ES2241506T3 - Uso de ribozimas en la detección de agentes adventicios. - Google Patents

Uso de ribozimas en la detección de agentes adventicios. Download PDF

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Abstract

Un método para detectar la presencia de un agente adventicio en una composición que comprende un reovirus, que comprende: (a) proporcionar una población de células indicadoras que expresa una ribozima, donde la ribozima es capaz de segmentar específicamente el genoma del reovirus; (b) poner en contacto las células indicadoras con la composición en condiciones que permiten la segmentación del genoma del reovirus por la ribozima; (c) determinar el efecto de la composición sobre las células indicadoras, donde cualquier efecto patógeno indica la presencia de un agente adventicio en la composición además del reovirus.

Description

Uso de ribozimas en la detecci6n de agentes adventicios.
Esta invenci6n se refiere a un metodo para detectar agentes adventicios en una composici6n que incluye un reovirus.
5 WO 01/72964 describe una metodologia basada en PeR cuantitativa para detectar agentes adventicios dentro de muestras derivadas de materiales biol6gicos pero no menciona el uso de celulas que expresan ribozimas en el metodo.
En el campo de las ciencias medicas o biol6gicas, siempre ha existido la demanda para producir grandes cantidades de microorganismos tales como virus, bacterias, levaduras, otros hongos, parasitos y priones. Los microorganismos
10 resultantes pueden utilizarse para aislar y purificar proteinas microbianas, generar vacunas o proporcionar microorganismos infecciosos para estudios en laboratorio o estudios medicos. Recientemente, el nuevo desarrollo de la terapia con virus ha aumentado el requerimiento de una producci6n eficiente de virus infecciosos.
Los tratamientos con reovirus (Patente de EE.UU.No. 6,136,307) es un ejemplo de la terapia con virus.
Reovirus es un virus de ARN de doble cadena con un genoma segmentado. El receptor para el reovirus de mamifero
15 es una molecula ubicua, por lo tanto el reovirus es capaz de unirse a una multitud de celulas. Sin embargo, la mayoria de las celulas no son susceptibles a la infecci6n por reovirus y la uni6n de un reovirus a su receptor celular no produce replicaci6n viral ni producci6n de particulas de virus. Esta es probablemente la raz6n por la cual el reovirus no se conoce que este asociado con ninguna enfermedad determinada.
Se ha descubierto recientemente que las celulas transformadas con el oncogen ras se vuelven susceptibles a
20 infecci6n por reovirus, mientras que las no transformadas no lo son (Strong et al., 1998). Por ejemplo, cuando las celulas NIH 3T3 resistentes a reovirus se transforman con Ras o Sos activados, una proteina que activa Ras, la infecci6n con reovirus es mas intensa. De manera similar, los fibroblastos de rat6n que son resistentes a infecci6n por reovirus se vuelven susceptibles despues de la transfecci6n con el gen receptor de EGF o el oncogen ν-erbB, los cuales activan la ruta ras (Strong et al., 1993; Strong et al., 1996). De esta manera, el reovirus puede infectar
25 selectivamente y eliminar celulas con una ruta activada ras.
La activaci6n de la ruta RAS explica un gran porcentaje de los tumores de mamiferos. La activaci6n de mutaciones del gen ras por si mismo ocurren en aproximadamente 30% de todos los tumores humanos (Bos, 1989), principalmente en carcinomas pancreaticas (90%), colorrectal esporadico (50%) y pulmonar (40%), asi como leucemia mieloide (30%). La activaci6n de factores corriente arriba o corriente abajo en la ruta ras tambien se asocia 30 con tumores. Por ejemplo, la sobreexpresi6n de HER2/Neu/ErbB2 o del receptor del factor de crecimiento epidermico (EGF) es comun en el cancer de mama (25-30%), y la sobreexpresi6n del receptor de factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) o del receptor de EGF es frecuente en gliomas y glioblastomas (40-50%). Se saben que los receptores del EGF y del PDGF activan el ras durante la uni6n a su respectivo ligando, y ν-erbB codifica un receptor constitutivamente activado que carece de dominio extracelular. En consecuencia, la terapia con
35 reovirus, que es altamente selectiva para celulas tumorales asociadas a ras, y se puede usar para tratar una amplia variedad de tumores.
El reovirus se puede producir y purificar en preparaciones a granel (Publicaci6n de Solicitud de Patente numero 2002/0037576 A1). Para garantizar que la preparaci6n de reovirus no contenga los agentes adventicios que pueden provocar efectos secundarios no deseados, la preparaci6n se valida mediante el uso de una linea de celulas
40 susceptibles y anticuerpos anti-reovirus. Por lo tanto, la linea celular esta expuesta solamente a la preparaci6n de virus, o a la preparaci6n de virus que se ha neutralizado por un anticuerpo neutralizante especifico de reovirus. Si la preparaci6n de virus de anticuerpo neutralizado es aun patogena para la linea celular, la preparaci6n de virus debe contener un virus adventicio u otro organismo. La preparaci6n es purificada adicionalmente o se descarta.
Este protocolo de validaci6n es caro, ya que requiere grandes cantidades altos titulos de anticuerpos de alta afinidad
45 para neutralizar el virus. Este problema se agrava aun mas en la actualidad, ya que podemos producir muy eficientemente reovirus, y la necesidad de anticuerpos es aun mayor. Por lo tanto, es deseable un enfoque mas rentable.
La presente invenci6n proporciona un metodo de validaci6n de preparaciones microbianas utilizando una ribozima que es especifica para el microorganismo que se prepara. Por ejemplo, un plasmido que codifica una ribozima que 50 escinde especificamente el genoma de reovirus se puede introducir en las celulas que son susceptibles a la infecci6n de reovirus. Las celulas transfectadas, expresando la ribozima, son capaces de inactivar el reovirus y asi no seran infectadas por el virus. Las celulas que expresan la ribozima se someten a continuaci6n a una preparaci6n de reovirus, y cualquier efecto patogeno causado por la preparaci6n de reovirus indicara que en la preparaci6n de reovirus esta presente un agente adventicio. Por el contrario, la ausencia de cualquier efecto patogeno valida la
55 preparaci6n como libre de agentes adventicios detectables.
Este metodo tambien es aplicable a virus u otros microorganismos que tienen un genoma de ADN. Ya que el
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genoma de ADN debe transcribirse a ARN para una infecci6n satisfactoria por el microorganismo, una ribozima especifica para el transcripto de ARN inhibira la infecci6n asi como la replicaci6n del microorganismo. Una vez mas, si las celulas que expresan el ribozima muestran cualquier efecto patogeno debido a la preparaci6n microbiana, debe estar presente un agente adventicio en la preparaci6n. Del mismo modo, este metodo tambien se puede utilizar para validar preparaciones de los priones.
En consecuencia, la presente invenci6n proporciona un metodo para detectar la presencia de un agente adventicio en una composici6n que contiene un reovirus, que comprende:
(a)
proporcionar una poblaci6n de celulas indicadoras que expresa una ribozima, donde la ribozima es capaz de separar especificamente el genoma del reovirus.
(b)
contactar las celulas indicadoras con la composici6n en condiciones que permitan la escisi6n del genoma del reovirus por la ribozima; y
(c)
determinar el efecto de la composici6n en las celulas indicadoras, en donde cualquier efecto pat6geno indica la presencia de un agente adventicio en la composici6n ademas del reovirus.
Las celulas pueden expresar la ribozima transitoriamente o permanentemente. Preferentemente, las celulas contienen un gen que codifica una ribozima que se integra en el genoma de las celulas. La ribozima puede escindir cualquier parte del genoma del reovirus que es importante para la replicaci6n o infecci6n por reovirus. Por ejemplo, la ribozima puede escindir el segmento S1 del reovirus, tal como Rz-553 o Rz-984.
Este metodo se puede utilizar para detectar agentes adventicios en cualquier reovirus. El reovirus preferiblemente es un reovirus de mamifero, mas preferiblemente un reovirus de serotipo 3 y siendo el mas apropiado un reovirus de cepa Dearing. El reovirus puede ser un reovirus recombinante. El reovirus recombinante se puede generar por coinfecci6n de celulas de mamifero con diferentes subtipos de reovirus. El reovirus recombinante puede ser de origen natural o no natural. El reovirus recombinante puede ser de dos o mas cepas de reovirus, particularmente dos o mas cepas de reovirus seleccionadas del grupo que consta de las cepas Dearing, Abney, Jones y Lang. El reovirus recombinante puede tambien proceder de la redistribuci6n de reovirus de diferentes serotipos, tales como los seleccionados del grupo que consta de reovirus de serotipo 1, reovirus de serotipo 2 y reovirus de serotipo 3. El reovirus recombinante puede estar constituido por secuencias de codificaci6n de proteinas de capa variante de origen natural o secuencias de codificaci6n de proteinas de capa mutada.
La presente invenci6n puede aplicarse a composiciones de cualquier microorganismo, incluyendo cualquier virus. En consecuencia, la presente invenci6n proporciona un metodo para detectar la presencia de un agente adventicio en una composici6n que comprende un virus en donde el virus contiene un genoma de ARN o utiliza un transcripto de ARN para replicarse, que comprende:
(a)
proporcionar una poblaci6n de celulas indicadoras que expresa una ribozima, donde la ribozima es capaz de separar especificamente el genoma deARN o transcripto deARN del virus.
(b)
contactar las celulas indicadoras con la composici6n en condiciones que permitan la escisi6n del genoma deARN
o transcripto de ARN del virus por la ribozima; y
(c)
determinar el efecto de la composici6n en las celulas indicadoras, en donde cualquier efecto pat6geno indica la presencia de un agente adventicio en la composici6n ademas del virus.
Las celulas pueden expresar la ribozima transitoriamente o permanentemente. Preferentemente, las celulas comprenden un gen que codifica ribozima que se integra en el genoma de las celulas.
El virus puede ser un virus ADN o virus ARN. Preferentemente, el virus es un virus oncolitico, que es capaz de replicar selectivamente en las celulas neoplasicas. Los virus oncoliticos preferidos incluyen, pero no se limitan a, adenovirus modificado, HSV modificado, virus vacunavacuna modificado, virus orf parapoxvirus modificado, virus de la gripe modificado, virus que expresan p53, virus ONYX-015, virus Delta24 y virus de laestomatitis vesicular.
Otro aspecto de la presente invenci6n proporciona un metodo para validar una composici6n que incluya un microorganismo, que comprende:
(a)
proporcionar una poblaci6n de celulas indicadoras que expresa una ribozima, donde la ribozima es capaz de separar especificamente el genoma de ARN o transcripto de ARN del microorganismo para inhibir la replicaci6n o infecci6n del microorganismo;
(b)
contactar las celulas indicadoras con la composici6n en condiciones que permitan la escisi6n del genoma deARN
o transcripto de ARN del microorganismo por la ribozima; y
(c)
determinar el efecto de la composici6n en las celulas indicadoras, en donde la ausencia de cualquier efecto pat6geno valida la composici6n como libre de un agente adventicio detectable.
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El microorganismo preferentemente es un virus, idealmente un virus capaz de replicarse selectivamente en las celulas neoplasicas y especialmente un reovirus.
Una celula indicadora util para detectar un agente adventicio en una composici6n de microorganismos puede expresar permanentemente una ribozima que es capaz de escindir el genoma o transcripto de ARN del microorganismo. Preferiblemente, el gen que codifica la ribozima se integra en el genoma de la celula indicadora. El microorganismo preferentemente es un virus y especialmente un reovirus. La celula preferentemente es derivada de las celulas de rif6n embrionario humano 293 (celulas HEK 293).
La presente invenci6n proporciona un metodo para detectar agentes adventicios en una preparaci6n de un microorganismo utilizando una ribozima que es especifica para el microorganismo. Asi, una poblaci6n de celulas susceptibles al microorganismo es transfectada por un vector de expresi6n que codifica la ribozima y expuesta a la composici6n que incluye el microorganismo. La ribozima inhibe la nfecci6n y/o replicaci6n del microorganismo en las celulas. Por lo tanto, el microorganismo no causa ningun efecto pat6geno en las celulas. eomo resultado, cualquier signo de efecto pat6geno es indicativo de la presencia de un agente adventicio en la preparaci6n del microorganismo.
Antes de describir la invenci6n en mayor detalle, se definen a continuaci6n los terminos utilizados en esta solicitud, a menos que se indique lo contrario.
Definiciones
Un "agente adventicio" es aquel que no esta pensado para ser incluido en una composici6n. Preferiblemente, un agente adventicio es un agente infeccioso, es decir un agente capaz de infectar una celula.
"Infectar" una celula se refiere al acto de introducirse y replicarse en una celula.
Una "ribozima" es una molecula de ARN o derivado de ARN que es capaz de escindir cataliticamente otro ARN (el "RNA diana"). Las ribozimas de la presente invenci6n pueden tener las caracteristicas de ribozimas de origen natural. Por ejemplo, las ribozimas aisladas de Tetrahymena thermophila tiene un sitio activo de ocho pares de bases que hibridan un secuencia de ARN diana antes de la escisi6n del objetivo (vease, por ejemplo, Zaug y eech, 1986). Para esta reacci6n es necesaria guanosina libre o derivados de guanosina , y se agrega una guanosina al extremo 5' del ARN escindido. Las ribozimas de la presente invenci6n tambien pueden ser ribozimas sinteticas, como aquellas descritas en la Patente de EE.UU.N° 5,254,678. Estas ribozimas sinteticas tienen regiones de hibridaci6n y regiones cataliticas separadas; por lo tanto, se pueden disefar las regiones de hibridaci6n para reconocer cualquier secuencia diana. Ademas, el ARN escindo no se modifica por estas ribozimas.
Una "celula indicadora" es una celula que expresa una ribozima, la cual es capaz de escindir e inactivar un microorganismo a ser validado. La celula indicadora, cuando no expresa la ribozima, es susceptible a la infecci6n por el microorganismo.
Un "efecto pat6geno" es un efecto negativo sobre el crecimiento o mantenimiento de una celula, particularmente los efectos asociados con infecciones microbianas. Efectos pat6genos incluyen, pero no se limitan a efecto citofatico (ePE), ruptura de celula, inhibici6n del crecimiento, inhibici6n de la sintesis de proteinas y apoptosis.
"Efecto citopatico" es un cambio observable en la estructura celular. El efecto citopatico puede variar con los diferentes tipos de celulas y producir su muerte, y se puede determinar de acuerdo a los conocimientos de la tecnica. Por ejemplo, algunos de los efectos mas comunes de la infecci6n viral son cambios morfol6gicos como (a) redondeo de la celula y desprendimiento del sustrato; (b) lisis de celulas; (c) formaci6n de sincitio; y (d) formaci6n de cuerpos de inclusi6n. El fecto citopatico mostrado por las celulas infectadas por reovirus, por ejemplo, viene indicado por la hinchaz6n de las celulas, toman un aspetco granular y se acumulan en racimos y se lisan..
"Validaci6n" de una composici6n, como se usa en este documento, significa demostrar que la composici6n no contiene un agente adventicio que sea detectable por el metodo empleado.
"Reovirus" se refiere a cualquier virus clasificado en el genero reovirus, ya sea de origen natural, modificado o recombinante. Los reovirus son virus con un genoma de ARN de doble cadena, segmentado. Los viriones miden 6080 nm de diametro y poseen dos capsidecapsides concentricas, cada una de ellas es icosaedrica. El genoma consta de ARN de doble cadena en 10-12 segmentos diferentes con un tamafo total del genoma de 16-27 kbp. Los segmentos de ARN individuales varian en tamafo. Se han recuperado de muchas especies Tres tipos diferentes pero relacionados. Los tres tipos comparten un antigeno comun de fijaci6n de complemento.
El reovirus humano consta de tres serotipos: tipo 1 (cepa Lang o T1L), tipo 2 (cepa Jones, T2J) y tipo 3 (cepa Dearing o cepa Abney, T3D). Los tres serotipos son facilmente identificables en la base de neutralizaci6n y ensayos de inhibici6n de hemaglutinina (vease, por ejemplo, Fields, B. N. et al., 1996).
El reovirus puede ser de origen natural o modificado. El reovirus es de "origen natural" cuando se puede aislar de una fuente en la naturaleza y no se ha modificado intencionalmente por los seres humanos en el laboratorio. Por ejemplo, el reovirus puede ser de una "fuente de campo", es decir, de un ser humano que se ha infectado con el
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reovirus.
El reovirus se puede modificar pero ser aun capaz de infectar liticamente una celula de mamifero que tiene una ruta ras activa. El reovirus se puede pre-tratar de manera quimica o bioquimica (por ejemplo, por tratamiento con una proteasa, como quimotripsina o tripsina) antes de la administraci6n a las celulas proliferantes. El tratamiento previo con una proteasa elimina la capa exterior o capside del virus y puede aumentar la infectividad del virus. El reovirus se puede cubrir en un liposoma o micela (ehandron y Nibert, 1998). Por ejemplo, el viri6n se puede tratar con quimotripsina en presencia de micelas formando concentraciones de detergentes de sulfato de alquilo para generar una nueva particula sub-viri6n infecciosa.
El reovirus puede ser un reovirus recombinante proveniente de la recombinaci6n/redistribuci6n de segmentos gen6micos de dos o mas reovirus geneticamente distintos. La recombinaci6n/redistribuci6n de segmentos gen6micos de reovirus puede ocurrir en la naturaleza despues de la infecci6n de un organismo huesped con al menos dos reovirus geneticamente distintos. Los viriones recombinantes tambien se pueden generar en cultivos celulares, por ejemplo, por co-infecci6n de celulas huespedhuesped permisivas con reovirus geneticamente distintos (Nibert et al. 1995).
En consecuencia, la invenci6n contempla el reovirus recombinante resultante de redistribuci6n de segmentos gen6micos de dos o mas reovirus distintos geneticamente, incluyendo pero no limitados a, reovirus humanos, tales como tipo 1 (por ejemplo, cepa Lang), tipo 2 (por ejemplo, cepa Jones) y tipo 3 (por ejemplo, cepa Dearing o cepa Abney), reovirus de mamiferos no humanos, o reovirus aviares. La invenci6n ademas contempla reovirus recombinantes que resultan de la redistribuci6n de segmentos de genoma de dos o mas reovirus geneticamente distintos en donde al menos un virus parental es disefado geneticamente, comprende uno o mas segmentos gen6micos sintetizados quimicamente, se han tratado con mutagenos quimicos o fisicos, o es el resultado de un proceso de recombinaci6n. La invenci6n ademas contempla el reovirus recombinante que ha sufrido recombinaci6n en presencia de mutagenos quimicos, incluyendo pero no limitandose a sulfato de dimetilo y bromuro de etidio, o mutagenos fisicos, incluyendo pero no limitandose a la luz ultravioleta y otras formas de radiaci6n.
La invenci6n ademas contempla reovirus recombinantes que cosnsiten en eliminaciones o duplicaciones en uno o mas segmentos de genoma, que comprenden informaci6n genetica adicional como resultado de recombinaci6n con un genoma de celula huespedhuesped, o que comprenden genes sinteticos.
El reovirus se puede modificar por la incorporaci6n de proteinas de capa mutantes, tal como por ejemplo σ1, en la capside exterior del viri6n. Las proteinas se pueden mutar por sustituci6n, inserci6n o eliminaci6n. Sustituci6n incluye la inserci6n de diferentes aminoacidos en lugar de los aminoacidos nativos. Inserciones incluyen la inserci6n de residuos de aminoacido adicionales en la proteina en una o mas ubicaciones. Eliminaciones incluyen eliminaciones de uno o varios residuos de aminoacidos en la proteina. Dichas mutaciones se pueden generar por metodos conocidos en la tecnica. Por ejemplo, el locus de oligonucle6tido dirigido a mutagenesis del gen que codifica para una de las proteinas de capa puede resultar en la generaci6n de la proteina deseada de capa mutante. La expresi6n de la proteina mutada en celulas de mamifero infectadas de reovirus in vitro como celulas eOS1 dara como resultado la incorporaci6n de la proteina mutada en la particula de viri6n de reovirus (Turner y Duncan, 1992; Duncan et al., 1991; Mah et al., 1990).
El reovirus preferentemente es un reovirus modificado para reducir o eliminar una reacci6n inmune al reovirus. Dichos reovirus modificados se denominan "reovirus inmunoprotegidos". Tales modificaciones pueden incluir el encapsulado del reovirus en una liposoma, una micela u otro vehiculo para enmascarar al reovirus del sistema inmune de mamiferos. Por otra parte, la capsidecapside exterior de la particula del viri6n de reovirus se puede eliminar, ya que las proteinas presentes en la capside exterior son el factor determinante de las respuestas humorales y celulares del huesped.
Una "celula neoplasica", tambien conocida como una "celula con un trastorno proliferativo", hace referencia a una celula que prolifera en una tasa anormalmente alta. Un crecimiento nuevo que consta de celulas neoplasicas es una neoplasia, tambien conocido como un tumor. Una neoplasia es un crecimiento anormal de tejido, generalmente formando una masa diferenciada, que crece por proliferaci6n celular mas rapido que el crecimiento del tejido normal. Una neoplasia puede mostrar falta parcial o total de la organizaci6n estructural y coordinaci6n funcional con el tejido normal. eomo se utiliza en el presente documento, una neoplasia pretende abarcar tumores hematopoyeticosy tumores s6lidos.
Una neoplasia puede ser benigna (tumor benigno) o maligna (tumor maligno o cancer). Los tumores malignos se pueden clasificar en terminos generales en tres tipos principales. Neoplasias malignas que resultan de estructuras epiteliales y son denominados carcinomas, neoplasias malignas que proceden de tejidos conectivos como musculo, cartilago, grasa o hueso, y se denominan sarcomas, y tumores malignos que afectan las estructuras hematopoyeticas (estructuras relativas a la formaci6n de ceulas de la sangre) incluyendo componentes del sistema inmunol6gico, y se denominan leucemias y linfomas. Otras neoplasias incluyen, pero no se limitan a, las neurofibromatosis.
"eelulas neoplasicas activadas con Ras" o "celulas neoplasicas mediadas por ras" se refiere a celulas que proliferan en una tasa anormalmente alta debido a, al menos en parte, activaci6n de la ruta ras. La ruta ras se puede activar 5
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por medio de mutaci6n estructural del gen ras, nivel elevado de la expresi6n genica de ras, elevada estabilidad del mensaje de gen ras, o cualquier mutaci6n u otro mecanismo que conduce a la activaci6n de ras o un factor o factores corrientes abajo o corriente arriba en la ruta ras, lo que aumenta la actividad de la ruta ras. Por ejemplo, la activaci6n del receptor de EGF, receptor de PDGF o sos resulta en la activaci6n de la ruta de ras. Las celulas neoplasicas mediadas por Ras incluyen, pero no se limitan a, las celulas de cancer mediadas por ras, que son celulas que se multiplican de forma maligna debido a la activaci6n de la ruta ras.
Un virus "oncolitico" es un virus capaz de infectar selectivamente y matar celulas neoplasicas. En particular, el virus oncolitico es capaz de replicarse en y lisar selectivamente celulas neoplasicas. Ejemplos de virus oncoliticos incluyen, pero no se limitan a, adenovirus modificado, HSV modificado, virus vacuna modificadovacuna, virus orf parapoxvirus modificado, virus de la gripe modificado, virus que expresa p53, el virus ONYX-015, virus Delta24, virus de la estomatitis vesicular, virus 1 del herpes simple mutante que es defectivo en hrR3, virus de la enfermedad de Newcastle, virus de la encefalitis, virus herpes zoster, virus de la hepatitis, virus de la gripe, virus de la varicela y el virus del sarampi6n.
El termino "adenovirus atenuado" o "adenovirus modificado" hace referencia a un adenovirus al que le falta el producto genico o productos que impiden la activaci6n de PKR, inhibido o mutado de forma que no se bloquea la activaci6n de PKR. Preferiblemente, no se transcribe el ARN de VAI. Tales adenovirus atenuados o modificados no son capaces de replicarse en celulas normales que no tienen una ruta ras activada, sin embargo, pueden ser capaces de infectar y replicarse en celulas que tienen una ruta ras activado.
El termino "HSV atenuado" o "HSV modificado" significa un virus del herpes simplex (HSV) que carece del producto
o productos genicos que impiden la activaci6n de PKR, inhibidos o mutados tal que la activaci6n de PKR no esta bloqueada. Preferentemente, no se transcribe el gen HSV γ134.5. Tal HSV atenuado o modificado no puede replicarse en celulas normales que no tienen una ruta ras activada, sin embargo, puede ser capaz de infectar y replicarse en celulas que tienen una ruta ras activada.
El virus Orf parapoxvirus es un poxvirus. Es un virus que provoca lesiones cutaneas agudas en diferentes especies de mamiferos, incluidos los seres humanos. Naturalmente, el virus orf parapoxvirus infecta ovejas, cabras y a los seres humanos a traves de la piel con heridas o lesionada, se replica en celulas epidermicas en regeneraci6n e induce lesiones pustulares que se convierten en costras (Haig et al., 1998). El termino " virus orf parapoxvirus" o " virus orf parapoxvirus modificado" significa un virus orf parapoxvirus que carece del producto genico o productos genicos que impiden la activaci6n de PKR, inhibido o mutado tal que no esta bloqueada la activaci6n de PKR. Preferentemente, no se transcribe el gen OV20.0L. Tal virus orf parapoxvirus atenuado o modificado no es capaz de replicarse en celulas normales que no tienen una ruta ras activada, sin embargo, puede ser capaz de infectar y replicar en celulas que tienen una ruta ras activada.
El termino "virus vacunavacuna atenuado" o "virus vacunavacuna modificado" significa un virus vacuna que carece del producto genico o productos genicos que impiden la activaci6n de PKR, inhibido o mutado tal que no esta bloqueada la activaci6n de PKR. Preferiblemente, no se transcribe el gen E3L y/o el gen K3L. Tal virus vacuna atenuado o modificado no puede replicarse en celulas normales que no tienen una ruta ras activada, sin embargo, puede ser capaz de infectar y replicarse en celulas que tienen una ruta ras activada.
El termino "virus de la gripe atenuado" o "virus de la gripe modificado" significa un virus de la gripe quecarece del producto genico o productos genicos que impiden la activaci6n de PKR, inhibido o mutado tal que no esta bloqueada la activaci6n de PKR. Preferiblemente, no se transcribe el gen NS1. Tal virus de influenza atenuado o modificado no puede ser capaz de replicarse en celulas normales que no tienen una ruta ras activada, sin embargo, puede ser capaz de infectar y replicarse en celulas que tienen una ruta ras activada.
Metodo
La presente invenci6n ofrece un metodo para detectar agentes adventicios en una composici6n que contenga microorganismos. Una modalidad del metodo se muestra en el ejemplo 1. Por lo tanto, para determinar si esta presente un agente adventicio en una preparaci6n de reovirus, se construye un plasmido que codifica una ribozima, Rz-553 (Shahi et al., 2001),. Rz-553 es una ribozima "martillo" que consiste en una regi6n catalitica flanqueada por dos secuencias de ocho nucle6tidos que hibrida al segmento S1 del genoma de virus. S1 codifica para la proteina σ1, que se une al receptor del reovirus en la celula. Por lo tanto, la escisi6n de S1 ARN conduce a reducci6n de infectividad de cualquier virus resultante. Tambien se construye un plasmido que codifica un mutante de Rz-553 en el cual se muta un nucle6tido unico en la regi6n catalitica (G a U). Se conoce que el mutante es completamente inactivo.
Los plasmidos se introducen en las celulas eOS-1, y se expone a las celulas transfectadas a una alicuota de la preparaci6n de reovirus que se prueba. Las celulas infectadas simuladas se utilizan como control. eomo se esperaba, las celulas que expresan la ribozima mutante presentan un amplia efecto citopatico (ePE). Sin embargo, las celulas que expresan Rz-553 tambien muestran una ePE moderada en comparaci6n con las celulas infectadas simuladas. Por lo tanto, la preparaci6n de reovirus no contiene un agente distinto a reovirus que causa el ePE en las celulas eOS-1.
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eualquier ribozima capaz de escindir la secuencia deARN diana de un microorganismo para inhibir la replicaci6n o infecci6n del microorganismo es util en la presente invenci6n.
La secuencia diana puede ser, por ejemplo, ARN de codificaci6n de proteinas estructurales (particularmente proteinas de la cobertura exterior), proteinas de la maquinaria de replicaci6n o proteinas importantes para entrada en la celula, como la proteina del receptor. Los metodos para la construcci6n de ribozimas especificas de secuencia son bien conocidos en la tecnica. Por ejemplo, la Patente de EE:UU. No. 5,254,678 describe las ribozimas cabeza de marti//o, que tienen una regi6n central catalitica flanqueada por dos regiones de hibridaci6n. Durante la hibridaci6n a la secuencia diana preseleccionada a traves de las regiones de hibridaci6n, la regi6n catalitica forma una estructura secundaria que facilita la escisi6n y escinde la secuencia diana. Aunque esta patente describe ribozimas en donde al menos una regi6n de hibridaci6n tiene un minimo de nueve nucle6tidos de hibridaci6n, en la presente invenci6n no se requiere tal longitud minima. En la presente invenci6n, cada regi6n de hibridaci6n puede contener seis, siete, ocho o mas nucle6tidos de hibridaci6n.
La Patente de EE.UU. No. 6,307,041 describe derivados de ribozimas cabeza de marti//o, incluyendo las formas circular, horquilla, circular/horquilla, lazo y horquilla-lazo. Estas ribozimas han aumentado la actividad especifica y requerimiento de cofactor diferente y tambien se pueden utilizar en la presente invenci6n. Otros ejemplos son la ribozima horqui//a como se describe en, por ejemplo, Patente de EE.UU. No. 5,631,359 y 5,631,115.
Todas estas ribozimas contienen al menos una regi6n de hibridaci6n y una regi6n catalitica. La regi6n de hibridaci6n esta disefada de acuerdo con la secuencia diana. La regi6n catalitica se puede derivar de, por ejemplo, una ribozima cabeza de martillo (Patente de EE.UU. No. 5,254,678), una ribozima de horquilla (Solicitud Europea No. 89 117 424), una ribozima de hepatitis delta (WO 91/04319 y WO 91/04324), una ribozima ARNasa P (Patente de EE.UU.No. 5,168,053), un grupo intr6n I (Patente de EE.UU.No.4,987, 071), o un intr6n de grupo II (Pyle, 1993).
Tambien se preve que puede combinarse en la presente invenci6n mas de una ribozima. Por ejemplo, se pueden combinar multiples ribozimas que reconocen diferentes regiones del mismo ARN. Alternativamente y preferentemente, se pueden utilizar conjuntamente ribozimas especificas para diferentes ARN del mismo microorganismo para aumentar la eficacia de la inactivaci6n del microorganismo. euando se utilizan multiples ribozimas, se pueden codificar en el mismo vector de expresi6n o codificar por separado.
La presente invenci6n se puede utilizar para detectar la presencia de agentes adventicios en cualquier preparaci6n microbiana. eabe sefalar que, si bien las ribozimas escinden s6lo el RNA, la aplicaci6n de la presente invenci6n no se limita a microorganismos con un genoma de ARN. MLos microorganismos con un genoma de ADN necesariamente necesitan replicarse a traves de un transcripto de ARN, y/o sintetizar proteinas a traves de la transcripci6n de ARN, como parte del proceso de infecci6n. Incluso los priones necesitan un transcripto de ARN para replicarse e infectar. Por lo tanto, la replicaci6n e infecci6n de cualquier microorganismo se pueden inhibir por una ribozima que escinde especificamente el transcripto/genoma de ARN microbiano.
El microorganismo de la presente invenci6n es preferentemente un virus y especialmente un virus oncolitico. Un virus oncolitico puede infectar y matar selectivamente a las celulas neoplasicas, por lo tanto es util en el tratamiento con virus. Ademas de reovirus, estos virus incluyen, pero no se limitan a, adenovirus modificado, HSV modificado, virus vacuna modificado, virus orf parapoxvirus modificado, virus de la gripe modificado, virus que expresa p53, el virus ONYX-015, virus Delta24, virus de la estomatitis vesicular, virus herpes simplex 1 mutante que es defectuoso en hrR3, virus de la enfermedad de Newcastle, virus de la encefalitis, virus del herpes zoster, virus de la hepatitis, virus de la gripe, virus varicela y virus del sarampi6n.
Los adenovirus, VHS, virus vacuna y orf virus parapoxvirus son virus que han desarrollado un mecanismo para superar la quinasa ARN de doble cadena (PKR). Normalmente, cuando el virus entra en una celula, la PKR se activa y bloquea la sintesis de proteinas, y el virus no puede replicarse en esta celula. Sin embargo, los adenovirus crean una gran cantidad de un ARN pequefo, ARN VA1. El ARN VA1 tiene amplias estructuras secundarias y se une a PKR en competencia con el ARN de doble cadena (ARNds) que activa normalmente PKR. Ya que se requiere una longitud minima deARNds para activar PKR, el ARN VA no activa la PKR. En su lugar, secuestra PKR en virtud de su gran cantidad. En consecuencia, no se bloquea la sintesis de proteinas y el adenovirus se puede replicar en la celula. Sin embargo, debe sefalarse que, aunque no se bloquea el mecanismo de sintesis de proteinas, la sintesis de proteinas de celula huesped inhibes inhibida por el virus para facilitar la sintesis de proteinas virales.
El virus vacuna codifica dos productos de genes, K3L y E3L, que sub-regulan la PKR con diferentes mecanismos. El producto del gen K3L tiene limitada homologia con la regi6n N-terminal de elF-2α, el sustrato natural de PKR y puede actuar como un pseudosustrato para PKR. El producto del gen E3L es una proteina de uni6n de ARNds y aparentemente funciona por el secuestro del activador ARNds.
Del mismo modo, el gen γ134.5 del virus del herpes simplex (HSV) codifica la proteina 34.5 de celulas infectadas por producto genico (IeP34.5) que pueden prevenir los efectos antivirales ejercidos por PKR. El virus orf parapoxvirus codifica el gen OV20.0L que participa en el bloqueo de la actividad de PKR. Por lo tanto, estos virus pueden infectar con exito celulas sin ser inhibidas por PKR.
En el adenovirus modificado, HSV modificado, virus modificado vacuna o virus orf parapoxvirus modificado, se ha
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mutado el mecanismo anti-PKR viral o es inactivado de otra forma. Por lo tanto, estos virus modificados no son capaces de replicarse en celulas normales que tienen una funci6n PKR normal. Las celulas neoplasicas activadas con Ras, sin embargo, no estan sujetas a inhibici6n de la sintesis de proteinas por PKR, porque ras inactiva la PKR. Estas celulas son por lo tanto susceptibles a la infecci6n por adenovirus modificado, HSV modificado, virus modificado vacuna u virus orf parapoxvirus modificado.
Los virus se pueden modificar o mutar de acuerdo con la relaci6n funci6n-estructura conocida de los inhibidores PKR virales. Por ejemplo, ya que la regi6n amino terminal de la proteina E3 del virus vacuna interactua con el dominio de la regi6n de carboxi-terminal de PKR, la eliminaci6n o mutaci6n puntual de este dominio impide la funci6n anti-PKR (ehang et al, 1992,1993, 1995; Sharp et al., 1998; Romano et al., 1998). El gen K3L del virus vacuna codifica pK3, un pseudosustrato de PKR. Existe una mutaci6n de perdida de funci6n en K3L. Al truncar o al colocar mutaciones puntuales dentro de la porci6n e-terminal de la proteina K3L, hom6logo a residuos 79 a 83 en eIF-2α, anulan la actividad inhibidora de PKR (Kawagishi-Kobayashi et al., 1997).
El HSV modificado incluye, pero se limita a, R3616 (ambas copias del gen γ134.5 se han eliminado), R4009 (dos codones de tope se han insertado en el gen γ134.5) y G207 (mutado en la ribonucle6tido reductasa y el gen γ134.5) (Andreansky et al., 1996). Estos virus modificados se han usado en el tratamiento de tumores cerebrales, y recientemente se ha demostrado que R3616 infecta preferentemente celulas activadas con ras (Farassati et al., 2001).
Asimismo, el virus delNS1 (Bergmann et al., 2001) es un virus de gripe A geneticamente disefado que puede replicar selectivamente en las celulas neoplasicas activadas con ras. La proteina NS1 del virus de la gripe es un factor de virulencia que supera la respuesta antiviral mediada por PKR por el hueped. El NS1 esta desactivado en el virus de delNS1, que no puede infectar las celulas normales, presumiblemente debido a la inhibici6n mediada por PKR, pero se replica correctamente en las celulas neoplasicas activadas con ras. Por lo tanto, tambien es util en la presente invenci6n un virus de la gripe modificado en donde NS1 se modifica o muta, tal como el virus delNS1,.
Otros virus oncoliticos incluyen los virus que matan selectivamente las celulas neoplasicas llevando un gen supresor de tumores. Por ejemplo, p53 es un supresor de tumores celulares que inhibe la proliferaci6n descontrolada de celulas normales. Sin embargo, aproximadamente la mitad de todos los tumores tienen un p53 funcionalmente deteriorado y proliferan en forma descontrolada. Por lo tanto, un virus que expresa el gen p53 tipo silvestre puede matar selectivamente las celulas neoplasicas que se convierten en neoplasicas debido a la inactivaci6n del producto del gen p53. Tal virus se ha construido y demuestra que induce apoptosis en celulas cancerosas que expresan p53 mutante (Blagosklonny et al., 1996).
Un enfoque similar involucra inhibidores virales de supresores tumorales. Por ejemplo, ciertos adenovirus, SV40 y el virus del papiloma humano incluyen proteinas que inactivan p53, permitiendo su propia replicaci6n (Nemunaitis, 1999). En el adenovirus serotipo 5, esta proteina es una proteina 55 Kd codificada por la regi6n de E1B. Si se elimina la regi6n E1B que codifica esta proteina 55 kd, como en el virus ONYX-015 (Bischoff et al., 1996; Heise et al., 2000; WO 94/18992), el inhibidor p53 55 kd ya no esta presente. eomo resultado, cuando ONYX-015 entra en una celula normal, p53 funciona para reprimir la proliferaci6n celular, asi como la replicaci6n viral, que se basa en el mecanismo proliferativo celular. Por lo tanto, ONYX-015 no replica en las celulas normales. Por otro lado, en las celulas neoplasicas con funci6n p53 interrumpida, ONYX-015 puede replicarse y eventualmente causar que la celula muera. En consecuencia, este virus puede utilizarse selectivamente para infectar y matar celulas neoplasicas defectivas en p53. Un tecnico con experiencia en la tecnica tambien puede mutar e interrumpir el gen inhibidor p53 en adenovirus 5 u otros virus, segun las tecnicas establecidas.
Otro ejemplo es el virus Delta24 que es un adenovirus mutante que lleva una eliminaci6n de 24 pares de base en la regi6n de E1A (Fueyo et al., 2000). Esta regi6n es responsable de uni6n al supresor de tumores celulares Rb e inhibe la funci6n Rb, permitiendo de este modo la maquinaria proliferativa celular, y por lo tanto que la replicaci6n del virus proceda de manera incontrolada. Delta24 tiene una delecci6n en la regi6n de uni6n de Rb y no se une a Rb. Por lo tanto, la replicaci6n del virus mutante se inhibe por la Rb de una celula normal. Sin embargo, si Rb es inactivado y la celula se convierte en neoplasica, ya no se inhibe Delta24. En cambio, el virus mutante se replica de forma eficiente y lisa la celula defectiva en Rb.
Otros virus oncoliticos incluyen los virus sensibles a interfer6n. El virus de estomatitis vesicular (VSV) mata selectivamente las celulas neoplasicas en presencia de interfer6n. Los interferones son factores circulantes que se unen los receptores de la superficie celular y que conducen por ultimo a una respuesta antiviral y una inducci6n de las sefales inhibidoras del crecimiento y/o sefales apopt6ticas en las celulas diana. Aunque los interferones te6ricamente se pueden utilizar para inhibir la proliferaci6n de celulas tumorales, este intento no ha sido muy exitoso debido a mutaciones tumorales especificas de componentes de la via del interfer6n.
Sin embargo, interrumpiendo la via del interfer6n para evitar la inhibici6n de crecimiento ejercida por el interfer6n, las celulas tumorales simultaneamente pueden comprometer su respuesta antiviral. De hecho, se ha demostrado que el VSV, un virus ARN encapsulado, de ARN inverso se replica rapidamente en y mata diversas lineas de celulas de tumores humanos en presencia de interfer6n, mientras que los cultivos de celulas primarias humanas normales al parecer estan protegidos por interfer6n. Una inyecci6n intratumoral de VSV tambien reduce la carga tumoral de
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ratones desnudos con xenoinjertos de melanoma humano subcutaneo (Stojdl et al., 2000).
Otros virus sensibles al interfer6n (WO 99/18799), es decir los virus que no replican en una celula normal en presencia de interferones, se pueden identificar mediante el desarrollo de una cultivo de celulas normales, poner en contacto el cultivo con el virus de interes en presencia de concentraciones variables de interferones, a continuaci6n determinar el porcentaje de muerte celular tras un periodo de incubaci6n. Preferiblemente, deben morir menos del 20% de celulas normales,e idealmente, menos del 10%.
Tambien es posible aprovechar el hecho de que algunas celulas neoplasicas expresan niveles altos de una enzima y construir un virus que dependa de esta enzima. Por ejemplo, la ribonucle6tido reductasa es abundante en metastasis hepaticas pero escasa en higado normal. Por lo tanto, un mutante del virus del herpes simple 1 (VHS-1) que sea defectuoso en la expresi6n de la ribonucle6tido reductasa, hrR3, se ha demostrado que se replica en las celulas de carcinoma de colon pero no en celulas del higado normales (Yoon et al., 2000).
Ademas de los virus discutidos anteriormente, se han asociado una variedad de otros virus con la eliminaci6n del tumor, aunque el mecanismo subyacente no siempre esta claro. El virus de la enfermedad de Newcastle (NDV) se replica preferentemente en celulas malignas y la cepa mas comunmente utilizada es 73-T (Reichard et al., 1992; Zorn et al., 1994; Bar Eli et al., 1996). Tambien se observa actividad antitumoral clinicas donde NDV reduce la carga tumoral tras la inoculaci6n intratumoral en una variedad de tumores, incluyendo cancer cervical, colorrectal, pancreas, gastrico, melanoma y renal (WO 94/25627; Nemunaitis, 1999).
Ademas, el virus de la encefalitis ha mostrado tener un efecto oncolitico en un tumor de sarcoma de rat6n, pero puede ser necesaria atenuaci6n para reducir su infectividad en las celulas normales. Se ha descrito regresi6n tumoral en pacientes con tumor infectados con el virus del herpes zoster, virus de la hepatitis, gripe, varicela o sarampi6n (para una revisi6n, consulte Nemunaitis, 1999). Estos virus son tambien virus oncoliticos candidatos.
Se contempla que para los virus oncoliticos modificados, en la que se modifica un acido nucleico para que se puedan replicar en las celulas del tumor, se puede disefar la ribozima para que escinda el ARN que corresponde al acido nucleico modificado. Se puede introducir la ribozima en las celulas tumorales susceptibles para preparar las celulas indicadoras. Ya que la ribozima escinde el ARN modificado, que es responsable de la infectividad en las celulas tumorales, no se producira ninguna infecci6n si no hay un agente adventicio en la preparaci6n de virus.
eelula indicadora
La celula indicadora puede prepararse a partir de una celula que sea susceptible a la infecci6n del microorganismo a validar. Se puede introducir un constructo que codifica la ribozima adecuada en la celula sensible por cualquier metodo conocido en la tecnica, tal como la precipitaci6n de fosfato de calcio, fusi6n de liposomas, lipofectina®, electroporaci6n e infecci6n viral.
Pueden ser utiles tanto la introducci6n transitoria como la estable del constructo en la presente invenci6n. Sin embargo, las celulas indicadoras preferentemente deberian expresar la ribozima de manera permanente. Para ello, se puede integrar en el genoma de la celula un vector de expresi6n que codifica la ribozima o introducirlo como un vector episomal (como un vector de virus del papiloma bovino). Normalmente, el vector de expresi6n contiene un marcador seleccionable, se seleccionan celulas que albergan los vectores de expresi6n mediante el marcador seleccionable y se mantienen bajo selecci6n. Son bien conocidos en la tecnica los metodos para la construcci6n, la transfecci6n y selecci6n de estos vectores, (vease, por ejemplo, Sambrook, 2001).
Los ejemplos siguientes se ofrecen para ilustrar esta invenci6n y no deben interpretarse en modo alguno como limitantes del alcance de la presente invenci6n.
Ejemplos
En los ejemplos siguientes, las abreviaturas siguientes tienen los siguientes significados. Las abreviaturas no definidas tienen sus significados generalmente aceptados.
°e = grado eelsius
hr = hora
min = minutos
μM = micromolar
mM = milimolar
M = molar
ml = mililitro
μl = microlitro 9
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mg = miligramo μg = microgramo FBS = suero bovino fetal PBS = salina amortiguada con fosfato DMEM = medio de Eagle modificado de Dulbecco α-MEM = medio de Eagle α-modificado β-ME = medio de Eagle β-modificado MOI = multiplicidad de infecci6n PFU = unidades de formaci6n de placa PKR = proteina quinasa activada con ARN de doble cadena EGF = factor de crecimiento epidermico PDGF = factor de crecimiento derivado de plaquetas ePE = efecto citopatico
Ejemplo�
Pruebas de una preparaci6n de reovirus
El reovirus se prepara y purifica segun la Solicitud de Patente No. 09/920,012. Brevemente, las celulas de rif6n embrionario humano 293 SF (293/SF) son cultivadas en matraces giratorios de 15 l y se infectan con reovirus en una multiplicidad de infecci6n de 0.5 cuando la densidad celular llega a 106/ml. El cultivo se incuba hasta que comienza la lisis celular, como se evidencia por el cambio de color de los medios de cultivo de rojo a naranja debido a la presencia de rojo de fenol en el medio, o por un recuento de celulas viables bajo el microscopio. En este punto, las celulas se recolectan por centrifugaci6n, se re-suspenden y separan por congelaci6n/descongelamiento. El virus se purifica luego por un gradiente de cloruro de cesio.
Las celulas eOS-1 se utilizan como una linea celular indicadora. Asi, las celulas eOS-1 crecen hasta 60% de confluencia en placas de 6 pozos y se transfectan con Rz-553 de codificaci6n de ADN o ADN control (mutante S1Rz-553) mediante el uso de Lipofectin (GIBeO/BRL) como se describe en Shahi et al. (2001). pSVLacZ (Promega) se co-transfecta en todos los experimentos para garantizar una eficacia de transfecci6n uniforme. 12 horas mas tarde, las celulas se lavan una vez con medio fresco y se infectan con una alicuota de la preparaci6n de reovirus descrito antes en un m.o.i. de 1 PFU/celula. Las celulas infectadas simuladas se tratan de la misma manera sin la preparaci6n de reovirus. 8 horas despues de la infecci6n, se observa si existe efecto citopatico (ePE) en las celulas.
Las celulas mutantes transfectadas Sl-Rz-553 muestran ePE extensa como se esperaba, ya que la ribozima mutante no inactiva el reovirus y la infecci6n de reovirus produce ePE en las celulas infectadas. Sin embargo, las celulas transfectadas Rz-553 tambien muestran ePE detectable en comparaci6n con las celulas infectadas simuladas. Ya que se sabe que Rz-553 inactiva el reovirus, estos resultados indican que esta preparaci6n de reovirus contiene un agente no-reovirus que causa efecto citopatico en celulas eOS-1.
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Claims (16)

  1. REIVINDICACIONES
    1.-Un metodo para detectar la presencia de un agente adventicio en una composici6n que incluya un reovirus, que comprende:
    (a)
    proporcionar una poblaci6n de celulas indicadoras que expresa una ribozima, donde la ribozima es capaz de escindir especificamente el genoma del reovirus.
    (b)
    contactar las celulas indicadoras con la composici6n en condiciones que permitan la escisi6n del genoma del reovirus por la ribozima; y
    (c)
    determinar el efecto de la composici6n en las celulas indicadoras, en donde cualquier efecto pat6geno indica la
    presencia de un agente adventicio en la composici6n ademas del reovirus. 2.-El metodo de conformidad con la reivindicaci6n 1, caracterizado porque las celulas indicadoras expresan la ribozima de un gen que se integra en el genoma de las celulas.
  2. 3.-El metodo de conformidad con la reivindicaci6n 1, caracterizado porque la ribozima es capaz de escindir especificamente el ARN s1 del reovirus. 4.-El metodo de conformidad con la reivindicaci6n 1, caracterizado porque la ribozima es Rz-553 o Rz-984. 5.-El metodo de conformidad con la reivindicaci6n 1, caracterizado porque el reovirus es un reovirus mamifero.
  3. 6.-El metodo de conformidad con la reivindicaci6n 1, caracterizado porque el reovirus es un reovirus humano. 7.-El metodo de conformidad con la reivindicaci6n 1, caracterizado porque el reovirus es un reovirus de cepa Dearing.
  4. 8.-El metodo de conformidad con la reivindicaci6n 1, caracterizado porque el reovirus es un reovirus recombinante.
  5. 9.-El metodo de conformidad con la reivindicaci6n 8, caracterizado porque el reovirus recombinante se genera por co-infecci6n de celulas de mamifero con diferentes subtipos de reovirus. 10.-El metodo de conformidad con la reivindicaci6n 8, caracterizado porque el reovirus recombinante es de origen
    natural.
  6. 11.-El metodo de conformidad con la reivindicaci6n 8, caracterizado porque el reovirus recombinante no es de origen natural. 12.-El metodo de conformidad con la reivindicaci6n 8, caracterizado porque el reovirus recombinante es de dos o
    mas cepas de reovirus.
  7. 13.-El metodo de conformidad con la reivindicaci6n 12, caracterizado porque las dos o mas cepas de reovirus se seleccionan del grupo que consta de la cepa Dearing, cepa Abney, cepa Jones y cepa Lang. 14.-El metodo de conformidad con la reivindicaci6n 8, caracterizado porque el reovirus recombinante resulta de la
    redistribuci6n de reovirus seleccionados del grupo que consiste en reovirus de serotipo 1, reovirus de serotipo 2 y
    reovirus de serotipo 3. 15.-El metodo de conformidad con la reivindicaci6n 8, caracterizado porque el reovirus recombinante comprende secuencias de codificaci6n de proteinas de capa variante de origen natural
  8. 16.-El metodo de conformidad con la reivindicaci6n 8, caracterizado porque el reovirus recombinante consta de
    secuencias de codificaci6n de proteinas de capa mutada. 17.-Un metodo para detectar la presencia de un agente adventicio en una composici6n que comprende un virus en donde el virus contiene un genoma de ARN o utiliza un transcripto de ARN para replicarse, que comprende:
    (a)
    proporcionar una poblaci6n de celulas indicadoras que expresa una ribozima, donde la ribozima es capaz de separar especificamente el genoma de ARN o transcripto de ARN del virus para inhibir la replicaci6n o infecci6n del virus;
    (b)
    contactar las celulas indicadoras con la composici6n en condiciones que permitan la escisi6n del genoma deARN
    o transcripto de ARN del virus por la ribozima; y
    (c)
    determinar el efecto de la composici6n en las celulas indicadoras, en donde cualquier efecto pat6geno indica la presencia de un agente adventicio en la composici6n ademas del virus.
    E03704136 21-10-2011
  9. 18.-El metodo de conformidad con la reivindicaci6n 17, caracterizado porque las celulas indicadoras expresan la ribozima de un gen que se integra en el genoma de las celulas.
  10. 19.-El metodo de conformidad con la reivindicaci6n 17, caracterizado porque el virus es un virus ADN.
  11. 20.-El metodo de conformidad con la reivindicaci6n 17, caracterizado porque el virus es capaz de infectar 5 selectivamente celulas neoplasicas.
  12. 21.-El metodo de conformidad con la reivindicaci6n 17, caracterizado porque el virus se selecciona del grupo que comprende adenovirus modificado, HSV modificado, virus vacuna modificado, virus orf parapoxvirus modificado, virus de la gripe modificado, virus que expresa p53, el virus ONYX-015, virus Delta24 y virus de la estomatitis vesicular.
    10 22.-Un metodo para validar una composici6n que incluya un microorganismo, que comprende:
    (a) proporcionar una poblaci6n de celulas indicadoras que expresa una ribozima, donde la ribozima es capaz de separar especificamente el genoma de ARN o transcripto de ARN del microorganismo para inhibir la replicaci6n o infecci6n del microorganismo;
    (b) contactar las celulas indicadoras con la composici6n en condiciones que permitan la escisi6n del genoma deARN 15 o transcripto de ARN del microorganismo por la ribozima; y
    (c) determinar el efecto de la composici6n en las celulas indicadoras, en donde la ausencia de cualquier efecto pat6geno valida la composici6n como libre de un agente adventicio detectable.
  13. 23.-El metodo de conformidad con la reivindicaci6n 13, caracterizado porque el microorganismo es un virus.
  14. 24.-El metodo de conformidad con la reivindicaci6n 13, caracterizado porque el microorganismo es un virus capaz 20 de infectar selectivamente celulas neoplasicas.
  15. 25.-El metodo de conformidad con la reivindicaci6n 13, caracterizado porque el microorganismo es un reovirus.
  16. 26.-El metodo de conformidad con la reivindicaci6n 13, caracterizado porque el microorganismo se selecciona del grupo que comprende adenovirus modificado, HSV modificado, virus vacuna modificado, virus orf parapoxvirus modificado, virus de la gripe modificado, virus que expresa p53, el virus ONYX-015, virus Delta24 y virus de lA
    25 estomatitis vesicular.
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