ES2241145T3

ES2241145T3 - Dispositivo y metodo para el tratamiento de heridas.

Info

Publication number: ES2241145T3
Application number: ES98924538T
Authority: ES
Inventors: Vladimir Ritter
Original assignee: Polyheal Ltd
Current assignee: Polyheal Ltd
Priority date: 1997-06-04
Filing date: 1998-06-04
Publication date: 2005-10-16
Anticipated expiration: 2018-06-04
Also published as: US5861149A; EP0988029A1; ATE292454T1; AU7671898A; EP0988029A4; US6086863A; IL133162A0; CA2292528C; DE69829662T2; WO1998055108A1; JP2002502413A; JP4594454B2; AU764113B2; DE69829662D1; EP0988029B1; BR9809725A; KR100589064B1; BRPI9809725B1; CA2292528A1; KR20010013349A

Abstract

La invención se refiere a un procedimiento y a un dispositivo para tratamiento de heridas y estimulación de la cicatrización de las heridas y regeneración del músculo. El procedimiento incluye la aplicación de una composición incluyendo unas microesferas no biodegradables con una superficie con una carga superficial sustancial sobre el sujeto. El dispositivo además incluye un portador farmacéuticamente aceptable y un contenedor que contiene la composición y el portador. Las microesferas empleadas en la presente invención han demostrado estimular la cicatrización de heridas y la regeneración del músculo tanto in vivo como in vitro.

Description

Dispositivo y método para el tratamiento de heridas.

Campo y antecedentes de la invención

La presente invención se refiere al tratamiento de las heridas y, en particular, se refiere al uso de una composición para la fabricación de un medicamento para acelerar la cicatrización y activar la regeneración muscular con microesferas como agente terapéutico.

La cicatrización es un proceso complejo en el que participan factores tales como células, componentes de la matriz extracelular (MEC) y el microentorno celular. Esencialmente, toda cicatrización implica la reparación o sustitución de tejidos dañados. La naturaleza precisa de tal reparación o sustitución depende de los tejidos afectados, aunque todos estos procesos implican determinados principios básicos. Para ilustrar estos principios, se describirá la cicatrización cutánea o de la piel, entendiéndose que la discusión también podría extenderse a todos los tipos de reparación de heridas.

La piel tiene múltiples capas, incluyendo queratina, epidermis y dermis. Si sólo está dañada la epidermis, como en la mayoría de las lesiones menores, los queratinocitos migran desde el borde de la herida y finalmente la cubren, volviendo a formar la epidermis y queratina [D. R. Knighton y V. D. Fiegel, Invest. Radiol., 26:604-611, 1991].

Si todas las capas de la piel están dañadas o destruidas, en primer lugar tejido conjuntivo nuevo, denominado tejido de granulación, debe rellenar el espacio de la herida. Este tejido se forma mediante depósito de componentes de la MEC, por fibroblastos que migran al espacio de la herida [D. R. Knighton y V. D. Fiegel, Invest. Radiol., 26:604-611, 1991]. Actualmente se cree que el depósito de estos componentes de la MEC, tales como colágeno, es importante para la cicatrización de la herida. De hecho, la técnica anterior enseña que la fuerza de la herida cicatrizante depende en último lugar del depósito de colágeno [Haukipuro, K., et al., Ann. Surg., 213:75-80, 1991]. Por tanto, el depósito de colágeno debe estar presente a un nivel suficientemente alto para dar a la herida cicatrizante fuerza y soporte.

Para el éxito de la cicatrización debe completarse todo este proceso de múltiples etapas. Si falta uno o más de estos componentes, la cicatrización no tiene lugar, la piel no se repara y la herida permanece abierta. Este tipo de heridas abiertas puede infectarse con facilidad, retrasando adicionalmente el proceso de cicatrización y conduciendo a la formación de úlceras y llagas en la piel. En muchos pacientes, el proceso de cicatrización se inhibe adicionalmente por la presencia de otros estados que complican, tales como diabetes y edad avanzada. Los pacientes con tales estados suelen tener heridas de la piel que ulceran y no cicatrizan, o que sólo cicatrizan lentamente después de que haya pasado un periodo prolongado de tiempo.

Se han utilizado varios tratamientos para acelerar la velocidad a la que cicatrizan las heridas. Por ejemplo, la patente de los EE.UU. nº 4.772.591 da a conocer un método para acelerar la velocidad de cicatrización aplicando una combinación de ácido ascórbico, tirosina o fenilalanina y sustancias antiinflamatorias en la herida. De manera similar, la patente de los EE.UU. nº 4.590.212 da a conocer un método de aplicación de paracetamol en la herida. Muchas otras patentes se han centrado en otros métodos para acelerar la velocidad de cicatrización. Sin embargo, ninguno de estos métodos ha demostrado ser ampliamente eficaz.

En un intento para mejorar los tratamiento para las heridas, se han empleado varios vehículos farmacéuticos para administrar agentes quimioterápicos a la herida. Tales vehículos se necesitan particularmente para heridas de la piel, ya que se exponen generalmente al aire o se cubren con vendajes o ropa. En cualquier caso, el agente terapéutico puede eliminarse fácilmente mediante roce, por ejemplo. Así, se han utilizado varias cremas, geles y polvos como vehículos farmacéuticos, en un intento para superar este problema.

Un grupo interesante de vehículos farmacéuticos emplea microesferas, que son partículas pequeñas, microscópicas fabricadas con varios materiales, incluyendo plásticos e hidratos de carbono de cadena larga. Se conocen muchas solicitudes de la técnica anterior con microesferas como vehículos para varios agentes terapéuticos. Por ejemplo, la patente de los EE.UU. nº 5.264.207 da a conocer microesferas como un vehículo para una sustancia farmacéutica o cosmética. Se aplica por vía cutánea una composición que contiene las microesferas y el principio activo, permitiendo las microesferas en efecto una vía de administración para el principio activo. Sin embargo, esta referencia no enseña o sugiere el uso de las propias microesferas como sustancia terapéutica.

De manera similar, las solicitudes PCT nº WO96/13164 y WO94/13333 dan a conocer ambas microesferas fabricadas con un material que cataliza la producción o liberación de determinadas sustancias terapéuticas. La solicitud PCT nº WO96/13164 da a conocer aductos de óxido nítrico poliméricos que liberan óxido nítrico cuando se aplican directamente en el tejido dañado. La solicitud PCT nº WO94/13333 da a conocer partículas que se modifican químicamente para tener actividad de radicales libres en el entorno de la herida. De nuevo, ninguna de las referencias enseña o sugiere el uso de las propias microesferas como sustancia terapéutica, sin modificación química del material de microesfera.

Sin embargo, se mostró que determinadas propiedades de las microesferas utilizadas como vehículos farmacéuticos influían en el efecto de la propia sustancia terapéutica. Por ejemplo, se estudió la activación de linfocitos T citotóxicos mediante aloantígenos de clase I inmovilizados en microesferas de látex. Aunque el aloantígeno de clase I estaba proporcionando claramente el propio estímulo, el grado de la estimulación celular se aumentó usando tamaños de partícula de 4 a 5 micras [M. F. Mescher, J. Immunol., 149:2402-2405, 1992]. Un aumento de este tipo de la estimulación puede demostrar necesidades de contacto de superficie para los linfocitos T citotóxicos. En otras palabras, el tamaño de partícula óptimo puede haber aumentado el efecto del aloantígeno de clase I proporcionando un área de superficie óptima para el contacto celular. Sin embargo, debe recalcarse que estas perlas seguían siendo sólo vehículos para el activo.

Ritter, V.G. et al., "The influence of protamine sulfate poly-N-ethyl-4-vinylpyridinium bromide and polystyrene latex myoblast fusion in culture", Biologicheskie Membrany, vol. 7, nº 5, 1990, páginas 521-533, describe la influencia de policationes, sulfato de protamina, bromuro de poli-N-etil-4-vinilpiridinio y perlas de látex en la fusión de mioblastos esqueléticos de embriones de polluelo in vitro.

Ritter, V.G. et al., "Substances that intensify endocytosis sharply accelerate myoblast fusion", Doklady Akademii Nauk SSSR, vol. 303, nº 1, 1998, páginas 239-240 describe la capacidad de fusión de bromuro de poli-N-etil-4-vinilpiridinio y partículas de látex de poliestireno en un cultivo de células musculares de embriones de polluelo.

Tawii, N. et al., "Positively charged beads create an enhancing environment for wound healing", Molecular Biology of the Cell, vol. 7, nº Suplemento, 1996, página 419A da a conocer que las perlas con carga positiva aumentan la fuerza de la herida.

El documento US-A-5 092 883 se refiere a un método para estimular el crecimiento del tejido conjuntivo blando y reparación en mamíferos usando perlas cargadas.

Se han realizado intentos para aprovechar la aparente capacidad de determinadas partículas para activar la eficacia de sustancias activas para estimular la cicatrización. Por ejemplo, la patente de los EE.UU. nº 3.842.830 da a conocer micropartículas de vidrio que actúan estimulando la cicatrización cuando se aplican directamente al tejido dañado. La patente de los EE.UU. nº 5.092.883 da a conocer perlas de dextrano con cargas positivas, biodegradables con una capacidad similar para estimular la osteogénesis y la curación de lesiones de tejidos blandos. Sin embargo, ninguna de estas referencias enseña o sugiere la estimulación de la regeneración de músculo mediante la administración de microesferas a la herida. Además, ninguna de estas referencias enseña microesferas que estimulan inicialmente un metabolismo y proliferación celulares más rápidos, que tienen además un efecto limitado, finito, de modo que el metabolismo y la proliferación celulares rápidos no se inducen permanentemente.

Un efecto limitado de este tipo es especialmente importante para estimular la cicatrización, que requiere un aumento inicial del metabolismo y proliferación celulares, seguido de un cese de tal activación celular después de que se haya producido la cicatrización. Sin una inducción de tal activación, no se producirá la cicatrización. Sin embargo, si la activación celular no cesa después de que la cicatrización esté sustancialmente completa, puede producirse formación anómala de cicatrices, como en la formación de queloides. Por tanto, debe existir un equilibrio entre la estimulación y la inhibición del metabolismo y proliferación celulares durante la cicatrización.

Por tanto, existe una necesidad médica no satisfecha de una sustancia particulada que puede aplicarse directamente a tejido dañado con el fin de estimular la cicatrización, que además tenga efectos autolimitados y que sea sustancialmente atóxica y que pueda estimular también la regeneración muscular.

Sumario de la invención

La invención es como se define en las reivindicaciones.

Los objetos de la presente invención se describen detalladamente en la siguiente descripción, figuras y reivindicaciones.

La presente invención se refiere a una composición, un dispositivo y un método para estimular la cicatrización usando microesferas. De manera inesperada, las microesferas del intervalo de tamaño particular descrito en el presente documento pueden estimular la cicatrización sin la adición o inclusión adicional de ningún fármaco u otra sustancia terapéutica. De hecho, tal como se describe más adelante, estas microesferas no se degradan o se someten a otra alteración química con el fin de producir su efecto terapéutico. Así, estas microesferas son el principio activo en las composi-
ciones de la presente invención, más que actuar simplemente como un vehículo para otro principio activo diferente.

Según las enseñanzas de la presente invención, se proporciona una composición, un método y dispositivo de tratamiento de la herida de un sujeto. La composición consiste esencialmente en un agente capaz de formar un contacto de múltiples puntos con una membrana celular, siendo el agente sustancialmente no biodegradable durante el periodo del tratamiento. El agente es una microesfera que grupos superficiales cargados. Según una realización, la composición consiste esencialmente en un agente con grupos superficiales cargados, en los que la carga puede ser negativa o positiva.

El material de microesfera se selecciona del grupo que consiste en poliestireno, poliestireno derivatizado, polimetilacrilato, silicona, polilisina y bromuro de poli-N-etil-4-vinilpiridinio. Según realizaciones determinadas de la presente invención, los grupos superficiales cargados se seleccionan de grupos cargados que consisten en poliestireno, poliestireno derivatizado, sulfato, bromuro de poli-N-etil-4-vinilpiridinio, protamina, sulfato de protamina, sales de protamina, polilisina y carboxilo. También preferiblemente, la microesfera tiene un diámetro en un intervalo de desde aproximadamente 0,01 micras hasta aproximadamente 200 micras, más preferiblemente en un intervalo de desde aproximadamente 0,1 hasta aproximadamente 100 micras y lo más preferiblemente de desde aproximadamente 0,1 hasta aproximadamente 20 micras.

Según otra realización preferida de la presente invención, la composición también incluye un vehículo farmacéuticamente aceptable para la microesfera. Preferiblemente, el vehículo farmacéuticamente aceptable es una disolución acuosa. Alternativa y preferiblemente, el vehículo farmacéuticamente aceptable es un material formador de gel. Más preferiblemente, el material formador de gel incluye metilcelulosa.

Según todavía otra realización preferida de la presente invención, la microesfera está presente en una concentración en un intervalo de desde aproximadamente el 0,0001 por ciento hasta el 1,5 por ciento, peso por peso. Más preferiblemente, la microesfera está presente en una concentración en un intervalo de desde aproximadamente el 0,001 por ciento hasta el 1,0 por ciento, peso por peso. Lo más preferiblemente, la microesfera está presente en una concentración en un intervalo de desde aproximadamente el 0,01 por ciento hasta el 0,2 por ciento, peso por peso.

Según todavía otra realización de la presente invención, se proporciona una composición para estimular la regeneración muscular en un sujeto, incluyendo la composición un agente capaz de formar un contacto de múltiples puntos con una célula muscular; teniendo preferiblemente una microesfera un grupo superficial con una carga sustancial que puede ser positiva o negativa.

Según todavía otra realización de la presente invención, se proporciona un dispositivo para tratar una herida, que incluye: (a) una composición que incluye un agente capaz de formar un contacto de múltiples puntos con una membrana celular y un vehículo farmacéuticamente aceptable en el que el agente es sustancialmente insoluble; y (b) un recipiente para contener la composición. Como se ejemplifica, el vehículo se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en medio acuoso, vehículo de aerosol, pomada y vendaje.

Según otras realizaciones preferidas de la presente invención, el vehículo farmacéutico se selecciona del grupo que consiste en disolución acuosa, material formador de gel, vehículo de aerosol y pomada. Preferiblemente, el vehículo farmacéutico es un material formador de gel. Más preferiblemente, el material formador de gel incluye metilcelulosa. Lo más preferiblemente, el recipiente es un tubo que se puede apretar. Alternativa y preferiblemente, el vehículo farmacéutico es una disolución acuosa. Más preferiblemente, el recipiente es un recipiente sustancialmente sellado y estéril. Lo más preferiblemente, el recipiente sustancialmente sellado y estéril es un pulverizador de aerosol.

Según todavía otra realización de la presente invención, se proporciona un dispositivo para estimular la regeneración muscular, que incluye: (a) una composición que incluye un agente que puede formar un contacto de múltiples puntos con una membrana celular y un vehículo farmacéuticamente aceptable en el que el agente es sustancialmente insoluble; y (b) un recipiente para contener la composición.

El método de la presente invención también puede utilizarse en cosmética, para prevenir el exceso de formación de cicatrices en un corte u otra herida en la piel, como la piel de la cara, y para tratar el acné.

Descripción detallada

La presente invención se refiere a un dispositivo y a un método para estimular la cicatrización usando microesferas. De manera inesperada, las microesferas del intervalo de tamaño particular descrito en el presente documento pueden estimular la cicatrización sin la adición o inclusión adicional de ningún fármaco u otra sustancia terapéutica. De hecho, tal como se describe más adelante, estas microesferas no se degradan o se someten a otra alteración química con el fin de producir su efecto terapéutico.

La estructura de estas microesferas incluye un núcleo y al menos un tipo de grupo superficial cargado que está presente al menos en el exterior del núcleo de la microesfera. Ejemplos de materiales adecuados para el núcleo incluyen polímeros de cadena larga tal como poliestireno, poliestireno derivatizado, polilisina, bromuro de poli-N-etil-4-vinilpiridinio, polimetilacrilato (PMMA) y silicona. Preferiblemente, el material se selecciona del grupo que consiste en poliestireno y poliestireno derivatizado.

Ejemplos de grupos superficiales incluyen, pero no se limitan a, sulfato, bromuro de poli-N-etil-4-vinilpiridinio, protamina, sulfato de protamina, sales de protamina, polilisina, carboxilo, poliestireno y poliestireno derivatizado. Más preferiblemente, el grupo superficial se selecciona del grupo que consiste en polilisina, poliestireno, poliestireno derivatizado y carboxilo. Estos grupos superficiales pueden estar presentes como parte del núcleo de la microesfera o pueden añadirse posteriormente mediante tales procesos químicos como derivatización del polímero de cadena larga. En lo sucesivo en el presente documento, el término "derivatización" se refiere al proceso de alterar, modificar o cambiar químicamente una molécula o una porción de la misma.

Por tanto, la estructura de las microesferas incluye un "núcleo" y un "grupo superficial" que son dos elementos distintos, incluso cuando la lista de posibles especies de ambos elementos coincida. Por ejemplo, el poliestireno puede ser tanto un grupo superficial como un material de núcleo de la microesfera.

Las microesferas producidas a partir del polímero deberían ser sustancialmente insolubles en medios acuosos, en lugar de formar una suspensión o dispersión en tales medios.

Con el fin de aclarar adicionalmente los parámetros de la presente invención, deben definirse varios términos. En lo sucesivo, el término "herida" incluye cualquier lesión en cualquier parte del organismo de un sujeto que incluye, pero no se limita a, estados agudos como quemaduras térmicas, quemaduras químicas, quemaduras por radiación, quemaduras producidas por un exceso de exposición a radiación ultravioleta como quemadura solar, daño a tejidos corporales tales como periné, como resultado del trabajo del parto y del parto, incluyendo lesiones originadas durante intervenciones médicas como episiotomías, lesiones inducidas por traumatismos incluyendo cortes, aquellas lesiones originadas en accidentes de automóvil y otros accidentes mecánicos, y aquellas producidas por armas de fuego, armas blancas y otras armas y lesiones posquirúrgicas, así como estados crónicos como úlceras por presión, úlceras de decúbito, estados relacionados con diabetes y mala circulación y todos los tipos de acné. Las áreas del organismo que pueden tratarse con la presente invención incluyen, pero no se limitan a, piel, músculo y órganos internos. En lo sucesivo, el término "sujeto" se refiere a un ser humano o animal inferior en el que se pone en práctica la presente invención.

En lo sucesivo, el término "estimular" incluye acelerar y activar. En lo sucesivo, "reducir la cicatrización patológica" incluye prevenir o disminuir el exceso de formación de cicatrices tales como queloides y cicatrices hipertróficas, así como disminuir la extensión de la formación de tejido cicatricial, tanto externamente tal como en la piel del sujeto, como internamente tal como las adherencias. Finalmente, debe observarse que el método de la presente invención también puede utilizarse en cosmética, para prevenir el exceso de formación de cicatrices en un corte u otra herida de la piel tal como la piel de la cara y para tratar el acné. En un sentido cosmético, el término "exceso de formación de cicatrices" incluye cualquier cicatrización patológica que no se desea o es inaceptable desde el punto de vista cosmético.

Aunque la discusión de más adelante se refiere a tipos específicos de microesferas, debería observarse que esto no pretende ser limitante en ningún sentido. Aquellos expertos en la técnica apreciarán que estas microesferas, más generalmente descritas como "agentes", pueden ser perlas, partículas o glóbulos que son sólidos o huecos. En realizaciones preferidas de la presente invención, estos agentes se dispersan en un medio de vehículo farmacéuticamente aceptable en el que los agentes son sustancialmente insolubles, como una suspensión en medio acuoso por ejemplo, o en un medio no acuoso tal como una pomada o un pulverizador de aerosol. La forma de los agentes puede ser regular, tal como esférica o elíptica, o formas regulares no esféricas; o la forma de las partículas puede ser irregular, de modo que la superficie no es una curva continua única o de modo que la superficie no es lisa.

Además, los agentes pueden ser una mezcla de diferentes polímeros y también pueden ser una mezcla de diferentes partículas, perlas o glóbulos de diferentes tamaños. Los agentes también pueden tener poros de diferentes tamaños.

A modo de ejemplo, el polímero de cadena larga que forma los agentes puede estar reticulado, lo que favorece particularmente la forma esférica de un microesfera, aunque una forma de este tipo puede obtenerse sin reticulación.

Alternativamente, las partículas pueden tener formas irregulares caóticas, particularmente si el polímero no está reticulado. La partícula puede tener cualquier forma, tal como enrollada, globular, extendida y de espiral aleatoria. Preferiblemente, el polímero no debe ser bioquímicamente reactivo y debe ser no biodegradable. Lo más preferiblemente, el polímero es no biodegradable sustancialmente durante el periodo de tratamiento, de modo que permanecerá sin degradarse durante el periodo necesario para la cicatrización de la herida. En lo sucesivo, el término "no biodegradable" se refiere a agentes que no son biodegradables durante el periodo de tratamiento, que es el periodo necesario para el tratamiento de la herida.

Como mínimo, los agentes deben tener las siguientes propiedades:

1.: Deben poder formar contactos de múltiples puntos con células o partes de células de las mismas, como la membrana celular exterior y moléculas en esta membrana;

2.: Deben poder estimular la cicatrización sin alteración o degradación química importante; y

3.: Deben ser sustancialmente insolubles en medios acuosos tales como líquidos corporales y en su lugar, deben formar una suspensión.

Estas características son importantes porque, como se tratará además a continuación, el efecto de los agentes de la presente invención parece estar directamente relacionado con la formación de contactos de múltiples puntos entre el material de los agentes y una parte de la célula como la membrana celular exterior, formando de esta manera una superficie adherente para que las células se unan. Tales contactos de múltiples puntos son posibles con muchos polímeros diferentes que permiten que los grupos cargados estén accesibles para la interacción con moléculas y partes de la membrana celular exterior. Por tanto, aunque la descripción de más adelante se centra en un tipo de agente, las microesferas, se entiende que la presente invención cubre cualquier material que pueda formar tales contactos de múltiples puntos.

Como se ha indicado anteriormente, la microesfera tiene preferiblemente un diámetro en un intervalo de desde aproximadamente 0,01 micras hasta aproximadamente 200 micras, más preferiblemente en un intervalo de desde aproximadamente 0,1 micras hasta aproximadamente 100 micras, y lo más preferiblemente desde aproximadamente 0,1 micras hasta aproximadamente 20 micras. Sin desear estar limitado por ningún mecanismo, debe observarse que estos intervalos preferidos son el mejor tamaño para permitir la captación de las microesferas por los macrófagos que infiltran el área de la herida. Parece que las microesferas atraen realmente y activan los macrófagos mediante el contacto con al menos una parte de los macrófagos, probablemente las moléculas de la membrana celular exterior del macrófago. Los efectos antiinflamatorios y antibacterianos observados para las microesferas son, por tanto, efectos presuntamente indirectos, obtenidos a través de la activación de los macrófagos o de otras célu-
las.

Otra propiedad importante de las microesferas es la carga de los grupos superficiales. La carga total llevada por determinados ejemplos preferidos de microesferas se midió como un potencial Z o zeta mediante movilidad electroforética (milivoltios) con un Zetamaster (Malvern Instruments, Reino Unido). El intervalo de los potenciales Z medidos en determinadas realizaciones ejemplificadas en el presente documento fue de desde -29,58 mV hasta -79,76 mV. En lo sucesivo, el término "cargado" se refiere a un potencial Z con un valor absoluto de al menos aproximadamente 1 mV, y preferiblemente de al menos aproximadamente 10 mV, ya sea negativo o positivo.

En las microesferas en las suspensiones probadas no se observó agregación, coalescencia, agrupación ni experimentaron endurecimiento irreversible. Aunque las microesferas sedimentaron algo con el tiempo, se resuspendían fácilmente con agitación suave.

Breve descripción de los dibujos

La invención se describe en el presente documento por medio de ejemplos sólo, con referencia a los dibujos adjuntos, en los que:

La figura 1 es un gráfico que muestra la capacidad de las microesferas de la presente invención para aumentar la actividad creatina fosfocinasa;

la figura 2 es un diagrama que ilustra el efecto de las microesferas de la presente invención sobre la síntesis de colágeno;

las figuras 3A-3C ilustran el efecto de las microesferas de la presente invención sobre la forma de los mioblastos;

las figuras 4A-4D ilustran la capacidad de las microesferas de estimular la cicatrización en ratas;

la figura 5 es un gráfico de la velocidad a la que el área de la herida de la figura 4 disminuye;

las figuras 6A y 6B comparan el efecto de las microesferas de la presente invención sobre la cicatrización con medios de cultivo tisular y solución salina en ratas;

las figuras 7A-7D demuestran la capacidad de las microesferas de la presente invención de estimular la cicatrización en un primer estudio de casos humanos;

las figuras 8A y 8B demuestran adicionalmente la eficacia de la presente invención en el estudio de casos humanos de las figuras 7A-7D;

las figuras 9A y 9B demuestran la eficacia de la presente invención en un segundo estudio de casos humanos;

las figuras 10A-10D muestran el efecto de la presente invención en un tercer estudio de casos humanos;

figuras 11A y 11B muestran la eficacia de la presente invención en un cuarto estudio de casos humanos; y

la figura 12 muestra la eficacia de una formulación en gel de la presente invención.

Descripción de las realizaciones preferidas

La presente invención se ejemplifica en el presente documento mediante el uso de microesferas que pueden utilizarse para estimular la cicatrización en general, así como la regeneración muscular. La cicatrización y la regeneración muscular implican ambas la reparación de tejido dañado y la sustitución del tejido que falta. La migración y proliferación de tipos específicos de células debe producirse de una manera ordenada y estructurada, que puede diferenciarse fácilmente del crecimiento incontrolado de tejidos malignos tales como tumores sólidos. En particular, las células implicadas en la cicatrización y reparación muscular deben activarse en primer lugar con el fin de llevar a cabo sus papeles necesarios en el proceso de cicatrización. Aunque se desconoce el mecanismo exacto, el crecimiento celular ordenado, estructurado en proliferación que se produce en la cicatrización demuestra claramente la presencia de un proceso regulador sumamente organizado.

Tal como se demuestra en los ejemplos facilitados a continuación, las microesferas de la presente invención no parecen interferir con este proceso complejo, organizado y estructurado, ya que estas microesferas sólo aceleran claramente el ritmo del proceso de cicatrización general, así como de las etapas específicas dentro de este proceso. Sin embargo, de manera inesperada, las microesferas de la presente invención no hacen que las células presenten un estado de activación metabólica continua, incontrolada, lo que indica que no se afectan los procesos reguladores normales. Por tanto, las microesferas de la presente invención no provocan una activación celular incontrolada.

Sin limitar la presente invención a un mecanismo particular, la adición de microesferas con grupos cargados negativamente puede tener un efecto terapéutico sobre la cicatrización al servir como una superficie adicional para la unión y la siembra de las células. Una hipótesis para la eficacia de las microesferas de la presente invención es que los grupos cargados negativamente permiten la creación de múltiples enlaces entre la superficie sólida de la microesfera y las membranas celulares, lo que representa contactos de múltiples puntos entre el material de la microesfera y la membrana celular. La formación de estos enlaces produce cambios en la distribución y el estado de los ligandos de membrana, reorganización citoesquelética, activación de transducción de las señales intracelulares y otros cambios bioquímicos, que conducen finalmente a la activación de la célula. La activación celular conduce entonces a la proliferación celular y a la producción de factores de crecimiento y de colágeno y otros componentes de la matriz extracelular. Debe observarse que la presente invención no necesita basarse en ningún mecanismo particular, ya que como se demuestra más adelante, estas microesferas tenían claramente un efecto beneficioso para el tratamiento de las heridas y la cicatrización in vivo.

En los ejemplos de a continuación se probaron varios tipos diferentes de microesferas. Estas microesferas estaban hechas de poliestireno, con grupos superficiales carboxilo o amino o sin grupos superficiales adicionales. Los diámetros de las microesferas oscilaron desde aproximadamente 0,1 hasta aproximadamente 20 micras. También se probó el potencial zeta de determinadas microesferas y se demostró que el tamaño de la esfera y el tipo de grupos superficiales tenía claramente un efecto sobre la cantidad de carga total transportada por cada microesfera, que podría tener un efecto importante sobre la capacidad de la microesfera para estimular la cicatrización.

Aunque se ilustran determinados tipos específicos de microesferas, se entiende que podrían utilizarse muchos otros tipos relacionados de microesferas si se cumplen las siguientes características.

1.: Deben poder formar contactos de múltiples puntos con células o partes de células de las mismas;

2.: Su mecanismo de acción no debe requerir alteración o degradación química; y

Otros atributos preferibles incluyen lo siguiente. En primer lugar, las microesferas deben fabricarse preferiblemente a partir de material que es no biodegradable durante el periodo de tratamiento, lo más preferiblemente de poliestireno. En segundo lugar, las microesferas deben llevar preferiblemente una carga sustancial, más preferiblemente una carga total negativa. Aunque el tamaño de las microesferas es menos crítico, preferiblemente las microesferas deberán tener desde aproximadamente 0,1 hasta aproximadamente 20 micras de diámetro. Preferiblemente, las microesferas deben estar derivatizadas con grupos superficiales carboxilo, aunque también pueden utilizarse otros grupos cargados negativamente. Por tanto, estos tipos de microesferas se facilitan con fines ilustrativos sólo y no pretenden ser limitantes de ninguna forma.

Los principios y operación de las microesferas según la presente invención pueden entenderse mejor con referencia a los ejemplos, dibujos y la descripción adjuntas.

Ejemplo 1 Efecto de las microesferas sobre la creatina fosfocinasa

Las microesferas de la presente invención indujeron claramente un aumento inicial de la actividad creatina fosfocinasa (CPK) de mioblastos cultivados, tal como se muestra en la figura 1. Sin embargo, tras ocho días, tanto las células no tratadas como las tratadas demostraron el mismo nivel de actividad CPK, lo que indica que la inducción de aumento de la actividad CPK por las microesferas de la presente invención es temporal. El método experimental fue el siguiente.

Se preparó un cultivo primario de músculo esquelético de embrión de rata tal como describe Freshney [R. J. Freshney, Culture of Animal Cells, Willey, 1986, págs. 117, 170-172]. Brevemente, se disecaron los músculos liberándolos de piel y hueso y se disgregaron mediante tripsinización caliente (0,25% de tripsina a 36,5ºC). Se redujo la contaminación por fibroblastos mediante cultivo en placa previo de células durante 1 hora en una incubadora con el 5% de CO_{2}, 37ºC, ya que los fibroblastos se adhieren en primer lugar a las placas de cultivo tisular. Los mioblastos se sembraron después en placas Petri de 35 mm a una concentración de 50.000 células por ml con 2 ml de medio (medio Eagle modificado por Dulbecco: medio 199 a una razón 1:4), enriquecido con antibióticos, 10% vol/vol de suero equino y 4% vol/vol de extracto embrionario de polluelo. El extracto embrionario de polluelo se preparó a partir de embriones de polluelo de 10 días de edad según R. J. Freshney, Culture of Animal Cells, Willey, 1986. Los antibióticos incluyeron anfotericina y gentamicina, diluidos 1:1000 con respecto a la concentración inicial patrón de 2,5 mg/ml. Tras 24 horas, se decantó el medio y se sustituyó con medio nuevo que contenía el 20% vol/vol de suero equino fetal y el 1% vol/vol de extracto embrionario de polluelo.

Las células cultivadas se trataron entonces con microesferas, empezando en el momento del cultivo en placas, en medios durante 4-8 días o sólo con medios. Las microesferas eran o bien de poliestireno carboxilado de 1, 2 o 4,5 micras de diámetro o bien sólo poliestireno de 4,5 micras de diámetro. La concentración de las microesferas fue de 10^{6} o 10^{7} por ml de medio, obteniéndose resultados similares para ambas concentraciones (no mostrados). Tras 4, 5, 6, 7 u 8 días de tratamiento, se midió la actividad creatina fosfocinasa mediante un ensayo estándar ("Creatine Kinase", Worthington Enzyme Manual, Worthington Biochemical Corporation, Freehold, N.J., EE.UU., 1972, págs. 54-55). Los resultados se muestran en la figura 1, como unidades de actividad CPK por mg de proteína celular total.

La figura 1 demuestra claramente la capacidad de las microesferas de la presente invención de inducir un aumento inicial de la actividad creatina fosfocinasa, comparada con las células control. Tras 4 días de tratamiento, las células tratadas con microesferas muestran un aumento inicial de la actividad CPK, en comparación con las células control. Este aumento es particularmente pronunciado en los días 5 y 6 de tratamiento. Sin embargo, el día 7, la actividad CPK en las células control empieza a conseguir la paridad con la de las células tratadas con microesferas. El día 8, tanto las células control como las tratadas con microesferas muestran niveles similares de actividad. Claramente, las microesferas estimularon un aumento inicial de actividad CPK en mioblastos, que se estabilizó tras 8 días de tratamiento. Tal aumento de la actividad CPK se correlaciona con la maduración bioquímica de las células miogénicas. Por tanto, las microesferas estimularon la maduración bioquímica de los mioblastos cultivados.

Ejemplo 2 Efecto de las microesferas sobre la proliferación y fusión celulares

Se demostró que las microesferas de la presente invención inducen un aumento inicial tanto de la proliferación celular como de la fusión de mioblastos, si se compara con las células control (no tratadas), tal como se muestra a continuación.

Los cultivos primarios de mioblastos de rata se prepararon tal como se describe en el ejemplo 1 anterior, excepto porque las células se hicieron crecer sobre cubreobjetos. Las células tratadas se incubaron con microesferas en medios, tal como se describe adicionalmente más adelante, mientras que a las células control sólo se les añadió medio.

Para determinar la extensión de la proliferación celular, se fijaron las células en etanol/ácido acético (3:1) y después se tiñeron con hematoxilina-eosina. Las células teñidas se contaron después en un microscopio óptico. Se calculó el índice mitótico como la proporción de células en mitosis contadas por 1000 células.

Para el examen de la proliferación celular, se utilizaron microesferas de poliestireno que tenían grupos superficiales de sulfato, con un diámetro de 0,18 micras y una concentración de 10^{7} microesferas/ml de medio. Se observó un aumento de 20 veces en el índice mitótico tras el tratamiento durante 24 horas con microesferas en comparación con las células control. Específicamente, el índice mitótico de las células control fue del 1,25 \pm 0,7%, mientras que el de las células tratadas con microesferas fue del 24,6 \pm 1,0%. Por tanto, las microesferas estimularon claramente un gran aumento del índice mitótico de los mioblastos.

También se examinó el efecto de las microesferas sobre la fusión de los mioblastos. Los resultados se facilitan en la tabla 1. Generalmente, las células tratadas con microesferas mostraron aproximadamente una tasa de fusión del 150% en comparación con los controles. Sin embargo, el grado de este efecto dependía del tipo de las microesferas y de la duración del tratamiento.

Los tipos de microesferas probadas se facilitan en la tabla 1. El diámetro de las microesferas se facilita en micras en "diámetro". Los grupos superficiales sobre las perlas de poliestireno se facilitan en "grupo superficial". Las perlas de poliestireno sin ninguna derivatización adicional son "poliestireno". Las perlas derivatizadas con grupos superficiales carboxilo o amino se describen como "carboxilo" y "amino", respectivamente. La concentración de perlas se facilita como número de perlas por ml de medio en "conc.".

Las células se prepararon, se fijaron y se tiñeron como para determinar la velocidad de proliferación de los mioblastos, descrita anteriormente. Inicialmente las células se cultivaron en placa en la densidad facilitada en la tabla 1 como células por ml de medio, en la columna "células iniciales". Las mediciones de la fusión de mioblastos se hicieron tras el número de días dado tras el tratamiento en "días tras el tratamiento".

El grado de fusión se calcula como la proporción de núcleos dentro de células multinucleares o miosimplastos, en relación con la cantidad total de núcleos dentro del campo microscópico, facilitado como "proporción de fusión" para las células tratadas con microesferas y "fusión control" para las células control, no tratadas. Se contaron al menos 400 núcleos para cada condición experimental. La razón del grado de fusión en las células tratadas con microesferas y las células control, no tratadas, se facilita como "efecto relativo". Si no se facilita ningún valor para una casilla particular en la tabla 1, el valor es el mismo que el de la fila superior.

1

Como puede observarse en la tabla 1, todos los diferentes tipos de microesferas estimularon la fusión celular de mioblastos, aunque el grado del efecto dependió del diámetro de la microesfera, el grupo superficial sobre la microesfera, el número de días tras el tratamiento y la concentración. La fusión de mioblastos se produce cuando el tejido muscular se forma durante la embriogénesis y también es una etapa muy importante en la regeneración muscular y reparación de tejido muscular dañado. Por tanto, la capacidad de las microesferas de estimular tal fusión indica claramente el potencial de estas microesferas de estimular la regeneración muscular, como se demuestra en el ejemplo 5 de más adelante.

Ejemplo 3 Efecto de las microesferas sobre la síntesis y depósito de colágeno

Como se indicó en la sección de antecedentes, la síntesis y depósito de colágeno es una etapa importante en el proceso de cicatrización. Además, la cantidad de colágeno depositado en la herida en un determinante importante de la fuerza de la herida. Por tanto, aunque las microesferas de la presente invención tienen claramente una variedad de efectos sobre diferentes tipos celulares, como se ha demostrado en los ejemplos anteriores y siguientes, un determinante importante de la capacidad de una composición de estimular la cicatrización es claramente su efecto sobre la síntesis y depósito de colágeno.

Tal como se muestra en las figuras 2A y 2B, las microesferas de la presente invención estimulan claramente la síntesis de colágeno mediante fibroblastos cultivados. El mayor efecto se observa con las microesferas de tipo I y tipo II. Las microesferas de tipo I tenían un diámetro de 4,5 micras, se fabricaron con poliestireno carboxilado y tenían un potencial Z de aproximadamente -26,96 mV. Las microesferas de tipo II tenían un diámetro de 0,49 micras, se fabricaron con poliestireno sólo y tenían un potencial Z de aproximadamente -34,5 mV. Las microesferas de tipo III tenían un diámetro de 1,0 micras, se fabricaron con poliestireno carboxilado y tenían un potencial Z de aproximadamente -53,34 mV. El método experimental fue el siguiente.

Se hicieron crecer cultivos de fibroblastos de prepucio en 75 cm^{2} de matraces de plástico (Corning Glass Works, Corning, N.Y.) en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) que contenía 4,5 mg/ml de glucosa complementada con el 10% vol/vol de suero bovino fetal, L-glutamina 2 mM, 50 \mug/ml de sulfato de gentamicina y 2,5 mg/ml de anfotericina B. Los cultivos se incubaron a 37ºC en el 5% de CO_{2} hasta la confluencia. Se recogieron los fibroblastos usando disolución de 0,25% de tripsina/0,05% de EDTA y se subcultivaron en placas de 2 pocillos con una densidad de 200.000 células/pocillo con el mismo medio durante 24 horas, tiempo en el que las células tratadas se incubaron con microesferas de tipo I, II o III. Las células control se incubaron sólo con medio.

Se midió la síntesis de colágeno tal como sigue. Los fibroblastos cultivados se incubaron previamente en DMEM complementado con el 0,5% de suero bovino fetal dializado durante 24 horas. Las células se marcaron con disolución de 3 \muCi 2,3^{-3}H-prolina o 3,4^{-3}H-prolina que contenía fumarato de \beta-aminopropionitrilo (BAPN) a una concentración final de 100 \muM, en presencia (figura 2A) o ausencia (figura 2B) de 10 \muM de ácido ascórbico como se indica. El ácido ascórbico promueve la síntesis de colágeno en los fibroblastos y es un factor de estimulación importante.

Tras 24 horas de incubación, la reacción se terminó y se extrajo el colágeno de cada pocillo mediante la adición de 30 \mul de ácido acético helado (0,5 M) que contenía pepsina (concentración final de 0,5 mg/ml), seguido de agitación suave a temperatura ambiente durante 4 horas. Tras la centrifugación, se descartó el residuo celular y se añadieron 80 \mul de disolución de colágeno en ácido acético 0,5 M en cada sobrenadante, con una concentración final de colágeno de aproximadamente 200 mg/ml. Se hizo precipitar el colágeno de cada sobrenadante mediante la adición de 0,4 ml de disolución de NaCl 5,2 M en ácido acético 0,5 M. Tras dejar reposar durante 2 horas, se separó el colágeno precipitado mediante centrifugación durante 15 minutos a 15000 rpm. Después, el sedimento se resuspendió en 750 \mul de tampón TRIS 10 mM, pH 7,4 que contenía NaCl 1 M. Se hizo precipitar el colágeno mediante la adición de 750 \mul de tampón TRIS, pH 7,4 que contenía NaCl 5 M. Tras 2 horas, se separó el colágeno mediante centrifugación, se volvió a disolver en ácido acético 0,5 M y se midió cada muestra en un contador de centelleo. Los resultados se muestran en las figuras 2A y 2B, facilitados como cpm por pocillo. Los datos representados son un promedio de muestras cuadruplicadas.

Tanto las microesferas de tipo I como de tipo II pudieron estimular la síntesis de colágeno por encima del nivel observado en los fibroblastos control (no tratados), tanto en presencia (figura 2A) como en ausencia (figura 2B) de ácido ascórbico. Las microesferas de tipo I tuvieron un mayor efecto en relación con las microesferas de tipo II en presencia de ácido ascórbico, aunque ambos tipos tuvieron un efecto similar en ausencia de ácido ascórbico. Las microesferas de tipo III no tuvieron efecto detectable sobre la síntesis de colágeno, ni en presencia ni en ausencia de ácido ascórbico.

Un hallazgo particularmente interesante es que tanto las microesferas de tipo I como de tipo II tuvieron un efecto, mientras que las microesferas de tipo III no lo tuvieron, lo que indica que el tamaño específico y el material de las microesferas es importante. Además, tanto las microesferas de tipo I como las de tipo II provocaron un efecto incluso en ausencia de ácido ascórbico, lo que indica que estos dos tipos de microesferas pueden potenciar la síntesis de colágeno incluso en ausencia de otros factores de estimulación. Por tanto, tanto las microesferas de tipo I como las de tipo II tienen claramente un efecto de estimulación sobre la síntesis de colágeno.

Ejemplo 4 Efecto de las microesferas sobre la forma de los mioblastos

Los cultivos celulares primarios de mioblastos de rata se prepararon como se describe en el ejemplo 1 anterior. Después se incubaron las células con (células tratadas) o sin (células control) microesferas de poliestireno durante 48 horas. Después se fijaron las células en glutaraldehído al 1% en solución salina tamponada con fosfato durante 1-4 días y se aclararon en PBS. Después se transfirieron las células a una disolución de ácido tánico al 1% y guanidina HCl al 1% (razón 1:1) en PBS durante 1 hora. Las muestras se fijaron posteriormente en OsO_{4} al 1% durante 1 hora y se deshidrataron en etanol graduado y freón 113 a temperatura ambiente. Las muestras se montaron después sobre portaobjetos, se recubrieron con oro y se examinaron en un microscopio electrónico de barrido JEOL T-300 a 2 kV.

Las figuras 3A-3C ilustran el efecto de las microesferas de la presente invención sobre la forma de los mioblastos. La célula en la figura 3A ha crecido sobre la microesfera, de modo que parte de la superficie celular es convexa más que plana. Las figuras 3B y 3C muestran células que extienden pseudopodos desde una parte de la célula sobre la que descansa la microesfera. El pseudopodo de la célula en la figura 3C es particularmente sobresaliente, lo que muestra que las microesferas influyen claramente en la forma de los mioblastos. Además, la formación y extensión de un pseudopodo requiere claramente cambios en la estructura citoesquelética, lo que demuestra que las microesferas también afectan al citoesqueleto de la célula. La formación de tales pseudopodos puede ser importante para la migración de las células en el área de la herida. Por tanto, la estimulación de tales pseudopodos por las microesferas indica su capacidad para estimular otra etapa importante en el proceso de cicatrización.

Ejemplo 5 Dispositivo y método de aplicación

La siguiente descripción es un dispositivo general y método para la aplicación de los agentes para la cicatrización. Los agentes, tales como microesferas, se aplican preferiblemente de manera repetida sobre la herida que debe tratarse. La frecuencia de aplicación, y la concentración aplicada, dependen de la gravedad de los síntomas y de la respuesta del sujeto al tratamiento. Las personas expertas en la técnica pueden determinar fácilmente las concentraciones óptimas, metodologías de dosificación y tasas de repetición. En el presente estudio, las microesferas se aplicaron a la herida que debe tratarse aproximadamente una vez al día, aunque son posibles naturalmente otras tasas de aplicación.

El método incluye la etapa de administrar los agentes tales como microesferas, en un vehículo farmacéuticamente aceptable en el que los agentes son sustancialmente insolubles, a un sujeto que debe tratarse. Ejemplos de vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen medios acuosos para una suspensión de agentes, medios no acuosos tales como pomadas, cremas y material que forma un aerosol, así como vendajes embebidos en, o que contienen de otro modo, medios con los agentes. Tal como se describe en más detalle más adelante y en el ejemplo 9, un vehículo farmacéuticamente aceptable particularmente preferido es un material que forma un gel, tal como metilcelulosa, de manera que las microesferas estén en forma de gel. Aunque la metilcelulosa es un ejemplo particularmente preferido de tal material que forma un gel, se entiende que también podrían utilizarse otros materiales que forman gel, especialmente si estos materiales que forman gel eran fisiológicamente inertes de manera sustancial. Los vendajes pueden ser oclusivos o no oclusivos. En cualquier caso, los agentes que están en un vehículo farmacéuticamente aceptable pueden describirse como una dispersión de agentes.

Los agentes se administran según una metodología de dosificación eficaz, preferiblemente hasta que se alcanza un criterio de valoración predefinido, tal como la ausencia de síntomas clínicos en el sujeto. El cierre de la herida que va a tratarse es un ejemplo de este tipo de criterio de valoración.

El dispositivo de la presente invención incluye una composición con uno o más agentes y un vehículo farmacéuticamente aceptable para los agentes y un recipiente para contener la composición. Preferiblemente, el recipiente es un recipiente estéril, sustancialmente sellado, tal como una bomba de dispersión de aerosoles y botes de pulverización. Alternativa y preferiblemente, el recipiente es un vendaje sustancialmente estéril. También alternativa y preferiblemente, el recipiente es un tubo que se puede apretar o una bomba de dispersión de gel. Un experto en la técnica podría seleccionar fácilmente recipientes adecuados para la composición, dependiendo de las propiedades del vehículo preferido.

Aunque las microesferas de la presente invención pueden incluso utilizarse sin un vehículo, simplemente colocándose directamente sobre la herida, la concentraciones extremadamente bajas de microesferas que son eficaces para la cicatrización son mucho más fáciles de aplicar cuando están presentes en un vehículo farmacéutico. Preferiblemente, las microesferas están presentes en una concentración en un intervalo de desde aproximadamente el 0,0001 por ciento al 1,5 por ciento, peso por peso. Más preferiblemente, las microesferas están presentes en una concentración en un intervalo de desde aproximadamente el 0,001 por ciento al 1,0 por ciento, peso por peso. Lo más preferiblemente, las microesferas están presentes en una concentración en un intervalo de desde aproximadamente el 0,01 por ciento al 0,2 por ciento, peso por peso. Tales concentraciones muy bajas son más eficaces de almacenar, transportar y especialmente aplicar, cuando están contenidas en un vehículo farmacéutico adecuado dentro de un recipiente adecua-
do.

Un ejemplo de combinación de vehículo y recipiente preferida es una suspensión acuosa u otro líquido contenido dentro de una bomba de dispersión de aerosol. Otro ejemplo de una combinación particularmente preferida de un vehículo y un recipiente es un material formador de gel, tal como metilcelulosa o cualquier otra sustancia formadora de gel adecuada, contenida dentro de un tubo que puede apretarse. La forma en gel se prefiere particularmente porque aumenta la retención de las microesferas dentro del área de la herida, permitiendo de esta forma una menor cantidad de la formulación en gel para ejercer el mismo efecto de cicatrización. Un efecto de este tipo se demuestra en el ejemplo 9 de más adelante. Por tanto, combinaciones preferidas particulares de un vehículo y un recipiente son claramente eficaces y convenientes para el transporte, almacenamiento y aplicación de las composiciones de la presente invención, especialmente a estas concentraciones preferidas muy bajas de microesferas.

Con independencia del dispositivo particular utilizado, los agentes, tales como microesferas, se aplican preferiblemente en un procedimiento de dos etapas. En primer lugar se aplican las microesferas en una dispersión a la herida, goteando, pulverizando, pintando, lavando o mediante cualquier otro método adecuado de aplicación tópica. Preferiblemente, se dejan pasar de 30 segundos a 2 minutos antes de la segunda etapa para permitir que las microesferas formen un contacto inicial con la herida. Preferiblemente, la segunda etapa incluye aplicar un vendaje oclusivo o no oclusivo, u otro recubrimiento adecuado embebido en la suspensión líquida que contiene las microesferas, a la herida. Esto reduce o elimina sustancialmente la absorción de las microesferas mediante el vendaje o recubrimiento. Este método se utilizó tanto en ratas como en seres humanos para la cicatrización, como se describe en los ejemplos de a continuación.

Las microesferas en la suspensión no experimentaron agregación, coalescencia, agrupamiento o endurecimiento irreversible. Aunque las microesferas sedimentaron algo con el tiempo, se resuspendieron fácilmente con agitación suave.

Ejemplo 6 Estimulación de la cicatrización en ratas por microesferas

Como se indicó anteriormente en los ejemplos 1-4, las microesferas de la presente invención estimulan varios procesos celulares in vitro que son importantes para la cicatrización. Sin embargo, los efectos in vitro e in vivo no siempre se correlacionan. Por tanto, se llevaron a cabo experimentos in vivo para valorar la capacidad de las microesferas de estimular la cicatrización en ratas. Tal como se muestra en las figuras 4A-4D, las microesferas de la presente invención estimulan claramente la cicatrización en las ratas. La figura 5 es un gráfico de la velocidad a la que disminuye el área de la herida, mostrando que las microesferas de la presente invención aumentan la velocidad a la que se produce tal disminución. Finalmente la tabla 2, muestra que las microesferas estimulan la regeneración muscular en ratas, El método experimental fue el siguiente.

Se anestesiaron ratas machos Wistar que pesaban entre 300 y 400 g, mediante nembutal (5 mg/kg de peso corporal). Se realizó una lesión de escisión en las zonas laterales del músculo tibial anterior de la siguiente manera. En primer lugar, se realizó una incisión longitudinal en la piel para exponer el músculo tibial anterior. Después, se realizó la escisión parcial de este músculo mediante un corte transversal de las fibras musculares, a lo largo de aproximadamente la mitad de la anchura del músculo. La pieza escindida se cortó entonces del músculo, dejando un espacio de aproximadamente 5 mm por 5 mm en el músculo. En todas las ratas, se extrajo la misma cantidad de tejido escindido (80 \pm 10 mg) desde precisamente la misma localización en el músculo. El área de la herida se cubrió entonces con 2 micras de microesferas de poliestireno en solución salina para las ratas tratadas y sólo solución salina para las ratas control. El área de la herida se midió entre los días 3 y 15 tras la lesión.

Las figuras 4A-4D muestran fotos de las áreas de herida preparadas tal como se ha descrito anteriormente. La figura 4A muestra la herida de la rata control inmediatamente después de la lesión, mientras que la figura 4B muestra la herida equivalente de la rata que va a tratarse. Las figuras 4C y 4D muestran las mismas ratas cinco días tras la lesión. La herida de la rata control se trató sólo con solución salina y todavía no ha cicatrizado completamente. Por el contrario, la herida de la rata tratada, tratada con microesferas, ha cicatrizado completamente. Por tanto, las microesferas de la presente invención estimulan claramente más rápido la cicatrización.

La figura 5 ilustra además la estimulación de la cicatrización por las microesferas de la presente invención. Las heridas de las ratas control cicatrizan, pero a una velocidad mucho más lenta que las heridas de las ratas tratadas. Por tanto, las microesferas aumentan claramente la velocidad a la que disminuye el área de la herida y cicatriza la herida.

Se prepararon portaobjetos para análisis histológico realizando una punción para biopsia del área de la herida. Se sacrificaron las ratas en los días 4, 5, 6, 7, 8, 9, 13 ó 14 tras la lesión y se realizaron biopsias para examen histológico. Se contó el número de células miogénicas especializadas en las fibras musculares nuevamente formadas o reparadas mediante determinación del número de núcleos "nuevos", que representan las células miogénicas activadas. Los núcleos de estas células son grandes, núcleos basófilos con cromatina dispersa y pueden diferenciarse fácilmente de los núcleos de los mioblastos existentes. Los resultados se facilitan en la tabla 2.

2

Tal como se muestra en la tabla 2, las microesferas de la presente invención estimulan claramente la regeneración muscular, medida como el número de núcleos "nuevos" o incorporados en las fibras musculares. El hecho de que las mediciones se hicieran en muestras histológicas tomadas de ratas tratadas in vivo también indica que las microesferas estimulan la regeneración muscular in vivo, así como in vitro.

Finalmente, la figura 6 compara el efecto de las microesferas de la presente invención sobre la cicatrización con medios de cultivo tisular y solución salina en ratas. Las heridas se indujeron en ratas tal como se describió anteriormente y se trataron las ratas con solución salina sólo (figura 6A, \aleph), medios de cultivo tisular sólo (figura 6B, \aleph), solución salina más microesferas (figura 6A, \Im) o medios de cultivo tisular más microesferas (figura 6B, \Im). Entonces, se fotografiaron las ratas 4 días después de producirse la herida. Como puede observarse en las figuras 6A y 6B, las microesferas pudieron inducir una velocidad mucho mayor de cicatrización con independencia de si el vehículo era solución salina o medios de cultivo tisular. Por tanto, el medio de cultivo tisular no fue responsable de ningún modo del efecto de las microesferas de la presente invención sobre la cicatrización.

Ejemplo 7 Estudios de toxicidad de las microesferas

No se observó ningún efecto tóxico de una preparación que contenía microesferas. El examen preliminar de las ratas tratadas a los 65 y 180 días después de la lesión mostró que ninguno de los siguientes órganos presentaba signos de cambios patológicos: corazón, hígado, pulmones, riñones, vasos sanguíneos, estómago, ganglios linfáticos y cerebro. Los experimentos con microesferas marcadas con fluorescencia mostraron que no se observaban signos de patología en las ratas tratadas. Además, las microesferas no penetraron en ninguno de los órganos anteriormente mencionados. No se detectó ningún crecimiento nuevo en los órganos anteriormente mencionados. Finalmente, las microesferas se dispersaron dentro del área de la herida pero no penetraron en las fibras musculares en regeneración.

Ejemplo 8 Efecto de las microesferas sobre la cicatrización en seres humanos

Los experimentos in vivo descritos en el ejemplo 6 anterior demuestran claramente que las microesferas de la presente invención pueden estimular la cicatrización y la regeneración muscular en ratas. Además, los resultados de los estudios de toxicidad en ratas descritos en el ejemplo 7 muestran que las microesferas son sustancialmente atóxicas. Por tanto, los estudios se llevaron a cabo para determinar el efecto de las microesferas de la presente invención sobre la cicatrización en seres humanos. Tal como se describe más adelante en detalle, los estudios de casos demostraron que las microesferas estimularon claramente la cicatrización en seres humanos. Preferiblemente, la concentración de microesferas en un intervalo de desde aproximadamente el 0,0001 por ciento hasta aproximadamente el 1,5 por ciento, peso por peso, se utilizó en una solución salina acuosa. Más preferiblemente, la concentración estaba en el intervalo de desde aproximadamente el 0,001 por ciento hasta aproximadamente el 1,0 por ciento peso por peso. Lo más preferiblemente, la concentración estaba en un intervalo de desde aproximadamente el 0,01 por ciento hasta aproximadamente el 0,2 por ciento peso por peso.

El primer estudio de casos fue el de una mujer de 66 años de edad con úlceras en la pierna izquierda que no cicatrizaban. La paciente también tenía celulitis de la pierna izquierda y venas varicosas en ambas piernas. Las úlceras en la zona interna del muslo de la paciente se trataron con Milton al 2% que es una sal de cloro corrosiva en agua. Las úlceras de la zona externa del muslo de la paciente se trataron con microesferas de la presente invención de 4,5 micras hechas de poliestireno en medio de cultivo tisular. La figura 7A muestra la herida control el día 0, mientras que la figura 7B muestra la herida control tras 4 meses de tratamiento. La figura 7C muestra la herida tratada el día 0, mientras que la figura 7D muestra la herida tratada tras 4 meses de tratamiento.

Tanto las heridas tratadas con las microesferas de la presente invención como aquellas tratadas con Milton mostraron signos de infección y otras dificultades de cicatrización durante los siguientes cuatro meses. Sin embargo, al final del periodo de tratamiento, las heridas tratadas con microesferas mostraron una mejora significativa. El tamaño de la herida había disminuido y las heridas estaban limpias, sin signos de infección. Por tanto, incluso para heridas que tenían dificultad de cicatrización, debido a complicaciones tales como infección, las microesferas de la presente invención mostraron una eficacia mayor para estimular la cicatrización que los tratamientos actualmente
disponibles.

Como una prueba adicional, la herida que había servido como control para la figura 7 anterior (figuras 7A y 7B) se trató con las mismas microesferas que las utilizadas para tratar la herida de las figuras 7C y 7D. Los resultados se muestran en las figuras 8A y 8B. La figura 8A muestra la herida el día 0 de tratamiento con microesferas, mientras que la figura 8B muestra la herida después de 21 días de tratamiento. La extensión de la herida había disminuido claramente, incluso después de un periodo de tiempo tan corto. Además, la herida era superficial y estaba limpia, y no producía más exudaciones.

El segundo estudio de casos fue el de una mujer de 52 años de edad que tenía una herida infectada durante dos años en la cara frontal del muslo izquierdo. La herida se trató con Milton al 1% durante una semana, se desbridó y después se trató con las microesferas de las figuras 7 y 8 durante 10 días. La figura 9A muestra la herida el día 0 de tratamiento, mientras que la figura 9B muestra la herida después de 10 días de tratamiento.

Después de 10 días, la herida mostró una mejora significativa. Había disminuido su extensión hasta un tamaño pequeño, estaba limpia y no producía más exudaciones, como puede observarse en la figura 9B. Aunque la herida no cerró completamente durante el periodo de tratamiento relativamente corto, sus efectos habían mejorado de manera significativa.

El tercer estudio de casos fue el de un hombre de 19 años que se había lesionado con un vertido químico en un accidente laboral en una empresa. Los productos químicos en cuestión, sulfuros, produjeron quemaduras graves y formación de vesículas en la cara derecha de su cuello y en la mano derecha. Durante los primeros dos días, todas las heridas se trataron con Silverol, un hidrogel con fuertes propiedades de absorción. Después, las heridas del antebrazo derecho se trataron con las microesferas de los estudios de casos 1 y 2, mientras que el resto de las heridas se trató con Silverol. Los resultados se muestran en las figuras 10A y 10B (herida control en el día 0 y día 5, respectivamente) y en las figuras 10C y 10D (herida tratada el día 0 y día 5, respectivamente).

Después de 5 días de tratamiento con microesferas, el estado de la herida tratada en el antebrazo había mejorado de manera significativa con respecto al resto de las heridas, que no se trataron con microesferas. La herida en el antebrazo había cicatrizado completamente después de 5 días de tratamiento con microesferas. Por el contrario, el resto de las heridas que se había tratado con Silverol no habían cicatrizado completamente. Por tanto, las microesferas estimularon claramente la cicatrización, lo que demuestra una mayor eficacia que los tratamiento actualmente disponibles.

El cuatro estudio de casos fue una mujer de 52 años de edad que tenía quemaduras de segundo grado de larga duración en las nalgas producidas por un baño caliente. Las heridas en la nalga izquierda se trataron con Silverol, mientras que las de la nalga derecha se trataron con microesferas de los estudios de casos anteriores. Los resultados se muestran sólo para las heridas tratadas con microesferas, en las figuras 11A (día 0) y 11B (día 7) de tratamiento.

Siete días después de empezar el tratamiento, las heridas de la nalga derecha que se habían tratado con microesferas, habían cicatrizado completamente con buen crecimiento epitelial. Por el contrario, las heridas de la nalga izquierda que se habían tratado con Silverol no había cicatrizado completamente y estaban cerrándose de manera relativamente lenta. Por tanto, las microesferas podían estimular la cicatrización a una velocidad mucho más rápida que los tratamientos convencionales.

El quinto estudio de casos fue una mujer de 28 años de edad que había sufrido quemaduras solares graves y extensas (datos no mostrados). Se trató con las microesferas de los estudios de casos anteriores. La paciente informó de una reducción importante del malestar y rápida cicatrización de la quemadura solar. Por tanto, las microesferas utilizadas en el método y dispositivo de la presente invención pueden tanto aliviar el malestar como estimular la cicatrización, aunque debería indicarse que el alivio del malestar es probablemente un efecto sumamente indirecto de las microesferas más que de la analgesia directa.

De hecho, cabe mencionar que puede suponerse que el informe de la paciente anterior incluye la reducción aparente de la sensación de malestar por la quemadura solar. Tal disminución del malestar probablemente no demuestra ninguna capacidad por parte de las microesferas para tener un efecto directo sobre la transmisión de los impulsos nerviosos o incluso de alterar directamente cualquier de los muchos factores que conducen a la sensación de malestar. En su lugar, este efecto es probablemente sumamente indirecto y se produce como resultado de la activación de los macrófagos que, a su vez, tiene efectos antiinflamatorios que conducen a la disminución de la sensación de malestar de la paciente.

El sexto estudio de casos fue un hombre de 64 años de edad con diabetes mellitus y una herida posquirúrgica en la pierna izquierda que no había cicatrizado con el tratamiento convencional en los ocho meses después de la cirugía. Se aplicaron las microesferas de los estudios de casos previos dos veces al día durante 17 días. Antes del tratamiento con microesferas, la herida posquirúrgica era de 7,5 cm por 8 cm y tenía 6 cm de profundidad, que es la profundidad en la que se localiza el hueso en esa zona de la pierna y estaba ensuciada con gangrena de los tejidos blandos y del hueso. Tras tres días de tratamiento con las microesferas, la gangrena había mejorado y se eliminó completamente tras ocho días (datos no mostrados). El tejido de granulación apareció en el músculo y hueso tras tres días de tratamiento. La regeneración ósea fue completa tras diez días de tratamiento. El día 14, la herida no estaba cerrada pero estaba cubierta con tejido de granulación con un color sano. La profundidad de la herida se redujo a casi 0,5 cm y el paciente afirmó estar dispuesto para cirugía de injerto de piel. El dolor también se alivió casi inmediatamente una vez empezado el tratamiento, pero como se ha indicado para el quinto estudio de casos, tal disminución del malestar fue probablemente un efecto sumamente indirecto, en vez de deberse a una acción directa de las microesferas. Por tanto, las microesferas pudieron estimular claramente, con éxito, la cicatrización después de que el tratamiento convencional fallara, incluso en presencia de factores de complicación tales como mala circulación asociada a la diabetes mellitus.

De estas seis historias de casos, junto con la amplia evidencia obtenida a partir de los estudios en ratas, se ha demostrado claramente que el uso de los agentes, tales como microesferas, según la presente invención tiene una eficacia mayor para la estimulación de la cicatrización y regeneración muscular que los tratamiento de la técnica anterior, disponibles actualmente. El método y dispositivo estimula, acelera y activa la cicatrización, así como disminuye la sensación de malestar en el sujeto.

Con respecto a la disminución del malestar, debería indicarse que los pacientes en los estudios de casos anteriores también informaron de reducción local del dolor y malestar procedentes de las heridas tratadas, particularmente el paciente que sufre quemadura solar, probablemente un efecto indirecto de las microesferas a través de su acción antiinflamatoria (también indirecta).

Finalmente, aunque no se muestren los datos, también se observó un efecto bacteriostático indirecto frente a las infecciones de las heridas por especies de Pseudomonas en seres humanos. El mecanismo tanto para la acción antiinflamatoria indirecta como el efecto bacteriostático indirecto no está claro, pero es probablemente un resultado de un efecto celular que implica la atracción y activación de macrófagos. Con independencia del mecanismo exacto, el uso de las microesferas según la presente invención representa claramente una mejora importante en el tratamiento de las heridas.

Además de estas aplicaciones probadas, se considera que las microesferas de la presente invención serían sumamente adecuadas para muchas aplicaciones cosméticas diferentes. Por ejemplo, además de la quemadura solar, las microesferas de la presente invención se consideran útiles para mejorar o incluso completar sustancialmente la cura del acné. Las microesferas de la presente invención también podrían incorporarse a cremas o geles de afeitado para el tratamiento de daños cutáneos menores, tales como pequeños arañazos o cortes asociados con el afeitado. Las microesferas de la presente invención también se consideran útiles para mejorar o incluso completar sustancialmente la cura de sustancialmente cualquier tipo de daño cutáneo.

Las microesferas de la presente invención se consideran adicionalmente útiles para la mejora o incluso la cura sustancialmente completa de hemorroides y de úlceras intestinales, tales como úlceras gástricas, úlceras asociadas con colitis ulcerosa y úlceras asociadas con Helicobacter pylori.

Ejemplo 9 Microesferas en forma de gel

La suspensión líquida de microesferas en una disolución acuosa, como se probó en el ejemplo 8 anterior, se convirtió en una forma de gel mediante la adición de metilcelulosa (Hoechst A.G., Alemania), una sustancia de otro modo inerte. La metilcelulosa se utilizó en una concentración en un intervalo de desde aproximadamente el 0,1 por ciento hasta aproximadamente el 5 por ciento peso por peso. Se encontró que las microesferas en formato de gel eran sumamente eficaces para la cicatrización, incluso cantidades menores de la formulación en gel podían ejercer todavía el mismo efecto cicatrizante porque la formulación en gel ayudaba a retener las microesferas en el área de la herida. El método experimental fue el siguiente.

En este estudio se utilizaron cobayas albinos derivados de Hartley que pesaban 300-400 gramos. Todas las intervenciones quirúrgicas se llevaron a cabo con anestesia general tras administración de ketamina HCl (150 mg/kg, Parke-Davis, EE.UU.). Tras la anestesia, se disecaron cuatro segmentos de piel en todo su espesor, bilateralmente simétricos, que medían 2 cm por 2 cm, del dorso de cada animal, dos de la región escapular y dos de la región lumbar.

Las microesferas en forma de gel se aplicaron en las heridas después de la cirugía. Se aplicaron entonces vendajes a las heridas. Los apósitos se cambiaron cada 48 horas con anestesia general, momento en el que todas las heridas se lavaron con solución salina caliente para eliminar cualquier residuo y cualquier resto de gel dentro de la herida. Se midieron entonces todas las heridas y se fotografiaron. Las microesferas en forma de gel se aplicaron entonces de nuevo a las heridas y se aplicaron vendajes limpios. La formulación en gel también se colocó en los vendajes. Las cuatro heridas de cada animal se trataron con la misma concentración de microesferas en forma de gel. La concentración de las microesferas fue del 0,0027 por ciento en peso en 2,5% de metilcelulosa. Las propias microesferas eran poliestireno y tenían 4,3 micras de diámetro. Como control, las heridas de algunos animales se trataron con la misma concentración de las mismas microesferas en una suspensión líquida, que también se colocó en los vendajes. En ambos casos, las microesferas en la suspensión líquida o en la formulación en gel se aplicaron en un volumen suficiente para rellenar sustancialmente el área de la herida, de modo que se aplicó una menor cantidad de formulación en gel que de suspensión líquida.

Las fotografías se analizaron con el programa de software ImageMeasure^{MR} (Pheonix Corp., Seattle, Washington, EE.UU.). Los resultados se pusieron en un gráfico como la variación de tiempo en el área fraccional de la herida, o la velocidad de cierre, frente a los controles, y se muestran en la figura 12. La variación de tiempo en el área fraccional de la herida se calculó como A_{0}-A_{i}/A_{0}, en la que A_{0} era el área de la herida el día 0 y A_{i} era el área de la herida el día i. Tanto las heridas tratadas con la suspensión líquida de microesferas como la tratada con la formulación en gel de microesferas cicatrizaron claramente a una velocidad sustancialmente similar, aunque se aplicó a las heridas un volumen menor de formulación en gel en comparación con la suspensión líquida.

Claims

1. Uso de una composición para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una herida de un sujeto, consistiendo la composición esencialmente en una microesfera que puede formar un contacto de múltiples puntos con una membrana celular, siendo dicha microesfera sustancialmente no biodegradable durante el periodo de tratamiento, estando hecha dicha microesfera de un material seleccionado del grupo que consiste en poliestireno, poliestireno derivatizado con un resto seleccionado del grupo que consiste en amino y carboxilo, polilisina, bromuro de poli-N-etil-4-vinilpiridinio, polimetilacrilato y silicona, y presentando dicho material de dicha microesfera un grupo superficial con una carga.

2. Uso según la reivindicación 1, en el que dicho grupo superficial se selecciona del grupo que consiste en sulfato, protamina, sulfato de protamina, sales de protamina y carboxilo.

3. Uso según la reivindicación 2, en el que dicho grupo superficial es carboxilo.

4. Uso según la reivindicación 1, en el que dicha microesfera tiene un diámetro en un intervalo de desde aproximadamente 0,01 \mum (micras) hasta aproximadamente 200 \mum (micras).

5. Uso según la reivindicación 4, en el que dicha microesfera tiene un diámetro en un intervalo de desde aproximadamente 0,1 \mum (micras) hasta aproximadamente 100 \mum (micras).

6. Uso según la reivindicación 1, en el que la composición comprende además un vehículo farmacéuticamente aceptable para dicha microesfera, siendo dicha microesfera sustancialmente insoluble en dicho vehículo.

7. Uso según la reivindicación 1, en el que la herida se selecciona del grupo que consiste en quemadura, traumatismo, posquirúrgico, posparto y crónico.

8. Uso según la reivindicación 1, en el que la herida se localiza en una parte del organismo del sujeto seleccionada del grupo que consiste en piel y músculo.