ES2241652T3

ES2241652T3 - Inmortalizacion condicional de celulas.

Info

Publication number: ES2241652T3
Application number: ES00960846T
Authority: ES
Inventors: Parmjit Jat
Original assignee: Ludwig Institute for Cancer Research Ltd; Reneuron Ltd; Ludwig Cancer Research
Current assignee: Ludwig Institute for Cancer Research Ltd; Reneuron Ltd; Ludwig Cancer Research
Priority date: 1999-09-17
Filing date: 2000-09-18
Publication date: 2005-11-01
Anticipated expiration: 2020-09-18
Also published as: CN1373804A; AU757816B2; EP1212420B1; ATE297987T1; IL148008A0; DE60020855D1; JP2003510046A; AU7301500A; DE60020855T2; US6399384B1; WO2001021790A1; EP1212420A1; CA2383253A1

Abstract

Célula de mamífero con la condición de que no sea una célula madre embriónica humana, que comprende un oncogén condicionalmente inducible y un polinucleótido exógeno que codifica la subunidad catalítica del complejo telomerasa.

Description

Inmortalización condicional de células.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a la inmortalización de células de mamífero para su aplicación terapéutica.

Antecedentes de la invención

Existe una conciencia y comprensión crecientes de la importancia de la terapia de trasplante para tratar los daños a los tejidos y órganos. Aunque el trasplante de órganos se aplica ampliamente, las terapias basadas en el trasplante de células individuales todavía se encuentran en etapas relativamente tempranas del desarrollo clínico.

Por ejemplo, se reconoce cada vez más que el trasplante de células adecuadas en un cerebro dañado puede mejorar o corregir cualquier déficit sensorial, motor, de comportamiento o psicológico provocados por el daño.

Para que las terapias basadas en células resulten útiles, debe ser posible obtener suficientes células para el trasplante. Un medio para asegurar esto es cultivar células no diferenciadas bajo condiciones que permitan la división y crecimiento repetidos. Una dificultad con la utilización de células no diferenciadas es que la división celular no regulada debe encontrarse inactivada antes o en el momento del trasplante en el paciente, con el fin de prevenir el crecimiento descontrolado en el sitio de trasplante.

Se han desarrollado muchas técnicas diferentes para proporcionar células adecuadas para el trasplante. Con respecto al trasplante neural, un enfoque ha sido mantener células fetales no diferenciadas bajo condiciones de cultivo que permitan que se produzca la división celular, y posteriormente inducir la diferenciación in vitro, previamente al trasplante.

Reynolds y Weiss, Science 255:1707 (1992), dan a conocer la utilización de factor de crecimiento epidérmico (EGF) para inducir la proliferación in vitro de células cerebrales adultas de ratón. Se pensaba que bajo condiciones adecuadas podía inducirse a las células a diferenciarse en astrocitos y neuronas.

La solicitud de patente internacional nº WO-A-94/16059 da a conocer una técnica para mantener in vitro un cultivo celular primario de neuronas mediante el cultivo de células en un medio libre de suero con por lo menos un factor trófico.

La solicitud de patente internacional nº WO-A-97/10329 da a conocer una técnica alternativa, utilizando una línea celular condicionalmente inmortalizada. Esta línea celular comprende un oncogén inmortalizante sensible a la temperatura que, bajo condiciones permisivas, mantiene las células madre neuroepiteliala es en el estado no diferenciado. En el momento del trasplante, el oncogén se encuentra inactivo debido a la temperatura más elevada del cuerpo humano (37ºC) y las células se diferencian en los tipos celulares requeridos para reparar el daño. La ventaja de utilizar el oncogén es que las células se mantienen en el estado no diferenciado hasta el trasplante, en cuyo momento las células se diferencian, en respuesta al daño específico, en el fenotipo de las células dañadas o perdidas. La patente US nº 5.688.692 también da a conocer células que expresan un antígeno T que no se une a ADN y que es sensible a la temperatura.

Sin embargo, se reconoce que, aunque las células humanas que expresan oncogenes pueden presentar una vida larga, todavía dejan de dividirse y finalmente experimentan crisis (muerte celular).

También se ha propuesto que las células humanas puedan inmortalizarse reconstituyendo la actividad de la telomerasa mediante la incorporación de una copia exógena de la subunidad catalítica de la telomerasa humana (Bodnar et al., Science 279:249-252, 1998). La telomerasa actúa manteniendo los telómeros, que se encuentran en los extremos de los cromosomas, y se cree que el acortamiento gradual de los telómeros durante la duplicación celular contribuye a la senescencia y que, por lo tanto, la reconstitución de la telomerasa inmortaliza las células. La telomerasa humana ya ha sido utilizada para inmortalizar muchos tipos celulares diferentes.

Counter et al., PNAS (USA) 95(25):4723-14728 (1998), dan a conocer también que la expresión ectópica de la subunidad catalítica de la telomerasa (hTERT) puede permitir que las células post-senescentes proliferen más allá de la crisis, hasta la inmortalidad celular. Las células estudiadas se transformaron con un oncogén que expresaba el antígeno T de SV40. Sin embargo, los autores concluyeron que la expresión de hTERT por sí sola podía ser suficiente para inmortalizar las células, y que la activación de hTERT podía constituir una etapa crítica en la progresión de los tumores. Por lo tanto, la enseñanza general de dicha publicación es que las células transformadas con hTERT serían inmortales. Lo anterior implica que las células serían inadecuadas para su utilización en la terapia de trasplantes.

Por lo tanto, aunque muchas de las técnicas que se han dado a conocer anteriormente pueden resultar útiles, todavía existe una necesidad de procedimientos para obtener células que conserven la inmortalidad previamente al trasplante, pero que la pierdan en el momento del trasplante.

Sumario de la invención

La presente invención se basa en el reconocimiento de que las células transducidas con un oncogén condicionalmente inducible y con por lo menos la subunidad catalítica del complejo telomerasa son inmortales bajo condiciones permisivas aunque pierden la inmortalidad bajo condiciones no permisivas.

De acuerdo con un aspecto de la presente invención, una célula de mamífero recombinante, o genéticamente manipulada, comprende un oncogén condicionalmente inducible o sensible a la temperatura, y un polinucleótido exógeno que codifica por lo menos la subunidad calítica del complejo telomerasa.

De acuerdo con un segundo aspecto de la invención, un constructo polinucleótido recombinante comprende un gen que codifica la subunidad catalítica del complejo telomerasa y un oncogén condicionalmente inducible o sensible a la temperatura.

De acuerdo con un tercer aspecto, un procedimiento para inmortalizar una célula de mamífero comprende incorporar, dentro de una célula de mamífero en proliferación, un oncogén condicionalmente inducible y un polinucleótido exógeno que codifica la subunidad catalítica del gen de la telomerasa.

De acuerdo con un cuarto aspecto, las células de la presente invención pueden utilizarse en terapia, en particular en la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de una enfermedad asociada con la pérdida o daño celular. Por ejemplo, las células madre neuroepiteliales pueden utilizarse para el tratamiento de los trastornos asociados con el daño cerebral, por ejemplo la enfermedad de Alzheimer.

Se ha descubierto que las células de acuerdo con la presente invención conservan un elevado nivel de estabilidad y a temperaturas no permisivas no son inmortales.

Lo anterior es un descubrimiento sorprendente e importante ya que sería previsible basándose en la técnica anterior que las células siguiesen siendo inmortales, debido a la reconstitución de la actividad de la telomerasa. Sin embargo, aparentemente, aunque el gen que codifica la telomerasa es constitutivo, la telomerasa no actúa conservando la inmortalidad. La conservación de la condicionalidad y de la estabilidad incrementada hace que las células de la presente invención sean adecuadas para cultivarse en serie con el fin de derivar una línea celular para el trasplante.

Descripción de los dibujos

Las siguientes figuras ilustran la invención.

La figura 1 es una ilustración esquemática de un constructo polinucleótido que contiene hTERT y el oncogén sensible a la temperatura que codifica el antígeno T grande de SV40; y

La figura 2 es una ilustración esquemática de un constructo alternativo con el hTERT y el oncogén en un orden diferente del de la figura 1.

Descripción de la invención

La presente invención da a conocer procedimientos para la preparación de células que son adecuadas para la terapia de trasplantes y que son inmortales hasta el momento del trasplante.

Las células requieren la presencia de un oncogén condicionalmente inducible. El término "condicionalmente inducible" se utiliza en la presente memoria para referirse a los oncogenes, la expresión de los cuales puede regularse bajo determinadas condiciones. El oncogén se expresará al aplicar las denominadas condiciones permisivas. Por ejemplo, algunos oncogenes son sensibles a la temperatura y únicamente se expresan cuando la temperatura de su ambiente es inferior a determinado valor. En una realización de la invención, el oncogén utilizado es un mutante del gen del antígeno T grande de SV-40 (U19tsA58), que no se une a ADN y que es sensible a la temperatura. También son conocidas alternativas adecuadas, entre ellas el oncogén del antígeno T del polioma.

Las células también requieren un polinucleótido exógeno que codifique por lo menos la subunidad catalítica del complejo telomerasa. El término "exógeno" se utiliza en el presente documento en su contexto normal para referirse al polinucleótido introducido en la célula y distinguirlo de los polinucleótidos endógenos naturales. La subunidad catalítica del complejo telomerasa es un enzima que actúa como una transcriptasa inversa y es conocida en la técnica. La subunidad humana se da a conocer en la patente nº GB-A-2317891.

El oncogén y el polinucleótido que codifica la telomerasa pueden estar comprendidos en un ADN recombinante o vector o constructo retrovirales para transducir/infectar las células. Los dos componentes pueden incorporarse en un vector o cada uno puede estar comprendido en un vector separado. Los vectores o constructos de la invención pueden comprender adicionalmente una región promotora adecuada para iniciar la transcripción del ADN, y un marcador seleccionable que puede utilizarse para identificar las células que han experimentado transducción/infección. La regulación de la expresión puede llevarse a cabo mediante procedimientos conocidos por los expertos en la materia. Por ejemplo, la regulación puede llevarse a cabo utilizando el promotor de la repetición terminal larga (LTR). Los promotores alternativos resultarán evidentes para el experto en la materia. Por ejemplo, la regulación puede llevarse a cabo utilizando el promotor del citomegalovirus (CMV). El promotor del CMV es un promotor muy fuerte, y puede preferirse cuando las células son células neurales, por ejemplo células madre neuroepiteliales.

Los procedimientos para introducir constructos adecuados en el interior de las células también son conocidos para los expertos en la materia.

Puede utilizarse cualquier célula de mamífero en la presente invención.

Por ejemplo, la célula puede ser una célula endotelial, y puede utilizarse para la revascularización de una pierna, del corazón y de otros órganos. Preferentemente, la célula es una célula somática humana, por ejemplo una célula madre epitelial humana, que es capaz de diferenciarse en un tipo celular específico. Una célula particularmente preferida es una célula madre neuroepitelial humana, que puede utilizarse en el trasplante neural para reparar pérdidas o daños celulares y para corregir déficits de comportamiento o psicológicos. Alternativamente, la célula puede ser una célula diferenciada, por ejemplo las células \beta de los islotes de Langerhans. Las células adicionales pueden incluir, pero sin limitación, las obtenibles de las glándulas endocrinas, células retinianas, células cocleares, células hepáticas, osteoblastos y osteoclastos, mioblastos y queratinocitos.

Preferentemente, el oncogén y la telomerasa se incorporan en la célula durante la etapa temprana del cultivo, habitualmente dentro de las primeras 10 divisiones celulares. El orden de incorporación del oncogén y la telomerasa no es crítico para el éxito del procedimiento, aunque se prefiere que la telomerasa se introduzca en primer lugar. Lo anterior se debe a que se ha descubierto, sorprendentemente, que la introducción de la telomerasa en primer lugar proporciona una mayor seguridad de obtener una línea celular diploide.

Las células transducidas o infectadas pueden cultivarse bajo condiciones conocidas por los expertos en la materia. Es preferible que las células se cultiven bajo condiciones no restrictivas. Un experto en la materia apreciará cuáles son las condiciones adecuadas para cada tipo celular particular, basándose en las técnicas de cultivo convencionales.

A continuación, se describe la invención adicionalmente en los Ejemplos siguientes, con referencia a los dibujos. Los Ejemplos muestran que, mediante la transducción de células humanas adecuadas con un oncogén sensible a la temperatura y con la subunidad catalítica del complejo telomerasa, resulta posible conservar la estabilidad a medida que los cultivos celulares se cultivan en un medio adecuado.

Ejemplo 1 1. Aislamiento de fibroblastos interlobulares mamarios (HMF) y de células endoteliales microvasculares mamarias (MMVE)

Los cultivos de fibroblastos interlobulares mamarios y de células endoteliales microvasculares mamarias se prepararon a partir de tejido mamario normal, obtenido con el consentimiento de los pacientes sometidos a cirugía estética (mamoplastia de reducción). Los cultivos de fibroblastos interlobulares se prepararon tal como se describe en Atherton et al., J. Cell Sci. 107:2931-2939, y se mantuvieron en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con suero de feto bovino al 10% y antibióticos (penicilina/estreptomicina). Las células endoteliales procedentes de microvasos se aislaron mediante clasificación inmunomagnética de cultivos primarios, utilizando el anticuerpo monoclonal de ratón QBEND-40 contra la trombomodulina, esencialmente tal como describen Drake y Lock, Human Reprod. 6:1156-1159 (1992). Los cultivos endoteliales se establecieron y se mantuvieron en medio EGM-2 (Biowhittaker).

2. Cultivo in vitro de células hasta la senescencia

Como control, se cultivaron preparaciones de células para determinar el punto de senescencia. Las células se descubrió que presentaban una vida en cultivo comprendida entre 10 y 16 duplicaciones de la población al cultivarlas en EGM-2. Aparte de una acumulación de partículas granulares en el citoplasma, las células senescentes se parecían a sus contrapartidas de cultivos tempranos, con la única diferencia de la completa ausencia de mitosis.

3. Transducción de tsA58-U19 y crecimiento extendido hasta la crisis

Las preparaciones de células de diferentes donantes se transdujeron, mientras todavía proliferaban entre las duplicaciones nº 6 y nº 9, con el mutante doble recombinante tsA58-U19 (Almazan y McKay, Brain Res., 579(s):234-245, 1992) del gen del antígeno T de SV40 en el vector pZIP, que contiene el gen neo-r. La transducción se llevó a cabo utilizando un sistema de empaquetamiento retroviral anfotrópico libre de virus ayudante (PA317, Clon 8), tal como describen Stamps et al., Int. J. Cancer 57(6):865-874, 1994. Se utilizó polibreno a 8 \mug/ml como adyuvante para mejorar la entrada de los virus.

Las frecuencias de transducción variaban entre el 10% y el 25% tras la selección con geneticina a 0,25 mg/ml. Tras la transferencia a la temperatura permisiva de tsA58 (33,5ºC), estos cultivos se subcultivaron adicionalmente durante 33 a 56 duplicaciones poblacionales a una fracción de división de 1:4. Durante este periodo, todas las células siguieron siendo estrictamente sensibles a la temperatura, con poco o ningún crecimiento a 36,5ºC o más. En todos los casos, sin embargo, el crecimiento finalmente cesó con la aparición de mitosis anormal y morfologías celulares anormales, incluyendo la heterogeneidad de tamaños y de los núcleos, indicativos de crisis. En total, una cantidad no inferior a 10^{8} células se cultivaron hasta la crisis celular, sin observarse ni un solo caso de inmortalización "espontánea". Por el contrario, las células epiteliales mamarias se inmortalizaron repetidamente a una frecuencia de aproximadamente 1 por cada 5 x 10^{6} células mantenidas hasta producirse la crisis.

4. Transducción de h-TERT e inmortalización posterior con conservación del crecimiento condicional

Las células de cultivos tempranos de un donante transducido con el sistema de antígeno T ts (MMVE-2) se transdujeron adicionalmente con la copia de ADNc de longitud completa de la subunidad catalítica del gen de la telomerasa humana en el vector pBabe (Morgenstern y Land, Nucleic Acids Research 18:3587-3596, 1990) junto con un gen de resistencia a la higromicina B, utilizando un sistema de empaquetamiento anfotrópico humano (TE-FLY). Se utilizó una serie de cuatro líneas de empaquetamiento clonadas, seleccionando previamente las líneas con títulos más elevados, a partir de la transferencia de la resistencia a la higromicina a una línea celular diana humana (células EJ de carcinoma de vejiga). Cada línea se utilizó para transducir, por duplicado, las células T ts MMVE-2 en presencia de 8 \mug/ml de polibreno. Se observó la transducción exitosa tras la selección con 25 \mug/ml de higromicina B.

Sorprendentemente, las células transducidas superaron en apariencia la senescencia, y continuaron proliferando a 33,5ºC, sin ninguna crisis o cambio claros en las tasas de proliferación, durante más de 40 semanas. Las células hasta el momento han experimentado >100 duplicaciones poblacionales a una tasa constante y aparentemente son funcionalmente inmortales.

Al probar su sensibilidad a la temperatura mediante cultivos réplica a 33,5ºC, 36,5ºC y 39,5ºC, las células ts T MMVE-2 transducidas con hTERT eran, sorprendentemente, tan sensibles como los cultivos tempranos de células con sólo tsT. Al contrario de lo que podría preverse, se produjo poco crecimiento a 36,5ºC y nada a 39,5ºC, es decir, las células eran condicionalmente inmortales. Todos los cultivos se llevaron a cabo con medio EGM-2, que contiene una diversidad de factores de crecimiento específicos de las células endoteliales, incluyendo b-FGF, VEGF, IGF-2 y heparina, así como FCS al 2%, evitando de esta manera someter a ensayo a las células bajo condiciones de crecimiento subóptimas o "restrictivas".

Con el fin de determinar el grado con el que la detención del crecimiento inducida por la temperatura era irreversible, los cultivos de fibroblastos se analizaron utilizando un ensayo clonogénico en el que se determinó la eficiencia de formación de colonias (CE) bajo condiciones óptimas (5% de oxígeno a 33,5ºC), tras diferentes periodos de detención del crecimiento a 39,5ºC. Se produjo una reducción sustancial en la CE en la mayoría de los cultivos, que era proporcional al tiempo transcurrido a la temperatura no permisiva. En uno de los cultivos HMF, por ejemplo, la CE tras 14 días a 39,5ºC había caído a <5% del valor del control, siendo la mayoría de las colonias, pequeñas y abortivas. Los resultados demuestran la progresiva irreversibilidad de las células transducidas y muestran que dicha irreversibilidad se debe a la inactivación térmica del antígeno T y no a un efecto no específico del choque térmico.

Las células también se sometieron a ensayo con el fin de establecer si experimentaban senescencia bioquímica al inactivarse el antígeno T, mediante la tinción de los cultivos para la \beta-galactosidasa ácida, activada en la senescencia. Tras 4 a 8 días a 39,5ºC, todos los cultivos de fibroblastos mostraban un número variable de células positivas (1 a 10%), mientras que no se detectaron células positivas en los cultivos correspondientes a 33,5ºC (<0,1%). En comparación, en un cultivo en crisis de fibroblastos HMF con únicamente antígeno T, el 53% de las células eran positivas. Lo anterior demuestra que las células inmortalizadas dependen del antígeno T para mantener su crecimiento, y que la inactivación del antígeno T provoca el cese irreversible del crecimiento celular y el inicio de la senescencia.

También se estableció el cariotipo de los cultivos celulares con el fin de determinar si el orden y ritmo de la transducción del gen retroviral afectaba al estado cromosómico de las células resultantes. Se observó un número modal diploide o aproximadamente diploide de cromosomas (46) tanto en las células MMVE como en las HMF; derivadas mediante la introducción de ambos genes durante la etapa temprana (es decir, dentro de las primeras 10 divisiones celulares), introduciendo hTERT en primer lugar. Al introducir ambos genes durante la etapa temprana y el oncogén en primer lugar, se demostró que las células presentaban un cariotipo bimodal con modos de reproducción aproximadamente diploides y aproximadamente tetraploides. Esto es un descubrimiento sorprendente y demuestra que las células diploides pueden prepararse más efectivamente al decidir que la introducción en la célula de la subunidad catalítica de la telomerasa se lleve a cabo en primer lugar.

En resumen, los resultados obtenidos muestran, sorprendentemente, que las células que comprenden el gen de longitud completa que codifica la subunidad catalítica de la telomerasa y el oncogén sensible a la temperatura, siguen siendo de crecimiento condicionado, es decir, las células no son inmortales a temperatura elevada.

Los resultados anteriores demuestran que la transducción separada con un oncogén sensible a la temperatura y una subunidad catalítica de la telomerasa, pueden mostrar características mejoradas en comparación con las células que únicamente comprenden el oncogén sensible a la temperatura.

Aunque la transducción separada muestra buenos resultados, podría resultar más fácil construir un vector adecuado que presentase ambos el oncogén y el gen que codifica la telomerasa.

Ejemplo 2

El presente Ejemplo demuestra la producción de vectores de expresión adecuados que coexpresan el antígeno T termolábil derivado del mutante que no se une a ADN de la región temprana de SV40 (U19tsA58); la subunidad catalítica de la hTERT del complejo telomerasa (ADNc) (Counter et al., PNAS 95(25):14723-14728, 1998) y un marcador seleccionable de acción dominante resistente a la neomicina fosfotransferasa (Neo), que codifica la resistencia a G418 (Clontech). El constructo final se ensambló en el vector de expresión retroviral pBabe (Morgenstern y Land, supra) basado en el virus de título elevado de la leucemia murina de Moloney (Mo MuLV). El ciclo vital del retrovirus se utilizó para convertir la región temprana de SV40 en virus que producen únicamente el antígeno T grande. Todos los constructos se ensamblaron en un huésped rec A (el derivado JS4-rec A de MC1061) mediante selección con ampicilina.

Se construyeron las dos versiones del vector:

Constructo 1

El presente constructo se ilustra en la figura 1. Se utilizó Mo MuLV LTR para controlar la hTERT, y se utilizó el promotor temprano de SV40 para controlar U19tsA58 y Neo. Se integró un sitio interno de entrada al ribosoma (IRES) entre los genes U19tsA58 y Neo (fusionado en el mismo marco de lectura del gen Neo) con el fin de inducir el reinicio de la traducción por parte de los ribosomas eucarióticos.

Constructo 2

El presente constructo se ilustra en la figura 2. Se utilizó Mo MuLV LTR para controlar U19tsA58 y el promotor temprano de SV40 se utilizó para controlar hTERT y Neo. Se insertó una secuencia IRES entre hTERT y Neo.

Estrategia de clonación

Cada vector se ensambló en tres secciones. Se utilizaron los vectores pBabe Neo-hTERT (hTERT extraído de pCI-Neo-hTERT, proporcionado por R.A. Weinberg, Whitehead Institute) y pBabe-Neo-U19tsA58 (en el que U19tsA58 se inserta en la orientación sentido con respecto a la transcripción del retrovirus) para preparar el extremo frontal de los constructos 1 y 2, respectivamente.

La clonación del IRES y su fusión en el mismo marco de lectura del gen Neo se llevó a cabo en el vector de clonación pPolyIII-I (obtenido de D. Kioussis, MRC, Mill Hill). pPolyIII-I es un vector útil para construir secuencias génicas debido a que contiene un polilínker grande, que comprende muchos sitios para enzimas de restricción que reconocen una secuencia de 6 nucleótidos. El tercer componente se clonó a partir del vector pBabe Puro (pBabe con un gen de resistencia a la puromicina).

Constructo 1

A. Clonación de IRES:Neo

La secuencia Neo se amplificó mediante PCR a partir del vector pLXSN (Clontech). Con el fin de mantener la longitud total del constructo en un mínimo, se utilizó únicamente la región codificante Neo (2066pb-2860pb de pLXSN). El IRES de 586 pb (región 5' de ARN no codificante del virus de la encefalomiocarditis (EMC)) se encuentra disponible en el vector pCITE-1 de Novogen. La región de inicio de EMC presenta un sitio de clonación Bal I en la posición 2918 y un sitio Nco I en 2925 de pCITE-1, que puede utilizarse para insertar la secuencia foránea en el mismo marco.

Se recomienda que las secuencias foráneas que carezcan de su propio AUG se fusionen en el mismo marco de lectura del AUG viral, en 2915-2917. Sin embargo, el corte con Bal I produce una G en el inicio del primer codón después del AUG de la secuencia foránea. Lo anterior resulta incompatible con la secuencia Neo, en la que la primera base después de AUG es A. Con el fin de solucionar este problema, el cebador 5' de Neo utilizado para amplificar la secuencia Neo en pLXSN, se diseñó para recrear la secuencia IRES entre las bases 2918 y 2929.

Cebador Neo directo (SEC ID nº 1)

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1

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Con el fin de insertar el extremo 3' de la secuencia Neo en pPolyIII-I, se diseñó el cebador 3' de PCR para que incluyese un sitio Sal I y un sitio Cla I (para la clonación a partir de pPolyIII-I en pBabe).

Cebador inverso Neo (SEC ID nº 2)

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2

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Por lo tanto, resultó posible extraer el IRES de pCITE-1 cortando con Eco RI y Bal I (los isoesquizómeros son Mls I, Msc I) y ligar la secuencia en los sitios Eco RI y Bal I de pPolyIII-I. A continuación, se amplificó la secuencia Neo del vector pLXSN utilizando los cebadores directos e inversos Neo anteriormente indicados y la región 3' del producto PCR cortado con Sal I previamente a la ligación en los sitios Bal I y Sal I de pPolyIII-I-IRES.

B. Inserción de U19tsA58

Se extrajo U19tsA58 de pZip-U19tsA58 (proporcionado por P. Jat del Ludwig Institute for Cancer Research) mediante una digestión con Bam HI y se insertó en el sitio Bam HI de pPolyIII-I-IRES:Neo en la orientación sentido con respecto a la transcripción del retrovirus.

C. Constructo final

El constructo final se creó mediante la ligación de las tres partes siguientes:

(i): U19tsA58-IRES-Neo extraído de pPolyIII-I-U19tsA58-IRES:Neo mediante digestión con Sfi I y Cla I;

(ii): la parte frontal del constructo fue proporcionada por el vector pBabe-Neo-hTERT mediante digestión con Sfi I y Not I. Se requería la sección izquierda; y

(iii): Fragmento que contenía pBS ori, adquirido del vector pBabe-Puro, mediante digestión con Cla I y Not I. Se requería el lado derecho del vector.

El constructo final es tal como se muestra en la figura 1.

Constructo 2

A. pPolyIII-I-hTERT-IRES:Neo

Para clonar el ADNc de hTERT e IRES:Neo en pPolyIII-I, se digirió pBabe Neo-hTERT inicialmente con Sal I, el cual corta en el extremo 3' de hTERT. Los sitios de clonación de hTERT son Eco RI (5') y Sal I (3'). Sin embargo, hTERT no puede ser clonado en el sitio Sal I de pPolyIII-I, debido a que éste es el sitio de clonación para el extremo 3' de IRES:Neo. Por lo tanto, en primer lugar se creó en la secuencia de la hTERT un extremo romo previamente a la extracción de la secuencia de ADNc de pBabe Neo-hTERT con Eco RI. pPolyIII-I-IRES:Neo se cortó con Eco RI, se creó un extremo romo en el mismo con Sal I para extraer IRES:Neo. Seguidamente, se clonaron hTERT e IRES:Neo en los sitios Eco RI y Sal I de pPolyIII-I uniendo los extremos romos entre 3' hTERT y 5' IRES:Neo.

El ensamblaje del constructo 2 implicó una ligación de las tres partes siguientes:

(i): hTERT-IRES:Neo extraído de pPolyIII-I-IRES:Neo en los sitios Sfi I y Cla I;

(ii): lado izquierdo del constructo 2, adquirido del vector pBabe-Neo-U19tsA58 mediante digestión con Sfi I y Not I; y

(iii): lado derecho del constructo 2, adquirido del vector pBabe-Puro mediante digestión con Cla I y Not I.

El constructo final es tal como se muestra en la figura 2.

Con respecto al diseño de los constructos, podría resultar más deseable regular la expresión de los componentes oncogén y hTERT a partir del promotor CMV. Lo anterior podría llevarse a cabo uniendo los componentes utilizando una secuencia IRES con inserción corriente abajo de un promotor CMV en un vector retroviral.

Los constructos pueden utilizarse para transducir células adecuadas con el fin de producir células condicionalmente inmortalizadas que presentan estabilidad mejorada durante su cultivo.

Las células recombinantes de la invención podrían resultar útiles en la terapia. Los procedimientos para la preparación de las formulaciones para la administración a un paciente resultarán evidentes para los expertos en la materia. Los excipientes, diluyentes, etc., adecuados nuevamente resultarán evidentes basados en la práctica actual en la preparación de terapias basadas en células. El número de células requerido para la administración variará dependiendo de la forma del tratamiento, de la gravedad de la enfermedad/daño y de la necesidad de aplicar múltiples dosis a lo largo de un periodo de tratamiento. Sin embargo, los expertos en la materia podrán determinar fácilmente cuál es el tratamiento apropiado basándose en las terapias existentes de trasplante de células.

<110> ReNeuron Limited

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Ludwig Institute for Cancer Research

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<120> INMORTALIZACIÓN CONDICIONAL DE CÉLULAS

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<130> REP06053WO

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<140> (todavía no conocido)

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<141> 2000-09-18

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<150> 99307405.3

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<151> 1999-09-17

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<160> 2

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<170> PatentIn Ver. 2.1

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<210> 1

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<211> 24

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido

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<400> 1

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ccacaaccat gattgaacaa gatg

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24

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<210> 2

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<211> 32

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial: oligonucleótido

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<400> 2

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ccgtcgacat cgattcagaa gaactcgtca ag

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32

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Claims

1. Célula de mamífero con la condición de que no sea una célula madre embriónica humana, que comprende un oncogén condicionalmente inducible y un polinucleótido exógeno que codifica la subunidad catalítica del complejo telomerasa.

2. Célula según la reivindicación 1, en la que el oncogén y el polinucleótido exógeno están comprendidos en un vector recombinante.

3. Célula según la reivindicación 1 ó 2, en la que el oncogén es sensible a la temperatura.

4. Célula según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que es una célula somática humana.

5. Célula según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que es una célula de fibroblasto estromal de mamífero o una célula microvascular de mamífero.

6. Célula según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que es una célula madre humana, con la condición de que no sea una célula madre embriónica humana.

7. Célula según la reivindicación 6, que es una célula madre neuroepitelial.

8.Célula según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el oncogén comprende el mutante sensible a la temperatura del gen del antígeno T de SV-40.

9. Célula según la reivindicación 8, en la que el mutante es tsA58-U19.

10. Polinucleótido recombinante que codifica la subunidad catalítica del complejo telomerasa y un oncogén condicionalmente inducible.

11. Polinucleótido según la reivindicación 10, que comprende además un gen marcador seleccionable y una región promotora.

12. Procedimiento para inmortalizar una célula de mamífero aislada con la condición de que no sea una célula madre embriónica humana, que comprende incorporar en el interior de una célula en proliferación, un oncogén condicionalmente inducible y un polinucleótido exógeno que codifica la subunidad catalítica del complejo telomerasa.

13. Procedimiento según la reivindicación 12, en el que el oncogén y el polinucleótido exógeno se incorporan en el interior de la célula en las primeras 10 divisiones celulares.

14. Procedimiento según la reivindicación 12 ó 13, caracterizado porque el polinucleótido exógeno se introduce en el interior de la célula antes que el oncogén.

15. Utilización de una célula según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de una enfermedad asociada con la pérdida o daño celulares.

16. Utilización según la reivindicación 15, en la que la célula es una célula madre neuroepitelial.