ES2239382T3 - Uso de la proteina c activada para el tratamiento de los estados hipercoagulables asociados con sepsis. - Google Patents

Abstract

PROCEDIMIENTO PARA TRATAR PACIENTES HUMANOS CON UN ESTADO HIPERCOAGULATIVO ADQUIRIDO O UNA DEFICIENCIA ADQUIRIDA DE PROTEINA C ASOCIADA CON LA SEPSIS, PURPURA FULMINANS, SEPSIS MENINGOCOCICA, TRANSPLANTE DE MEDULA OSEA Y OTROS, QUEMADURAS GRAVES, EMBARAZO, CIRUGIA MAYOR, TRAUMAS GRAVES O SINDROME ALVEOLOCAPILAR. CONSISTE EN LA ADMINISTRACION DE LA PROTEINA C ACTIVADA, QUE PROPORCIONA UN AGENTE TERAPEUTICO ALTAMENTE SELECTIVO DE BAJO POTENCIAL PARA OCASIONAR COMPLICACIONES HEMORRAGICAS.

Description

Uso de la proteína C activada para el tratamiento de los estados hipercoagulables asociados con sepsis.

Esta invención se refiere a la ciencia médica, particularmente al tratamiento de estados hipercoagulables adquiridos asociados con deficiencia de sepsis con proteína C activada.

La proteína C es una serina proteasa y un anticoagulante que se da en la naturaleza que juega un papel en la regulación de hemostasis a través de su capacidad para bloquear la generación de producción de trombina en factores inactivadores Va y VIIIa en la cascada de coagulación. La proteína C humana se fabrica in vivo principalmente en el hígado como un polipéptido individual de 461 aminoácidos. Esta molécula precursora sufre múltiples modificaciones postraduccionales incluyendo 1) eliminación de una secuencia señal de 42 aminoácidos; 2) eliminación proteolítica del residuo de lisina en la posición 155 y el residuo arginina en la posición 156 de la única cadena del zimógeno para fabricar la forma de dos cadenas de la molécula (es decir, una cadena ligera de 155 residuos de aminoácido anclada a través de un puente disulfuro a la serina proteasa que contiene cadena pesada de 262 residuos aminoácidos); 3) carboxilación dependiente de vitamina K de nueve residuos ácidos de glutámico agrupados en los primeros 42 aminoácidos de la cadena ligera, dando como resultado 9 residuos ácidos gamma-carboxiglutámicos; y 4) unión de carbohidrato a cuatro sitios (uno en la cadena ligera y tres en la cadena pesada). La cadena pesada contiene la tríada de serina proteasa bien establecida in vivo de Asp 257, His 211 y Ser 360. Finalmente, el zimógeno de dos cadenas circulante se activa in vivo mediante trombina y un fosfolípido de superficie en la presencia de ión calcio. La activación resulta de la eliminación de un dodecapéptido en el extremo N-terminal de la cadena pesada, que produce proteína activada C (aPC) que posee actividad enzimática.

En conjunción con otras proteínas, aPC funciona como quizás el regulador a la baja más importante de la coagulación de la sangre que da como resultado protección contra trombosis. Además de sus funciones anticoagulación, aPC tiene efectos antiinflamatorios, a través de su inhibición de generación de citoquinas (por ejemplo TNF e IL-1) y también ejerce propiedades profibrinolíticas que facilitan la lisis de coágulos. Así, el sistema enzimático proteína C representa un mecanismo fisiológico principal de anticoagulación, antiinflamación y fibrinolisis.

Sepsis

Sepsis se define como una respuesta inflamatoria sistémica a la infección, asociada con y mediada por la activación de un número de mecanismos de defensa del hospedador, incluyendo la red de citoquinas, leucocitos y el complemento y sistemas de coagulación/fibrinolisis [Mesters, y col., Blood 88: 881-886, 1996]. Coagulación intravascular diseminada [DIC], con deposición amplia de fibrina en la microvasculatura de varios órganos, es una manifestación temprana de sepsis/choque séptico. DIC es un mediador importante en el desarrollo del síndrome de fallo multiorgánico y contribuye a la prognosis pobre de pacientes con choque séptico [Fourrier, y col., Chest 101: 816-823, 1992].

Se han notificado varios estudios preclínicos esperanzadores que usan proteína C en diversos modelos animales de sepsis. Un estudio de un modelo de sepsis en babuino por Taylor y col., [J. Clin. Invest. 79: 918-25, 1987], usó proteína C humana activada derivada de plasma. Los animales se trataron profilácticamente (es decir, el aPC se dio al comienzo de la infusión de dos horas de la E. coli LD_{100}). Cinco de cinco animales sobrevivieron 7 días y se consideraron supervivientes permanentes al protocolo experimental. En animales control que reciben una infusión idéntica de E. coli, cinco de cinco animales murieron entre 24 y 32 horas. La dosis eficaz fue de 7 a 8 mg/kg.

En un modelo de sepsis de lipopolisacárido (LPS; E. coli) en ratas [Murakami, y col., Blood 87: 642-647, 1996], el daño vascular pulmonar inducido por LPS se inhibió mediante proteína C activada humana derivada de plasma a una dosis de 100 \mug/kg. Además, en un modelo de sepsis por ligamiento y punción en conejos, Okamoto y col., [Gastroenterology 106: A747, 1994], demostró que la proteína C activada humana derivada de plasma fue efectiva en proteger a los animales de coagulopatía y fallo orgánico a una dosis de 12 \mug/kg/hora durante 9 horas. Debido a la especificidad de especies de aPC, los resultados obtenidos en estos animales no son necesariamente predictivos del tratamiento de humanos. El nivel de dosis eficaz de la proteína C activada de humanos es extremadamente variable e impredecible dependiendo del modelo de animal seleccionado. Por ejemplo, la vida media en suero de la proteína C activada humana en humanos es de 30 a 40 minutos, comparada con la vida media de 8 a 10 minutos en babuinos y 90 minutos en conejos.

Ha habido numerosos intentos recientes para tratar sepsis en humanos, en la mayor parte usando agentes que bloquean mediadores de la inflamación asociados con la patofisiología de esta enfermedad. Sin embargo, los estudios clínicos con una diversidad de agentes que bloquean mediadores inflamatorios han sido fallidos [revisado en Natanson, y col., Ann. Intern. Med. 120: 771-783, 1994; Gibaldi, Pharmacotherapy 13: 302-308, 1993]. Dado que muchos de los mediadores implicados en inflamación son respuestas compensatorias, y por lo tanto tienen efectos saludables, algunos investigadores han sugerido que bloquear su acción puede no ser apropiado [por ejemplo, Parrillo, N. Engl. J. Med. 328: 1471-1477, 1993].

Recientemente, el bloqueo de DIC se ha propuesto como una nueva diana para ensayos clínicos en sepsis [por ejemplo, Levi y col., JAMA 270: 975-979, 1993]. Sin embargo, bloquear simplemente el defecto de coagulación en sepsis puede no ser suficiente. Como se revisó por Esmon, [Arteriosclerosis & Thromb. 12: 135-145, 1992], varios antitrombóticos no han mostrado eficacia en el modelo séptico en babuino, incluyendo el factor Xa bloqueado en el sitio activo [Taylor, y col., Blood 78: 364-368, 1991], hirudina e hirulog [Maraganore, Perspectiva in Drug Discovery and Design 1:461-478, 1994]. Cada uno de estos antitrombóticos fue capaz de bloquear la coagulopatía de consumo en los animales pero no fueron capaces de mejorar la supervivencia. Adicionalmente, los investigadores en Japón [solicitud de patente JP7097335A] han propuesto tratar coagulopatía asociada con deficiencia hepática, la cual tiene el potencial de desarrollar síntomas similares a DIC, con proteína C activada derivada de plasma.

Hasta la fecha, el zimógeno de la proteína C humana derivada de plasma se ha usado como un adjunto exitoso a la terapia convencional agresiva en el manejo de veinticinco pacientes con púrpura fulminans en sepsis bacteriana de los cuales sobrevivieron veintidós (Gerson, y col., Pediatrics 91: 418-422, 1993; Smith, y col., Thromb. Haemost, PS1709, p 419, 1997; Rintala y col., Lancet 347: 1767, 1996; Rivard, y col., J. Pediatr. 126: 646-652, 1995). Gerson y col., [1993] describen un estudio de caso de un tratamiento de un niño con bacteremia gram positiva y púrpura fulminans demostradas, quien falló al responder al tratamiento agresivo convencional. El paciente se trató con zimógeno de proteína C humana derivada de plasma (inyección intravenosa rápida de 280 \mug/kg + infusión a 40 \mug/kg/hora) que resultó en una corrección asociada de coagulopatía y DIC, y detención de los signos clínicos del desarrollo de choque séptico asociado con púrpura fulminans. Rintala, y col., [1996] notificó en tratamiento de dos adultos con septicemia meningocócica presente con púrpura fulminans. Los pacientes se trataron con zimógeno de proteína C derivada de plasma a inyección intravenosa embolada de 400 \mug/kg cada seis horas durante 8-10 días. Uno murió y uno sobrevivió. Rivard, y col., [1995] notificaron el tratamiento de cuatro pacientes con meningococcemia presente también con púrpura fulminans, quienes sobrevivieron todos siguiendo terapia con zimógeno de proteína C humana. Estos pacientes se trataron a una dosis de inyección intravenosa embolada de 400 \mug/kg cada seis horas. Aunque el tamaño de muestra para estos estudios es pequeño, la mortalidad asociada con meningococcemia presentada con púrpura fulminans es mayor del 50% [Powars, y col., Clin. Infectious Diseases 17: 254-261, 1993]. Sin embargo, debido a que estos estudios se llevan a cabo con el zimógeno de la proteína humana C, ofrecen sólo una pequeña sugerencia para establecer la dosis y duración de terapia con proteína C activada.

Además de meningococcemia, púrpura fulminans y/o DIC se han asociado con numerosas infecciones bacterianas, virales, o protozoarias las cuales incluyen pero no se limitan a infecciones causadas por Rickettsia (fiebre maculosa de las Montañas Rocosas, fiebre botonosa mediterránea, tifus, etc.) [Graybill, y col., Southern Medical Journal, 66(4): 410-413, 1973; Loubser, y col., Annals of Tropicals Paediatrics 13: 277-280, 1993]; Salmonella (fiebre tifoidea, fiebre por mordedura de rata) [Koul, y col., Acta Haematol, 93: 13-19, 1995]; Pneumococci [Carpenter y col., Scand. J. Infect. Dis., 29: 479-483, 1997], Yersinia pestis [peste bubónica] [Butler y col., The Journal of Infectious Disease, 129: 578-584, 1974]; Legionella pneumophila (enfermedad del legionario); Plasmodium falciparum (malaria cerebral) [Lercari, y col., Journal of Clinical Apheresis, 7: 93-96, 1992]; Burkholderia pseudomallei (melioidosis); Pseudomonas pseudomallei (melioidosis) [Puthucheary, y col., Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene, 86: 683-685, 1992]; Streptococci (infecciones odontogénicas) [Ota, Y., J. Japanese Assoc. Infect. Dis., 68: 157-161]; virus zóster [Nguyen, y col., Eur. J. Pediatr., 153: 646-649, 1994]; Bacillus anthracis (anthrax) [Franz, y col., Journal of the American Medical Assoc., 278(5): 399-411, 1997]; Leptospira interrogans (leptospirosis) [Hill, y col., Seminars in Respiratory Infections, 12(1): 44-49, 1997]; Staphylococci [Levin, M., Pediatric Nefrology, 8: 223-229]; Haemophilus aegyptius (fiebre púrpura brasileña); Neisseria (gonococcemia, meningococcemia); y Mycobacterium tuberculosis (tuberculosis miliar).

Incluso a través de la púrpura fulminans, DIC o condiciones de deficiencia de proteína C adquirida en sepsis/choque séptico u otras infecciones se han documentado bien como se indica anteriormente, hay pocos datos sobre como tratar estos pacientes con proteína C activada. Establecer niveles de dosis para humanos usando los datos de farmacología preclínica generados a partir de tratamiento con proteína C activada en modelos animales es difícil debido a las propiedades específicas de especie de las acciones biológicas de la proteína C.

La caracterización y la purificación novedosa de la proteína C recombinante expresada en células HEK293 se describe por S.C. Betty Yan y col. (1990) Biotechnology (8) 655-661 (XP008028568). El tratamiento de sepsis en babuino con proteína C activa derivada de plasma se discute en el documento de patente US5009889.

Para la facilidad de la comparación de los niveles de dosificación de proteína C destacados en literatura y documentos de patente, la tabla 1 expone niveles de dosis normalizados de varios estudios en humanos o primates no humanos. Estos datos establecen niveles de dosificación que son superiores o inferiores a los niveles de dosis proporcionados en la presente invención. Significativamente, los estudios en humanos se hicieron utilizando zimógeno de proteína C derivada de plasma mientras el estudio de los primates no humanos utilizó aPC humana recombinante.

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A pesar de estos informes, sin embargo, el régimen de dosificación para terapia segura y eficaz en humanos que sufren de un estado adquirido hipercoagulable asociado con sepsis permanece desconocido. Estos estudios no son predictivos del uso de la proteína C recombinante activada de la presente invención en el tratamiento de estados hipercoagulables en humanos.

La presente invención describe el uso de aPC en un ensayo clínico en pacientes de sepsis severa. En estos pacientes, el grupo tratado r-aPC demostró mejora estadística en funciones de órganos, bajando de marcadores de DIC y disminuyendo en mortalidad comparados con el grupo control con placebo. Las dosis de aPC usados en los pacientes de sepsis severa fueron 12, 18, 24 y 30 \mug/kg/hora en una infusión de 48 horas. Las dosis de 12 y 18 \mug/kg/hora no fueron efectivas en este estudio. Sorprendentemente, las dosis de 24 y 30 \mug/kg/hora usadas en este estudio fueron eficaces y son considerable e inesperadamente bajas comparadas con los datos de farmacología preclínica publicados.

Además, los solicitantes han encontrado que los estudios de toxicología preclínica en primates no humanos indican que la seguridad de aPC durante una infusión de 96 horas se limita a una dosis máxima de aproximadamente 50 \mug/kg/hora. Estos datos también son inesperados cuando se comparan con la técnica previa. De hecho, los niveles de dosis de r-aPC para humanos que se han basado en estudios previos preclínicos y clínicos estarán por encima del intervalo toxicológico establecido en los estudios toxicológicos anteriores.

La presente invención proporciona el uso de proteína C recombinante activada en la elaboración de un medicamento para el tratamiento o prevención de un estado hipercoagulable adquirido asociado con sepsis, a administrarse a un paciente humano mediante infusión continua de una dosificación de 20 \mug/kg/hora a 50 \mug/kg/hora de una proteína C humana activada durante de 24 a 144 horas, en el que dicha proteína C activada es obtenible mediante expresión del zimógeno de la proteína C en células HEK 293, seguida por activación in vitro.

La invención proporciona adicionalmente el uso de una proteína C recombinante activada en la elaboración de un medicamento para el tratamiento de un estado hipercoagulable adquirido asociado con sepsis en un paciente humano, estando dicho medicamento para administración en una cantidad para lograr un nivel en plasma de proteína C activada de aproximadamente 50 ng/ml a 24 horas, en la que dicha proteína C activada es obtenible mediante expresión de zimógeno de proteína C en células HEK 293, seguida por activación in vitro.

Así, la presente invención establece procedimientos que utilizan aPC en el tratamiento de un estado hipercoagulable asociado con sepsis en pacientes humanos.

Para los propósitos de la presente invención, como se describe y reivindica en el presente documento, los siguientes términos son como se definen a continuación.

aPC o proteína C activada se refiere a proteína C recombinante activada. aPC incluye y es preferiblemente proteína C humana aunque aPC puede incluir también otras especies o derivados que tienen actividades proteolíticas, amidolíticas, esterolíticas, y biológicas (anticoagulantes o profibrinolíticas) de la proteína C completa. Ejemplos de derivados de la proteína C se describen por Gerlitz, y col., patente de los Estados Unidos Nº. 5.453.373, y Foster, y col., patente de los Estados Unidos Nº. 5.516.650. La proteína C activada recombinante se puede producir activando zimógeno de proteína C humana recombinante in vitro o mediante secreción directa de la forma activada de proteína C. La proteína C se puede producir, a partir de células 293 del riñón humano como un zimógeno después purificado y activado mediante técnicas conocidas por el artesano experto.

Tratamiento - describe el manejo y cuidado de un paciente para el propósito de combatir una enfermedad, afección o trastorno e incluye la administración de una aPC profilácticamente para prevenir la aparición de los síntomas o complicaciones de la enfermedad, afección, o trastorno, o administrar aPC para eliminar la enfermedad, afección o trastorno.

Infusión continua - continuar de forma sustancialmente ininterrumpida la introducción de una disolución dentro de una vena durante un periodo de tiempo especificado.

Inyección intravenosa embolada - la inyección de un fármaco en una cantidad definida (llamada una inyección intravenosa embolada) durante un periodo de tiempo de hasta aproximadamente 120 minutos.

Adecuado para administración - una formulación o disolución liofilizada que es apropiada para darse como el agente terapéutico.

Receptáculo - un recipiente tal como un vial o botella que se usa para recibir el material designado, es decir, aPC.

Forma de dosificación unitaria - se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosificaciones unitarias para sujetos humanos, conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de material activo calculado para producir el efecto terapéutico deseado, en asociación con un excipiente farmacéutico adecuado.

Estados hipercoagulables - coagulabilidad excesiva asociada con coagulación intravascular diseminada, condiciones pretrombóticas, activación o coagulación, o deficiencia congénitamente adquirida de factores de coagulación tales como aPC.

Zimógeno - zimógeno de proteína C, como se usa en el presente documento, se refiere a formas inactivas, segregadas, bien sean de una cadena o de dos cadenas, de proteína C.

Juvenil - un paciente humano que incluye pero no está restringido a recién nacidos, infantes, y niños menores de 18 años de edad.

Cantidad efectiva - una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto farmacéutico.

Púrpura fulminans - lesiones equimóticas de la piel, fiebre, hipotensión asociada con sepsis bacteriana, o infecciones virales, bacterianas, o protozoarias. La coagulación intravascular diseminada está presente usualmente.

La presente invención se refiere al tratamiento o prevención de estados hipercoagulables asociados con sepsis con proteína C activada. La aPC se puede fabricar mediante técnicas bien conocidas en la técnica utilizando células HEK 293, ejemplos de las cuales se describen por Grinnell en la patente de los Estados Unidos Nº. 5.681.932. Además, los ejemplos de la producción transgénica de las proteínas recombinantes se describen por Drohan, y col., en la patente de los Estados Unidos Nº. 5.589.604 y Archibald, y col., patente de los Estados Unidos Nº. 5.650.503.

Para estar plenamente aditiva y operable bajo los procedimientos presentes, el aPC hecho por cualquiera de estos procedimientos puede sufrir modificaciones postraduccionales tales como la adición de nueve gamma-carboxi-glutamatos (gamma-carboxilación, es decir contenidos en Gla), la adición de un eritro-beta-hidroxi-Asp (beta-hidroxilación), la adición de cuatro oligosacáridos unidos a Asn (glicoxilación), la eliminación de la secuencia líder (42 secuencias de aminoácidos) y eliminación del dipéptido Lys-156-Arg 157. Sin tales modificaciones postraduccionales, aPC no es completamente funcional o no es nada funcional.

El aPC se puede formular de acuerdo a procedimientos conocidos para preparar composiciones farmacéuticamente útiles. El aPC se administrará parenteralmente para asegurar su administración dentro de la corriente sanguínea en una forma efectiva inyectando la dosis apropiada como infusión continua durante de aproximadamente 24 a aproximadamente 144 horas. La cantidad de aPC administrada será de 20 \mug/kg/hora a 50 \mug/kg/hora. Más preferiblemente, la cantidad de aPC administrado será de 22 \mug/kg/hora a 40 \mug/kg/hora. Incluso más preferiblemente la cantidad de aPC administrado será de 22 \mug/kg/hora a 30 \mug/kg/hora. Las cantidades más preferibles de aPC administradas serán de 24 \mug/kg/hora o 30 \mug/kg/hora.

Alternativamente, el aPC será administrado inyectando una parte (de 1/3 a ½) de la dosis apropiada durante de aproximadamente 23 horas a aproximadamente 144 horas lo cual resulta en la dosis apropiada administrada durante de 24 horas a 144 horas.

Sólo después de estudios clínicos cuidadosamente controlados y estudios experimentales exhaustivos los solicitantes han descubierto que los niveles de dosis de 20 \mug/kg/hora a 50 \mug/kg/hora infundidos continuamente durante de 24 a 144 horas dan como resultado terapia eficaz. El nivel de dosis más preferible de aPC para administrarse para tratar pacientes humanos con un estado hipercoagulable adquirido como se describe en el presente documento será de aproximadamente 24 \mug/kg/hora.

Preparación 1

Preparación de proteína C humana

La proteína C humana recombinante (r-hPC) se produjo en las células 293 del riñón humano mediante técnicas bien conocidas para el artesano experto tales como aquellas expuestas en Yan, patente de los Estados Unidos Nº. 4.981.952. El gen que codifica la proteína C humana se describe y reivindica en Bang, y col., patente de los Estados Unidos Nº. 4.775.624. El plásmido para expresar la proteína C humana en células 293 fue plásmido pLPC el cual se describe en Bang, y col., patente de los Estados Unidos Nº. 4.992.373. La construcción de plásmido pLPC se describe también en la solicitud de patente europea Nº. 0.445.939, y en Grinnell, y col., 1987, Bio/Technology 5: 1189-119. Brevemente, el plásmido se transfectó en células 293, después los transformantes estándar se identificaron, subcultivaron y crecieron en medios libres de suero. Después de la fermentación, el medio libre de células se obtuvo mediante microfiltración.

La proteína C humana se separó del fluido de cultivo mediante una adaptación de las técnicas de Yan, patente de los Estados Unidos Nº. 4.981.952. Se fabricó el medio aclarado a 4 mM en EDTA antes de que se absorbiera a una resina de intercambio aniónico (Fast-Flow Q, Pharmacia). Después de lavar con 4 volúmenes de columna de Tris 20 mM, NaCl 200 mM, pH 7,4 y 2 volúmenes de columna de Tris 20 mM, NaCl 150 mM, CaCl_{2} 10 mM, pH 7,4., el zimógeno de la proteína C humana recombinante unida se eluyó con Tris 20 mM, NaCl 150 mM, CaCl_{2} 10 mM, pH 7,4. La proteína eluída estaba más del 95% pura después de la elución según se juzgó mediante electroforesis en gel de de SDS-poliacrilamida.

La purificación adicional de la proteína se llevó a cabo fabricando la proteína 3 M en NaCl seguido por adsorción a una resina de interacción hidrofóbica (Toyopearl Phenil 650 M, TosoHass) equilibrada en Tris 20 mM, NaCl 3 M, CaCl_{2} 10 mM, pH 7,4. Después de lavar con dos volúmenes de columna de tampón de equilibrado sin CaCl_{2}, la proteína humana recombinante C se eluyó con Tris 20 mM, pH 7,4.

La proteína eluída se preparó para activación mediante eliminación de calcio residual. La proteína C humana recombinante se pasó a través de una columna de afinidad de metales (Chelex-100, Bio-Rad) para eliminar calcio y unir de nuevo a un intercambiador de aniones (Fast Flow Q, Pharmacia). Ambas de estas columnas se dispusieron en series y equilibraron en Tris 20 mM, NaCl 150 mM, EDTA 5 mM, pH 6,5. Después de la carga de la proteína, la columna de Chelex-100 se lavó con un volumen de columna del mismo tampón antes de desconectarlo de las series. La columna de intercambio aniónico se lavó con 3 volúmenes de columna de tampón de equilibrado antes de que eluya la proteína con NaCl 0,4 M, Tris-acetato 20 mM, pH 6,5. Las concentraciones de proteína de la proteína C humana recombinante y las disoluciones de la proteína C activada recombinante se midieron mediante extinción de UV de 280 nm E^{0,1%}= 1,85 ó 1,95, respectivamente.

Preparación 2

Activación de proteína C humana recombinante

La trombina bovina se acopló a CH-sefarosa activada 4B (Pharmacia) en la presencia de HEPES 50 mM, pH 7,5 a 4ºC. La reacción de acoplamiento se hizo sobre la resina ya empaquetada en una columna que usa aproximadamente 5000 unidades de trombina/ml de resina. La disolución de trombina se hace circular a través de la columna durante aproximadamente 3 horas antes de añadir MEA a una concentración de 0,6 ml/l de una disolución circulante. La disolución que contiene MEA se hizo circular durante unas 10-12 horas adicionales para asegurar el bloqueo completo de las aminas que no han reaccionado de la resina. Después de bloquear, la resina acoplada a trombina se lavó con 10 volúmenes de columna de NaCl 1 M, Tris 20 mM, pH 6,5 para eliminar toda la proteína unida no específicamente, y se usó en reacciones de activación después de equilibrar en tampón de activación.

El r-hPC purificado se hizo 5 mM en EDTA (para quelar cualquier calcio residual) y se diluyó a una concentración de 2 mg/ml con Tris 20 mM, pH 7,4 o Tris-acetato 20 mM, pH 6,5. Este material se pasó a través de una columna de trombina equilibrada a 37ºC con 50 mM de NaCl y, bien con Tris 20 mM a pH 7,4, o bien con Tris-acetato a pH 6,5. La velocidad de flujo se ajustó para permitir durante aproximadamente 20 minutos de tiempo de contacto entre el r-hPC y resina de trombina. El efluente se recogió e inmediatamente se ensayó su actividad amidolítica. Si el material no tenía una actividad específica (amidolítica) comparable a un estándar establecido de aPC, se recicló sobre la columna de trombina para activar el r-hPC hasta su completación. Esto se siguió mediante dilución 1:1 del material con 20 mM de tampón como anteriormente, con un pH de cualquiera entre 7,4 y 6,0 (siendo preferible el pH menor para prevenir autodegradación) para mantener la aPC a concentraciones menores mientras espera la siguiente etapa de procesamiento.

La eliminación de la trombina filtrada a partir del material de aPC se llevó a cabo uniendo la aPC a una resina de intercambio aniónico (Fast Flow Q, Pharmacia) equilibrada en tampón de activación (bien Tris 20 mM, pH 7,4 o bien, preferiblemente Tris-acetato 20 mM, pH 6,5) con NaCl 150 mM. La trombina pasa a través de la columna y eluye durante un lavado con volumen de 2-6 columnas con 20 mM de tampón de equilibrado. La aPC unida se eluye con un gradiente de etapas que usa NaCl 0,4 M bien en Tris-acetato 5 mM, pH 6,5 o bien en Tris 20 mM, pH 7,4. Los lavados de la columna de volumen más alto facilitan la eliminación más completa del dodecapéptido. El material eluído a partir de esta columna se almacenó bien en una disolución congelada o bien como un polvo liofilizado.

La actividad amidolítica (AU) de un aPC se determinó por eliminación de p-nitroanalina del sustrato sintético H-D-Phe-Pip-Arg-p-nitroanilida (S-2238) adquirido de Kabi Vitrum usando un espectrofotómetro de disposición de diodos Beckman DU-7400. Una unidad de proteína activada C se definió como la cantidad de enzima requerida para la liberación de 1 \mumol de p-nitroanilina en 1 minuto a 25ºC, pH 7,4, usando un coeficiente de extinción para p-nitroanilina a 405 nm de 9620 M^{-1}cm^{-1}.

La actividad anticoagulante de la proteína C activada se determinó midiendo la prolongación del tiempo de coagulación en el ensayo de coagulación del tiempo de la tromboplastina parcialmente activada (APTT). Se preparó una curva estándar en tampón de dilución (1 mg/ml de BSA de calidad de radioinmunoensayo, Tris 20 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, NaN_{3} 0,02%) variando en la concentración de proteína C de 125 a 1000 ng/ml, mientras se prepararon muestras a varias diluciones en este intervalo de concentración. A cada cubeta de muestra, se añadieron 50 \mul de plasma de caballo frío y 50 \mul de reactivo de tiempo de tromboplastina parcialmente activado reconstituido (reactivo APTT, Sigma) e incubaron a 37ºC durante 5 minutos. Después de la incubación, se añadieron 50 \mul de las muestras o estándares apropiados a cada cubeta. El tampón de dilución se usó en lugar de muestra o estándar para determinar el tiempo de coagulación basal. El temporizador del fibrómetro (CoA Screener Hemostasis Analyzer, American Labor) se inició tras la adición de 50 \mul de CaCl_{2} 30 mM a 37ºC a cada muestra o estándar. La concentración de proteína C activada en muestras se calcula a partir de la ecuación de regresión lineal de la curva estándar. Los tiempos de coagulación notificados aquí son la media de un mínimo de tres repeticiones, incluyendo muestras de curvas estándar.

Las descripciones anteriores permiten a alguien con habilidad apropiada en la técnica preparar aPC y utilizarla en el tratamiento de estados hipercoagulables asociados con sepsis.

Ejemplo 1 Niveles en plasma humano de aPC

Seis pacientes humanos recibieron una infusión intravenosa de aPC a 1 mg/m^{2}/hora o aproximadamente 0,024 mg/kg/hora durante un periodo de 24 horas. El aPC administrado fue una formulación liofilizada que contenía 10 mg de aPC, tampón Tris-acetato 5 Mm y 100 mM de cloruro de sodio reconstituido con dos mililitros de agua y ajustado a pH 6,5.

Las concentraciones de plasma de aPC se midieron usando un ensayo amidolítico de inmunocaptura. La sangre se recogió en la presencia de un anticoagulante de citrato y benzamidina, un inhibidor reversible de aPC. La enzima se capturó desde plasma mediante un anticuerpo monoclonal murino específico de aPC, C3, inmovilizado en una placa de microvaloración. El inhibidor se eliminó lavando y la actividad amidolítica de aPC se midió usando un sustrato cromogénico de oligopéptidos. Tras la incubación durante 16-20 horas a 37ºC, la absorbancia se midió a 405 nm y los datos se analizaron mediante un algoritmo ajustado a curva lineal proporcionado. Las concentraciones de aPC se estimaron a partir de una curva estándar que varía en concentraciones de 0 a 100 ng/ml. El límite de la cuantificación del ensayo fue 1,0 ng/ml. Los niveles de dosis de aPC y las concentraciones de plasma se midieron a aproximadamente 24 horas. La dosis de 0,024 mg/kg/hora produjo una concentración de plasma de aproximadamente 50 ng/ml a 24 horas.

Ejemplo 2 Ensayo controlado por placebo de doble ciego en pacientes humanos con sepsis, estadio 1

Este protocolo es un ensayo en dos estadios, de doble ciego controlado por placebo en pacientes con sepsis severa. En el estadio 1, se infundió a un total de 72 pacientes durante 48 horas con una proteína C activada humana recombinante (r-aPC).

Los criterios de entrada incluyen tres de los cuatro criterios comúnmente aceptados para la sepsis (velocidad del corazón, esfuerzo respiratorio, temperatura incrementada/disminuida, cuenta de células blancas en sangre incrementada/disminuida). Los pacientes también han de manifestar algún grado de disfunción orgánica definida bien como "shock", bien como salida de orina disminuida, o bien como hipoxemia. Se utilizaron cuatro dosis diferentes: 12, 18, 24 y 30 \mug/kg/hora. El r-aPC se infundió durante 48 horas mediante un procedimiento de infusión continua. Los puntos finales primordiales de este estudio fueron: seguridad como una función de dosis y duración de dosis, y; la capacidad de r-aPC para corregir la coagulopatía como una función de dosis y duración de dosis.

La información de mortalidad incluye todas las dosis, incluso las dosis más bajas, a menos que se indique otra cosa. Es importante notar que nuestra mortalidad con placebo es consistente con la mortalidad anterior al placebo. La mortalidad por todas las causas el día 28 fue el punto final en pacientes que reciben placebo frente a pacientes que reciben r-aPC.

La velocidad de mortalidad con placebo general observada fue del 38% (10/26) y la velocidad de mortalidad con r-aPC general observada fue del 20% (9/46). Un subgrupo que implica sólo las dos dosis superiores de r-aPC (24 y 30 \mug/kg/hora) frente a pacientes con placebo tiene una velocidad de mortalidad observada del 13% (3/24).

Un segundo subgrupo de análisis incluye pacientes con una deficiencia en proteína C adquirida, definida como una actividad basal de proteína C de menos del 60%. De los datos disponibles de los 64 pacientes que tienen actividad basal de proteína C, 61 pacientes o el 95%, tienen una deficiencia de proteína C adquirida al tiempo de entrada en el estudio. La velocidad de mortalidad de placebo observada para los pacientes deficientes en proteína C fue del 41% (9/22) y la velocidad observada de velocidad de mortalidad con r-aPC para los pacientes deficientes en proteína C fue del 18% (7/39).

Una pieza de información significativa sugiere que el tratamiento a dosis bajas con r-APC es de beneficio con pacientes con sepsis severas incluido el tiempo medio de muerte en pacientes con placebo frente a pacientes tratados. De los diez pacientes que murieron en el grupo, el tiempo medio para morir fue de 6 días. En los pacientes tratados con r-aPC, el tiempo medio para morir fue de 14 días. Adicionalmente, 4 de los 9 pacientes quienes murieron en la subdivisión r-aPC del tratamiento sobrevivieron 21 o más días y sucumbieron subsiguientemente a un evento no relacionado con su primer episodio de sepsis. Dos de los cuatro últimos muertos ocurrieron en el grupo de baja dosis (12 \mug/kg/horas). Ambos de estos pacientes permanecían en la Unidad de Cuidados Intensivos (ICU) y se sometieron a ventilación mecánica durante la duración total del estudio hasta su muerte (día 27). Los otros dos pacientes con muertes tardías estaban en el grupo de dosis alta (30 \mug/kg/horas). Ambos de estos pacientes mostraron mejoría inicial. En dos semanas ambos salieron de ventilación mecánica y se trasladaron al ICU. Un paciente murió una semana después de estrés respiratorio inducido por sepsis después de solicitar una orden de "no resucitar" (DNR) en el acto. El segundo paciente murió en el día 28 después de sufrir un episodio de insuficiencia pulmonar relativo a un segundo episodio de sepsis. Este paciente ha requerido también estatus DNR y por lo tanto no se reintubó. Se debería destacar que el retratamiento con r-aPC de pacientes que desarrollan un segundo episodio de sepsis severa durante el día 28 de estudio no se aprobó bajo el protocolo de tratamiento.

La información de mortalidad en este estudio es sorprendente e inesperada. Ningún otro estudio de sepsis controlado por placebo de doble ciego ha generado datos que demuestren una marcada reducción tal en todas las causas de mortalidad en 28 días.

Ejemplo 3 Formulación de proteína C activada

Una formulación liofilizada estable de proteína C activada se preparó mediante un procedimiento el cual comprende liofilizar una disolución que comprende aproximadamente 2,5 mg/ml de proteína C activada, aproximadamente 15 mg/ml de sacarosa, 20 mg/ml de NaCl, y un tampón de citrato de sodio que tiene un pH mayor de 5,5 pero menor de 6,5. Adicionalmente, la formulación liofilizada estable de proteína C activada comprende liofilizar una disolución que comprende 5 mg/ml de proteína C activada, 30 mg/ml de sacarosa, 38 mg/ml de NaCl, y un tampón citrato que tiene un pH mayor que 5,5 pero menor que 6,5.

La razón de aPC:sal:agente para dar volumen (peso:peso:peso) es un factor importante en una formulación adecuada para el procedimiento de secado en frió. La razón varía dependiendo de la concentración de aPC, selección y concentración de sal y selección y concentración del agente para dar volumen. Particularmente, se prefiere una razón de una parte proteína C activada frente a 7,6 partes de sal frente a 6 partes de agente para dar volumen.

Una formulación de dosificación unitaria de proteína C activada adecuada para administración por infusión continua se preparó mezclando proteína C activada, NaCl, sacarosa, y tampón citrato sódico. Después de mezclar, 4 ml de la disolución se transfirieron a un receptáculo de dosificación unitaria y se liofilizaron. El receptáculo de dosificación unitaria que contiene de aproximadamente 5 mg a 20 mg de proteína C activada adecuada para administrar una dosificación de 0,02 \mug/kg/hora a aproximadamente 0,05 \mug/kg/hora a pacientes en necesidad de la misma, se selló y almacenó hasta su uso.

Claims (10)

1. Uso de proteína C activada recombinante en la elaboración de un medicamento para el tratamiento o prevención de un estado hipercoagulable adquirido asociado con sepsis, para administrarse a un paciente humano mediante infusión continua de una dosificación de 20 \mug/kg/hora a 50 \mug/kg/hora de proteína C humana activada durante de 24 a 144 horas, en la que dicha proteína C es obtenible mediante expresión de zimógeno de la proteína C en células HEK 293, seguida de activación in vitro.

2. El uso de acuerdo con la reivindicación 1 en el que dicho paciente humano es un individuo juvenil.

3. El uso de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2 en el que dicho medicamento es para administración y proporcionar una dosificación de 22 \mug/kg/hora a 50 \mug/kg/hora de proteína C activada humana.

4. El uso de acuerdo con la reivindicación 3 en el que dicho medicamento es para administración para proporcionar una dosificación de 22 \mug/kg/hora a 40 \mug/kg/hora de proteína C activada humana.

5. El uso de acuerdo con la reivindicación 3 en el que dicho medicamento es para administración para proporcionar una dosificación de 22 \mug/kg/hora a 30 \mug/kg/hora de proteína C activada humana.

6. El uso de acuerdo con la reivindicación 3 en el que dicho medicamento es para administración para proporcionar una dosificación de 24 \mug/kg/hora a 50 \mug/kg/hora de proteína C activada humana.

7. El uso de acuerdo con la reivindicación 3 en el que dicho medicamento es para administración para proporcionar una dosificación de aproximadamente 24 \mug/kg/hora de proteína C activada humana.

8. El uso de acuerdo con la reivindicación 3 en el que dicho medicamento es para administración para proporcionar una dosificación de aproximadamente 30 \mug/kg/hora de proteína C activada humana.

9. El uso de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2 en el que de un tercio a un medio de la dosis apropiada por hora de dicha proteína C activada es para administración como una inyección intravenosa embolada durante un tiempo de 5 minutos a 120 minutos, seguidos por infusión continua de la dosis apropiada durante de 23 horas a 144 horas lo cual resulta en la dosis apropiada administrada durante de 24 a 144 horas.

10. Uso de proteína C activada recombinante en la elaboración de un medicamento para el tratamiento de un estado hipercoagulable adquirido asociado con sepsis en un paciente humano, siendo dicho medicamento para su administración en una cantidad para lograr un nivel en plasma de una proteína C activada de aproximadamente 50 ng/ml a 24 horas, en el que dicha proteína C activada es obtenible mediante expresión del zimógeno de proteína C en células HEK 293, seguidas por activación in vitro.