ES2257794T3

ES2257794T3 - Procedimientos para tratar trastornos vasculares con proteina c activada.

Info

Publication number: ES2257794T3
Application number: ES98302165T
Authority: ES
Inventors: Brian William Grinnell; Daniel Charles Howey; Charles Van Jackson
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 1997-03-24
Filing date: 1998-03-24
Publication date: 2006-08-01
Anticipated expiration: 2018-03-24
Also published as: WO1998042358A1; ATE319472T1; KR20010005626A; IL131615A0; JP2001518933A; NO994630D0; ID23176A; BR9808063A; TW513307B; AU6474198A; TR199902335T2; JP4680329B2; CA2284279A1; NZ337291A; CN1168492C; EA199900862A1; DE69833727D1; EP0872245B1; NO994630L; AU733756B2

Abstract

SE DESCRIBE EL USO DE PROTEINA C ACTIVADA PARA LA FABRICACION DE UN MEDICAMENTO PARA EL TRATAMIENTO DE TRASTORNOS VASCULARES Y OCLUSIVOS CON UNA DOSIS DE APROXIMADAMENTE 0,01 MG/KG/HR A 0,05 MG/KG/HR.

Description

Procedimientos para tratar trastornos vasculares con proteína C activada.

Campo de la invención

Esta invención se refiere a la ciencia médica, en particular al tratamiento de trastornos vasculares con proteína C humana activada.

Antecedentes de la invención

La Proteína C es una serinaproteasa y anticoagulante natural que desempeña un papel en la regulación de la homeostasis a través de la desactivación del los factores V_{a} y VIII_{a} de la cascada de la coagulación. in vivo, la proteína C humana se forma, principalmente, en el hígado como un único polipéptido de 461 aminoácidos. Esta molécula precursora experimenta múltiples modificaciones postraduccionales, incluidas 1) la escisión de una secuencia señalizadora de 42 aminoácidos; 2) la eliminación proteolítica del zimógeno monocatenario del residuo de lisina localizado en posición 155 y del residuo de arginina de la posición 156, para formar la forma bicatenaria de la molécula, (es decir, una cadena ligera de 155 residuos de aminoácidos unida a través de un puente disulfuro a la cadena pesada que contiene la serina proteasa de 262 residuos de aminoácidos); 3) la carboxilación dependiente de vitamina K de nueve residuos de ácido glutámico en los primeros 42 aminoácidos de la cadena ligera, lo que tiene como resultado 9 residuos de ácido gamma- carboxiglutámico; y 4) la unión de hidratos de carbono en cuatro puntos (uno en la cadena ligera y tres en la cadena pesada). La cadena pesada contiene la bien establecida tríada de serinaproteasa de Asp 257, His 211 y Ser 360. Por último, el zimógeno bicatenario circulante es activado in vivo por la trombina en una superficie de fosfolípidos en presencia de ion calcio. La activación es el resultado de la eliminación de un dodecapéptido en el extremo N de la cadena pesada, lo que produce una proteína C activada (aPC) que posee actividad enzimática.

Junto con otras proteínas, la proteína C funciona como quizá el más importante regulador por disminución de la coagulación sanguínea. En otras palabras, el sistema enzimático de la proteína C representa un mecanismo fisiológico principal de la anticoagulación.

La mejor manera de ver el sistema de coagulación es como una reacción en cadena que implica la activación secuencial de zimógenos en serinaproteasas activas que, en último término, producen la enzima, la trombina, que a través de una proteolisis limitada convierte el fibrinógeno plasmático en el gel insoluble, fibrina. Dos acontecimientos clave en la cascada de la coagulación son la conversión del factor de coagulación X en Xa por el factor de coagulación IXa y la conversión de la protrombina en trombina por la acción del factor de coagulación Xa. Estas dos reacciones se producen sobre las superficies de las células, más notablemente en la superficie de las plaquetas. Estas dos reacciones requieren cofactores. Los cofactores principales, los factores V y VIII, del sistema circulan como precursores relativamente inactivos, pero cuando se forman las primeras pocas moléculas de trombina, la trombina vuelve y activa los cofactores mediante proteolisis limitada. Los cofactores activados, Va y VIIIa, multiplican la velocidad de la conversión de la protrombina en trombina, así como de la conversión del factor X en factor Xa, por aproximadamente cinco órdenes de magnitud. La proteína C activada prefiere de forma abrumadora dos sustratos de proteínas plasmáticas que hidroliza y destruye de forma irreversible. Estos sustratos de proteínas plasmáticas son las formas activadas de los cofactores de coagulación Va y VIIIa. La proteína C activada degrada sólo mínimamente los precursores inactivados, los factores de coagulación V y VIII. En perros, se ha mostrado que la proteína C activada incrementa de forma brusca los niveles circulantes de la principal enzima fibrinolítica fisiológica, el activador de plasminógeno tisular (tPA). In vitro, se ha mostrado que la proteína C activada potencia la lisis de fibrina en sangre entera humana. Por tanto, la proteína C activada representa un auxiliar importante de la fibrinolisis in vivo en el
hombre.

Hoy en día, se dispone de pocos tratamientos eficaces para las oclusiones vasculares, incluido el accidente cerebrovascular trombótico. Recientemente, la FDA ha aprobado el tratamiento con tPA si se administra dentro de las primeras tres horas del inicio del accidente cerebrovascular. El tratamiento de los accidentes cerebrovasculares con heparina o con anticoagulantes orales, aunque e ocasiones es beneficioso, conlleva un riesgo elevado de hemorragia en la zona cerebral infartada.

Griffin y col., en la patente de EE.UU. nº 5.084.274 ha presentado el uso de aPC recombinante (r-aPC) en el tratamiento de la oclusión trombótica o la tromboembolia en un modelo de babuino. Griffin indicó niveles de dosis dentro del intervalo de 0,2 mg/kg/h a 1,1 mg/kg/h para el tratamiento de la oclusión trombótica. Sin embargo, los solicitantes han descubierto que estos niveles de dosis se encuentran dentro de un intervalo significativamente por encima del nivel toxicológico de la r-aPC. Por ejemplo, los estudios toxicológicos preclínicos realizados con primates no humanos indican que la seguridad de la r-aPC para una infusión de 96 horas está limitada a una dosis máxima de aproximadamente 0,05 mg/kg/h. Por tanto, el nivel de dosis menor indicado por Griffin y col., es decir 0,2 mg/kg/h, se encuentra a un nivel 4 veces mayor que la dosis tóxica establecida por los solicitantes para seres humanos. Por tanto, incluso el nivel de dosis menor indicado por Griffin conllevaría un riesgo elevado de hemorragia en la zona cerebral infartada, lo que agravaría el déficit que acompaña al accidente cerebrovascular. En consecuencia, incluso a la luz de las enseñanzas de Griffin y col., sigue existiendo una necesidad de identificar un tratamiento eficaz de la formación de trombos arteriales en seres humanos con aPC.

En contra de las enseñanzas de investigadores anteriores, los solicitantes que sólo el tratamiento con dosis bajas de r-aPC es útil en el tratamiento del accidente cerebrovascular trombótico. La administración de aPC también es beneficiosa a la hora de prevenir la extensión local del trombo arterial ocluyente microvascular y macrovascular, lo que reduce el déficit neurológico que resulta del accidente cerebrovascular.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona el uso de proteína C activada humana para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de trastornos tromboembólicos arteriales y vasculares oclusivos humanos, donde dicho medicamento es una composición farmacéutica que consiste, esencialmente, en proteína C activada humana formulada para la administración a una dosis de 0,01 mg/kg/h a 0,05 mg/kg/h.

Esta invención también proporciona el uso de proteína C activada humana para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de trastornos tromboembólicos arteriales y vasculares oclusivos humanos, donde dicho medicamento es una composición farmacéutica que consiste, esencialmente, en proteína C activada humana formulada para la administración a una dosis de 0,01 mg/kg/h a 0,05 mg/kg/h y donde dicho medicamento se proporciona en una forma farmacéutica monodosis, en un recipiente de monodosis que contiene de 5 a 20 mg de proteína C activada humana adecuada para su disolución en una solución estéril para la administración a dicha dosis mediante infusión
continua.

Descripción detallada de la invención

Para los fines de la presente invención, como se describe y reivindica en la presente memoria descriptiva, los términos siguientes son como se define a continuación.

aPC o proteína C activada se refiere a la proteína C, ya sea recombinante o derivada de plasma. aPC incluye, y preferiblemente lo es, la proteína C humana, aunque aPC también puede incluir otras especies o derivados que posean actividades proteolítica, amidolítica, esterolítica y biológica (anticoagulante o pro-fibrinolítica) de proteína C. Gerlitz, y col., en la patente de EE.UU. nº 5.453.373, y Foster y col., en la patente de EE.UU. nº 5.516.650, describen ejemplos de derivados de proteína C.

TTPA- tiempo de tromboplastina parcial activada.

UA- unidades amidolíticas.

PCH- zimógeno de proteína C humana

MEA- 2-aminoetanol.

tPA- activador de plasminógeno tisular.

r-PCH- zimógeno de proteína C humana recombinante

r-aPC-proteína C activada recombinante producida mediante la activación del zimógeno de la proteína C in vitro o in vivo o mediante secreción directa de la forma activada de la proteína C de células procarióticas, células eucarióticas o animales transgénicos, incluida, por ejemplo, la secreción a partir de células 293 renales humanas como un zimógeno, después purificada y activada mediante técnicas bien conocidas para el experto en la técnica y demostradas por Yan, patente de EE.UU. nº 4.981.952, y por Cottingham, documento WO 97/20043.

Infusión continua- R la introducción continua sustancialmente ininterrumpida de una solución en un vaso sanguíneo durante un periodo específico de tiempo.

Inyección en bolo- la inyección de un fármaco en una cantidad definida (denominada bolo) durante un periodo de tiempo de hasta 120 minutos.

Adecuado para administración- Una formulación o solución preparada preferentemente a partir de aPC liofilizada que es adecuada para administrar como agente terapéutico.

Zimógeno- precursor enzimáticamente inactivo de una enzima proteolítica. El zimógeno de proteína C. como se usa en la presente memoria descriptiva, se refiere a formas inactivas, secretadas, monocatenarias o bicatenarias, de la proteína C.

Los solicitantes han encontrado que en estudios de toxicología preclínicos realizados en primates no humanos se indica que la seguridad de la r-aPC para una infusión de 96 horas está limitada a una dosis máxima de aproximadamente 0,05 mg/kg/h. Estos datos son inesperados cuando se comparan con la técnica anterior. De hecho, los niveles de dosis de la r-aPC para seres humanos que se han basado en estudios previos preclínicos y clínicos están por encima del intervalo toxicológico establecido en los estudios toxicológicos anteriores.

La presente invención proporciona el uso de la proteína C activada humana para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de trastornos tromboembólicos arteriales y vasculares oclusivos humanos, donde dicho medicamento es una composición farmacéutica que consiste, esencialmente, en proteína C activada humana formulada para la administración a una dosis de 0,01 mg/kg/h a 0,05 mg/kg/h.

La administración de la proteína C activada humana a niveles de dosis bajos es útil para el tratamiento del accidente cerebrovascular trombótico sin los problemas hemorrágicos concomitantes que pueden asociarse con niveles de dosis elevados. La presente invención además demuestra usar la proteína C humana recombinante (r-aPC) en un estudio clínico con seres humanos para determinar la concentración en plasma sanguíneo de r-aPC (Ejemplo 11).

La presente invención también demuestra el efecto de la administración intravenosa de una r-aPC sobre la reperfusión de arterias coronarias totalmente ocluidas en un modelo canino de trombosis oclusiva de arterias coronarias (Ejemplo 2). Sorprendentemente, en cinco de seis animales tratados con r-aPC se demostró reperfusión de los vasos en comparación con la reperfusión de vasos en ninguno de los seis animales control.

La presente invención se refiere al tratamiento con proteína C activada humana de trastornos vasculares oclusivos arteriales o tromboembólicos humanos, incluidos el accidente cerebrovascular trombótico, la trombosis arterial periférica, los émbolos que se originan en el corazón o las arterias periféricas, el infarto de miocardio agudo y la enfermedad de arterias coronarias.

La aPC se puede formular de acuerdo con procedimientos conocidos para preparar composiciones farmacéuticamente útiles. Preferentemente, la aPC se administra por vía parenteral para garantizar su liberación en la circulación sanguínea en una forma eficaz mediante la inyección de la dosis adecuada como infusión continua durante de una a cuarenta y ocho horas. Más preferentemente, la dosis adecuada de aPC se administrará mediante infusión continua durante de 4 a 36 horas. Incluso más preferentemente, la dosis adecuada de aPC se administrará mediante infusión continua durante de 12 a 24 horas. Más preferentemente, la dosis adecuada de aPC se administrará mediante infusión continua durante aproximadamente 24 horas. La administración de aPC comenzará lo antes posible después del diagnóstico del accidente cerebrovascular.

La cantidad de aPC administrada es de 0,01 mg/kg/h a 0,05 mg/kg/h, que es equivalente a de 20 mg/70 kg/24 horas a 84 mg/70 kg/24 horas. Aunque el nivel de dosis se identifica como una cantidad específica por 24 horas, un experto en la técnica reconocería que esto es una designación del nivel de dosis y que no está necesariamente limitado a una infusión de 24 horas sino que puede incluir infusión continua durante diversos tiempos, por ejemplo de una hora a cuarenta y ocho horas. Más preferentemente, la cantidad de aPC administrada es de 0,01 mg/kg/h a 0,04 mg/kg/h (de 20 mg/70 kg/24 horas a 67 mg/70 kg/24 horas). Aunque más preferentemente, la cantidad de aPC administrada será de 0,01 mg/kg/h a 0,03 mg/kg/h (de 20 mg/70 kg/24 horas a 50 mg/70 kg/24 horas). La cantidad más preferida de aPC administrada es de 0,024 mg/kg/h (40 mg/70 kg/24 horas).

Como alternativa, la aPC se administrará mediante la inyección de una porción de la dosis adecuada por hora en forma de inyección en bolo en un tiempo desde 5 minutos a 30 minutos, seguida por la infusión continua de la dosis adecuada durante veintitrés horas a 47 horas, que tiene como resultado la administración de la dosis adecuada en de 24 horas a 48 horas.

Como se ha indicado anteriormente, los niveles de dosis de aPC presentados antes contrastan con los presentados por Griffin y col. Griffin reclamó niveles de dosis dentro del intervalo de 0,2 mg/kg/h a 1,1 mg/kg/h para el tratamiento de la oclusión trombótica. En contraste, los niveles de dosis reivindicados en la presente memoria descriptiva son equivalentes a un décimo de esta dosis o a un intervalo de 0,01 mg/kg/h a 0,05 mg/kg/h. El nivel de dosis más preferible para la administración de la aPC para la oclusión trombótica como se ha descrito en la presente memoria descriptiva será 0,024 mg/kg/h. Es significativo observar que el nivel de dosis más preferible de 0,024 mg/kg/h como se indica en la presente memoria descriptiva es 8 veces menor que el nivel de dosis más bajo reivindicado por Griffin y 44 veces menor que el nivel de dosis mayor reivindicado por Griffin.

Preparación 1

Preparación de proteína C humana

La proteína C recombinante humana (rPCH) se produjo en células renales humanas 293 mediante técnicas bien conocidas para el experto en la técnica, tales como las que se exponen en Yan, patente de EE.UU. nº 4.981.952. El gen que codifica la proteína C humana se describe y reivindica en Bang y col., patente de EE.UU. nº 4.775.624. El plásmido usado para expresar la proteína C humana en las células 293 fue el plásmido pLPC, que se describe en Bang y col., patente de EE.UU. nº 4.992.373. La construcción del plásmido pLPC también se describe en la publicación de patente europea nº 0 445 939 y en Grinnell y col., 1987, Bio/Technology 5:1189-1192. Brevemente, se realizó la transfección del plásmido en las células 293, a continuación se identificaron los transformantes estables, se subcultivaron y se indujo el crecimiento en medio sin suero. Tras la fermentación, el medio sin las células se obtuvo mediante
microfiltración.

La proteína C humana se separó del líquido de cultivo mediante una adaptación de las técnicas de Yan, patente de EE.UU. nº 4.981.952. El medio clarificado se convirtió en 4 mM en EDTA antes de su absorción en una resina de intercambio aniónico (Fast-Flow Q, Pharmacia). Después de lavar con 4 volúmenes de columna de Tris 20 mM, NaCl 200 mM, pH 7,4 y 2 volúmenes de columna de Tris 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4, el zimógeno de proteína C humana recombinante unido se eluyó con Tris 20 mM, NaCl 150 mM, CaCl_{2} 10 mM, pH 7,4. La proteína eluida tenía una pureza superior al 95% tras la elución, como lo indica la electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS.

La posterior purificación de la proteína se consiguió haciendo la proteína 3M en NaCl, seguido por la absorción en una resina de interacción hidrófoba (Toyopearl Phenyl 650M, TosoHaas) equilibrada en Tris 20 mM, NaCl 3M, CaCl_{2} 10 mM, pH 7,4. Después de lavar con 2 volúmenes de columna de tampón de equilibrado sin CaCl_{2}, se eluyó la proteína C humana recombinante con Tris 20 mM, pH 7,4.

La proteína eluida se preparó para su activación mediante la eliminación del calcio residual. La proteína C humana recombinante se pasó por una columna de afinidad metálica (Chelex-100, Bio-Rad) para eliminar el calcio y se unió de nuevo a un intercambiador de aniones (Fast Flow Q, Pharmacia). Estas dos columnas se dispusieron en serie y se equilibraron en Tris 20 mM, NaCl 150 mM, EDTA 5 mM, pH 6,5. Después de la carga de la proteína, la columna Chelex-100 se lavó con un volumen de columna del mismo tampón antes de desconectarla de la serie. La columna de intercambio aniónico se lavó con 3 volúmenes de columna de tampón de equilibrado antes de eluir la proteína con NaCl 0,4 M, Tris 20 mM-acetato, pH 6,5. Las concentraciones proteicas de la proteína C humana recombinantes y las soluciones de proteína C recombinante activada se midieron mediante extinción a UV 280 nm E^{0,1%}= 1,85 o 1,95 respectivamente.

Preparación 2

Activación de la proteína C humana recombinante

Se acopló trombina bovina a CH-Sefarosa 4B activada (Pharmacia) en presencia de HEPES 50 mM, pH 7,5 a 4ºC. La reacción de acoplamiento se realizó en una resina ya introducida en una columna usando aproximadamente 5000 unidades de trombina/ml de resina. La solución de trombina se hizo circular a través de la columna durante aproximadamente 3 horas antes de añadir MEA a una concentración de 0,6 ml/l de solución circulante. La solución que contenía MEA se hizo circular durante 10-12 horas adicionales para garantizar el bloqueo completo de las aminas sin reaccionar en la resina. Después del bloqueo, la resina acoplada a trombina se lavó con 10 volúmenes de columna de NaCl 1M, Tris 20 mM, pH 6,5 para eliminar toda la proteína unida de forma inespecífica y se usó en reacciones de activación tras equilibrar en tampón de activación.

La rPCH purificada se hizo 5 mM en EDTA (para quelar cualquier calcio residual) y se diluyó hasta una concentración de 2 mg/ml con Tris 20 mM, pH 7,4 o Tris 20 mM-acetato, pH 6,5. Este material se pasó a través de una columna de trombina equilibrada a 37ºC con NaCl 50 mM y Tris 20 mM, pH 7,4 o Tris 20 mM- acetato, pH 6,5. Se ajustó la velocidad del flujo para permitir un tiempo de contacto entre la rPCH y la resina de trombina durante aproximadamente 20 minutos. Se recogió el efluente e inmediatamente se analizó para determinar la actividad amidolítica. Si el material no tenía una actividad específica (amidolítica) comparable con un patrón establecido de aPC, se recicló por la columna de trombina para activar la rPHC hasta la finalización. A esto le siguió la dilución 1:1 del material con tampón 20 mM como anteriormente, con un pH cualquiera entre 7,4 o 6,0 (siendo preferible el pH menor para impedir la autodegradación) para mantener la aPC a concentraciones menores mientras se esperaba la siguiente etapa de procesamiento.

La eliminación de la trombina lixiviada del material aPC se realizó mediante la unión de la aPC a una resina de intercambio de aniones (Fast Flow Q, Pharmacia) equilibrada en tampón de activación (bien Tris 20 mM, pH 7,4 o, preferentemente, Tris 20 mM-acetato pH 6,5) con NaCl 150 mM. La trombina atraviesa la columna y eluye durante un lavado con 2-6 volúmenes de columna con tampón de equilibrado 20 mM. La aPC unida se eluye con un gradiente escalonado usando NaCl 0,4M en Tris 5 mM-acetato, pH 6,5 o Tris 20 mM, pH 7,4. Lavados con volúmenes de la columna mayores facilitaron una eliminación más completa del dodecapéptido. El material eluido de esta columna se almacenó en una solución congelada (-20ºC) o en forma de polvo liofilizado.

La actividad amidolítica (UA) de una aPC se determinó mediante liberación de p- nitroanilina del sustrato sintético H-D-Phe-Pip-Arg-p-nitroanilida (S-2238) obtenido de Kabi Vitrum usando un espectrofotómetro con matriz de diodos Beckman DU-7400. Se definió una unidad de proteína C activada como la cantidad de enzima requerida para la liberación de 1 mmol de p-nitroanilina en 1 min a 25ºC, pH 7,4, usando un coeficiente de extinción para la p-nitroanilina a 405 nm de 9620 M^{-1}cm^{-1}.

La actividad anticoagulante de la proteína C activada se determinó midiendo la prolongación del tiempo de coagulación en el análisis de coagulación con el tiempo de tromboplastina parcial activada (TTPA). Se preparó una curva patrón en tampón de dilución (1 mg/ml de BSA para radioinmunoensayo, Tris 20 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, NaN_{3} 0,02%) con una concentración de proteína C variable de 125-1000 ng/ml, mientras que las muestras se prepararon a varias diluciones en este intervalo de concentraciones. A cada cubeta con la muestra se añadieron 50 \mul de plasma frío de caballo y 50 \mul de reactivo reconstituido para el tiempo de tromboplastina parcial activada (reactivo para TTPA, Sigma) y se incubó a 37ºC durante 5 min. Tras la incubación, a cada cubeta se añadieron 50 \mul de las muestras o los patrones adecuados. En lugar de la muestra o el patrón se usó tampón de dilución para determinar el tiempo de coagulación basal. Tras la adición a cada muestra o patrón de 50 \mul a 37ºC CaCl_{2} 30 mM se puso en marcha el cronómetro del fibrómetro (CoA Screener Hemostasis Analyzer, American Labor). La concentración de proteína C activada en las muestras se calcula a partir de la ecuación de regresión lineal de la curva patrón. Los tiempos de coagulación que se comunican en la presente son la media de un mínimo de tres duplicados, incluidas las muestras de la curva patrón.

Las descripciones anteriores proporcionan la experiencia adecuada en la técnica para preparar aPC para su uso en el tratamiento del accidente cerebrovascular trombótico.

Ejemplo 1 Niveles en plasma humano de aPC

Seis pacientes humanos recibieron una infusión iv de aPC a 1 mg/m2/hora o aproximadamente 0,024 mg/kg/h en un periodo de 24 horas. La aPC administrada fue una formulación liofilizada que contenía 10 mg de aPC, tampón Tris acetato 5 mM y cloruro sódico 100 mM reconstituida con dos ml de agua y ajustada a un pH 6,5.

Las concentraciones en plasma de aPC se midieron usando un ensayo de Inmunocaptación-amidolítico. La sangre se recogió en presencia de anticoagulante citrato y benzamidina, un inhibidor reversible de la aPC. La enzima fue capturada del plasma con un anticuerpo monoclonal murino específico para aPC, C3, inmovilizado en la placa de microtitulación. El inhibidor se eliminó mediante lavado y la actividad amidolítica o aPC se midió usando un sustrato cromogénico oligopeptídico. Tras la incubación durante 16-20 h a 37ºC, se midió la absorbancia a 405 nm y los datos se analizaron mediante un algoritmo de ajuste de la curva lineal potenciada. Las concentraciones de aPC se estimaron a partir de una curva patrón de concentraciones variables de 0-100 ng/ml. El límite de cuantificación del ensayo fue 1,0 ng/ml. Los niveles de dosis de la aPC y las concentraciones en plasma se midieron a aproximadamente 24 horas. Los límites plasmáticos están comprendidos entre 2 ng/ml y menos de 100 ng/ml. Preferentemente, Los límites plasmáticos se encuentran entre 30 ng/ml y 60 ng/ml y, todavía más preferentemente, 50 ng/ml. Por tanto, la dosis de 0,024 mg/kg/h da la concentración plasmática más preferible de 50 mg/ml a 24 horas para el tratamiento del accidente cerebrovascular trombótico sin los problemas hemorrágicos concomitantes de los niveles de dosis mayores.

Ejemplo 2 Reperfusión inducida en un modelo canino de trombosis oclusiva de las arterias coronarias

Doce perros (de 17-22 kg, ambos sexos, Butler Farms) se anestesiaron con pentobarbital sódico (30 mg/kg, iv) y recibieron ventilación con aire ambiente. Se insertaron cánulas para medir la presión arterial, la administración de fármacos y la extracción de muestras de sangre de la arteria carótida, la vena femoral y la vena yugular, respectivamente. Se realizó una toracotomía izquierda, el corazón se suspendió en una cuna pericárdica y se aisló un segmento de 2 cm de la arteria coronaria circunfleja izquierda (ACCI) en posición proximal a la primera rama diagonal principal- La ACCI se sondó con una sonda de flujo electromagnético, electrodos estimulantes y un oclusor externo para medir el flujo de sangre en las coronarias, producir lesión vascular y proporcionar estenosis crítica, respectivamente. La lesión vascular se produjo colocando el electrodo estimulante (ánodo) en contacto con el lado íntimo del vaso y estimulando el ánodo con corriente de 100 \mu A d.c. (el circuito se completó mediante la colocación del cátodo en un punto subcutáneo). La corriente para inducir la lesión continuó durante 60 minutos y después se detuvo estuviera el vaso ocluido o no. Los vasos alcanzaron la oclusión total transcurridos aproximadamente 60 minutos del inicio de la lesión vascular. Treinta minutos después de la oclusión total de los vasos (establecida como un flujo en las arterias coronarias de cero durante 30 minutos), una infusión intravenosa continua de 2,0 mg/kg/h o 20 ml de tampón Tris, pH 7,4 (grupo tratado con vehículo) se infundió durante 2 horas. Se realizó un seguimiento de las preparaciones durante 4 horas desde el punto de inicio de la lesión en la ACCI. Se determinaron la presión arterial, la frecuencia cardíaca y el flujo de sanguíneo coronario y se analizaron. Se extrajeron muestras de sangre a tiempos diferentes durante todo el experimento para determinar los tiempos de coagulación sanguínea (Hemochron 801), y los tiempos de sangrado gingival de referencia se determinaron usando un dispositivo de tiempo de sangrado Simplate II. Una segunda serie de muestras de sangre (citradas) se recogió durante el experimento para la determinación del inhibidor del activador de plasminógeno en plasma 1(PAI-1). Los niveles plasmáticos de PAI-1 se determinaron utilizando un kit de ELISA IMUBINDÔ (American Diagnostica). Todos los datos (comunicados como la media \pm EME) se analizaron en busca de diferencias estadísticas con un ANOVA simple seguido por un análisis de Student-Neuman-Keuls para determinar la significación a nivel de p-0,05. La incidencia de la reperfusión y permeabilidad se analizaron con una prueba exacta de Fisher a un nivel de p< 0,05.

Una infusión continua de 2,0 mg/kg/h de aPC produjo un incremento de 6 veces el tiempo de coagulación en sangre entera con TTPA al final de la infusión de 2 horas (tabla 1). El TTPA había comenzado a volver a sus valores normales hacia el final del experimento. No se produjo ningún efecto observable sobre el tiempo de coagulación de la trombina o el tiempo de sangrado de referencia. Los resultados se indican en la Tabla 2.

TABLA 2 Efectos de la aPC sobre los tiempos de coagulación y de sangrado de referencia en el perro anestesiado

Tratamiento	Parámetro	Prefármaco	Inf. 60 minutos	Inf. 120 min	Fin.
Vehículo	Tiempo de trombina(s)	36 \pm 1	38 \pm 4	33 \pm 1	34 \pm 1
a	TTPA(s)	100 \pm 6	95 \pm 5	89 \pm 10	91 \pm 10
(n= 6)	Tiempo de sangrado de
	referencia(s)	132 \pm 15	182 \pm 14	152 \pm 15	159 \pm 13
aPC*	Tiempo de trombina(s)	33 \pm 1	34 \pm 1	34 \pm 1	34 \pm 1
(n= 6)	TTPA(s)	96 \pm 6	573 \pm 237	670 \pm 209	138 \pm 13
	Tiempo de sangrado de
	referencia(s)	199 \pm 41	272 \pm 84	204 \pm 20	193 \pm 39
\; \begin{minipage}[t]{153mm} El régimen de dosificación usado para el grupo tratado con vehículo fue de 20 ml de solución salina tamponada-Tris en infusión durante 2 h y la administración de aPC (2,0 mg/kg/h x 2 horas) comenzó 30 minutos después de la oclusión total del vaso.\end{minipage}
* \begin{minipage}[t]{153mm} Indica existencia de diferencia estadística al nivel de p< 0,05 frente al grupo tratado con vehículo. Cada valor representa la media \pm EME. \end{minipage}

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La Tabla 3 ilustra los efectos de la administración intravenosa de aPC sobre la reperfusión de arterias coronarias totalmente ocluidas. El tiempo hasta la oclusión trombótica total de las arterias coronarias fue similar en los 2 grupos; 66 \pm 7 y 62 \pm 6 minutos en el grupo tratado con vehículo y el tratado con aPC respectivamente. En cinco de seis vasos del grupo tratado con aPC se demostró reperfusión en comparación con ninguno de los 6 vasos del grupo que recibió vehículo; el tiempo hasta la reperfusión en el grupo tratado con aPC fue de 128 \pm 17 min. El flujo sanguíneo coronario en el grupo tratado con aPC fue significativamente mayor que el correspondiente en el grupo tratado con vehículo; el grupo tratado con aPC alcanzó 13,7 \pm 2,7 ml/min durante el periodo de reperfusión y un volumen de flujo de 1069 \pm 623 ml (esto representa un restablecimiento de aproximadamente el 60-70% del flujo sanguíneo coronario existente antes de la trombosis en este grupo). Tres de los cinco vasos expuestos a aPC siguieron siendo permeables al final de las 4 horas de experimento. Por tanto, los datos demuestran que la aPC es eficaz en el tratamiento de la trombosis oclusiva de las arterias coronarias en un modelo canino.

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TABLA 3 Efectos de la aPC sobre el restablecimiento del flujo sanguíneo coronario en el modelo canino de trombosis de arterias coronarias

Parámetro	Vehículo	aPC
	(n= 6)	(n= 6)
Tiempo hasta la oclusión (min)	66 \pm 7	62 \pm 6
Masa del trombo (mg)	10,8 \pm 2,1	8,2 \pm 1,2
Incidencia de reperfusión	0	5 de 6*
Tiempo hasta la reperfusión (min)	0	128 \pm 17*
Permeabilidad del vaso al final del experimento	0 de 6	3 de 5
FSC durante la reperfusión (ml/min)	0	13,7 \pm 2,7*
Volumen de reperfusión (ml)	0	1069 \pm 623
* \begin{minipage}[t]{153mm}Indica la existencia de una diferencia estadística al nivel de p< 0,05 frente al grupo tratado con vehículo. Cada valor representa la media \pm SEM. \end{minipage}

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Las muestras de sangre extraídas durante cada experimento demostraron la existencia de una correlación significativa con la infusión intravenosa de una aPC y niveles circulantes del inhibidor del activador del plasminógeno-1 (PAI-1). Al final de la infusión intravenosa de aPC, los niveles plasmáticos de PAI-1 habían disminuido un 80%. Tras el cese de la infusión de aPC, los niveles plasmáticos de PAI-1 comenzaron a retornar a los niveles anteriores a la infusión.

Aunque estos niveles de dosis en este modelo canino parecen ser superiores a los niveles de dosis indicados para seres humanos, los solicitantes han descubierto que el perro es especialmente insensible a la proteína C activada humana, por tanto, los niveles de dosis indicados son adecuados para seres humanos.

Claims

1. Uso de proteína C activada humana para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de trastornos tromboembólicos arteriales y oclusivos vasculares humanos, en el que dicho medicamento es una composición farmacéutica consistente esencialmente en proteína C activada humana formulada para la administración a una dosis de 0,01 mg/kg/h a 0,05 mg/kg/h.

2. Uso como se reivindica en la reivindicación 1, en el que el trastorno oclusivo vascular o tromboembólico es accidente cerebrovascular trombótico.

3. Uso como se reivindica en la reivindicación 1, en el que el trastorno oclusivo vascular o tromboembólico es trombosis arterial periférica.

4. Uso como se reivindica en la reivindicación 1, en el que el trastorno oclusivo vascular o tromboembólico es un émbolo procedente del corazón o las arterias periféricas.

5. Uso como se reivindica en la reivindicación 1, en el que el trastorno oclusivo vascular o tromboembólico es infarto de miocardio agudo y enfermedad de las arterias coronarias.

6. Uso como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que la dosis es 0,01 mg/kg/h a 0,03 mg/kg/h de proteína C activada humana.

7. Uso como se reivindica en la reivindicación 6, en el que la dosis es 0,024 mg/kg/h de proteína C activada humana.

8. Uso como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que la concentración en plasma sanguíneo de proteína C activada humana es de 2 ng/ml a menos de 100 ng/ml.

9. Uso según la reivindicación 8, en el que en el que la concentración en plasma sanguíneo de proteína C activada humana es de 20 ng/ml a 80 ng/ml.

10. Uso según la reivindicación 8 o la reivindicación 9, en el que la concentración en plasma sanguíneo de proteína C activada humana es de 30 ng/ml a 60 ng/ml.

11. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, en el que la concentración en plasma sanguíneo de proteína C activada humana es de 50 ng/ml.

12. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que la administración se realiza mediante inyección en bolo durante hasta 120 minutos.

13. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que la administración se realiza mediante infusión continua durante de 1 a 48 horas.

14. Uso de una proteína C activada humana para la fabricación de un medicamento según la reivindicación 1, en el que dicho medicamento se proporciona en una forma farmacéutica monodosis, en un recipiente de monodosis que contenga de 5 a 20 mg de proteína C activada humana adecuada para su disolución en una solución estéril para la administración a dicha dosis mediante infusión continua.

15. Uso según la reivindicación 14, en el que la proteína C activada humana está liofilizada.

16. Uso según la reivindicación 14 o la reivindicación 15, en el que la administración se realiza mediante infusión continua durante de 1 a 48 horas.