ES2239770T3 - Nuevos peptidos derivados de la proteina humana de choque termico 60 para el tratamiento de diabetes, sus compuestos, metodos y equipos de diagnostico. - Google Patents
Nuevos peptidos derivados de la proteina humana de choque termico 60 para el tratamiento de diabetes, sus compuestos, metodos y equipos de diagnostico.Info
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Abstract
NUEVOS PEPTIDOS QUE SON EPITOPOS DE LA PROTEINA HUMANA DE CHOQUE TERMICO DE 60 KDA (HSP60) PUEDEN SER UTILIZADOS PARA EL DIAGNOSTICO Y TRATAMIENTO DE DIABETES MELLITUS DEPENDIENTE DE INSULINA (IDDM). SE DESCUBREN ASIMISMO COMPOSICIONES FARMACEUTICAS QUE CONTIENEN DICHOS PEPTIDOS Y KITS PARA SU USO EN EL DIAGNOSTICO DE IDDM.
Description
Nuevos péptidos derivados de la proteína humana
de choque térmico 60 para el tratamiento de diabetes, sus
compuestos, métodos y equipos de diagnóstico.
La presente invención se refiere a un péptido que
es un epítopo de la proteína de choque térmico humana 60 KDa (hsp
60) y a compuestos farmacéuticos, así como a su utilización en
métodos y un equipo de pruebas para el diagnóstico de diabetes
mellitus dependiente de insulina (IDDM).
La diabetes de tipo I, o IDDM, es una enfermedad
autoinmune provocada por células T que atacan y destruyen las
células \beta productoras de insulina, situadas en las isletas del
páncreas (Castano y Eisenbarth, 1990). El proceso autoinmune que
culmina en IDDM empieza y avanza sin síntomas. La enfermedad aparece
clínicamente sólo cuando la pérdida acumulada de células \beta
supera la capacidad de las células \beta residuales en suministrar
insulina. Ciertamente, el colapso de la homeostasis de la glucosa y
IDDM clínica se cree que tienen lugar solamente después de que
80-90% de las células \beta han sido inactivadas
por el sistema inmune. Por lo tanto, los pacientes que pueden ser
identificados como afectados por IDDM están destinados a encontrarse
en una etapa avanzada de la destrucción autoinmune de sus células
\beta. Además, el diagnóstico incipiente de diabetes preclínica
por la detección de marcadores inmunológicos de la autoinmunidad de
células \beta se puede realizar solamente después del inicio del
proceso autoinmune. Por lo tanto, la necesidad terapéutica es la de
encontrar un método específico, efectivo y seguro para invertir un
proceso autoinmune que ya se encuentra bastante desarrollado.
Los presentes inventores han examinado esta
cuestión con anterioridad al estudiar el desarrollo espontáneo de
diabetes en ratones de la cepa NOD, que se considera que es un
modelo fiel de IDDM humano (Castano y Eisenbarth, 1990). Los ratones
NOD desarrollan insulitis aproximadamente a las cuatro semanas de
edad, empezando como infiltrado periisletas suave y avanzando en una
fuerte inflamación intraisletas. La hiperglicemia, que demuestra la
insuficiencia de insulina, empieza en las hembras en nuestra colonia
aproximadamente a las 14-17 semanas de edad. A las
35-40 semanas de edad, la casi totalidad de las
hembras de ratones NOD han desarrollado diabetes grave, y la mayor
parte mueren por ausencia de tratamiento de insulina. Los ratones
macho NOD tienen una menor incidencia de la enfermedad por razones
no aclaradas. La diabetes de los ratones NOD se ha demostrado que es
provocada por células T autoinmunes (Bendelac y otros, 1987).
La reactividad de las células T y los
autoanticuerpos, con respecto a diferentes antígenos, han sido
detectados en pacientes humanos de IDDM, así como en ratones NOD
(Elías, 1994), y no se ha aclarado si la inmunidad a cualquiera de
los antígenos objetivo individuales posibles es la causa principal
de la enfermedad. Más allá de la cuestión de causa se encuentra la
cuestión de terapia.
Se ha demostrado que el inicio del proceso
autoinmune en ratones NOD puede ser impedido al someter los ratones,
antes del inicio de la diabetes, a diferentes manipulaciones, tales
como una dieta restringida, infecciones víricas o estimulación no
específica del sistema inmune (Bowman y otros, 1994). La diabetes en
ratones NOD puede ser también prevenida por inducción de tolerancia
inmunológica en ratones prediabéticos al antígeno decarboxilasa de
ácido glutámico (Kaufman y otros, 1993; Tisch y otros, 1993).
La diabetes mellitus dependiente de insulina
(IDDM), que se desarrolla espontáneamente en los ratones NOD hembra,
se ha asociado con la reactividad inmune a una serie de
autoantígenos (Bach, 1994). Son notables entre estos antígenos el
péptido p277 procedente de la secuencia de la proteína de choque
térmico de mamíferos 60 kDa (hsp60). Esto corresponde a los residuos
437-460 en la molécula humana hsp60 (Elías y otros
1991, solicitud de patente israelí Nº 94241, publicación patente PCT
WO90/10449). El péptido humano p277 tiene la siguiente
secuencia:
Val-Leu-Gly-Gly-Gly-Cys-Ala-Leu-Leu-Arg-Cys-Ile
Pro-Ala-Leu-Asp-Ser-Leu-Thr-Pro-Ala-Asn-Glu-Asp
(a.a. 437-460 de SEQ ID
NO:1).
Los ratones NOD prediabéticos manifiestan
respuestas espontáneas diabetogénicas de células T a la hsp60 y a la
variante humano (2) o de ratón del péptido p277 (3). Los péptidos
del ratón y humano difieren en un aminoácido, y son
inmunológicamente reactivos cruzados (3). Algunas cepas de ratones
no propensas a diabetes, tales como C57BL/6, desarrollan
hiperglicemia transitoria e insulitis cuando se inmunizan a p277
conjugado de forma covalente a una molécula portadora inmunogénica
extraña (4). Y ratones de la cepa C57BL/KsJ desarrollan respuestas
espontáneas a las células T a hsp60 y a p277 después de tratamiento
con una dosis muy baja de la toxina de células \beta
estreptozotocina (STZ) que induce diabetes autoinmune (5).
Además de estar involucrado en la expresión de la
enfermedad, el péptido p277 parece ser funcional en la curación del
proceso autoinmune: la administración subcutánea de p277 en
coadyuvante incompleto de Freund (IFA; aceite mineral) llegó a la
interrupción del avance de la enfermedad en ratones NOD jóvenes (2),
o en ratones NOD con una edad de 12-17 semanas con
insulitis avanzada (6, 7). Tanto la variante humana (6, 7) y de
ratón (3) de p277 fueron eficaces. Los ratones transgénicos NOD para
el gen hsp60 de ratón en un promotor MHC de clase II demostró la
regulación en disminución de su respuesta proliferativa espontánea a
células T a p277, y se evitó que una proporción significativa de los
ratones desarrollara diabetes (8). Además, la administración de p277
a ratones C57BL/KsJ interrumpió el desarrollo de diabetes autoinmune
en ratones que habían recibido anteriormente una dosis muy baja de
STZ; el tratamiento de estos ratones con un péptido de la molécula
GAD65 no fue eficaz (9).
La solicitud de patente israelí Nº 112094, que
corresponde a la solicitud de patente internacional WO 96/19236,
demostró tener igual actividad que 277 en un tratamiento de la
diabetes.
El documento WO 90/10449 da a conocer epítopos
del péptido p277 y p278 que responden a las posiciones
437-460 y 458-474 de las moléculas
humanas hsp60 y su utilización para diagnóstico, tratamiento y
vacunación contra IDDM. Young y otros (Experientia, 48,
650-656, 1992) dan a conocer que dos regiones de hsp
alrededor de unos residuos 180-188 y
458-474 están involucradas en enfermedades
autoinmunes, especialmente IDDM.
Variantes del péptico p277, en las que uno o
ambos residuos de cisteína en las posiciones 6 y 11 fueron
sustituidos por residuos de valina, indicados respectivamente
p277(Val^{6}), p277 (Val^{11}) y p277
(Val^{6}-Val^{11}), se describieron en la
solicitud de patente internacional WO 96/19236, correspondiendo a la
solicitud de patente israelí Nº 112094, y demostraron tener igual
actividad que p277 en el tratamiento de diabetes.
Es un objetivo de la presente invención dar a
conocer péptidos adicionales de hsp60 humano, cuyos péptidos son
útiles para diagnóstico y tratamiento de IDDM.
En un estudio de fragmentos y péptidos de la
molécula hsp60 humana, se descubrió que pacientes de IDDM y ratones
NOD responden a otros epítopos de las células T de hsp60 que se
pueden utilizar para diagnóstico y terapia de IDDM. Estos epítopos,
por sí solos o conjuntamente con p277 o una variante de p277
seleccionada entre p277(Val^{6}), p277 (Val^{11}) y p277
(Val^{6}-Val^{11}), pueden mejorar la eficacia
del tratamiento.
Estos nuevos péptidos se indican en la siguiente
tabla 1.
Otros péptidos de hsp60, incluyendo los
designados p278 (que corresponden a las posiciones
458-474 de la secuencia de hsp60 humana), p19
(correspondiente a las posiciones 271-290 de la
secuencia de hsp60 humana, y p21 (correspondiente a las posiciones
301-320 de la secuencia hsp60 humana) se mostraron
con menor efectividad. Se observará que el término amino de p278 se
solapa con el péptido p277 efectivo por tres residuos (NED), y el
término carboxi de p278 se solapa con el péptido p32 efectivo en
nueve residuos (EIIKRTLKI). Por lo tanto, los 11 residuos restantes
de p32 son críticos (PAMTIAKNAGV).
La presente invención se refiere, por lo tanto,
al péptido p32 identificado en la tabla 1 y a las sales y derivados
funcionales del mismo.
Constituye otro objetivo de la presente invención
dar a conocer métodos y equipos para el diagnóstico anticipado de
IDDM utilizando los péptidos de la invención. En el curso de
desarrollo de IDDM, los animales expresan moléculas hsp60 o
moléculas que son reactivas cruzadas con las mismas, que entran en
la sangre y en la orina de los animales. También expresan
anticuerpos y células T, dirigidas específicamente a dichas
moléculas. Por lo tanto, la presencia de hsp60 (o moléculas que son
reactivas cruzadas con el mismo), o anticuerpos o células T
específicas a aquél en sangre y orina sirven como ensayo para
detección del proceso IDDM antes de que se haya completado la
destrucción de las células \beta, y de que el individuo quede
condenado a diabetes para toda su vida.
La presencia o inicio de IDDM en un paciente se
puede diagnosticar por pruebas de sangre o de orina de dicho
paciente para detectar la presencia de anticuerpos o células T que
son inmunológicamente reactivas con hsp60 humano, utilizando como
antígeno un péptido p32 según la presente invención.
De acuerdo con lo anterior, la presente invención
proporciona un método para el diagnóstico de la presencia o inicio
de IDDM en un paciente, comprendiendo someter a pruebas dicho
paciente en cuanto a la presencia de anticuerpos
anti-hsp60, o de una célula T que es inmunorreactiva
con hsp60 utilizando un péptido de la presente invención como
antígeno, de manera que un resultado indicador de la presencia
positiva de anticuerpos anti-hsp60 o de una célula T
inmunorreactiva con hsp60 indica una elevada probabilidad de
presencia o inicio de IDDM.
En el método para el diagnóstico de IDDM, el
paciente puede ser sometido a prueba para detectar la presencia de
anticuerpos anti-hsp60, de manera que dicho método
de pruebas puede comprender un radio inmunoensayo o una prueba
ELISA.
El paciente puede ser sometido a prueba también
en cuanto a la presencia de una célula T inmunorreactiva con hsp60.
En una realización de este aspecto, el método de pruebas comprende
una prueba de proliferación de células T, que comprende las
siguientes etapas:
- (i)
- preparar una fracción celular mononuclear, que contiene células T a partir de una muestra sanguínea obtenida del paciente;
- (ii)
- añadir a dicha fracción celular mononuclear un antígeno seleccionado del péptido de la invención;
- (iii)
- incubar dicha fracción celular en presencia de dicho antígeno, durante un período de tiempo adecuado y bajo condiciones de cultivo adecuadas;
- (iv)
- añadir un nucleótido etiquetado al cultivo celular incubado de (iii) en un tiempo adecuado, antes del final de dicho período de incubación para proporcionar la incorporación de dicho nucleótido etiquetado en el ADN de células T proliferantes; y
- (v)
- determinar la cantidad de células T proliferantes por análisis de la cantidad de nucleótido etiquetado, incorporado en dichas células T.
En la anterior etapa (iv) dicho nucleótido
etiquetado es preferentemente 3H-timidina. La
determinación de la cantidad de células T proliferantes se lleva a
cabo por cálculo del índice de estimulación de las células T por
métodos estándar.
En otra realización de este aspecto de la
invención, el método de prueba comprende una prueba de respuesta de
citoquina de células T, en la que las etapas (i) a (iii) son iguales
que en la anterior prueba de proliferación de células T, y en una
cuarta etapa (iv) se detecta la presencia de citoquina, tal como
IFN-\gamma, IL-2,
IL-4, IL-6, IL-10,
TNF\alpha o TGF\beta, segregada por los linfocitos que
reaccionan en el medio, mediante métodos estándar con equipos de
tipo comercial.
Según otro aspecto, la presente invención da a
conocer un método in vivo, en el que un antígeno seleccionado
de los péptidos de la invención es inyectado por vía subcutánea en
un paciente y se observa la aparición de una reacción de la piel
detectable (hipersensibilidad de tipo retardado; DTH).
La presente invención se refiere también a medios
para llevar a cabo dichos ensayos, así como equipos para llevar a
cabo dichos ensayos. Los equipos pueden ser preparados para llevar a
cabo cualquiera de los diferentes ensayos utilizados para conseguir
la presente invención. Cada uno de dichos equipos comprende la
totalidad de materiales necesarios para llevar a cabo un ensayo
único o un número fijo de ensayos. Por ejemplo, dicho equipo para
determinar la presencia de anticuerpos anti-hsp60
puede contener un péptido inmovilizado en fase sólida, según la
invención, y un anticuerpo marcado capaz de reconocer la zona o
región no variable del anticuerpo anti-hsp60 a
detectar, tal como Fab antihumano marcado o etiquetado. El equipo
puede contener también instrucciones para utilizar el mismo y
contenedores para contener los materiales del equipo. Se puede
utilizar cualquier etiqueta convencional, tal como un radioisótopo,
una encima, un cromóforo o un fluoróforo. Un radioisótopo típico es
iodo-125 o azufre-35. Se incluyen,
entre las encimas típicas para este objetivo, la peroxidasa,
galactosidasa de rábano y fosfatasa alcalina.
Un equipo para diagnóstico de la presencia de
IDDM por comprobación de la presencia de anticuerpos
anti-hsp60 comprende:
- (i)
- un antígeno seleccionado entre péptidos, según la invención; y
- (ii)
- un anticuerpo etiquetado, capaz de reconocer la zona no variable de dichos anticuerpos anti-hsp60 a detectar.
Un equipo para el diagnóstico de la presencia de
IDDM por comprobación de la presencia de una célula T, que es
inmunorreactiva con hsp60, comprenderá:
- (i)
- un antígeno seleccionado de los péptidos de la invención;
- (ii)
- un medio adecuado de cultivo de linfocitos (células T); y
- (iii)
- un nucleótido etiquetado para la prueba de proliferación de células T, o bien una citoquina, por ejemplo, equipo de ensayos para interferongamma para la prueba de citoquina.
Para la prueba in vivo, el equipo
comprenderá solamente un péptido según la invención en una forma
adecuada de inyección.
La presente invención se refiere, además, a la
utilización del péptido 32 para impedir o tratar IDDM. La vacunación
con unpéptido antígeno, según la presente invención, puede
proporcionar una regulación descendente específica de la
autoinmunidad con respecto al antígeno, y crea, de manera efectiva,
resistencia al proceso autoinmune de IDDM. Ello es igualmente cierto
con respecto a la vacunación con células T específicas para dichos
antígenos, en una forma atenuada o no virulenta, o después de haber
sido tratado para mejorar su antigenicidad o fragmentos o fracciones
activas del mismo. Si se ha manifestado que el paciente se encuentra
ya en etapas incipientes preclínicas de IDDM, la inyección de dicho
antígeno o célula T (o fracción) puede crear una regulación
descendente de la autoinmunidad para este antígeno, y puede
interrumpir, por lo tanto, el proceso autoinmune antes de que se
haya producido un daño permanente significativo. El péptido puede
también ser utilizado como agente terapéutico para interrumpir el
proceso autoinmune, incluso después de que éste esté muy avanzado,
tal como se ha demostrado recientemente por el laboratorio de los
inventores con respecto al tratamiento de ratones NOD con el péptido
p277 (Elias y Cohen,
1994).
1994).
De acuerdo con lo anterior, la presente invención
proporciona un preparado para impedir o tratar diabetes mellitus
dependiente de insulina (IDDM), comprendiendo: (a) células T que han
desarrollado especifidad para una proteína o péptido que genera
reacciones inmunológicas cruzadas con un péptido de la invención,
cuyas células han sido activadas por incubación en presencia de
dicho péptido; (b) dichas células T que han sido irradiadas o
atenuadas de otro modo; (c) dichas células T que han sido sometidas
a tratamiento de presión por medio de presión hidrostática,
tratamiento con un agente de reticulación químico y/o tratamiento
con un agente citoesquelético reticulante; (d) fragmentos o
proteínas superficiales procedentes de (a), (b) o (c); o bien (e) un
péptido que consiste esencialmente en la región variable del
receptor de (a) específico para dicha proteína, o bien una sal,
derivado funcional, precursor o fracción activa del mismo.
En una realización preferente de la invención, el
preparado comprende células T humanas que han desarrollado
especificidad por contacto in vitro con dicho péptido, según
la invención.
La presente invención proporciona también un
compuesto farmacéutico para prevención o tratamiento de IDDM, que
comprende un portador farmacéuticamente aceptable y, como principio
activo, una cantidad efectiva de un péptido según la invención, una
sal o un derivado funcional del mismo.
La invención se refiere, además, a la utilización
del péptido 32 para impedir o tratar IDDM, que comprende la
administración a un paciente que lo necesita, un compuesto
farmacéutico que comprende el péptido 32, una sal o un derivado
funcional del mismo, o un preparado que comprende células T que han
desarrollado especificidad a dicho péptido según la invención.
La figura 1 muestra las posiciones de los
péptidos a los que se hace referencia en la totalidad de la
secuencia de la molécula humana hsp60.
La figura 2 muestra la proliferación de células T
en ratones NOD a péptidos humanos hsp60 p12, p32,
p277(Val^{6}-Val^{11}) y p278.
La figura 3 es un gráfico que muestra respuestas
proliferativas de células T de ratones NOD a péptidos. Se
sumergieron grupos de 3 ratones NOD con péptidos de ratón p12, p277
de ratón, GAD-p35 y MT-p278 en IFA,
cada uno de ellos a una dosis de 25 \mug en IFA. Los nodos de
drenaje del linfa fueron retirados 10 días más tarde y ensayados en
cuanto a respuestas proliferativas al correspondiente péptido, con
las concentraciones de 5, 10, 20 y 50 \mug/ml. Se ha mostrado la
estimulación a la concentración óptima de 20 \mug/ml. Se
obtuvieron las siguientes gamas de cpm en controles de medio: p12 de
ratón; 881; p277 de ratón, 1243; MT-p278, 698 y
GAD-p35 1430. El p38 péptido de ratón es un péptido
derivado de hsp60 (556-573) de ratón, que no tiene
homología de secuencia con los péptidos emitidos de comprobación, y
que sirve como control negativo de la especificidad. Estos
resultados son representativos de los tres experimentos llevados a
cabo. Cada uno de los ensayos fue realizado por triplicado, para lo
cual los valores SD se han indicado por las barras. No hubo
reactividad cruzada entre los péptidos (no
mostrados).
mostrados).
La figura 4 es un gráfico que muestra el efecto
de la administración del péptido en la diabetes. Se trataron grupos
de 10-20 ratones NOD de 10 semanas de edad con 100
\mug de p12 de ratón, p277, p35-GAD o
MT-p278 en IFA, o IFA sólo. Los ratones fueron
sangrados mensualmente y se siguieron desde el inicio de la
hiperglicemia. En comparación con el grupo de control tratado con
IFA, los ratones tratados con p12 y p277 estaban protegidos
significativamente, P<0,05.
La figura 5 muestra los isótopos de anticuerpos
IgG1, IgG2a y IgG2b en respuesta a tratamiento de péptidos. Los
ratones fueron tratados tal como se ha descrito en la leyenda de la
figura 4. Se analizaron las muestras individuales en cuanto a
anticuerpos a p12 A de ratón; p277 B; GAD-p35 C; y
MT-p278 D, de los isotipos IgG1, IgG2a y IgG2b. Se
obtuvieron efectos similares en dos experimentos. Los resultados son
presentados como absorbancia a 405 nm (OD) de 10 ratones
individuales de cada grupo. El nivel de significación de la
prevalencia de anticuerpos de IgG1 y IgG2b en grupos A y B en
comparación con C y D es P<0,001. Las diferencias entre los
niveles de los anticuerpos IgG1 y IgG2b en comparación con
anticuerpos IgG2a en grupos A y B eran significativas (p<0,001).
No existía reactividad cruzada entre los anticuerpos (no
mostrado).
La figura 6 muestra la correlación negativa entre
anticuerpos y glucosa en la sangre. Un grupo de ratones NOD hembra
fue tratado con p12 (10 ratones), o con IFA sólo (9 ratones), tal
como se describe en la leyenda t figura 4. La cantidad de anticuerpo
específico anti-p12 (unidades O.D ELISA en sueros
diluidos 1:50 medido a los 7 meses de edad) se ha indicado junto con
la concentración de glucosa en sangre medida a los 7 meses de edad.
El grado de correlación entre alto contenido de anticuerpos y
glucosa en la sangre es P<0,002.
La figura 7 es un gráfico que muestra respuestas
proliferativas de células T (S.I.) de un donante paciente de IDDM a
antígenos de cancelación, a proteína hsp60 y a péptidos sintéticos
hsp60.
La figura 8 es un gráfico que muestra respuestas
proliferativas de células T (S.I.) de un donante sano a antígenos de
cancelación, a hsp60, y péptidos sintéticos hsp60.
La figura 9 es un gráfico que muestra respuestas
proliferativas de células T (S.I.) de otro donante paciente de IDDM
a antígeno de cancelación, a hsp60 y a péptidos sintéticos
hsp60.
Las figuras 10A y 10B son gráficos que muestran
respuestas proliferativas de células T (S.I.) de dos donantes
pacientes de IDDM a péptidos sintéticos hsp60.
Siempre que se mencionen en la presente
descripción y reivindicaciones "péptido según la invención", o
cualquiera de las designaciones individuales, tales como "péptido
32", también se prevén sales y derivados funcionales de los
mismos, siempre que se mantenga la actividad biológica del péptido
con respecto a la diabetes.
Las "sales" de los péptidos de la invención
que se prevén en la misma son sales fisiológicamente aceptables
orgánicas e inorgánicas.
"Derivados funcionales" de los péptidos de
la invención, tal como se utiliza en esta descripción, cubren
derivados que se pueden preparar a partir de grupos funcionales que
se presentan como cadenas laterales en los residuos o grupos
terminales N- o C-, por medios conocidos en esta técnica, y están
incluidos en la invención siempre que sean farmacéuticamente
aceptables, es decir, que no destruyan la actividad del péptido, que
no confieran características tóxicas a los compuestos que los
contienen y que no afecten de manera adversa sus características
antigénicas.
Estos derivados pueden incluir, por ejemplo,
esteres alifáticos de grupos carboxilo, amidas de grupos carboxilo
producidas por reacción con amoníaco o con aminas primarias o
secundarias, derivadas de N-acilo de grupos amino
libres de residuos de aminoácidos formados por reacción con
fracciones acilo (por ejemplo, grupos alcanoilo o aroílo
carbocíclicos) o derivados de O-acilo de grupos
hidróxilo libres (por ejemplo, los de residuos de serilo o treonilo)
formados por reacción con fracciones de acilo.
Los péptidos de la invención pueden ser
utilizados como inmunógeno en compuestos farmacéuticos,
particularmente vacunas para aliviar y tratar IDDM, así como
antígeno en compuestos de diagnóstico para diagnosticar IDDM. Estos
productos farmacéuticos y compuestos de diagnóstico, que pueden ser
preparados de formas conocidas en la técnica, forman parte asimismo
de la presente invención.
El compuesto terapéutico, de acuerdo con la
presente invención, puede ser administrado oral o parenteralmente,
por ejemplo, de forma subcutánea, intramuscular, intravenosa,
intranasal o intrarrectal.
La invención se ilustrará a continuación de forma
no limitativa por medio de los ejemplos siguientes y de las figuras
adjuntas.
(i) Ratones. Se suministraron ratones
hembra cultivados de la cepa NOD/Lt por el Animal Breeding Center
del Weizmann Institute of Science, Rehovot, Israel, o por el Jackson
Laboratory, Bar Harbor, ME. Estos ratones desarrollan
espontáneamente diabetes autoinmune a las 14 hasta 17 semanas de
edad, lo que imita IDDM en humanos.
(ii) Antígenos. Se sintetizaron péptidos
en el Departamento de Química Orgánica del Weizmann Institute of
Science utilizando un sintetizador de péptidos múltiple automatizado
(Abimed modelo AMS 422; Langenfeld, Alemania) siguiendo los
protocolos de la empresa para una síntesis de
N-a-fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc).
Los productos en crudo fueron purificados por HPLC en fase inversa
en una columna C8 semipreparativa (Lichrosorb RP-8,
7 mm, 250 x 10 mm, Merck, Darmstadt, Alemania). La elución de
péptidos fue conseguida por gradientes lineales establecidos entre
0,1% de ácido trifluoroacético en agua y 0,1% de ácido
trifluoroacético en 75% de acetonitrilo en agua (v/v). La pureza de
los productos de péptido único fue demostrada por HPLC de fase
inversa analítica y análisis de aminoácidos. El péptido
MT-p278 procede de la secuencia de hsp60
(431-447) micobacteriano. El péptido p277 está
sustituido en las posiciones 6 y 11 por valina (V) en lugar de
cisteína (C) en secuencia nativa. La sustitución de los dos residuos
C por V aumenta notablemente la estabilidad del péptido sin afectar
su actividad inmunológica. El péptido sustituido V es reactivo
cruzado por completo con el péptido nativo por células T y ensayos
de anticuerpos. Siempre que no se especifique, se intenta la
secuencia humana. Los péptidos p12 de ratón y p38 de ratón son
derivados de la molécula hsp60 de ratón, y corresponden a sus
secuencias 168-188, 437-460 y
556-573. El péptido GAD-p35 procede
de la molécula GAD65 (524-543). La secuencias de
aminoácidos de todos los péptidos utilizados se muestran en
la
tabla 2.
tabla 2.
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\vskip1.000000\baselineskip
Ratones. Se inmunizaron ratones NOD de 9
semanas o ratones de otras cepas en las plantas de las patas
traseras, con 0,1 ml de una emulsión que contenía 25 \mug de
péptido en coadyuvante de Freund completo (CFA; Difco, Detroit, Ml.)
mezclado con una cantidad igual en volumen de solución salina con
tampón de fosfato (PBS). Los nodos del linfa poplíteo de drenaje
fueron retirados 10 días más tarde y se probaron suspensiones de
linfocitos en cultivos triplicados en cuanto a proliferación en
presencia de los diferentes péptidos (5 \mug/ml) utilizando la
incorporación de [^{3}H]-timidina, tal como se ha
descrito (Elias y otros, 1991). Los resultados se muestran como
índice de estimulación (SI): proporción de cpm medio en presencia
del péptido de prueba con respecto a cpm medio de cultivos de
control sin el péptido. Los errores estándar eran siempre menores de
10% de las medias.
(iv) Tratamiento y seguimiento. Se
emulsionaron péptidos 100 mg, en PBS, con un volumen igual de IFA y
se inyectaron de forma subcutánea en hembras NOD de 10 semanas, tal
como se ha descrito (Elias y Cohen, 1995). Los ratones de control
recibieron un volumen igual de PBS emulsionado en IFA. Los ratones
fueron controlados mensualmente para la glucosa en sangre sin ayuno
a 10 am, utilizando el sensor de glucosa en sangre (MediSense. Inc.,
Waltham, MA). Los ratones con una proporción de glucosa en sangre
superior a 11,1 mmol/L se consideraron diabéticos; esta
concentración de glucosa era superior a 3 desviaciones estándar por
encima de la concentración de glucosa en sangre media, medida en
ratones no diabéticos (Elias y Cohen, 1995). Se llevó a cabo el
examen histológico de las isletas del páncreas en secciones
manchadas con hematoxilina y eosino. Las secciones fueron puntuadas
independientemente por dos observadores, que no conocían la
identidad de los grupos. La prueba de chi cuadrado fue utilizada
para asegurar las diferencias estadísticas entre los diferentes
tratamientos.
(v) Anticuerpos del suero. Se sangraron
ratones mensualmente para detectar respuestas a anticuerpos. El
ensayo ELISA fue realizado tal como se describe (Elias y otros,
1991). En breve, se recubrieron placas Maxi-sorb de
fondo plano (Nunc, Roskilde, Dinamarca) para detección de
anticuerpos antipéptido, con 100 ml/pocillo de péptido en PBS, a una
concentración de 10 mg/ml durante 2 horas a temperatura ambiente
seguido de una incubación durante una noche a 4ºC. Después de la
incubación con péptido, las placas fueron lavadas y bloqueadas
durante 2 horas a 37ºC con 7% de BSA (Sigma) en PBS. Los sueros
fueron diluidos 1:50 y a continuación añadidos durante 2 horas a
37ºC, seguido por incubación durante 2 horas con 100 ml por pocillo
de IgG antirratón de cabra (cadena gamma Fc específica) conjugado a
fosfatasa alcalina (Jackson, Philadelphia, PA). Después de lavado,
las placas fueron incubadas con el sustrato, dietanolamina (Sigma) y
fueron leídas utilizando un lector ELISA a 405 nm.
Se comprobó la inmunogenicidad de los péptidos
hsp60 p12, p32, p277(Val^{6}-Val^{11}) y
p278 en ratones NOD por inmunización de los ratones con los péptidos
emulsionados en CFA en las plantas de las patas traseras, y
ensayando las respuestas proliferativas al drenar las células de los
ganglios linfáticos después de 10 días, tal como se ha descrito
anteriormente en la sección iii(a). Tal como se ha mostrado
en la figura 2, los péptidos
p277(Val^{6}-Val^{11}), p12 y p32 fueron
fuertemente inmunogénicos, mientras que p278 no fue
inmunogénico.
Para comprobar si los péptidos p12 y p32 pueden
bloquear el avance de diabetes como
p277(Val^{6}-Val^{11}), los péptidos
p277(Val^{6}-Val^{11}), p12 o p32 (100
\mug en una emulsión de 0,1 cc de IFA) fueron administrados por
vía subcutánea a grupos de 10-12 ratones hembra
NOD/Lt de nueve semanas del Jackson Laboratory,
Bar-Harbor, ME. La diabetes, determinada como
niveles de glucosa en sangre persistentes superiores a 11,1 mmol/l,
se comprobó a las 25 semanas de edad. Los ratones de control no
recibieron tratamiento o fueron tratados con p278.
Tal como se ha mostrado en la Tabla 1, los
p277(Val^{6}-Val^{11}), p12 y p32 fueron
eficaces en el tratamiento de la diabetes, siendo la incidencia de
diabetes en los ratones sin tratar o en ratones tratados con p278 de
90%, mientras que los ratones tratados con
p277(Val^{6}-Val^{11}), p12 y p32
muestran una incidencia de 10%, 20% y 30%, respectivamente. Por otra
parte, el péptido p278 de control no tuvo efecto terapéutico.
Es posible que una combinación de dos o tres
péptidos de epítopo de hsp60 serán más eficaces que solamente un
péptido, dado que será afectada por la terapia una población
superior de células T.
Para determinar las respuestas de células T a
varios péptidos de hsp60, se comprobaron linfocitos procedentes de
sangre periférica de pacientes de IDDM de diagnóstico reciente (2
semanas-4 meses) en un ensayo de proliferación. Se
extrajeron 10-20 ml de sangre pasándolos a un tubo
estéril conteniendo heparina como anticoagulante y diluidos en PBS
1:2. Se aislaron las células mononucleares periféricas (PBMC) por
centrifugación de la sangre sobre una capa de linfopreparado. Las
células PBMC fueron comprobadas en cuanto a proliferación por
triplicado en presencia de los diferentes antígenos (10 \mug/ml)
durante 6 días utilizando la incorporación de
[^{3}H]-timidina como medición de la
proliferación. Los antígenos sometidos a prueba eran hsp60 humano o
los péptidos de hsp60
p277(Val^{6}-Val^{11}), p12, p32 y el
péptido de control p278. La respuesta proliferativa de células T se
muestra como índice de estimulación (SI): La proporción entre la
incorporación de timidina estimulada por péptido y la incorporación
de timidina de fondo (sin añadidura de antígeno) por las células
T.
Los resultados se resumen a continuación en la
Tabla 4.
| Un índice de estimulación (SI) superior a 2,0 se considera una respuesta positiva. | |
| N.D. = No determinado; 277(V) = p277(Val^{6}-Val^{11}) |
Se puede observar que la mayor parte de pacientes
respondieron a hsp60(6/8) y que la totalidad de los seis que
respondieron a hsp60 también respondieron, como mínimo, a uno de los
tres péptidos de hsp60: p12, p32 o
p277(Val^{6}-Val^{11}). Por lo tanto, la
respuesta al grupo de los péptidos puede servir para caracterizar
los individuos que responden al conjunto de la molécula de
hsp60.
Se detectaron respuestas de células T espontáneas
en ratones NOD prediabéticos al péptido p277 de ratón (Elias y
otros, 1991; Birk y otros, 1996) y a fragmentos más grandes de la
molécula de hsp60 de ratón que contenía la secuencia p277 de ratón
(Birk y otros, 1996). Para detectar otros epítopos de las células T
en la molécula hsp60 de ratón, se inmunizaron ratones NOD con
acumulaciones de péptidos que solapan la secuencia hsp60, y se
observó que todos los ratones tenían una respuesta fuerte a p277 de
ratón y a p12 de ratón (figura 3). Otros péptidos inmunogénicos para
ratones NOD son el péptido MT-p278 (residuos
458-474 en la molécula Micobacteriana de hsp60) y
GAD-p35 (residuos 524-543 en la
molécula GAD65). La figura 3 muestra que MT-p278 es
fuertemente inmunogénico igual que el p277 de ratón y p12 de ratón;
GAD-p35 es también inmunogénico, pero en menor
medida.
Un estudio longitudinal de ratones NOD hembra
entra en edades de 3-16 semanas demostró que no se
producían respuestas espontáneas a p12 de ratón en el bazo (no
mostrado), si bien se observaron respuestas a p277 de ratón y a la
molécula completa hsp60 de ratón. Por lo tanto, de los cuatro
péptidos inmunogénicos: p12 y p277 de la molécula de ratón hsp60,
GAD-p35 de la molécula GAD65 asociada a diabetes, y
MT-p278, se detectaron respuestas espontáneas
inmunogénicas externas, solamente a p277 de ratón y a
MT-p278.
Siguiendo un protocolo que se demostró eficaz con
p277 de ratón (Elias y otros, 1991; Elias y Cohen, 1994; Elias y
Cohen, 1995), se trataron grupos de ratones NOD hembra de 10 semanas
mediante una inyección subcutánea única de cada péptido (100 mg)
emulsionada en IFA. Se observaron los ratones en cuanto el
desarrollo de diabetes durante 8 meses de edad. La figura 4 muestra
que péptidos de p277 de ratón y p12 de ratón fueron ambos efectivos
en la inhibición del desarrollo de diabetes (P<0,05). Por el
contrario, el tratamiento con los péptidos MT-p278 o
GAD-p35 no fue distinto del tratamiento con IFA
solo. Un total de 3 experimentos demostró esencialmente los mismos
resultados.
El tratamiento satisfactorio de diabetes inducida
por STZ con péptido p277 de ratón se asoció con la aparición de
anticuerpos antipéptido predominantemente de isotipos IgG1 y IgG2b
(Elias y Cohen, 1996). Se examinaron, por lo tanto, los ratones NOD
tratados con péptido en cuanto a anticuerpos en el suero. La figura
5 muestra que los dos péptidos eficaces en la interrupción de la
diabetes, p12 de ratón y p277 de ratón, fueron también eficaces en
la inducción de fuertes contenidos de anticuerpos de los isotipos
IgG1 y IgG2b (P<0,001). Las concentraciones de anticuerpos IgG1 y
IgG2b eran también significativamente superiores que las
concentraciones del anticuerpo IgG2a en estos grupos (p<0,001).
Los ratones tratados con los péptidos MT-p278 o
GAD-p35 no respondieron de manera tan potente;
ninguno de los ratones tratados con GAD-p35 produjo
anticuerpos específicos IgG1 y solamente dos de diez ratones
tratados con MT-p278 produjeron anticuerpos de
isotipo IgG1. Los ratones tratados con MT-p278 o
GAD-p35 produjeron concentraciones
significativamente menores de anticuerpos IgG2b (P<0,001). Por lo
tanto, la eficacia en la inhibición de la diabetes fue asociada con
la inducción de una respuesta anticuerpo principalmente de los
isotipos IgG1 y IgG2b.
La relación entre una respuesta terapéutica
efectiva y la concentración de anticuerpo fue confirmada por
comparación de la concentración de la glucosa en sangre con la
concentración de anticuerpos en ratones individuales de 7 meses de
edad. La figura 6 muestra que los ratones con concentraciones más
elevadas de anticuerpos p12 antirratón tendían a tener
concentraciones de glucosa en sangre más bajas y al revés, los
ratones tratados con p12 de ratón que produjeron pocos anticuerpos
al p12 de ratón tendían a tener elevadas concentraciones de glucosa
(P<0,002).
Los resultados que se presentan en este ejemplo
indican que el péptido p12 de la molécula hsp60 de ratón, igual que
el péptido p277, pueden ser eficaces en el tratamiento de ratones
próximos a la aparición de hiperglicemia clara. Como contraste a
p277, las respuestas proliferativas de células T espontáneas a p12
en el bazo de ratones NOD prediabéticos no fueron observadas. Por lo
tanto, la respuesta proliferativa antipéptido espontánea detectable
en la periferia no es exigencia para que un péptido sea eficaz en el
bloqueo del proceso autoinmune diabético.
El descubrimiento de que el péptido p277 no es el
único péptido de hsp60 que puede modular la diabetes en ratones NOD
es significativo. Era previsible que el papel de hsp60 en diabetes
en ratones NOD se pudo haber producido por un efecto mimético entre
el péptido p277 de hsp60 y alguna molécula desconocida más
específica para células \beta (Cohen, 1991). No obstante, es muy
improbable que dos segmentos distintos de hsp60, p277 y p12,
pudieran ambos imitar segmentos de la molécula de células \beta
propuesta pero desconocida. La efectividad de p12 en el tratamiento
de péptidos soporta la conclusión de que la molécula funcional
similar a hsp60 en diabetes es la propia hsp60 (Birk y otros,
1996).
El fallo del péptido MT-p278 y
GAD-p35 en interrumpir el desarrollo de diabetes
indica que no se puede utilizar ningún autoantígeno para suprimir el
proceso autoinmune. Es interesante que el MT-p278 ha
fallado en inducir altas concentraciones de anticuerpo o en proteger
a pesar del hecho de que este péptido es fuertemente inmunogénico
para células T (observación no publicada). No obstante, la inducción
de anticuerpos de cualquier especificidad no afecta necesariamente
la diabetes NOD; el tratamiento de ratones NOD con BSA, que induce
elevadas concentraciones de anticuerpos, así como fuertes respuestas
de células T (no mostrado), no afecta el desarrollo de la diabetes
(Elias y Cohen, 1994). Si bien el GAD-p35 no fue
descubierto por los inventores como fuertemente inmunogénico para
células T, tal como lo eran los otros péptidos (figura 3), los
ratones NOD se ha indicado que manifiestan respuestas espontáneas de
células T a este péptido (Kaufman y otros, 1989).
Finalmente, la asociación de un tratamiento
efectivo con inducción de anticuerpos específicos al péptido sugiere
que los efectos terapéuticos de p12 y p277 se pueden relacionar con
la activación de las células T de tipo Th2 responsables de ayudar la
inducción de anticuerpos IgG1 específicos, anticuerpos regulados por
la producción de IL-4 (Mossman y Coffman, 1993).
Dichas células T podrían suprimir las células T Th1 propuestas como
responsables de daños a las células \beta (Katz y otros, 1995;
Liblau y otros, 1995). Ciertamente, se ha observado que la terapia
de péptidos p277 de diabetes NOD es asociada con un aumento de
células T productoras de IL-4 y de
IL-10 en el bazo y una disminución de células T que
producen INF-\gamma tanto en el bazo como en las
isletas (observación no publicada). La aparición de anticuerpos
específicos de péptidos que comportan isotipos Th2 como respuesta a
la terapia de péptidos, parece ser un indicador de una respuesta
favorable.
Participaron en el programa veintiséis pacientes
recientemente diagnosticados de IDDM (1 a 16 semanas después de
diagnóstico de IDDM). Las edades de los pacientes estaban
comprendidas entre 5 y 60 años. Los pacientes fueron explorados en
cuanto a sus respuestas proliferativas de las células T de sangre
periférica a hsp60 humano y a péptidos sintéticos hsp60 humanos,
tales como se muestran en las tablas 1 y 5, que son partes de la
secuencia de proteína hsp60 humana.
Las células T de los pacientes fueron analizadas
también en cuanto a sus respuestas proliferativas a antígenos de
cancelación estándar, tales como toxoide de tétanos, Candida
albecans y gripe, y se puntuaron las respuestas como positivas
si el índice de estimulación (S.I.) era de 2 o superior (ver a
continuación).
Se ensayó la proliferación utilizando el
siguiente protocolo:
Se extrajeron de pacientes IDDM cincuenta ml de
sangre periférica suplementada con 10 IU/ml de heparina o
alternativamente de controles sanos. Se añadieron dos volúmenes de
PBS (libre de calcio y magnesio). El preparado de
sangre-PBS fue mezclado utilizando una pipeta de 10
ml. Un volumen de 10 ml Ficoll fue colocado debajo de la mezcla de
sangre seguido de centrifugación a 2.000 rpm durante 30 minutos a
temperatura ambiente (R.T.) 20-24ºC (desfrenado).
Las células T de la sangre periférica en el recubrimiento ("buffy
coat") fueron recogidas utilizando una pipeta de 10 ml y
transferidas a un nuevo tubo de pruebas de 50 ml. Se añadió a las
células T recogidas un volumen de 30 a 40 ml de PBS (libre de calcio
y magnesio). Éste se mezcló a continuación y se centrifugó a 1.000
rpm durante 20 minutos a temperatura ambiente (frenado).
Se separó por aspiración el sobrenadante, y la
pastilla de células fue resuspendida en medio de cultivo libre de
suero AIM-V (GIBCO, USA). El medio de cultivo
contiene AIM-V suplementado con 1% de
piruvato-sódico, 1% de L-glutamina
(200 mM cada uno), 1% de penicilina/estreptomicina (10.000 U/ml /
10.000 mg/ml y 2% Hopes (1 M, pH 7,3). De manera alternativa, se
utilizó RPMI suplementado con 10% de suero AB del banco de sangre.
La mezcla de células fue centrifugada a 2.000 rpm durante 10 minutos
a temperatura ambiente (frenado). El sobrenadante fue aspirado
nuevamente y la pastilla de células fue resuspendida en un volumen
menor de AIM-V reciente (10-20 ml).
Las células fueron resuspendidas y contadas. El contaje de las
células y los ensayos de viabilidad fueron llevados a cabo
utilizando azul tripán. Para esta etapa se utilizaron un
hemocitómetro y un microscopio óptico.
La concentración de células fue ajustada a
continuación a 2x10^{6} células/ml en medio AIM-V.
Un volumen de 100 \mul de células por pocillo fue transferido a
cada pocillo de una placa de microtitulación de 96 pocillos. A
continuación, se añadieron 100 \mul de medio conteniendo el doble
de la concentración de antígeno recomendada (ver a continuación
lista de antígenos y concentraciones). El ensayo fue llevado a cabo
por cuadruplicado. Se ensayaron cuatro pocillos con células y medios
sin antígeno como control. Las placas fueron cultivadas a 37ºC en un
incubador humidificado con 5% de CO_{2} durante 7 días. Al día 6
del período de cultivo, se añadió 1 \muCi/pocillo de
^{3}H-timidina. Los cultivos se continuaron
durante 18 horas, y a continuación se recogieron. Se sometió a
ensayo la proliferación celular por incorporación de
^{3}H-timidina al ADN con determinación,
utilizando líquido de destellos y un lector contador beta.
| Antígenos comprobados | Concentración |
| Toxoide de Tetanos (Connaught Lab. Inc. Pen. USA) | 5 g/ml |
| Candida albicans (Miles, WA. USA) | 20 \mug/ml |
| hsp60 recombinante humano (StressGen, Canadá) | 2-5 \mu/ml |
| Péptidos sintéticos de hsp60 humano | 20 \mug/ml |
Las respuestas proliferativas fueron medidas de
acuerdo con la timidina ^{3}H incorporada por el ADN de las
células T (Elias y otros, 1991). Los contajes radioactivos por
minuto (CPM) fueron comparados entre células cultivadas con los
antígenos sometidos a prueba o sin antígeno (medio solamente) como
control. Los valores de proliferación fueron representados como
valor del índice de estimulación (S.I.): CPM medio con el antígeno
dividido por el CPM medio sin el antígeno. Los valores de S.I.
superiores o iguales a 2 se consideraron positivos.
Los resultados demostraron que la incidencia de
individuos reactivos a hsp60 humano o a péptidos de hsp60 era más
elevada entre los pacientes de IDDM (84%) que entre personas sanas
(30%). El valor de la prueba p exacta de Fisher de la diferencia es
de 0,0044, que es muy significativo.
Las respuestas proliferativas, de dos pacientes
IDDM representativos y de un individuo sano, a la proteína hsp60
humana, a los péptidos sintéticos hsp60 y a varios antígenos se
muestran en las figuras 7, 8 y 9. La tabla 5 muestra dos ejemplos
individuales de péptidos sintéticos de hsp60 (p19, p21) a los que no
respondieron pacientes de IDDM (ver también figuras 10A y 10B).
Se puede apreciar que cada uno de los pacientes
respondió a antígenos de cancelación ("recall antigens")
(Candida, tétanos o gripe) y a proteína hsp60 humana y a varios
péptidos humanos hsp60. La persona de control respondió solamente a
los antígenos de cancelación.
Las secuencias de los péptidos sintéticos de
hsp60 a los que respondieron por lo menos uno de los pacientes de
IDDM se muestran en la tabla 1. Cada uno de estos péptidos tiene
potencial terapéutico para el tratamiento de IDDM.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La descripción anterior de las realizaciones
específicas dará a conocer, de manera tan completa, la naturaleza
general de la invención que otros expertos podrán, aplicando los
conocimientos de la técnica conocida (incluyendo el contenido de las
referencias citadas), modificar fácilmente y/o adaptar para
diferentes aplicaciones las mencionadas realizaciones específicas,
sin experimentación indebida, sin salir del concepto general de la
presente invención. Por lo tanto, dichas adaptaciones y
modificaciones están destinadas a quedar comprendidas dentro del
significado y alcance de los equivalentes de las realizaciones que
se han dado a conocer, basándose en las informaciones y normas que
se han presentado en esta descripción. Se comprenderá que las frases
o terminología está destinada a descripción y no limitación, de
manera tal que la terminología o fraseología de la presente
invención se tiene que interpretar por los técnicos en la materia a
la luz de las informaciones presentadas en esta descripción, en
combinación con los conocimientos de cualquier técnico ordinario en
la materia.
Bach JF. (1994)
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Bendelac A, Carnaud C,
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(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: YEDA RESEARCH & DEVELOPMENT CO. LTD. at the Weizmann Institute of Science
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: P.O. Box 95
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Rehovot
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Israel
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 76 100
\vskip0.500000\baselineskip
- (G)
- TELÉFONO: 972-8-9470617
\vskip0.500000\baselineskip
- (H)
- TELEFAX: 972-B-9470739
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Irun R. COHEN
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 11 Hankin Street
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Rehovot
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Israel
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 76354
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Dana ELIAS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 57 Derech Yavne
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Rehovot
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Israel
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 78344
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Rivka ABULAFIA
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 31/11 Weizmann Street
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Yahud
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- PAÍS: Israel
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 56000
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Jana BOCKOVA c/o Ms. Joan Fraser, NYS/Pediatrics, SUNY Health Sciences Center
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 11th Floor. Room 040
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Stony Brook
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: N.Y.
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: USA
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 11794
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: NUEVOS PÉPTIDOS DERIVADOS DE LA PROTEÍNA HUMANA DE CHOQUE TÉRMICO 60 PARA EL TRATAMIENTO DE DIABETES, SUS COMPUESTOS, MÉTODOS Y DISPOSITIVOS DE ADMINISTRACIÓN
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 6
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- FORMULARIO LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disco flexible
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: compatible con IBM PC
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: Patente en divulgación #1.0, Versión #1.30 (EPO)
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: IL 114407
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 30-JUN-1995
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA ID DE SECUENCIA Nº 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 573 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- HEBRAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIAS: ID DE SECUENCIA Nº 1:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SECUENCIA ID Nº 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 24 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- HEBRAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN SECUENCIA: SECUENCIA ID Nº 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Val Leu Gly Gly Gly Val Ala Leu Leu Arg Val
Ile Pro Ala Leu Asp}
\sac{Ser Leu Thr Pro Ala Asn Glu Asp}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN POR SECUENCIA ID Nº 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- HEBRAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TIPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN SECUENCIA: SECUENCIA ID Nº 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Glu Glu Ile Ala Gln Val Ala Thr Ile Ser Ala
Asn Gly Asp Lys Asp}
\sac{Ile Gly Asn Ile}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN POR SECUENCIA ID Nº 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 17 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- HEBRAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TIPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN SECUENCIA: SECUENCIA ID Nº 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Glu Gly Asp Glu Ala Thr Gly Ala Asn Ile Val
Lys Val Ala Leu Glu}
\sac{Ala}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN POR SECUENCIA ID Nº 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 20 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- HEBRAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TIPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN SECUENCIA: SECUENCIA ID Nº 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Arg Leu Ser Lys Val Ala Pro Val Ile Lys
Ala Arg Met Met Glu}
\sac{Tyr Gly Thr Thr}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SECUENCIA ID Nº 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 18 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- HEBRAS: única
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TIPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN SECUENCIA: SECUENCIA ID Nº 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Pro Gly Met Gly Ala Met Gly Gly Met Gly Gly
Gly Met Gly Gly Gly}
\sac{Met Phe}
Claims (15)
1. Péptido utilizable como inmunógeno o antígeno
en un compuesto para el diagnóstico y tratamiento de IDDM,
caracterizado porque dicho péptido es el péptido p32 residuos
466-485 de la secuencia ID nº 1, y sales y derivados
funcionales del mismo.
2. Método para el diagnóstico de la presencia o
inicio de diabetes mellitus dependiente de insulina (IDDM) en un
paciente, que comprende la prueba in vitro de la sangre u
orina de dicho paciente con un péptido, de acuerdo con la
reivindicación 1, como antígeno para la presencia de anticuerpos o
células T, que son inmunológicamente reactivas con hsp60 humano.
3. Método, según la reivindicación 2, que
comprende la prueba de la sangre u orina de dicho paciente para
investigar la presencia de anticuerpos anti-hsp60 o
de una célula T inmunorreactiva con hsp60, de manera que un
resultado indicativo de la presencia positiva de anticuerpos
anti-hsp60 o de una célula T inmunorreactiva con
hsp60 indica una elevada probabilidad de presencia o inicio de
IDDM.
4. Método, según la reivindicación 2 ó 3, en el
que la sangre u orina de dicho paciente es comprobada para
investigar la presencia de anticuerpos anti-hsp60,
por ejemplo, por un radioinmunoensayo o prueba ELISA.
5. Equipo de diagnóstico de la presencia de IDDM
por prueba de la presencia de anticuerpos
anti-hsp60, de acuerdo con el método de cualquiera
de las reivindicaciones 2 a 4, que comprende:
- (i)
- un antígeno, que es un péptido, según la reivindicación 1; y
- (ii)
- un anticuerpo etiquetado, capaz de reconocer la zona no variable de dichos anticuerpos anti-hsp60 a detectar.
6. Equipo, según la reivindicación 5, en el que
dicho antígeno es el péptido según la reivindicación 1.
7. Equipo, según la reivindicación 5 ó 6, en el
que dicho antígeno es inmovilizado sobre una base sólida, incluyendo
además el equipo de instrucciones para la utilización del mismo en
el diagnóstico de IDDM, y la etiqueta seleccionada del grupo que
consiste en radioisótopos, encimas, cromóforos y fluoróforos.
8. Método, según la reivindicación 2 ó 3, en el
que la sangre de dicho paciente es comprobada para investigar la
presencia de una célula T inmunoreactiva con hsp60, por un método de
prueba que comprende una prueba de proliferación de células T, que
comprende las siguientes etapas:
- (i)
- preparación de una fracción de célula mononuclear, que contiene células T de una muestra sanguínea obtenida de dicho paciente;
- (ii)
- añadir a dicha fracción de células mononucleares un antígeno seleccionado a partir de un péptido, según la reivindicación 1;
- (iii)
- incubar dicha fracción de células en presencia de dicho antígeno, durante un período de tiempo adecuado y bajo las condiciones de cultivo adecuadas;
- (iv)
- añadidura de un nucleótido etiquetado al cultivo de células incubadas de (iii) en un momento adecuado antes del final de dicho período de incubación para proporcionar la incorporación de dicho nucleótido etiquetado en el ADN de las células T proliferantes; y
- (v)
- determinar la cantidad de células T proliferantes por análisis de la cantidad de nucleótido etiquetado incorporado en dichas células T.
9. Equipo para diagnosticar la presencia de IDDM
por comprobación de la presencia de una célula T inmunoreactiva con
hsp60, de acuerdo con el método, según cualquiera de las
reivindicaciones 2, 3 y 8, que comprende:
- (i)
- un antígeno seleccionado a partir de un péptido, según la reivindicación 1;
- (ii)
- un nucleótido etiquetado; y
- (iii)
- un medio adecuado para el cultivo de linfocitos.
10. Método, según la reivindicación 2 ó 3, en el
que la sangre de dicho paciente es comprobada para averiguar la
presencia de una célula T inmunoreactiva con hsp60, por un método de
prueba que comprende una prueba de respuesta de citoquinas de
células T, que comprende las siguientes etapas:
- (i)
- preparar una fracción celular mononuclear que contiene células T, a partir de una muestra de sangre obtenida de dicho paciente;
- (ii)
- añadir a dicha fracción celular mononuclear un antígeno seleccionado a partir de un péptido, según la reivindicación 1;
- (iii)
- incubar dicha fracción celular en presencia de dicho antígeno durante un período de tiempo adecuado y en condiciones de cultivo adecuadas; y
- (iv)
- medir la presencia de una citoquina segregada por los linfocitos que responden al medio.
11. Método, según la reivindicación 10, en el que
la citoquina es IFN-\tau, IL-2,
IL-4, IL-6, IL-10,
TNF\alpha ó TGF\beta.
12. Equipo para el diagnóstico de la presencia
IDDM por la prueba de la presencia de una célula T inmunoreactiva
con hsp60, según el método de las reivindicaciones 10 ó 11, que
comprende:
- (i)
- un antígeno seleccionado a partir de un péptido, según la reivindicación 1;
- (ii)
- un medio adecuado para el cultivo de linfocitos; y
- (iii)
- un equipo de ensayo para medir la presencia de la citoquina segregada por los linfocitos hacia el medio.
13. Compuesto farmacéutico que comprende un
péptido, según la reivindicación 1, y un portador farmacéuticamente
aceptable.
14. Utilización de un péptido, según la
reivindicación 1, para la preparación de un compuesto farmacéutico
para el tratamiento de IDDM.
15. Compuesto que comprende un péptido, según la
reivindicación 1, conjuntamente con un péptido seleccionado del
grupo que consiste en los residuos 437-460 de p277
de secuencia ID Nº 1; residuos 437-460 de la
secuencia ID Nº 1, en el que el Cys en la posición 442 está
sustituido por Val; residuos 437-460 de la secuencia
ID Nº 1, en el que el Cys en la posición 447 está sustituido por
Val; y un péptido de secuencia ID Nº 2.
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