B}, en particular [^{125}I]CGP 62413 y [^{125}I]CGP 71872. Además, son posibles estudios funcionales en los cuales un receptor para GABA_{B} recombinante se expresa en sistemas de células que contienen proteínas G y efectores tales como canales iónicos que pueden ser activados por GABA y agonistas de receptor para GABA_{B}.

Las proteínas de acuerdo con la invención pueden definirse electrofisiológicamente en animales transgénicos o knockout, por ejemplo en términos de su sensibilidad en los ensayos para el(los) receptor(es) para GABA_{B} que son conocidos en el estado de la técnica, tales como la medida de sus tardíos IPSP (potenciales de inhibición pos sinápticos), inhibición de pulso pareado, o depresión inducida por (-)-baclofen del campo de los EPSP (potenciales de excitación pos sinápticos). Los receptores para GABA_{B} son responsables por la observación de los IPSP como resultado de acoplamiento directo a los canales de potasio en las neuronas, de forma tal que los agonistas y antagonistas establecidos de los receptores para GABA_{B} pueden ser usados para determinar la presencia de receptores para GABA_{A} en preparaciones neuronales ensayando su efecto sobre los IPSP.

Convenientemente, sin embargo, las proteínas receptoras para GABA_{B} de acuerdo con la invención, se evalúan por su susceptibilidad a CGP64213 y CGP71872 como se mide por el ensanchamiento del pulso pareado de campo de los EPSP. Ambos compuestos anulan el ensanchamiento del pulso pareado normalmente asociado con los receptores para GABA_{B} ya que son antagonistas efectivos de autoreceptor para GABA_{B}. Preferiblemente, por lo tanto, la activación de las proteínas receptoras para GABA de acuerdo con la invención es inhibida específicamente por CGP64213 y CGP71872. Ejemplos de inhibición específica por estos compuestos se exponen más abajo.

Como se lo utiliza aquí, el término "receptor(es) para GABA_{B}" se refiere a las proteínas cuyas secuencias son fundamentalmente aquellas publicadas en las SEQ ID Nos. 2 y 8, mientras que el término "proteínas receptoras para GABA_{B}" incluye derivados y variantes tales como por ejemplo, variantes unidas de las mismas que se relacionan estructuralmente y/o funcionalmente al(los) receptor(es) para GABA_{B}. Las proteínas receptoras para GABA_{B} preferidas de acuerdo con la invención son por ejemplo aquellas publicadas en las SEQ ID Nos 4 y 6, y comparten al menos un determinante estructural común con los receptores para GABA_{B} que tienen las secuencias de aminoácidos publicadas en las SEQ ID Nos 2 y 8, respectivamente. "Determinante estructural común" significa que el derivado en cuestión comprende al menos una característica estructural de los receptores para GABA_{B} publicados en la SIQ ID Nos 2 y 8. Las características estructurales incluyen la posesión de un epítopo o sitio antigénico que es capaz de reaccionar en forma cruzada con los anticuerpos que se generan contra una ocurrencia natural o un polipéptido receptor desnaturalizado para GABA_{B} o fragmento del mismo, la posesión de identidad de secuencia de aminoácidos con el(los) recepto(es)
para GABA_{B} y características que tienen una relación común de estructura/función. Así, las proteínas receptoras para GABA_{B} como las proveídas por la presente invención incluyen mutaciones de aminoácidos, variantes de glicolisación y otros derivados covalentes del(los) receptor(es) para GABA_{B} que retienen las propiedades fisiológicas y/o físicas
del(los) receptor(es) para GABA_{B}.

Además, incluidos dentro del alcance del término "proteínas receptoras para GABA_{B}" están las variantes de ocurrencia natural de(los) receptor(es) para GABA_{B} encontrados dentro de especies particulares, preferiblemente un mamífero. Tales variantes pueden ser codificadas por un gen relacionado de la misma familia del gen, por una variante alélica de un gen particular, o representa una variante alternativa empalmada del gen receptor para GABA_{B}. Las variantes de acuerdo con la invención tienen la misma función básica que el(los) receptor(es) para GABA_{B}, pero pueden poseer características divergentes consistentes con su naturaleza como variantes. Por ejemplo, se espera que los receptores para GABA_{B} sean miembros de una familia de proteínas receptoras para GABA_{B}, cuyo aislamiento y caracterización es posibilitada por primera vez por la presente invención. Los diferentes miembros de la familia del receptor para GABA_{B} puede esperarse que tenga diferentes perfiles de actividad, posiblemente de acuerdo con las diferencias en su localización específica dentro del tejido y el papel en la modulación de las señales neuronales.

Además, la presente invención permite el aislamiento y caracterización de otros receptores para GABA_{B}, proteínas receptoras para GABA_{B} y ácidos nucleicos que codifican proteínas de receptores para GABA_{B} de cualquier especie, incluido el hombre. El suministro de datos de secuencia permiten a una persona entrenada en la técnica aplicar una metodología de hibridación estándar, como se conoce en el estado de la técnica y se expone por medio de ejemplos más abajo, para aislar cualquier ácido nucleico deseado que codifique a un receptor para GABA_{B}.

La invención comprende además derivados del(los) receptor(es) para GABA_{B}, que retienen al menos un determinante estructural común del(los) receptor(es) para GABA_{B}. Por ejemplo, los derivados incluyen moléculas en donde la proteína de la invención es modificada covalentemente por sustitución química, enzimática o por cualquier medio apropiado con una fracción diferente de un aminoácido de ocurrencia natural. Tal fracción puede ser una fracción detectable tal como una enzima o un radioisótopo.

Los derivados que retienen determinantes estructurales comunes pueden ser fragmentos del(los) receptor(es) para GABA_{B}. Los fragmentos del(los) receptor(es) para GABA_{B} comprenden dominios individuales de los mismos, así como péptidos más pequeños derivados de los dominios. Preferiblemente, los polipéptidos más pequeños derivados del(los) receptor(es) para GABA_{B} de acuerdo con la invención definen un rasgo único que es característico del(los) receptor(es) para GABA_{B}. Los fragmentos pueden ser en teoría de cualquier tamaño, mientras que retengan un rasgo del(los) receptor(es) para GABA_{B}. Preferiblemente, los fragmentos estarán entre 5 y 600 aminoácidos de longitud. Los fragmento mayores se consideran como truncamientos del(los) receptor(es) completos para GABA_{B} y generalmente abarcados por el término "del(los) receptor(es) para GABA_{B}". Preferiblemente, dichos fragmentos retienen la actividad funcional del(los) receptor(es) para GABA_{B}. Tales fragmentos pueden ser producidos por personas entrenadas en la técnica, utilizando técnicas convencionales, por remoción de los residuos de aminoácido de las proteínas receptoras para GABA_{B} de la invención, que no son esenciales para un aspecto funcional particular de las proteínas receptoras para GABA_{B}. La determinación de los aspectos funcionales de una proteína receptora para GABA_{B} puede hacerse empleando análisis farmacológicos o electrofisiológicos como se describe aquí, y particularmente por medio de análisis que hacen seguimiento a la capacidad de la proteína receptora para GABA_{B} para enlazar GABA o una imitación de GABA, o para acoplarse a proteínas G.

Los derivados del(los) receptor(es) para GABA_{B} también comprenden mutaciones de los mismos los cuales pueden contener supresiones de aminoácidos, adiciones o sustituciones, sometidos al requerimiento de mantener al menos un rasgo característico del(los) receptor(es) para GABA_{B}. Por lo tanto, las sustituciones conservadoras de aminoácidos pueden hacerse sustancialmente sin alterar la naturaleza del(los) receptor(es) para GABA_{B}. Las sustituciones y supresiones adicionales pueden hacerse además a los fragmentos de proteínas receptoras para GABA_{B} comprendidas por la invención. Los mutantes de proteínas receptoras para GABA_{B} pueden producirse a partir de un ADN que codifica una proteína receptora para GABA_{B} que ha sido sometida a mutagénesis in vitro resultando por ejemplo en una adición, intercambio y/o supresión de uno o más tripletes que codifican aminoácidos. Por ejemplo, las variantes por sustitución, supresión o inserción del(los) receptor(es) para GABA_{B} pueden prepararse por métodos recombinantes y rastrearse por inmunoreactividad cruzada o fisiológica con las formas nativas del(los) receptor(es) para GABA_{B}.

Las mutaciones pueden llevarse a cabo por cualquier método conocido por aquellos entrenados en la técnica. Se prefiere, sin embargo, la mutagénesis dirigida al sitio de una secuencia de ácidos nucleicos que codifica los polipéptidos de interés. Se conocen en el estado de la técnica una variedad de métodos para la mutagénesis dirigida al sitio, desde los métodos que emplean fagos de entrelazamiento sencillo tales como M13 por técnicas basadas en PCR (ver "PCR Protocols: A guide to methods and applications", M.A. Innis, D.H. Gelfand, J.J. Sninsky, T.J. White (eds.). Academic Press, New York, 1990). Preferiblemente, puede emplearse el Altered Site II Mutagenesis System (Promega), de acuerdo con las instrucciones dadas por el fabricante.

Los fragmentos, mutaciones y otros derivados del(los) receptor(es) para GABA_{B} retienen preferiblemente una homología sustancial con el(los) receptor(es) para GABA_{B}. Como se lo usa aquí, "homología" significa que las dos entidades comparten suficientes características para que una persona entrenada determine que son similares en origen y función. Preferiblemente, homología se usa para referirse a una identidad de secuencia. Por lo tanto, los derivados del(los) receptor(es) para GABA_{B} preferiblemente retienen una sustancial identidad de secuencia con las secuencias publicadas en las SEQ ID Nos. 2 y 8, respectivamente.

"Homología sustancial", donde homología indica identidad de secuencia, significa una identidad de secuencia superior al 30%, preferiblemente una identidad de secuencia superior al 65% y más preferiblemente una identidad de secuencia del 80% o más.

De acuerdo con un aspecto adicional de la presente invención, se proveen ácidos nucleicos que codifican receptores para GABA_{B} y proteínas receptoras para GABA_{B} (SEQ ID Nos. 1, 7 y 3, 5, respectivamente). Además de ser útil para la producción de receptores y proteínas receptoras para GABA_{B} recombinante, estos ácidos nucleicos también son útiles como sondas, permitiendo así fácilmente a aquellos entrenados en la técnica, identificar y/o aislar ácidos nucleicos que codifican más miembros de la familia de receptores para GABA_{B} y variantes de los mismos como se manifiesta más abajo.

En otro aspecto, la invención provee secuencias de ácidos nucleicos que son complementarias con, o son capaces de hibridación con, secuencias de ácido nucleico que codifican a los receptores o proteínas receptoras para GABA_{B}. Preferiblemente, tales ácidos nucleicos son capaces de hibridación bajo una astringencia alta o moderada, como se define más abajo.

Además, los ácidos nucleicos de acuerdo con la invención son útiles en un método para determinar la presencia de un receptor para GABA_{B} o el ácido nucleico específico de la proteína receptora, dicho método comprende hibridar el ADN (o ARN) codificando (o complementario a) el receptor y proteína receptora para GABA_{B} o para ensayar el ácido nucleico de la muestra y determinar la presencia del ácido nucleico específico del receptor o proteína receptora para GABA_{B}.

La invención también provee un método para amplificar una muestra de ensayo de ácido nucleico que comprende la iniciación de una reacción (en cadena) de la polimerasa de ácido nucleico con ácido nucleico (ADN o ARN) que codifica a un receptor o proteína receptora para GABA_{B}, o un ácido nucleico complementario de los mismos.

Los ácidos nucleicos específicos del receptor o proteína receptora para GABA_{B} aislados, incluyen ácidos nucleicos que se encuentran libres de al menos un ácido nucleico contaminante con el cual se encuentran normalmente asociados en la fuente natural de ácidos nucleicos específicos del receptor o proteína receptora para GABA_{B} o en preparaciones de ácido nucleico crudo, tales como bibliotecas de ADN y similares. Los ácidos nucleicos aislados están presentes por lo tanto, en forma o composición diferentes a como se encuentran en la naturaleza. Sin embargo, el receptor para GABA_{B} aislado y los ácidos nucleicos que codifican proteínas receptoras incluyen un receptor para GABA_{B} y ácidos nucleicos específicos de proteínas receptoras generalmente en células que expresan un receptor o proteína receptora para GABA_{B}, donde los ácidos nucleicos se encuentran en una diferente ubicación cromosómica a aquella de las células naturales, o de otra forma están flanqueadas por secuencias de ADN diferentes de aquellas encontradas en la naturaleza.

De acuerdo con la presente invención, se proveen ácidos nucleicos aislados, por ejemplo ADNs o ARNs que codifican receptores para GABA_{B} y proteínas receptoras para GABA_{B}, particularmente receptores y proteínas receptoras para GABA_{B} de mamíferos, tales como por ejemplo receptores y proteínas receptoras para GABA_{B} de humanos y de rata, o fragmentos de los mismos. En particular, la invención provee moléculas de ADN que codifican receptores o proteínas receptoras para GABA_{B}, de humanos y de rata, o fragmentos de los mismos. Por definición, tal ADN comprende un ADN de entrelazamiento sencillo, un ADN de entrelazamiento doble que consta de dicho ADN que codifica y ADN complementario del mismo, o este ADN complementario (de entrelazamiento sencillo) en si mismo. Ejemplos de ácidos nucleicos que codifican receptores para GABA_{B} y proteínas receptoras para GABA_{B} se representan en las SEQ ID Nos. 1, 7, y 3, 5, respectivamente.

Las secuencias preferidas que codifican receptores y proteínas receptoras para GABA_{B} son aquellas que tienen sustancialmente la misma secuencia de nucleótidos que las secuencias codificadoras en las SEQ ID Nos. 1, 3, 5 y 7, como las más preferidas. Como se las usa aquí, las secuencias de nucleótidos que son sustancialmente las mismas, comparten al menos alrededor del 90% de identidad. Sin embargo, en el caso de unir variantes que tienen por ejemplo, una homología adicional de secuencia del exón, puede ser menor.

Los ácidos nucleicos de la invención, sean usados como sondas o de otra manera, son preferiblemente sustancialmente homólogos a las secuencias que codifican a los receptores y proteínas receptoras para GABA_{B} como se muestra en las SIQ ID Nos. 1, 3, 5 y 7. Los términos "sustancialmente" y "homólogos" se usan como se definió antes con referencia a los polipéptidos del receptor para GABA_{B}.

Preferiblemente, los ácidos nucleicos de acuerdo con la invención son fragmentos de secuencias que codifican al receptor o proteínas receptoras para GABA_{B} o, o derivados de los mismos como se definió antes en relación con los polipéptidos. Los fragmentos de las secuencias de ácidos nucleicos son de unos pocos nucleótidos en longitud, preferiblemente con una longitud de 5 a 150 nucleótidos, son especialmente útiles como sondas.

Ejemplos de ácidos nucleicos pueden caracterizarse alternativamente como aquellas secuencias de nucleótidos que codifican a un receptor o proteína receptora para GABA_{B} como se definió antes y la hibridación de las secuencias de ADN publicadas en las SEQ ID Nos. 1, 3, 5 y/o 7, o un fragmento seleccionado de dichas secuencias de ADN. Se prefieren aquellas secuencias que codifican receptores y proteínas receptoras para GABA_{B} que hibridan bajo condiciones de alta astringencia a las secuencias de las SEQ ID Nos. 1, 3, 5 y/o 7.

La astringencia de hibridación se refiere a condiciones bajo las cuales los híbridos de los ácidos polinucleicos son estables. Tales condiciones son evidentes para aquellos normalmente entrenados en este campo. Como es sabido por todos aquellos entrenados en la técnica, la estabilidad de los híbridos se refleja en la temperatura de fusión (T_{m}) del híbrido, la cual disminuye aproximadamente entre 1 a 1,5ºC por cada 1% de disminución en la homología de la secuencia. En general, la estabilidad de un híbrido es una función de la concentración de ión sodio y de la temperatura. Típicamente, la reacción de hibridación se realiza bajo condiciones de alta astringencia, seguida por lavados de astringencia variada.

Como se usa aquí, alta astringencia se refiere a condiciones que permiten la hibridación solamente de aquellas secuencias de ácidos nucleicos que forman híbridos estables en Na^{+} 1 M a 65-68ºC. Las condiciones de alta astringencia pueden proveerse por ejemplo por hibridación en una solución acuosa que contiene 6xSSC, 5xsolución de Denhardt, 1%SDS (dodecil sulfato de sodio), 0,1 de pirofosfato de sodio y 0,1 mg/ml de ADN de esperma de salmón desnaturalizado como competidor no específico. Después de la hibridación, los lavados de alta astringencia pueden hacerse en varias etapas, con un lavado final (alrededor de 30 minutos) a la temperatura de hibridación en 0,2 - 0,1 x SSC, 0,1% SDS.

Astringencia moderada se refiere a condiciones equivalentes a la hibridación en la solución descrita antes, pero alrededor de 60-62ºC. En ese caso el lavado final se realiza a la temperatura de hibridación en 1x SSC, 0,1% SDS.

Baja astringencia se refiere a condiciones equivalentes a la hibridación en la solución descrita antes alrededor de 50-52ºC. En ese caso, el lavado final se realiza a la temperatura de hibridación en 2x SSC, 0,1% SDS.

Se entiende que estas condiciones pueden adaptarse y duplicarse utilizando una variedad de soluciones amortiguadoras, por ejemplo soluciones amortiguadores con base en formamida, y temperaturas. La solución de Denhardt y SSC son bien conocidas por aquellos entrenados en la técnica, como otras soluciones amortiguadoras de hibridación adecuadas (ver, por ejemplo Sambrook y colaboradores, eds. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York o Ausubel y colaboradores, eds. (1990) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc.). En particular, la persona entrenada entenderá que la astringencia de las condiciones de hibridación pueden variarse alterando ciertos parámetros, principalmente la concentración de sal y la temperatura, y que las condiciones obtenidas son un resultado del efecto combinado de todos esos parámetros. Las condiciones óptimas de hibridación tienen que determinarse empíricamente, así como la longitud y el contenido por GC de la sonda también juegan un papel.

Los ácidos nucleicos de acuerdo con la invención pueden diseñarse además para tener secuencias completamente diferentes de aquellas de los ácidos nucleicos que codifican receptores y proteínas receptoras para GABA_{B}, como los derivados de fuentes naturales, a través del aprovechamiento de la degradación del código aminoácido. En la mayoría de los casos pueden usarse una variedad de tripletas de nucleótidos para codificar un aminoácido dado. Por lo tanto, puede diseñarse un número casi ilimitado de ácidos nucleicos que codifican idénticos receptores y proteínas receptoras para GABA_{B}. Aquellos que difieren más de la secuencia de los ácidos nucleicos que se presentan en forma natural, pueden ser muy diferentes como para ser incapaces de hibridarse luego. La invención abarca específicamente por lo tanto a cualquier ácido nucleico que codifique un receptor para GABA_{B} o proteína receptora para GABA_{B} como se definió antes. Se prefieren todos los ácidos nucleicos que codifican las secuencias de los receptores y proteínas receptoras para GABA_{B} expuestas en las SEQ ID Nos. 2, 8 y 4, 6, respectivamente.

Dada la guía que se proporciona aquí, los ácidos nucleicos de la invención se obtienen de acuerdo a los métodos bien conocidos en el estado de la técnica. Por ejemplo, un ADN de la invención se obtiene por síntesis química, usando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), o rastreando una biblioteca genómica o una biblioteca apropiada de cADN preparada a partir de una fuente que se cree que posea un receptor o proteína receptora para GABA_{B} y que los exprese en un nivel detectable.

Los métodos químicos para la síntesis de un ácido nucleico de interés, se conocen en el estado de la técnica e incluyen métodos triéster, fosfito, fosforamidita y fosfonato ácido, PCR y otros métodos autoiniciadores, así como también la síntesis de oligonucleótidos sobre soportes sólidos. Estos métodos pueden usarse si se conoce la secuencia completa del ácido nucleico, o si se dispone de la secuencia del complementario del ácido nucleico de la cadena de codificación. Alternativamente si se conoce la secuencia del aminoácido objetivo, uno puede inferir las secuencias potenciales de ácido nucleico utilizando los residuos conocidos y preferidos de codificación para cada residuo de aminoácido.

Un medio alternativo para aislar un gen que codifique al receptor o proteína receptora para GABA_{B} es utilizar tecnología PCR como se describe por ejemplo en la sección 14 de Sambrook y colaboradores, 1989. Este método requiere del uso de sondas de oligonucleótidos que hibridarán a un ácido nucleico específico de receptor o proteína receptora para GABA_{B}.

Puede aislarse un ácido nucleico que codifique a un receptor o proteína receptora para GABA_{B} por rastreo de cADN apropiado o de bibliotecas genómicas bajo condicionas de hibridación adecuadas con una sonda, esto es, un ácido nucleico descrito aquí que incluya oligonucleótidos derivables de las secuencias expuestas en las SIQ ID Nos 1, 3, 5 y 7. Las bibliotecas apropiadas están comercialmente disponibles o pueden prepararse por ejemplo a partir de líneas celulares, muestras de tejidos, y similares. Las bibliotecas se rastrean con sondas o con herramientas analíticas diseñadas para identificar el gen de interés o la proteína codificada por él. Por medios apropiados de bibliotecas de expresión de cADN que incluyen anticuerpos monoclonales o policlonales que reconocen y se unen específicamente al receptor para GABA_{B} o proteína receptora para GABA_{B}; oligonucleótidos de alrededor de 20 a 80 bases de longitud que codifican cADN específico de receptor o proteína receptora para GABA_{B} conocidos o sospechados, de la misma o de diferentes especies; y/o cADNs complementarios u homólogos o fragmentos de los mismos que codifican al mismo gen o un gen híbrido. Las sondas apropiadas para rastrear las bibliotecas de ADN genónmico incluyen, pero no se limitan a, oligonucleótidos, cADNs o fragmentos de los mismos que codifican al mismo ADN o a un híbrido; y/o ADNs genómicos homólogos o fragmentos de los mismos.

Las técnicas particularmente preferidas de rastreo incluyen la hibridación de una muestra de ensayo de ADN (cADN o biblioteca genómica) con un cADN específico de receptor o proteína receptora para GABA_{B} (SEQ ID Nos 1, 3, 5, 7) bajo condiciones adecuadas de hibridación. Pueden usarse como sondas, ya sean los fragmentos o la longitud completa del cADN específico del receptor o proteína receptora para GABA_{B}. Tal rastreo inicialmente se lleva a cabo bajo condiciones de baja astringencia. Las condiciones de baja astringencia son como se las definió aquí antes, pero pueden variarse ajustando la temperatura y fuerza iónica de la solución de hibridación. Por ejemplo, las condiciones apropiadas comprenden hibridación a una temperatura entre 40ºC y 60ºC en NaH_{2}PO_{4} 0,5 M, pH 7,2, dodecilsulfato de sodio al 7% (SDS), albúmina de suero bovino al 1%, EDTA 1 mM, con una etapa de lavado a 50ºC o menos en 2x citrato salino estándar (SSC, 20xSSC que contiene cloruro de sodio 3M, citrato de sodio 0,3M, pH 7,0), SDS al 0,1%. Preferiblemente, las condiciones de hibridación se seleccionaran para que permitan la identificación de secuencias de nucleótidos que tengan al menos una homología de secuencia del 40% con respecto a la sonda. Técnicas similares de rastreo de homología útiles para la identificación y aislamiento de cADNs adicionales y de genes de la familia del gen del receptor para GABA_{B}, se describen en la patente norteamericana número 5.202.257, incorporada aquí como referencia.

Después de que se ha utilizado hibridación de baja astringencia para identificar cADN o clones genómicos que tienen una similitud sustancial con la secuencia de la sonda, estos clones se someten entonces a condiciones de astringencia entre moderada y alta con miras a identificar aquellos clones que tienen un nivel particularmente alto de homología con respecto a la secuencia de la sonda. Ejemplos adicionales de condiciones de alta astringencia comprenden una temperatura de hibridación de alrededor de 60ºC a 68ºC utilizando la solución de hibridación anteriormente mencionada.

Con miras a la identificación de los cADN específicos del receptor y proteína receptora para GABA_{B} de acuerdo con la invención, la información de secuencia compilada puede usarse para diseñar un juego de secuencias de iniciador de oligonucleótido degenerado de las regiones más conservadas entre los miembros de la familia del gen. Una mezcla de tales iniciadores de oligonucleótido pueden utilizarse en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para amplificar cADNs o segmentos genómicos de genes rotados de los ya aislados cADNs específicos del receptor y proteína y receptora para GABA_{B}.

Posteriormente, estos segmentos pueden servir como sondas para identificar más clones cADN completos utilizando condiciones de hibridación de alta astringencia. Alternativamente, pueden usarse anticuerpos derivados contra los receptores para GABA_{B} o proteína receptora para GABA_{B} proveída por la presente invención para purificar y secuenciar a los receptores y proteínas receptoras para GABA_{B} relacionados, también reconocidos por los anticuerpos.

El rastreo de bibliotecas con miras a aislar ácidos nucleicos de acuerdo con la invención, puede realizarse además por rastreo de expresión. Tal metodología es conocida por aquellos entrenados en la técnica, por ejemplo, como se expone en Sambrook y colaboradores (Op. Cit.), pero esencialmente comprende la incorporación de clones de ácido nucleico dentro de los vectores de expresión que son luego rastreados utilizando un ligando específico para el producto de proteína deseado. Los ligandos específicos del receptor o proteína receptora para GABA_{B} pueden ser anticuerpos, como se describe más abajo, o agonistas o antagonistas específicos para GABA. Especialmente preferidos son los compuestos tales como CGP 64213, descrito mas abajo.

Como se usa aquí, una sonda oligonucleótida es preferiblemente un ADN entrelazado en forma sencilla o ARN que tiene una secuencia de nucleótidos que incluye entre 10 y 50, preferiblemente entre 15 y 30 y más preferiblemente al menos alrededor de 20 bases contiguas que son lo mismo que (o el complemento de) un número equivalente o mayor de bases contiguas como se expuso en las SEQ ID Nos 1, 3, 5 y 7. Las secuencias de ácidos nucleicos seleccionadas como sondas deben ser de suficiente longitud y suficientemente no ambiguas como para minimizar resultados positivos falsos. Las secuencias de nucleótidos se basan usualmente en secuencias de nucleótidos conservados o altamente homólogos, o regiones del receptor o proteína receptora para GABA_{B}. Los ácidos nucleicos usados como sondas pueden estar degenerados en una o más posiciones. El uso de oligonucleótidos degenerados puede ser de particular importancia en donde una biblioteca se rastrea a partir de especies en las cuales el uso preferencial de un codón en esas especies, no es conocido.

Las regiones preferidas a partir de las cuales se construyen sondas incluyen secuencias de codificación 5' y/o 3', secuencias previstas para codificar sitios de unión de ligandos, y similares. Por ejemplo, pueden utilizarse como sondas ya sean los clones cADN completos descritos aquí o fragmentos de los mismos. Preferiblemente, las sondas de ácido nucleico de la invención se marcan con medios de marcación adecuados para fácil detección por hibridación. Por ejemplo, un medio de marcación adecuado es radiomarcador. El método preferido de marcación de un fragmento de ADN es por incorporación \alpha^{32}P dATP con el fragmento Klenow de ADN polimerasa en una reacción de iniciación aleatoria, como es bien conocido en el estado de la técnica. Los oligonucleótidos usualmente se marcan en un extremo con ATP marcado \gamma^{32}P y quinasa polinucleótida. Sin embargo, también pueden utilizarse otros métodos (por ejemplo, no radioactivos) para marcar al fragmento u oligonucleótido, incluyendo por ejemplo marcación enzimática, marcación fluorescente con fluoroforos adecuados y biotinilación.

Después de rastrear la biblioteca, por ejemplo con una porción de ADN que incluye sustancialmente la totalidad de la secuencia de codificación de proteína del receptor o proteína receptora para GABA_{B}, o un oligonucleótido apropiado basado en una porción de dicho ADN, se identifican clones positivos por detección de una señal de hibridación; los clones identificados se caracterizan por mapeo de enzima de restricción y/o análisis de secuencia de ADN, y luego se examinan, por ejemplo por comparación con las secuencias expuestas aquí, para establecer si ellos incluyen ADN que codifica a un receptor o proteína receptora para GABA_{B} completo (esto es, sí ellos incluyen iniciación de traslado y codones de terminación). Sí los clones seleccionados están incompletos, pueden ser usados para rastrear nuevamente a la misma o a una biblioteca diferente para obtener clones de superposición. Si la biblioteca es genómica, entonces los clones de superposición pueden incluir exones e intrones. Si la biblioteca es una biblioteca de cADN, entonces los clones de superposición incluirán una estructura de lectura abierta. En ambos ejemplos, pueden identificarse clones de receptor de longitud completa por comparación con los ADNs y las secuencias deducidas de aminoácidos que se proveen aquí.

Con miras a detectar cualquier anormalidad del receptor o proteína receptora para GABA_{B} endógena, puede realizarse un rastreo genético utilizando las secuencias de nucleótidos de la invención como sondas de hibridación. También, con base en las secuencias de ácido nucleico que se proveen aquí, pueden diseñarse agentes terapéuticos del tipo antisentido. En una referencia particular de ello, se observa que los oligonucleótidos antisentido se basan en sondas de oligonucleótido como se definió aquí antes, y se incluyo dentro de la definición de las mismas. Tales oligonucleótidos, especialmente pero no solamente cuando se pretenden para ser usados como agente terapéuticos antisentido, pueden comprender modificaciones del oligonucleótido, como por ejemplo por incorporación de análogos de nucleótidos no naturales y modificaciones de oligonucleótidos naturales. Por ejemplo, los oligonucleótidos pueden abarcar un soporte principal alterado, por ejemplo en la forma de un fosforotioato, modificaciones tales como modificaciones 2'-O-metilo, o pueden estar en forma de ácidos nucleicos de péptido.

Se prevé que los ácidos nucleicos de la invención pueden ser fácilmente modificados por sustitución de nucleótidos, supresión de nucleótidos, inserción de nucleótidos o inversión de una extensión de nucleótido y cualquier combinación de los mismos. Tales mutaciones pueden utilizarse para producir un mutante de receptor o proteína receptora para GABA_{B} que tenga una secuencia de aminoácido diferente de las secuencias del receptor o proteína receptora para GABA_{B} como se describe aquí o como se encuentra en la naturaleza. La mutagénesis puede predeterminarse (especificación del sitio) o en forma aleatoria. Una mutación que no sea una mutación silenciosa no debe ubicar secuencias por fuera de las estructuras de lectura y preferiblemente no creara regiones complementarias que pudieran hibridarse para producir una estructura de mARN secundaria tales como anillos u horquillas.

En aún otro aspecto de la invención los ácidos nucleicos son moléculas de ADN y comprenden además un vector replicable que comprende al ácido nucleico que codifica al receptor o proteína receptora para GABA_{B} enlazados operativamente para controlar las secuencias reconocidas por un huésped transformado por el vector. Como se lo usa aquí, vector (o plásmido) se refiere a elementos discretos que se utilizan para introducir ADN heterólogo dentro de células ya sea para expresión o replicación de las mismas. La selección y el uso de tales vehículos es una materia rutinaria para la persona normalmente entrenada en la técnica y se describe, por ejemplo, en Sambrook y colaboradores, (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second edition, Cold Spring Harvor Laboratory Press. Muchos vectores están disponibles, y la selección del vector apropiado dependerá del uso que se pretenda del vector, esto es si va a ser utilizado para amplificación de ADN o para expresión de ADN, el tamaño del ADN que va a ser introducido dentro del vector, y la célula huésped que va a ser transformada con el vector. Cada vector contiene diferentes componentes dependiendo de su función (amplificación de ADN o expresión de ADN) y la célula huésped para la cual es compatible. Los componentes del vector generalmente incluyen, pero no se limitan a uno o más de los siguientes: un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un elemento mejorador, un promotor, una secuencia de terminación de transcripción y una secuencia de señal.

Convenientemente, un vector de expresión eucariota que codifica un receptor o proteína receptora para GABA_{B} comprenderá una región de control del locus (LCR). Los LCR son capaces de dirigir la expresión independiente del sitio de integración de alto nivel de los transgenes integrados dentro de la cromatina de la célula huésped, que es especialmente importante donde el gen del receptor o proteína receptora para GABA_{B} se expresa en el contexto de una línea celular eucariota transfectada permanentemente en la cual ha ocurrido la integración cromosómica del vector, y en vectores diseñados para aplicaciones de terapia génica o en animales transgénicos.

Los vectores apropiados para expresión en células huésped eucariotas incluyendo células de levaduras, hongos, insectos, plantas, animales, humanos o nucleadas de otros organismos multicelulares, contendrán también las secuencias necesarias para la terminación de la transcripción y para estabilizar al mARN. Tales secuencias están comúnmente disponibles a partir de las regiones no trasladadas 5' y 3' de los ADNs eucariotas o virales o cADNs.

Además, la invención provee células huésped transformadas con tal vector y un método para utilizar un ácido nucleico que codifica a un receptor o proteína receptora para GABA_{B} de acuerdo con la invención para producir tal receptor o proteína receptora para GABA_{B}, que comprende expresar un ácido nucleico específico del receptor o proteína receptora para GABA_{B} en un cultivo de las células huésped transformadas y, si se desea, recuperar el receptor o proteína receptora para GABA_{B} a partir del cultivo de célula huésped. De acuerdo con otra modalidad de la presente invención, se proveen células que contienen los ácidos nucleicos anteriormente descritos. Tales células huésped tales como las procariotas, levaduras y células eucariotas superiores, pueden utilizarse para ADN de replicación y producción del receptor o proteína receptora para GABA_{B}. Las procariotas apropiadas incluyen eubacterias, tales como organismos Gram negativos o Gram positivos, tales como E. coli, por ejemplo hebras DH5a de E.coli K-12, MC1061/P3 y HB101, o bacilos. Otros huéspedes adecuados para vectores que codifican proteína receptora para GABA_{B} incluyen microbios eucariotas tales como hongos filamentosos o levaduras, por ejemplo Saccharomyces cerevisiae. Las células eucariotas superiores incluyen células de insectos y de vertebrados, particularmente células de mamíferos. En años recientes, la propagación de células de vertebrados en cultivos (cultivo de tejidos) se ha convertido en un procedimiento de rutina. Ejemplos de líneas útiles de células huésped de mamíferos son las líneas de células epiteliales o fibroblásticas tales como las células de ovario de hámster chino (CHO), las células COS, las células NIH 3T3, las células HeLa o las células HEK293. Las células huésped ha que se hace referencia en esta descripción, comprenden células en cultivo in vitro, así como también células que se encuentran dentro de un animal huésped.

El ADN puede incorporarse en forma estable dentro de las células o pueden expresarse en forma transitoria usando métodos conocidos en el estado de la técnica, tales como aquellos detallados en Sambrook y colaboradores, Op. Cit., o Ausubel y colaboradores, (1990) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc.

Los polipéptidos de acuerdo con la invención pueden expresarse convenientemente en sistemas de células de insectos, incluidos insectos completos. Las líneas de células de insectos apropiadas para ser utilizadas en el método de la invención incluyen, en principio, cualquier célula de lepidóptero que sea capaz de ser transformada con un vector de expresión y proteínas heterólogas de expresión codificadas de ese modo. En particular, se prefiere el uso de las líneas de células Sf, tales como la línea de células de la Spodoptera frugiperda IPBL-SF-21 AE (Vaughn y colaboradores, (1977) In Vitro, 13, 213-217). La línea de células derivada Sf9 es particularmente preferida. Sin embargo, pueden emplearse otras líneas de células, tales como Triclopusia ni 368 (Kurstack y Marmorosh, (1976) Invertebrate Tissue Culture Applications in Medicine, Biology and Agriculture. Academic Press, New York, USA). Esas líneas de células, así como otras líneas de células de insectos adecuadas para usarse en la invención, están disponibles comercialmente (por ejemplo, con Stratagene, La Jolla, CA, USA).

Los vectores de expresión adecuados para usarse en la invención incluye todo los vectores que son capaces de expresar proteínas ajenas en líneas de células de insectos. En general, los vectores que son útiles en mamíferos y en otras células eucariotas, también son aplicables a cultivos de células de insectos. Los vectores de baculovirus, especialmente apropiados para cultivos de células de insectos, son especialmente preferidos y se encuentran comercialmente ampliamente disponibles (por ejemplo, con Invitrogen and Clontech). Se conocen otros vectores de virus capaces de infectar células de insectos, tales como Sindbis virus (Hahn y colaboradores, (1992) PNAS (USA) 89, 2679-2683). El vector baculovirus de escogencia (revisado por Miller (1988) Ann. Rev. Microbiol. 42, 177-199) es el virus polihedrosis multinuclear Autographa californica, AcMNPV.

Los ácidos nucleicos y/o proteínas de acuerdo con la invención pueden usarse en métodos para rastrear compuestos de mezclas de compuestos que son moduladores potenciales de receptores para GABA_{B}, y por lo tanto agentes farmacológicos potenciales. Por ejemplo, las células transformadas con un gen codifican un receptor o proteína receptora para GABA_{B} pueden utilizarse en un ensayo de rastreo con base en células, en las cuales se hace seguimiento a la respuesta de la célula a los agentes que son analizados. La respuesta puede ser en la forma de la activación de un gen reportero, un cambio farmacológico o electrofisiológico medible, o similares. Alternativamente, los receptores y proteínas receptoras para GABA_{B} purificados de acuerdo con la invención, pueden usarse en ensayos in vitro para rastrear a los moduladores de actividad del receptor para GABA_{B}.

Igualmente, los compuestos que son capaces de modular la expresión de los genes del receptor para GABA_{B}, regulando así la actividad del receptor para GABA_{B}, pueden rastrearse utilizando un sistema de expresión en el cual un gen de prueba (que puede ser por sí mismo uno de los genes del receptor para GABA_{B}) esta ligado operativamente a las secuencias de control normalmente asociadas con el gen del receptor para GABA_{B}.

La invención incluye además compuestos identificados por tales ensayos de rastreo, y el uso de tales compuestos para el tratamiento de condiciones que son susceptibles de tratamiento por modulación del receptor para GABA_{B} como se ejemplificó antes.

De acuerdo con aún otra modalidad de la presente invención, se proveen anticuerpos específicamente para reconocimiento y unión a uno o más de los receptores y proteínas receptoras para GABA_{B} de la invención. Por ejemplo, tales anticuerpos pueden generarse contra los receptores para GABA_{B} que tienen las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEQ ID Nos. 2 y 8. Alternativamente, las proteínas del receptor para GABA_{B} como se exponen en las SEQ ID Nos. 4 y 6 o los fragmentos de proteína del receptor para GABA_{B} (que pueden también ser sintetizados por métodos in vitro) se fusionan (por expresión recombinante o un enlace peptidilo in vitro) a un polipéptido inmunogénico y este polipéptido de fusión, a su vez, se usa para elevar los anticuerpos contra un epítopo de proteína del receptor para GABA_{B}.

Los anticuerpos del receptor o proteína receptora para anti GABA_{B} pueden recuperarse a partir del suero de los animales inmunizados. Los anticuerpos monoclonales pueden prepararse a partir de células de animales inmunizados en la forma convencional.

Los anticuerpos de la invención son útiles para estudiar la localización de proteína del receptor para GABA_{B}, rastreando una biblioteca de expresión para identificar a los ácidos nucleicos que codifican a los receptores y proteínas receptoras para GABA_{B}, o la estructura de los dominios funcionales, así como también para la purificación de los receptores y proteínas receptoras para GABA_{B}, y similares.

Los anticuerpos de acuerdo a la invención pueden ser anticuerpos enteros de clases naturales, tales como anticuerpos IgE e IgM, pero son preferiblemente anticuerpos IgG. Además, la invención incluye fragmentos de anticuerpo, tales como Fab, F (ab')_{2}, Fv y ScFv. Los fragmentos pequeños, tales como Fv y ScFv, poseen propiedades convenientes para aplicaciones de diagnóstico y terapéuticas gracias a su pequeño tamaño y consiguiente distribución superior en el tejido.

Los anticuerpos de acuerdo a la invención pueden usarse en aplicaciones de diagnóstico y terapéuticas. Por lo tanto, pueden ser anticuerpos alterados que comprenden una proteína efectora tal como una toxina o un marcador. Especialmente preferidos son los marcadores que permiten la representación de la distribución del anticuerpo in vivo. Tales marcadores pueden ser marcadores radioactivos o marcadores radioopacos, tales como partículas metálicas, que son fácilmente observables dentro de un organismo. Además, pueden ser marcadores fluorescentes u otros marcadores que sean observables en muestras de tejido removidas de organismos.

Puede usarse tecnología de ADN recombinante para mejorar los anticuerpos de la invención. Por lo tanto, pueden construirse anticuerpos quiméricos con miras a disminuir la inmunogenicidad de los mismos en aplicaciones diagnósticas o terapéuticas. Además, la inmunogenicidad puede minimizarse humanizando los anticuerpos por transplante CDR [ver la solicitud de patente europea 0 239 400 (Winter)] y, opcionalmente, modificación de estructura [ver EP 0 239 400 y Riechmann y colaboradores, Nature, 322, 323-327, 1998].

Los anticuerpos de acuerdo a la invención pueden obtenerse a partir de suero animal, o, en el caso de los anticuerpos monoclonales o fragmentos de los mismos, producidos en cultivos de células. La tecnología de ADN recombinante puede usarse para producir los anticuerpos de acuerdo al procedimiento establecido, en bacterias o preferiblemente cultivos de células de mamíferos. Los sistemas de cultivos de células seleccionados, secretan preferiblemente el producto del anticuerpo.

Por lo tanto, la presente invención incluye un proceso para la producción de un anticuerpo de acuerdo a la invención que comprende cultivar un huésped, por ejemplo, E. coli o células de mamífero, que han sido transformadas con un vector híbrido que comprende un casete de expresión que comprende un promotor operativamente ligado a la primera secuencia de ADN que codifica un péptido señalador enlazado en la estructura de lectura propiamente dicha a una segunda secuencia de ADN que codifica a dicha proteína, y que aísla a dicha proteína.

La invención concierne además a células hibridoma que secretan los anticuerpos monoclonales de la invención. Las células hibridoma preferidas de la invención son genéticamente estables, secretan anticuerpos monoclonales de la invención de los específicamente deseados y pueden activarse a partir de cultivos en plena congelación por descongelación y nueva clonación.

La invención también tiene que ver con un proceso para la preparación de una línea de célula hibridoma que secreta anticuerpos monoclonales dirigidos a un receptor o proteína receptora para GABA_{B}, caracterizada porque un mamífero adecuado, por ejemplo un ratón Balb/c, se inmuniza con receptor o proteína receptora para GABA_{B} purificado, un portador antigénico que contiene un receptor o proteína receptora para GABA_{B} purificado, o con células que se comportan como receptoras o proteína receptora para GABA_{B}, células que producen anticuerpos de los mamíferos inmunizados se fusionan con células de una línea celular apropiada de mieloma, las células híbridas obtenidas en la fusión se clonan, y se seleccionan los clones de las células que secretan los anticuerpos deseados. Por ejemplo, las células de bazo de ratones Balb/c inmunizados con células que se comportan como receptoras o proteína receptora para GABA_{B}, se fusionan con las células de la línea de células de mieloma PAI, o la línea de células de mieloma Sp2/0-Ag14, las células obtenidas de híbrido se rastrean por la secreción de los anticuerpos deseados, y las células con hibridoma positivo se clonan.

La invención también tiene que ver con los ADNs recombinantes que comprenden un inserto que codifica para un dominio variable de cadena pesada y/o un dominio variable de cadena liviana de anticuerpos dirigidos al dominio extracelular del receptor o proteína receptora para GABA_{B} como se describió antes. Por definición, tales ADNs comprenden codificar ADNs entrelazados en forma sencilla, ADNs entrelazados en forma doble que consisten de dichos ADNs que codifican y de ADNs complementarios de los mismos, o los ADNs complementarios por si mismos (enlazados en forma sencilla).

La invención también provee un mamífero transgénico no humano que ha sido modificado para modular la expresión del receptor o proteína receptora para GABA_{B} endógeno. Preferiblemente, el mamífero transgénico no humano es un ratón transgénico. Por ejemplo, por lo tanto, un ratón transgénico puede diseñarse de tal forma que la producción del receptor o proteína receptora para GABA_{B} sea grandemente reducida o eliminada, de acuerdo con los procedimientos establecidos en el estado de la técnica (Mansour y colaboradores, Nature 336, 348-352, 1988). Alternativamente, el ratón transgénico de la invención puede expresar elevados niveles de receptor o proteína receptora para GABA_{B}, o puede ser sometida a regulación de la expresión del receptor o proteína receptora para GABA_{B} en forma desarrollada o para un tejido específico, o por medio de control por agentes exógenos. El estudio de tal animal proporciona una idea de la importancia de los receptores y proteínas receptoras para GABA_{B} in vivo.

La invención se describe más abajo en los siguientes Ejemplos, solamente para los propósitos de ilustración.

Ejemplo de Referencia 1

Síntesis del ligando CGP64213

El radioligando [^{125}I]CGP64213, que es utilizado para visualizar a los receptores para GABA_{B} expresados en las células COS, se sintetiza de acuerdo con el Esquema 1, usando los siguientes reactivos y condiciones:

(1): NaH, THF, rt, 3 h; 5-bromovaleronitrilo, rt, 16 h; (2) Niquel Raney, NH_{3} al 4% en EtOH, 45ºC, 16 h; (3) N-etoxi-carbonilftalimida, Na_{2}CO_{3}, H_{2}O, CH_{2}Cl_{2}, rt, 5 h; (4) Me_{3}SiCl, EtOH, CH_{2}Cl_{2}(1:9), rt, 17 h; (5) Me_{3}SiCl, Et_{3}N, THF, rt, 17 h; (R)-epiclorohidrina, 10 mol% ZnCl_{2} THF, 80ºC, 17 h; HOAC, MeOH, rt, 17 h; (6) i-Pr_{2}EtN, EtOH, 80ºC, 7 d; (7) LiOH, EtOH, H_{2}O (1:1), 100ºC, 17 h; MeOH, H_{3}PO_{4}; (8) HCl conc., 100ºC, 17 h; (9) i-Pr_{2}EtN, DMF, rt, 72 h; (10) Na^{125}I, solución amortiguadora de fosfato pH 7,4, H_{2}O_{2}, cat. Lactoperoxidasa, 30 min, RP-HPLC.

El etil (1,1-dietoxietil)fosfinato 1, preparado de acuerdo con Froestl, W. Y colaboradores, J. Med. Chem. (1995), 38, 3297-3312, a partir de ácido fosfónico y trietilortoacetato, catalizado con boro trifluoruro dietil etearato, se condensa con 5-bromovaleronitrilo para dar el aceitoso ciano derivado 2 (p.e. 164ºC a 0,13 mbar), que es hidrogenado sobre níquel Raney en etanol que contiene amoníaco al 4% para dar una amina primaria 3 (p.e. 150-160ºC a 10^{-4} mbar; temperatura del baño Kugelrohr). El grupo amino en 3 se protege como ftalimida para dar 4, que se desprotege ahora en la fracción del ácido fosfónico bajo condiciones muy suaves para dar el éster del ácido fosfónico monosustituido 5. Por reacción con trimetilclorosilano, el éster fosfinato penta valente 5 se convierte en un fosfonito siliado muy reactivo, que reacciona fácilmente con (R)-epiclorohidrina con catalizador cloruro de zinc, para producir clorohidrina 7. La condensación con 1-(R)-(+)-(3-cianofenil)-etilamina 8, que se prepara así misma por resolución de la (3-ciano-fenil)-etilamina racémica con N-acetil-L-leucina para separar la 1-(S)-(+)-(3-cianofenil)-etilamina (de acuerdo con Pickard y colaboradores, J. Amer. Chem.Soc. (1990) 112, 5741-5747) y tratamiento del licor madre restante con (-)-ácido canfánico seguido por tres cristalizaciones, da el éster de nitrilo aromático 9, que se hidroliza al derivado del ácido meta-benzóico 10 con hidróxido de litio. Ocurre la hidrólisis concomitante del éster fosfinato de etilo. El grupo protector ftalamida se remueve por ebullición con ácido clorhídrico concentrado durante la noche para dar el intermediario clave CGP57604A, el clorhidrato del ácido ([3-[1-(R)-[[3-(5-aminopentil)-hidroxifosfinil]-2-(S)-hidroxipropil]amino]-etil]-benzóico). Éste reacciona con el reactivo comercialmente disponible N-hidroxisuccinimidil-3-(4-hidroxipentil)-propionato 11 en DMF usando base de Hünig para dar el intermediario 12, que se yoda con yoduro de sodio (isótopo 125) usando peróxido de hidrógeno y cantidades catalíticas de lactoperoxidasa para dar el ligando reactivo [^{125}I]CGP 64213.

\newpage

Esquema 1

5

El ligando no marcado CGP 64213 se prepara en una forma ligeramente diferente: el ácido 3-(4-hidroxi-5-yodofenil) propiónico 13 se prepara por yodación del ácido 3-(4-hidroxi-fenil) propiónico de acuerdo con Runeberg, J., Acta Chem. Scand. (1958), 12, 188-91. El N-hidroxi-succinimidil-3-(4-hidroxi-5-yodofenil)propionato 14 (p.f.: 191-4ºC) se prepara de acuerdo con el Esquema 2 con un rendimiento del 73%. La condensación de CGP 57604ª (Esquema 1) con 14 usando base de Hünig en DMF a temperatura ambiente durante 72 horas procedió como la reacción 9 del Esquema 1 para dar CGP 64213 no reactivo (p.f: 170-5ºC, cristalizado a partir de acetona) con un rendimiento del 53%.

Esquema 2^{a}

6

^{a} Reactivos y condiciones: N-hidroxisuccinimida, DCC, dioxano, rt, 16 h.

Caracterización del radioligando [^{125}I]CGP 64213 Preparación de membranas sinápticas a partir de corteza cerebral de rata

Se usan veinte ratas macho [Tif: RAI f (SPF)] de alrededor de 200 g de peso corporal. Los animales se decapitan, se remueven los cerebros, las cortezas cerebrales se diseccionan y homogenizan en 10 volúmenes de hielo enfriado con sacarosa 0,32 M, que contienen MgCl_{2} (1 mM), con un homogenizador de vidrio/Teflón. Las membranas se centrifugan a 100 x g durante 15 min, los gránulos se resuspenden y se repite la centrifugación. Los sobrenadantes se reúnen y se centrifugan a 20.000 x g durante 15 min. El gránulo se sacude osmóticamente por resuspensión en 10 volúmenes de H_{2}O y se mantiene en hielo durante 30 min. La suspensión se centrífuga a 39000 x g, se resuspende en solución amortiguadora de Krebs-Henseleit (Tris 20 mM, pH 7,4, NaCl 118 mM, glucosa 5,6 mM, KH_{2}PO_{4} 1,2 mM, MgSO_{4} 1,2 mM, KCl 4,7 mM, CaCl_{2} 1,8 mM), y se mantiene durante 2 días a -20ºC. Las membranas se deshielan a temperatura ambiente, se lavan tres veces con solución amortiguadora de Krebs-Henseleit por centrifugación a 20.000 x g durante 15 min, se deja durante la noche a 4ºC y se lava nuevamente tres veces. El gránulo final se resuspende con homogenizador de vidrio/Teflón en 20 ml de la misma solución amortiguadora. Alícuotas de 2 ml se congelan y se almacenan en nitrógeno líquido. Justo antes de usarse, las membranas se deshielan rápidamente en baño de agua a 37ºC
y se lavan nuevamente por centrifugación a 20.000 x g durante 15 min con la misma solución amortiguadora tres veces.

Ensayo de unión y caracterización del radioligando

La incubación con [^{125}I]CGP 64213, radioactividad específica para material fresco 2000 Ci/mmol, se realiza en 0,2 ml de solución amortiguadora Tris-Krebs-Henseleit, pH 7,4, a 20ºC durante 90 minutos con 50 \mug de proteína de membrana de corteza como sustrato. La incubación se termina por filtración a través de filtros Whatman GF/B de fibra de vidrio. La unión no específica se define por CGP 54626A 10^{-6} M y es un 5% de la unión total a una concentración de 2 nM. En experimentos de saturación con incremento de las concentraciones de [^{125}I]CGP 64213 y con un ajuste no lineal por mínimos cuadrados, se determina una constante de disociación K_{D} de 2,66 nM. En estudios de inhibición a una concentración de [^{125}I]CGP 64213 de 0,1 nM, el L-baclofen mostró una constante de inhibición de K_{i} de 442 nM y el antagonista CGP 54626 A, una K_{i} de 2,5 nM en buena concordancia con las K_{i}' obtenidas con otros radioligandos antagonistas del receptor para GABA_{B}. Se encontró que el ligando no marcado CGP 64213 es inactivo a una concentración de 1 \muM en ensayos de receptores para GABA_{B}, benzodiazepina, kainato, AMPA, NMDA, para el sitio independiente de unión de la estricnina en los receptores para NMDA, receptores para colinérgicos muscarinicos, adrenérgicos \alpha_{1}- y \alpha_{2}-, \beta-adrenérgicos, 5HT_{1}, 5HT_{2}, 5HT_{3}, histamina_{1}, histamina_{2}, adenosina_{1}, \mu-opiato y sustancia P. El compuesto es por lo tanto selectivo para receptores para GABA_{B}. A una concentraciones de 0,1 nM de [^{125}I]CGP 64213 se miden las cinéticas de asociación y disociación. El tiempo medio de asociación es de 20 min a 20ºC y el tiempo medio de disociación de 40 min. El tiempo medio de disociación se incrementa a 4 horas por reducción de la temperatura a 4ºC. Esta velocidad disminuida y la radioactividad altamente específica de [^{125}I]CGP 64213 permiten estudios
autoradiográficos de la unión del receptor en células COS como sistemas de expresión para receptores para GABA_{B}.

Ejemplo de Referencia 2

Preparación del ligando de fotoafinidad

El ligando de fotoafinidad [^{125}I]CGP 71872, que se usa para marcar a los receptores para GABA_{B} de las membranas de la corteza de rata y los receptores para GABA_{B} recombinante expresados en la células COS, se sintetiza de acuerdo con el Esquema 3: se condensa el reactivo comercialmente disponible N-hidroxi-succinimidil-4-azidosalicilato 15 con CGP 57604A para dar el intermediario 16, que es yodado con el isótopo 125 del yoduro de sodio usando cloramina T para dar una mezcla aproximadamente 1:1 del derivado 5-yodo de [^{125}I]CGP 71872 y el derivado 3-yodo de [^{125}I]CGP 72565. Ellos se separan por medio de HPLC en fase reversa sobre una columna Vydac 218TP54 (tiempos de retención: 16,4 y 17,4 minutos, respectivamente). Los reactivos y las condiciones son las siguientes:

(1) CGP 57604A (Esquema 1), i-Pr_{2}EtN, DMF, rt, 70 h; (2) Na^{125}I, cloramina T, NaOH 0,01 N, rt, 1 h; RP-HPLC.

Esquema 3

7

El ligando no marcado CGP 71872 se prepara en una forma diferente: el N-hidroxi-succinimidil-4-azido-5-yodo-salicilato 17 se prepara por yodación del ácido 4-azidosalicílico y subsiguiente condensación con N-hidroxi-succinimida (Esquema 4). La condensación de 17 con CGP 57604A (ver Esquema 1, reacción 9) procedió con un rendimiento del 57% para dar CGP 71872 no reactivo (p.f: >190ºC dec.).

Reactivos y condiciones como sigue: (1) NaI, NaHO 2N, cloramina T, rt, 88 h; (2) N-hidroxisuccinimida, DCC, dioxano, rt, 16 h;

Esquema 4

8

Caracterización del ligando de fotoafinidad [^{125}I]CGP 71872 Ensayo de unión y caracterización del ligando

Se utilizan como sustrato las membranas de la corteza de rata como se describe para el ensayo de [^{125}I]CGP 64213. Se realiza la incubación con [^{125}I]CGP 71872, radioactividad específica de material fresco 2000Ci/mmol, en 0,2 ml de solución amortiguadora de Krebs-Henseleit, pH 7,4, a 20ºC durante 90 min con 50 \mug de proteína de membrana como sustrato. La incubación se termina por filtración a través de filtros Whatman GF/B de fibra de vidrio. La unión no específica se define por CGP 54626A 10^{-6} M y es un 5% de la unión total a una concentración de 2 nM de [^{125}I]CGP 71872. En experimentos de saturación con incremento de las concentraciones de [^{125}I]CGP 71872 y con un ajuste no lineal por mínimos cuadrados, se calcula una constante de disociación K_{D} de 3,1 nM. En experimentos de inhibición el L-baclofen mostró una K_{i} de 340 nM y el antagonista CGP 54 626 A mostró una K_{i} de 3,1 nM. Se encuentra que el ligando no marcado CGP 64213 es inactivo a una concentración de 1 \muM en el mismo ensayo del receptor como se describió para [^{125}I]CGP 64213 y es, por lo tanto, también selectivo para los receptores para GABA_{B}. A una concentración de 2 nM y 20ºC, el tiempo medio para asociación es de 5 min, el tiempo medio de disociación de 10 min. El tiempo de disociación a 8ºC es mucho más largo. Solamente 25% de los radioligandos se disocian después de 120 min.

Marcación por fotoafinidad de membranas

Las membranas de la corteza cerebral de ratas y de células COS1 transfectadas en forma transciente con cADN de rata para GABA_{B}R1a y GABA_{B}R1b, respectivamente, se suspendieron en solución amortiguadora Tris-Krebs-Henseleit, Ph 7,3, a una concentración de 4 mg de proteína/ml, se incubaron el la oscuridad con [^{125}I]CGP 71872 0,6 nM durante una hora a temperatura ambiente. La incubación se termina por centrifugación a 20.000 x g durante 10 min a 4ºC. Esta etapa remueve al marcador de fotoafinidad no enlazado. Bajo estas condiciones, alrededor del 50% de la reactividad total usada se unió a los receptores. El gránulo se resuspende a una concentración de 4 mg de proteína/ml en un vial de polietileno y se ilumina con luz UV(365 nm) durante 3 min (24 W). La suspensión se centrífuga a 20.000 x g durante 10 min y se resuspende a una concentración de 8 mg/ml de proteína en solución amortiguadora. Cuando la marcación se lleva a cabo en presencia de un exceso de antagonista del receptor para GABA_{B} no marcado (MCGP 54626A 10^{-6} M) no se enlaza reactividad a las membranas. Las membranas marcadas pueden almacenarse a -80ºC. Los resultados se muestran en las Figuras 1a y 1b.

Adicionalmente, la marcación por fotoafinidad con [^{125}I]CGP 71872 de las células de las membranas de la corteza, el cerebelo y la espina dorsal, se analiza como se reseñó arriba y revela que las dos variantes R1a y R1b de la proteína para GABA_{B} se expresan diferencialmente en el sistema nervioso. En el cerebelo, la proteína de 100K está predominantemente por encima de la proteína de 130K, mientras que en la espina dorsal la proteína de 130K prevalece más. En un tejido de la corteza, ambas proteínas aparecen con igual abundancia. Ninguna proteína se marca en tejidos tales como hígado y riñón que se espera que carezcan de receptores para GABA_{B} y por lo tanto, han sido usados como controles (ver Figura 4a).

Además, los receptores para GABA_{B} nativo se marcan por fotoafinidad en presencia de varias sustancias competidoras indicadas en la Figura 4b. Ni los ligandos selectivos para GABA_{B}, muscimol y bicuculina, ni el ácido cis-aminocrotónico (CACA) agonista del receptor para GABA_{B} o el inhibidor del sistema de consumo para GABA, SK&F89976A (Zuiderwijk, M., Veenstra, E., López Da Silva, F. H. & Ghijsen, W. E. J. M. Efectos de los bloqueadores portadores de consumo SK&F89976-A y L-trans-PDC, sobre la liberación in vivo de aminoácidos en el hipocampo de la rata. Eur. J. Pharmacol. 307, 275-282 (1996)), compiten significativamente por unir al radioligando. En contraste, los GABA agonistas del receptor para GABA_{B}, APPA (ácido 3-aminopropil-fosfínico) y L-Baclofen compiten con [^{125}I]CGP 71872 por ligarse. Como otro criterio conocido, L-baclofen compite más potentemente que D-baclofen. Los antagonistas del receptor para GABA_{B} CGP54626A, CGP35348, y el ligando de fotoafinidad no reactivo también son efectivos desplazadores de [^{125}I]CGP 71872 en los receptores nativos. Para todos los ligandos analizados, no hay una diferencia visible en el desplazamiento de [^{125}I]CGP 71872 por las proteínas 130K y 100K, indicando un enlazamiento farmacológicamente cualitativamente similar para los dos receptores.

Los receptores para GABA_{B} nativo están N-glicosilados, como se muestra por la reducción en el peso molecular a 110K y 90K, respectivamente, después de la descomposición con N-glicosidasa F (Fig. 4c). No se detecta un desplazamiento significativo en peso molecular después del tratamiento enzimático con O-glicosidasa (Fig. 4c). Las proteínas marcadas por fotoafinidad de 130K y 100K se detectan en tejidos de todas las especies de vertebrados analizados, incluido el pez cebra (Fig. 4d), indicando que las dos proteínas y sus sitios de enlazamiento de antagonistas están altamente conservados. Las proteínas de los receptores avícolas para GABA_{B} exhiben pesos moleculares ligeramente mayores que en otras especies, posiblemente reflejando las diferencias en glicosilación y/o empalme del ARN. El no-enlazamiento del ligando de fotoafinidad a cualquier proteína puede detectarse en la Drosophila melanogaster de la fruta y en el nematodo Haemonchus concortus.

Ejemplo de Referencia 3

Síntesis del ligando antagonista para GABA_{B} CGP 54626A

El ligando usado para experimentos de desplazamiento, CGP 54626A, se sintetiza de acuerdo con el Esquema 5:

Esquema 5^{a}

9

: ^{a} Reactivos y condiciones: (1) NaH, THF, rt, 3 h; bromometilciclohexano, reflujo, 24 h; (2) Me_{3}SiCl, EtOH, CH_{2}Cl_{2} (1:9), rt, 24 h; (3) Me_{3}SiCl, Et_{3}N, THF, rt, 24 h; (R)-epiclorohidrina, 10 mol% ZnCl_{2} THF, 80ºC, 17 h; HOAC, MeOH, rt, 17 h; (4) i-Pr_{2}EtN, EtOH, 80ºC, 7 d; (5) HCl conc., 100ºC, 24 h.

El etil (1,1-dietoxietil)fosfinato 1, preparado de acuerdo con Froestl y colaboradores, J. Med. Chem. (1995), 38, 3297-3312, a partir de ácido fosfónico y trietilortoacetato catalizado por boro trifluoruro dietiletearato, se condensa con bromometilciclohexano para dar el derivado aceitoso 18 (p.e. 85ºC a 6 x 10^{-4} mbar), que se desprotege por la fracción del ácido fosfónico bajo condiciones muy suaves para dar el éster del ácido fosfónico monosustituido 19 (p.e. 50ºC a 3 x 10^{-4} mbar). Por reacción con trimetilclorosilano, el éster fosfinato penta valente 19 se convierte en un fosfonito etil trivalente muy reactivo, que reacciona rápidamente con (R)-epiclorohidrina 6 cuando es catalizado con cloruro de zinc para producir clorohidrina 20. La condensación con 1-(S)-(-)-(3,4-diclorofenil)-etilamina 21, preparada por resolución de la 1-(3,4-diclorofenil)-etilamina racémica con (+)-ácido mandélico de acuerdo con Mickel, EP 543780 A2, produjo la correspondiente amina secundaria 22 como una mezcla 1:1 de diasteroisómeros, que se hidrolizan por ebullición con ácido clorhídrico concentrado para dar CGP 54626A.

[^{3}H] CGP54626A se prepara en forma análoga (Esquema 6) por condensación de etil (1,1-dietoxietil) fosfinato 1 con bromuro de 3,4-dehidro-ciclohexilmetil (preparado de acuerdo con Yadav y Fallis, (1991) Can. J. Chem. 69, 779-789), preparación del correspondiente 3,4-dehidroderivado de CGP 54626A, esto es, CGP 54951A, el cual es tritiado bajo condiciones muy cuidadosamente controladas para dar [^{3}H] CGP54626A. El compuesto es el primer radioligando antagonista del receptor para GABA_{B} que fue caracterizado por Bittiger y colaboradores, Pharmacol. Común (1992), 2, 23.

Esquema 6^{a}

10

: ^{a} Reactivos y condiciones: (1) NaH, THF, rt, 3 h; 3-4-dehidrobromo-metilciclohexano, reflujo, 24 h; (2) Me_{3}SiCl, EtOH, CH_{2}Cl_{2} (1:9), rt, 24 h; (3) Me_{3}SiCl, Et_{3}N, THF, rt, 24 h; (R)-epiclorohidrina, 10 mol% ZnCl_{2} THF, 80ºC, 17 h; HOAC, MeOH, rt, 17 h; (4) i-Pr_{2}EtN, EtOH, 80ºC, 4 d; (5) LiOH, EtOH, H_{2}O, 100ºC, 17 h; HCl, MeOH, rt, 1 h; (6) ^{3}H_{2}, 5% Pd/C, HCl, MeOH, pH = 1, rt, 15 min, prep. TLC.

Ejemplo 4 Prueba de la actividad funcional del CGP 64213 y CGP 71872 como antagonistas del receptor para GABA_{B} por medio de mediciones electrofisiológicas in vitro

Los experimentos se realizan sobre rebanadas de hipocampo con espesor de 400 \mum obtenidas ya sea de ratas hembra COB Wistar (3-4 semanas de edad) o ratas macho Tif: RAI f (SPF) usando técnicas estándar. En resumen, las ratas se dislocan cervicalmente antes de la decapitación. El cerebro menos el cerebelo se remueven rápidamente y se coloca en fluido cerebro espinal artificial enfriado con hielo (ACSF). El hipocampo se aísla cuidadosamente y, utilizando un cuchilla para tejido (Sorvall®) o un rebanador por vibración (Campden), se cortan rebanadas en forma transversal con espesor de 400 \mum. La región CA3 de cada rebanada se remueve por medio de un corte con escapelo. Este procedimiento se lleva a cabo para eliminar los cambios en función de la red que puedan ocurrir debido a una forma epiléptica de rompimiento en el área CA3. Las rebanadas resultantes CA3 escindidas quirúrgicamente se colocan sobre un tamiz de nylon en la interfase de un ACSF de perfusión (1-2 ml. min^{-1}), calentado (32ºC), y una atmósfera humidificada enriquecida con oxígeno (O_{2} al 95%, CO_{2} al 5%). El medio de perfusión estándar comprende (mM): NaCl, 124; KCl, 3; NaHCO_{3}, 26; NaH_{2}PO_{4}, 1,25; CaCl_{2}, 2; MgSO_{4}, 1; D-glucosa, 10; y se le burbujea con O_{2} al 95%, CO_{2} al 5%. Se utiliza un amplificador Axosonda o un amplificador Axoabrazadera-2 (Axon Instruments, Foster City, CA, USA) en modo de puente para hacer registros extracelulares ya sea desde stratum radiatum o stratum oriens usando microeléctrodos rellenos con NaCl 4 M (2-5 M\Omega). Los registros intracelulares se hacen utilizando microeléctrodos rellenos con metil sulfato de potasio 2 M (60-100 M\Omega). Los registros digitalizados se almacenan en el disco duro de un PC compatible con IBM para los análisis fuera de línea. Los eléctrodos de estimulación bipolar, elaborados con alambre de níquel-cromo aislado de 55 \mum de diámetro, se ubican en stratum radiatum cerca del electrodo de registro colocado ya sea en stratum radiatum o en stratum oriens, para proveer una activación monosináptica ortodrómica de las neuronas CA1 (Davies y colaboradores, (1990) Journal of Physiology 424: 513). En cada experimento los estímulos comprenden pulsos de onda cuadrada (20-200 \mus; 5-30 V) enviados homosinápticamente con una intensidad fija. Todas las drogas se administran por medio de perfusión. Los datos se presentan como la media \pm error estándar de la media (S.E.M.) y la significancía estadística se evalúa utilizando pruebas t Student. Los valores de n se refieren al número de veces en que un experimento particular se realiza, cada uno en una rebanada diferente tomada de una rata diferente.

Autoreceptores para GABA_{B}

El ensanchamiento del pulso pareado de campo de los EPSP se utiliza para hacerle seguimiento a los efectos del CGP 71872 y del CGP 64213 sobre los autoreceptores de GABA_{B}. El ensanchamiento del pulso pareado ocurre cuando dos estímulos son enviados a 5-10 Hz (intervalo de ínter estímulos 100-200 ms); un protocolo de estimulación que no libera suficiente GABA para activar a los heteroreceptores para GABA_{B} que causaría, en cualquier caso, una depresión en vez de facilitar al segundo campo EPSP. Este fenómeno también es independiente de los receptores pos sinápticos para GABA_{B} (Nathan y colaboradores (1991) Exp. Brain Res. 84(3) 529-537). Esto, sin embargo, es ocluido por el bloqueo del receptor para GABA_{B} mediado por los IPSP, y es inhibido por los antagonistas del receptor para GABA_{B} en concentraciones que se requieren para bloquear los autoreceptores para GABA_{B} (Nathan y colaboradores (1990), Brain Research 531: 55-65). (Obsérvese que estas concentraciones son 3 a 10 veces más grandes que aquellas necesarias para bloquear a los receptores pos sinápticos para GABA_{B} tanto en las neurona piramidales como en las ínter neuronas inhibitorias determinando un efecto a estos receptores). El ensanchamiento del pulso pareado de campo de los EPSP (fEPSPs) es una medida sensible de la actividad del autoreceptor para GABA_{B}. No existe un precedente para que algún compuesto sea efectivo en este sistema de ensayo y ni en otros ensayos de la actividad del autoreceptor para GABA_{B}, por ejemplo, el pulso pareado o la depresión inducida del (-)-baclofen de los IPSC.

La estimulación del pulso pareado en un intervalo de ínter estímulos de 200 ms causa un consistente ensanchamiento del segundo EPSP con relación al primer EPSP. Por lo tanto, el área bajo la curva del segundo fEPSP es de 247 \pm 17% (en la serie de experimentos con CGP 64213) y de 241 \pm 21% (en la serie de experimentos con CGP 71872) del primer fEPSP, respectivamente. En presencia de CGP 64213 (0,3 \muM; n = 5) y CGP 71872 (1 \muM; n = 3) este ensanchamiento del pulso pareado de los EPSP es abolido indicando la efectividad de esos compuestos como antagonistas de los autoreceptores para GABA_{B}.

Heteroreceptores para GABA_{B}

El efecto de CGP 71872 sobre la depresión del campo de los EPSP inducida por la aplicación del baño de (-)-baclofen, se usa como un ensayo para el efecto de este compuesto sobre los heteroreceptores para GABA_{B} localizados sobre los terminales aferentes del glutamato. Aunque, bajo estas condiciones, el (-)-baclofen activará otras poblaciones de receptores para GABA_{B} (por ejemplo, autoreceptores para GABA_{B} y receptores pos sinápticos para GABA_{B}), además de los heteroreceptores para GABA_{B}, la activación de estos receptores tendería a aumentar el tamaño del campo de ESPS en vez de disminuirlo. Como tal, este método es una medida razonable de la actividad de los heteroreceptores para GABA_{B}. Este método proporciona una forma más confiable y cuantitativamente más repetible para la activación de los heteroreceptores para GABA_{B} que aquel utilizado por Isaacson y colaboradores (1993) Neuron 332: 156-158, ya que no cuenta con el GABA liberado fisiológicamente para activar los heteroreceptores. Este método más moderno es inherentemente variable debido a las diferentes concentraciones de GABA liberado sinápticamente al cual están expuestos los heteroreceptores en diferentes preparaciones; un parámetro que depende del nivel de GABA liberado, la distancia entre el sitio de liberación y el heteroreceptor, y la eficiencia de los sitios de consumo de GABA. Es importante notar, sin embargo, que, hasta la fecha, no se ha documentado discrepancia entre los resultados obtenidos usando estos dos métodos para estudiar los heteroreceptores para GABA_{B} para ningún compuesto analizado.

El (-)-baclofen (10 \muM) no tuvo efectos significativos sobre la andanada de fibras presinápticas del campo de los ESPS (100 \pm 1% de control; P>0,05), registrado en stratum radiatum, pero deprime la pendiente del campo de los EPSP y la amplitud del pico en 65 \pm 6% y 76 \pm 9%, respectivamente (n = 10). La depresión máxima se obtiene después de 5-10 min de perfusión y persiste en este nivel durante la duración de la aplicación del agonista. La adición de CGP 71872 (1 \muM) al medio de perfusión reversó la depresión en cada experimento en el cual se analizó (n = 6; P<0,05). Se obtuvieron resultados similares para el registro de los campos de los EPSP en stratum oriens (n = 3). En rebanadas de cerebro, CGP 71872 no tuvo efecto significativo sobre la amplitud del pico, la pendiente o sobre la andanada de fibras presinápticas del campo de los ESPS registrado en stratum radiatum (n = 4; P>0,05) u oriens (n = 3).

Receptores pos sinápticos para GABA_{B}

El efecto de CGP 71872 sobre el último IPSP aislado farmacológicamente se usa como sistema de prueba para evaluar el efecto de CGP 71872 sobre los receptores pos sinápticos para GABA_{B} localizados sobre las neuronas piramidales CA1. Hay abundante literatura (Froestl y colaboradores (1995) Op. Cit.; Jarolimek y colaboradores (1993) Neuro. Lett. 154: 31-34; Olpe y colaboradores (1990) Clin. Neuropharmacol. 13 Suppl. 2: 396; McCormick, (1990) J. Neurophysiol. 62/5: 1018; Lambert y colaboradores, (1989) Neurosci. Lett 107: 125-128; Soltesz y colaboradores, (1989) Brain Research 479: 49-55; Mueller y Misgeld, (1989) Neurosci. Lett. 102: 229-234; Dutar y Nicoll, (1988) Nature 322: 156-8; Karlsson, Pozza y Olpe, (1988) Eur. J. Pharmacol. 148: 485-486) que indica que este IPSP es mediado por la activación sináptica de los receptores GABA_{B}. Además, este método ha sido utilizado muchas veces en el pasado y los datos generados siempre han sido consistentes con aquellos generados por el antagonismo de hiperpolarizaciones inducidas por (-)-baclofen; una aproximación que también ha sido adoptada como un ensayo para la actividad de los receptores pos sinápticos para GABA_{B}.

El efecto de CGP 71872 se prueba sobre un receptor monosinápticamente activado para GABA_{B} mediado por el último IPSP aislado usando una combinación de los antagonistas del aminoácido excitatorio ionotrópico D-2-amino-5-fosfonopentanoato (AP5; 50 \muM) y 6-ciano-7-nitroquinoxalina-2,3-diona (CNQX; 20 \muM), y la picrotoxina antagonista del receptor para GABA_{B} (50 \muM). En todas las neuronas analizadas, CGP 71872 (1 \muM) abolió al último IPSP (n = 6), indicando que este compuesto es un antagonista de los receptores pos sinápticos para GABA_{B}.

Ejemplo 5 Construcción de la biblioteca de cADN

El ARN se purifica a partir de corteza y cerebelo de ratas de 7 días de edad de acuerdo con Chomczynski, P. & Sacchi, N. (1987) Anal. Biochem. 162, 156-159. El ARN poli A(+) se enriquece por dos pasajes sobre una oligo (dT) columna (Boehringer Mannheim) como lo describen (Maniatis, T., Fritsch, E.F. & Sambrook, J. (1982) Molecular cloning: A laboratory manual (Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, NY). El cADN con entrelazado doble Oligo (dT) cebado, se sintetiza a partir de 5 \mug de ARN poli A(+) utilizando un sistema comercial de síntesis de cADN (Amersham). La transcriptasa reversa suministrada con el juego es reemplazada por la transcriptasa reversa ARNseH(-) Superscript II (Gibco BRL). La solución de cADN se concentra sobre dispositivos Centricon-100 (Amicon), preabsorbidos con tARN, hata un volumen final de 100 \mul. Pequeños cADN se remueven pasándolos través de una columna Chromaspin-1000 (Clontech). Se añaden adaptadores BstXI (Invitrogen) usando ligasa ADN T4 (Boerhinger Mannheim) y los cADN se fraccionan por tamaños sobre un gel de agarosa. Los cADN con tamaños mayores a 2kb se purifican (Qiaex, Qiagen) y se liga dentro de los sitios BstXI del vector de expresión pcADNI (Invitogen). Una alícuota de la mezcla de ligación se transforma (BioRad Gene Pulser II) dentro de células electrocompetentes E. coli MC 1061/P3. Se estima que la complejidad de la biblioteca es de 2 x 10^{6} clones independientes. El tamaño promedio del inserto es deducido a partir del análisis de 48 clones es de 2,9kb (tamaños que van desde 2,0kb hasta 6,6 kb).

Los plásmidos para las transfecciones de células COS1 se aíslan de las colonias de bacterias obtenidas después de la rotación inicial de la transformación de cADN. En resumen, una alícuota de la biblioteca de cADN se transforma en dentro de células electrocompetentes E. coli MC 1061/P3 y se dosifican por cultivo sobre placas de agar. Las bibliotecas de cADN se dividen en reservorios de aproximadamente 2'000 colonias que se cultivan sobre placas de agar de 9 cm y crecen durante la noche a 37ºC. La bacteria se raspa de las placas y el plásmido de ADN se prepara utilizando columnas de intercambio iónico (Qiawell, Qiagen).

Ejemplo 6 Transfección de células COS con cADN

Las células COS1 se obtienen de la American Type Culture Collection (ATCC) y crecen en medio Aguila modificado de Dulbeccos (DMEM) suplementado con suero de ternero fetal (FCS) al 10% y 15 \mug/ml de gentamicina (Gibco BRL) en atmósfera humidificada con CO_{2} al 5%.

El plásmido ADN de los reservorios de colonias bacteriales independientes se introducen dentro de células COS1 utilizando una modificación del procedimiento estándar de transfección DEAE-dextrano. En resumen, un día antes de la transfección, se siembran 7,5 x 10^{5} células por placa de 9 cm. Al día siguiente se remueve el medio y se incuban las células durante 15 minutos en 10 ml de solución amortiguadora salina de fosfato (tabletas PBS, Gibco BRL). Después, el PBS se remueve y se añaden a la placa 4 ml de 1 mg/ml de DEAE-dextrano (Pharmacia) en PBS. Después de 9 min de incubación a temperatura ambiente, las células se lavan cada una dos veces con 5 ml de PBS. El PBS se aspira y se añaden a la placa 4 \mug de ADN de plásmido (derivado de los reservorios de colonias bacteriales independientes) en 540 \mul de PBS y se incuban las células con el ADN durante 30 min a 37ºC con oscilación ocasional. Se añaden enseguida 4 ml de medio DMEM que contiene suero NU al 10% (Collaborative Research) y 80 \muM de cloroquina (Sigma). Después de 4 horas de incubación a 37ºC se remueve el medio y se incuban las células durante 2 min en sulfóxido de dimetilo (Merck) al 10% (vol/vol) en PBS. Las células se lavan con PBS, se añade el medio de cultivo de las células a las placas de cultivo y se las deja crecer durante 2 ó 3 días adicionales.

Ejemplo 7 Identificación del clon receptor para GABA_{B} por ensayo de enlazamiento del ligando

Los reservorios de cADN (2000 clones independientes cada uno) se analizan para la expresión del receptor para GABA_{B}, después de la transfección por transciente dentro de células COS1, usando un ensayo de enlazamiento del radioligando con CGP 64213 yodado (actividad específica 2'000 Ci/mmol).

Las placas de cultivo con células COS1 transfectadas se colocan sobre hielo y se lavan cada una dos veces con 5 ml de solución amortiguadora Tris-Krebs-Henseleit enfriada sobre hielo (Tris-Cl 20 mM de pH 7,4, NaCl 118 mM, glucosa 5,8 mM, KH_{2}PO_{4} 1,2 mM, MgSO_{4} 1,2 mM, KCl 4,7 mM, CaCl_{2} 18 mM). Después se incuban las células con 0,2 nM de ^{125}I-CGP 64213 en solución amortiguadora Tris-Krebs (1 ml de solución por placa de 9 cm). Después de 80 min de incubación a temperatura ambiente, las placas se enfrían sobre hielo y se lavan dos veces durante 5 min con 5 ml de solución amortiguadora Tris-Krebs enfriada sobre hielo. Seguidamente, las placas se secan con aire utilizando un ventilador y se remueven las paredes de las placas. Para la autorradiografía, se expone el fondo de las placas, junto con rastreadores de intensificación, a películas Kodak X-OMAT AR durante 2 ó 3 semanas a 80ºC.

Se rastrearon un total de 640.000 clones independientes (320 reservorios individuales) de la biblioteca de cADN anteriormente mencionada. Un reservorio da una señal positiva en el ensayo de enlazamiento del ligando. El ADN del plásmido de este reservorio es transformado nuevamente dentro de las células electrocompetentes MC 1061/P3. Se prepararon 10 reservorios de plásmido con 500 colonias cada una, dos de los cuales resultaron positivos en el ensayo de enlazamiento. Después de 4 rondas consecutivas de subdivisiones de uno de los dos reservorios (selección SIB; McCormick, M. (1987) Methods Enzymol. 151, 445-449) se identificó un clon sencillo de cADN que contenía un inserto 4376bp. Este primer clon de cADN identificado, originalmente referido como F4, se designó como GABA_{B}R1a (SEQ ID No.1). Este clon cADN abarca una gran codificación de estructura de lectura abierta para una proteína putativa de 960 aminoácidos con un peso molecular calculado de 108kDa (SEQ ID No. 2). De acuerdo con von Heijne (von Heijne, G. (1986) Nucl. Acids. Res. 14, 4683-4691) los primeros 16 aminoácidos codifican con gran probabilidad a un péptido señal que está ausente en la proteína completa. El peso molecular calculado de la proteína completa predicha es de 106kDa. El análisis de hidrofobicidad de la proteína putativa con el algoritmo de Kyte y Dolittle (1982) J. Mol. Biol. 157, 105-132, utilizando programas de análisis de secuencia de la University of Wisconsin Genetics Computer Group (Devereux y colaboradores, (1984) Nucl. Acids. Res. 12, 387-395) predice, como se esperaba para un receptor superficial de célula acoplado a proteínas G, varias regiones de membrana. Los sitios putativos de N-glicosilación se encuentran en las posiciones de los aminoácidos 7, 67, 392, 423, 465, 485, 497 y 614 de la proteína completa predicha como se expuso en SEQ ID No. 2.

Ejemplo 8 Ensayo del receptor clonado para GABA_{B}

Con miras a aislar las membranas que contienen al receptor clonado para GABA_{B}, las placas de cultivo que contienen células COS que expresan al receptor para GABA_{B} se lavan dos veces con solución amortiguadora Tris-Krebs-Henseleit. Después, las células se raspan de las placas, se homogenizan en un homogenizador vidrio-vidrio y se centrifugan durante 30 min a 4ºC a 40.000 g. La etapa de homogenización y centrifugación se repite una vez más. El gránulo se resuspende en solución amortiguadora y se almacena en nitrógeno líquido para más análisis.

Las membranas de las células COS1 transfectadas con el cADN del receptor para GABA_{B} (las membranas derivadas en forma similar de los tejidos de cerebro se usan como referencia) se suspenden en solución amortiguadora Tris-Krebs-Henseleit en una concentración aproximadamente de 1 mg/ml. Las membranas se incuban entonces en la oscuridad con ^{125}I-CGP 71872 0,6 nM durante una hora a temperatura ambiente. En experimentos de control se incluyen 1 \muM de CGP 54626A no marcado, un antagonista específico de receptor para GABA_{B}. La incubación se termina por centrifugación a 20.000 g durante 10 min a 4ºC. El gránulo se lava una vez en solución amortiguadora para remover el marcador de fotoafinidad enlazado del no enlazado. El gránulo se resuspende en solución amortiguadora y se ilumina con luz UV (365 nm, 24 W) durante 3 min. La suspensión se centrifuga nuevamente (20 min, 40.000 g). El gránulo se lava en solución amortiguadora, se disuelve en solución amortiguadora de la muestra SDS y se separa sobre un gel SDS al 6% de acuerdo con Laemmli, U.K (1970) Nature 227, 680-685. El gel se seca y, junto con los rastreadores de intensificación, se exponen a películas de rayos X Dupont Reflection NEF-495 durante la noche. La proteína expresada a partir del clon de cADN 4'376bp tiene una masa molecular aparente de alrededor de 120Kda (Figura 1). El peso molecular aparente del receptor para GABA_{B} recombinante se estima a partir de la movilidad relativa de aquellos de los estándares SDS-PAGE (BioRad).

La farmacología de enlazamiento del receptor para GABA_{B}R1a expresada en células COS1, se compara con la farmacología de enlazamiento de los receptores para GABA_{B} nativo en membranas de corteza cerebral de ratas. Con ese ánimo, se comparan las características de enlazamiento del radioligando [^{125}I]CGP 64213 y la inhibición de este enlazante por antagonistas y agonistas seleccionados del receptor para GABA_{B}. La constante de disociación K_{D} del receptor para GABA_{B}R1a expresado en las células COS se determinó que es 1,85 nM. El K_{D} de los receptores para GABA_{B} expresados en las membranas de la corteza se determinó que es 2,7 nM y por lo tanto es similar al valor obtenido para el receptor recombinante. Los valores IC_{50} (Tabla 1) y las pendientes de las curvas de inhibición (Figura 2) para los antagonistas del receptor para GABA_{B} CGP 54626A (Froestl y colaboradores, (1992) Pharmacol. Communications 2, 52-56), CGP 71872, CGP 64213 y CGP 35348 (Froestl y colaboradores, 1992) son muy similares para los receptores recombinante y nativo. El orden de rango de afinidad para los antagonistas GABA, L-baclofen y CGP 27492 (ácido aminofosfínico, APPA) es idéntico al de los receptores recombinante y nativo, sin embargo, la afinidad del agonista es siempre significativamente menor que la del receptor para GABA_{B}R1a recombinante (Figura 3, Tabla 1). Se sabe que GTP o su análogo estable Gpp(NH)p reducen la afinidad de los agonistas por los receptores para GABA_{B} nativo por desacoplamiento de los receptores de sus proteínas G (Hill y colaboradores, (1984) J. Neurochem. 42, 652-657). Por lo tanto, la menor afinidad de los agonistas por el receptor recombinante puede reflejar el hecho de que en las células COS, las proteínas G que normalmente se acoplan a los receptores para GABA_{B} en células de cerebro, no están disponibles. Hemos determinado que para los receptores para GABA_{B} de la corteza de rata, el valor IC_{50} del L-baclofen se desplaza desde 170 nM hasta 10 nM en presencia de 300 \muM de Gpp(NH)p. Por lo tanto, el desacoplamiento de las proteínas G de los receptores para GABA_{B} nativo, resulta en un valor de IC_{50} comparable con los 34 \muM obtenidos por el receptor para GABA_{B}R1a recombinante expresado en las células COS. En conclusión, el receptor para GABA_{B}R1a recombinante muestra similar farmacología de enlazamiento que los receptores para GABA_{B} nativo de la corteza de rata.

TABLA 1

100

Ejemplo 9 Uso del cADN del receptor para GABA_{B}R1a para clonar genes relacionados

El cADN aislado del receptor para GABA_{B}R1a de rata (SEQ ID No. 1) es útil como sonda para identificar y aislar cADNs adicionales, genes y proteínas de la familia del gen del receptor para GAGA_{B}. También es útil para identificar y aislar cADNs, genes y proteínas de la familia del gen del receptor para GAGA_{B} en otras especies, tales como por ejemplo, humanos.

Con miras a aislar un clon adicional de rata (mencionado como GAGA_{B}R1b) y clones humanos de receptor para GAGA_{B}, la biblioteca para rata anteriormente mencionada y la biblioteca de cADN de cerebro fetal humano (Clontech, Palo Alto, cat. No. HL3025s) se hibridan en forma cruzada con cADN de GABA_{B}R1a bajo condiciones de hibridación adecuadas. La biblioteca humana es una biblioteca de Oligo (dT)-cebado unidireccional que consta de 1,2 x 10^{6} clones cADN independientes insertados en el vector de expresión pcADNI. El método de rastreo de una biblioteca de plásmidos por hibridación de colonias se describe en Sambrook y colaboradores (1989). La sonda de hibridación usada es un fragmento de ^{32}P marcado 1,3kb Pvull/Scal correspondiente a las bases 1931 a 3264 del cADN de GABA_{B}R1a (SEQ ID No. 1). La hibridación es en NaH_{2}PO_{4} 0,5 M (pH 7,2), SDS al 7%, EDTA 1 mM a 60ºC durante la noche. Las subsiguientes etapas de lavado son de una hora hasta astringencia final de 0,5 x SSC, SDS al 0,1% a 55ºC (biblioteca de rata) o 2 x SSC, SDS al 0,1% a 50ºC (biblioteca de humano). Las películas de Kodak X OMAT AR se exponen a las membranas durante la noche a -80ºC con rastreadores de intensificación. Las películas de rayos X se alinean a las placas de agar con las colonias bacteriales y se aíslan las colonias que contienen clones cADN de hibridación cruzada. Las bacterias se trasladan nuevamente sobre las placas de agar y se repite dos veces el rastreo de la hibridación de la colonia. Las colonias individuales obtenidas se analizan además por hibridación de las manchas de Southern. Los clones de cADN seleccionados se analizan por secuenciación y se caracteriza un cADN 2,9 kb para GABA_{B}R1b de rata (ver SEQ ID No. 5). Este cADN codifica una proteína de 844 aminoácidos (ver SEQ ID No. 6). El GABA_{B}R1b completo difiere del primer GAGA_{B}R1a en que los residuos del aminoácido 147 N-terminal se reemplazan por 18 residuos diferentes. Presumiblemente, esas dos variantes del receptor para GABA_{B} se derivan del mismo gen por un empalme alternativo. Esos clones que son positivos en el rastreo de la biblioteca humana son también analizados por secuenciación y revelan un clon llamado GABA_{B}R1a/b (ver SEQ ID No. 3) con una secuencia parcial que codifica a una proteína receptora de 793 residuos de aminoácidos (ver SEQ ID No. 4), así como otro clon llamado GABA_{B}R1b humano (ver SEQ ID No. 7) que representa un cADN completo que codifica a un receptor humano para GABA_{B} que tiene 844 aminoácidos (ver SEQ ID No. 8).

Ejemplo 10 Receptores para GABA_{B} expresados en forma estable en células HEK293 acopladas negativamente a ciclasa adenilato

Se describen los receptores para GABA_{B} para inhibir la actividad de la ciclasa adenilato, estimular a la fosfolipasa A_{2}, activar los canales de K^{+}, inactivar los canales de Ca^{2+} dependientes del voltaje y para modular la hidrólisis del fosfolípido inositol. Como GABA_{B}R1a y -b tienen idéntica secuencia en todos los dominios predichos que son intracelulares, se espera que ellos sean capaces de acoplarse a los mismos sistemas efectores. Usando preparaciones de rebanadas corticales de rata, el L-baclofen ha mostrado que reduce la acumulación de cAMP estimulada por forskolina, aproximadamente en un 40%. Se analiza la habilidad del GABA_{B}R1a expresado establemente en células HEK293 para reducir la acumulación de cAMP estimulada por forskolina (Fig. 5). Escogimos concentraciones de forskolina y L-baclofen que producirían un efecto máximo. La forskolina estimula los niveles de cAMP en células HEK293 en más de diez veces sobre el nivel basal. La estimulación de los receptores para GABA_{B} expresados en forma recombinante por adición conjunta de 300 \muM de L-baclofen, reduce la acumulación de cAMP estimulada por forskolina, aproximadamente en un 30%. Esta inhibición es antagonizada por CGP 54626A, un antagonista de receptor para GABA_{B}. La modulación de la actividad del adenilato de ciclasa por GABA_{B}R1a es sensible a la toxina de la tos ferina, indicando que en las células HEK293, que son deficientes en G_{o}, GABA_{B}R1a se acopla a G_{i}. Como control, el L-baclofen no inhibe la formación de cAMP estimulada por forskolina en células no transfectadas HEK293 (Fig. 5).

Depósito de datos

El clon de receptor para GABA_{B}, GABA_{B}R1a derivado de rata, se depositó bajo el tratado de Budapest en la Deutsche Sammlung von Microorganismen und Zellkulturen GMBH (DSMZ), Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Alemania, con fecha de depósito efectivo el 17 de mayo de 1996 bajo el número de acceso DSM 10689.

Los clones del receptor para GABA_{B}, GABA_{B}R1b derivado de rata, así como GABA_{B}R1b derivado de fuente humana se depositaron bajo el tratado de Budapest en la Deutsche Sammlung von Microorganismen und Zellkulturen GMBH (DSMZ), Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Alemania, con fecha de depósito efectivo el 21 de febrero de 1997 bajo los número de acceso DSM 11422 y 11421, respectivamente.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i): SOLICITANTE:

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(A): NOMBRE: NOVARTIS AG

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(B): CALLE: SCHWARZWALDALLEE

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(C): CIUDAD: Basilea

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(E): PAÍS: Suiza

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(F): CÓDIGO POSTAL: 4002

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(G): TELÉFONO: +41 61 696 11 11

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(H): TELEFAX: +41 61 696 79 76

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(I): TELEX: 962 991

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(ii): TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Nuevos Receptores

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(iii): NÚMERO DE SECUENCIAS: 8

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(iv): FORMA QUE PUEDE LEERSE EN EL COMPUTADOR:

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(A): TIPO DE MEDIO: Disco flexible

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(B): COMPUTADOR: IBM PC compatible

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(C): SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

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(D): SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Versión #1.30 (EPO)

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 3:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 4376 pares de bases

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(B): TIPO: ácido nucleico

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(C): ENTRELAZAMIENTO: doble

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(D): TOPOLOGÍA: linear

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cADN a mARN

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(iii): HIPOTÉTICA: NO

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(iv): ANTISENTIDO: NO

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(vi): FUENTE ORIGINAL:

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(A): ORGANISMO: Rattus norvegicus

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(vii): FUENTE INMEDIATA:

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(B): CLON: GABABRIa rata

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(ix): CARACTERÍSTICA:

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(A): NOMBRE / CLAVE: CDS

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(B): UBICACIÓN: 182..3061

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(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE / CLAVE: mat_péptido

\vskip0.500000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 182..3061

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:

11

12

13

14

15

16

17

18

19

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 2:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(E): LONGITUD: 960 aminoácidos

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(F): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(G): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:

20

21

22

23

24

25

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 2620 pares de bases

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(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENTRELAZAMIENTO: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cADN a mARN

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(iii): HIPOTÉTICA: NO

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(iv): ANTISENTIDO: NO

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(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Homo sapiens

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(vii): FUENTE INMEDIATA:

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(B): CLON: GABABRIa/b humano

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(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE / CLAVE: CDS

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(B): UBICACIÓN: 1..2379

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(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE / CLAVE: mat_péptido

\vskip0.500000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 1..2379

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:

26

28

29

30

31

32

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 4:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 793 aminoácidos

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(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:

33

35

36

37

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 2837 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENTRELAZAMIENTO: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cADN a mARN

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Rattus norvegicus

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA:

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CLON: GABABR1b rata

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE / CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 228..2759

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE / CLAVE: mat_péptido

\vskip0.500000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 228..2579

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:

39

41

42

43

44

45

46

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 844 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6

\vskip1.000000\baselineskip

47

48

49

50

51

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 7

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 2924 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): ENTRELAZAMIENTO: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: cADN a mARN

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): HIPOTÉTICA: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): ANTISENTIDO: NO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): FUENTE INMEDIATA:

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(B): CLON: GABABR1b humano

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE / CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 169..2700

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE / CLAVE: mat_péptido

\vskip0.500000\baselineskip

(B): UBICACIÓN: 169..2700

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:

52

54

55

56

57

58

59

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(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 844 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(x): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8:

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60

61

62

63

64

65

66

67

Claims

1. Un receptor o proteína receptora para GABA_{B} aislado, codificado

(a): por cualquiera de las secuencias de ácido nucleico que comprenden una secuencia de ácido nucleico, como se expuso, en los nucleótidos 182 a 3061 de la SEQ ID No: 1; como se expuso, en los nucleótidos 1 a 2379 de la SEQ ID No: 3; como se expuso, en los nucleótidos 228 a 2759 de la SEQ ID No: 5; o como se expuso, en los nucleótidos 169 a 2700 de la SEQ ID No: 7;

(b): por cualquiera de los clones de ácido nucleico seleccionados del grupo que consiste de los clones depositados en el DSMZ bajo el número de acceso DSM 10689 DSM 11421 y DSM 11422; o

(c): por cualquiera de las secuencias de ácido nucleico que hibridan bajo condiciones de astringencia moderada a polinucleótidos de las SEQ ID No.: 1, SEQ ID No.: 3, SEQ ID No.: 5 o SEQ ID No.: 7, por lo cual las condiciones de astringencia moderada se completan con una etapa de lavado alrededor de los 60-62ºC, 1x SSC y 0,1% SDS.

2. El receptor o proteína receptora para GABA_{B} de la reivindicación 1, en donde dicho receptor o proteína receptora para GABA_{B} es capaz de enlazarse específicamente al menos a uno de los antagonistas selectivos del receptor para GABA_{B} de las Fórmulas I ó II:

68

69

3. El receptor o proteína receptora para GABA_{B} aislado de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el receptor o proteína receptora para GABA_{B} aislado es un receptor o proteína receptora para GABA_{B} humano.

4. El receptor o proteína receptora para GABA_{B} de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la secuencia de aminoácidos comprende una secuencia de aminoácidos que tiene una identidad superior al 30% con las SEQ ID No.: 2, SEQ ID No.: 4, SEQ ID No.: 6, o SEQ ID No.: 8.

5. El receptor o proteína receptora para GABA_{B} de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la secuencia de aminoácidos comprende una secuencia de aminoácidos como se expuso en las SEQ ID No.: 2, SEQ ID No.: 4, SEQ ID No.: 6, o SEQ ID No.: 8.

6. Un ácido nucleico aislado que codifica a un receptor o proteína receptora para GABA_{B} que comprende una secuencia de aminoácidos como se expuso en las SEQ ID No.: 1, SEQ ID No.: 3, SEQ ID No.: 5, o SEQ ID No.: 7.

7. El ácido nucleico aislado de acuerdo con la reivindicación 6, en donde la secuencia de ácido nucleico comprende la secuencia de nucleótidos como se expuso en los nucleótidos 182 a 3061de la SEQ ID No.: 1; como se expuso en los nucleótidos 1 a 2379 de la SEQ ID No.: 3; como se expuso en los nucleótidos 228 a 2759 de la SEQ ID No.: 5; o como se expuso en los nucleótidos 169 a 2700 de la SEQ ID No.: 7.

8. El ácido nucleico aislado de acuerdo con la reivindicación 6, en donde la secuencia de ácido nucleico se codifica por un clon de ácido nucleico seleccionado del grupo que consiste de los clones depositados en el DSMZ bajo el número de acceso DSM 10689, DSM 11421 y DSM 11422.

9. Una sonda de ácido nucleico que es capaz de hibridar a cualquiera de las secuencias de ácido nucleico que comprenden la SEQ ID No.: 1, SEQ ID No.: 3, SEQ ID No.: 5, o SEQ ID No.: 7 bajo condiciones de astringencia moderada o alta, por lo cual las condiciones de astringencia moderada se completan con una etapa de lavado alrededor de los 60-62ºC, 1x SSC y 0,1% SDS, y las condiciones de astringencia alta se completan con una etapa de lavado alrededor de los 65-68ºC, 0,2-0,1x SSC, 0,1% SDS, y con la condición de que se excluya la sonda de ácido nucleico con el Número de Acceso EMBL X90542.

10. La sonda de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 9, en donde la sonda de ácido nucleico tiene una secuencia de ácido nucleico antisentido en relación con las secuencias de ácido nucleico como se exponen en la reivindicación 9.

11. Un anticuerpo que se genera contra un receptor o proteína receptora como se expone en la SEQ ID No.: 2, SEQ ID No.: 4, SEQ ID No.: 6, o SEQ ID No.: 8.

12. El anticuerpo de la reivindicación 11, en donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, policlonal o quimérico.

13. El anticuerpo de la reivindicación 11, en donde el anticuerpo es un Fab, F(ab')_{2}, Fv o un fragmento de ScFv.

14. Un vector replicable de ácido nucleico que comprende una secuencia de codificación que consiste de un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 6 operativamente ligado a las secuencias de control.

15. Una célula huésped transformada con un vector de acuerdo con la reivindicación 14.

16. Una célula animal transgénica no humana que comprende un receptor o proteína receptora para GABA_{B} de acuerdo con la reivindicación 1, con tal de que dicha célula animal transgénica no humana no exprese en forma endógena a un receptor o proteína receptora para GABA_{B} de acuerdo con la reivindicación 1.

17. Un método para identificar un ácido nucleico que codifica un receptor o proteína receptora para GABA_{B}, que comprende las etapas de:

: preparar una biblioteca de expresión de moléculas que codifican cADN que potencialmente codifican un receptor o proteína receptora para GABA_{B};

: rastrear la biblioteca de expresión con un ligando específico capaz de enlazarse a un receptor o proteína receptora para GABA_{B}, en donde el ligando específico es el compuesto de Fórmula I

70

o el compuesto de Fórmula II:

71

18. Un método para identificar un ácido nucleico que codifica un receptor o proteína receptora para GABA_{B}, que comprende las etapas de:

(a): preparar una biblioteca que codifica cADN o moléculas de ADN genómico que potencialmente codifican un receptor o proteína receptora para GABA_{B};

(b): rastrear la biblioteca por hibridación con una sonda de ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 10; y

(c): identificar las moléculas de ácido nucleico que hibridan a la sonda.

19. Un método para rastrear compuestos o mezclas de compuestos que son moduladores potenciales de la actividad del receptor para GABA_{B}, que comprende las etapas de:

: preparar un sistema de ensayo que comprende un receptor o proteína receptora para GABA_{B} recombinante; exponer el sistema de ensayo al compuesto o mezcla de compuestos;

: identificar el compuesto o mezcla de compuestos que causan modulación de la actividad receptora para GABA_{B} como es medida por el sistema del ensayo.

20. Un método para rastrear compuestos o mezclas de compuestos que son moduladores potenciales de la expresión del receptor para GABA_{B}, que comprende las etapas de:

: proveer un sistema de expresión que comprende un gen de ensayo operativamente enlazado a las secuencias de control normalmente asociadas con un gen que codifica a un receptor o proteína receptora para GABA_{B};

: identificar los compuestos que causan un cambio en el nivel de expresión del gen del ensayo.

21. El antagonista selectivo del receptor para GABA_{B} de Fórmula I o II de acuerdo con la reivindicación 2.