ES2242181T3

ES2242181T3 - Transcripcion genica y radiacion ionizante: procedimiento y composiciones.

Info

Publication number: ES2242181T3
Application number: ES93921410T
Authority: ES
Inventors: Ralph R. Weichselbaum; Dennis E. Hallahan; Vikas P. Sukhatme; Donald W. Kufe
Original assignee: University of Chicago
Current assignee: University of Chicago
Priority date: 1992-09-11
Filing date: 1993-09-08
Publication date: 2005-11-01
Anticipated expiration: 2013-09-08
Also published as: PT662137E; JPH08501448A; DE69333815D1; ATE295889T1; AU4850993A; EP0662137B8; US20010006954A1; DE69333815T2; US20060058258A1; WO1994006916A1; US6605712B1; AU686112B2; CA2144406C; EP0662137A1; US5770581A; US7041653B2; EP0662137B1; US6156736A; CA2144406A1

Abstract

EL PRESENTE INVENTO PROPORCIONA UNA MOLECULA QUE COMPRENDE UN PROMOTOR-INCREMENTADOR RESPONSABLE DE RADIACION OPERATIVAMENTE LIGADO A UNA REGION CODIFICADORA QUE CODIFICA AL MENOS UN POLIPEPTIDO. LA REGION CODIFICADORA PUEDE COMPRENDER UNA SECUENCIA SIMPLE DE CODIFICACION PARA UN POLIPEPTIDO O DOS O MAS SECUENCIAS CODIFICADORAS DE LIGAMIENTO DE DNA, ACTIVACION O DOMINIOS DE REPRESION DE UN FACTOR DE TRANSCRIPCION. TAMBIEN SE PROPORCIONAN PROCESOS PARA REGULAR LA EXPRESION DE POLIPEPTIDOS E INHIBIR EL CRECIMIENTO TUMORAL USANDO TALES MOLECULAS DE DNA.

Description

Transcripción génica y radiación ionizante: procedimientos y composiciones.

La presente solicitud es una continuación en parte de la solicitud de patente US número de serie 07/633.626, registrada el 20 de diciembre de 1990, cuya exposición se incorpora en la presente memoria como referencia.

La presente invención se refiere a procedimientos y composiciones que se relacionan con la regulación de la transcripción génica y de la expresión polipeptídica por la radiación ionizante.

Ciertos genes pueden jugar un papel en la respuesta celular al estrés o a los agentes que dañan al ADN. Por ejemplo, las metalotioneínas I y II, la colagenasa y el activador del plasminógeno, son inducidos después de la irradiación UV (Angel, et al., 1986; 1987; Fornace, et al., 1988a y b; Miskin, et al., 1981). Los transcritos de la B2 III polimerasa aumentan después del tratamiento con el choque térmico (Fornace, et al., 1986; 1989a). Además, aunque el nivel de la ADN polimerasa \beta ARNm aumenta después del tratamiento con agentes que dañan al ADN, este transcrito no cambia tras irradiación, sugiriendo que los agentes específicos que dañan al ADN, regulan de modo diferencial la expresión génica (Fornace, et al., 1989b). Después del tratamiento con UV, choque térmico, o carcinógenos químicos, los niveles del ARN del protooncogén c-fos se elevan (Andrews, et al., 1987; Hollander, et al., 1989a). A este respecto, las tasas relativas de la transcripción de fos durante el choque térmico no cambian, sugiriendo que este estrés aumentó el ARN de c-fos mediante mecanismos postranscripcionales (Hollander, et al., 1989b).

Las investigaciones de los efectos citotóxicos de la radiación ionizante se han centrado en la reparación del daño al ADN o en la modificación de la letalidad de la radiación por la hipoxia (Banura, et al., 1976; Moulder, et al., 1984). En los procariotas y en los eucariotas inferiores, se ha mostrado que la radiación ionizante induce la expresión de varios genes que reparan el ADN (Little, et al., 1982); sin embargo, la inducción de la expresión génica mediante la radiación ionizante no se ha descrito en las células de mamíferos. Agentes que dañan al ADN distintos a los rayos X, inducen la expresión de distintos genes en eucariotas superiores (Fornace, et al., 1988, 1989; Miskin et al., 1981).

Lo que se sabe respecto a los efectos de la radiación ionizante es que provoca daño en el ADN y la muerte celular. En muchos ejemplos, los efectos son proporcionales a la tasa de la dosis. Se ha postulado que la radiación ionizante induce múltiples efectos biológicos mediante la interacción directa con el ADN o a través de la formación de tipos de radicales libres que conducen a dañar el ADN (Hall, 1988). Estos efectos inducen mutaciones génicas, transformación maligna y muerte celular. Aunque se ha demostrado que la radiación ionizante induce la expresión de ciertos genes reparadores del ADN en algunas células procarióticas y eucarióticas inferiores, se sabe poco acerca de los efectos de la radiación ionizante en la regulación de la expresión génica en los mamíferos (Borek, 1985). Varios estudios han descrito cambios en el patrón de síntesis proteica observado después de la irradiación de las células de mamíferos. Por ejemplo, el tratamiento con radiaciones ionizantes de las células del melanoma maligno humano, se asocia con la inducción de varias proteínas no identificadas (Boothman et al, 1989). La síntesis de ciclina y polipéptidos corregulados se suprime por la radiación ionizante en las células REF52 de la rata, pero no en las progenies de células REF52 transformadas por el oncogén (Lambert y Borek, 1988). Otros estudios han demostrado que ciertos factores de crecimiento o citoquinas pueden estar implicados en el daño al ADN inducido por los rayos X. A este respecto, el factor de crecimiento derivado de las plaquetas se libera de las células endoteliales después de irradiación (Witte, et al., 1989).

La iniciación de la síntesis del ARNm constituye un punto crítico de control en la regulación de procesos celulares y depende de la unión de algunos factores transcripcionales de regulación a secuencias específicas del ADN. Sin embargo, se sabe poco acerca de la regulación del control transcripcional por la exposición a las radiaciones ionizantes en las células eucariotas. Los efectos de la radiación ionizante sobre la regulación postranscripcional de la expresión génica de los mamíferos, asimismo se desconocen.

Muchas patologías, situaciones y deficiencias metabólicas se beneficiarán de la destrucción, alteración o inactivación de las células afectadas o del reemplazo de un producto génico anormal o ausente. En ciertas situaciones, las células afectadas se concentran en un tejido reconocible. Los procedimientos terapéuticos habituales que intenten buscar y destruir estos tejidos o suministrarles productos génicos necesarios, muestran severas limitaciones. Para algunas enfermedades, por ejemplo, el cáncer, las radiaciones ionizantes son útiles como terapia. Los procedimientos para potenciar los efectos de la radiación, reduciendo de esta forma la dosis necesaria, beneficiarán mucho a los pacientes cancerosos. Por tanto, se han buscado procedimientos y composiciones para potenciar los efectos de la radiación, investigando los efectos de ésta en la expresión génica. Constituyó un objetivo proporcionar nuevos tipos de terapia utilizando la radiación, para explorar otros usos de ésta.

En un aspecto, la presente invención se refiere a una molécula sintética de ADN que comprende un promotor-potenciador que es sensible a la radiación, unido a una región codificante que codifica un polipéptido por lo menos, la cual región codificante está unida funcionalmente a una región de finalización de la transcripción.

El potenciador-promotor sensible a la radiación comprende un dominio CArC de un promotor Egr-1. En una forma de realización preferida, una región codificante codifica un único polipéptido. Un polipéptido preferido codificado por dicha región codificante posee la capacidad de inhibir el desarrollo de una célula y, particularmente, de una célula tumoral.

Un polipéptido preferido y que puede servir de ejemplo es una citoquina, un factor de supresión tumoral negativo dominante, un inhibidor angiogénico o un quimioatractor monocítico. Más particularmente, dicho polipéptido preferido es TNF-\alpha, interleuquina-4, JE, ricina, la toxina PF4 de Pseudomonas, p53, el producto del gen del retinoblastoma o el producto génico del tumor de Wilms.

Otro polipéptido preferido codificado por dicha región codificante posee actividad protectora radioactiva respecto al tejido normal. Dicho polipéptido preferido y que puede servir de ejemplo, que posee actividad radioprotectora, es la interleuquina-1; TNF; un factor de crecimiento tisular tal como un factor de crecimiento hematopoyético, un factor de crecimiento hepatocítico, un factor de crecimiento renal, un factor de crecimiento endotelial, o un factor de crecimiento muscular liso vascular; interleuquina-6; un "barrendero" de radicales libres, o un receptor del factor de crecimiento tisular.

Preferentemente, 1) un factor de crecimiento hematopoyético es la interleuquina-3 ó un factor estimulante colonial (CSF) tal como GM-CSF, G-CSF y M-CSF; 2) un factor de crecimiento endotelial es el factor de crecimiento fibroblástico (bFGF); 3) un factor de crecimiento muscular liso vascular es el factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF); y 4) un "barrendero" de radicales libres es la manganeso superóxido dismutasa (MnSOD).

Otro polipéptido preferido codificado aún por dicha región codificante presenta actividad anticoagulante, trombolítica o trombótica, tal como se ejemplifica por el activador del plasminógeno, una estreptoquinasa o un inhibidor del activador plasminogénico.

Otro polipéptido preferido codificado por dicha región codificante posee la capacidad para catalizar la conversión de un promedicamento a un medicamento. Dichos polipéptidos preferidos y que pueden tomarse como ejemplo, son la timidina quinasa del virus herpes simple y una citosina desaminasa.

Otro polipéptido preferido codificado por dicha región codificante es un antígeno superficial que es un producto génico de un complejo principal de histocompatibilidad. Dichos polipéptidos preferidos y que pueden tomarse como ejemplo son las proteínas H2 y las proteínas HLA.

En otro aspecto, una región codificante de una molécula de ADN de la presente invención, codifica la totalidad o una parte de más de un polipéptido. Preferentemente, estos polipéptidos son factores de transcripción. Según dicha forma de realización, una región codificante comprende:

(a): una primera secuencia codificante que codifica un dominio que se une al ADN de un primer factor de transcripción;

(b): una segunda secuencia codificante que codifica un dominio de activación o represión de un segundo factor de transcripción;

(c): una tercera secuencia codificante que codifica una señal de localización nuclear, en la cual la primera, segunda y tercera secuencias codificantes están unidas funcionalmente entre ellas en cualquier orden en un marco de lectura, con la condición de que sólo se requiere que la tercera secuencia codificante esté presente, si la primera o segunda secuencia codificante no codifica una señal de localización nuclear; y

(d): una región de finalización-transcripción que está unida funcionalmente a cualquiera de la primera, segunda o tercera secuencias codificantes, de modo que la región de finalización-transcripción se localiza en el extremo 3' para todas las primeras, segundas y terceras secuencias codificantes.

En una forma de realización preferida, una primera secuencia codificante codifica un dominio de unión al ADN del factor de transcripción GAL4, una segunda secuencia codificante codifica el dominio de activación de VP-16, el dominio de activación de NF-\kappaB, el dominio de represión del gen WT1 supresor del tumor de Wilms, o el dominio de represión de Egr-1.

Todavía otro aspecto, una molécula de ADN de la presente invención comprende una región de unión que es capaz de unir un dominio de unión al ADN de un factor de transcripción, cuya región de unión está unida funcionalmente a un promotor mínimo que está unido funcionalmente a una región codificante que codifica un polipéptido, cuya región codificante está unida funcionalmente a una región de finalización de la transcripción.

Preferentemente, el factor de transcripción es GAL4 y el polipéptido es el mismo que el que se ha mencionado anteriormente.

La presente invención considera también una composición farmacéutica que comprende una molécula de ADN de la presente invención y un excipiente fisiológicamente aceptable.

En otro aspecto, la presente invención considera una célula transformada o transfectada con una molécula de ADN de esta invención, o una célula transgénica derivada de dicha célula transformada o transfectada. Preferentemente, una célula transformada o transgénica de la presente invención es un leucocito, tal como un linfocito que infiltra un tumor o una célula T o una célula tumoral.

En otro aspecto, la presente invención considera un procedimiento para regular la expresión de un polipéptido, que comprende las etapas siguientes:

(a): unir funcionalmente un potenciador-promotor sensible a la radiación, según se define en las reivindicaciones, a una región codificante que codifica el polipéptido, la cual región codificante está unida funcionalmente a una región de finalización de la transcripción para formar una molécula de ADN; y

(b): exponer la molécula de ADN a una dosis efectiva de radiación ionizante que induzca una expresión efectiva.

En una forma de realización alternativa, se prepara más de una molécula de ADN. Preferentemente, estas moléculas de ADN comprenden:

(1): una primera molécula de ADN, que comprende un potenciador-promotor sensible a la radiación, según se define en las reivindicaciones, unido funcionalmente a una región codificante que comprende

(d): una región de finalización-transcripción que está unida funcionalmente a cualquiera de la primera, segunda o tercera secuencias codificantes, de modo que la región de finalización-transcripción se localice en el extremo 3' para todas las primeras, segundas y terceras secuencias codificantes; y

(2): una segunda molécula de ADN, que comprende una región de unión que es capaz de unir el dominio de unión al ADN del primer factor de transcripción, cuya región de unión está unida funcionalmente a un promotor mínimo que está unido funcionalmente a una región codificante que codifica un polipéptido, la cual región codificante está unida funcionalmente a una región de finalización de la transcripción.

Un potenciador-promotor sensible a la radiación, un factor de transcripción, un dominio de unión de un factor de transcripción y un dominio de activación o represión de un factor de transcripción, son preferentemente aquéllos que se mencionaron anteriormente. Asimismo un polipéptido codificado por una región codificante es preferentemente el mismo que el que se ha mencionado anteriormente.

Si la regulación es inhibida, una región codificante comprende preferentemente:

(a): una primera secuencia codificante que codifica un dominio de unión al ADN del factor de transcripción que actúa positivamente para un gen que codifica el polipéptido;

(b): una segunda región codificante que codifica un dominio de represión de un factor de transcripción;

(c): una tercera secuencia codificante que codifica una señal de localización nuclear, en la cual región codificante la primera, segunda y tercera secuencias codificantes están unidas funcionalmente entre ellas en cualquier orden en un marco de lectura, con la condición de que sólo se requiere que la tercera secuencia codificante esté presente, si la primera o segunda secuencia codificante no codifica una señal de localización nuclear; y

(d): una región de finalización-transcripción que está unida funcionalmente a cualquiera de la primera, segunda o tercera secuencias codificantes, de modo que la región de finalización-transcripción se localice en el extremo 3' para todas las primeras, segundas y terceras secuencias codificantes.

Preferentemente, la segunda secuencia codificante codifica el dominio de represión del gen WT1 que suprime el tumor de Wilms, o el dominio de represión de Egr-1.

Todavía en otro aspecto, la presente invención considera un procedimiento para inhibir el crecimiento de un tumor, que comprende las etapas siguientes:

(a): suministrar al tumor una cantidad terapéuticamente efectiva de una molécula de ADN, que comprende un potenciador-promotor sensible a la radiación, según se define en las reivindicaciones, unido funcionalmente a una región codificante que codifica un polipéptido que posee la capacidad de inhibir el crecimiento de una célula tumoral, la cual región codificante está unida funcionalmente a una región de finalización de la transcripción; y

(b): exponer el tumor a una dosis de radiación ionizante que induzca una expresión efectiva.

Un potenciador-promotor sensible a la radiación comprende un dominio CArG de un promotor Egr-1, y un polipéptido es una citoquina, un factor de supresión tumoral negativo dominante, o un inhibidor de la angiogénesis.

Suministrar es introducir preferentemente la molécula de ADN en el tumor. Si éste se encuentra en un individuo, suministrar es administrar la molécula de ADN al sistema circulatorio de este. En una forma de realización preferida, administrar comprende las etapas siguientes:

(a): proporcionar un excipiente que contenga la molécula de ADN; y

(b): administrar el excipiente al individuo.

Un excipiente consiste preferentemente en una célula transformada o transfectada con la molécula de ADN. Una célula transformada o transfectada preferida y que puede tomarse como ejemplo es un leucocito, tal como un linfocito que se infiltra en un tumor o una célula T o una célula tumoral procedente del tumor que está siendo tratado. Alternativamente, el excipiente es un virus o un anticuerpo que reacciona inmunológicamente con un antígeno del tumor.

En una forma de realización preferida, la exposición comprende las etapas siguientes:

(a): proporcionar un anticuerpo marcado radioactivamente que reacciona inmunológicamente con un antígeno del tumor; y

(b): suministrar al tumor una cantidad eficaz del anticuerpo marcado que induzca la expresión.

Alternativamente, un procedimiento para inhibir el crecimiento de un tumor, comprende las etapas siguientes:

(a): suministrar al tumor una cantidad terapéuticamente efectiva de

(1): una primera molécula de ADN, que comprende un potenciador-promotor sensible a la radiación, según se define en las reivindicaciones, unido funcionalmente a una región codificante que comprende:

(i): una primera secuencia codificante que codifica un dominio que se une al ADN de un primer factor de transcripción;

(ii): una segunda secuencia codificante que codifica un dominio de activación o represión de un segundo factor de transcripción;

(iii): una tercera secuencia codificante que codifica una señal de localización nuclear, en la cual la primera, segunda y tercera secuencias codificantes están unidas funcionalmente entre ellas en cualquier orden en un marco de lectura, con la condición de que sólo se requiere que la tercera secuencia codificante esté presente, si la primera o segunda secuencia codificante no codifica una señal de localización nuclear; y

(iv): una región de finalización-transcripción que está unida funcionalmente a cualquiera de la primera, segunda o tercera secuencias codificantes, de modo que la región de finalización-transcripción se localice en el extremo 3' para todas las primeras, segundas y terceras secuencias codificantes; y

(2): una segunda molécula de ADN, que comprende una región de unión que es capaz de unir el dominio de unión al ADN del primer factor de transcripción, la cual región de unión está unida funcionalmente a un promotor mínimo que está unido funcionalmente a una región codificante que codifica un polipéptido, que tiene la capacidad de inhibir el crecimiento de una célula tumoral, la cual región codificante está unida funcionalmente a una región de finalización de la transcripción; y

(b): exponer la célula a una dosis de radiación ionizante efectiva que induzca la expresión.

Preferentemente, el potenciador-promotor sensible a la radiación y el polipéptido, son los mismos que se han mencionado anteriormente. El suministro es preferentemente el mismo que el expuesto anteriormente.

En los dibujos que forman parte de la memoria:

La Figura 1 muestra la influencia de TNF-\alpha sobre la letalidad de la radiación de los sarcomas humanos que producen TNF-\alpha y de las células tumorales humanas que no producen TNF-\alpha.

I. La invención

La presente invención se refiere a composiciones y procedimientos para regular la transcripción de una secuencia de ADN codificante y la expresión de un polipéptido codificado por esa secuencia. Una composición de la presente invención comprende una o más moléculas de ADN sintético que comprenden una región potenciadora-promotora que es sensible a la radiación ionizante, y una región codificante que codifica, por lo menos, un polipéptido. En la presente invención, se ejerce el control sobre la transcripción de una secuencia codificante del ADN mediante una región potenciadora-promotora sensible a la radiación ionizante. La región potenciadora-promotora se utiliza como un interruptor para controlar selectivamente la expresión de un polipéptido codificado por esa secuencia. La regulación de la expresión polipeptídica específica en una célula o tejido diana distinto, proporciona oportunidades para la destrucción, alteración o inactivación de esa célula o tejido.

A. Moléculas de ADN

En un aspecto, la presente invención considera una molécula sintética de ADN que comprende un potenciador-promotor sensible a la radiación unido funcionalmente a una región codificante que, por lo menos, codifica un polipéptido, la cual región codificante está unida funcionalmente a una región de finalización de la transcripción. Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "sintético" indica que una molécula de ADN de la presente invención está preparada por el hombre (no se encuentra naturalmente) mediante cualquier medio que incluye pero no se limita a la síntesis de novo. Preferentemente, esta molécula sintética de ADN es aislada y purificada y existe sustancialmente libre de otros ácidos nucleicos, proteínas y similares.

1. Potenciador-promotor sensible a la radiación

Un promotor es una región de una molécula de ADN (que se encuentra) típicamente en el interior de 100 pares de nucleótidos aproximadamente, enfrente de (corriente arriba) del punto en el cual empieza la transcripción (es decir, un sitio de iniciación de la transcripción). Esa región contiene típicamente varios tipos de elementos secuenciales de ADN que se sitúan en posiciones relativas similares en genes diferentes. Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "promotor" incluye a lo que en la técnica se hace referencia como una región promotora corriente arriba, una región promotora o un promotor de una unidad generalizada de transcripción de la ARN polimerasa II eucariótica. Promotores que pueden considerarse como ejemplos y preferidos, son la secuencia TATA, la secuencia CAAT y los elementos secuenciales ricos en GC.

Otro tipo de elemento discreto secuencial regulador de la transcripción es un potenciador. Un potenciador proporciona especificidad de tiempo, localización y nivel de expresión para una región codificante particular (es decir, un gen). Una función importante de un potenciador es aumentar el nivel de transcripción de una región codificante en una célula que contiene uno o más factores de transcripción que se unen al potenciador. De forma distinta a un promotor, un potenciador puede funcionar cuando está localizado a distancias variables a partir de los sitios de iniciación de la transcripción, tan lejos como un promotor pueda estar presente.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "potenciador-promotor" significa una unidad compuesta que contiene elementos tanto potenciadores como promotores. Tal como se utiliza en la presente memoria, un "potenciador-promotor sensible a la radiación" indica un potenciador-promotor cuya función de control de la transcripción, es afectada por la radiación ionizante. Típicamente, después de la exposición a una dosis efectiva de radiación ionizante, un potenciador-promotor sensible a la radiación de la presente invención, estimula o aumenta la tasa de transcripción de una región controlada por aquél potenciador-promotor. Un potenciador-promotor preferido y que puede tomarse como ejemplo para utilizarse en una molécula de ADN de la presente invención, es un dominio CArG de un promotor Egr-1, un promotor para el gen factor alfa de necrosis tumoral (TNF-\alpha) o un promotor c-Jun.

a. Dominio CArG del promotor Egr-1

La exposición de las células de mamíferos a la radiación ionizante está asociada con la inducción de la expresión del gen Egr-1. El gen Egr-1 (conocido también como zif/268, TIS-8, NFGI-A y Krox-24; Sukhatme, et al. 1988; Christy, et al., 1988; Milbrandt, 1987; Lemaire, et al,. 1988; Lim, et al., 1987; Gessler, 1990) codifica una fosfoproteína nuclear de 533 residuos aminoácidos con un dominio de dedos de zinc Cys_{2}-His_{2} que es parcialmente homólogo al dominio correspondiente en el gen de susceptibilidad al tumor de Wilms (Gessler, 1990). La proteína Egr-1 se une a la secuencia CGCCCCCGC del ADN de forma dependiente del zinc y funciona como un regulador de la transcripción génica (Christy, et al., 1989; Cao, et al., 1990; Lau, et al., 1987). Tanto las señales mitogénicas como las de diferenciación han mostrado que inducen la expresión rápida y transitoria de Egr-1 en diversos tipos celulares. La exposición de las células humanas HL-525 a los rayos X se asoció con aumentos en los niveles de ARNm Egr-1. Estos aumentos fueron máximos a las 3 horas y transitorios. Ensayos de procesamiento nuclear que se llevaron a cabo, demostraron que este efecto estaba relacionado, por lo menos en parte, con la activación de la transcripción del gen Egr-1.

Las secuencias sensibles a las señales inducidas por la radiación ionizante se determinaron mediante análisis de deleción del promotor Egr-1. La inducibilidad por los rayos X del gen Egr-1 fue conferida por una región que contenía seis respuestas séricas o dominios o dominios CC(A/T)_{6}GG(CArG).

Una región que abarca los tres elementos CArG distales o situados corriente arriba, se mostró funcional en la respuesta a los rayos X, pues la deleción secuencial de aquéllos tres dominios CArG disminuyó la respuesta progresivamente. Se encontró que un único dominio CArG, sin embargo, era suficiente para conferir la inducibilidad para los rayos X. Estos resultados indican que la radiación ionizante induce la transcripción de Egr-1 a través de uno o más dominios CArG.

Para identificar elementos cis responsables de la transcripción de Egr-1 inducida por los rayos X, la región promotora Egr-1 que abarca desde la posición -957 corriente arriba al sitio de iniciación de la transcripción, a la posición +248, se unió a un gen informador de la cloranfenicol acetil transferasa (CAT), para formar el plásmido pEgr-1 P1.2. La región del promotor Egr-1 contiene varios elementos putativos cis que incluyen seis dominios CArG (Christy. et al., 1989; Qureshi, et al., 1991). El tratamiento de células transfectadas pEgr-1 P1.2 con la radiación ionizante, se asoció con un aumento de 4,1 veces en la actividad CAT, cuando se compararon con las células transfectadas pero no irradiadas. Al contrario, estudios similares llevados a cabo con el plásmido p\Delta Egr-1 P1.2 (similar al pEgr-1 P1.2, excepto porque los nucleótidos entre las posiciones -550 a - 50 están suprimidos), demostraron una pequeña inducibilidad, (si es que alguna) por los rayos X. De este modo, la inducibilidad por los rayos X de Egr-1 es mediada probablemente por las secuencias situadas entre las posiciones -550 y -50 del promotor Egr-1.

La irradiación de las células transfectadas con el plásmido pE425, el cual plásmido contiene una región de 491 pares de bases aproximadamente del promotor Egr-1, con seis dominios CArG unidos funcionalmente a un gen CAT, se asoció con una inducción de 3,6 veces la actividad CAT, comparada con la obtenida en las células no irradiadas transfectadas con este constructo.

A continuación, se utilizó una serie de constructos en los que se habían eliminado partes del promotor Egr-1, para definir ulteriormente los elementos sensibles a los rayos X en pE425. Estos constructos se muestran a continuación esquemáticamente en el Esquema 1.

Esquema 1

1

En el Esquema 1, los rectángulos negros verticales indican dominios CArG de los plásmidos indicados. Una región que codifica CAT se muestra en el extremo 3' de cada molécula. Los signos de paréntesis indican deleciones relacionadas con la región promotora de Egr-1 que se muestra esquemáticamente en la parte superior del esquema. Los números indican posiciones de los nucleótidos relacionados con el sitio de iniciación de la transcripción (indicado por el número 0).

Si las células se transfectaban con constructos que presentaban una deleción secuencial de los tres dominios distales CArG, la inducibilidad por los rayos X de la actividad CAT disminuyó progresivamente. La transfección con el plásmido pE395 (primer CArG suprimido) confirió un grado menor de inductibilidad por los rayos X que la transfección con pE425. La transfección con el plásmido pE359 (deleción del primer y segundo dominios CArG) dio lugar a ulteriores disminuciones en la actividad CAT. La transfección con el plásmido pE342 (deleción de los primeros tres dominios CArG) se asoció con una inducción mínima de la actividad CAT.

Se realizaron otros estudios con fragmentos del promotor Egr-1 unidos a elementos de un gen de la timidina quinasa del virus del herpes simple (HSV-TK) y el gen CAT. No existió una inducibilidad detectable por los rayos X de la actividad CAT en las células transfectadas con el plásmido pTK35CAT (que contiene un promotor de la timidina quinasa, pero no regiones promotoras Egr-1). Al contrario, en las células transfectadas con el plásmido pE425/250 TK (que contiene los cuatro dominios distales CArG y que utiliza el promotor HSV-TK), la actividad CAT fue inducible por los rayos X. La región del promotor Egr-1 que abarca desde -395 a -250, la cual excluye el primer elemento CArG, fue asimismo funcional para conferir la inducibilidad por los rayos X al promotor heterólogo.

Aunque estos hallazgos proporcionaron un apoyo ulterior para la implicación de los dominios CArG en la transcripción de Egr-1 inducida por los rayos X, otras secuencias entre estos dominios podrían servir asimismo como elementos funcionales cis. La transfección de células con el plásmido pSRE1TK (que contiene el primer dominio CArG que posee siete pares de bases de las secuencias que franquean los extremos 5' y 3'), indujo la transcripción de pTK35CAT.

De este modo, la inducibilidad por los rayos X del gen Egr-1 es conferida por una región del promotor Egr-1 que contiene dominios CArG. Los seis dominios CArG del promotor Egr-1 se localizan en el interior de una región del promotor Egr-1 situada 960 bases nucleótidas aproximadamente corriente arriba del sitio de iniciación de la transcripción del gen Egr-1 (referencia). Un único dominio CArG es suficiente para conferir la inducibilidad por la radiación. Preferentemente, un potenciador-promotor sensible a la radiación, comprende por lo menos uno de los tres dominios CArG más distales (es decir, situados corriente arriba). Una descripción detallada de la inducibilidad por la radiación del gen Egr-1 por los dominios CArG (situados) corriente arriba del sitio de iniciación de la transcripción, puede encontrarse en el Ejemplo 4, a continuación en la presente memoria.

Estudios con el promotor c-fos han demostrado que el dominio CArG o elemento de respuesta sérica, es funcional para inducir la transcripción de este gen en respuesta al suero y otras señales (Triesman, 1990). El elemento CArG es necesario para la inducción de c-fos por tanto las vías de señalización mediadas por PKC, como por las señales inducidas por el factor de crecimiento, independientes de PKC (Fish, et al., 1987; Gilman, 1988; Buscher, et al., 1988; Sheng, et al., 1988; Stumpo, et al., 1988; Graham, et al., 1991). La cinética de la inducción, así como la represión de la expresión de c-fos, son similares a las de Egr-1 en otros modelos (Sukhatme, et al., 1988; Guis, et al., 1990). Verdaderamente, los cambios inducidos por los rayos X en los transcritos de c-fos, son similares a los obtenidos para Egr-1 en las células HL-525, y en éstas, la expresión de c-fos inducida por TPA, como la de Egr-1, es atenuada. Estudios con el promotor c-fos han demostrado que el dominio CArG funciona como un sitio de unión para el factor de respuesta sérico (SRF) (Treisman, 1986; Prywes, et al., 1988). El SRF se une, pero con afinidad variable, a los distintos elementos CArG en el promotor Egr-1 (Christy, et al., 1989).

Los estudios previos han demostrado que la unión de SRF a CArG en el promotor c-fos no está alterada de modo detectable por el suero y otras situaciones (Treisman, 1986; Prywes, et al., 1986; Sheng, et al., 1988). Las proteínas nucleares de las células 3T3 en reposo y de las estimuladas por el suero, han mostrado asimismo una pequeña diferencia, si es que alguna, en la unión al primer elemento CArG del promotor Egr-1 (Gius, et al., 1990). Estos hallazgos sugieren que la radiación ionizante, como el suero, induce una modificación postranscripcional del SRF. Otros estudios han demostrado que la fosforilación de SRF es necesaria para la activación o transcripción (Prywes, et al., 1988). Las quinasas responsables de este efecto, sin embargo, no están claras.

Alternativamente, la radiación ionizante puede conducir a la modificación de otras proteínas que interactúan con el SRF o el dominio CArG. Tanto SAP-1 como el p62^{TCF} (factor complejo ternario) reconocen complejos SRF-ADN (Dalton, et al., 1992; Shaw, et al., 1989), mientras que p62^{DBF} (factor directo de unión) se une directamente al SRE (Ryan, et al., 1989; Walsh, 1989). Otros estudios han demostrado que SRE-ZBP experimenta una modificación postraduccional y se une a este elemento (Attar, et al., 1992). Una o varias de estas proteínas pueden estar implicadas, por tanto, en la transcripción de Egr-1 inducida por los rayos X.

2. Región codificante

Un potenciador-promotor sensible a la radiación está unido funcionalmente a una región codificante que codifica, por lo menos, un polipéptido. Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "unido funcionalmente" significa que un potenciador-promotor está conectado a una región codificante, de tal forma, que la transcripción de esta región codificante está controlada y regulada por dicho potenciador- promotor. En la técnica son bien conocidos los medios para unir funcionalmente un potenciador- promotor a una región codificante. Asimismo como es bien conocido en la técnica, la orientación precisa y la localización respecto a una región codificante cuya transcripción está controlada, depende inter alia de la naturaleza específica del potenciador-promotor. De este modo, un promotor mínimo de secuencia TATA se localiza típicamente entre 25 y 30 pares de bases aproximadamente, corriente arriba de un sitio de iniciación de la transcripción, y un elemento promotor corriente arriba, se localiza típicamente entre 100 y 200 pares de bases aproximadamente, corriente arriba de un sitio de iniciación de la transcripción. Al contrario, un potenciador puede
localizarse corriente abajo del sitio de iniciación, pudiéndose encontrar a una distancia considerable de este sitio.

a. Polipéptido único

En una forma de realización, una región codificante de una molécula de ADN de la presente invención, codifica un único polipéptido. Tal como se utiliza en la presente invención, el término "polipéptido" significa un polímero de aminoácidos conectado mediante enlaces amídicos, en el que el número de residuos aminoácidos puede oscilar entre 5 y un millón aproximadamente. Preferentemente, un polipéptido tiene entre 10 y 1000 residuos aminoácidos aproximadamente, más preferentemente incluso, entre 20 y 500 residuos aminoácidos aproximadamente. Así, tal como se utiliza en la presente memoria, un polipéptido incluye a lo que a menudo se hace referencia en la técnica como un oligopéptido (de 5 a 10 residuos aminoácidos), un polipéptido (de 11 a 100 residuos aminoácidos) y una proteína ( > de 100 residuos aminoácidos). Un polipéptido codificado por una región codificante puede experimentar una modificación postraduccional para formar conjugados con hidratos de carbono, lípidos, ácidos nucleicos y similares, para formar glicopolipéptidos (ejemplo, glicoproteínas), lipopolipéptidos (ejemplo, lipoproteínas) y otros conjugados similares.

Cualquier polipéptido puede ser codificado por una región codificante de una molécula de ADN de la presente invención. Una región codificante puede comprender intrones y exones de modo que la región codificante comprenda por lo menos un marco de lectura abierto para la transcripción, traducción y expresión de dicho polipéptido. De este modo, una región codificante puede comprender un gen, un gen dividido o una molécula de ADNc. En el caso de que la región codificante comprenda un gen dividido (que contiene uno o más intrones), una célula transformada o transfectada con una molécula de ADN que contenga ese gen dividido, debe tener medios para eliminar aquellos intrones y cortar y empalmar juntos los exones en el transcrito de ARN de luna molécula de ADN, si se desea la expresión del producto génico.

En una forma de realización preferida, un polipéptido codificado por una región codificante de una molécula de ADN de la presente invención, interfiere con la integridad estructural o funcional de una célula expuesta a ese polipéptido. Dicho polipéptido tiene la capacidad de inhibir el crecimiento de una célula y, particularmente, de una célula tumoral. Un polipéptido es preferentemente una citoquina, un factor de supresión tumoral negativo dominante, un inhibidor de la angiogénesis, o un quimioatractor monocítico.

Los negativos dominantes para las enzimas celulares tal como la Raf-1-quinasa son citotóxicos para las células tumorales humanas (Qureshi, et al., 1991). Los negativos dominantes para los oncogenes tal como N-myc, pueden ser efectivos, asimismo, en el tratamiento del cáncer.

La expresión de los genes supresores tumorales tal como p53, el gen de la susceptibilidad al retinoblastoma (Rb), o el gen del tumor de Wilms, pueden ser controlados por la radiación. La transfección de las células tumorales deficientes en p53 con un vector de expresión de p53 abroga el crecimiento celular (Johnson, et al., 1991).

El crecimiento celular depende de la angiogénesis y ésta está directa o indirectamente inducida por el tumor. La inducción de la angiogénesis constituye una etapa importante en la carcinogénesis y en el desarrollo metastásico. La angiogénesis es inducida durante la transición de la hiperplasia a la neoplasia. Ya que la angiogénesis es necesaria para el crecimiento tumoral, cualquier compuesto antiangiogénico natural o sintético puede tener potencial antineoplásico. La inhibición de la angiogénesis tumoral mediante la expresión controlada de un gen antiangiogénico puede jugar un importante papel en el tratamiento del cáncer. Los inhibidores de la proliferación celular endotelial capilar y/o de la angiogénesis son un inhibidor derivado del cartílago y el factor 4 plaquetario (PF4) (revisado en Neta, et al., 1991; Zucker, et al., 1991).

El gen de los fibroblastos del ratón es inducido por PDGF. El producto génico fibroblástico, JE o la proteína-1 quimioatractora monocítica (mPC-1) es un miembro de una familia de glicoproteínas tipo citoquina cuya expresión es inducida por una señal mitogénica en los monocitos, macrófagos y células T. JE se ha identificado, caracterizado y producido de forma recombinante a partir tanto de fibroblastos humanos como de los murinos (Rollins et al., 1989). Los productos génicos fibroblásticos murinos y humanos se denominaron mJE y hJE, respectivamente.

MCP-1 o JE es un quimioatractor monocítico específico in vitro que está relacionado estructuralmente con una familia de citoquinas proinflamatorias tales como las proteínas inflamatorias macrofágicas.

Polipéptidos preferidos y que pueden servir de ejemplo son el factor de necrosis tumoral (TNF), la interleuquina-4, JE, PF4 ricina, una toxina bacteriana tal como la toxina de Pseudomonas; p53, el producto génico del retinoblastoma o el producto génico del tumor de Wilms.

En otra forma de realización preferida, un polipéptido codificado por una región codificante, posee una actividad radioprotectora respecto a las células normales (es decir, el polipéptido protege a una célula normal o tejido de un efecto deletéreo de la radiación). Polipéptidos preferidos y que pueden servir de ejemplo y que tienen actividad radioprotectora son la interleuquina-1; factor de necrosis tumoral; un factor de crecimiento tisular tal como un factor de crecimiento hematopoyético, un factor de crecimiento hepatocítico, un factor de crecimiento renal, un factor de crecimiento endotelial, o un factor de crecimiento muscular liso vascular; interleuquina-6; un "barrendero" de radicales libres, o un receptor del factor de crecimiento tisular.

Preferentemente, 1) un factor de crecimiento hematopoyético es un factor estimulante colonial tal como GM-CSF, G-CSF, M-CSF o la interleuquina-3; 2) un factor de crecimiento endotelial es un factor de crecimiento fibroblástico básico; 3) un factor de crecimiento muscular liso vascular es un factor derivado de las plaquetas (PDGF); y 4) un "barrendero" de radicales libres es la manganeso superóxido dismutasa (MnSOD).

Se ha demostrado el efecto radioprotector de las IL-1 e IL-6 que se han administrado (Neta, et al., 1991; Neta, et al., 1992). El beneficio añadido de radioprotección de las células hematopoyéticas se demostró por el TNF exógeno que se añadió previamente a la irradiación, que ha demostrado proteger el sistema hematopoyético en los animales (Neta, et al., 1991).

Estudios realizados por Neta et al han demostrado que IL-1 induce varios factores de crecimiento hematopoyético (GM-CSF, G-CSF, M-CSF, IL3, e IL-6) que contribuyen claramente al crecimiento y diferenciación acelerados de las células progenitoras hematopoyéticas (Neta, et al., 1991). Uckun et al han examinado los efectos radioprotectores del condicionamiento pre-total de la irradiación del organismo (TBI) con el factor estimulante colonial recombinante granulocítico (rG-CSF) y el factor macrófago CSF granulocito recombinante (rGM-CSF) en una amplia serie de ratones irradiados letalmente (Uckun, et al., 1989). La administración de rG-CSF o rGM-CSF antes de TBI protege a una fracción significativa de los ratones de los efectos letales de LD 100/30 TBI (Waddick, et al., 1991). Con dosis equivalentes, rG-CSF mostró una actividad radioprotectora más potente que rGM-CSF. La tasa de supervivencia después de TBI fue asimismo significativamente más alta en los ratones que recibían óptimamente dosis radioprotectoras de rG-CSF, cuando se compararon con los que recibían óptimamente dosis radioprotectoras de rGM-CSF. El pretratamiento con rG-CSF seguido por rGM- CSF fue ligeramente más efectivo que el rG-CSF solo en ratones irradiados supraletalmente, pero no en los ratones irradiados letalmente. Neta et al. han mostrado asimismo que la administración de dosis subóptimas y no radioprotectoras de IL-1 alfa, muestran también sinergia con GM-CSF o G-CSF para conferir una radioprotección óptima (Neta, et al., 1988), sugiriendo que dicha interacción puede ser necesaria para la radioprotección de las células progenitoras hematopoyéticas.

TNF puede inducir radioprotección mediante la producción de manganeso superóxido dismutasa (MnSOD), que se mostrado asociada con la resistencia a la radiación en la progenie HUT-78 de células T (Wong, et al., 1991). C-met es el receptor para el factor de crecimiento del hepatocito, y es activado durante la regeneración hepática y renal. Estos genes pueden utilizarse para evitar el daño de la radiación a estos órganos.

Las malformaciones arteriovenosas (AVMs) en el cerebro se han tratado con radiocirugía. Esta tecnología implica el envío de dosis altas de irradiación a la AVM. La íntima de AVMs se engrosa mediante la proliferación endotelial, obliterándose los microvasos sanguíneos (Steiner, 1984). Se ha mostrado que la proliferación endotelial y del músculo liso está asociada con la producción de bFGF y PDGF. Los resultados clínicos pueden mejorarse añadiendo bFGF y PDGF.

En aún otra forma de realización preferida, el polipéptido codificado por la región codificante posee actividad anticoagulante, trombolítica o trombótica, tal como se ejemplifica por el activador de plasminógeno, una estreptoquinasa o un inhibidor del activador plasminogénico.

El valor de la revascularización arterial coronaria que resulta de la fibrinolisis inducida farmacológicamente, en pacientes con el desarrollo de un infarto miocárdico, se ha evaluado rigurosamente (revisado en Tiefenbrunn, 1992; Becker, et al., 1991). En estudios controlados, se ha demostrado consistentemente la mejoría de la función ventricular izquierda e incluso mejorías más impresionantes en las tasas de supervivencia. El beneficio máximo está relacionado con la restauración del flujo sanguíneo miocárdico. El beneficio máximo se alcanza con una restauración temprana y sostenida de la permeabilidad arterial coronaria. Los pacientes deben evaluarse cuidadosamente antes de iniciar el tratamiento, respecto especialmente de peligros hemorrágicos potenciales, siendo necesario planear una evaluación apropiada del seguimiento y una terapia concomitante. Sin embargo, dado el abrumador cuerpo de datos que están disponibles actualmente respecto a sus beneficios y seguridad relativa, la trombolisis deberá considerarse como una terapia convencional para pacientes que desarrollen un infarto miocárdico agudo.

Los estudios animales del ictus han sido alentadores respecto a la recanalización arterial y a la seguridad (revisado en Brott, 1991; Levine, et al., 1992). La recanalización arterial se ha demostrado en pacientes con ictus isquémico después de administrar cualquiera de los diversos medicamentos trombolíticos. No se han finalizado los ensayos clínicos controlados por placebo, y por tanto, no se han podido establecer beneficios clínicos. Aunque incluso el desarrollo de la hemorragia cerebral no haya sido una complicación frecuente, la mortalidad y morbilidad muy altas han sido inquietantes. Irónicamente, la terapia trombolítica sigue siendo válida para el tratamiento de las hemorragias subaracnoideas y quizás también para la hemorragia intracerebral espontánea. Los estudios en el hombre han sido limitados, pero las complicaciones han sido modestas y los resultados clínicos, alentadores.

Todavía en otra forma de realización preferida, un polipéptido codificado por una región codificante, tiene una capacidad de catalizar la conversión de un promedicamento a un medicamento o para sensibilizar una célula a un agente terapéutico. Como ejemplo, células manipuladas para contener un gen para la timidina quinasa (tk) de un virus del herpes simple (HSV) y para expresar HSV-tk, se vuelven sensibles a la acción del agente antivírico ganciclovir (GCV) (Culver et al., 1992). Como otro ejemplo, células manipuladas para contener un gen para la citosina desaminasa bacteriana, y expresar esta enzima, pueden catalizar la conversión de 5'-fluorocitosina no tóxica inactiva, a citotoxina 5-fluorouracilo activa (Culver et al., 1992).

De este modo, un polipéptido preferido que tiene la capacidad de catalizar la conversión de un promedicamento a un medicamento o para sensibilizar una célula a un agente terapéutico, es la timidina quinasa del virus del herpes simple o una citosina desaminasa.

Otro polipéptido codificado preferido por una región codificante es un antígeno superficial que es un producto génico de un complejo principal de histocompatibilidad (MHC). Tal como es bien conocido en la técnica, MHC representa un conjunto de loci genéticos unidos, que están implicados en la regulación de la respuesta inmune. Los productos génicos MHC se encuentran en las superficies celulares en las que actúan como marcadores antigénicos para diferenciarse de otros antígenos. Típicamente, los productos génicos MHC se clasifican como de tipo I o II, dependiendo de su función. A los MHCs de distintos animales se les han dado denominaciones distintas y correspondientes. Como ejemplo, los productos génicos humanos MHC se denominan mediante el prefijo HL; los productos génicos murinos MHC se denominan mediante el prefijo H-2; los productos génicos MHC de la rata se denominan mediante el prefijo RT1 y los productos génicos MHC del chimpancé se denominan mediante el prefijo ChLA.

Productos génicos MHC humanos preferidos y que pueden tomarse como ejemplo son los antígenos de tipo I HLA-A, HLA-B y HLA-D, y los antígenos de tipo II HLA-Dr y HLA-Dc.

b. Más que un polipéptido

En otro aspecto, una región codificante de una molécula de ADN de la presente invención codifica la totalidad o una parte de más de un polipéptido. Preferentemente, estos polipéptidos son factores de transcripción.

Un factor de transcripción es una proteína reguladora que se une a una secuencia específica de ADN (por ejemplo, promotores y potenciadores) y regula la transcripción de una región codificante del ADN. Típicamente, un factor de transcripción comprende un dominio de unión que se une al ADN (un dominio de unión al ADN) y un dominio regulador, que controla la transcripción. Si un dominio regulador activa la transcripción, el dominio regulador se denomina un dominio de activación. Si el dominio regulador inhibe la transcripción, este dominio regulador se denomina dominio de represión.

Según dicha forma de realización, una región codificante comprende:

(c): una tercera secuencia codificante que codifica una señal de localización nuclear,

en la cual la primera, segunda y tercera secuencias codificantes están unidas funcionalmente entre ellas en cualquier orden en un marco de lectura, con la condición de que sólo la tercera secuencia codificante requiere estar presente, si la primera o segunda secuencia codificante no codifica una señal de localización nuclear; y

Tal como se utiliza en la presente memoria, la frase "unida funcionalmente en un marco de lectura" significa que las secuencias codificantes están conectadas entre ellas de forma tal que un marco de lectura abierto se mantiene entre estas secuencias. En la técnica, se conocen bien medios para unir en un marco de lectura secuencias codificantes del ADN.

Los dominios de los factores de transcripción que se unen al ADN, se conocen bien en la técnica. Factores de transcripción ejemplares conocidos por contener un dominio que se une al ADN son las proteínas GAL4, c-fos, c-Jun, lac1, trpR, CAP, TFIID, CTF, Spl, HSTF y NF-\kappaB. Preferentemente, un dominio que se une al ADN se deriva de la proteína GAL4.

La proteína GAL4 es un factor de transcripción de la levadura, que comprende 881 residuos aminoácidos. La proteína GAL4 de la levadura activa la transcripción de genes que son necesarios para el catabolismo de la galactosa y de la melibiosa. GAL4 comprende numerosos discretos que incluyen un dominio que se une al ADN (Marmorstein et al, 1992).

Las secuencias de ADN reconocidas por GAL4 tienen una longitud de 17 pares de bases (pb), y cada sitio se une a un dímero de la proteína. Cuatro de dichos sitios, similares pero no idénticos secuencialmente, se encuentran en la secuencia de activación que se encuentra situada corriente arriba (UAS_{G}), que media, por ejemplo, la activación de GAL4 de los genes GAL1 y GAL10 (Marmorstein et al., 1992).

Se han asignado funciones a varias partes de la proteína GAL4 de 881 aminoácidos, que incluyen la unión al ADN (residuos 1-65) y la dimerización (residuos 65-94). Además, se han identificado tres regiones ácidas activantes (residuos 94-106; 148-196; 768-881), pues tiene una región cercana al extremo carboxilo que se une a la proteína inhibitoria GAL80 (Marmorstein et al., 1992).

La región de GAL4 que se une al ADN tiene seis residuos de cisteína, que se conservan entre un conjunto de proteínas homólogas, que coordinan dos iones de Zn^{2+} en un agregado de tiolato bimetálico. Los residuos 10 a 40, que forman el dominio de unión de los metales, constituyen una unidad globular compacta. Los residuos 1 a 9 y los residuos C-terminal al 41 están desordenados (Marmorstein et al, 1992).

El fragmento de la proteína se une a su sitio de ADN como un dímero simétrico. Cada subunidad se añade a tres módulos distintos: un dominio compacto de unión metálica (residuos 8 a 40), un engarce extendido (residuos 41 a 49), y un elemento de dimerización \alpha-helicoidal (residuos 50 a 64). El dominio de unión metálica pone en contacto tres pares de bases del ADN en la ranura principal, y se refiere por tanto a un módulo de reconocimiento (Marmorstein et al., 1992).

El módulo de reconocimiento se mantiene junto mediante dos iones metálicos, coordinados tetrahédricamente por las seis cisteínas. El módulo de reconocimiento de GAL4 define un tipo en el grupo de los dominios que se unen al ADN que presentan Zn^{2+} como elemento estructural.

Los residuos 50 a 64 forman una hélice \alpha anfipática. La molécula completa de GAL4 contiene residuos adicionales entre 65 y 100 que contribuyen a las interacciones diméricas y mantienen la proteína como un dímero, incluso cuando no está unida al ADN. La secuencia aminoácida de GAL4 está de acuerdo con una estructura en bobina enrollada que puede continuar en una repetición de un grupo de siete elementos más allá del extremo C de GAL4 (1 a 65). Además, los residuos 79 a 99 incluyen tres secuencias potencialmente \alpha-helicoides de un grupo de siete elementos. El segmento que interviene (residuos 82 a 78) contiene una prolina. El elemento completo de dimerización de GAL4 podría por tanto compartir algunas características estructurales con factores de transcripción "helicoidal-bucle-helicoidal".

Se conocen por lo menos otras once proteínas fúngicas que se unen al ADN que contienen secuencias repetidas CX_{2}CX_{6}C similares a las encontradas en el módulo de reconocimiento de GAL4: LAC9, PPR1, QA-1F, QUTA1, ARGRII, HAP1, MAL63, LEU3, PUT3, y AMDR. En la mayoría de ellas, el "bucle" entre la tercera y la cuarta cisteínas tiene seis residuos de largo, pero contiene un residuo menos en MAL63, PDR1, PUT3, y AMDR, y tiene algunos residuos más en LEU3. Los residuos 15 a 20 de GAL4, que se encuentran muy cerca del ADN en el complejo, están muy conservados en estos homólogos. Arg 15 y Lys 20, que forman uniones de sales de fosfato que anclan la primera hélice del módulo de reconocimiento al ADN, se conservan en todos pero no en AMDR, que posee His y Arg en estas posiciones, respectivamente. El residuo 19 es habitualmente hidrofóbico, y el residuo 17 es básico, excepto en QA-1F y LEU3. Lys 18, que lleva a cabo contactos base específicos en el complejo GAL4, se conserva en todos los casos, menos en tres. En dos de las excepciones (QA-1F y MAL63) es Arg; en la otra (PUT3), es His. Estas conservaciones sugieren que los módulos de reconocimiento de estos homólogos de GAL4 se acercan todos al ADN de una forma similar (Marmorstein et al., 1992).

Existen secuencias CCG para LAC9, PPR1, LEU3 y PUT3 dispuestas simétricamente en sitios conocidos. Secuencias características de un grupo de 7 elementos sugieren que varios de las homólogos (LAC9, PPR1, QA-1F, QUTA1) contienen elementos de dimerización en forma de bobina enrollada similares a los de GAL4. En otros, tal como ARGRII, HAP1, y LEU3, no se encuentran secuencias obvias de un grupo de siete elementos en los 60 residuos inmediatamente C-terminales a los módulos de reconocimiento. En LEU3, los grupos de siete elementos se encuentran en un residuo más cercano al módulo de reconocimiento que en GAL4; en HAP1, aparecen desplazados hacia el extremo C por siete residuos. Estas observaciones implican alguna heterogeneidad de las estructuras de dimerización y de las longitudes de los engarces (Marmorstein et al., 1992).

Los parientes más cercanos de GAL4 son LAC9, que lleva a cabo la misma función en K. lactis, y PPR1, que regula la biosíntesis pirimidínica en S. cerevisiae. GAL4 y LAC9 se unen a los mismos sitios del ADN; PPR1 reconoce sitios con el triplete CCG separado por seis pares de bases, antes que por 11. GAL4 y LAC9 tienen secuencias aminoácidas similares en sus engarces y segmentos de dimerización; los engarces y elementos de dimerización de PPR1 no presentan similitud secuencial a la de GAL4, aparte de las características rugosas de sus regiones con un grupo de siete elementos (Marmorstein et al., 1992).

En una forma de realización preferida, por tanto, una primera secuencia codificante de una molécula de ADN de la presente invención, codifica un dominio de unión de GAL4 al ADN. Preferentemente, este dominio de unión comprende secuencias de residuos aminoácidos de GAL4 de 1 a 147, las cuales denominaciones numéricas se refieren a secuencias de residuos aminoácidos que se designan consecutivamente empezando en el extremo amino. Así, una primera secuencia codificante comprende aproximadamente 444 pares de bases nucleótidas del gen GAL4, los cuales pares de bases codifican las secuencias de los residuos aminoácidos 1 a 147 de GAL4.

En otra forma de realización preferida, una primera secuencia codificante de una molécula de ADN de la presente invención codifica un dominio de GAL4 que se une al ADN que comprende secuencias de residuos aminoácidos del 1 al 65 aproximadamente de GAL4, las cuales denominaciones numéricas se refieren a secuencias de residuos aminoácidos que se designan consecutivamente empezando en el extremo amino. Así, una primera secuencia codificante comprende 198 pares de bases nucleótidas aproximadamente del gen GAL4, los cuales pares de bases codifican los residuos aminoácidos 1 a 65 de GAL4.

Los factores de transcripción que tienen dominios de represión o activación son bien conocidos en la técnica. Factores de transcripción ejemplares que tienen de activación son GAL4, c-Jun, la proteína vírica VP-16, y el factor nuclear NF-\kappaB.

Tal como se ha expuesto anteriormente, GAL4, una proteína de 881 residuos aminoácidos, activa la transcripción de factores implicados en el metabolismo de los hidratos de carbono de las levaduras. Existen probablemente dos o tres acídicos de activación en la proteína GAL4. Estos de activación comprenden (1) los residuos aminoácidos 94 a 106, (2) los residuos aminoácidos 148 a 196, y (3) los residuos aminoácidos 768 a 881, en los que los residuos aminoácidos se designan consecutivamente empezando en el extremo amino (Marmorstein et al., 1992).

En una forma de realización, una segunda secuencia codificante codifica un dominio de activación de GAL4. Dicha secuencia codificante comprende secuencias de bases nucleótidas de 69, 147 y 342 pares de bases aproximadamente, que codifican respectivamente los de activación a los que se ha aludido anteriormente.

C-Jun es una forma importante del factor de transcripción AP-1 de 40 a 44 kD. En el interior de la proteína Jun, existen varios regulatorios y que se une al ADN. Próxima al dominio que se une al ADN se encuentra una región denominada A_{2}, que es necesaria para activar la transcripción (Lewin, 1991). A_{1}, un dominio adicional de activación transcripcional se encuentra cerca del extremo N adyacente a una región denominada Delta (\Delta), que se propone unir a una proteína celular que inhibe las propiedades activantes transcripcionales de Jun (Baichwal, 1990 y Baichwal, 1991). La actividad transcripcional de Jun puede conferirse a través de cualquiera o de los dos de activación A_{1} y A_{2}.

El aumento de la unión de Jun a las secuencias AP-1 después de irradiación sugiere que la proteína Jun se modifica después de la irradiación. Considerado conjuntamente los hallazgos recientes de que la proteína quinasa C (PKC) se activa después de la irradiación de las células y de que la disminución de PKC suprime la inducción de c-Jun por la irradiación, (Hallahan, 1992), es probable que la irradiación active Jun a través de la modificación MAP-K del dominio A_{1} (Binetruy, 1991 y Pulverer, 1991).

La capacidad de un dominio de activación de Jun para estimular la transcripción, se demostró en estudios de células transformadas o transfectadas con moléculas de ADN que comprenden dichos. Las células HeLa y RIT-3 se transfectaron con dos plásmidos. El plásmido pSG-Jun5-253 contenía el promotor SV40 (no sensible transcripcionalmente a la radiación) situado corriente arriba de una región codificante que codificaba una proteína quimérica (GAL4-Jun) que comprendía una secuencia para \Delta, A_{1}, y A_{2} (Baichwal, 1990) y el dominio que se une al ADN del gen GAL4 de la levadura (el dominio que se une al ADN de Jun se reemplazó con el dominio que se une al ADN del gen GAL4, Baichwal, 1990). Un segundo plásmido, G5BCAT se construyó para contener la secuencia del ADN que se une a la proteína Gal4 situada en el extremo 5' de la secuencia E1b TATA y corriente arriba del gen informador CAT (Baichwal, 1990).

La activación transcripcional del dominio de activación de Jun mediante irradiación de las células transfectadas, estimuló la transcripción y expresión de la proteína quimérica Gal-Jun, la cual proteína se unió a la secuencia de unión Gal4 e inició la transcripción y expresión de CAT. La irradiación de las células RIT-3 transfectadas sólo con G5BCAT, no demostró aumento en la actividad de CAT. Resultados similares se obtuvieron en las células HeLa que contenían el inhibidor de Jun.

Sin embargo, las células Hep G2 (que no contenían el inhibidor de Jun; Baichwal, 1990) transfectadas con pSG-Jun5-235 y G5BCAT, no demostraron activación inducida por los rayos X de la proteína quimérica Gal4-Jun. Estos datos sugieren que la proteína quimérica Gal-Jun se activa después de la irradiación, lo que lleva a la unión al ADN para acelerar la transcripción de CAT.

A causa de que la expresión del gen c-Jun inducida por los rayos X se atenuó cuando PKC disminuyó o se inhibió, se añadió el inhibidor H7 de PKC a las células RIT-3 transfectadas con pSG-Jun5-235 y G5BCAT. El tratamiento con H7 abrogó el aumento inducido por los rayos X en la actividad CAT, sugiriendo que la activación de PKC inducida por la irradiación es necesaria para la expresión génica (Hallahan, 1991a; Hallahan, 1991b). Estos datos sugieren que la disociación del inhibidor de Jun puede ser un mecanismo par regular la transcripción mediada por la radiación.

Todavía en otro aspecto, una molécula de ADN de la presente invención comprende una región de unión que es capaz de unir un dominio que se une al ADN de un factor de transcripción, la cual región de unión está unida funcionalmente a un promotor mínimo que está unido funcionalmente a una región codificante que codifica un polipéptido, la cual región codificante está unida funcionalmente a una región de finalización-transcripción.

Preferentemente, una región de unión es capaz de unir el dominio que se une al ADN del primer factor de transcripción que se ha mencionado anteriormente. Como ejemplo, si el dominio de unión es un dominio de unión Gal4, una región de unión de una molécula de ADN une a este dominio de unión Gal4. Una región de unión está unida funcionalmente a un promotor mínimo (por ejemplo, una secuencia TATA) que está unido funcionalmente a una región codificante que codifica un polipéptido. Una molécula de ADN que se prefiere como ejemplo, que comprende una región de unión, el promotor mínimo y la región codificante, es el plásmido pG5BCAT. El plásmido pG5BCAT comprende una región de unión que une el dominio que se une al ADN de Gal4 (residuos aminoácidos 1-147) unido funcionalmente a una secuencia E1b TATA que está unida funcionalmente al gen CAT (Véase el Ejemplo v a continuación en la presente memoria).

En una forma de realización preferida, un dominio de activación es un dominio de activación de la proteína vírica VP-16 o del factor nuclear NK-fB.

La proteína vírica VP-16 es un polipéptido de 65 kD de 490 residuos aminoácidos aproximadamente, que se expresa durante la fase temprana inmediata de la infección vírica por el herpes simple y activa la transcripción y expresión subsiguiente de las proteínas celulares infectadas (ICP) tales como ICP4 (Trienzenberg et al., 1988).

El dominio de activación de VP-16 comprende una secuencia de residuos aminoácidos de 78 residuos aminoácidos aproximadamente, localizado en el extremo carboxilo de VP16 (residuos aminoácidos 413 a 490 numerados a partir del extremo amino). El dominio de activación de VP16 está además centrado probablemente en una secuencia de 61 residuos aminoácidos localizada entre el residuo 429 aproximadamente y el residuo 456 aproximadamente (Trienzenberg et al., 1988).

Así, en una forma de realización preferida, una segunda secuencia codificante codifica secuencias de residuos aminoácidos entre el residuo número 413 y el residuo número 490 de VP16 y, más preferentemente, entre el residuo número 429 y el residuo 456 aproximadamente de VP16.

El factor nuclear NF-\kappaB es un factor de transcripción. El dominio de activación de NF-\kappaB comprende secuencias de residuos aminoácidos entre el residuo en posición 414 y el residuo en posición 515, numerados a partir del extremo amino. De este modo, una segunda secuencia codificante comprende preferentemente pares de bases nucleótidas que codifican residuos aminoácidos entre el residuo en posición 414 aproximadamente al residuo en posición 515 aproximadamente de NF-\kappaB (Ballard, 1992).

c. Señal de localización nuclear

Una de las secuencias codificantes contiene por lo menos una señal de localización nuclear. Dicha señal permite que el factor de transcripción codificado penetre en el núcleo e interaccione con el ADN en éste. Preferentemente, dicha señal de localización nuclear está contenida en la primera o segunda secuencia codificante. Si una señal de localización nuclear no se encuentra en una primera o segunda secuencia codificante, dicha señal está contenida en una tercera secuencia codificante.

Las señales de localización nuclear son bien conocidas en la técnica. Dicha señal preferida y que puede servir como ejemplo, se deriva del gran antígeno T (SV40) del Virus Simiano 40. En una forma de realización preferida, una señal de localización nuclear SV40 comprende una secuencia de residuos aminoácidos de entre 7 y 15 residuos de aminoácidos aproximadamente, alrededor de un residuo de lisina (Lys) en posición 128 del gran antígeno T de SV40 (Kalderon et al, 1984). En una forma de realización más preferida, una señal de localización nuclear comprende la secuencia de residuos aminoácidos de SV40 que abarca desde la posición del residuo 126 aproximadamente a la posición del residuo 132 aproximadamente.

d. Región de finalización-transcripción

La ARN polimerasa transcribe una secuencia de ADN codificante a través de un sitio en el que tiene lugar la poliadenilación. Típicamente, las secuencias de ADN localizadas algunos cientos de pares de bases corriente abajo del sitio de poliadenilación, sirven para finalizar la transcripción. A estas secuencias de ADN se alude en la presente memoria como regiones de finalización-transcripción. Estas regiones son necesarias para una poliadenilación eficiente del ARN mensajero transcrito (ARNm).

Las regiones de finalización-transcripción son bien conocidas en la técnica. Una región de finalización-transcripción preferida que se utiliza en una molécula de ADN de la presente invención, comprende entre los nucleótidos 1533 y 2157 aproximadamente de la hormona humana del crecimiento (Seeburg, 1982).

3. Preparación de una molécula de ADN

Una molécula de ADN de la presente invención se prepara según técnicas estándar bien conocidas por los expertos en la materia. En primer lugar, se preparan o aíslan fragmentos de ADN que contienen las diversas regiones de una molécula deseada de ADN. A continuación estas regiones se unen para formar una molécula de ADN de la presente invención. En la técnica, son bien conocidos medios para sintetizar, aislar y unir fragmentos de ADN.

Las secuencias de ADN de hasta aproximadamente 200 pares de bases pueden prepararse utilizando técnicas sintéticas en fase sólida bien conocidas. Así, por ejemplo, si un potenciador-promotor sensible a la radiación es un dominio CArG de un promotor Egr-1, se pueden preparar sintéticamente uno o más de estos.

Si una secuencia deseada de ADN tiene aproximadamente de 200 o más nucleótidos, esa secuencia se obtiene típicamente de los tejidos, células o constructos disponibles comercialmente (por ejemplo, vectores o plásmidos) que se sepa contienen esa secuencia deseada.

Como ejemplo, se ha aislado y secuenciado del hígado del ratón un clon ADNc de Egr-1 (Tsai-Moris, 1988). Se aisló un ADNc de c-Jun y se secuenció a partir de la rata (Hatori, 1988 y Unlap, 1992). En la técnica, son bien conocidas fuentes que contienen regiones de ADN codificante que codifican polipéptidos específicos. La Tabla 1 a continuación sumariza fuentes conocidas por contener secuencias codificantes de ADN para polipéptidos ejemplares.

TABLA 1

\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
  Polipéptido  \+  \hskip 2cm \+  Fuente del ADN
codificante \cr \+\+\cr  TNF \+ \+ CETUS\cr  ricina \+ \+
CETUS\cr  p53 \+ \+ Dr. Vogelstein,   Johns Hopkins University\cr 
MnSOD \+ \+ Genentech\cr  exotoxina de Pseudomonas \+ \+ Dr. Steve
Lory, Univ. of
Washington\cr}

Si una fragmento de ADN se obtiene a partir de una célula o de otro organismo, el ADN total se extrae a partir del organismo o célula y se fragmenta utilizando enzimas de restricción. La selección de qué enzima o enzimas se utilice depende de la secuencia del ADN que se desee obtener. Secuencias particulares de ADN de interés se aíslan, identifican y purifican entonces utilizando técnicas estándar bien conocidas en la técnica. Si es necesario, una secuencia de ADN codificante puede amplificarse antes de aislarla. Un medio preferido para amplificar una secuencia de ADN de interés es la reacción en cadena de la polimerasa.

Se ha preparado una amplia variedad y número de moléculas de ADN que comprenden un potenciador-promotor sensible a la radiación y una región codificante (Véanse los Ejemplos 1 a 6, a continuación en la presente memoria). La Tabla 2, a continuación, resume la composición de dichas moléculas ejemplares de ADN.

TABLA 2

2

a. pE425-TNF

El plásmido pE425-TNF comprende bases nucleótidas entre la posición nucleótida -425 y la posición nucleótida +65 (relativa al sitio de comienzo de la transcripción) del gen Egr-1 unido funcionalmente a una región codificante que codifica TNF-\alpha. pE425-TNF se construyó a partir de los plásmidos pE-TNF, que contiene TNF ADNc, y del plásmido pE425-CAT, que contiene el segmento Egr-1, una región de finalización de la transcripción y un segmento de poliadenilación de CAT.

Se digirió pE-TNF con la enzima de restricción Pst I para producir un fragmento de 1,1 kilobase (kb) que contenía TNF ADNc. pE425-CAT se digirió con la enzima de restricción Hind III para producir un fragmento de 3,3 kb que contenía el gen CAT y un segmento de 3,2 kb que contenía el fragmento Egr-1 y la señal de poliadenilación de CAT. Los extremos del fragmento de 1,1 kb de pE-TNF y del fragmento de 3,2 kb de pE425-CAT se hicieron romos en el saliente del extremo 3' con la T4 ADN polimerasa y en el saliente del extremo 5' con Klenow, utilizando procedimientos estándar bien conocidos en la técnica.

El pE425 resultante y el TNF ADNc se unieron por los extremos romos utilizando la T4 ADN ligasa y la T4 ARN ligasa empleando procedimientos estándar bien conocidos en la técnica, para formar pE425-TNF. La digestión de pE425-TNF con BamH1 y Hind II produjo segmentos de 1,4 kb y 4,5 kb del constructo con sentido y un segmento de 0,9 kb del constructo antisentido indicando la orientación del sentido del plásmido.

El plásmido pE425-CAT se preparó a partir de un fragmento de 491 pares de bases aproximadamente del promotor Egr-1, el cual fragmento está localizado entre la base nucleótida -425 y la base nucleótida +65 relativa al sitio de comienzo transcripcional y el plásmido pCATm (Gius et al. 1990).

El fragmento de 491 pares de bases de Egr-1 se obtuvo del plásmido p2.4, el cual contenía un fragmento de 2,4 kb de la secuencia que franqueaba el extremo 5' del gen Egr-1 (Tsai-Morris, 1988). Brevemente, se utilizó el ADN de células hepáticas 3T3 de ratones Balb/c para construir una genoteca \DeltaFix utilizando un procedimiento de clonación de llenado parcial bien conocido. Se rastrearon aproximadamente 100.000 clones no amplificados en la cepa JC7623 de E. coli (rec B, rec C, sbc B; Winas et al., 1985), con un plásmido OC 3.1 de Egr-1 marcado con P^{32} (Sukhatme et al., 1988) que contenía un inserto completo (de longitud total) de ADNc de 3,1 kb. Se hibridizaron membranas (GeneScreenPlus, New England Nuclear) durante aproximadamente 16 horas a 65ºC aproximadamente en SDS al 1%, sulfato de dextrano al 10% y 1 M NaCl. Los filtros se lavaron hasta una alcanzar una restricción final de 65ºC en 0,2 x SSC. Se prepararon autoradiografías exponiendo los filtros durante aproximadamente 18 horas a -70ºC con una pantalla de intensificación. Se obtuvo un único clon, denominado mgEgr-1.1, el cual clon se hibridizó al extremo 5' del fragmento EcoRI-ApaI de 120 pares de bases del plásmido OC 3.1.

Un fragmento PvuII-PvuII de 2,4 kb y un fragmento XbaI-XbaI de 6,6 kb derivado de mgEgr-1.1 se subclonaron en los sitios SmaI y XbaI de pUC13 y pUC18 (Promega Corp. Madison, WI), respectivamente, para formar los plásmidos p2.4 y p6.6 respectivamente.

A partir del plásmido p2.4, se obtuvo un fragmento de 1206 pares de bases aproximadamente (entre la posición -957 de la base de nucleótidos y la posición +248 de la base de nucleótidos relativa al sitio de comienzo de la transcripción), para formar el plásmido pEgr-1 P1.2. Se construyó un mutante de deleción a partir de pEgr-1 P1.2 utilizando oligómeros y la reacción en cadena de la polimerasa, para formar el fragmento de 491 pares de bases que se extiende entre la posición -425 de la base nucleótida a la posición +65 de la base nucleótida.

El plásmido pCAT3m se obtuvo a partir del Dr. Laimonis A. Laimins, (Howard Hughes Medical Institute Research Laboratories, University of Chicago, Chicago, IL). El plásmido pE-TNF se preparó según el procedimiento de Wong (Wong, 1985).

b. pE425-p53

El plásmido pE425-p53 comprende un fragmento de 491 pares de bases aproximadamente del promotor de Egr-1 unido funcionalmente a una región codificante del factor supresor tumoral p53. pE425-p53 se construyó a partir de un plásmido (pC53SN3; Diller, 1990) que contiene p53 ADNc, y de un plásmido pE425-CAT, que contiene el segmento Egr-1 y una región de finalización-transcripción, el segmento de poliadenilación de CAT. El plásmido pE425-CAT se preparó tal como se ha descrito anteriormente.

c. pE425-raf 301-1

El plásmido pE425-raf 301-1 comprende un fragmento de 491 pares de bases aproximadamente del promotor de Egr-1 unido funcionalmente a una región codificante de un producto serina/treonina-proteína quinasa específica de un oncogén de una célula de sarcoma murino 3611. pE425-raf 301-1 se construyó a partir de los plásmidos pMN301-1, que contiene el raf dominante negativo (Kolch, 1991), y pE425-CAT que contiene el segmento Egr-1 y una región de finalización-transcripción, el segmento de poliadenilación de CAT.

d. pE425-MnSOD

El plásmido pE425-MnSOD comprende un fragmento de 491 pares de bases aproximadamente del promotor de Egr-1 unido funcionalmente a una región codificante de la manganeso superóxido-dismutasa, "barrendero" de radicales libres (MnSOD). pE425-MnSOD se construyó a partir de un plásmido nMnSOD #0664 (Genentech) (Wong, 1989) que contiene MnSOD ADNc y pE425-CAT, que contiene el segmento Egr-1 y una región de finalización-transcripción, el segmento de poliadenilación de CAT.

e. G5-TNF

El plásmido G5-TNF comprende el dominio que se une al ADN del gen GAL4 de la levadura y la secuencia TATA del promotor mínimo E1b unida funcionalmente a una región codificante que codifica TNF-\alpha. pG5-TNF se construyó a partir del plásmido G5BCAT y del plásmido pE-TNF.

El plásmido G5BCAT, que contiene la secuencia de ADN que se une a la proteína Gal4 situada en el extremo 5' de la secuencia TATA E1b situada corriente arriba del gen informador CAT (Baichwal, 1990). El plásmido G5BCAT se digirió con la enzima de restricción EcoRI. El fragmento grande se aisló y sus extremos se hicieron romos en el saliente del extremo 3' utilizando la T4 ADN polimerasa y en el saliente del extremo 5' con Klenow. Esta digestión eliminar el promotor mínimo, pero conserva el extremo poly-A.

El TNF ADNc se eliminó del plásmido pE4 utilizando la enzima de restricción Pst I y el fragmento de 1,1 kb que contenía TNF-ADNc se aisló y sus extremos se hicieron romos en el saliente del extremo 3' utilizando la T4 ADN polimerasa y en el saliente del extremo 5' con Klenow.

El G5B resultante y el TNF ADNc se unieron por los extremos romos utilizando la T4 ADN ligasa y la T4 ARN ligasa. En el plásmido resultante G5-TNF se llevó a cabo una elaboración de mapas mediante enzimas de restricción y la secuenciación del ADN para asegurar la orientación del sentido de TNF. El plásmido G5BCAT se preparó mediante el procedimiento de Baichwal (Baichwal et al., 1990). El plásmido pE-TNF se preparó tal como se mostró anteriormente.

f. c-Jun CAT

El plásmido c-Jun-CAT comprende un fragmento de 1100 pares de bases aproximadamente del promotor c-Jun unido funcionalmente a una región codificante de CAT. El plásmido c-Jun-CAT se construyó a partir del plásmido h-jun-CAT según el procedimiento de Angel (Angel, 1988).

g. pE25-exotoxina de Pseudomonas

Se preparó un plásmido que comprendía un dominio CArG de un promotor de Egr-1 y una región codificante que codifica la exotoxina de Pseudomonas, a partir del plásmido PE425 y del plásmido pMS150A (Lory, 1988), que contiene la región que codifica la exotoxina de Pseudomonas.

h. Otros constructos

Otras moléculas de ADN de la presente invención se prepararon utilizando técnicas similares a las que se han expuesto anteriormente. Ejemplos específicos de la preparación de otras moléculas de ADN pueden encontrarse a continuación en los ejemplos 1 a 6 de la presente memoria.

B. Composición farmacéutica

En otro aspecto, la presente invención considera una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de por lo menos una molécula de ADN de la presente invención, y un excipiente fisiológicamente aceptable.

Una cantidad terapéuticamente efectiva de una molécula de ADN que se combina con un excipiente para producir una forma única de dosificación, varía, dependiendo del huésped tratado y del modo particular de administración.

Tal como es bien conocido en la técnica, un nivel específico de dosis para cualquier paciente particular depende de una variedad de factores, que incluyen la actividad del compuesto específico utilizado, la edad, el peso corporal, la salud general, el sexo, la dieta, el tiempo y la vía de administración, la tasa de excreción, la combinación de medicamentos, y la gravedad de la enfermedad en particular que está experimentado la terapia.

Una composición de la presente invención se administra típicamente por vía oral o parenteral, en formulaciones de dosis unitarias que contienen excipientes estándar fisiológicamente aceptables, no tóxicos y bien conocidos, adyuvantes y vehículos si se desea. El término parenteral tal como se utiliza en la presente memoria, incluye inyecciones subcutáneas, intravenosas, intramusculares, intraarteriales o técnicas de infusión.

Las preparaciones inyectables, por ejemplo, las suspensiones acuosas inyectables estériles u oleaginosas, se formulan según la técnica conocida, utilizando agentes humidificantes o dispersantes apropiados y agentes de suspensión. La preparación inyectable estéril puede asimismo consistir en una solución inyectable estéril o en una suspensión en un diluyente o disolvente no tóxico aceptable parenteralmente, por ejemplo, como una solución en 1,3-butanediol.

Entre los vehículos y disolventes aceptables que pueden utilizarse están el agua, la solución de Ringer, y la solución isotónica de cloruro sódico. Además, como medio disolvente o de suspensión, se utilizan convencionalmente aceites fijados y estériles. Con este propósito, puede utilizarse cualquier aceite fijado que incluya mono o di-glicéridos sintéticos. Además, en la preparación de inyectables, se utilizarán ácidos grasos tales como el ácido oleico.

Una molécula de ADN de la presente invención pueden también acomplejarse con un conjugado poly(L-Lisina)(PLL)-proteína tal como un conjugado de transferrina-PLL o un conjugado asialoorosomucoide-PLL.

Las formas de dosificación líquidas para administración oral incluyen emulsiones, jarabes, soluciones, suspensiones, y elíxires farmacéuticamente aceptables, que incluyen diluyentes inertes utilizados habitualmente en la técnica, tales como el agua. Dichas composiciones pueden comprender asimismo adyuvantes, tales como agentes humectantes, agentes emulsificantes y de suspensión, y agentes perfumantes, saborizantes y edulcorantes.

C. Células transformadas o transfectadas y transgénicas.

En otro aspecto, la presente invención proporciona una célula transformada o transfectada con una o más moléculas de ADN de la presente invención, así como células transgénicas derivadas de aquéllas células transformadas o transfectadas. En la técnica se conocen medios para transformar o transfectar células con moléculas exógenas de ADN.

Una molécula de ADN se introduce en una célula utilizando técnicas estándar de transformación o transfección que se conocen bien en la técnica, tales como la transfección mediada por el fosfato de calcio, o por el DEAE-dextrano, fusión de protoplastos, electroporación, liposomas y microinyección directa (Sambrook, Fritsch y Maniatis, 1989).

El procedimiento utilizado más ampliamente es la transfección mediada por el fosfato de calcio o el DEAE-dextrano. Aunque el mecanismo no está claro, se cree que el ADN transfectado penetra en el citoplasma celular mediante endocitosis y se transfiere al núcleo. Dependiendo del tipo celular, en cualquier tiempo puede transfectarse hasta un 20% de una población de células cultivadas. A causa de su alta eficiencia, la transfección mediada por el fosfato cálcico o el DEAE-dextrano es el procedimiento de elección para experimentos que requieran la expresión transitoria del ADN extraño en un gran número de células. La transfección mediada por el fosfato cálcico se utiliza asimismo para establecer progenies celulares que transportan copias integradas del ADN extraño, que se organizan habitualmente en una colección tándem cabeza-cola.

En el procedimiento de fusión protoplástica, los protoplastos derivados de las bacterias que transportan grandes cantidades de copias de un plásmido de interés, se mezclan directamente con células cultivadas de mamífero. Después de la fusión de las membranas celulares (habitualmente con polietilenglicol), el contenido de las bacterias se suministra al citoplasma de las células de mamíferos y el ADN plasmídico se transfiere al núcleo. La fusión protoplástica no es tan eficiente como la transfección para muchas de las progenies celulares en las que le endocitosis del ADN tienen lugar de modo poco eficiente. La fusión protoplástica produce frecuentemente copias múltiples del ADN plasmídico, integrado al azar en el cromosoma del huésped.

La aplicación de impulsos eléctricos breves de alto voltaje a diversas células de mamíferos y plantas, conduce a la formación de poros de tamaños nanométricos en la membrana plasmática. El ADN es captado directamente en el citoplasma celular bien a través de estos poros, o como consecuencia de la redistribución de los componentes de la membrana que acompaña al cierre de éstos. La electroporación puede ser extremadamente eficiente y utilizarse tanto para la expresión transitoria de los genes de clones, como para el establecimiento de progenies celulares que transporten copias integradas del gen de interés. La electroporación, al contrario que la transfección mediada por el fosfato cálcico y la fusión protoplástica, da lugar frecuentemente a progenies celulares que transportan una o por lo menos, algunas, copias integradas del ADN extraño.

La transformación liposómica implica la encapsulación del ADN y del ARN en el interior de los liposomas, seguido por la fusión de éstos con la membrana celular. Además, el ADN que es revestido con un lípido catiónico sintético, puede introducirse en las células mediante fusión. La microinyección directa de una molécula de ADN en los núcleos, tiene la ventaja de no exponer el ADN a los compartimientos celulares tal como los endosomas de un pH bajo.

La microinyección se utiliza por tanto, primariamente, como un procedimiento para establecer progenies de células que transporten copias integradas del ADN de interés.

D. Procedimiento de regulación de la expresión

En otro aspecto, la presente invención considera un procedimiento para regular la expresión de un polipéptido. La expresión polipeptídica es regulada estimulando o inhibiendo la transcripción de una región codificante que codifica ese polipéptido. Según una forma de realización, un procedimiento para regular la expresión polipeptídica comprende las etapas siguientes:

(a): unir funcionalmente un potenciador-promotor sensible a la radiación, según se define en las reivindicaciones, a una región codificante que codifica este polipéptido, la cual región codificante está unida funcionalmente a una región de finalización -transcripción para formar una molécula de ADN; y

(b): exponer la molécula del ADN a una dosis de la radiación ionizante que induzca una expresión efectiva.

Una molécula de ADN que se utiliza con dicho procedimiento es una molécula de ADN de la presente invención, según se ha expuesto anteriormente.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la frase "dosis de la radiación ionizante que induzca una expresión efectiva" significa aquélla dosis de la radiación ionizante que sea necesaria para estimular o "conectar" un potenciador-promotor sensible a la radiación de la presente invención. La cantidad de radiación ionizante que se requiera en una célula dada depende inter alia de la naturaleza de esa célula. Típicamente, una dosis que induce una expresión efectiva es menor que una dosis de radiación ionizante que causa daño celular o directamente la muerte. Los medios para determinar una cantidad que induzca una expresión efectiva, son bien conocidos en la técnica.

En una forma de realización preferida una cantidad que induzca una expresión efectiva está entre 2 y 20 Gray (Gy) aproximadamente, administrados a una tasa de entre 0,5 y 2 aproximadamente Gy/minuto. Más preferentemente incluso, una cantidad que induzca una expresión efectiva de la radiación ionizante está entre 5 y 15 Gy aproximadamente.

Tal como se utiliza en la presente memoria, "radiación ionizante" significa la radiación que contiene partículas o fotones que tienen una energía suficiente o pueden producir ésta a través de interacciones nucleares, para producir ionización (ganancia o pérdida de electrones). Una radiación ionizante preferida y que puede tomarse como ejemplo, es una radiación de rayos X. En la técnica, se conocen medios para suministrar la radiación X a un tejido o célula diana.

Las células que contienen una molécula de ADN de la presente invención que codifica un polipéptido particular, expresan este polipéptido cuando se exponen a la radiación ionizante.

Como ejemplo, el tratamiento de células transfectadas con el plásmido pEgr-1 P1.2 con radiación ionizante se asoció con un aumento de 4,1 veces en la actividad de CAT, comparado con las células transfectadas pero no irradiadas. El plásmido pEgr-1 P1.2 comprende un potenciador-promotor sensible a la radiación (extendiéndose la región promotora del Egr-1 entre la posición -957 corriente arriba hasta el sitio de comienzo de la transcripción, y la posición +248) unido funcionalmente al gen informador CAT. Verdaderamente, la irradiación de las células transfectadas pE425-CAT se asoció con una inducción de 3,6 veces la actividad CAT comparada con la que existía en las células no irradiadas transfectadas con este constructo.

A continuación, se utilizó una serie de constructos del promotor Egr-1 en los que se habían llevado a cabo supresiones para definir ulteriormente los elementos sensibles a los rayos X en pE425-CAT. La deleción secuencial de los tres CArGs distales disminuyó progresivamente la actividad CAT. El plásmido pE395-CAT (primer CArG suprimido) confirió inducibilidad a los rayos X en un grado menor que pE425-CAT. La deleción del primer y segundo CArG (pE359-CAT) dio lugar a disminuciones ulteriores en la actividad CAT, mientras que la deleción de los primeros tres CArG (pE342-CAT) se asoció con aumentos mínimos en la actividad CAT.

Otros estudios se llevaron a cabo con fragmentos del promotor Egr-1 unidos a HSV-TK y el gen CAT. No existió inducibilidad detectable de pTK35CAT (que no contenía ningún dominio CArG de un promotor Egr-1) mediante los rayos X. Al contrario, las células transfectadas con el plásmido pE425/250TK (que contenía los cuatro distales CArG de Egr-1 eran sensibles al tratamiento con rayos X. La región del promotor Egr-1 que abarcaba entre las posiciones nucleótidas -395 y -250, la cual región no incluye el primer dominio CArG, fue asimismo funcional para conferir inducibilidad mediante los rayos X al promotor heterólogo, pero en un grado menor que pE425/250TK. La inducibilidad mediante los rayos X de la expresión CAT se observó también en células transfectadas con un plásmido que comprendía sólo un dominio CArG.

Mediante otro ejemplo, la expresión de la proteína TNF-\alpha fue inducida por la radiación ionizante en las células transfectadas con el plásmido pE425-TNF. Las células SQ-20B, RIT-3 y HL-525 fueron transfectadas con el plásmido pE425-TNF mediante precipitación DEAE. Las células transfectadas se expusieron a 10 Gy de radiación X con una tasa de 1 Gy/minuto. La expresión de TNF-\alpha aumentó aproximadamente 2 veces, 5 veces y 4 veces, respectivamente, en las células SQ-20B, RIT-3 y HL-525, cuando se compararon con las células transfectadas pero no irradiadas.

Mediante un ejemplo comparativo, la expresión CAT se indujo mediante radiación ionizante en las células RIT-3 transfectadas con el plásmido c-Jun-CAT, el cual plásmido comprende un segmento de 1100 pares de bases del promotor c-Jun funcionalmente unido a un gen CAT. Las células se cotransfectaron con un vector de expresión del promotor SV40-\beta galactosidasa para controlar la eficiencia de la transfección.

Los transfectantes fueron irradiados (10 Gy, 1 Gy/min, GE Maxitron) 40 horas después de la transfección. CAT se extrajo 6 horas después de la irradiación. La actividad CAT aumentó aproximadamente 3 veces después de la irradiación de las células RIT-3 transfectadas con pc-Jun-CAT. La expresión de \beta gal no fue afectada por la radiación. La radiación ionizante no aumentó la expresión de CAT en las células transfectadas con un plásmido que comprendía el promotor mínimo Jun (entre la posición -18 de las bases nucleótidas y la posición +170 de las bases nucleótidas relativa al sitio de comienzo de la transcripción) unido funcionalmente a CAT.

El conjunto de datos expuesto anteriormente muestran que la radiación ionizante puede utilizarse como un disparador para regular la transcripción de una región codificante en una molécula de ADN de la presente invención y la expresión de un polipéptido codificado por dicha región.

En una forma de realización alternativa, la expresión polipeptídida es regulada utilizando dos moléculas de ADN. Una de estas moléculas de ADN comprende un potenciador-promotor sensible a la radiación según se define en las reivindicaciones, unido funcionalmente a una región codificante que comprende:

(b): una secuencia codificante que codifica un dominio de activación o represión de un segundo factor de transcripción;

(c): una tercera secuencia codificante que codifica una señal de localización nuclear, en la cual la primera, segunda y tercera secuencias codificantes están unidas funcionalmente entre ellas en cualquier orden en un marco de lectura, con la condición de que la tercera secuencia codificante requiere estar presente, sólo si la primera o segunda secuencia codificante no codifica una señal de localización nuclear; y

Una segunda molécula de ADN comprende una región de unión que es capaz de unir el dominio de unión del primer factor de transcripción al ADN, la cual región de unión está unida funcionalmente a un promotor mínimo que está unido funcionalmente a una región codificante que codifica un polipéptido, la cual región codificante está unida funcionalmente a una región de finalización-transcripción.

Un potenciador-promotor sensible a la radiación, un factor de transcripción, un dominio de unión de un factor de transcripción y un dominio represor o de activación de un factor de transcripción, son preferentemente el conjunto anteriormente expuesto. Un polipéptido codificado por una región codificante es asimismo el mismo que se ha expuesto antes.

Las células transfectadas con dichas moléculas de ADN muestran una expresión polipeptídica inducible mediante la radiación ionizante.

Mediante un ejemplo comparativo, se transfectaron dos plásmidos en células HeLa y RIT-3 utilizando un procedimiento de precipitación cálcica. El primer plásmido (pSG424) contenía el promotor SV40 (no sensible transcripcionalmente a la radiación) situado corriente arriba de la secuencia codificante, para las regiones \delta, A1 y A2 del dominio de activación de la proteína Jun, en la que el dominio que se une al ADN de Jun se reemplazó con el dominio que se une al ADN de GAL4. Un segundo plásmido, G5BCAT, contenía la secuencia de ADN que se une a la proteína Gal4 unida a un promotor mínimo TK situado corriente arriba del gen informador CAT.

Se irradiaron células transfectadas con 10 Gy de rayos X. La actividad CAT aumentó en las células HeLa y RIT-3 transfectadas irradiadas, comparadas con las células transfectadas pero no irradiadas.

Como ejemplo, la irradiación indujo un aumento en la expresión de TNF-\alpha en las células RIT-3 transfectadas con los plásmidos pE425-Gal4/VP-16 y pG5-TNF. El plásmido pE425-Gal4/VP-16 comprende un fragmento de 491 pares de bases aproximadamente del promotor Egr-1 que contiene 6 CArG, el cual fragmento está unido funcionalmente a una región codificante que comprende una primera secuencia codificante que codifica un dominio que se une al ADN de Gal4, unida funcionalmente en el marco (de lectura) a una segunda secuencia codificante que codifica el dominio de activación de la proteína vírica VP-16. El plásmido G5-TNF comprende un segmento de ADN que se une al dominio de unión de Gal4 unido funcionalmente al promotor mínimo unido funcionalmente a una región codificante que codifica TNF-\alpha. Las células RIT-3 se cotransfectaron con los plásmidos pE425-Gal/VP16 y G5-TNF utilizando la lipofacción. Las células transfectadas se irradiaron 36 horas después de la transfección y el TNF ensayó 10 horas después de la irradiación. La concentración del TNF intracelular aumentó aproximadamente 9 veces cuando se comparó con las células transfectadas con sólo el G5-TNF.

Preferentemente, la segunda secuencia codificante codifica el dominio de represión del gen WT1 supresor del tumor de Wilms del dominio de represión de Egr-1. Un potenciador-promotor sensible a la radiación y un primer factor de transcripción, son los mismos que los expuestos anteriormente.

E. Procedimiento de inhibición del crecimiento tumoral

(a): suministrar al tumor una cantidad terapéuticamente efectiva de una molécula de ADN, que comprende un potenciador-promotor según se define en las reivindicaciones, sensible a la radiación y unido funcionalmente a una región codificante que codifica un polipéptido que tiene la capacidad de inhibir el crecimiento de la célula tumoral, la cual región codificante está unida funcionalmente a una región de finalización de la transcripción; y

(b): exponer el tumor a una dosis de la radiación ionizante que induzca una expresión efectiva.

Un potenciador-promotor sensible a la radiación comprende un dominio CArG de un promotor Egr-1 y un polipéptido que tiene la capacidad de inhibir el crecimiento celular tumoral que es una citoquina; además, un factor supresor tumoral dominante negativo, o un inhibidor de la angiogénesis. Los polipéptidos preferidos y que sirven como ejemplo son TNF-\alpha, interleuquina-4, ricina, toxina de Pseudomonas, p53, el producto génico del retinoblastoma o el producto génico del tumor de Wilms.

TNF es citotóxico para las células tumorales. En 12 progenies celulares de tumores epiteliales humanos que se analizaron en cuanto a la citotoxicidad para TNF, se encontró una interacción entre TNF y la radiación; y se encontró asimismo una acción letal sinérgica combinando los dos agentes (Hallahan, et al., 1990; Hallahan, et al, 1989). Se encontró que el TNF tenía efectos citotóxicos a concentraciones entre 10 y 1000 unidades/ml en diez de doce progenies celulares tumorales estudiadas (Hallahan, et al., 1990; Hallahan, et al, 1989). Además, se observó en siete de estas diez progenies celulares, una letalidad sinérgica o aditiva por TNF y rayos X.

Cuando las células procedentes de un tumor de células renales murinas se sometieron a técnicas de ingeniería molecular para secretar grandes dosis de interleuquina-4 (IL-4) localmente, fueron rechazadas predominantemente de forma independiente de las células T (Golumbek, et al., 1985). Sin embargo, los animales que rechazaron los tumores transfectados con IL-4 desarrollaron inmunidad sistémica dependiente de las células T para el tumor parental. Esta inmunidad sistémica fue tumor específica y mediada primariamente por las células CD8+ T. Los tumores parentales establecidos pudieron curarse mediante la respuesta inmune sistémica generada por la inyección de los tumores tratados con técnicas de ingeniería genética. Estos resultados proporcionaron una base teórica para utilizar células tumorales transfectadas génicamente con linfoquinas que se activan mediante irradiación, como una modalidad para la terapia del cáncer.

La ricina es una citotoxina que inactiva los ribosomas de mamíferos catalizando la división del enlace N-glicosídico del rARN 28S (Endo & Tsurngi, 1987). Esta enzima es extremadamente tóxica cuando se administra sistémicamente, pero puede localizarse en los tumores mediante la radiación diana del gen que codifica la ricina.

El gen alfa del tipo factor transformante de crecimiento se ha fusionado con el gen de la toxina de Pseudomonas, a partir del cual se ha suprimido el dominio de reconocimiento celular (Chaudhary et al., 1987). El gen quimérico se ha expresado en Escherichia coli, y la proteína quimérica, PE40-TGF-alfa, se ha purificado mucho. PE40-TGF-alfa elimina a las células que expresan receptores del factor epidérmico de crecimiento y tiene poca actividad contra células con pocos receptores. Esta proteína quimérica podría ser útil para tratar cánceres que contengan abundantes receptores del factor epidérmico de crecimiento. El gen que codifica la toxina de Pseudomonas o su quimérico, puede ser dirigida por la radiación para eliminar las secuelas sistémicas potenciales de esta toxina.

Suministrar es inyectar preferentemente la molécula de ADN en el tumor. Si éste se encuentra en un individuo, suministrar se refiere a administrar preferentemente la molécula de ADN al sistema circulatorio del individuo. En una forma de realización más preferida, la administración comprende las etapas siguientes:

(a): proporcionar un vehículo que contenga la molécula de ADN; y

(b): administrar el vehículo al individuo.

Un vehículo es preferentemente una célula transformada o transfectada con la molécula de ADN, o una célula transfectada derivada de dicha célula transformada o transfectada. Una célula transfectada o transformada preferida y que se puede tomar como ejemplo es un leucocito tal como un linfocito infiltrante tumoral o una célula T o una célula tumoral procedente del tumor que se está tratando. Los medios para transformar o transfectar una célula con una molécula de ADN de la presente invención se han expuesto anteriormente.

Los linfocitos humanos pueden ser transfectados asimismo con constructos plasmídicos que induzcan la radiación, utilizando la tecnología existente, que incluye la transferencia génica mediada retrovíricamente (Overell, et al., 1991; Fauser, 1991). En una forma de realización ejemplar, las células LAK que tienden, como es conocido, a albergarse en el sitio tumoral en cuestión con alguna preferencia, también se distribuyen en el organismo en otras localizaciones, y pueden utilizarse para localizar tumores. Verdaderamente, una de las ventajas más importantes del sistema inducible de la radiación es que sólo aquéllas células LAK que se encuentren en el campo de radiación, serán activadas y activarán asimismo sus genes linfoquínicos exógenamente introducidos. De este modo, para el caso de las células LAK, no existe una necesidad particular de una ulterior dirección (para localizar el tumor).

Alternativamente, el vehículo es un virus o un anticuerpo que infecta específicamente o reacciona inmunológicamente con un antígeno del tumor. Los retrovirus utilizados para suministrar los constructos a los tejidos diana del huésped, son generalmente virus en los que se ha inactivado la 3' LTR (región de transferencia lineal). Es decir, existen 3'LTR's menos potenciadoras, a las que a menudo se hace referencia como SIN (virus que se auto-inactivan), a causa de que después de una infección productiva en la célula huésped, la 3'LTR se transfiere al extremo 5' y ambas LTR's víricas son inactivas respecto a la actividad transcripcional. Una utilización de estos virus bien conocida por los expertos en la materia, es clonar genes para los que los elementos reguladores del gen clonado se insertan en el espacio entre las dos LTR's. Una ventaja de un sistema de infección vírico es que permite un nivel muy alto de infección en la célula receptora apropiada, por ejemplo, las células LAK.

A efectos de la presente invención, un potenciador-promotor según se define en las reivindicaciones, sensible a la radiación, que se encuentra en el extremo 5' de la región codificante apropiada, puede clonarse en el virus, utilizando técnicas estándar bien conocidas en la técnica.

Los constructos víricos se suministran a un huésped mediante cualquier procedimiento que haga que los constructos alcancen las células del tejido diana, mientras se conserven las características del constructo utilizado en la presente invención. Como ejemplo, una progenie celular de glioma de rata, C6-BU-1, mostró susceptibilidades distintas al virus del herpes simple de tipo 1 (HSV-1) y al tipo 2 (HSV-2), y principalmente, todas las cepas HSV-1 ensayadas persistieron en esta progenie celular, pero no lo hicieron así las cepas HSV-2 (Sakihama, et al., 1991). Las células C6-BU-1 están formadas por subpoblaciones heterogéneas en cuanto a susceptibilidad al HSV-1, que puede ser posiblemente intercambiable. Además, el crecimiento de tumores producidos a partir de las células derivadas de C6 que transportaban el gen HSV-1 tk, pero no las células C6 parentales, pudieron ser inhibidas mediante la administración intraperitoneal de ganciclovir (Ezzeddine, et al., 1991). Este trabajo demostró la efectividad de la timidina quinasa expresada por el gen HSV-1 tk para sensibilizar las células tumorales cerebrales a los efectos tóxicos de los análogos nucleósidos. Los vectores retrovíricos podrían de este modo demostrarse útiles en el suministro selectivo de este gen asesino para dividir las células tumorales en el sistema nervioso, en el que la mayoría de las células endógenas no se dividen. La radiación se utilizará para potenciar la especificidad del suministro o activación de la transcripción del gen tk sólo en las áreas irradiadas.

Los anticuerpos se han utilizado para dirigir y suministrar moléculas de ADN. Un conjugado anticuerpo-poly(L-lisina)(NPLL) modificado en el extremo N, forma fácilmente un complejo con el ADN plasmídico (Trubetskoy et al., 1992). Un complejo de anticuerpos monoclonales contra una trombomodulina superficial celular conjugada con NPLL se utilizó para dirigir un ADN plasmídico extraño, a un pulmón de ratón y a una progenie celular endotelial pulmonar de ratón que exprese un antígeno. Las células endoteliales dirigidas expresaron el producto codificado por aquél ADN extraño.

(a): proporcionar un anticuerpo marcado radioactivamente que reaccione inmunológicamente con un antígeno tumoral; y

(b): suministrar una inducción de una expresión efectiva del anticuerpo marcado radioactivamente al tumor.

La eficacia de utilizar anticuerpos para dirigir la radioterapia se ha demostrado, incluyendo el modelo de dosis para el tumor y el tejido normal a partir de radioinmunoterapia intraperitoneal con emisores alfa y beta^{4}. Esta tecnología se ha aplicado a experimentos in vivo. Astatine-211 labeling of an antimelanoma antibody and its Fab fragment using N-succinimidyl p-astatobenzoate; comparison in vivo with the p-(125)iodobenzoyl conjugate^{5}.

Alternativamente, un procedimiento para la inhibición del crecimiento de un tumor comprende las etapas siguientes:

(a): suministrar al tumor una cantidad terapéuticamente efectiva de:

(1): una primera molécula de ADN que comprende un potenciador-promotor según se define en las reivindicaciones, sensible a la radiación, unido funcionalmente a una región codificante que comprende

(ii): una secuencia codificante que codifica un dominio de activación o represión de un segundo factor de transcripción;

(iii): una tercera secuencia codificante que codifica una señal de localización nuclear, en la cual región codificante la primera, segunda y tercera secuencias codificantes están unidas funcionalmente entre ellas en cualquier orden en un marco de lectura, con la condición de que la tercera secuencia codificante requiere estar presente, sólo si la primera o segunda secuencia codificante no codifica una señal de localización nuclear; y

(2): una segunda molécula de ADN que comprende una región de unión que es capaz de unir el dominio de unión del primer factor de transcripción al ADN, la cual región de unión está unida funcionalmente a un promotor mínimo que está unido funcionalmente a una región codificante que codifica un polipéptido con actividad citotóxica celular tumoral, la cual región codificante está unida funcionalmente a una región de finalización-transcripción; y

(b): exponer la célula a una dosis de radiación ionizante que induzca una expresión efectiva.

Un potenciador-promotor sensible a la radiación comprende un dominio CArG de un promotor Egr-1 y un polipéptido que tiene actividad citotóxica celular tumoral y que es una citoquina, un factor supresor tumoral dominante negativo, o un inhibidor de la angiogénesis, tal como se ha expuesto anteriormente.

El suministro es preferentemente el mismo que se ha expuesto anteriormente.

TNF-\alpha aumenta después de tratamiento con rayos X en ciertas células de sarcoma humano. El aumento en el ARNm TNF-\alpha se acompaña por una producción aumentada de la proteína TNF-\alpha. La inducción de una proteína citotóxica mediante exposición de las células que contienen el gen TNF a los rayos X, se sospechó cuando se encontró que el medio decantado de cultivos irradiados de algunas progenies celulares de sarcoma humano, era citotóxico para aquéllas células, así como para otras progenies celulares tumorales. El nivel de TNF-\alpha en los cultivos tumorales irradiados se elevó por encima del de las células no irradiadas, cuando se analizó mediante la técnica ELISA (Sariban, et al., 1988). Investigaciones posteriores mostraron que la proteína TNF-\alpha, elevada después de la irradiación, potencia la mortalidad celular debido a los rayos X, mediante un mecanismo inusual previamente no descrito (véase el Ejemplo 1 comparativo).

El ARN de las células no tratadas (control) y de las células irradiadas se fraccionó en cuanto a tamaño, hidridizándose a TNF-\alpha ADNc marcado con P^{32} (STSAR-13) y al plásmido PE4 que contenía TNF-\alpha ADNc (STSAR-48). Los autoradiogramas mostraron una expresión aumentada de ARNm TNF-\alpha 3 horas después de irradiación en la progenie celular STSAR-13 y a las 6 horas en la progenie celular STSAR-48. Estos datos muestran que la expresión del gen TNF-\alpha aumenta después de la radiación.

La Figura 1 exhibe la influencia de TNF-\alpha sobre la letalidad de la radiación de los sarcomas humanos que producen TNF-\alpha y de las células tumorales humanas que no producen TNF-\alpha. Las líneas continuas indican los efectos de sólo la radiación, y las líneas no continuas indican los efectos de TNF-\alpha y de la irradiación. Los datos representativos de la supervivencia para la progenie celular STSAR-33 se muestran en la gráfica a la izquierda, A. La línea continua inferior representa la supervivencia de células con TNF-\alpha a 1000 unidades/ml, corregido para una eficiencia de sembrado (PE) del 30%. La supervivencia de las células tumorales epiteliales humanas(SQ-20B) irradiadas con TNF-\alpha (10 unidades/ml y 1000 unidades/ml) se muestra en la gráfica de en medio, B. Los datos de supervivencia para SQ-20B muestran un efecto aditivo de TNF-\alpha (1000 unidades/ml). Las supervivencias con TNF-\alpha se corrigen para una letalidad del 85% con TNF-\alpha sólo. Los datos de supervivencia a la radiación para HNSCC-68 se muestran en la gráfica a la derecha, C. Una dosis no letal de TNF-\alpha (10 unidades/ml)se añadió 24 horas antes de la irradiación.

Como puede apreciarse a partir de estos resultados y a partir de la información que se consideró en el Ejemplo Comparativo 1, el factor \alpha de necrosis tumoral aumenta después del tratamiento con los rayos X. Tanto el ARNm como las proteínas TNF-\alpha aumentaron.

Aunque se ha observado que los agentes que dañan al ADN distintos a la radiación ionizante inducen una expresión variable de los genes de mamíferos y procarióticos, el gen TNF-\alpha es el primer gen de mamífero que se ha encontrado que muestra un aumento de la expresión después de exponerlo a la radiación ionizante. Este gen no está categorizado como un gen de reparación del ADN.

Una molécula de ADN de la presente invención tiene otras utilizaciones además de la inhibición del crecimiento tumoral. A continuación, en la Tabla 3, se sumarizan dichos usos ejemplares.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 3

3

Los ejemplos siguientes ilustran formas de realización particulares de la presente invención no limitando en modo alguno ni la exposición ni las reivindicaciones.

Ejemplo comparativo 1

Aumento del ARNm Factor de necrosis tumoral-\alpha después de exposición celular a la radiación ionizante A. Productos proteicos

Para investigar la producción de la proteína TNF-\alpha después de la irradiación con rayos X, se cuantificaron mediante la técnica ELISA los niveles de TNF-\alpha en el medio de las progenies celulares tumorales humanas y de los fibroblastos (Sariban, et al., 1988) antes y después de la exposición a 500-cGy rayos X. Cinco de las trece progenies celulares de sarcoma de tejido blando y óseo humanos (STSAR-5, -13, -33, -43, y -48) liberaron TNF-\alpha al medio después de irradiación, mientras que los niveles de TNF-\alpha no estaban elevados en el sobrenadante de progenies celulares fibroblásticas humanas normales (GM-1522 y NHF-235) y de cuatro progenies celulares tumorales epiteliales humanas (HN-SCC-68, SCC-61, SCC-25, y SQ-20B) después de exposición a la radiación. El ensayo mide de forma segura los niveles de TNF-\alpha entre 0,1 y 2,0 unidades por ml (2,3 x 10^{6} unidades/mg) (Saribon, et al., 1988). La progenie celular tumoral STSAR-13 produjo cantidades indetectables de TNF-\alpha antes de la irradiación con rayos X y de 0,35 unidades/ml después de la exposición a los rayos X. Las progenies celulares STSAR-5 y -33 respondieron a la irradiación de rayos X con aumentos en las concentraciones de TNF-\alpha de > 5 a 10 veces; sin embargo, cantidades superiores a 2 unidades/ml superaron el intervalo del ensayo (Saribon, et al., 1988). Las progenies celulares STSAR-43 y -48 demostraron aumentos en TNF-\alpha de 1,5 a 3 veces (Tabla 4, a continuación). La proteína TNF-\alpha en el medio se elevó primero las 20 horas después de tratamiento con los rayos X, alcanzó niveles máximos a los 3 días, y éstos permanecieron elevados más allá de 5 días. Además, el sobrenadante de la progenie celular STSAR-33 irradiada pero no de control, fue citoxóxico para la progenie celular SQ-20B sensible a TNF-\alpha.

TABLA 4 Nivel de TNF-\alpha (unidades/ml)

4

Los niveles de TNF-\alpha se midieron en el medio a partir de cultivos celulares confluentes (control) y en células confluentes irradiadas (rayos X). Los niveles de TNF-\alpha aumentaron, tal como se midió mediante la técnica ELISA. MFH, histiocitoma fibroso maligno.

B. Análisis del ARN

Se detectaron niveles aumentados de ARNm TNF-\alpha en las progenies celulares de sarcoma que producían TNF-\alpha después de irradiación, respecto a los controles no irradiados. Por ejemplo, transcritos de TNF-\alpha estaban presentes en las progenies celulares STSAR-13 y -48 no irradiadas. Los niveles de ARNm TNF-\alpha en la progenie celular STSAR-13 aumentó en 2,5 veces, medido mediante densitometría 3 horas después de la exposición a 500 cGy, declinando entonces a niveles basales en 6 horas. Estos transcritos aumentaron a las 6 horas después de la irradiación en la progenie celular STSAR-48, indicando de este modo alguna heterogeneidad entre progenies celulares en términos de la cinética de la expresión del gen TNF-\alpha. Al contrario, la irradiación no tuvo un efecto detectable sobre los niveles de 7S ARN o en la expresión del gen de la \beta polimerasa.

C. Interacción entre TNF-\alpha y la irradiación de rayos X

Para investigar la influencia de TNF-\alpha sobre la citotoxicidad inducida por la radiación en las progenies celulares que producen TNF-\alpha, se añadió a los cultivos antes de la irradiación, TNF-\alpha humano recombinante. El TNF-\alpha humano recombinante (1000 unidades/ml) (2,3 x 10^{6} unidades/mg) fue citotóxico para cuatro de los cinco sarcomas que producían TNF-\alpha (STSAR-5, -13, -33, y -43). La eficiencia de sembrado (PE) se redujo entre un 60 y 90% a 1000 unidades/ml en estas progenies. El análisis de la supervivencia a la radiación de la progenie celular STSAR-33 se llevó a cabo con TNF-\alpha (10 unidades/ml). La sensibilidad a la radiación (D_{0}), definida como el inverso de la pendiente terminal de las curvas de supervivencia fue de 80,4 cGy para la progenie celular STSAR-33. Cuando se añadió TNF-\alpha 20 horas antes de la irradiación, la D_{0} fue de 60,4 cGy. Las fracciones que sobrevivieron se corrigieron respecto a la PE reducida con TNF-\alpha. Así, la interacción entre TNF-\alpha y la radiación en las células STSAR-33 fue sinérgica (Dewey, 1979).

Concentraciones subletales de TNF-\alpha (10 unidades/ml) potenciaron la muerte por irradiación en la progenie celular STSAR-33, sugiriendo un efecto de radiosensibilización de TNF-\alpha. La fracción superviviente de la progenie celular STSAR-5 entre 100 y 700 cGy fue más baja que lo esperado por la muerte independiente de TNF-\alpha y los rayos X, aunque los valores D_{0} eran similares. Así, la interacción entre TNF-\alpha y la radiación es aditiva (Dewey, 1979) en las células STSAR-5. Las progenies celulares STSAR-13 y STSAR-43 fueron eliminadas independientemente con los rayos X y TNF-\alpha, no observándose interacción.

Para determinar las posibles interacciones entre TNF-\alpha y los rayos X en células no productoras de TNF-\alpha, se irradiaron células tumorales epiteliales humanas (SQ-20B y HNSCC-68) 20 horas después de que se añadiera TNF-\alpha. Estas progenies celulares no producen TNF-\alpha en respuesta a la radiación ionizante. TNF-\alpha (1000 unidades/ml) fue citotóxico para las células SQ-20B SCC-61, reduciendo el PE entre un 60 y 80%. La D_{0} para la progenie celular SQ-20B es de 239 cGy. Con TNF-\alpha (1000 unidades/ml) añadido 24 horas antes de los rayos X, la D_{0} fue de 130,4 cGy. Por tanto, se demostró una interacción sinérgica (Dewey, 1979) entre TNF-\alpha y los rayos X en esta progenie celular. El TNF-\alpha añadido después de la irradiación, no potenció la muerte celular por la radiación en las progenies celulares SQ-10B. Concentraciones no letales de TNF-\alpha (10 unidades/ml) dieron lugar a muertes potenciadas por la radiación en la progenie celular HNSCC-68, proporcionando evidencia de que TNF-\alpha puede sensibilizar algunas progenies celulares tumorales, tanto mensenquimáticas como epiteliales, a la radiación.

Los siguientes procedimientos específicos se utilizaron en el Ejemplo Comparativo 1.

Progenies celulares. Se han descrito procedimiento de establecimiento de progenies celulares epiteliales y de sarcoma humano (Weichselbaum, et al., 1986; 1988). El medio de cultivo para las células tumorales epiteliales fue el de Eagle modificado por Dulbecco al 72,5%/22,5% de mezcla F-12 nutricia de Ham (DMEM/F-12 (3:1) suero bovino fetal al 5% (FBS), transferrina a 5 \mug/ml/10^{-10} M toxina colérica/1,8 x 10^{-4} M adenina, hidrocortisona a 0,4 \mug/ml/2 x 10^{-11} M triyodo-L-tironina/penicilina a 100 unidades/ml/estreptomicina a 100 \mug/ml.

El medio de cultivo para las células del sarcoma fue DMEM/F-12 (3:1)/20% FBS, penicilina a 100 unidades/ml/ estreptomicina a 100 \mug/ml.

Ensayo de la proteína TNF-\alpha. Células del sarcoma humano se cultivaron tal como se ha descrito anteriormente y se dejaron crecer hasta confluencia. El medio se analizó respecto a TNF-\alpha 3 días después de llevar a cabo su suministro, y otra vez entre 1 y 3 días después de irradiación. Trece progenies celulares del sarcoma humano establecido se irradiaron con 500 centigray (cGy) de rayos X con un generador Maxitron de 250 kV (Weichselbaum, et al., 1988). Se midió el TNF-\alpha mediante ELISA con dos anticuerpos monoclonales que tenían epítopos distintos para la proteína TNF-\alpha (Sariban et al., 1988); el ensayo detecta TNF-\alpha entre 0,1 y 2,0 unidades/ml.

Aislamiento del ARN y su análisis de transferencia. El ARN celular total se aisló a partir de células utilizando el procedimiento del cloruro de litio-tiocianato de guanidina (Cathala, et al., 1983). El ARN se fraccionó por tamaños mediante electroforesis en gel de agarosa al 1%-formaldehído, se transfirió a membranas de nylon (GeneScreenPlus, New England Nuclear), se hibridizó tal como se ha descrito previamente, al fragmento BamHI de 1,7 kilobases (kb) del plásmido PE4 que contenía TNF-\alpha ADNc (19, 23), y se autoradiografió durante 16 días a -85ºC con pantallas de intensificación. También se hibridizaron transferencias Northern a 7S ARNr y plásmidos \beta-polimerasa, tal como se describe (Fornace, et al., 1989). La tinción con bromuro de etidio reveló cantidades iguales de ARN aplicadas a cada carril. La hibridización de transferencia ARN del TNF-\alpha se analizó después de irradiación celular con 500 cGy. Las células se lavaron con solución salina fría tamponada de fosfato y se situaron en hielo en cada intervalo de tiempo. El ARN se aisló a 3, 6, y 12 horas después de la irradiación.

Irradiación con rayos X y TNF-\alpha. Células que crecían exponencialmente se irradiaron utilizando un generador de rayos X de 250 kV. El ensayo formador de coloniasse utilizó para determinar la supervivencia celular (Weichselbaum, et al., 1988). Las curvas de supervivencia de modelo multidiana se ajustaron a un modelo multidiana de un único acierto (S = 1-(-e^{D/D0,n}). Concentraciones del TNF-\alpha humano recombinante (10 unidades/ml) (2:3 x 10^{6} unidades/mg) y (1000 unidades/ml) (Asahi Chemical, New York), se añadieron 24 horas antes de la irradiación.

Ejemplo comparativo 2

Aumento de la expresión de c-Jun después de la exposición a la radiación ionizante

Otra molécula comparativa del ADN deriva del protooncogén c-Jun y de genes relacionados. La radiación ionizante regula la expresión del protooncogén c-Jun y también de los genes relacionados c-fos y Jun-B. El producto proteico de c-Jun contiene una región que se une al ADN que está compartida por miembros de una familia de factores de transcripción. El nivel de expresión después de la radiación depende de la dosis. El gen c-Jun codifica un componente del complejo proteico AP-1 y es importante en los eventos tempranos de señalización implicados en varias funciones celulares. AP-1, el producto del protooncogén c-Jun reconoce y se une a secuencias específicas de ADN y estimula la transcripción de genes sensibles a ciertos factores de crecimiento y ésteres de forbol (Bohmann, et al., 1987; Angel, et al., 1988). El producto del protooncogén c-Jun contiene un dominio que se une al ADN muy conservado que es compartido por una familia de factores de transcripción de mamíferos que incluyen Jun-B, Jun-D, c-fos, fos-B, fra-1 y la proteína GCN4 de la levadura.

Además de regular la expresión del gen c-Jun, los transcritos c-Jun son degradados postranscripcionalmente por una proteína lábil en las células irradiadas. La regulación postranscripcional de la expresión génica se describe en Sherman et al., 1990.

Contrariamente a lo que se esperaría basándose en un previo daño al ADN y en las tasas de mortalidad para otros agentes, la disminución de la tasa de la dosis, por ejemplo, desde 14,3 Gy/min a 0,67 Gy/min, se asoció con un aumento de la inducción de los transcritos de c-Jun.

Los niveles máximos de ARNm c-Jun fueron detectables después de 50 Gy de radiación ionizante. Cinéticas similares de la inducción de c-Jun se observaron en células leucémicas monocíticas U-937 humanas irradiadas y en fibroblastos diploides AG-1522 humanos normales. El tratamiento de las células AG-1522 con radiación ionizante se asoció asimismo con la aparición de un transcrito menor de c-Jun, de 3,2 kb.

Los procedimientos siguientes se utilizaron en el Ejemplo Comparativo 2.

Cultivo celular. Células leucémicas promielocíticas humanas HL-60, célulasleucémicas monocíticas U-397 (ambas del American Type Culture Collection), y fibroblastos prepuciales diploides AG-1522 (National Institute of Aging Cell Repository, Camden, NJ), se hicieron crecer de forma estándar. Las células se irradiaron utilizando un acelerador Philips RT 250 a 250 kV y 14 mA, equipado con un filtro Cu de 0,35-mm, o una célula Gamma 1000 (Atomic Energy of Canada, Ottawa), con una fuente de Cs^{137} que emitía a una tasa establecida de dosificación de 14,3 Gy/min, como se determinó mediante dosimetría. Las células de control se expusieron a las mismas condiciones, pero no se irradiaron.

Análisis de transferencia Northern. Se aisló el ARN celular total tal como se describe (29). Se separó el ARN (20 \mug por carril) en un gel de agarosa/formaldehído, se transfirió a un filtro de nitrocelulosa, y se hibridizó con las siguientes sondas de ADN marcadas con P^{32}: (i) la BamHI/EcoRI c-Jun ADNc de 1,8 kilobases (kb) (30); (ii) la ScaI/Nco I c-fos ADN de 0,91 kb, formada por los exones 3 y 4 (31); (iii) el EcoRI Jun-B ADNc de 1,8 kb aislado del plásmido p465.20 (32); y (iv) el PstI \beta actina ADNc de 2,0 kb purificado a partir de pA1 (33). Los autoradiogramas se rastrearon utilizando un densitómetro láser LKB UltroScan XL y se analizaron utilizando el empaquetamiento de software LKB GelScan XL. La intensidad de la hibridización de c-Jun se normalizó respecto a la expresión de la \beta-actina.

Análisis transcripcional del procesado. Células HL-60 se trataron con radiación ionizante y los núcleos se aislaron después de 3 horas. Transcritos de ARN marcado con P^{32} alargados n de nuevo, se hibridizaron a ADNs plasmídicos que contenían varios insertos clonados después de digestión con endonucleasas de restricción, de la siguiente forma: (i) el fragmento Pst I de 2,0 kb del plásmido pA1 de la \beta-actina del pollo (control positivo); (ii) el inserto BamHI de 1,1 kb del gen de la \beta-globina humana (control negativo); y (iii) el fragmento BamHI/EcoRI de 1,8 kb del ADNc c-Jun humano del plásmido pBluescript SK(+). El ADN digerido se procesó en un gel de agarosa al 1% y se transfirió a filtros de nitrocelulosa mediante el procedimiento Southern. Se llevó a cabo la hibridización con 10^{7} cpm de ARN marcado con P^{32} por ml de tampón de hibridización durante 72 horas a 42ºC. Se realizó la autoradiografía durante 3 días y los autoradiogramas se rastrearon como ya se ha descrito previamente.

Ejemplo 1 Transcripción inducida por la radiación de Jun y de Egr-1

Existió una expresión aumentada del ARNm para distintos tipos de respuesta temprana inmediata a genes de la radiación (Jun, Egr-1), entre las 0,5 y las 3 horas después de la irradiación celular con rayos X. La preincubación con la cicloheximida se asoció con la superinducción de Jun y de Egr-1 en las células irradiadas con rayos X. La inhibición de la actividad de la proteína quinasa C (PKC) por la estimulación prolongada con TPA o del inhibidor H7 de la proteína quinasa antes de la irradiación, atenuó el aumento en los transcritos Egr-1 y Jun. Estos datos implicaron a Egr-1 y Jun como transductores de señales durante la respuesta celular a la alteración producida por la radiación y sugirió que este efecto es mediado en parte por una vía dependiente de la proteína quinasa C (PKC).

Los homodímeros Jun y los heterodímeros Jun/fos regulan la transcripción mediante la unión a sitios AP1 en ciertas regiones promotoras (Curran y Franza, 1988). Que los genes Jun y fos sean inducidos después de la exposición a los rayos X en las células de leucemia mieloide humana, sugiere que transductores de la señal nuclear participan en la respuesta celular a la radiación ionizante.

Los genes Egr-1 y Jun se expresan rápida y transitoriamente en ausencia de una síntesis proteica de novo después de la exposición a la radiación ionizante. Egr-1 y Jun están más probablemente implicados en la transducción de la señal después de una irradiación con rayos X. La regulación a la baja de PKC mediante TPA y H7 se asocia con la atenuación de la inducción del gen Jun y Egr-1 mediante la radiación ionizante, implicando la activación de PKC y la inducción subsiguiente de los genes Egr-1 y Jun como eventos de señalización que inicien la respuesta fenotípica de la célula del mamífero al daño producido por la radiación ionizante.

El ARN de control de las células no irradiadas demostró niveles bajos pero detectables de los transcritos Egr-1 jun. Al contrario, la expresión de Egr-1 aumentó de forma dependiente de la dosis en las células irradiadas. Los niveles eran escasos pero detectables después de 3 Gy y aumentaron de forma dependiente de la dosis después de 10 y 20 Gy. Se utilizaron veinte Gy en experimentos que examinaban el curso del tiempo de la expresión génica, de forma que los transcritos eran fácilmente detectables. Las células permanecieron viables tal como se determinó mediante la exclusión del colorante azul tripán durante este tiempo. Se observó un aumento dependiente del tiempo en los niveles de Egr-1 y ARNm Jun. Las células SQ-20B demostraron aumentos coordinados en la expresión de Egr-1 y Jun a los 30 minutos después de la irradiación, que disminuyó hasta niveles de base en el intervalo de 3 horas. Al contrario, los niveles del transcrito de Egr-1 aumentaron respecto a los basales a las 3 horas, mientras Jun aumentó en una hora y volvió a los valores basales a las 3 horas en AG1522. Los niveles de Jun aumentaron a las 6 horas en las células 293, mientras Egr-1 aumentó a las 3 horas y volvió a los niveles basales a las 6 horas.

Para determinar si Egr-1 y Jun participaron como genes tempranos inmediatos después de la irradiación con los rayos X, los efectos de la inhibición de la síntesis proteica mediante la cicloheximida se estudiaron en las progenies celulares 293 y SQ-20B después de la exposición a los rayos X. El tratamiento con cicloheximida sola dio lugar a un aumento escaso pero detectable en los transcritos de Egr-1 y Jun normalizados a 7S. En ausencia de CHI, el nivel de la expresión de Egr-1 y Jun volvió a los niveles basales. Al contrario, las células SQ-20B pretratadas con CHI demostraron una elevación persistente de Egr-1 a las 3 horas, y las células 293 demostraron una elevación persistente del ARNm Jun a las 6 horas después de la irradiación, indicando de este modo la superinducción de estos transcritos.

Los niveles de ARNm de los factores de transcripción Egr-1 y Jun aumentaron después de la exposición a la radiación ionizante de una forma dependiente del tiempo y de la dosis. La importancia potencial de la inducción de Egr-1 y Jun mediante la radiación ionizante se ilustra por el hallazgo reciente de que inducción por los rayos X de la cadena PDGF\alpha estimula la proliferación de las células endoteliales vasculares (Witte et al., 1989). PDGF tiene de unión de AP-1 y Egr-1, mientras que TNF presenta unos elementos similares a secuencias diana de AP-1 y Egr-1 (Rorsman, et al., 1989; Economou, et al., 1989). La inducción por los rayos X de PDGF y TNF está regulada probablemente por Egr-1 y Jun.

El siguiente es un procedimiento utilizado en el Ejemplo 1:

Inhibidores de la quinasa

La progenie celular SQ-20B fue pretratada con 1 \muM TPA durante 40 horas para regular a la baja PKC, estimulándose entonces con TPA, suero, o rayos X (20 Gy). Los controles incluyeron rayos X sin pretratamiento con TPA, TPA (50 nM) sin pretratamiento con TPA y células no tratadas. Se aisló ARN después de una hora y se hibridizó a Egr-1. Las células SQ-20B se preincubaron con 100 \muM de H7 (1-(5-isoquinolinilsulfonil)-2-metil piperazina) o 100 \muM de HA1004 (N-(2-metil-amino)etil)-5-isoquinolinasulfonamida) (Seikagaku America, Inc., St. Petersberg, FL) durante 30 minutos o pretratadas con TPA (1 \muM) durante 40 horas y seguido por exposición a 20 Gy de irradiación con rayos X. Se extrajo el ARN una hora después de la irradiación. Las células de control positivo tratadas bajo las mismas condiciones pero en ausencia del inhibidor, recibieron también 20 Gy, mientras que las células de control negativo no recibieron ni H7 ni rayos X. Se extrajo el ARNm una hora después de los 20 Gy sin inhibidor. Se hibridizaron transferencias Northern a Egr-1 o 7S. Las células 293 pretratadas con los inhibidores recién mencionados, se irradiaron, se extrajo el ARN después de 3 horas y la transferencia Northern se hibridizó a las sondas Jun y 7S.

Ejemplo 2 La radiación ionizante activa la transcripción del gen Egr-1 a través de los CArG

La respuesta celular a la radiación ionizante incluye la detención del crecimiento ciclo-específico celular, la activación de los mecanismos de reparación del ADN y la subsiguiente proliferación de células supervivientes. Sin embargo, los acontecimientos responsables del control de esta respuesta no están claros. Estudios recientes han demostrado que la exposición a la radiación ionizante está asociada con la activación de ciertos genes temprano-inmediatos que codifican factores de transcripción. Estos incluyen miembros de las familias de genes Jun/fos y de la respuesta temprana al crecimiento (Egr) (Sherman et al., 1990; Hallahan, et al, 1991). Otros estudios han demostrado que los rayos X inducen la expresión y la actividad de unión del ADN del factor nuclear \kappaB (NF-\kappaB; Brach, et al., 1991).

La activación de estos factores de transcripción puede representar la transducción de señales nucleares tempranas a cambios a más largo plazo en la expresión génica, que constituyen la respuesta a la radiación ionizante. En este contexto, la irradiación de diversos tipos celulares se asocia asimismo con el aumento en la expresión de los genes de TNF, PDGF, FGF y de la interleuquina-1 (Hallahan et al., 1989; Witte, et al., 1989; Woloschak, et al,. 1990; Sherman, et al., 1991). La expresión de las citoquinas puede concebirse como implicada en la reparación y repoblación asociada con el daño inducido mediante los rayos X a los tejidos, y puede explicar algunos de los efectos de la radiación ionizante en los organismos (Hall, 1988). Además, es posible que los factores de transcripción temprano-inmediata sirvan para inducir estos cambios en la expresión génica.

Los presentes estudios se refieren a los mecanismos responsables de la activación inducida por los rayos X del gen Egr-1 (también conocido como zif/268, TIS-8, NFGI-A y Krox-24; Sukhatme, et al, 1988; Christy, et al., 1988; Milbrandt, 1987; Lemaire, et al., 1988; Lim et al., 1987). El gen Egr-1 codifica una fosfoproteína nuclear de 533 aminoácidos con un dominio de dedos de zinc Cys_{2}-His_{2} que es parcialmente homólogo para el dominio correspondiente en el gen de susceptibilidad para el tumor de Wilms (Gessler, 1990). La proteína de Egr-1 se une a la secuencia CGCCCCCGC del ADN de una forma zinc dependiente y funciona como un regulador de la transcripción génica (Christy, et al, 1989; Cao, et al., 1990; Gupta, et al, 1991). Tanto las señalas mitogénicas como las de diferenciación han mostrado que inducen la expresión transitoria y rápida de Egr-1 en diversos tipos celulares. Por ejemplo, el gen Egr-1 es inducido después de estimulación mitogénica de células BAlb/c-3T3 por el suero, PDGF o FGF (Lau, et al, 1987; Sukhatme, et al., 1987). El gen Egr-1 es inducido asimismo durante: 1) diferenciación cardíaca y neuronal de la progenie EC pluripotente (Sukhatme, et al., 1988); y 2) diferenciación monocítica de las progenies celulares leucémicas mieloides humanas (Kharbanda, et al,. 1991; Bernstein, et al., 1991). Mientras que la transcripción de Egr-1 se activa por la actividad de la proteína tirosina quinasa de v-src y v-fps (Gius, et al., 1990; Christy, et al., 1989; Homma, et al., 1986), trabajos adicionales indican que la actividad serina/treonina quinasa de c-raf 1 está implicada asimismo en la mediación de la inducibilidad de este gen (Chirgwin, et al., 1979). Otros estudios han demostrado que la inducción de la expresión de Egr-1 es similar a la de c-fos en muchas situaciones y que esta regulación coordinada es mediada por la presencia de elementos de respuesta sérica en ambos promotores (Sukhatme, et al., 1988; Cleveland, et al,. 1980; Wilson, et al, 1978).

Aunque trabajos previos han demostrado que el tratamiento con las radiaciones ionizantes está asociado con aumentos en los niveles de ARNm Egr-1 (Hallahan, et al., 1991), los mecanismos responsables de este efecto no están claros. Los presentes estudios demuestran que los rayos X activan la transcripción del gen Egr-1. La repuesta sérica o el dominio CArG o los (CC(A/T)_{6}GG) en el promotor 5' del gen Egr-1 son funcionales en esta respuesta. Este es el primer informe de secuencias específicas de ADN que están implicadas en la regulación de la transcripción génica mediante la radiación ionizante.

Un escaso pero detectable nivel de transcritos de Egr-1 de 3,4-kb se encontraban en las células HL-525 no tratadas. Al contrario, el tratamiento con la radiación ionizante se asoció con un aumento en la expresión de Egr-1 que fue detectable en 1 hora. Los aumentos máximos (18 veces) en los niveles de ARNm Egr-1 se obtuvieron a las 3 horas, mientras que intervalos más largos se asociaron con la regulación a la baja de una manera más próxima que en las células de control. Esta inducción transitoria de la expresión de Egr-1 tuvo lugar en ausencia de cambios significativos en los niveles de ARNm actina.

Los ensayos del procesamiento nuclear se llevaron a cabo para determinar si los aumentos inducidos por los rayos X en los transcritos de Egr-1 están controlados en el nivel transcripcional. No existió una transcripción detectable del gen de la \beta-globina (control negativo) en las células HL-525, mientras que el gen de la actina (control positivo) se transcribió constitutivamente. Además, el tratamiento con la radiación ionizante tuvo poco efecto en la transcripción de estos genes. Sin embargo, mientras que la transcripción del gen Egr-1 fue detectable a niveles escasos en las células de control, el tratamiento con la radiación ionizante dio lugar a un aumento de 30 veces en esta tasa. Considerados conjuntamente, estos hallazgos indicaron que la expresión de Egr-1 inducida por los rayos X está controlada sustancialmente por mecanismos transcripcionales.

Para identificar los elementos cis responsables de la transcripción de Egr-1 inducida por los rayos X, la región promotora de Egr-1 que abarca entre la posición -957 (situada) corriente arriba y el sitio de comienzo de la transcripción en la posición +248, se unió al gen informador CAT (plásmido pEgr-1 P1.2). Esta región contiene varios elementos cis putativos que incluyen dos sitios AP-1 y seis CArG (Christy, et al., 1989; Gius, et al., 1990). El tratamiento de las células transfectadas pEgr-1 P1.2 con las radiaciones ionizantes, se asoció con un aumento de 4,1 veces en la actividad de CAT, comparada con las células transfectadas pero no irradiadas. Al contrario, estudios similares llevados a cabo con el plásmido p\DeltaEgr-1 P1.2 (pares de bases suprimidas entre las posiciones -550 y -50) demostraron alguna inducibilidad, si es que la mostraron) mediante los rayos X. Estos datos sugieren que la inducibilidad por los rayos X de Egr-1 es mediada por secuencias que se encuentran entre las posiciones -550 y -50 del promotor Egr-1. En verdad, la irradiación de las células transfectadas pE425 se asoció con una inducción de 3,6 veces de la actividad de CAT, comparada con la de las células no irradiadas transfectadas con este constructo.

Se utilizaron a continuación una serie de constructos del promotor de Egr-1 en el que se habían hecho algunas supresiones, para definir ulteriormente los elementos sensibles a los rayos en pE425. Estos constructos se han descrito previamente y se muestran esquemáticamente en el Esquema 1. La deleción secuencial de los tres CArGs distales disminuyó progresivamente la actividad de CAT. pE395 (primer CArG suprimido) confirió inducibilidad para los rayos X en un grado menor que pE425. La deleción del primer y segundo CArGs (pE359) dio lugar a disminuciones posteriores en la actividad CAT, mientras que la deleción de los tres primeros CArG (pE342) se asoció con un pequeño aumento, si es que alguno, en la actividad de CAT. Considerados conjuntamente, estos hallazgos sostienen la hipótesis de que los tres elementos CArG distales confieren inducibilidad del gen Egr-1 respecto a los rayos X.

Otros estudios se realizaron con fragmentos del promotor de Egr-1 unido a HSV-TK y el gen CAT. No existió inducibilidad detectable de pTK35CAT por los rayos X. Al contrario, pE425/250TK, que contiene los cuatro CArG distales, fue más sensible al tratamiento con rayos X que pTK35CAT. La región entre las posiciones de bases nucleótidas -395 y -250, que excluye el primer elemento CArG, fue asimismo funcional para conferir inducibilidad por los rayos X al promotor heterólogo, pero en un grado menor que pE425/250TK. Mientras estos hallazgos proporcionaron un soporte ulterior para la implicación de los CArG en la transcripción de Egr-1 inducida por los rayos X, otras secuencias entre estos podrían ser los elementos funcionales cis. La inducibilidad por los rayos X de la transcripción de pTK35CAT se demostró también con el primer CArG con siete pares de bases de las secuencias franqueantes del extremo 3' y del extremo 5' (pSRE1TK).

Ya que los resultados de los ensayos de expresión transitoria indicaban que el dominio CArG es la secuencia diana para la activación del gen Egr-1 mediada por los rayos X, se han llevado a cabo otros estudios para determinar si las proteínas nucleares interaccionan con este elementos y si el tratamiento con los rayos X altera esta interacción. Los extractos nucleares de las células tratadas y no tratadas con rayos X, se incubaron con una sonda marcada con P^{32} que abarcaba el primer dominio CArG. Las proteínas nucleares de las células control dieron lugar a la formación de varios complejos ADN-proteína. Un patrón similar se obtuvo con proteínas nucleares procedentes de células tratadas con los rayos X. para determinar qué complejos reflejaban la unión CArG-proteína, cantidades crecientes de sondas no marcadas se preincubaron con las proteínas nucleares. En estos experimentos, un exceso de 100 veces la sonda no marcada inhibía completamente la formación del complejo con menos movilidad. Al contrario, la adición de un oligonucleótido que contenía la secuencia de consenso NF-\kappaB no relacionada, no tenía efecto sobre la intensidad de este complejo. Estos hallazgos y los resultados de estudios similares de retraso en el gel con este fragmento marcado (Cleveland, et al., 1980), indican que el complejo mencionado representa la interacción específica CArG-proteína.

Los procedimientos siguientes se utilizaron en el Ejemplo 4:

Cultivos celulares. Células leucémicas mieloides humanas HL-525 (Jamal, et al., 1990), se mantuvieron en medio RPMI 1640 que contenía suero bovino fetal al 20% (FBS) con 1 mM de L-glutamina, 100 U/ml de penicilina y 100 \mug/ml de estreptomicina. La irradiación (20 Gy) se llevó a cabo a temperatura ambiente utilizando una célula Gamma 1000 (Atomic Energy of Canada Ltd., Ontario) con una fuente de Cs^{137} que emitía a una tasa fija de dosificación de 13,3 Gy/min, determinada mediante dosimetría.

Aislamiento y análisis del ARN. El ARN celular total se purificó mediante la técnica de cloruro de cesio-isotiocianato de guanidina (Grosschedl, et al., 1985). El ARN se analizó mediante electroforesis a través de geles de formaldehído agarosa al 1%, se transfirió a filtros de nitrocelulosa, y se hibridizó alas siguientes sondas de ADN marcadas con P^{32}: 1) el inserto de dedos no de zinc de 0,7 kb, de un ADNc Egr-1 murino (9); y 2) el inserto PstI de 2,0 kb de un gen de la \beta-actina de pollo purificado a partir del plásmido pA1 (Dignam, et al., 1983). Se llevaron a cabo hibridizaciones a 42ºC durante 24 horas en formamida (vol/vol) al 50%, 2x SSC, 1X solución de Denhardt, SDS al 0,1%, y 200 \mug/ml de ADN espermático de salmón. Los filtros se lavaron dos veces en 2x SSC-0,1% SDS a temperatura ambiente y entonces, en 0,1 x SSC-0,1% SDS a 60ºC durante 1 hora. La intensidad de la señal se determinó mediante densitometria de láser y se normalizó con la del control de actina.

Ensayos de procesamiento nuclear. Se aislaron los núcleos a partir de 10^{8} células y se suspendieron en 100 \mul de tampón de glicerol (50 mM Tris-HCl, pH 8,3, glicerol al 40%, 5 mM MgCl_{2}, y 0,1 mM EDTA). Un volumen igual de tampón reactivo (10 mM Tris-HCl, pH 8,05 mM MgCl_{2},100 mM KCl, 1 mM ATP, 1 mM CTP, 1 mM GTP, y 5 mM ditiotreitol) se añadió a los núcleos en suspensión y se incubó a 26ºC durante 45 minutos con 250 \muCi (\alpha^{-32}p) UTP (3000 Ci/mmol; Dupont, Boston, MA). El ARN nuclear se aisló tal como se describe (Kharbanda, et al., 1991) y se hibridizó a los siguientes ADNs: 1) un inserto BAmHI de 1,1 kb de un gen de la \beta-globina humana (control negativo) (Hallahan et al., 1991); 2) un digesto PstI del plásmido pA1 que contiene un fragmento del gen de la \beta-actina del pollo (control positivo) (Dignam et al., 1983); y 3) el inserto de 0,7 kb del ADNc Egr-1 murino (Sukhatme, et al., 1988). Los ADNs digeridos se procesaron en geles de agarosa al 1% y se transfirieron a filtros de nitrocelulosa. Se realizaron las hibridaciones con 10^{7} cpm de ARN/ml marcado con P^{32}/en 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 4xSSC, 1 mM EDTA, SDS al 0,1%, 2x solución de Denhardt, formamida al 40%, y 100 \mug/ml de ARNt de levadura durante 72 horas a 42ºC. Los filtros se lavaron en a) 2x SSC-0,1% SDS a 37ºC durante 30 minutos; b) 200 ng/ml RNasa A en 2xSCC a temperatura ambiente durante 5 minutos; y c) 0,1x SSC-0,1% SDS a 42ºC durante 30 minutos.

Ensayos del informador. Se prepararon los constructos pEgr-1P1.2, pE425, pE395, pE359, pE342, pE125, pE98 y pE70 tal como se describe (26). pE425/250TK se construyó clonando un fragmento HindIII-SmaI de pE425, que abarcaba la región entre -425 y -250 del promotor Egr-1, situada corriente arriba del promotor de la timidina quinasa (HSV-TK) del virus del herpes simple en el plásmido pTK35CAT (Homma, et al., 1986). pE395/250TK se construyó de la misma forma utilizando un fragmento HindIII-SmaI del pE395. pSRE1TK contiene el primer dominio CArG o el más distal del extremo 5' en el promotor Egr-1 junto con siete pares de bases de las secuencias franqueantes de los extremos 5' y 3' clonadas en el sitio SalI-BamHI de pTK35CAT (Homma, et al., 1986). Los constructos se transfirieron a células que utilizaban la técnica DEAE-dextrano (Treisman, et al., 1990). Las células (2 x 10^{7}) se incubaron en 1 ml de solución salina tamponada-Tris (25 mM Tris-HCl, pH 7,4, 137 mM NaCl, 5 mM KCl, 0,6 mM Na_{2}HPO_{4}, 0,7 mM CaCl_{2}, y 0,7 mM MgCl_{2} que contenía 0,4 mg de DEAE-dextrano y un plásmido de 8 \mug, a 371ºC durante 45 minutos. Las células se lavaron con medio que contenía FBS al 10%, se volvieron a suspender en medio completo y se incubaron entonces a 37ºC. Treinta y seis horas después de la transfección, una alícuota de las células sirvió como un control y la otra se trató con radiación ionizante. Las células se recuperaron después de 8 horas y se lisaron mediante tres ciclos de congelación y descongelación en 0,25 M Tris-HCl, pH 7,8 y 1 \muM de fenilmetilsulfonil-fluoruro. Se incubaron cantidades iguales de extractos celulares con 0,025 \muCi (C^{14}) cloranfenicol, 0,25 M Tris-HCl, pH 7,8 y 0,4 mM acetilcoenzima A durante 1 hora a 37ºC. El ensayo enzimático se finalizó añadiendo acetato de etilo. La capa orgánica que contenía el (C^{14}) cloranfenicol se separó mediante cromatografía en capa fina, utilizando cloroformo:metanol (95%; 5%, vol/vol). Después de autoradiografía, las formas tanto acetiladas como las no acetiladas de (C^{14}) cloranfenicol se cortaron a partir de las placas, y la conversión de cloranfenicol a la forma acetilada se calculó midiendo la radioactividad en un contador de \beta-centelleo.

Ensayos del retardo del gel. Se prepararon extractos nucleares tal como se describe en Fish, et al., 1987. Un oligonucleótido bicatenario sintético de 40 pares de bases que contenía el primer elemento CArG (Cleveland, et al., 1980) se marcó en el extremo con (\alpha-^{32}P) dCTP utilizando la T4 polinucleótido quinasa y purificándose entonces en un gel de poliacrilamida al 5%. La sonda purificada marcada en el extremo (1 ng; aprox. 1 x 10^{5} cpm) se incubó con cantidades variables del extracto proteico nuclear durante 15 minutos a 20ºC en un tampón que contenía 12 mM HEPES, pH 7,9, 60 mM KCl, 1 mM EDTA, 5 mM ditiotreitol, glicerol (vol/vol) al 6%, 1 \mug de albúmina sérica bovina, y 0,25 \mug de ADN espermático de salmón sometido a ultrasonidos. Se llevaron a cabo experimentos competitivos con la sonda no marcada, o con un oligonucleótido de 22 pares de bases que contenía el sitio de unión de NF-\kappaB. Los oligonucleótidos competitivos se preincubaron con el extracto proteico nuclear durante 20 minutos a 4ºC antes de añadir la sonda marcada. Los productos finales de la reacción se analizaron mediante electroforesis en un gel de poliacrilamida al 5% que contenía 1/4x TBE (22 mm Tris, 22 mM ácido bórico, 0,5 mM EDTA) y la subsiguiente autoradiografía.

En los presentes estudios, las células HL-525 respondieron a la radiación ionizante con la inducción de los niveles de ARNm Egr-1. Estos hallazgos indicaron que la radiación ionizante aumenta la expresión de Egr-1 mediante vías de señalización distintas de las activadas durante la inducción de este gen en las células tratadas con TPA. Además, el hallazgo de que la expresión del gen TNF inducida por los rayos X se atenúa en la progenie HL-525 (Gilman, 1988) sugiere que la radiación ionizante induce a los genes Egr-1 y TNF mediante distintas vías de señalización en estas células.

Estos estudios demuestran además que la expresión de Egr-1 inducida por los rayos X se regula por lo menos en parte, mediante mecanismos transcripcionales. Los ensayos de procesamiento nuclear demostraron un aumento en la tasa de la transcripción del gen Egr-1 después de la radiación ionizante. Además, el análisis del promotor de Egr-1 completo (de longitud total) (pEgr-1 P1.2) en los ensayos de expresión transitoria demostró la inducibilidad mediante la radiación ionizante. La transfección de p\DeltaEgr-1P1.2 (pares de bases nucleótidas suprimidas entre las posiciones -550 y-50) y pE425 proporcionó la evidencia adicional de que la región promotora que contenía los seis elementos CArG era responsable de conferir la inductibilidad por los rayos X. Estos hallazgos fueron confirmados por la utilización de varios otros constructos de promotores afectos de supresiones, que indicaban que la región que abarcaba los primeros tres elementos CArG es funcional para la respuesta los rayos X.

En este contexto, la deleción secuencial de estos CArGs eliminó progresivamente la respuesta a los rayos X. Los cuatro CArGs distales confirieron asimismo la inducibilidad de los rayos para un promotor heterólogo y este efecto disminuyó suprimiendo el primer dominio CArG. De forma más importante, estudios con el primer dominio CArG demostraron que este elemento era suficiente para conferir la respuesta a los rayos X. Considerados conjuntamente, estos hallazgos apoyan fuertemente a la hipótesis del dominio CArG como elemento sensible a la radiación.

Ejemplo comparativo 3

Señalización de la radiación mediada por la activación de Jun

La radiación ionizante produce un amplio abanico de efectos sobre las células, que incluyen la inducción de mutaciones, letalidad, transformación maligna en algunas células supervivientes, detención del ciclo celular, y proliferación subsiguiente de las células. Jun, un factor de transcripción que es central para la promoción tumoral, la proliferación y la regulación del ciclo celular, es activado por agentes que dañan al ADN en las células de mamífero (Devary, 1991 y Bernstein, 1989). Un mecanismo propuesto para la activación de Jun es mediante su disociación de un inhibidor de la transcripción de Jun (Baichwal, 1990).

Para investigar la unión proteica a la secuencia de AP-1 después de la irradiación, se extrajeron proteínas nucleares de las progenies celulares RIT-3 irradiadas, del sarcoma humano, con intervalos de 5 minutos, durante 30 minutos, después de exposición a 10 Gy. Las secuencias marcadas con P^{32} que se une a AP-1, NF\kappaB, SP-1 y CTF, se incubaron con extractos celulares separándose entonces mediante electroforesis las mezclas ADN-proteína. Se encontró un aumento en la unión de las proteínas nucleares a secuencias AP-1 ADN, 10 y 20 minutos después de la irradiación, cuando se comparó con las células de control no tratadas en el ensayo de cambio de movilidad electroforética, mientras que no aumentó la unión proteica nuclear a NF-\kappaB, SP-1, Oct-1 o CTF después de la irradiación de las células RIT-3.

La formación de complejos ADN-proteína no se evitó añadiendo a las células, previamente a la radiación, el inhibidor cicloheximida de la síntesis proteica. La unión a AP-1 se eliminó cuando la secuencia de consenso AP-1 no marcada (Rauscher, 1988) compitió por la proteína nuclear cuando se añadió a los extractos antes de la adición de la AP-1 marcada y eliminó las bandas producidas por los extractos procedentes de las células RIT-3 irradiadas. Al contrario, una secuencia no específica de ADN (Oct-1) no compitió por la unión a la proteína nuclear. Estos datos indican que la unión a la proteína nuclear a AP-1 después de la irradiación, es específica.

Para determinar si las proteínas nucleares que se unen a AP-1 a partir de las células RIT-3 irradiadas, comparten epítopos con factores de transcripción conocidos, se añadieron los antisueros Jun y fos (Chiles, 1991 y Stopera, 1992) a extractos nucleares antes de la adición de secuencias ADN AP-1 marcadas. La adición del antisuero a los que se unen al ADN de fos (Ab-2) y Jun (CRB), dio lugar a una reducción en la formación del complejo proteico con la secuencia AP-1 después de la irradiación. Concentraciones crecientes de antisuero redujeron progresivamente, de acuerdo con esto, los complejos ADN-proteína. Estos datos indican que las proteínas que se unen a la secuencia AP-1 después de irradiación, tienen epítopos reconocidos por el antisuero para los que se unen al ADN de Jun y fos.

Para determinar si el Jun activado dio lugar a un aumento de la transcripción del sitio de unión de AP-1, después de la exposición a la radiación ionizante, el plásmido (p3xTRE-CAT) que contenía tres sitios AP-1 situados corriente arriba del promotor mínimo tk (pBLCAT2), se transfectó en las células RIT-3. La irradiación de los transfectantes p3xTRE-CAT dio lugar a un aumento de 3 veces en la expresión de CAT. Para determinar si el promotor c-Jun fue inducido por la radiación de una forma análoga al suero y los ésteres de forbol, el segmento de 1840 pares de bases del promotor de c-Jun situado corriente arriba del gen (Angel, 1988) de la cloranfenicol acetil transferasa (CAT), se transfectó en las células RIT-3. Después de la transfección, las células se mantuvieron en suero fetal de ternera al 0,2% (FCS) y se irradiaron (10 Gy, 2 Gy/min) 40 horas post-transfección, y CAT se extrajo 5 horas después de la irradiación.

La transfección del fragmento -1,1 kb a la región de +740 pares de bases del promotor c-Jun (c-Jun-CAT) demostró un aumento de 3 veces en la expresión génica después de exposición a la radiación ionizante. La transfección del plásmido con una deleción del sitio AP-1 situado en +150 pares de bases (-132/+170 \Delta AP-1CAT) dio lugar a una pérdida de la inducción mediada por los rayos X. Estos resultados sugieren que el AP-1 activado participa en la transcripción de c-Jun y que la secuencia ADN AP-1 es suficiente y necesaria para conferir la inducción génica mediada por los rayos X.

En el interior de la proteína Jun, existen varios reguladores y dominios que se unen al ADN. Cerca del dominio que se une al ADN existe una región denominada como A_{2}, que es necesaria para activar la transcripción (revisado en (Lewin, 1991). A_{1}, un dominio de activación transcripcional adicional, se encuentra cerca del extremo N, adyacente a una región llamada Delta (\Delta) que es propuesta para unir una proteína celular que inhibe las propiedades activantes transcripcionales de Jun (Baichwal, 1990 y Baichwal, 1991). La actividad transcripcional de Jun puede ser conferida mediante ambos de activación A_{1} y A_{2} o cualquiera de ellos. El tratamiento con los ésteres de forbol da lugar a la modificación de la proteína Jun mediante una fosforilación dependiente de la proteína quinasa C (PKC) de la región A_{1}, autoinduciendo, por tanto, la transcripción de c-Jun (Binetruy, 1991 y (Pulverer, 1991).

El aumento de la unión de Jun a las secuencias AP-1 después de la irradiación, indica que la proteína Jun se modifica después de la irradiación. Considerado conjuntamente con los hallazgos recientes de que PKC se activa después de la irradiación de las células y de que la disminución de PKC suprime la inducción de c-Jun por la irradiación (Hallahan, 1992), los datos sugieren que la exposición a los rayos X activa Jun a través de la modificación de PKC del dominio A_{1} (Binetruy, 1991 y Pulverer, 1991).

Se transfectaron dos plásmidos en células HeLa y RIT-3 para estudiar la activación del potencial transcripcional de la proteína Jun después de la irradiación. pSG-Jun5-253 contiene el promotor SV40, que no es sensible transcripcionalmente a la radiación, situado corriente arriba de la secuencia codificante para \Delta, A_{1} y A_{2} (Baichwal, 1990). El dominio que se une al ADN de Jun se reemplazó con el dominio que se une al ADN del gen GAL4 de la levadura que codifica una proteína implicada en la regulación transcripcional de la levadura (Baichwal, 1990). Un segundo plásmido, G5BCAT contiene la secuencia de ADN que se une a la proteína Gal4 situada en el extremo 5' de la secuencia E1b TATA corriente arriba del gen informador CAT (Baichwal, 1990). Cuando el dominio de activación de la proteína Jun se vuelve transcripcionalmente activo, la proteína quimérica Gal-Jun, inicia la transcripción de CAT después de unirse a la secuencia de unión a Gal4.

Estos plásmidos se co-transfectaron mediante la precipitación con fosfato cálcico en células HeLa y RIT-3. Los transfectantes se irradiaron con 20 Gy y demostraron un aumento triple en la actividad CAT, comparada con los controles no tratados. Este nivel de expresión fue comparable con el observado después de la estimulación con TPA, que produjo un aumento de 3,5 veces en la actividad CAT. La irradiación de las células RIT-3 transfectadas con sólo G5BCAT no demostró un aumento en la actividad CAT. Resultados similares se obtuvieron en las células HeLa que contienen el inhibidor Jun. Sin embargo, las células Hep G2 que no contienen el inhibidor Jun (Baichwal, 1990), no demostraron una activación inducida por los rayos X del Gal4-Jun quimérico. Estos datos sugieren que la proteína quimérica Gal-Jun se activa después de la irradiación, dando lugar a una unión al ADN para acelerar la transcripción de CAT.

A causa de que la expresión del gen c-Jun inducida por los rayos X se atenúa cuando PKC disminuye o es inhibida, el inhibidor H7 de PKC se añadió a células RIT-3 transfectadas con pSG-Jun5-235 y G5BCAT. El tratamiento con H7 abrogó el aumento inducido por los rayos X en la actividad CAT. Este hallazgo está de acuerdo con resultados previos que demostraron que la activación de PKC inducida por los rayos X es necesaria para la expresión génica (Hallahan, 1991).

El inhibidor de la transcripción de Jun, que se une a los dominios \Delta/A_{1}, reprime la actividad transcripcional de A_{1}. El inhibidor de la transcripción de Jun se definió originariamente en experimentos en los que un exceso de Jun compitió por el inhibidor y por tanto, permitió que el Jun no inhibido aumentara la transcripción del constructo G5-CAT cuando se comparó con las células de control no tratadas. Basándose en estos resultados, se informa que las células HeLa contienen el inhibidor de Jun (Baichwal, 1990), mientras que éste no se encuentra en las células HepG2. Para determinar si el inhibidor de Jun se encuentra en las células RIT-3, el vector de expresión CMV-jun, que expresa constitutivamente c-Jun, se cotransfectó con pSGJun5-235 y G5BCAT. La expresión basal de CAT aumentó en las células RIT-3 y HeLA pero no en las células HepG2 cuando CMV-Jun se añadió. Estos resultados confirman y extienden los resultados de Tjian et al, en que las células HeLa y RIT-3 contienen el inhibidor de Jun pero no las células HepG2. Las células que contienen el inhibidor de Jun demostraron un aumento en la transcripción de G5BCAT mediada por la radiación, mientras que las células que no contienen el inhibidor de Jun no muestran aumento en la transcripción de G5BCAT.

Las células RIT-3 cotransfectadas con CMV-Jun, pSGJun5-235 y G5BCAT no demostraron un aumento en la transcripción, comparadas con los transfectantes tratados con condiciones idénticas, pero no con irradiación. Estos datos sugieren que la disociación del inhibidor de Jun puede ser un mecanismo para regular la transcripción mediada por la radiación.

Los procedimientos siguientes se utilizaron en el Ejemplo Comparativo 3:

Extractos nucleares. Se prepararon extractos nucleares según los procedimientos descritos previamente (Schreiber, 1989) a los 10, 20, 30 y 60 minutos después de la irradiación. Las células RIT-3 (10^{6}) se lavaron en 10 ml PBS, se rasparon, y se sedimentaron mediante centrifugación a 1500 g durante 5 minutos. El sedimento se volvió a suspender en 1 ml PBS, se transfirió a un tubo de Eppendorf y se sedimentó otra vez durante 15 segundos. PBS se eliminó y el sedimento celular se volvió a suspender en 400 \mul de tampón A frío (10 mM HEPES pH 7,9; 10 mM KCl; 0,1 mM EDTA; 1 mM DTT; 0,5 mM PMSF). Se dejó que las células se hincharan en hielo durante 15 minutos, seguido por la adición de 25 ml de NP-40 al 10%. La mezcla se centrifugó durante 30 segundos y el sedimento nuclear se volvió a suspender en 50 \mul de tampón B frío (20 mM HEPES pH 7,9; 0,4 M NaCl; 1 mM EDTA; 1 mM EGTA; 1 mM DTT; 1 mM PMSF) durante 15 minutos, centrifugándose el extracto nuclear durante 5 minutos. El contenido proteico se determinó mediante el procedimiento de Bradford (Bio-Rad). El ADN de secuencia consenso AP-1 (BRL-GIBCO) se marcó en el extremo con (P^{32})dATP utilizando el fragmento Klenow de la ADN polimerasa I.

Ensayos de unión. Los ensayos de unión se llevaron a cabo incubando el ADN marcado en el extremo (1 ng) con 10 \mug de proteína nuclear, 75 mM KCl y 1 \mug/ml de poly (dI-dC) en una reacción de 20 \mul durante 20 minutos a temperatura ambiente.

Ensayos competitivos. Se realizaron estudios competitivos utilizando oligonucleótidos que correspondían a los elementos conocidos AP-1 y Oct-1 (BRL-GIBCO) que actuaban en modo cis, con un exceso molar de 100 veces comparado con los fragmentos marcados. Los productos reactivos se separaron mediante electroforesis en gel de poliacrilamida al 5%, se secaron y se analizaron mediante autoradiografía.

Estudios con antisueros. Los antisueros para las proteínas Jun y fos redujeron la unión a AP-1 inducida por la radiación. Los antisueros para los factores humanos de transcripción c-Jun (aminoácidos 73 a 87, Ab-2, Oncogene Sci.), c-Jun, Jun-B, Jun-D (Cambridge Research, log OA-11-837), y c-fos (aminoácidos 4-17, Ab-2, Oncogene Sci y (aminoácidos 1-14, Lot OA-11-823, Cambridge Research) se añadieron a 10 \mug de extractos nucleares con una dilución 1:200, incubándose a 24ºC con agitación durante una hora. Los segmentos de ADN se añadieron tal como se ha descrito anteriormente, seguido por la separación utilizando los ensayos de cambio de movilidad electroforética.

Ensayos de transfección. Plásmidos que contenían c-Jun-CAT, 3xTRE-CAT, y \DeltaAP-1-CAT (2 \mug) se cotransfectaron con un plásmido que contenía un promotor CMV unido al gen de la \beta-galactosidasa (1 \mug) y 12 \mug de ADN excipiente en las células RIT-3. Las células se transfectaron utilizando el Reactivo Lipofectina (BRL-GIBCO) durante 20 horas, seguido por la adición de medio con suero fetal bovino al 0,2%. Los transfectantes se incubaron durante 40 horas después de la transfección, seguido por tratamiento con una radiación ionizante de 10 Gy (1 Gy/min, Maxitron GE), recuperándose mediante raspado 6 horas después. Las células se lisaron y los extractos se incubaron con (C^{14}) cloranfenicol y acetil coenzima A durante 1 hora a 37ºC. La actividad CAT se determinó separando el (C^{14}) Cloranfenicol-acetilado mediante cromatografía ascendente. El contaje de centelleo, tanto de las formas no acetiladas como de las acetiladas de (C^{14}) cloranfenicol, se utilizó para cuantificar la actividad CAT. Anteriormente, se muestran los resultados de: El segmento de 1,1 Kb del promotor c-Jun unido a CAT (c-Jun-CAT). El 3xTRE-CAT. El plásmido \DeltaAP-1-CAT en el que la secuencia AP-1 se ha suprimido a partir del promotor de c-Jun. La actividad CAT se compara con los transfectantes tratados con TPA y no irradiados. Se presentan la media y los errores estándar de los 3
experimentos.

Los plásmidos pSG-Jun5-253 (2 \mug) y G5BCAT (4 \mug) se cotransfectaron con un plásmido que contenía un promotor CMV unido al gen de la \beta-galactosidasa (1 \mug) y 12 \mug del ADN excipiente en las células RIT-e y HeLa utilizando la lipofección. La actividad CAT se compara con los transfectantes tratados con TPA y no irradiados. Se presentan la media y los errores estándar de los 3 experimentos.

Ejemplo comparativo 4

Implicación de los intermediarios reactivos en la inducción de la transcripción del gen c-Jun mediante la radiación ionizante

Se ha postulado que la radiación ionizante induce la activación de los mecanismos de reparación del ADN, de la detención del ciclo celular en la fase G_{2} y de la letalidad mediante la interacción directa con el ADN, o a través de la formación de intermediarios de oxígeno reactivo (ROI) que dañan al ADN. Estudios recientes han sugerido además un papel para la activación de genes tempranos-inmediatos en la respuesta a la radiación ionizante. Por ejemplo, la exposición de células a los rayos X está asociado con la activación de la familias génicas c-Jun/c-fos y Erg-1 que codifican factores de transcripción. Otros estudios han demostrado que la radiación ionizante induce la expresión y la actividad de unión al ADN del factor nuclear \kappaB (NF-\kappaB). La activación de los factores de transcripción representa probablemente un punto crítico de control para transducir señales nucleares tempranas a cambios a largo plazo en la expresión génica, que reflejan la respuesta al daño inducido por los rayos X. Estudios han demostrado que el tratamiento con radiación se asocia con un aumento en la expresión de ciertas citoquinas, incluyendo TNF, el factor de crecimiento derivado de las plaquetas, el factor de crecimiento fibroblástico y la interleuquina-1. El aumento en la expresión de TNF después de la exposición a la radiación ionizante está regulado por mecanismos transcripcionales, aunque no se sabe que proteínas que se unen al ADN confieren esta inducibilidad.

El gen c-Jun codifica la forma más importante del factor de transcripción AP-1 de 40-44 kD. Como se observa en las células irradiadas, este gen es inducido como un evento temprano inmediato en respuesta a los ésteres de forbol y a ciertos factores de crecimiento. El complejo Jun/AP-1 se une a la secuencia heptomérica de consenso del ADN, TGA^{G}/_{C}TCA. El dominio de unión del ADN de c-Jun es compartido por una familia de factores de transcripción, que incluyen Jun-B, Jun-D y c-fos. Además, la afinidad de la unión de c-Jun al ADN está relacionada con la formación de homodímeros o heterodímeros con productos de la familia génica fos.

Jun-B forma también dímeros y se une al elemento AP-1, aunque las propiedades actuantes trans de Jun-B difieren de las de c-Jun. Mientras que el producto del gen Jun-D interacciona asimismo con c-fos y posee similares propiedades de unión que las de c-Jun, la función de Jun-D es desconocida. Ciertas informaciones están disponibles respecto a las señales que contribuyen a la regulación de estos genes. Por ejemplo, el hallazgo de que los ésteres de forbol activan la transcripción de c-Jun en diversos tipos celulares, ha implicado la intervención de un mecanismo dependiente de una fosforilación. Una vía similar parece jugar un papel, por lo menos en parte, en la inducción de la expresión de c-Jun mediante la radiación ionizante. A este respecto, el tratamiento prolongado con los ésteres de forbol para regular a la baja la PKC, está asociado con disminuciones en los efectos de los rayos X sobre la transcripción de c-Jun. Además, los inhibidores no específicos de PKC, tales como el derivado H7 de la isoquinolinosulfonamida, bloquean la expresión de c-Jun inducida por los rayos X. Considerándolo conjuntamente con la demostración de que la radiación ionizante induce una actividad con características de PKC, estos hallazgos han sugerido que la PKC o una quinasa relacionada transduce señales que confieren una inducibilidad a los rayos X del gen c-Jun.

Los presentes estudios examinaron los efectos de la radiación ionizante sobre la expresión de c-Jun en una variante de las células HL-60, denominada HL-525, que es deficiente en la transducción de la señal mediada por PKC. Esta variante es resistente tanto a la diferenciación inducida por los ésteres de forbol, como a la expresión del gen TNF inducida por los rayos X. Los presentes resultados demuestran que las células HL-525 también son resistentes a la inducción de la expresión de c-Jun por los ésteres de forbol. Los resultados asimismo demuestran que el tratamiento de estas células con radiaciones ionizantes está asociado con una superinducción de los niveles de ARNm c-Jun comparadas con las células HL-60 sensibles a los ésteres de forbol. Estos hallazgos indican que este efecto de la radiación ionizante está relacionado por lo menos en parte con la formación de intermediarios de oxígeno reactivo.

Estudios previos han demostrado que el tratamiento de las células HL-205 con TPA está asociado con la translocación de la actividad de PKC desde la fracción citosólica a la membrana celular, mientras que durante exposiciones similares de las células HL-525 no se detecta una redistribución celular de PKC. A Debido a que el trabajo previo había sugerido que la radiación ionizante induce una expresión génica de respuesta temprana mediante un mecanismo PKC-dependiente, se llevaron a cabo estudios para determinar los efectos de los rayos X sobre una célula, tales como HL-525, que es deficiente en la transducción de la señal mediada por PKC. Se detectó un escaso nivel de transcritos de c-Jun en las células HL-205 no tratadas, mientras que el tratamiento con la radiación ionizante se asoció con un aumento transitorio que fue máximo a las 3 horas. La cinética e intensidad de esta respuesta fueron idénticas a las informadas para las células parentales HL-60. La expresión del gen c-Jun también fue escasa en las células no tratadas HL-525. Sin embargo, la exposición de estas células a la radiación ionizante dio lugar a niveles de ARNm c-Jun que, a las 3 horas, fueron 3,5 veces mayores que los obtenidos en las células HL-205. Se detectaron de modo similar en las células HL-525 niveles más altos de expresión de c-Jun a las 6 y 8 horas después de la exposición a los rayos X. La expresión de los genes Jun-B y Jun-D aumentó también transitoriamente después de irradiación con rayos X de la progenie HL-205. Hallazgos similares se obtuvieron con las células HL-525, aunque los niveles de ARNm para Jun-B y Jun-D a las 3 horas fueron entre 2,0 y 2,5 veces más altos a las 3 horas en esta variante, comparados con los de las células HL-205.

Las proteínas codificadas por los miembros de la familia génica Jun pueden formar heterodímeros con los productos génicos fos. Consecuentemente, los efectos de los rayos X sobre la expresión de c-fos y fos-B también se estudiaron. Los transcritos c-fos se encontraban a niveles bajos en las células HL-205 y existió un pequeño efecto (si es que lo hubo) de la radiación ionizante sobre la expresión de este gen. Hallazgos similares se obtuvieron para fos-B. Al contrario, mientras que la expresión de c-fos y fos-B era también baja en las células HL-525, la exposición a los rayos X se asoció con aumentos transitorios en los transcritos para los dos genes. La cinética de estos aumentos en la expresión del gen fos fue similar a la obtenida para los miembros de la familia del gen Jun. Así, la activación de múltiples genes Jun y fos pudo contribuir a diversas señales nucleares en la respuesta de las células a los rayos X.

El tratamiento de las células HL-60 y de otras células leucémicas mieloides con TPA se asocia con la inducción del gen c-Jun. Efectos similares se obtuvieron en las células HL-205 tratadas con TPA. La respuesta de estas células a TPA se asoció con aumentos en la expresión de c-Jun que fueron detectables a las 6 horas y alcanzaron niveles máximos a las 24 horas. Al contrario, exposiciones similares de las células HL-525 a TPA dieron lugar a un aumento en la expresión de c-Jun que fue transitorio y atenuado a las 12 horas, comparado con el de la unión en HL-205. Estos hallazgos indicaron que las células HL-525 son resistentes por lo menos en parte a los efectos de TPA sobre los eventos de señalización mediados por Jun/AP-1. Ya que TPA activa PKC y la translocación de esta enzima es indetectable en las células HL-525, la expresión de PKC en las progenies HL-205 y HL-525 se comparó. Se ha mostrado que las células HL-60 expresan los isozimas \alpha y \beta-PKC. En verdad, los transcritos para PKC\alpha y PKC\beta fueron detectables en las células HL-205. Sin embargo, la expresión constitutiva de ambos genes disminuyó por encima del 75% en las células HL-525.

Estos resultados sugirieron que la resistencia relativa de las células HL-525 a la transcripción de c-Jun inducida por TPA, podría atribuirse a los bajos niveles de la expresión de PKC. Considerando conjuntamente con el hallazgo de que la expresión de c-Jun es superinducida por la radiación ionizante en las células HL-525, estos resultados sugieren asimismo que la expresión de c-Jun inducida por los rayos X puede ser mediada por eventos independientes de PKC\alpha y PKC\beta.

Para definir posteriormente los mecanismos responsables para la inducción de la expresión de c-Jun en las células HL-525, se llevaron a cabo ensayos de procesamiento nuclear para determinar los efectos de los rayos X sobre las tasas de transcripción de c-Jun. Estudios similares se realizaron en las células HL-205 con propósitos comparativos. El gen de la actina (control positivo) se transcribió constitutivamente en las células HL-205, mientras que no existió transcripción detectable del gen de la \beta-globina (control negativo). Patrones similares se observaron en las células HL-525. La transcripción del gen c-Jun fue detectable a niveles bajos en ambos tipos celulares. Además, el tratamiento con rayos X de las progenies HL-205 y HL-525 dio lugar a una estimulación 6 y 5 veces mayor en la tasa de la transcripción de c-Jun, respectivamente. Estos hallazgos sugirieron que otros mecanismos, quizás a nivel postranscripcional, fueron responsables de los niveles más altos de la expresión de c-Jun, después del tratamiento de las células HL-525.

Para abordar esta posibilidad, se estudió la estabilidad del ARNm de c-Jun después del tratamiento con actinomicina D para inhibir la transcripción posterior. La semivida biológica de los transcritos de c-Jun en las células HL-205 tratadas con rayos X, fue de 31 minutos. Al contrario, la estabilidad de estos transcritos en las células HL-525 irradiadas, aumentó 3 veces con una semivida biológica de 106 minutos. Considerados conjuntamente, estos resultados indicaron que la activación transcripcional del gen c-Jun por los rayos X es similar en ambos tipos celulares y que los niveles más altos de la expresión de c-Jun en la variante HL-525 están relacionados con las diferencias en el control postranscripcional.

El hallazgo de que la radiación ionizante induce la expresión de c-Jun en las células HL-525 que exhiben una respuesta alternada de este gen a TPA, sugirió que vías independientes de PKC pueden mediar este efecto de los rayos X. En este contexto, se sabe que la radiación ionizante induce la formación de ROIs. Además, estudios recientes han demostrado que H_{2}O_{2}, otro agente que actúa mediante la producción de ROIs, activa al gen c-Jun en las células HeLa. Los efectos de ROIs en las células es contrarrestado por el antioxidante bien caracterizado N-acetil-L-cisteína (NAC). La exposición de las células HL-205 a 30 mM NAC había tenido un efecto pequeño, si es que alguno, sobre los niveles constitutivos de los transcritos c-Jun. Sin embargo, este agente inhibió los aumentos inducidos por los rayos X en la expresión de c-Jun en más del 90%. Hallazgos similares se obtuvieron en las células HL-525. Estos efectos inhibitorios de NAC sobre la expresión de c-Jun inducida por los rayos X fueron mediados por un bloque en activación transcripcional del gen c-Jun. Mientras que la radiación ionizante sola aumentó la tasa de transcripción de c-Jun en las células HL-525 en 4 veces, la adición de NAC inhibió esta respuesta en cerca de un 90%.

Al contrario, NAC no tuvo un efecto detectable sobre la inducción del gen c-Jun en las células HL-525 por la 1-\beta-D-arabinofuranosilcitosina (Ara-C; datos que no es muestran), otro agente que daña al ADN que se incorpora a la cadena de ADN. Loshallazgos indicaron que NAC es un inhibidor específico de la transcripción de c-Jun inducida por los rayos X, a través, presumiblemente, de sus efectos de ROIs.

Estudios previos han demostrado que la respuesta celular a otros diversos tipos de agentes que dañan al ADN, incluyendo ara-C, la luz UV, los agentes alquilantes y el etoposido, incluye la inducción de la expresión de c-Jun. Estos hallazgos han sugerido que el daño al ADN per se es la señal responsable para la activación de este gen. Esta respuesta parece también implicar a una proteína quinasa regulada a la baja por la exposición prolongada al TPA. Ya que los ROIs dañan al ADN, se realizaron estudios para determinar si la respuesta a estos intermediarios incluye asimismo un mecanismo sensible a TPA. El tratamiento de las células HL-525 con únicamente TPA entre 36 y 39 horas no tuvo un efecto detectable sobre los niveles de ARNm c-Jun. Sin embargo, el pretratamiento con este agente bloqueó los aumentos inducidos por los rayos X en la expresión de c-Jun en un 75%.

Estudios similares se llevaron a cabo con briostatina, un agente distinto de TPA, que activa a PKC también de forma transitoria. El tratamiento de las células HL-525 con briostatina durante 36 horas tuvo poco efecto, si es que alguno, sobre la inducción de los transcritos de c-Jun por la radiación ionizante. Ya que H_{2}O_{2} actúa asimismo como un agente que daña al ADN mediante la producción de ROIs, se llevaron a cabo experimentos similares en las células HL-525 tratadas con este agente. H_{2}O_{2} indujo de forma transitoria la expresión de c-Jun en estas células y este efecto fue inhibido por NAC.

El pretratamiento con TPA bloqueó los aumentos inducidos por H_{2}O_{2} en la expresión de c-Jun en un 80%, mientras que una exposición similar a la briostatina no tuvo un efecto detectable. Considerados conjuntamente, estos hallazgos indicaron que agentes tales como la radiación ionizante y H_{2}O_{2} que produjeron ROIs, inducen la expresión de c-Jun mediante un mecanismo regulado a la baja por TPA y no por la briostatina.

NAC contrarresta los efectos del estrés oxidativo "barriendo" a los ROIs y aumentando el glutatión intracelular (GSH). Estudios previos han demostrado que NAC es un inhibidor potente de la activación inducida por los ésteres de forbol de la repetición terminal larga del HIV-1. Se ha encontrado asimismo que este antioxidante inhibe la activación del factor nuclear \kappaB(NF-\kappaB)por los ésteres de forbol y otros agentes tal como H_{2}O_{2}. Los hallazgos disponibles sugieren que los ROIs activan NF-\kappaB induciendo la liberación de la subunidad inhibitoria I\kappaB. Los ROIs también se forman durante el tratamiento de las células con la radiación ionizante. Así, la respuesta celular a este agente puede implicar la activación inducida por ROI de factores de transcripción y por tanto, de efectos más a largo plazo en la expresión génica. Verdaderamente, trabajos recientes han demostrado que la actividad de unión al ADN y la expresión de NF-\kappaB es inducida después de exposición a la radiación ionizante. Sin embargo, los ROIs tienen unas semividas biológicas extremadamente cortas y mientras que la unión al ADN de NF-\kappaB aumenta rápidamente en las células tratadas con los rayos X, no está claro si este efecto está directa o indirectamente relacionado con la formación de los radicales de oxígeno.

Los resultados de los presentes estudios sugieren que los ROIs contribuyen asimismo a la activación de la transcripción de c-Jun mediante la radiación ionizante. Este evento fue inhibido por NAC. Además, H_{2}O_{2} aumentó la expresión de c-Jun y este efecto fue inhibido de modo similar por NAC. Mientras que estos hallazgos podrían reflejar una inhibición no específica de la expresión de c-Jun, NAC no tuvo un efecto detectable sobre los aumentos inducidos por ara-C en los transcritos de c-Jun. Ara-C daña al ADN por la incorporación a sus cadenas elongantes y no se sabe que medie sus efectos citotóxicos a través de los ROIs. Es interesante que la respuesta celular a ara-C incluya también la activación de NF-\kappaB. Ya que los ROIs dañan al ADN en las células irradiadas y tratadas con H_{2}O_{2} este daño puede representar el evento en común con agentes tales como ara-C.

Otros estudios han sugerido que la inducción de la expresión de c-Jun por la radiación ionizante es mediada por un mecanismo dependiente de PKC. El tratamiento prolongado con TPA para regular a la baja los resultados de PKC en una atenuación marcada del gen c-Jun por los rayos X, es inhibido asimismo por H7, un inhibidor no específico de PKC, pero no por HA1004, un inhibidor más selectivo de las proteína quinasas dependientes de los nucleótidos cíclicos. Consecuentemente, las progenies celulares tales como HL-525, que son deficientes en la señalización mediada por PKC, responderían probablemente a la radiación ionizante con una inducción atenuada de la expresión de c-Jun. Verdaderamente, la activación de la expresión de TNF en las células HL-525 tratadas con rayos X, disminuye, comparada con las progenies HL-60 sensibles a TPA. Además, el presente hallazgo de que el tratamiento de las células HL-525 con TPA está asociado con una respuesta atenuada de c-Jun, da pie a sospechar un defecto en los eventos mediados por PKC que controlan la expresión de c-Jun. Sin embargo, las células HL-525 respondieron a la radiación ionizante con un aumento en la expresión de c-Jun, que de hecho fue más pronunciada que la obtenida en las células HL-205.

Los resultados demuestran que este aumento en los niveles de ARNm c-Jun está regulado por la activación de la transcripción de c-Jun, así como por la prolongación en las semividas biológicas de estos transcritos. Otros miembros de la familia Jun/fos (Jun-B, Jun-D, c-fos, fos-B) fueron también inducidos después de exposición a los rayos X de la variante HL-525, mientras que el tratamiento de estas células con TPA dio lugar a un pequeño efecto, si es que a alguno, sobre la expresión de estos genes. Estos hallazgos indicaron que la radiación ionizante aumenta la expresión de Jun/fos a través de vías de señalización distintas de las activadas durante la inducción de estos genes en las células tratadas con TPA.

La base para la falta de la redistribución de PKC en las células HL-525 tratadas con TPA no está clara. Sin embargo, la translocación de PKC desde el citosol a la membrana celular, puede ser necesario para ciertos eventos de señalización inducidos por TPA, tales como la inducción de la expresión de c-Jun. Sin embargo, no se sabe si la translocación a la membrana celular es necesaria para la activación de cada una de las distintas isoformas de PKC. Los presentes resultados demuestran que el tratamiento prolongado de la variante HL-525 con TPA, bloquea los aumentos inducidos por los rayos X en la expresión de c-Jun. Este hallazgo apoya la implicación de un mecanismo dependiente de PKC.

La variante HL-525 expresa niveles relativamente bajos de PKC\alpha y PKC\beta, comparados con las células HL-205. También se encontraron niveles bajos a indetectables de ARNm PKC\gamma tanto en las progenies HL-205 como en las HL-525 (datos que no se muestran). De este modo, otros isozimas de PKC que son sensibles a la regulación a la baja de PKC, pueden ser responsables de las señales de transducción que confieren inducibilidad por los rayos X del gen c-Jun. Alternativamente, el tratamiento prolongado con TPA podría provocar una regulación a la baja de otras vías de señalización independientes de PKC implicadas en la inducción de c-jun por la radiación ionizante. Se mostró previamente que el tratamiento por los rayos X estaba asociado con la activación de una actividad de tipo PKC.

Los procedimientos siguientes se utilizaron en el Ejemplo Comparativo 4.

Cultivo celular. El clon HL-205 se aisló a partir de la progenie celular leucémica mieloide HL-60 humana. La variante resistente al éster de forbol de las células HL-60, denominada HL-525, se aisló exponiendo las células de tipo salvaje a concentraciones bajas de 12-0-tetradecanoilforbol-13-acetato (TPA; 0,5 a 3 nM) en 102 pasos. Estas células se mantuvieron en medio RPMI 1640 que contenía suero bovino fetal al 20% (FBS) con 1 mM de L-glutamina, 100 U/ml de penicilina y 100 \mug/ml de estreptomicina. Se llevó a cabo radiación a la temperatura ambiente utilizando una célula Gamma 1000 (Atomic Energy at Canada Ltd., Ontario) con una fuente Cs^{137} que emitía a una tasa establecida de dosificación de 14,3 Gray (Gy)/min, determinada dosimétricamente.

Aislamiento y análisis del ARN. El ARN celular total se purificó mediante la técnica de cloruro de cesio-isotiocianato de guanidina. El ARN se analizó mediante electroforesis a través de geles de formaldehído agarosa al 1%, se transfirió a filtros de nitrocelulosa, y se hibridizó a las siguientes sondas de ADN marcadas con P^{32}: 1) el inserto BamHI/EcoRI de 1,8 kb de un gen c-Jun humano purificado a partir de un plásmido pBluescript SK(+); 2) el fragmento EcoRI de 1,5 kb del ADNc Jun-B murino a partir del plásmido p465.20; 3) Jun-D; 4) el inserto ScaI/NcoI de 0,9 kb del gen c-fos humano purificado a partir del plásmido pc-fos-1; 5) el inserto PstI de 2,0 kb de un gen de la \beta-actina de pollo purificado a partir del plásmido pA1; y 6) el inserto BamHI/PstI de 1,9 kb de un ADNc TNF humano purificado a partir del plásmido pE4. Se llevaron a cabo hibridizaciones a 42ºC durante 24 horas en formamida (vol/vol) al 50%, 2x SSC, 1x solución de Denhardt, SDS al 0,1%, y 200 \mug/ml de ADN espermático de salmón. Los filtros se lavaron dos veces en 2x SSC-0,1% SDS a temperatura ambiente y entonces, en 0,1 x SSC-0,1% SDS a 60ºC durante 1 hora.

Ensayos de procesamiento nuclear. Se aislaron los núcleos a partir de 10^{8} células y se suspendieron en 100 \mul de tampón de glicerol (50 mM Tris-HCl, pH 8,3, glicerol al 40%, 5 mM MgCl_{2}, y 0,1 mM EDTA). Un volumen igual de tampón reactivo (10 mM Tris-HCl, pH 8,5 mM MgCl_{2},100 mM KCl, 1 mM ATP, 1 mM CTP, 1 mM GTP, y 5 mM ditiotreitol) se añadió a los núcleos en suspensión y se incubó a 26ºC durante 30 minutos con 250 \muCi (\alpha^{-32}P) UTP (3000 Ci/mmol; Dupont, Boston, MA). El ARN nuclear se aisló tal como se describe y se hibridizó a los siguientes ADN: 1) un digesto PstI del plásmido pA1 que contiene un fragmento del gen de la \beta-actina del pollo; y 2) un digesto BamHI/EcoRI del plásmido pBluescript SK(+) que contiene un fragmento del gen c-Jun humano. Los ADN digeridos se procesaron en geles de agarosa al 1% y se transfirieron a filtros de nitrocelulosa. Se realizaron las hibridaciones con 10^{7} cpm de P^{32}ARN/ml en 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 4xSSC, 1 mM EDTA, SDS al 0,1%, 2x solución de Denhardt, formamida al 40%, y 100 \mug/ml de ARNt de levadura durante 72 horas a 42ºC. Los filtros se lavaron en a) 2x SSC-0,1% SDS a 37ºC durante 30 minutos; b) 200 ng/ml RNasa A en 2xSCC a temperatura ambiente durante 5 minutos; y c) 0,1x SSC-0,1% SDS a 42ºC durante 30 minutos.

Ejemplo 3 Protocolo para el tratamiento del cáncer cefálico y del cuello con TNF inducido por rayos X y rayos X terapéuticos

Para el tratamiento de pacientes con cáncer de cabeza y cuello, se siguen las etapas siguientes:

1. Se prepara una molécula de ADN (constructo genético) que comprende un potenciador-promotor según se define en las reivindicaciones, sensible a la radiación, unido funcionalmente a una región codificante que codifica un polipéptido.

Este constructo comprende preferentemente un dominio CArG de un promotor Egr-1 y el gen para el factor de necrosis tumoral. Este constructo se denomina "constructo A" para los propósitos de este ejemplo.

2. El "Constructo A" se dispone en un retrovirus que se autoinactiva.

3. Las células asesinas activadas por la linfoquina (LAK) son infectadas con el retrovirus que transporta el "constructo A". las células van a dirigirse contra las células malignas en la cabeza y en el cuello.

4. Las células LAK infectadas se infunden en el paciente que va a ser tratado.

5. La región de la cabeza y del cuello es irradiada.

Los ejemplos anteriores ilustran formas de realización particular de la presente invención. El experto en la materia apreciará fácilmente que los cambios, modificaciones y alteraciones para dichas formas de realización pueden realizarse sin apartarse del verdadero espíritu del alcance de la invención.

Referencias

Las referencias detalladas a continuación así como todas las referencias citadas en la presente memoria se incorporan a modo de referencia puesto que sirven para complementar, explicar, proporcionar antecedentes, o enseñar metodología, técnicas y/o composiciones utilizadas en la presente memoria.

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Claims

1. Molécula sintética de ADN que comprende un potenciador-promotor sensible a la radiación unido funcionalmente a una región codificante que codifica por lo menos un polipéptido, inhibiendo dicho polipéptido el crecimiento de una célula sometida a inducción por la radiación de dicho promotor, cuya región codificante está unida funcionalmente a una región de finalización-transcripción, en la que dicho potenciador-promotor sensible a la radiación, comprende por lo menos un dominio CArG de un promotor Egr-1.

2. Molécula de ADN según la reivindicación 1, en la que el potenciador-promotor sensible a la radiación comprende un dominio CArG de un promotor Egr-1, cuyo dominio CArG se encuentra dispuesto entre la posición -425 y la posición -395 del promotor Egr-1.

3. Molécula de ADN según la reivindicación 1, en la que el potenciador-promotor sensible a la radiación comprende por lo menos uno de los tres dominios CArG más distales de un promotor Egr-1, cuyos dominios CArG más distales se encuentran dispuestas entre la posición -425 y la posición -342 del promotor Egr-1.

4. Molécula de ADN según la reivindicación 1, en la que el potenciador-promotor sensible a la radiación comprende tres dominios CArG de un promotor Egr-1, cuyos tres dominios CArG más distales se encuentran dispuestas entre la posición -395 y la posición -250 del promotor Egr-1.

5. Molécula de ADN según la reivindicación 1, en la que el promotor inducible por radiación comprende seis dominios CArG de un promotor Egr-1.

6. Molécula de ADN según la reivindicación 1, en la que el potenciador-promotor sensible a la radiación es un promotor Egr-1.

7. Molécula de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que el polipéptido codificado es una citoquina, un factor de supresión tumoral, o un inhibidor de la angiogénesis.

8. Molécula de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que el polipéptido codificado es el factor alfa de necrosis tumoral.

9. Molécula de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que el polipéptido codificado cataliza la conversión de un promedicamento en un medicamento.

10. Molécula de ADN según la reivindicación 9, en la que el polipéptido codificado es la timidina quinasa del virus del herpes simple, o una citosina desaminasa.

11. Molécula de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en la que el potenciador-promotor sensible a la radiación contiene 1205 nucleótidos o menos.

12. Molécula de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, para su utilización en un procedimiento de inhibición del crecimiento de un tumor.

13. Célula transformada o transfectada con una molécula de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.

14. Célula transformada o transfectada según la reivindicación 13 que es una célula tumoral.

15. Vehículo que contiene una molécula de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.

16. Vehículo según la reivindicación 15, en el que el vehículo es un virus.

17. Vehículo según la reivindicación 15, en el que el vehículo es un anticuerpo que reacciona inmunológicamente con un antígeno de un tumor.

18. Vehículo según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17 para su utilización en un procedimiento para la inhibición del crecimiento de un tumor.

19. Utilización in vitro del vehículo según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17, en un procedimiento para la administración de una proteína a una célula tumoral.

20. Composición farmacéutica que comprende un excipiente fisiológicamente aceptable y una molécula de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.

21. Composición farmacéutica según la reivindicación 20, en la que el polipéptido codificado es el factor alfa de necrosis tumoral.

22. Composición farmacéutica que comprende un vehículo según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17 o una célula transformada o transfectada según cualquiera de las reivindicaciones 13 y 14, y un excipiente fisiológicamente aceptable.

23. Composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 20 a 22 para su utilización en un procedimiento de inhibición del crecimiento de un tumor.

24. Utilización in vitro de un potenciador-promotor sensible a la radiación, que comprende por lo menos un dominio CArG de un promotor de Egr-1 para la expresión sensible a la radiación, por lo menos, de un polipéptido que inhibe el crecimiento de una célula.

25. Utilización de una molécula de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 o de una célula transformada o transfectada según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 14 o de un vehículo, según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17, para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento del cáncer y de procesos cancerosos secundarios, que se manifiestan como un efecto secundario de la quimioterapia y radioquimioterapia estándar, ataxia, telangiectasia y/o xeroderma pigmentosum.