ES2234072T3

ES2234072T3 - Formulaciones de proteina c activada.

Info

Publication number: ES2234072T3
Application number: ES98303311T
Authority: ES
Inventors: Andrew David Carlson; Theodore Arsay Sheliga
Original assignee: Eli Lilly and Co
Current assignee: Eli Lilly and Co
Priority date: 1997-04-28
Filing date: 1998-04-28
Publication date: 2005-06-16
Anticipated expiration: 2018-04-28
Also published as: NZ337828A; PE86299A1; AU7258998A; CA2287267C; AU743531B2; NO995198D0; CN1235638C; EP0875563A3; TR199902631T2; IL132502A0; WO1998048822A1; SV1998000050A; PL195642B1; JP4383546B2; IL132325A; EA199900979A1; JP2001524111A; EP0875252B1; KR100564189B1; AU740753B2

Abstract

LA PRESENTE INVENCION TRATA DE FORMULADOS FARMACEUTICOS DE PROTEINA C ACTIVADA QUE TAMBIEN INCLUYEN SACAROSA, CLORURO DE SODIO Y TAMPON DE CITRATO DE SODIO A UN PH ENTRE APROXIMADAMENTE 5,5 Y 6,5. LOS FORMULADOS DE PROTEINA C ACTIVADA DE LA PRESENTE INVENCION SON MAS ESTABLES QUE OTROS FORMULADOS DE PROTEINA C ACTIVADA, Y MUESTRAN MENOS PRODUCTOS DE DEGRADACION A LO LARGO DEL TIEMPO.

Description

Formulaciones de proteína C activada.

Esta invención pertenece al campo de la medicina humana, de manera particular al tratamiento de trastornos vasculares con proteína C activada. De manera más específica, la presente invención se refiere a formulaciones de la proteína C humana activada.

La proteína C es una serina proteasa, y es un anticoagulante que se produce de forma natural y que juega un papel en la regulación de la homeostasis, inactivando los factores V_{a} y VIII_{a} en la coagulación en cascada. La proteína C humana se fabrica in vivo principalmente en el hígado como un polipéptido simple de 461 aminoácidos. Esta molécula precursora de cadena simple experimenta múltiples modificaciones post translacionales que incluyen 1) división de una secuencia señal de 42 aminoácidos; 2) eliminación proteolítica de una cadena de zimógeno del residuo de lisina en la posición 156 y del residuo de la arginina en la posición 157 para fabricar un forma zimógena de 2 cadenas de la molécula (es decir, una cadena ligera de 155 residuos de aminoácido ligada mediante un puente disulfuro a una cadena pesada con 262 residuos de aminoácido que contiene serina proteasa); 3) carboxilación dependiente de la vitamina K de 9 residuos de ácido glutámico encastrados en los primeros 42 aminoácidos de la cadena ligera, dando como resultado 9 residuos de ácido gamma-carboxiglutámico; y 4 (adhesión de carbohidrato en cuatro emplazamientos) uno en la cadena ligera y tres en la cadena pesada. La cadena pesada comprende la tríada de serina proteasa bien establecida de Asp 257, His 211 y Ser 360. Finalmente, el zimógeno de 2 cadenas circulante se activa in vivo por la trombina en la superficie de un fosfolípido en presencia del ión calcio. La activación se obtiene a partir de la eliminación de un dodecapéptido en el N-terminal de la cadena pesada, dando lugar a una proteína C activada (PCa) que posee actividad enzimática

De manera adicional a las actividades enzimáticas de la PCa dentro de la cascada de coagulación de la sangre, la PCa se puede también autodegradar, induciendo una disminución de la funcionalidad como anticoagulante. Los solicitantes han descubierto una importante vía de degradación. La autodegradación del N-terminal de la cadena ligera puede dar como resultado un corte sobre cualquier lado del residuo de la histidina en la posición 10. De esta manera, esta vía de degradación da como resultado dos productos inactivos: 1) proteína C des (1-9) activada, en la que se han eliminado los primeros diez residuos N-terminal de la cadena ligera; y 2) proteína C des (1-10) activada, en la que se han eliminado los primeros diez residuos N-terminal de la cadena ligera. Esta vía de degradación, de la que no se ha informado anteriormente, da como resultado una pérdida de actividad anticoagulante debida a la eliminación de los residuos críticos de GLA en las posiciones 6 y 7. Por tanto, minimizando el nivel de los productos de autodegradación de la proteína C des (1-9) y des (1-10) activada es importante conseguir una formulación farmacéutica de proteína C activada potente y de pureza alta. Estas variantes fueron anteriormente productos de degradación desconocidos y son sumamente difíciles, si no imposibles, de eliminar por las técnicas de purificación convencionales. Los solicitantes han descubierto de forma adicional que la solubilidad en estado sólido mejora significativamente en presencia de un grupo seleccionado de agentes de relleno.

Es claramente deseable minimizar dicha degradación de la proteína C activada en la solución y los estados sólidos liofilizados. De acuerdo con esto, estos descubrimientos permiten la preparación de formulaciones de proteína C activada, potente y de pureza alta que sean farmacéuticamente elegantes para el médico a cargo del paciente.

La presente invención proporciona formulaciones de proteína C activada esencialmente libres de tales productos de degradación, de manera particular, formas des (1-9) y des (1-10) de la cadena ligera de proteína C activada. Por tanto, las mencionadas formulaciones son adecuadas para la administración a un paciente en necesidad de la anterior.

La presente invención proporciona una formulación liofilizada estable que comprende una proteína C activada y un agente de relleno seleccionado entre el grupo constituido por manitol, trehalosa, rafinosa, sacarosa, y mezclas de los anteriores.

La presente invención proporciona también una formulación liofilizada estable que comprende aproximadamente 2,5 mg/mL de proteína C activada, aproximadamente 15 mg/mL de sacarosa, y aproximadamente 20 mg/mL de NaCl. Además, la presente invención proporciona una formulación liofilizada estable que comprende aproximadamente 5 mg/mL de proteína C activada, aproximadamente 30 mg/mL de sacarosa, y aproximadamente 38 mg/mL de NaCl.

La presente invención proporciona también un procedimiento para preparar una formulación que comprende proteína C activada y un agente de relleno seleccionado entre el grupo constituido por manitol, trehalosa, rafinosa, y sacarosa y mezclas de los anteriores.

La invención proporciona también una forma de dosificación unitaria que contiene la formulación en la que la relación peso a peso es aproximadamente de 1 parte de proteína C activada, aproximadamente 7,6 partes de sal y aproximadamente 6 partes de agente de relleno.

La invención proporciona de manera adicional un procedimiento de tratamiento de estados de enfermedad que implica coagulación intravascular que comprende la administración de una formulación de proteína C activada descrita en el presente documento.

Para los objetivos de la presente invención, como se describe y se reivindica en el presente documento, los siguientes términos son como se define a continuación.

PCa o proteína C activada se refiere a la proteína C activada recombinante o derivada de plasma. La PCa incluye y es preferiblemente una proteína C humana activada aunque la PCa puede incluir también otras especies o derivado que tengan la proteína C con actividades proteolítica, amidolítica, esterolítica y biológica (anticoagulante o pro-fibrinolítica). Los ejemplo de derivados de la proteína C se describen por Gerlitz, y col., en la Patente de Estados Unidos Nº 5.453.373, y Foster, y col., en la Patente de Estados Unidos Nº 5.516.650.

APTT - tiempo de tromboplastina parcialmente activada.

PCh-r - zimógeno de proteína C humana recombinante.

PCa-r - proteína C activada recombinante producida activando el zimógeno de la proteína C in vitro o in vivo o por secreción directa de la forma activada de la proteína C a partir de células procariotas, células eucariotas, o animales transgénicos que incluyen, por ejemplo, secreción a partir de células kidney 293 humanas como un zimógeno purificado y activado a continuación mediante técnicas bien conocidas por aquellos expertos en la técnica y demostradas en Yan, Patente de Estados Unidos Nº 4.981.952, y Cottingham, Documento WO 97/20043.

Infusión continua - continuando de manera esencialmente ininterrumpida la introducción de una solución en el interior de un vaso sanguíneo durante un período específico de tiempo.

Inyección del bolo - la inyección de un fármaco en una cantidad definida (denominada un bolo) de una vez.

Adecuado para la administración - una formulación liofilizada o solución que es apropiada para administrar como agente terapéutico.

Zimógeno - zimógeno de la proteína C, tal como se usa en el presente documento, se refiere a formas inactivas, de una cadena o dos cadenas de proteína C.

Tampón farmacológicamente aceptable - se conoce en la técnica un tampón farmacológicamente aceptable. Los tampones farmacológicamente aceptables incluyen fosfato de sodio, citrato de sodio, acetato de sodio, o TRIS.

La proteína C activada es un agente antitrombótico con un índice terapéutico más amplio que los anticoagulantes disponibles, tales como los anticoagulantes del tipo de la heparina y la hidroxicumarina oral. Como agente antitrombótico, la PCa tiene un profundo efecto en el tratamiento de una amplio variedad de estados de enfermedad adquiridos que implican la coagulación intravascular, incluyendo el ataque trombótico, trombosis profunda de vena, embolia pulmonar, trombosis arterial periférica, embolia originada por el corazón o las arterias periféricas, infarto agudo de miocardio, coagulación intravascular diseminada, y oclusiones pre o postcapilares agudas, que incluyen transplantes o trombosis de retina.

La presente invención se refiere a formulaciones de proteína C activada. La formulación deseada será aquella que sea un producto estable liofilizado de alta pureza, constituida por proteína C activada y un agente de relleno seleccionado entre el grupo constituido por manitol, trehalosa, rafinosa, y sacarosa. El producto liofilizado se reconstituye con el diluyente apropiado tal como agua estéril o suero salino estéril. De manera preferible, la solución resultante tiene un pH de aproximadamente 5,5 a aproximadamente 6,5.

Las interacciones moleculares en una formulación entre la proteína C activada, el tampón, la concentración de sal, el pH, la temperatura, y los agentes de relleno son complejas, y el papel de cada factor contribuye a que la estabilidad de la formulación sea impredecible. Las formulaciones liofilizadas de la presente invención proporcionan una proteína C activada, estable, enzimáticamente activa tras resuspensión debido a una menor autodegradación la presente invención tiene niveles particularmente reducidos de des (1-9) PCa y des (1-10) PCa. De manera general, los niveles de des (1-9) y des (1-10) PCa son menores del 10% del producto de autodegradación.

De manera preferible, los niveles de des (1-9) y des (1-10 ) PCa son menores del 8% del producto de autodegradación. Aún más preferible, los niveles de des (1-9) y des (1-10) PCa son menores del 5% y de manera más preferible menores del 3% del producto de autodegradación. Esta estabilidad se obtiene mediante un control cuidadoso de las condiciones de procesamiento y mediante la adición de sacarosa, trehalosa, rafinosa, o manitol. De manera interesante, otros agentes de relleno tales como almidón de hidroxietilo y glicina no ofrecen la estabilidad necesaria o elegancia farmacéutica.

Los agentes de relleno de la presente invención proporcionan una composición farmacéuticamente elegante que tiene una apariencia uniforme y se solubiliza fácilmente cuando se resuspende con el soluto apropiado. Tras reconstitución, la formulación es estable de hasta 24 horas a 48 horas a temperatura ambiente. Dando como resultado una estabilidad anteriormente inalcanzable.

Los agentes de relleno preferidos en la formulación de la proteína C activada son la sacarosa, trehalosa y rafinosa. Los agentes de relleno más preferidos son la sacarosa y la rafinosa y el agente de relleno más preferido es la sacarosa. La cantidad de agente de relleno en la formulación es de 1 parte de PCa a 1 a 10 partes de agente de relleno sobre un peso en peso base. Más aún, la concentración del agente de relleno de la formulación es una formulación variable importante del proceso de criodesecación. La concentración óptima de agente de relleno es dependiente de la cantidad de PCa y especies de agentes de relleno seleccionadas. La concentración preferida de sacarosa en la solución refrigerante es de 10 a 40 mg/mL. Una concentración más preferida es de 15 a 30 mg/mL. La concentración más preferida de sacarosa en la solución refrigerante es de 15 mg/mL en una formulación de PCa a 2,5 mg/mL. La concentración más preferida de sacarosa en la solución refrigerante es de 30 mg/mL en una formulación de PCa a 5,0 mg/mL. La presencia del agente de relleno reivindicado en la formulación de proteína C activada ofrece un incremento en la estabilidad química y física.

Antes de la criodesecación y tras reconstitución, es preferible mantener el pH en el intervalo de 5,5 a 6,5 para minimizar el estado de autodegradación de la solución. El pH preferido de la formulación es un pH entre aproximadamente pH 5,6 y aproximadamente pH 6,4. Más preferido es un pH entre aproximadamente 5,7 a aproximadamente 6,3 Incluso más preferido es un pH entre aproximadamente 5,8 a aproximadamente 6,2. Aún incluso más preferido es un pH entre aproximadamente 5,9 a aproximadamente 6,1. El pH más preferido es aproximadamente un pH de 6,0.

Para mantener un control efectivo del pH, la solución de PCa contendrá un tampón farmacéuticamente aceptable. De acuerdo con esto, tras la criodesecación, la formulación opcional y preferible comprende un tampón farmacéuticamente aceptable. Los sistemas tampón representativos incluyen Tris-acetato, citrato de sodio, y fosfato de sodio. Los sistemas de tampón más preferidos incluyen citrato de sodio y fosfato de sodio. El tampón más preferido es citrato de sodio. La molaridad preferida del sistema tampón es 10 mM a 50 mM. Una molaridad más preferida del sistema tampón es 10 mM a 20 mM. La molaridad más preferida es 40 mM. El técnico experimentado reconocerá que están disponibles muchos sistemas tampón diferentes que también se pueden usar en las formulaciones de la presente invención.

De manera similar, durante la criodesecación y tras la reconstitución, la fuerza iónica es una variable crítica para asegurar el estado de estabilidad de la solución. La fuerza iónica se determina generalmente por la concentración de sal de la solución. Las sales farmacéuticamente aceptables usadas típicamente para generar la fuerza iónica incluyen pero no se limitan a cloruro de potasio (KCl) y cloruro de sodio (NaCl) La sal preferida en la presente invención es cloruro de sodio. Durante la criodesecación, la concentración de sal debe ser suficientemente alta para dar lugar a la cristalización de la sal durante la etapa de congelación del ciclo de criodesecación de manera preferible, la concentración de cloruro de sodio es mayor de 150 mM. De manera más preferible, la concentración de cloruro de sodio en la solución refrigerada está entre 150 mM a 1000 mM. Para una formulación que contiene 2,5 mg/mL de PCa, la concentración de cloruro de sodio más preferible en la solución refrigerante está entre 150 mM a 650 mM. Incluso más preferible la concentración de cloruro de sodio en la solución refrigerante está entre 250 mM a 450 mM. Aún incluso más preferible, la concentración de cloruro de sodio en la solución refrigerante está entre 300 mM a 400 mM. La concentración más preferible de cloruro de sodio en la solución refrigerante es 325 mM para una formulación que contiene 2,5 mg/mL de PCa.

De manera similar, para una formulación que contiene 5,0 mg/mL de PCa, la concentración de cloruro de sodio más preferible en la solución refrigerante está entre 150 mM a 1000 mM. Incluso más preferible, la concentración de cloruro de sodio en la solución refrigerante está entre 250 mM a 750 mM. Aún incluso más preferible, la concentración de cloruro de sodio en la solución refrigerante está entre 400 mM a 700 mM. La concentración de cloruro de sodio más preferible en la solución refrigerante es 650 mM para una formulación que contiene 5,0 mg/mL de PCa.

La relación de PCa: sal : agente de relleno (p:p:p) es un factor importante en una formulación adecuada para el proceso de criodesecación. La relación varía dependiendo de la concentración de PCa, la selección de la sal y la concentración y la selección del agente de relleno y la concentración. Una persona experta en la técnica identificará fácilmente la relación preferida de PCa : sal : agente de relleno mediante técnicas apreciadas en la técnica y descritas, por ejemplo, en el Ejemplo 1. de manera particular, se prefiere una relación en peso de una parte de proteína C activada a entre aproximadamente 7 a 8 partes de sal a entre aproximadamente 5 a 7 partes de agente de relleno. Más preferida es una relación de aproximadamente 1 parte de proteína C activada a aproximadamente 7,6 partes de sal a aproximadamente 6 partes de agente de relleno.

La sal preferida es cloruro de sodio a una concentración de 325 mM (para una formulación que contenga 2,5 mg/mL de PCa) y 650 mM (para una formulación que contenga 5,0 mg/mL de PCa) y a una relación de aproximadamente 1,3:1 con sacarosa (p:p). Esta concentración es lo suficientemente alta para dar lugar a que la sal cristalice durante el proceso de congelación, resultando más similar en una mezcla amorfa de PCa, sacarosa y citrato que se puede liofilizar. De esta manera, la fuerza iónica del NaCl a las concentraciones preferidas de 325 mM y 650 mM comunica una estabilidad a la formulación durante el proceso de criodesecación.

La presente invención proporciona de manera adicional un procedimiento para preparar una formulación liofilizada estable que comprende liofilizar una solución que comprende la proteína C activada y un agente de relleno seleccionado entre el grupo constituido por manitol, trehalosa, rafinosa, y sacarosa, y mezclas de los anteriores. La invención proporciona también un procedimiento para preparar una formulación liofilizada estable que comprende liofilizar una solución que comprende aproximadamente 2,5 mg/mL de proteína C activada, aproximadamente 15 mg/mL de sacarosa, aproximadamente 19 mg/mL de NaCl, y un tampón de citrato de sodio que tiene un pH mayor de 5,5 pero menor de 6,5. Además, la presente invención proporciona un procedimiento paral a preparación de una formulación liofilizada estable que comprende liofilizar una solución que comprende aproximadamente 5 mg/mL de proteína C activada, aproximadamente 30 mg/mL de sacarosa, aproximadamente 38 mg/mL de NaCl, y un tampón de citrato de sodio que tiene un pH mayor de 5,5 pero menor de 6,5. Además, la presente invención proporciona una forma de dosificación unitaria que comprende un receptáculo de dosificación unitaria que contiene una formulación liofilizada estable que comprende proteína C activada y un agente de relleno seleccionado entre el grupo constituido por manitol, trehalosa, refinosa, y sacarosa, y mezclas de los anteriores. Además, la presente invención proporciona un procedimiento de tratamiento de estados de enfermedad que implica la coagulación intravascular que comprende la administración de la mencionada formulación.

La PCa se administra preferiblemente de forma parenteral para asegurar su liberación en la corriente sanguínea en una forma efectiva inyectando la dosis apropiada como infusión continua durante aproximadamente una a aproximadamente cuarenta y ocho horas. La cantidad administrada de PCa está entre aproximadamente 0,01 mg/kg/h a aproximadamente 0,05 mg/kg/h. De manera alternativa, la PCa se administrara inyectando una porción de la dosis apropiada por hora como una inyección de bolo durante un tiempo entre aproximadamente 5 minutos a aproximadamente 30 minutos, seguida por una infusión continua de la dosis apropiada durante aproximadamente veintitrés horas a aproximadamente 47 horas que da como resultado una dosis apropiada administrada durante 24 horas a 48 horas.

Los siguientes ejemplos ayudarán a describir como se practica la invención e ilustrarán la invención. El alcance de la presente invención no debe construirse como constituido meramente por los siguientes ejemplo.

Preparación 1

Preparación de la proteína C humana

La proteína C humana recombinante (PCh-r) se produjo en células kidney 293 humanas mediante técnicas bien conocidas para el técnico experto tales como las que se muestran en Yan, Patente de Estados Unidos Nº 4.981.952, la enseñanza completa de la cual se incorpora en el presente documento como referencia. El gen que codifica la proteína C humana se describe y reivindica en Bang, y col., Patente de Estados Unidos Nº 4.775.624. El plásmido usado para expresar la proteína C humana en las células 293 fue el plásmido pLPC que se describe en Bang, y col., Patente de Estados Unidos Nº 4.992.373. La construcción del plásmido pLPC se describe también en la Solicitud de Patente Europea Nº 0 445 939, y en Grinnell, y col., 1987, Bio/Technology 5:1189-1192. De manera breve, el plásmido se transfectó en el interior de las células 293, a continuación, se identificaron los transformantes estables, se subcultivó y creció en un medio libre de suero. Después de la fermentación, se obtuvo medio libre de células por microfiltra-
ción.

La proteína C humana se separó del cultivo fluido mediante una adaptación de las técnicas de Yan, Patente de Estados Unidos Nº 4.981.952. El medio clarificado se llevó hasta 4 mM en EDTA antes de que se absorbiera en una resina de intercambio aniónico (Fast-Flow Q, Pharmacia). Después del lavado con 4 volúmenes de columna de Tris 20 mM, NaCl 200 mM, pH 7,4 y 2 volúmenes de columna de Tris 20 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4, el zimógeno de la proteína C humana recombinante enlazada se eludió con Tris 20 mM, NaCl 150 mM, CaCl_{2} 10 mM, pH 7,4. La proteína eluída fue mayor del 95% de pureza después de la elución como se juzga por la electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida.

La purificación adicional de la proteína se llevó a cabo llevando la proteína hasta 3 M en NaCl, seguida por la adsorción en una resina de interacción hidrófoba (Toyopearl Phenyl 650 M TosoHaas) equilibrada en Tris 20 mM , NaCl 3 M, CaCl_{2} 10 mM, pH 7,4. Después del lavado con 2 volúmenes de columna de tampón de equilibrio sin CaCl_{2}, la proteína C humana recombinante se eludió con Tris 20 mM, pH 7,4.

La proteína eluída se preparó para la activación por eliminación del calcio residual. La proteína C humana recombinante se pasó sobre una columna de afinidad para metales (Chelex-100, Bio-Rad) para eliminar el calcio y enlazar de nuevo a un intercambiador aniónico (Fast Flow Q, Pharmacia). Ambas columnas fueron dispuestas en serie y equilibradas en Tris 20 mM, NaCl 150 mM, EDTA 5 mM, pH 7,4. Después de la carga de la proteína, la columna Chelex-100 se lavó con un volumen de columna del mismo tampón antes de desconectarla de la serie. La columna de intercambio aniónico se lavó con 3 volúmenes de columna de tampón de equilibrio antes de eluir la proteína con NaCl 0,4 M, Tris-acetato 20 mM, pH 6,5. Las concentraciones de proteína de la proteína C humana recombinante y las soluciones de proteína C activada recombinante se midieron por UV a 280 nm con un coeficiente de extinción E^{0,1%}= 1,81 o 1,85, de manera respectiva.

Preparación 2

Activación de la proteína C humana recombinante

Se acopló trombina bovina a CH-Sefarosa 4B activada (Pharmacia) en presencia de HEPES 50 mM, pH 7,5 a 4ºC. La reacción de acoplamiento tuvo lugar sobre resina ya empaquetada en una columna usando aproximadamente 5000 unidades de trombina/mL de resina. Se hizo circular la solución de trombina a través de la columna durante aproximadamente 3 horas antes de añadir 2-amino-etanol (MEA) a una concentración de 0,6 mL/ L de solución circulante. La solución que contenía MEA se hizo circular durante 10-12 horas más para asegurar el bloqueo completo de las aminas sin reaccionar sobre la resina. Después del bloqueo, la trombina acoplada a la resina se lavó con 10 volúmenes de columna de NaCl 1 m, Tris 20 mM, pH 6,5 para eliminar toda la proteína no específicamente enlazada, y se usó en las reacciones de activación después del equilibrio en la activación del tampón.

Se llevó la PCh-r hasta 5 mM en EDTA (para quelar cualquier residuo de calcio) y se diluyó a una concentración de 2 mg/mL con Tris 20 mM, pH 7,4 o Tris-acetato 20 mM, pH 6,5. Este material se paso a través de una columna de trombina equilibrada a 37ºC con NaCl 50 mM y bien Tris 20 mM pH 7,4 o Tris-acetato 20 mM pH 6,5. El caudal se ajustó para permitir aproximadamente 2 min de tiempo de contacto entre la PCh-r y la resina de trombina. El efluente se recogió y se ensayó inmediatamente para la actividad amidolítica. Si el material no tiene una actividad específica (amidolítica) comparable a un estándar establecido de PCa, este se recircula a la columna de trombina para activar la PCh-r hasta completar. Esto fue seguido por dilución 1:1 del material con tampón 20 mM, como anteriormente, con un pH de 7,4 o 6,5 para mantener la PCa a concentraciones más bajas mientras este espera la próxima etapa de procesamiento.

La eliminación de la trombina lixiviada procedente del material de la PCa se llevó a cabo enlazando la PCa con una resina de intercambio aniónico (Fast Flow Q, Pharmacia) equilibrada en el tampón de activación (bien Tris 20 mM, pH 7,4 o Tris-acetato 20 mM, pH 6,5) con NaCl 150 mM. La trombina no interactúa con la resina de intercambio aniónico bajo estas condiciones, pero pasa a través de la columna en el efluente de aplicación de la muestra. Una vez la PCa se cargó sobre la columna, se realizó un lavado con un volumen de columna de 2-6 con tampón de equilibrio 20 mM, antes de eluir la PCa enlazada en una etapa de elusión usando NaCl 0,4 M en bien Tris-acetato 5 mM, pH 6,5 o en Tris 20 mM, pH 7,4. Con volúmenes de lavado más elevados de la columna se facilita de manera más completa la eliminación del dodecapéptido El material eluído procedente de esta columna se almacenó en una solución congelada (-20ºC) o como un polvo liofilizado.

Se determinó la actividad del anticoagulante de la proteína C activada midiendo la prolongación del tiempo de coagulación en el ensayo del tiempo de coagulación de la tromboplastina parcial activada (APTT). Se preparó una curva estándar en tampón de dilución (1 mg/mL de albúmina de suero bovino calidad radioinmunoensayo [BSA], Tris 20 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, NaN_{3} 0,02%) oscilando la concentración de la proteína C entre 125-1000 ng/mL, mientras que las muestras se prepararon a diversas diluciones en este intervalo de concentración. A cada cubeta de muestra se añadieron 50 \mul de plasma frío de caballo y 50 \mul reactivo para tiempo de tromboplastina parcialmente activado reconstituido (aptt Reagent, Sigma) e incubó a 37ºC durante 5 min. Después de la incubación se añadieron 50 \mul de las muestras apropiadas o estándares a cada cubeta. Se usó el tampón de dilución en lugar de la muestra o estándar para determinar el tiempo de coagulación basal. El temporizador del fibrómetro (CoA Screener Hemostasis Analyzer, American Labor) comenzó inmediatamente después de la adición de 50 \mul de CaCl_{2} 30 mM a 37ºC a cada muestra o estándar. La concentración de proteína C activada en las muestras se calculó a partir de la ecuación de regresión lineal de la curva estándar Los tiempos de coagulación que aparecen aquí son los promedios de un mínimo de tres réplicas, incluyendo las muestras de la curva estándar.

Ejemplo 1 Formulación de la proteína C activada

La proteína C humana activada se preparó como se ha descrito en las Preparaciones 1 y 2. Las formulaciones de la proteína C activada se analizaron para el procesamiento en un criodesecador convencional. Se usaron la microscopía de criodesecación y la calorimetría diferencial de barrido (DSC) para medir dos parámetros que determinan si una formulación se puede procesar en un criodesecador convencional. La microscopía de criodesecación es una técnica útil en la determinación de las temperaturas de colapso de las soluciones congeladas que se van a liofilizar. La DSC es una técnica útil en la determinación de la temperatura de transición vítrea (Tg') de la solución congelada. Las temperaturas de colapso y de transición vítrea son especialmente provechosas en la predicción de los límites superiores de temperatura que pueden usarse con seguridad durante el procedimiento de criodesecación. Los resultados de la microscopía de criodesecación son complementarios a la temperatura de transición vítrea de la tg', valores obtenidos por DSC. Una temperatura de colapso por encima de -40ºC es óptima para la muestra que se va a procesar en un criodesecador convencional.

TABLA 1 Procesado mediante criodesecación de matrices de formulación de PCa

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La relación de PCa a sacarosa a cloruro de sodio (en tampón citrato 10 o 20 mM) es una formulación variable importante que afecta las temperaturas de colapso y de transición vítrea. Para ser procesado en un criodesecador convencional, la concentración de cloruro de sodio debe ser suficientemente alta (de manera preferible 325 mM para 2,5 mg/mL de PCa y 650 mM para 5 mg/ml de formulaciones de PCa) para dar lugar a que el cloruro de sodio se separe por cristalización durante la parte de congelación del proceso de criodesecación. Las formulaciones de la PCa se pueden procesar en un criodesecador convencional para producir productos liofilizados constituidos por 1 parte de PCa, 6 partes de sacarosa, y 7,6 partes de cloruro de sodio en peso.

Ejemplo 2 Estabilidad de la PCa en formulaciones de productos que contienen diferentes agentes de relleno

Se prepararon formulaciones de PCa para investigar el efecto de varios agentes de relleno sobre la estabilidad de la molécula. Se añadieron un total de seis excipientes a la PCa en tampón fosfato que no contenía sales. Estos agentes de relleno son glicina, manitol, sacarosa, trehalosa, rafinosa, e hidroxietil almidón (HES). La estabilidad de la PCa en el fosfato, sin sales, sin formulación de agentes de relleno ("control") se comparó con las formulaciones que tenían agentes de relleno. Las muestras se almacenaron a 50ºC, 40ºC y 25ºC durante diferentes periodos de tiempo. Los datos de los análisis de estas muestras se compararon con los valores iniciales (tiempo = 0). Se usaron ensayos de potencia APTT, cromatografía líquida de alta resolución de exclusión por tamaños (SE-HPLC), SDS-PAGE, y contenido en proteína, para evaluar la estabilidad física y química de las formulaciones.

Se prepararon formulaciones de PCa disolviendo PCa en tampón fosfato hasta 5 mg/ml de PCa. Se añadieron los agentes de relleno a porciones de la solución de PCa, en una relación de 6:1 (agentes de relleno a PCa), o 30 g/ml. Las muestras se liofilizaron hasta 5 mg PCa/vial.

Las formulaciones se guardaron para estabilidad a 50ºC durante 14 y 28 días; 40ºC durante 28 días, 48 días y 6 meses; y 25ºC para 6 y 12 meses. Para cada punto de tiempo, se analizaron dos viales de cada formulación de forma independiente como muestras separadas, y los datos de estas muestras se compararon con los valores iniciales (tiempo = 0). Los análisis incluyeron potencia PCa (APTT), SDS-PAGE, porcentaje de monómero PCa, y contenido en proteína.

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No hubo cambios significativos en el pH, color, características del embalaje y apariencia física de ninguna de las muestras a lo largo del período de estabilidad de un año. Cuando se analizaron mediante los procedimientos APTT y S-HPLC, las formulaciones de glicina y HES presentaron una estabilidad física (debido a la agregación) y estabilidad química (potencia) menores cuando se comparan con el control. La formulación de manitol ofreció una estabilidad física y química ligeramente superior a la del control, y el resto de formulaciones con sacarosa, trehalosa y rafinosa, demostraron todas una estabilidad física y química incluso superior cuando se compara con el control. Por tanto, manitol, sacarosa, trehalosa, y rafinosa, como agentes de relleno en formulaciones PCa ofrecen una mayor estabilidad física y química cuando se comparan con una formulación de PCa sin un agente de relleno o con los que tienen glicina o HES.

Ejemplo 3 Estabilidad de la proteína C humana activada recombinante

Se almacenaron dos lotes de una formulación liofilizada de proteína C humana activada recombinante (PCa) durante un mes a 40ºC y 75% de humedad relativa, y a continuación se analizó su posible degradación. La estabilidad de la PCa también se controló después de la reconstitución con agua estéril y almacenamiento de hasta 72 horas a temperatura ambiente. El producto PCa liofilizado consistió de 10 mg de PCa, 60 mg de sacarosa, 76 mg de NaCl, y 15,1 mg de citrato por vial. La PCa de esta formulación es estable cuando se almacena en estado seco durante al menos 1 mes a 40ºC y 75% de humedad relativa, y en solución durante 24 h cuando se almacena a temperatura ambiente.

Ambos lotes se prepararon usando la misma fórmula de 10 mg de PCa, 60 mg de sacarosa, 76 mg de NaCl, y 15,1 mg de citrato por vial. Ambos lotes se almacenaron durante 1 mes a 40ºC y 75% de humedad relativa, y la estabilidad de la PCa se controló usando el ensayo de potencia APTT, HPLC de emparejamiento iónico para cuantificar los péptidos de PCa y la espectrometría de masas para cuantificar las formas variantes de proteína. Uno de los lotes se reconstituyó también con agua estéril hasta 1 mg/mL de PCa, y se mantuvo a temperatura ambiente. Se controló la estabilidad de la PCa en solución en los puntos de tiempo a 0, 1, 4, 8, 24, 48 y 72 horas, usando los procedimientos APTT y espectrometría de masas.

No hubo pérdida de la actividad de la PCa y hubo una cantidad insignificante de degradación estructural de la molécula tras almacenamiento en estado seco durante 1 mes a 40ºC y 75% de humedad relativa. La PCa de esta formulación es estable hasta 24 horas a 1 mg/mL después de la reconstitución.

Claims

1. Una formulación liofilizada que comprende proteína C humana activada recombinante; un agente de relleno seleccionado del grupo constituido por manitol, trehalosa, rafinosa, y sacarosa, y mezclas de los anteriores; y un sistema tampón tal que la reconstitución de la formulación resultante tenga un pH comprendido entre 5,5 y 6,5.

2. La formulación que se reivindica en la Reivindicación 1 en la que el pH está comprendido entre aproximadamente 5,9 y 6,1.

3. La formulación que se reivindica en la Reivindicación 1 o la Reivindicación 2 en la que el sistema tampón se selecciona entre Tris-acetato, citrato de sodio y fosfato de sodio, o mezclas de los anteriores.

4. La formulación que se reivindica en la Reivindicación 3, en la que el sistema tampón es citrato de sodio.

5. La formulación que se reivindica en una cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 4, que comprende además una sal farmacéuticamente aceptable.

6. Una formulación liofilizada que comprende proteína C humana activada recombinante; y un agente de relleno seleccionado del grupo constituido por manitol, trehalosa, rafinosa, y sacarosa; en la que la relación ponderal es 1 parte de proteína C humana activada recombinante a entre aproximadamente 7 y 8 partes de sal a entre aproximadamente 5 a 7 partes de agente de relleno.

7. La formulación que se reivindica en la Reivindicación 6 en la que la relación ponderal es 1 parte de proteína C humana activada recombinante a 7,6 partes de sal a 6 partes de agente de relleno.

8. La formulación que se reivindica en una cualquiera de las Reivindicaciones 5 a 7 en la que la sal se selecciona entre cloruro de potasio y cloruro de sodio.

9. La formulación que se reivindica en la Reivindicación 8 en la que la sal es cloruro de sodio.

10. La formulación que se reivindica en una cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 9, en la que el agente de relleno es sacarosa.

11. La formulación que se reivindica en una cualquiera de las Reivindicaciones 5 a 10 tal que tras la reconstitución, la formulación resultante comprende 5 mg/mL de proteína C humana activada recombinante, 30 mg/mL de sacarosa y 38 mg/mL de cloruro de sodio.

12. Una formulación liofilizada que comprende 5 mg de proteína C humana activada recombinante, 30 mg de sacarosa y 38 mg de cloruro de sodio.

13. La formulación que se reivindica en una cualquiera de las Reivindicaciones 1 a 12, para uso en el tratamiento de estados de enfermedad que implican coagulación intravascular.

14. La formulación que se reivindica en la Reivindicación 13, en la que dicho estado de enfermedad que implica coagulación intravascular se selecciona entre el grupo constituido por ataque trombótico, trombosis profunda de vena, embolia pulmonar, trombosis arterial periférica, embolia originada desee el corazón o arterias periféricas, infarto agudo de miocardio, coagulación intravascular diseminada, y oclusiones pre o post-capilares agudas.

15. La formulación que se reivindica en la Reivindicación 14, para uso en el tratamiento del ataque trombótico.

16. Una forma de dosificación unitaria que comprende la formulación de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 colocadas en un receptáculo de dosificación unitaria.