ES2240145T3

ES2240145T3 - Formulaciones para vacunas contra rotavirus.

Info

Publication number: ES2240145T3
Application number: ES00955357T
Authority: ES
Inventors: Carl J. Burke; David B. Volkin
Original assignee: Merck and Co Inc
Current assignee: Merck and Co Inc
Priority date: 1999-08-03
Filing date: 2000-08-03
Publication date: 2005-10-16
Anticipated expiration: 2020-08-03
Also published as: DE60020570D1; US6403098B1; CA2378864A1; AU6757600A; DE60020570T2; DK1206189T3; ATE296538T1; JP4138314B2; JP2003505482A; EP1206189A1; EP1206189A4; EP1206189B1; WO2001008495A1; PT1206189E

Abstract

Una formulación para vacuna líquida contra rotavirus que comprende: a) al menos una cepa de rotavirus: de aproximadamente 1 x 105 a aproximadamente 1000 x 105 ufp/ml; b) azúcar: de aproximadamente 1 a aproximadamente 70% (p/v); c) fosfato: de aproximadamente 0, 01 a aproximadamente 2 M; d) al menos un carboxilato: de aproximadamente 0, 05 a aproximadamente 2 M; caracterizado porque comprende además al menos un componente seleccionado entre el grupo constituido por e) aproximadamente del 0, 5% a aproximadamente el 1, 25% de albúmina de suero humano recombinante, y f) aproximadamente del 0, 001% a aproximadamente el 2% de un tensioactivo no iónico

Description

Formulaciones para vacunas contra rotavirus.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a nuevas formulaciones líquidas y liofilizadas de rotavirus útiles como vacunas y procedimientos para su preparación.

Antecedentes de la invención

Los rotavirus (RV) causan gastroenteritis aguda, una enfermedad que requiere hospitalización de bebés y niños pequeños en países desarrollados, y es una causa frecuente de muerte en niños menores de 5 años en regiones en vías de desarrollo delmundo. Estudios en Estados Unidos, Australia y Japón han demostrado que entre el 34 y el 63% de los niños hospitalizados por enfermedad diarreica aguda se asocian con infección por rotavirus. La incidencia de hospitalización por gastroenteritis por rotavirus en una organización para el mantenimiento de la salud en los Estados Unidos se estimó que era del 222 por 100.000 en niños de 13 a 24 meses de edad, y del 362 por 100.000 en los menores de un año. La infección con rotavirus se asoció con el 63% de todas las hospitalizaciones por diarrea aguda en esta población pediátrica. Una revisión de los datos de mortalidad en los Estados Unidos desde 1973 a 1983 indicó que se producían 500 muertes al año en niños menores de 4 años debido a enfermedades diarreicas, y que del 20 al 80% del exceso de muertes invernales debidas a diarrea en los Estados Unidos se asocian con infecciones por rotavirus. Los rotavirus también son responsables de una proporción importante de la mortalidad asociada con enfermedades diarreicas en países del tercer mundo. Por tanto, una vacuna eficaz contra rotavirus podría tener un impacto importante en la salud de niños tanto en áreas del mundo desarrolladas como en vías de desarrollo.

Los rotavirus tienen cápside interna y externa con un genoma de ARN bicatenario formado por once segmentos génicos. Se han definido múltiples serotipos mediante pruebas de neutralización de reducción de placa, y los estudios de virus reagrupamientos han demostrado que dos proteínas de la cápside externa, VP7 y VP4, son las determinantes del serotipo del virus. La proteína VP7 está codificada por el segmento génico 7, el segmento génico 8 o el segmento génico 9 de un rotavirus humano concreto. La localización del gen que codifica para VP7 se puede determinar para cada rotavirus específico mediante procedimientos experimentales convencionales. La proteína VP4 es una proteína estructural principal de la superficie de 88.000 dalton producto del gen 4 de un rotavirus. Al igual que VP7, funciona como un antígeno principal específico de serotipo, operativo en pruebas de neutralización de suero (NS), capaz de inducir un anticuerpo neutralizante específico de serotipo, y capaz de inducir protección inmune específica de serotipo contra enfermedades por rotavirus, en un sistema de ratón. En algunas referencias anteriores, VP4 se denominó VP3. Después de 1988, un cambio en la nomenclatura, dio como resultado la denominación más apropiada de esta proteína como VP4.

Puesto que los segmentos génicos que codifican para las proteínas VP7 y VP4 segregan independientemente, se ha propuesto que la nomenclatura de serotipaje incluya tanto el tipo G, determinado por VP7, como el tipo P, determinado por VP4. La mayoría de las infecciones por rotavirus humanos en los Estados Unidos están causadas por virus de los tipos G 1, 2, 3 ó 4, y los tipos P 1, 2 ó 3. Sin embargo, en Asia, Europa y ciertos países del tercer mundo otros tipos de rotavirus, incluyendo por ejemplo, el tipo G9, tienen mayor prevalencia.

Una serie de rotavirus animales están atenuados en humanos y se han evaluado como vacunas potenciales de rotavirus vivos, incluyendo el rotavirus bovino WC3 de serotipo G6. Se demostró que la vacuna del virus WC3 era inmunogénica y no reactogénica en niños, pero no siempre proporcionaba inmunidad protectora contra las infecciones por rotavirus humanos. Se ha sugerido que es necesaria inmunidad específica de serotipo para inducir una protección constante contra diarrea por rotavirus. La Solicitud Internacional Publicada Nº WO 98/13065 (Merck & Co., Inc.) describe formulaciones para vacunas contra rotavirus, en particular una formulación líquida para vacuna contra rotavirus que comprende de aproximadamente 1 x 10^{5} a aproximadamente 1000 x 10^{5} ufp/ml o al menos una cepa de rotavirus, de aproximadamente 1 a aproximadamente 70% (p/v) de azúcar, de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 2 M de fosfato y de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 2 M de al menos un carboxilato. También se describe una formulación para vacuna contra rotavirus liofilizada que comprende de aproximadamente 1 a aproximadamente 1000 x 10^{5} ufp/ml de al menos una cepa de rotavirus, de aproximadamente 1 a aproximadamente 20% (p/v) de al menos un azúcar y de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 2 M de fosfato.

Existe una necesidad en la técnica de vacunas eficaces que proporcionen inmunidad protectora contra la infección por rotavirus y los síntomas clínicos graves asociados con ella. La Solicitud Internacional Publicada Nº WO 99/12568 (Merck & Co., Inc.) describe el uso de albúmina sérica humana recombinante en estabilizadores para vacunas de virus vivos, incluyendo vacunas que comprenden vacunas contra varicela zoster, sarampión, paperas y rubéola. La Solicitud de Patente Europea Nº 0028563A1 (Merck & Co., Inc.) describe una composición estabilizada para vacuna en forma líquida que contiene un virus vivo, tales como el sarampión, paperas o rubéola, varicela, poliomielitis o hepatitis y similares. La Patente de Estados Unidos Nº 4.500.512 (Baume) describe un agente estabilizante para vacunas que contienen virus atenuados vivos, constituido por una solución de fosfato tamponado que contiene iones de calcio y magnesio, lactosa, sorbitol y al menos un aminoácido. En particular, se describe una vacuna contra la fiebre amarilla.

Para la distribución mundial de vacunas contra rotavirus, es necesario formular vacunas que sean estables en diversas condiciones ambientales. Se conocen los componentes usados para estabilizar vacunas. Sin embargo, se deben determinar experimentalmente las formulaciones específicas y componentes útiles para estabilizar vacunas contra rotavirus. Un objeto de la presente invención son las presentes formulaciones que estabilizan vacunas contra rotavirus.

Resumen de la invención

La presente invención proporciona nuevas formulaciones de rotavirus útiles como vacunas y procedimientos para su preparación.

Breve descripción de las figuras

Figura 1. Efecto de combinaciones de tampones sobre la estabilidad de rotavirus a 37ºC durante 1 semana. Los datos para el reagrupamiento G1 se muestran en el panel A y los del reagrupamiento P1 en el panel B. Todos los valores se expresan como ufp/ml normalizados con respecto a la referencia o muestra del día 0. Las combinaciones de tampones se representan como sigue: citrato sódico 0,05 M + bicarbonato sódico 0,15 M (\Box), citrato sódico 0,05 M + fosfato sódico 0,15 M (o), ácido láctico 0,05 M + bicarbonato sódico 0,15 M (\triangle), ácido láctico 0,05 M + fosfato sódico 0,15 M (\triangledown) y succinato sódico 0,20 M + fosfato sódico 0,05 M (\lozenge). Todas las formulaciones tienen valores de pH de 7.

Figura 2. Capacidad neutralizante de ácidos de los tampones de la formulación comparados con bicarbonato. Se tituló 1 ml de cada tampón con HCl 0,01 M. Símbolos: bicarbonato sódico 0,4 M (\bullet), citrato sódico 0,1 M + fosfato sódico 0,3 M (o), citrato sódico 0,1 M + bicarbonato sódico 0,3 M (+) y succinato sódico 0,2 M + fosfato sódico 0,1 M (\lozenge).

Figura 3. Datos de estabilidad para rotavirus reagrupamientos en formulaciones líquidas de sacarosa al 5%/succinato sódico 0,1 M/fosfato sódico 0,05 M tras su almacenamiento a diversas temperaturas. Los datos para el rotavirus G1 se muestran en el panel A y para el rotavirus P1 en el panel B. Los títulos se muestran por mililitro.

Figura 4. Datos de estabilidad para rotavirus reagrupamiento en formulaciones líquidas de sacarosa al 50%/succinato sódico 0,1 M/fosfato sódico 0,05 M tras su almacenamiento a diversas temperaturas. Los datos para el rotavirus G1 se muestran en el panel A y para el rotavirus P1 en el panel B. Los títulos se muestran por mililitro.

Figura 5. Datos de estabilidad para formulaciones líquidas de rotavirus G1 con el tampón superior, sacarosa y concentraciones de gelatina hidrolizada a diversas temperaturas. El panel A muestra los datos para el rotavirus G1 en medios E de Williams ("WE"), sacarosa al 50%, succinato sódico 0,2 M y fosfato sódico 0,1 M. Los datos de estabilidad para la vacuna en medios E de Williams, sacarosa al 70%, succinato sódico 0,2 M y fosfato sódico 0,1 M se muestran en el panel B. El panel C muestra los datos para rotavirus G1 en sacarosa al 50%, citrato sódico 0,1 M y fosfato sódico 0,3 M; el panel D muestra los datos del rotavirus G1 en medios E de Williams, sacarosa al 50%, succinato sódico 0,2 M, fosfato sódico 0,1 M y gelatina hidrolizada al 5%. Los títulos se muestran por mililitro. Los puntos de datos de 4ºC quedan ocultos por los puntos de datos de -70ºC y 15ºC.

Figura 6. Datos de estabilidad para formulaciones líquidas de rotavirus P1 con el tampón superior, sacarosa y concentraciones de gelatina hidrolizada a diversas temperaturas. El panel A muestra los datos para el rotavirus P1 en medios E de Williams ("WE"), sacarosa al 50%, succinato sódico 0,2 M y fosfato sódico 0,1 M. Los datos de estabilidad para la vacuna en medios E de Williams, sacarosa al 70%, succinato sódico 0,2 M y fosfato sódico 0,1 M se muestran en el panel B. El panel C muestra los datos para rotavirus P1 en sacarosa al 50%, citrato sódico 0,1 M y fosfato sódico 0,3 M; el panel D muestra los datos del rotavirus P1 en medios E de Williams, sacarosa al 50%, succinato sódico 0,2 M, fosfato sódico 0,1 M y gelatina hidrolizada al 5%. Los títulos se muestran por mililitro.

Figura 7. Datos de estabilidad para formulaciones líquidas de rotavirus en sacarosa al 50%, succinato sódico 0,1 M y fosfato sódico 0,05 M tras su almacenamiento a diversas temperaturas. Los datos para el rotavirus G2 se muestran en el panel A y para G3 en el panel B. Los títulos se muestran por mililitro.

Figura 8. Datos de estabilidad para formulaciones liofilizadas de rotavirus G1 tras su almacenamiento a diversas temperaturas. El panel A muestra los datos para el rotavirus G1 dializado antes de la liofilización en sacarosa al 1%, manitol al 4% y fosfato sódico 10 mM. Los datos de estabilidad para vacunas dializadas antes de la liofilización en lactosa al 1%, manitol al 4% y fosfato sódico 10 mM se muestran en el panel B. El panel C muestra los datos para el rotavirus G1 diluido en fosfato antes de la liofilización en sacarosa al 1%, manitol al 4% y fosfato sódico 75 mM. Los títulos se muestran por mililitro.

Figura 9. Datos de estabilidad para formulaciones liofilizadas de rotavirus P1 tras su almacenamiento a diversas temperaturas. El panel A muestra los datos del rotavirus P1 dializado antes de la liofilización en sacarosa al 1%, manitol al 4% y fosfato sódico 10 mM. Los datos de estabilidad para vacunas dializadas antes de la liofilización en lactosa al 1%, manitol al 4% y fosfato sódico 10 mM se muestran en el panel B. El panel C muestra los datos para el rotavirus P1 diluido antes de la liofilización en sacarosa al 1%, manitol al 4% y fosfato sódico 75 mM. Los títulos se muestran por mililitro.

\newpage

Figura 10. Efecto estabilizante de la albúmina humana recombinante (AHr) sobre la estabilidad del rotavirus G1 en formulaciones líquidas a 30ºC. Los valores de cambio de potencia se expresan como log de ufp comparado con muestras a -70ºC. El estabilizador es sacarosa al 50%/fosfato 0,1 M/citrato 0,2 M/medio de cultivo tisular/pH 6,2 en presencia o ausencia de AHr.

Descripción detallada de la invención

La presente invención proporciona nuevas formulaciones de rotavirus útiles como vacunas y procedimientos para su preparación. Más especialmente, la invención se refiere a formulaciones estabilizantes para vacunas líquidas y liofilizadas contra rotavirus. Además, algunas de estas formulaciones se pueden administrar por vía oral con o sin preneutralización del ácido gástrico puesto que algunas de las formulaciones contienen altos niveles de componentes de tamponamiento.

Debido a la distribución mundial de vacunas y a la diversidad de temperaturas ambientales, es necesario formular vacunas que sean estables bajo diversas condiciones ambientales. Se han usado diversos procedimientos de estabilización. Estos incluyen los siguientes:

a) Temperaturas bajas (-10ºC a -70ºC). La mayoría de las vacunas son estables durante su almacenamiento a temperaturas extremadamente bajas. Sin embargo, las instalaciones de almacenamiento a bajas temperaturas son costosas y no siempre están disponibles; esto limita la utilidad y el carácter práctico de este enfoque.

b) Liofilización. Las vacunas liofilizadas son razonablemente estables y se pueden almacenar a 2-8ºC durante un periodo de tiempo predeterminado. La liofilización puede, sin embargo, tener como consecuencia la pérdida de título vírico durante el desecado reduciendo de ese modo el rendimiento del proceso de fabricación. Aunque una vacuna liofilizada es típicamente más estable que una formulación líquida, durante el almacenamiento a largo plazo, una vacuna liofilizada puede incluso deteriorarse, hasta el punto que puede o no tener suficiente título para conferir inmunización. Además, puesto que una vacuna liofilizada necesita ser reconstituida antes de su uso, la preparación líquida reconstituida puede perder potencia mientras permanece a temperatura ambiente antes de su uso. Esta pérdida de título durante la reconstitución puede también tener como consecuencia un título insuficiente para conferir
inmunidad.

c) Estabilizadores. Estos son compuestos químicos específicos que interaccionan y estabilizan moléculas biológicas y/o excipientes farmacéuticos generales que se añaden a la vacuna y se usan conjuntamente con procedimientos de almacenamiento a bajas temperaturas o procedimientos de liofilización.

Estas formulaciones se pueden preparar mediante (1) dilución de la vacuna a granel en el estabilizador, (2) diálisis/diafiltración en el estabilizador o (3) concentración de la vacuna a granel y diafiltración en el estabilizador, seguido de liofilización si es necesario.

Las cantidades y concentraciones de los componentes de las formulaciones descritas en este documento se entenderán por los expertos en la materia como los porcentajes peso/volumen cuando se refieran a formulaciones liofilizadas o líquidas. Por ejemplo, una concentración del 10% en una formulación líquida es 10 gramos en 100 mililitros de la forma líquida antes de la liofilización. Otras medidas, tales como la molaridad de un compuesto, se refieren a una formulación líquida o a una formulación liofilizada antes de la liofilización.

La composición estabilizadora de la presente invención contiene los siguientes componentes en aproximadamente las cantidades indicadas. Por conveniencia, las cantidades se indican en números redondos. Sin embargo, un experto en la materia reconocerá que se espera que cantidades entre el 10 ó 20 por ciento de los valores indicados también puedan ser apropiados, es decir, cuando se indica el 20%, está implícito un intervalo del 16-18% al 22-24% y puede ser apropiado. Para formulaciones líquidas:

Sacarosa:	1-70% (p/v)
Fosfato sódico o potásico:	0,01-2 M
Succinato sódico o citrato sódico:	0,05-2 M

Medio de cultivo tisular, 0-resto del volumen restante solución salina o agua:

Para formulaciones liofilizadas:

Fosfato sódico	0,05-2 M
Sacarosa	1-20%
Manitol	1-20%
Lactosa	1-20%

Además, puede también estar presente los siguientes:

Gelatina hidrolizada	2,5% (p/v)
Cloruro sódico	150 Mm
Glutamato sódico	7 Mm.

Pueden usarse los siguientes compuestos en lugar de sacarosa, y a osmolaridad comparable: fucosa, trehalosa, ácido poliaspártico, hexafosfatode inositol (ácido fítico), ácido siálico o ácido N-acetilneuramínico-lactosa. También, puede sustituirse la sacarosa por cualquier azúcar o alcohol de azúcar adecuado tal como dextrosa, manitol, lactosa o sorbitol, a concentraciones eficaces par alcanzar la estabilización deseada.

La concentración de azúcar se refiere a la viscosidad de la formulación. En casos en los que se desea viscosidad reducida, es conocido en la técnica que es preferible usar bajas concentraciones de azúcar, por ejemplo, sacarosa. También los expertos en la materia apreciarán que el límite superior de la concentración de azúcar puede venir dictado por la capacidad de una formulación para experimentar etapas de filtración o procesamiento requeridas.

También pueden usarse tensioactivos no iónicos para estabilizar formulaciones líquidas de rotavirus. Un tipo en particular de tensioactivos no iónicos que puede usarse para estabilizar realizaciones líquidas de las formulaciones de vacunas descritas en este documento es polisorbato (ésteres de ácido graso de polioxietilensorbitán). Las formulaciones líquidas se hacen según se muestra en este documento con la adición de diversos tipos de polisorbatos comunes. Los más preferidos son polisorbato 20 y 80 (por ejemplo, Tween® 20 y Tween® 80). Se prefiere que cuando se añade un tensioactivo no iónico, se use una concentración de aproximadamente 0,001% a aproximadamente 0,50% de polisorbato 80 o polisorbato 20 en una formulación líquida. También pueden aplicarse otros tensioactivos no iónicos para estabilizar formulaciones de rotavirus. Estos incluyen otros ésteres de polioxietilensorbitán de ácido graso (polisorbatos) tales como polisorbato 20, 21, 40, 60, 61, 65, 80, 81, 85 y 120, éteres de polioxietilenalquilo tales como Brij 35®, Brij 58® así como otros incluyendo, pero sin limitarse a, éteres octilfenólicos de nonaetilenglicol incluyendo Triton X-100® y NP40®, éteres octilfenólicos de heptilenglicol incluyen Triton X-114®, triolatos de sorbitán incluyendo Span 85 y copolímeros de bloque de polioxietileno y polioxipropileno tales como las series de tensioactivos no iónicos Pluronic® (por ejemplo, Pluronic 121).

Sólo se necesita titular el tensioactivo y ensayar la estabilidad de la formulación resultante como se muestra en este documento para determinar una concentración aceptable de tensioactivo. El límite superior al cual el nivel de tensioactivo no es aceptable para una formulación administrada a humanos será cuando el tensioactivo deje de proporcionar estabilidad añadida a la formulación o cuando el tensioactivo cause otro efecto negativo. El nivel inferior será aquel al cual no se observe una mejora en la estabilidad de la formulación. Se prefiere que el tensioactivo se use a una concentración de aproximadamente 0,005% a aproximadamente 0,5%. Sin embargo, pueden ser útiles concentraciones de aproximadamente 0,001%, 0,0025%, 0,005%, 0,0075%, 0,01%, 0,025%, 0,05%, 0,075%, 0,1%, 0,25%, 0,5%, 0,75%, 1%, 1,25%, 1,50%, 1,75%, 2,0%, 2,25%, 2,5% ó 2,75%.

Pueden emplearse aminoácidos en las formulaciones liofilizadas mostradas en este documento. Se ha encontrado que los aminoácidos pueden mejorar la estabilidad de una vacuna preparada en las formulaciones liofilizadas. Los aminoácidos preferidos son arginina y glutamina. Es apropiada una concentración de aproximadamente el 0,2% a aproximadamente el 2% del peso seco. Se prefiere una concentración de aproximadamente el 0,5% a aproximadamente el 1,25% del peso seco y es más preferida a una concentración de aproximadamente el 1% del peso seco en formulaciones liofilizadas. Puede usarse una combinación de aminoácidos, pero la concentración total de los aminoácidos no deber ser mayor del 2,0%. Como para el tensioactivo, puede titularse la concentración de aminoácidos mientras se observa la estabilidad y cualquier efecto negativo en la formulación. La concentración concreta de aminoácidos se determina mejor de manera empírica y puede estar en cualquier punto del intervalo de 0,001% a 2,0%.

Otro excipiente útil tanto en formulaciones para vacunas líquidas como liofilizadas, como se muestra en este documento, es albúmina humana recombinante. La albúmina sérica humana recombinante se produce usando sistemas de expresión génica y, por tanto, es más seguro que usar albúmina aislada a partir del suero de seres humanos. La concentración de albúmina típicamente está en el intervalo de aproximadamente el 0,1% a aproximadamente el 2%, preferiblemente aproximadamente el 1%. Como para el tensioactivo, la concentración puede titularse mientras se observan la estabilidad y cualquier efecto negativo en la formulación. La concentración concreta se determina mejor de forma empírica y puede estar en cualquier punto del intervalo de 0,001% a 3,0%.

Como diluyente medio de cultivo tisular puede usarse solución salina o agua. Frecuentemente se usa medio E de Williams ("WE"), lo que se entiende como medio E de Williams o medio E de Williams modificado.

También, los agentes tamponadores para neutralizar el ácido gástrico no se limitan a citrato, fosfato y succinato y pueden incluir bicarbonato o ácidos carboxílicos comunes (carboxilatos) tales como, pero no de forma limitante, fumarato, tartrato, lactato, maleato, etc. La idoneidad de cualquiera de éstos puede calcularse simplemente ensayando una formulación en la que se sustituyen o combinan estos agentes con fosfato, citrato o succinato. Puede usarse hasta aproximadamente 2,0 M de carboxilatos en las formulaciones líquidas y liofilizadas de esta invención, sin embargo, se prefiere usar menos de aproximadamente 1,0 M, por ejemplo aproximadamente 0,05-0,9 M, y puede ser menos de aproximadamente 0,7 M, por ejemplo, 0,05 a aproximadamente 0,7 M. También se prefiere usar menos de 0,5 M, por ejemplo, de aproximadamente 0,05 a 0,45 M. Pueden ser apropiadas concentraciones concretas en estos intervalos. También pueden usarse concentraciones mayores de componentes tamponadores (por ejemplo, fosfato, succinato, citrato) si, por ejemplo, se requiere una neutralización gástrica adicional. En casos en los que en tampones fosfato/citrato o fosfato/succinato es útil una capacidad tamponadora adicional, es preferible aumentar adicionalmente las concentraciones de succinato o citrato en lugar de fosfatos, como agentes tamponadores.

Puede usarse fosfato hasta aproximadamente 2,0 M en las formulaciones líquidas y liofilizadas de esta invención, sin embargo, se prefiere usar menos de aproximadamente 1,0 M, por ejemplo, aproximadamente 0,010-0,8 M, y a menudo menos de 0,5 M, por ejemplo, aproximadamente 0,010 a 0,45 M. Es más preferible usar menos de aproximadamente 0,35 M, por ejemplo, 0,010-0,30 M. Pueden ser apropiadas concentraciones concretas dentro de estos intervalos. En formulaciones líquidas, se prefiere mantener la concentración de fosfato de aproximadamente o inferior a 0,30 M, por ejemplo, 0,010-0,35 M para evitar la precipitación de sales de fosfato, por ejemplo, durante el almacenamiento a largo plazo o ciclos de congelación/descongelación. De esta manera, el límite superior para la concentración de fosfato en cualquier formulación en particular puede venir dictada por la formación o precipitación de sales de fosfato y si las sales afectan de forma negativa la realización de la formulación en áreas tales como estabilidad y administración. Las concentraciones concretas de cualquier formulación pueden determinarse fácilmente por ensayos empíricos estándar que incluyen ajustes del pH en el intervalo de pH 6-8.

Como orientación general, se presentan a continuación en la Tabla 1 ejemplos de las capacidades neutralizantes de ácidos de algunas formulaciones líquidas.

TABLA 1 Capacidades neutralizantes de ácidos (CNA) de formulaciones estabilizadoras de rotavirus

Fosfato sódico	Citrato sódico	Sacarosa	CNA
(M)	(M)	(%)	(mEq/ml)
0,30	0,10	50	0,48
0,30	0,70	50	1,55
0,75	0,25	50	1,07

También se proporcionan para orientación general algunas formulaciones preferidas. Para formulaciones liofilizadas:

Fosfato sódico	20 mM
Gelatina hidrolizada	2,5% (p/v)
Sacarosa	5% (p/v)
Cloruro sódico	150 mM
Glutamato sódico	7 mM

o

Sacarosa o lactosa	1% (p/v)
Manitol	4% (p/v)
Fosfato sódico o potásico	0,01-0,1 M

Una formulación preferida de un estabilizador de vacuna vírica líquida de la presente invención es como sigue:

Sacarosa	50% (p/v)
Fosfato sódico o potásico	0,1 M
Succinato sódico	0,2 M
Medio de cultivo tisular	usado para todas las diluciones

o

Sacarosa	50% (p/v)
Fosfato sódico o potásico	0,3 M
Citrato sódico	0,1 M
Medio de cultivo tisular	usado para todas las diluciones

o

Sacarosa	30% (p/v)
Fosfato sódico o potásico	0,3 M
Citrato sódico	0,7 M
Medio de cultivo tisular	usado para todas las diluciones.

En estas formulaciones preferidas, puede ser apropiado usar solución salina o agua en lugar de, o en combinación con, el medio de cultivo tisular.

Esta invención implica formulaciones de rotavirus y/o rotavirus reagrupamiento (RRV) adecuados para su uso como vacunas, que se caracterizan por la seguridad para humanos y la capacidad para conferir protección inmune contra infección por rotavirus humanos. Los RRV se producen por reagrupamiento genético entre un rotavirus bovino atenuado (preferiblemente WC3 o progenie del mismo) y al menos un rotavirus que representa un serotipo humano importante desde el punto de vista epidemiológico. En un tipo de RRV, el rotavirus humano contribuye al reagrupamiento en al menos el segmento génico que codifica la proteína VP7. En otro tipo de RRV; el rotavirus parental humano contribuye al reagrupamiento al menos en el segmento génico que codifica la proteína VP4. Aún en otro tipo de RRV, la cepa del rotavirus humano parental contribuye al menos en ambos segmento de los genes VP7 y VP4. En tipos adicionales de RRV, la cepa del rotavirus humano parental puede contribuir con segmentos génicos además de aquellos que codifican los antígenos VP7 y/o VP4.

El gen humano del rotavirus que codifica para el antígeno de neutralización VP7 y/o VP4 en el RRV, puede seleccionarse a partir de cualquier serotipo humano de rotavirus para el cual se desea la inmunización. De forma deseable, en un reagrupamiento de esta invención el gen de VP7 deriva de un serotipo humano de rotavirus G1, G2, G3 ó G4 y la proteína VP4 deriva de un serotipo humano P1 ó P2. Entre las cepas de rotavirus destacadas por ser clínicamente significativas en infecciones por rotavirus humano (en lo sucesivo en este documento "cepas de rotavirus humanos"), incluyendo cepas útiles en la presente invención, están las cepas proporcionadas a continuación:

: serotipo G1: W179, Wa, D;

: serotipo G2: cepas WISC2 y DS1;

: serotipo G3: cepas W178, P, HCR3A;

: serotipo G4: Bricout (Br) B, ST3;

: serotipo G8: 69M;

: serotipo G9: W161;

: serotipo P1: W179, W178, W161, Wa;

: serotipo P2: DS1; y

: serotipo P3: WISC2, BrB, BrA, M37.

Esta lista de cepas de rotavirus humanos no es exclusiva. Por ejemplo, varias cepas de rotavirus previamente identificadas en infecciones animales también se han encontrado en infecciones humanas. Puede preverse que estas cepas pueden ser útiles como cepas de rotavirus "humanos" para los fines de esta invención, por ejemplo, el rotavirus "porcino" OSU, un serotipo G5, y el rotavirus "bovino" B223, un serotipo G10. Un experto en la materia puede obtener fácilmente otras cepas humanas apropiadas a partir de depositarios adecuados o fuentes académicas o comerciales.

Los genes no humanos presentes en reagrupamientos se obtienen preferiblemente a partir de la cepa atenuada WC3 de rotavirus bovino de serotipo G6 o su progenie, descrita en detalle en la patente de Estados Unidos 4.636.385. Sin embargo, se prefieren también otros reagrupamientos de rotavirus, particularmente, otros reagrupamientos bovinos.

TABLA 2

1

\vskip1.000000\baselineskip

Se comprenderá que las cepas mostradas en la Tabla 2 se han depositado bajo el Tratado de Budapest en referencia a las Patentes de Estados Unidos Nº 5.626.851 y 5.750.109. Las cepas se muestran aquí como ejemplo de aquellas que pueden usarse para una vacuna.

Composiciones de Vacunas

Las vacunas para proporcionar protección inmunológica contra la diarrea aguda causada por infección por rotavirus humano pueden contener uno o más rotavirus o reagrupamientos de rotavirus en una formulación de la presente invención. Los ejemplos de reagrupamientos de rotavirus y combinaciones de los mismos y su uso en vacunas se encuentran en las Patentes de Estados Unidos Nº 5.626.851 y 5.750.109, ambas incorporadas en su integridad como referencias en este documento. En la tabla 3 se resumen varios ejemplos de composiciones de vacunas.

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 3

Composiciones de vacunas	Reagrupamientos preferidos
G1 + G2 + G3 + G4	W179-3,9 + (W179+WISC2) +
	W178-8 + BrB-9
G1 + G2 + G3 + G4 + P1	W179-3,9 + (W179-3+WISC2-9) +
	W178-8 + BrB-9 + W179-4
G1 + G2 +G3 + P1	W179-3,9 + (W179-3+WISC2-9) +
	W178-8 + W179-4
G1 + P1	W179-3,9 + W179-4
G1 + G2 + G3	W179-3,9 + (W179-3+WISC2-9) + W178-8
G1 + G2 + G3 + G4 +	W179-3,9 + (W179-3+WISC2-9) + W178-8
P1 + P2	+ BrB-9 + W179-4 + DS1-4
G1	W179-3,9

\newpage

Las vacunas de rotavirus formuladas de acuerdo con esta invención pueden contener componentes convencionales. Los componentes adecuados son conocidos por los expertos en la materia. Estas composiciones de vacunas pueden prepararse en formas líquidas o en formas liofilizadas. Pueden añadirse otros componentes opcionales, por ejemplo, estabilizadores, tampones, conservantes, aromatizantes, excipientes y similares. La determinación de formulaciones específicas útiles para estabilizar las composiciones de vacunas ha requerido amplia experimentación.

Cuando se adapta para administración oral, una formulación incluye como vehículo medio E de Williams ("WE")/
sacarosa al 50%/succinato 0,1 M/fosfato líquido 50 mM. Otras formulaciones incluyen succinato 0,2 M y fosfato 0,1 M, o citrato 0,1 M y fosfato 0,3 M. Otra formulación incluye citrato 0,7 M y fosfato 0,3 M con medio E de Williams/sacarosa al 30%. Además, los nuevos adyuvantes para estimular o aumentar las respuestas inmunes desarrollados para la administración oral deberían ser compatibles con estas formulaciones. Cuando se adapten para administración parenteral, también pueden emplearse adyuvantes convencionales (por ejemplo, sales de aluminio) o nuevos adyuvantes en la composición de vacuna.

De forma opcional, la vacuna puede formularse preferiblemente para contener otros principios activos y/o antígenos inmunizantes. Por ejemplo, cuando se adaptan para administración oral, puede ser deseable una formulación con la vacuna de Sabin contra la poliomielitis.

La pauta de dosificación implicada en un procedimiento para vacunación, incluyendo el tiempo, número y cantidades de vacunas de reinmunización, se determinará considerando diversos huéspedes y factores medioambientales, por ejemplo, la edad de los pacientes, el tiempo de administración y la localización geográfica y entorno.

Procedimiento de vacunación

Por tanto, también se incluye en la invención un procedimiento de vacunación de humanos contra infecciones por rotavirus humano con las nuevas composiciones para vacunas de RRV. Las composiciones para vacunas, incluyendo uno o más de los reagrupamientos descritos en este documento, se administran preferiblemente por vía oral, en una dosis adecuada, preferiblemente líquida.

La dosificación para todas las vías de administración está generalmente entre 10^{5} y 10^{9} unidades formadoras de placa (ufp) del reagrupamiento, siendo la dosificación preferida de 10^{7} ufp. Se pueden administrar también dosis adicionales de la vacuna. Puede ser preferible inocular a bebés y niños susceptibles, sobre base anual, antes de la "temporada del rotavirus". Se ha observado que la infección por rotavirus en humanos tiene lugar en varias regiones geográficas durante la misma temporada, por ejemplo, en invierno en los Estados Unidos. Las inoculaciones repetidas antes de esa temporada pueden estar indicadas para bebés y niños susceptibles. Por ejemplo, una pauta de dosificación preferida actualmente para los Estados Unidos incluye tres dosis con aproximadamente dos meses de diferencia antes del comienzo de la temporada del rotavirus.

Los siguientes ejemplos ilustran procedimientos para preparar las formulaciones para vacunas de RRV de la invención. Estos ejemplos son sólo ilustrativos y no limitan el alcance de la invención.

Ejemplo 1

La administración de una vacuna por vía oral expone la vacuna al bajo pH del entorno gástrico. La mayoría de las vacunas tienden a inactivarse por tales condiciones extremas. Para asegurar el suministro de la vacuna activa se examinaron posibles tampones por su capacidad para neutralizar ácidos, así como su capacidad para estabilizar el rotavirus.

Estabilidad del rotavirus en presencia de tampones neutralizantes de ácidos

Se evaluó el efecto en la estabilidad del rotavirus de combinaciones de tampones de citrato, lactato y succinato (5 en total) a 37ºC durante un periodo de 1 semana. Los tampones, cuyas concentraciones se dan en la leyenda de la figura 1, se añadieron a un volumen igual de rotavirus en medio WE e incubados durante 0, 3 ó 7 días.

Para el serotipo G1, las combinaciones de bicarbonato no tenían efecto en el tiempo en la pérdida de la mitad del título infeccioso (t_{1/2}) ya que los valores eran similares a los de sacarosa al 5% (0,5 días). Por el contrario, los tampones fosfato que contenían citrato, lactato y succinato estabilizaban el virus, exhibiendo valores de t_{1/2} de 1,2, 1,4 y 1,5 días, respectivamente (figura 1).

Como se muestra en la figura 1, el fosfato tenía un efecto similar sobre la estabilidad de P1. El tampón lactato/fosfato tenía una t_{1/2} de 2,4 días y la combinación succinato/fosfato tenía una t_{1/2} de 6,8 días comparado con un valor de aproximadamente de 1,2 días para una solución de sacarosa al 5%. De forma similar a sus efectos sobre el rotavirus G1, las combinaciones de tampones que contienen bicarbonato conferían menos estabilidad al serotipo P1 que los tampones similares que contiene fosfato.

Combinación de rotavirus con tampón neutralizante de ácidos Administración única

El efecto estabilizante de succinato/fosfato, así como de otros tampones, sugiere que la formulación puede contener un neutralizador de ácidos. Un mililitro de los tampones ensayados parece neutralizar suficiente ácido para mantener el pH por encima de 3,5 (figura 2), que se conoce de nuestra experimentación directa y de la bibliografía científica por ser necesario para la prevención de la capacidad infectiva del rotavirus. En función de los volúmenes de ácido gástrico de bebés y las tasas de secreción de ácido, el pH se puede mantener in vivo durante aproximadamente 0,5 h con las formulaciones líquidas descritas en este trabajo, sin embargo, tendrán que realizarse estudios clínicos en humanos para confirmar estas suposiciones. Como otra prueba de la capacidad de tamponamiento, se realizó la prueba USP para la capacidad neutralizante de ácidos. Como se muestra en la tabla 4, los componentes de tamponamiento de la formulación de RV son más eficaces que un volumen igual de fórmula para bebés.

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 4 Capacidad neutralizante de ácidos medida mediante la prueba USP para una nueva formulación líquida de rotavirus (1); formulación usada en ensayos clínicos anteriores por otros (2); medios de cultivo tisular (3); fórmula para bebés (4) y un antiácido (5)

	mEq/ml
(1) sacarosa al 50% + succinato sódico 0,2 M
+ fosfato sódico 0,1 M en medio E de Williams ("WE")	0,41
(2) bicarbonato sódico 0,3 M + citrato sódico 0,033 M	0,40
(3) Medio E de Williams	0,02
(4) Isomil®	0,12
(5) Mylanta®	5,17

Para formulaciones liofilizadas se puede lograr una capacidad de tamponamiento adicional mediante la reconstitución con un tampón neutralizante de ácidos descrito en este documento o compuestos neutralizantes de ácidos disponibles comúnmente tal como una solución de bicarbonato. De esta forma, con una formulación líquida o liofilizada, es posible una capacidad de tamponamiento adecuada sin pretratamiento. Por consiguiente, la vacuna para rotavirus se puede administrar preferiblemente en una administración única, antes que con una etapa de neutralización gástrica por separado seguida de la vacuna. Si todavía se desea el pretratamiento de los pacientes (fórmula de alimentación o dosis de bicarbonato o un antiácido como Mylanta®) para asegurar una neutralización adecuada de los ácidos gástricos para vacunación oral rutinaria con rotavirus, estas formulaciones proporcionarán aún un gran aumento en la estabilidad de almacenamiento como se describe en la siguiente sección. Además, los reagrupamientos de rotavirus son compatibles con fórmulas para bebés (por ejemplo, Isomil® y Similac®), así como tampones de bicarbonato y muestran estabilidad térmica comparable en presencia o ausencia de estos estabilizadores.

Ejemplo 2

Los sitios de unión posibles en rotavirus se pueden considerar como dianas para la estabilización. Se ha sugerido que en las proteínas de rotavirus están presentes los sitios de unión a calcio y cinc y la presencia de estos cationes puede estabilizar la vacuna. Otros cationes divalentes pueden unirse también a estos u otros sitios y estabilizar el rotavirus y sus reagrupamientos. La unión de otros compuestos también se investigó para identificar compuestos que puedan estabilizar la vacuna sin interferir con su capacidad para conferir inmunogenicidad.

a. Efecto de iones metálicos divalentes

Se sabe que la adición de quelantes de metales tales como EDTA o EGTA causa una pérdida en la capacidad infectiva de RV, presumiblemente por perturbar la cubierta externa del RV. Esto sugiere que los metales pueden ser necesarios para la integridad estructural. Por consiguiente, se examinaron los iones metálicos divalentes para valorar su capacidad potencial para estabilizar el rotavirus (RV).

Se dializó el rotavirus en medio WE a 4ºC durante aproximadamente 16 horas en tampón tris 20 mM y NaCl 100 mM. La solución final se suplementó con 10 mM de CaCl_{2}, MnCl_{2}, MgCl_{2}, ZnCl_{2} o CaCl_{2} + ZnCl_{2} para rendir una concentración final de 10 mM del ión metálico. Las muestras se pueden filtrar antes de la formulación. Las muestras se incubaron a 37ºC durante 0, 2/3 y 7 días y se almacenaron después a -70ºC hasta que fueron ensayadas. Cada punto de datos representa un promedio de 2 muestras duplicadas.

Como se muestra en la tabla 5, el calcio y el magnesio mejoran la estabilidad de los reagrupamientos de rotavirus G1 y P1 a 37ºC cuando las formulaciones se preparan mediante diálisis de las masas víricas en formulaciones sin medio de cultivo tisular El cinc disminuye drásticamente la semivida de inactivación (t_{1/2}) de G1 y disminuye significativamente la t_{1/2} de P1 en presencia o ausencia de calcio. Es posible que el Zn^{2+} pueda reemplazar al Ca^{2+}, causando la desestabilización de la cápside externa de forma análoga a la retirada de Ca^{2+} por EDTA. Una explicación alternativa puede ser que el Zn^{2+} activa las metaloproteinasas endógenas o potencia las nucleasas derivadas del cultivo celular. La adición de metales divalentes no aumenta la estabilidad térmica de RV cuando se formulan en un estabilizador que contiene medio de cultivo tisular tal como E de Williams o E modificado de Williams. Los reagrupamientos G2 y G3 parecen comportarse de forma similar a los reagrupamientos G1 y P1 cuando se comparan en medios de cultivo tisular suplementado con catión.

De esta manera, cuando se preparan formulaciones estabilizadas de rotavirus como se describen en este documento, es preferible que estén presentes niveles suficientes de iones metálicos divalentes. Estos iones metálicos son proporcionados con mayor probabilidad por el medio de cultivo tisular y células usadas en el cultivo celular para preparar la masa vírica. Si es necesario, los metales iónicos también pueden suplementarse en la formulación final mediante adición directa individual o a través del uso de medio de cultivo tisular

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 5 Efecto de metales divalentes en las cinéticas de inactivación de reagrupamientos de rotavirus. Los valores representan la pérdida de log en el título del virus después de 3 días a 37ºC

Catión añadido (10 mM)	P1	G1
Ninguno	2,2	2,5
Ca^{2+}	0,5	0,2
Zn^{2+}	>3,8	>4,0
Zn^{2+} + Ca^{2+}	>3,9	>3,9
Mn^{2+}	1,5	2,2
Mg^{2+}	2,6	4,2

b. Efecto de azúcares y polianiones biológicamente relevantes

Los experimentos preliminares descritos anteriormente muestran que los reagrupamientos de rotavirus se estabilizan por tampón fosfato. Puesto que hay ejemplos de proteínas monoméricas que se estabilizan por fosfato, que también se estabilizan por polianiones relacionados tales como sulfato, hexafosato de inositol (ácido fítico) y diversos compuestos sulfatados (heparina y \beta-ciclodextrina sulfatada), se ensayó la capacidad de estos compuestos para estabilizar rotavirus. Las formas poliméricas de polianiones son generalmente estabilizadores más eficaces puesto que puede mantenerse una densidad de carga mayor a concentraciones más bajas de ligando, por tanto, se examinó también el ácido poliaspártico debido a su densidad de carga altamente negativa. Se examinó el ácido siálico (ácido N-acetilneuramínico) ya que puede unirse a VP4 y, por tanto, puede proporcionar protección respecto a la degradación o desplegamiento inducido por temperatura. Así mismo, se ensayaron los derivados de ácido siálico, tales como ácido N-acetilneuramínico-lactosa y mucina. Se ha sugerido que la pérdida de capacidad infectiva del RV con la maduración de hospedador es debida a un intercambio en la presencia de ácido siálico por fucosa; por consiguiente se examinó la fucosa. Por último, se examinó la trehalosa por sus reputadas propiedades como excipiente de secado
favorable.

Como puede observarse en la tabla 6, pueden añadirse diversos compuestos a las formulaciones de rotavirus y estabilizar el virus durante los ensayos de estabilización acelerada. El hexafosfato de inositol mostró la mayor capacidad para estabilizar RV comparado con el resto de ligandos de este estudio. Para G1 se observó un aumento de 4 veces en la estabilidad térmica a 37ºC. La mucina previene la capacidad infectiva, probablemente no por desestabilización de la estructura del virión sino porque secuestra el RV (se observaron agregados antes del ensayo). Los polímeros sulfatados tuvieron un efecto insignificante, sin embargo, todos los demás compuestos ensayados estabilizó RV en grado variable. Por ejemplo, la trehalosa alarga la semivida de la inactivación de G1 más de 2 veces y de P1 menos del 50%.

El ácido siálico estabilizó tanto RV G1 como P1. El ácido siálico debería estabilizar los tipos G y no los tipos P si el sitio de unión se localiza en VP4. En estos experimentos, en general, P1 parece tener una semivida menor en presencia de polianiones. La menor t_{1/2} en presencia de heparina y ácido poliaspártico puede sugerir que RV se une más fuertemente a estos ligandos antes que ser desestabilizados por ellos. El mecanismo de supresión de estabilidad no está completamente claro. Un bajo nivel de capacidad infectiva medido por el ensayo de placa puede estar causado por la desestabilización de los viriones en sí o por el secuestro de RV por el ligando. Si la asociación entre RV y el excipiente es moderada, se esperaría que el ligando se disociara en condiciones de dilución del ensayo (así como in vivo). Los complejos fuertemente unidos pueden contener partículas víricas estables que todavía no son infecciosas ya que son incapaces de disociarse. Este último caso parece aplicarse a mucina, heparina y posiblemente a ácido poliaspártico. Tampoco pueden descuidarse los efectos adversos de los excipientes sobre las células usadas en los ensayos de placa. A pesar del mecanismo, ciertos polianiones no proporcionan ventajas. Parece que hexafosfato de inositol es el más favorable de todos los ligandos examinados, excediendo la estabilidad inducida por tampones que contienen fosfato. Estos resultados también apoyan estudios previos descritos en este trabajo que muestran que el fosfato estabiliza RV de forma dramática. De esta manera, diversos fosfatos (por ejemplo, monofosfatos y polifosfatos) y compuestos fosforilados (por ejemplo, azúcares fosforilados) pueden estabilizar el rotavirus.

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 6 Efecto de polianiones y azúcares en las cinéticas de inactivación. Las muestras se incubaron a 37ºC durante 1 semana

añadido a RV en WE	t_{1/2}(días ) para G1	t_{1/2}(días ) para P1
\beta-ciclodextrina sulfatada al 5%	0,5	0,8
fucosa al 5%	1,2	1,7
ácido poliaspártico al 5%	1,5	0,6
hexafosfato de inositol al 1%	2,0	3,2
heparina al 1%	0,7	<0,1
ácido siálico al 1%	0,8	1,4
ácido N-acetilneuramínico-lactosa al 1%	1,2	1,5
mucina al 1%	<0,1	<0,1
thehalosa al 5%	1,3	2,0
sacarosa al 5%	0,5	1,4

\vskip1.000000\baselineskip

Ejemplo 3

Se obtuvieron los datos de estabilidad en sonda de un año para varias formulaciones liofilizadas y líquidas optimizadas de rotavirus G1 y P1 a diversas temperaturas y comparado con los datos de estabilidad de una formulación no optimizada, medio WE/sacarosa al 5%. Las formulaciones líquidas optimizadas que contienen reagrupamientos de rotavirus en medio WE con sacarosa, fosfato sódico y succinato sódico o citrato sódico mostraban una mejora sustancial en la estabilidad. Se observaron mejoras adicionales en la estabilidad durante el almacenamiento para las formulaciones liofilizadas. Con la formulación apropiada, la termoestabilidad del rotavirus excede la de las vacunas líquidas existentes de virus vivos (es decir, OPV) y liofilizadas (por ejemplo, sarampión).

El efecto estabilizante de los tampones succinato/fosfato o citrato/fosfato ofrecen el potencial de combinar la potenciación de la estabilidad con una neutralización gástrica. Las formulaciones líquidas, así como las formulaciones liofilizadas que pueden reconstituirse usando este tampón, pueden permitir que la formulación se suministre en una administración única.

a. Datos de estabilidad de la formulación líquida

Cuando se formulan en medio E de William/sacarosa al 5%/succinato 0,1 M/fosfato 50 mM a pH 7, la vacuna del reagrupamiento de rotavirus G1 pierde 0,7 log del título después de 1 año a 4ºC cuando se compara con muestras almacenadas a -70ºC (figura 3). La vacuna del reagrupamiento P1 pierde 0,2 log en las mismas condiciones. Después de 6 meses a 22ºC, el reagrupamiento G1 pierde 2,6 log del título de infección mientras que el reagrupamiento de rotavirus P1 pierden 5,2 log. Este puede compararse con la formulación líquida no optimizada del reagrupamiento G1 en medio E de William/sacarosa al 5% que se ha usado recientemente en ensayos clínicos con una pérdida mayor de 5 log de capacidad infectiva tras la incubación durante 6 meses a 22ºC y 1-2 log a 4ºC después de un año. Estos datos demuestran el efecto estabilizante adicional de las combinaciones de tampón específicas descritas en este
trabajo.

En medio E de Williams/sacarosa al 50%/succinato 0,1 M/fosfato 50 mM a pH 7, la vacuna de reagrupamiento de rotavirus G1 pierde 0,8 log de título después de 1 año a 4ºC cuando se compara con muestras almacenadas a -70ºC (figura 4). La vacuna de reagrupamiento P1 pierde menos de 0,3 log en las mismas condiciones. A 22ºC, tanto la vacuna G1 como P1 pierden aproximadamente 2 log de capacidad infectiva tras 1 año. Estos datos demuestran el efecto estabilizante adicional de altas concentraciones de azúcar.

Las formulaciones adicionales con altas concentraciones de tampón (medio E de Williams/sacarosa al 50%/succinato 0,2 M/fosfato 0,1 M, pH 7) estabilizan de forma adicional la vacuna de rotavirus G1 a 4ºC teniendo como resultado una pérdida no significativa del título cuando se compara con muestras similares almacenadas a -70ºC (figura 5). Además, no se observa pérdida del título de G1 en ninguna de las formulaciones líquidas optimizadas almacenadas a 4ºC durante un año. La capacidad infectiva del reagrupamiento P1 es de 0,2 log menos que las muestras almacenadas a -70ºC para todas las formulaciones (figura 6). Aunque las estabilidades de los reagrupamientos de rotavirus G1 y P1 a 4ºC son similares para las formulaciones que usan altas concentraciones de tampón, la formulación que contiene medio E de Williams/sacarosa al 50%/citrato 0,1 M/fosfato 0,3 a pH 7 muestra menos perdida a 22ºC cuando se compara con otras formulaciones. Por ejemplo, el rotavirus G1 en medio E de Williams/sacarosa al 50%/succinato 0,2 M/fosfato 0,1 M muestra una pérdida de 1,5 log en el título después de un año a 22ºC, mientras que la formulación de medio E de Williams/sacarosa al 50%/citrato 0,1 M/fosfato 0,3 M muestra sólo una pérdida de 0,6 log después de este periodo. La mayor concentración de fosfato en la última formulación puede ser responsable del incremento de la estabilidad ya que la presencia de fosfato y compuestos fosforilados aumenta la termoestabilidad de los reagrupamientos de rotavirus, como se demuestra en experimentos anteriores de análisis. Aunque, el rotavirus en la formulación tamponada con citrato/fosfato parece ser más estable a 22ºC, es menos estable a 45ºC para ambos reagrupamientos y a 37ºC para el rotavirus P1.

Después de 12 meses de 4ºC en medio E de Williams/sacarosa al 50%/succinato 0,1 M/fosfato 50 mM a pH 7, el reagrupamiento de rotavirus G2 perdía 0,1 log de capacidad infectiva y el reagrupamiento G3 disminuía 0,3 log en el título cuando se comparaba con muestras similares almacenadas a -70ºC (figura 7). Comparado con los reagrupamientos G1 y P1 en formulaciones similares (figura 3), G2 y G3 tienen estabilidades comparables a las del reagrupamiento de rotavirus P1 y mejores que las obtenidas con el reagrupamiento G1 a 4ºC. Sin embargo, las vacunas de G2 y G3 parecen ser menos estables que la vacuna G1 a 22ºC.

Se estudió la estabilidad de los reagrupamientos G1 en presencia y ausencia de medio de cultivo tisular en formulaciones que incluyen sacarosa, fosfato y citrato (tabla 7). La formulación A que sólo contiene sacarosa al 5% en WE, sirvió como estándar en este estudio. La formulación de ensayo B contiene fosfato sódico 0,3 M y citrato sódico 0,1 M con sacarosa al 50% en WE. La formulación de ensayo C contiene sacarosa al 50%, fosfato sódico 0,3 M y citrato sódico 0,1 M sin WE. La masa vírica se diluye 10 veces en las formulaciones B o C. De esta manera, el 100% del medio líquido en B es medio de cultivo tisular, mientras que el 10% del medio líquido en C es medio de cultivo tisular. En C, la masa vírica es la única fuente de medio de cultivo tisular. Como se muestra en la tabla 7, las formulaciones B y C mostraron mayor estabilidad que la formulación A. La presencia o ausencia de medio de cultivo tisular tiene un pequeño, aunque mesurable, efecto sobre la estabilidad del rotavirus a 30ºC (compárese B y C, tabla 7). Este efecto fue mayor a 37ºC, pero aún pequeño comparado con el estándar (formulación A). Estos datos indican que un amplio intervalo de concentración (10-100%) de medio de cultivo tisular es aceptable par lograr una estabilidad
mejorada.

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 7 Pérdida de potencia (como log de ufp/ml) del rotavirus G1 usando formulaciones con y sin medio de cultivo tisular. Las formulaciones A, B y C se describen en el texto

	A	B	C
Pérdida tras 1 semana a 30ºC	3,2	0,7	0,6
Pérdida tras 1 semana a 37ºC	>6,5	0,6	1,0

Para examinar el efecto del medio de cultivo tisular a proporciones de volumen de menos del 10%, se empleó la diálisis para eliminar completamente el medio de cultivo tisular de la masa vírica. Cuando se preparó una formulación líquida de rotavirus a partir de la masa vírica dializada, conteniendo, de esta manera, un 0% de medio de cultivo tisular en la formulación final, estas preparaciones se inactivaban más rápido que las preparaciones en las que la masa de rotavirus se diluyó simplemente en un estabilizador sin medio de cultivo tisular (dando como resultado una presencia de medio de cultivo tisular en la formulación final para vacuna del 10%). Esto sugiere que la diálisis puede haber retirado los componentes estabilizantes esenciales que están presentes en el medio de cultivo tisular WE. En ausencia de una cantidad eficaz de medio de cultivo tisular, pueden añadirse cationes divalentes tal como calcio a la formulación para vacuna dializada para mejorar la estabilidad (véase tabla 5). La diálisis a varias escalas de procesamiento se puede realizar también usando procedimientos de diafiltración o ultrafiltración.

La estabilidad de los reagrupamientos G1 se estudió sobre un intervalo de pH. El reagrupamiento de rotavirus G1 se formuló en el estabilizador fosfato sódico 0,3 M/citrato sódico 0,1 M/sacarosa al 50% a diferentes valores de pH. El título vírico indica que bajo condiciones de estabilidad acelerada, la estabilidad del reagrupamiento G1 es mayor en el intervalo desde aproximadamente pH 4,0 a aproximadamente pH 8,0, especialmente entre aproximadamente pH 5,0 y aproximadamente pH 7,0. Por "pH aproximado" se entiende dentro de aproximadamente 0,3 unidades del valor de pH indicado.

\newpage

TABLA 8 Pérdida del log de la potencia del rotavirus G1 después de 1 mes a 30 ó 37ºC en el estabilizador fosfato sódico 0,3 M/citrato sódico 0,1 M/sacarosa al 50% a diversos valores de pH

	1 mes a 30ºC	1 mes a 37ºC
pH 3	4,6	>6
pH 4	1,3	>6
pH 5	1,3	1,5
pH 6	1,3	1,4
pH 7	1,4	2,2
pH 8	1,6	>6

b. Datos de estabilidad de la formulación liofilizada

Las vacunas de G1 mostraron una pérdida de 0,3 log después de un año a 22ºC en una formulación liofilizada de sacarosa al 1%/manitol al 4%/fosfato sódico 10 mM a pH 7 (figura 8). Las formulaciones que contienen sacarosa al 1%/manitol al 4%/fosfato sódico 75 mM a pH 7 no mostraron pérdidas significativas después de un año a temperaturas de 22ºC o inferiores. Las vacunas de P1 mostraron menor estabilidad que las formulaciones correspondientes de G1. En sacarosa al 1%/manitol al 4%/fosfato sódico 10 mM a 4ºC durante un año, el reagrupamiento P1 muestra una pérdida en el título de 0,4 log cuando se comparaba con la vacuna almacenada a menos 70ºC (figura 9). Una formulación similar con más fosfato muestra una pérdida de la capacidad infectiva de menos de 0,2 log. La vacuna de P1 en un estabilizador de fosfato, sacarosa y gelatina hidrolizada no muestra una pérdida significativa después de un año a 4ºC. Estas formulaciones liofilizadas se prepararon diluyendo 10 veces la masa del rotavirus en el estabilizador (concentración final de medio de cultivo tisular del 10%) o mediante diálisis de la masa del rotavirus en el estabilizador (retirada completa del medio de cultivo tisular).

Ejemplo 4 Formulaciones líquidas

Se han identificado varias formulaciones optimizadas para una vacuna líquida contra rotavirus. Una formulación estabilizante final consiste en sacarosa al 50%, fosfato 0,1 M, citrato 0,2 M y WMEM a pH 6,2. La formulación estabilizante tiene una capacidad neutralizante de ácidos (CNA) de 0,8 mEq/2 ml de dosis. La adición a este estabilizador de polisorbato 80 o polisorbato 20 mejoró de forma adicional la estabilidad del reagrupamiento de rotavirus G1. Como se muestra en la tabla 9, en la formulación optimizada que contiene 0,01-0,1% de polisorbato, el rotavirus G1 tiene estabilidad mejorada de 4ºC a 30ºC, comparado con la formulación optimizada sin polisorbato.

Los tensioactivos no iónicos que tienen propiedades similares a los polisorbatos 20 y 80 pueden ser útiles para estabilizar formulaciones líquidas de rotavirus. Estos incluyen otros ésteres de polioxietilensorbitán de ácido graso (polisorbatos), como polisorbato 21, 40, 60, 61, 65, 81, 85 y 120, ésteres de polioxietilenalquilo como Brij 35®, Brij 58®, así como otros que incluyen, aunque sin limitación, éteres octilfenólicos de nonaetilenglicol incluyendo Triton X-100® y NP40®, éteres octilfenólicos de heptilenglicol incluyendo Tritón X-114®, triolatos de sorbitán, incluyendo Span 85 y copolímeros de bloque de polioxietileno y polioxipropileno tales como las series Pluronic® de tensioactivos no iónicos (por ejemplo, Pluronic 121).

\newpage

TABLA 9 Estabilidad del rotavirus G1 a diversas temperaturas en varias formulaciones líquidas en presencia y ausencia de los tensioactivos no iónicos polisorbato 20 y polisorbato 80. Todos los valores de potencia se expresan como la pérdida en log de ufp comparado con muestras a -70ºC. El estabilizador es sacarosa al 50%/fosfato 0,1 M/citrato 0,2 M/WMEM/pH 6,2. Los valores negativos indican una potencia superior comparada con el control

3

De forma similar, una vacuna pentavalente contra rotavirus que contiene los reagrupamientos de rotavirus G1, G2, G3, G4, P1 se estabiliza también por la presencia de polisorbato 80 en una formulación que contenga un 15% de masas víricas en medio de cultivo tisular y un 85% de estabilizador (con o sin medio de cultivo tisular). La concentración final fijada es sacarosa al 50%/fosfato 0,1 M/citrato 0,2 M/pH 6,2 con 15% ó \sim100% de medio de cultivo tisular. Después de un mes a 25ºC, la vacuna pentavalente muestra una estabilidad mejorada en formulaciones que contienen polisorbato 80 comparado con las vacunas formuladas sin polisorbato 80, como se muestra en la tabla 10.

\newpage

TABLA 10 Efecto de la concentración de polisorbato 80 sobre la estabilidad de la vacuna pentavalente contra rotavirus. Los valores se citan como la pérdida de potencia después de un mes a 25ºC comparado con un control a -70ºC medido mediante ensayos de formación de placas víricas. Todas las formulaciones contienen un 15% de masas víricas en medio de cultivo tisular y 85% de estabilizador (con o sin medio de cultivo tisular). De esta manera, la concentración final fijada es sacarosa al 50%/fosfato 0,1 M/citrato 0,2 M/pH 6,2 con 15% o \sim100% de medio de cultivo tisular (en este caso "100%" se refiere al estabilizador preparado con medio de cultivo tisular)

\vskip1.000000\baselineskip

4

\vskip1.000000\baselineskip

La estabilidad de almacenamiento a largo plazo a 4ºC tanto de vacunas monovalentes como pentavalentes contra rotavirus en una formulación líquida que contiene polisorbato 80 se ha demostrado por un periodo de 8 meses medido mediante ensayos de formación de placas víricas. La formulación para vacuna contiene 15% de masa vírica en medio de cultivo tisular y 85% de estabilizador con una concentración final fijada de sacarosa al 50%/fosfato 0,1 M/citrato 0,2 M/pH 6,2/polisorbato 80 al 0,01%. Las pérdidas estimadas a 4ºC se dan en la tabla 11 comparado con controles a -70ºC.

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 11 Estabilidad de almacenamiento a 4ºC después de 8 meses de las vacunas pentavalentes contra rotavirus en una formulación líquida que contiene sacarosa al 50%/fosfato 0,1 M/citrato 0,2 M/pH 6,2/polisorbato 80 al 0,01% con medio de cultivo tisular al 15%. Los valores medios de cambio de potencia se obtuvieron a partir de la combinación de grupos de datos procedentes de diferentes experimentos a 4ºC durante 8 meses. Un valor positivo representa una ganancia neta en potencia en relación con un control a -70ºC

\vskip1.000000\baselineskip

Reagrupado	Cambio de potencia media
	(log UFP)
G1	-0,05
G2	-0,15
G3	0,13
G4	0,01
P1	-0,01
Pentavalente	0,12

\vskip1.000000\baselineskip

La estabilidad de formulaciones líquidas de vacunas contra rotavirus puede mejorarse también por la adición de albúmina humana recombinante (AHr). Como se muestra en la figura 10, el rotavirus G1 formulado con uno de los estabilizadores líquidos optimizados sin AHr pierde aproximadamente un log de la potencia después de cuatro semanas a 30ºC en este experimento (sacarosa al 50%/fosfato 0,1 M/citrato 0,2 M/medio de cultivo tisular/pH 6,2). La estabilidad vírica a esta temperatura se mejora significativamente por la adición de AHr al 0,1% (p/v) ó al 1,0% al mismo estabilizador. Las albúminas de otras fuentes, como albúmina sérica bovina (BSA) o albúmina sérica humana purificada de suero (HSA) pueden tener efectos estabilizantes similares a los de AHr en formulaciones para rotavirus. Sin embargo, se prefiere la albúmina recombinante debido a su procedimiento de preparación.

Formulaciones liofilizadas

Se han identificado varias formulaciones estabilizantes para una vacuna liofilizada contra rotavirus. Estas formulaciones incluyen sacarosa al 1%, manitol al 4%, medio de cultivo tisular al 50% y fosfato sódico 10 mM a pH 6,5. La estabilidad del rotavirus liofilizado se mejora además por la adición de hasta 0,1% (p/v; 10 mg/ml) de arginina al estabilizador. Las estabilidades de los rotavirus reagrupados G1 y G2 se mejoran además a temperaturas en el intervalo de 4-37ºC por la adición de arginina (tabla 12). La inclusión de arginina mejora generalmente la estabilidad del rotavirus como se puede observar en la tabla 13. Como se muestra en la tabla 14, otros aminoácidos incluidos en el estabilizador sacarosa/manitol también mejora la estabilidad del rotavirus a 37ºC.

Se ha diseñado un tampón de reconstitución para formulaciones liofilizadas. Proporciona una capacidad neutralizante de ácidos adicional necesaria para tamponar el ácido gástrico. Este tampón consiste en sacarosa al 50% y citrato sódico 0,7 M a pH 7 y tiene una CNA de 1,5 mEq/ml. No se observó pérdida de potencia del rotavirus G1 después de su reconstitución e incubación durante 30 min a 37ºC ó 2 horas a 30ºC.

Concentraciones más bajas de sacarosa (intervalo = 0-50%) y citrato (intervalo 0,2-0,7 M) también tendrán el efecto deseado. Se pueden usar estas concentraciones más bajas de sacarosa y citrato en el tampón de reconstitución si se incrementa el volumen de reconstitución.

\vskip1.000000\baselineskip

TABLA 12 Estabilidad de los rotavirus G1 y G2 en formulaciones liofilizadas. Todos los valores se expresan como la pérdida en log de ufp comparado con un control a -70ºC. El estabilizador es sacarosa al 1%, manitol al 4% y fosfato sódico 10 mM a pH 6,5. Todas las formulaciones contienen medio de cultivo tisular al 50% derivado de las masas víricas y los diluyentes. Los valores negativos indican una potencia superior comparada con el control

5

\newpage

TABLA 13 Efecto de arginina sobre la estabilidad de los cinco reagrupamientos en formulaciones liofilizadas. Los valores representan la pérdida de potencia expresada como el log de ufp tras la incubación durante una semana a 37ºC comparados con un control a -70ºC. El estabilizador base es sacarosa al 1% + manitol al 4%. Se usó el tampón fosfato a una concentración de 10 mM a pH 6,5 para todas las formulaciones. Todas las formulaciones contienen medio de cultivo tisular al 50% derivado de las masas víricas y los diluyentes. Los valores negativos indican una potencia superior comparado con el control

6

TABLA 14 Efecto de los aminoácidos en la estabilidad de los rotavirus G1 y P1 en formulaciones liofilizadas. Los valores representan la pérdida de potencia expresada como el log de ufp tras la incubación durante dos semanas a 37ºC comparado con un control a -70ºC. El estabilizador base es sacarosa al 1% + manitol al 4%. Se usó el tampón fosfato a una concentración de 10 mM a pH 6,5 para todas las formulaciones. Todas las formulaciones contienen medio de cultivo tisular al 50% derivado de las masas víricas y los diluyentes

\vskip1.000000\baselineskip

7

Claims

1. Una formulación para vacuna líquida contra rotavirus que comprende:

a) al menos una cepa de rotavirus: de aproximadamente 1 x 10^{5} a aproximadamente 1000 x 10^{5} ufp/ml;

b) azúcar: de aproximadamente 1 a aproximadamente 70% (p/v);

c) fosfato: de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 2 M;

d) al menos un carboxilato: de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 2 M;

caracterizado porque comprende además

al menos un componente seleccionado entre el grupo constituido por

e) aproximadamente del 0,5% a aproximadamente el 1,25% de albúmina de suero humano recombinante, y

f) aproximadamente del 0,001% a aproximadamente el 2% de un tensioactivo no iónico

2. La formulación de la reivindicación 1 en la que dicho al menos un carboxilato se selecciona entre el grupo constituido por succinato, citrato, fumarato, tartrato, maleato y lactato.

3. La formulación según la reivindicación 1 en la que dicho azúcar se selecciona entre el grupo constituido por sacarosa, manitol, lactosa, sorbitol, dextrosa, fucosa, trehalosa, ácido poliaspártico, hexafosfato de inositol (ácido fítico), ácido siálico o ácido N-acetilneuramínico-lactosa.

4. La formulación líquida para vacuna de la reivindicación 1 que comprende además:

g) al menos un diluyente seleccionado entre el grupo constituido por medio de cultivo tisular, solución salina y agua hasta completar el volumen.

5. La formulación de la reivindicación 1 en la que la concentración de azúcar está entre aproximadamente 5 y aproximadamente 70%; la concentración de fosfato está entre aproximadamente 0,05 y aproximadamente 0,3 M; y dicho al menos un ácido carboxílico es citrato o succinato a una concentración entre aproximadamente 0,05 y aproximadamente 0,7 M.

6. La formulación según la reivindicación 1 en la que el pH está entre aproximadamente pH 5,0 y aproximadamente pH 8,0.

7. La formulación según la reivindicación 1 en la que dicho fosfato se selecciona entre el grupo constituido por monofosfatos, polifosfatos y compuestos fosforilados.

8. La formulación según la reivindicación 7 en la que dichos compuestos fosforilados son azúcares fosforilados.

9. La formulación según la reivindicación 1 en la que el tensioactivo no iónico se selecciona entre el grupo constituido por polisorbatos, ésteres de polioxietilenalquilo, éteres octilfenólicos de nonaetilenglicol, éteres octilfenólicos de heptilenglicol, triolatos de sorbitán y copolímeros de polioxietileno-polioxipropileno.

10. La formulación según la reivindicación 1 en la que la concentración de tensioactivo está entre aproximadamente el 0,005% y aproximadamente el 0,5%.

11. Una formulación liofilizada para vacuna contra rotavirus que comprende:

b) al menos un azúcar: aproximadamente del 1% a aproximadamente el 20% (p/v);

c) fosfato: de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 2 M;

caracterizado porque comprende además

al menos un componente seleccionado entre el grupo constituido por

d) aproximadamente del 0,1% a aproximadamente el 1,25% de albúmina sérica humana recombinante y

\newpage

e) aproximadamente del 0,1% a aproximadamente el 1,25% de al menos un aminoácido seleccionado entre el grupo de aminoácidos constituido por glutamato, glutamina y arginina.

12. La formulación según la reivindicación 11 en la que dicho al menos un azúcar se selecciona entre el grupo constituido por sacarosa, manitol y lactosa.

13. La formulación de la reivindicación 11 que comprende

a) al menos un azúcar seleccionado entre el grupo constituido por sacarosa y lactosa: aproximadamente al 1% (p/v);

b) manitol: aproximadamente al 4% (p/v) y

c) fosfato: de aproximadamente 0,010 a aproximadamente 0,075 M.

14. La formulación según la reivindicación 11 en la que después de la reconstitución, el pH está entre aproximadamente pH 5,0 y aproximadamente pH 7,0.

15. Un procedimiento para preparar formulaciones para vacunas contra rotavirus que comprende:

a) cultivar un rotavirus y mezclar el rotavirus con una solución estabilizante concentrada para formar una mezcla concentrada; y, opcionalmente,

b) dializar la masa vírica o la mezcla concentrada para formar una solución de vacuna contra rotavirus;

en el que la solución de vacuna incluye al menos un componente seleccionado entre el grupo constituido por (i) del 0,5% a aproximadamente el 1,25% de albúmina sérica humana recombinante aproximadamente y (ii) del 0,001% a aproximadamente el 2% de un tensioactivo no iónico aproximadamente y (iii) del 0,1% a aproximadamente el 1,25% de al menos un aminoácido aproximadamente seleccionado entre grupo de aminoácidos constituido por glutamato, glutamina y arginina.

16. El procedimiento de la reivindicación 15 que comprende además la liofilización de la solución de vacuna.

17. La formulación para vacuna según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 para uso en terapia.

18. Uso de una formulación para vacuna según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 para la fabricación de un medicamento para la prevención de una enfermedad causada por la infección con rotavirus.