ES2242195T3 - Moduladores de proteinas reguladoras. - Google Patents

Abstract

SE PROPORCIONA UN MODULADOR DE SUCESOS CELULARES REGULADORES QUE ACONTECEN INTRACELULARMENTE Y EN LOS QUE INTERVIENEN PROTEINAS REGULADORAS QUE CONTIENEN UN MOTIVO DEL TIPO "DOMINIO DE MUERTE". EL "DOMINIO DE MUERTE" ES UNA PORCION REGULADORA DE LAS PROTEINAS REGULADORAS Y EL MODULADOR ES CAPAZ DE INTERACCIONAR CON UNO O MAS MOTIVOS "DOMINIO DE MUERTE" CONTENIDOS EN LAS PROTEINAS REGULADORAS AFECTANDO LA ACCION REGULADORA DE UNA O MAS DE LAS PROTEINAS REGULADORAS. EL MODULADOR ES CAPAZ DE INTERACCIONAR PREFERIBLEMENTE CON LOS MOTIVOS "DOMINIO DE MUERTE" CONTENIDOS EN P55 1, RIP, TRADD O ANQUIRINA, COMO SE ILUSTRA EN LA FIGURA. TAMBIEN SE PROPORCIONA UN METODO PARA LA PRODUCCION DE MODULADORES. LOS MODULADORES SON UTILES PARA MODULAR FUNCIONES CELULARES EN LAS QUE INTERVIENEN PROTEINAS QUE CONTIENEN EL "DOMINIO DE MUERTE".

Description

Moduladores de proteínas reguladoras.

Campo de la invención

La presente invención está en general en el campo de las proteínas reguladoras que ejercen sus efectos mediante procesos de señalización intracelular que están mediados por elementos reguladores (dominios o motivos) contenidos en los dominios intracelulares de estas proteínas. Más específicamente, la presente invención se refiere a nuevos moduladores de anticuerpo o fragmentos de cualquiera de ellos que son capaces de interaccionar con, o unirse a, el recién descubierto motivo de "dominio de muerte" presente en un amplio intervalo de proteínas relacionadas y no relacionadas, seleccionadas de TNF-R p55, FAS-R, NGF-R, una proteína relacionada MORT-1, proteínas conocidas como TRADD y RIP y la proteína no relacionada anquirina 1. Estos nuevos moduladores son capaces de modular o regular la actividad de las proteínas que contienen el motivo de "dominio de muerte".

Antecedentes de la invención y técnica anterior

Existe un grupo muy grande de proteínas reguladoras que ejercen sus efectos reguladores mediante procesos de señalización intracelular, mediados por partes o motivos reguladores contenidos en estas proteínas. Los miembros de este grupo de proteínas incluyen receptores que pertenecen a la familia de receptores de TNF/NGF tales como, por ejemplo, los receptores p55 y p75 de TNF (TNF-R p55 y p75), el receptor de NGF (NGF-R) y la proteína Fas/APO1 (también denominada receptor de ligando de FAS o FAS-R, y denominada a continuación en la presente memoria FAS-R); estando caracterizados estos receptores por tener un dominio de unión a ligando extracelular, un dominio transmembrana y un dominio intracelular (IC), estando implicado el dominio intracelular o partes del mismo en la mediación de los eventos de señalización intracelular iniciados por la unión del ligando al dominio extracelular. Otros miembros de este grupo incluyen diversas proteínas intracelulares, por ejemplo, proteínas estructurales asociadas al citoesqueleto, las anquirinas, que tienen un dominio regulador que está posiblemente implicado en la capacidad de estas proteínas de asociarse o unirse a otras proteínas citoesqueléticas, por ejemplo espectrina, o a otras proteínas transmembrana. Aún otro miembro de este grupo es la proteína MORT-1 recientemente identificada (también denominada HF1, véanse los documentos pendientes de tramitación IL 112002 e IL 112692), que es capaz de unirse específicamente al dominio intracelular del FAS-R y que es también capaz de autoasociación y de mediar, de manera independiente de ligando, efectos citotóxicos sobre células. En MORT-1, se identificó también un dominio regulador (véase el documento IL 112692).

El factor de necrosis tumoral (TNF-\alpha) y la linfotoxina (TNF-\beta) (en adelante en la presente memoria, TNF designa tanto TNF-\alpha como TNF-\beta) son citocinas proinflamatorias multifuncionales, formadas principalmente por fagocitos mononucleares, que tienen muchos efectos sobre las células (Wallach, D. (1986) en Interferon 7 (Ion Gresser ed.), pág. 83-122, Academic Press, Londres; y Beutler y Cerami (1987)). Tanto TNF-\alpha como TNF-\beta inician sus efectos mediante la unión a receptores de superficie celular específicos. Es probable que algunos de los efectos sean beneficiosos para el organismo: pueden destruir, por ejemplo, células tumorales o células infectadas por virus, y aumentar las actividades antibacterianas de los granulocitos. De este modo, el TNF contribuye a la defensa del organismo contra tumores y agentes infecciosos y contribuye a la recuperación de lesiones. Por tanto, el TNF puede utilizarse como agente antitumoral, en cuya aplicación se une a sus receptores sobre la superficie de células tumorales e inicia así los eventos que conducen a la muerte de las células tumorales. El TNF puede utilizarse también como agente antiinfeccioso.

Sin embargo, tanto TNF-\alpha como TNF-\beta tienen también efectos perjudiciales. Existen evidencias de que la sobreproducción de TNF-\alpha puede desempeñar un papel patogénico importante en varias enfermedades. Por tanto, los efectos de TNF-\alpha, principalmente sobre los vasos, son ahora conocidos por ser una causa importante de los síntomas de shock séptico (Tracey et al., 1986). En algunas enfermedades, el TNF puede causar una pérdida excesiva de peso (caquexia) al suprimir actividades de adipocitos y causar anorexia, y por tanto se denominó al TNF-\alpha caquetina. Se ha descrito también como mediador de la lesión a tejidos en enfermedades reumáticas (Beutler y Cerami, 1987) y como un mediador importante de la lesión observada en reacciones de injerto contra hospedador (Piquet et al., 1987). Además, el TNF es conocido por estar implicado en el proceso de inflamación y en muchas otras enfermedades.

Dos receptores distintos, expresados independientemente, los TNF-R p55 y p75, que se unen específicamente tanto a TNF-\alpha como a TNF-\beta, inician y/o median los efectos biológicos anteriormente observados del TNF. Estos dos receptores tienen dominios intracelulares estructuralmente distintos, sugiriendo que señalizan diferentemente (véase Hohmann et al., 1989; Engelmann et al., 1990; Brockhaus et al., 1990; Loetscher et al., 1990; Schall et al., 1990; Nophar et al., 1990; Smith et al., 1990 y Heller et al., 1990). Sin embargo, los mecanismos celulares, por ejemplo, las diversas proteínas y posiblemente otros factores que están implicados en la señalización intracelular de los TNF-R p55 y p75, han de elucidarse todavía (en el documento IL 109632 se describen por primera vez nuevas proteínas capaces de unirse a los dominios intracelulares de los TNF-R p55 y p75, denominándose estos dominios intracelulares, respectivamente, p75IC y p55IC). Es esta señalización intracelular, que aparece habitualmente después de la unión del ligando, concretamente TNF (\alpha ó \beta), al receptor, la responsable del inicio de la cascada de reacciones que da como resultado en última instancia la respuesta observada de la célula ante el TNF.

Con respecto al efecto citocida anteriormente citado del TNF, en la mayoría de las células estudiadas hasta ahora, este efecto se desencadena principalmente por el TNF-R p55. Los anticuerpos contra el dominio extracelular (dominio de unión a ligando) del TNF-R p55 pueden desencadenar por sí mismos el efecto citocida (véase el documento EP 412486), que se correlaciona con la eficacia de reticulación de receptor por los anticuerpos, que se cree que es la primera etapa en la generación del proceso de señalización intracelular. Además, los estudios mutacionales (Brakebusch et al., 1992; Tartaglia et al., 1993) han mostrado que la función biológica del TNF-R p55 depende de la integridad de su dominio intracelular, y en consecuencia, se ha sugerido que la iniciación de la señalización intracelular que conduce al efecto citocida del TNF aparece como consecuencia de la asociación de dos o más dominios intracelulares del TNF-R p55. Además, el TNF (\alpha y \beta) aparece en forma de un homotrímero y, como tal, se ha sugerido que induce la señalización intracelular a través del TNF-R p55 mediante su capacidad de unirse a y de reticular las moléculas de receptor, concretamente, de causar la agregación de receptor. En los documentos pendientes de tramitación IL 109632 e IL 111125, se describe cómo p55IC y p55DM pueden autoasociarse e inducir, de modo independiente de ligando, efectos asociados a TNF en células.

Es otro miembro de la superfamilia de receptores de TNF/NGF el receptor de FAS (FAS-R), que se ha denominado también el antígeno Fas, una proteína de superficie celular expresada en diversos tejidos y que comparte homología con una serie de receptores de superficie celular, incluyendo TNF-R y NGF-R. El FAS-R media la muerte celular en forma de apoptosis (Itoh et al., 1991) y parece servir como selector negativo de células T autorreactivas, concretamente durante la maduración de células T. El FAS-R media la muerte apoptótica de células T que reconocen autoantígenos. Se ha encontrado también que las mutaciones en el gen FAS-R (lpr) causan un trastorno de linfoproliferación en ratones que se parece a la enfermedad autoinmune humana lupus eritematoso sistémico (LES) (Watanabe-Fukunaga et al., 1992). El ligando del FAS-R parece ser una molécula asociada a la superficie celular portada por, entre otras, células T asesinas (o linfocitos T citotóxicos, CTL), y por tanto cuando dichos CTL se ponen en contacto con células que portan FAS-R, son capaces de inducir la muerte celular apoptótica de las células portadoras de FAS-R. Además, se ha preparado un anticuerpo monoclonal que es específico de FAS-R, siendo capaz este anticuerpo monoclonal de inducir la muerte celular apoptótica en células portadoras de FAS-R, incluyendo células de ratón transformadas con ADNc que codifica FAS-R humano (Itoh et al., 1991).

Se ha encontrado también que diversas otras células normales, además de linfocitos T, expresan el FAS-R sobre su superficie y pueden destruirse mediante el desencadenamiento de este receptor. La inducción incontrolada de dicho proceso de destrucción se sospecha que contribuye a la lesión de tejido en ciertas enfermedades, por ejemplo, la destrucción de células hepáticas en hepatitis aguda. En consecuencia, encontrar vías para limitar la actividad citotóxica del FAS-R puede tener potencial terapéutico.

A la inversa, puesto que se ha encontrado que ciertas células malignas y células infectadas por VIH portan el FAS-R en su superficie, pueden utilizarse anticuerpos contra FAS-R o el ligando de FAS-R para desencadenar los efectos citotóxicos mediados por FAS-R en éstas y proporcionar así un medio para combatir dichas células malignas o células infectadas por VIH (véase Itoh et al., 1991). Encontrar otros medios para potenciar la actividad citotóxica del FAS-R puede tener por lo tanto también potencial terapéutico.

En los documentos pendientes de tramitación IL 109632, IL 111125 e IL 112002, se describe que el dominio intracelular de FAS-R, el denominado FAS-IC, es capaz de autoasociación y contiene en su dominio intracelular una región denominada el "dominio de muerte" (DM) que es el responsable principal de la autoasociación de FAS-IC. Este "dominio de muerte" comparte homología de secuencia con el "dominio de muerte" de TNF-R p55 (p55DM).

Ha sido una necesidad largo tiempo sentida proporcionar un modo de modular la respuesta celular ante TNF (\alpha o \beta) y ligando de FAS-R, por ejemplo, en situaciones patológicas como se citan anteriormente, cuando se sobrexpresa TNF o ligando de FAS-R es deseable inhibir los efectos citocidas inducidos por TNF o el ligando de FAS-R, mientras que en otras situaciones, por ejemplo aplicaciones de curación de heridas, es deseable potenciar el efecto del TNF, o en el caso de FAS-R, en células tumorales o células infectadas por VIH es deseable potenciar el efecto mediado por FAS-R.

Se han propuesto una serie de enfoques por los presentes inventores (véanse, por ejemplo, las solicitudes europeas nº EP 186833, EP 308378, EP 398327 y EP 412486) para regular los efectos perjudiciales del TNF al inhibir la unión de TNF a sus receptores utilizando anticuerpos anti-TNF o utilizando receptores de TNF solubles (que son esencialmente los dominios extracelulares solubles de los receptores) para competir con la unión de TNF a TNF-R unidos a la superficie celular. Además, basándose en que la unión de TNF a sus receptores es necesaria para los efectos celulares inducidos por TNF, se han propuesto enfoques por los presentes inventores (véanse, por ejemplo, el documento IL 101769 y su correspondiente EP 568925) para modular el efecto de TNF mediante la modulación de la actividad de los TNF-R. Brevemente, el documento EP 568925 (IL 101769) se refiere a un método de modulación de la transducción de señal y/o escisión en TNF-R mediante el que los péptidos u otras moléculas pueden interaccionar con el receptor mismo o con proteínas efectoras que interaccionan con el receptor, modulando así el funcionamiento normal de los TNF-R. En el documento EP 568925, se describe la construcción y caracterización de diversos mutantes de TNF-R p55, que tienen mutaciones en los dominios extracelular, transmembrana e intracelular del TNF-R p55. De este modo, se identificaron regiones en los dominios anteriores de TNF-R p55 como esenciales para el funcionamiento del receptor, concretamente la unión del ligando (TNF) y la posterior transducción de señal y señalización intracelular que, en última instancia, da como resultado el efecto de TNF observado sobre las células. Además, se describen también una serie de enfoques para aislar e identificar proteínas, péptidos u otros factores que son capaces de unirse a las diversas regiones en los dominios anteriores del TNF-R, pudiendo estar implicadas dichas proteínas, péptidos y otros factores en la regulación o modulación de la actividad del TNF-R. Se dan a conocer también en el documento EP 568925 una serie de enfoques para aislar y clonar las secuencias de ADN que codifican dichas proteínas y péptidos; para construir vectores de expresión para la producción de estas proteínas y péptidos; y para la preparación de anticuerpos o fragmentos de los mismos que interaccionan con el TNF-R o con las proteínas y péptidos anteriores que se unen a diversas regiones del TNF-R. Sin embargo, no se hace descripción en el documento EP 568925 de las proteínas y péptidos reales que se unen a los dominios intracelulares de los TNF-R (por ejemplo, TNF-R p55) ni se hace descripción alguna del enfoque de dos híbridos de levadura para aislar e identificar dichas proteínas o péptidos que se unen a los dominios intracelulares de los TNF-R. De forma similar, hasta el momento no ha habido ninguna descripción de proteínas ni péptidos capaces de unirse al dominio intracelular de FAS-R.

Por tanto, cuando se desea inhibir el efecto de TNF, o del ligando de FAS-R, sería deseable reducir la cantidad o la actividad de los TNF-R o FAS-R en la superficie celular, mientras que se desearía un aumento en la cantidad o la actividad de los TNF-R o FAS-R cuando se buscara un efecto potenciado de TNF o ligando de FAS-R. Con este fin, los promotores tanto de TNF-R p55 como de TNF-R p75 se han secuenciado y analizado, y se han encontrado una serie de motivos de secuencia clave que son específicos de diversos factores reguladores de la transcripción, y como tal la expresión de estos TNF-R puede controlarse a nivel de su promotor, concretamente, la inhibición de la transcripción desde los promotores para una reducción del número de receptores, y una potenciación de la transcripción desde los promotores para un aumento en el número de receptores (véanse los documentos IL 104355 e IL 109633). Los estudios correspondientes referentes al control de FAS-R al nivel del promotor del gen de FAS-R han de reseñarse todavía.

Además, debe mencionarse también que, aunque es conocido que los receptores de factor de necrosis tumoral (TNF), y el receptor estructuralmente relacionado FAS-R, desencadenan en células, tras la estimulación por ligandos producidos por leucocitos, actividades destructoras que conducen a su propia eliminación, los mecanismos de este desencadenamiento son aún poco conocidos. Los estudios mutacionales indican que en FAS-R y en el receptor de TNF p55 (p55-R), la señalización para citotoxicidad implica distintas regiones en de sus dominios intracelulares (Brakebusch et al., 1992; Tartaglia et al., 1993; Itoh y Nagata, 1993). Estas regiones (los "dominios de muerte") tienen similitud de secuencia. Los "dominios de muerte" tanto de FAS-R como de p55-R tienden a autoasociarse. Esta autoasociación promueve aparentemente la agregación de receptores que es necesaria para el inicio de la señalización (véanse los documentos IL 109632, IL 111125 e IL 112002, así como Song et al., 1994, Wallach et al., 1994, Boldin et al., 1995), y a altos niveles de expresión de receptor, puede dar como resultado el desencadenamiento de señalización independiente de ligando (documentos IL 109632, IL 111125 y Boldin et al., 1995).

Las anquirinas constituyen una familia de proteínas que controla las interacciones entre los componentes integrales de membrana y los elementos citoesqueléticos, y se encuentran en un amplio intervalo de tejidos, tales como tejido cerebral y en eritrocitos, siendo la anquirina de eritrocito la mejor caracterizada. Las anquirinas son proteínas intracelulares asociadas a los elementos citoesqueléticos de la célula y tienen tres dominios: un dominio superior implicado en la unión a los dominios intracelulares de proteínas transmembrana, conteniendo este dominio superior las bien conocidas repeticiones denominadas repeticiones de anquirina; un dominio medio que está implicado en la unión a espectrina, concretamente la unión de espectrina a proteínas transmembrana a través de las anquirinas; y un dominio C-terminal o inferior (o tercero), que es el dominio regulador que puede fosforilarse, regulando este dominio la actividad de los otros dos dominios cuando se fosforila o desfosforila. Este último dominio regulador tiene también tres partes: una parte media que puede eliminarse mediante ayuste alternativo de forma natural, y por tanto ciertas anquirinas tienen estas partes y otras no; y otras dos partes, menos bien caracterizadas (para una revisión de las anquirinas véanse Lux et al., 1990 y Lambert y Bennett, 1993).

Debe observarse, sin embargo, como se da a conocer a continuación en la presente memoria, que según la presente invención se ha descubierto que la parte superior del dominio regulador anteriormente observado (C-terminal) de la anquirina contiene el denominado motivo de "dominio de muerte", que puede funcionar mediando la unión de proteínas entre sí (actividad de los dos primeros dominios de anquirina), o puede funcionar conformacionalmente regulando la proteína anquirina.

El NGF-R es un receptor de NGF de baja afinidad que no está bien caracterizado. El NGF-R se considera que está implicado en la regulación del crecimiento, tal como su posible implicación en la señalización intracelular de los efectos inducidos por NGF. Sin embargo, una reciente publicación da a conocer que la sobreexpresión de NGF-R en ausencia de NGF puede causar la muerte celular. Por tanto, el NGF-R parece tener un papel regulador en la viabilidad celular (véase Radizadeh et al., 1993).

Debe observarse, sin embargo, como se da a conocer a continuación en la presente memoria, que según la presente invención se ha descubierto que el NGF-R contiene un motivo de "dominio de muerte" en su dominio intracelular, que puede estar implicado en la mediación de los eventos intracelulares asociados al papel regulador desempeñado por el NGF-R con respecto a la viabilidad celular.

MORT-1 es una proteína recién descubierta que se une al dominio intracelular de FAS-R, es capaz de autoasociación y puede tener actividad de citotoxicidad celular por sí misma. Por tanto, MORT1 es también una proteína reguladora implicada en procesos de señalización intracelular. Se ha descubierto también que MORT-1 tiene un motivo de "dominio de muerte" que está asociado a su actividad biológica observada (véanse los documentos pendientes de tramitación IL 112002 e IL 112692).

Se han clonado recientemente otras dos proteínas intracelulares: RIP (Stanger et al., 1995) y TRADD (Hsu et al., 1995), que se unen a los dominios intracelulares de TNF-R p55 o FAS-R y aparentemente toman parte en la inducción de su efecto citocida. Se encontró que las tres proteínas, MORT-1, RIP y TRADD, contenían el motivo de secuencia compartido entre los "dominios de muerte" de los dominios intracelulares de TNF-R p55 y FAS-R. Como en los receptores, los motivos de "dominio de muerte" (DM) en las tres proteínas intracelulares parecen ser sitios de interacción proteína-proteína. Las tres proteínas interaccionan con los dominios intracelulares de TNF-R p55 y FAS-R mediante la unión de sus DM con los de los receptores, y tanto en TRADD como en RIP (aunque no en MORT-1), los DM se autoasocian. Se ha encontrado ahora que MORT-1 y TRADD se unen diferencialmente a FAS-R y a TNF-R p55 y se unen también entre sí. Además, ambas se unen eficazmente a RIP.

La interferencia de la interacción entre las tres proteínas intracelulares anteriores dará como resultado la modulación de los efectos causados por esta interacción. Por tanto, la inhibición de la unión de TRADD a MORT-1 puede modular la interacción FAS-R - TNF-R p55. La inhibición de RIP, además de la inhibición anterior de la unión de TRADD a MORT-1, puede modular adicionalmente la interacción FAS-R - TNF-R p55.

Los anticuerpos monoclonales creados contra el "dominio de muerte" de TNF-R p55, específicamente contra el sitio o sitios de unión de TRADD y RIP, pueden utilizarse también para inhibir o evitar la unión de estas proteínas, y por tanto causar la modulación de la interacción entre FAS-R y TNF-R p55.

En un modo análogo al observado anteriormente con respecto a TNF/TNF-R y ligando de FAS/FAS-R, existe también la necesidad de proporcionar un modo de modular la actividad de las proteínas anteriormente observadas, concretamente anquirina, NGF-R y MORT-1, a saber, inhibir su actividad cuando está asociada a efectos perjudiciales, por ejemplo citotoxicidad celular relacionada con enfermedad/trastorno o cambios conformacionales en la forma celular; o para potenciar su actividad cuando se desea ésta, por ejemplo, para la destrucción dirigida de células enfermas, etc.

En las solicitudes pendientes de tramitación IL 109632, IL 111125, IL 112002 e IL 112692, se describen proteínas que están implicadas en la modulación de la actividad de receptores que pertenecen a la familia de receptores de TNF/NGF, estando caracterizadas estas proteínas por ser capaces de unirse/asociarse a los dominios intracelulares de uno o más de estos receptores.

La presente invención se refiere a moduladores de anticuerpo que son capaces de interaccionar con/unirse a uno o más de los denominados motivos de "dominio de muerte" en los dominios intracelulares de proteínas que contienen dichos dominios, siendo estas proteínas las proteínas relacionadas TNF-R p55, FAS-R, NGF-R, una proteína relacionada MORT-1 y las proteínas TRADD y RIP, y la proteína no relacionada anquirina 1. Estos moduladores se caracterizan por reconocer rasgos estructurales generales comunes con los motivos de "dominio de muerte" de proteínas que contienen el motivo de "dominio de muerte", y también por reconocer rasgos estructurales específicos presentes en cada uno de los diferentes motivos de "dominio de muerte" de estas proteínas.

En consecuencia, es un objetivo de la invención proporcionar moduladores, como se observa anteriormente, capaces de unirse a o interaccionar con los motivos de "dominio de muerte" de una o más de las proteínas que contienen motivo de "dominio de muerte", y modular así la actividad de estas proteínas.

Es posible proporcionar antagonistas (por ejemplo, anticuerpos) de una clase de moduladores, a saber, las proteínas o péptidos de origen natural que se unen a proteínas que contienen el motivo de "dominio de muerte", y dichos antagonistas pueden utilizarse para inhibir el proceso de señalización, cuando se desee, cuando dichas proteínas o péptidos de unión a motivos de "dominio de muerte" sean efectoras de señal positiva (concretamente, induzcan la señalización), o para potenciar el proceso de señalización, cuando se desee, cuando dichas proteínas de unión a motivo de "dominio de muerte" sean efectoras de señal negativa (concretamente, inhiban la señalización).

Dichas proteínas o péptidos de unión al motivo de "dominio de muerte" pueden utilizarse también para aislar y caracterizar proteínas o factores adicionales que pueden estar implicados, por ejemplo, cadena más abajo en el proceso de señalización, y/o para aislar e identificar otros receptores cadena más arriba en el proceso de señalización a los que se unen estas proteínas de unión al motivo de "dominio de muerte", y por tanto, en cuya función están también implicados.

Además, es un objetivo de la presente invención utilizar las proteínas de unión al motivo de "dominio de muerte" anteriormente citadas como antígenos para la preparación de anticuerpos policlonales y/o monoclonales del mismo. Los anticuerpos, a su vez, pueden utilizarse para la purificación de las nuevas proteínas de unión al motivo de "dominio de muerte" de diferentes fuentes, tales como extractos celulares o estirpes celulares transformadas.

Además, estos anticuerpos pueden utilizarse con fines de diagnóstico, por ejemplo, para identificar trastornos relacionados con el funcionamiento anormal de efectos celulares mediados por las diversas proteínas pertenecientes al grupo de proteínas que contienen el motivo de "dominio de muerte".

Las composiciones farmacéuticas que comprenden los moduladores de unión al motivo de "dominio de muerte" anteriores (proteínas, péptidos, moléculas orgánicas) y las composiciones farmacéuticas que comprenden los antagonistas de proteína o péptido de unión al motivo de "dominio de muerte", pueden proporcionarse para el tratamiento o la profilaxis de afecciones relacionadas con la actividad de proteínas que contienen el motivo de "dominio de muerte", por ejemplo, dichas composiciones pueden utilizarse para potenciar el efecto o efectos de TNF o ligando de FAS mediados por NGF-R, MORT-1, RIP, TRADD y anquirina, o para inhibir el efecto o efectos de TNF o ligando de FAS mediados, dependiendo de la naturaleza anteriormente observada de los moduladores o antagonistas de unión al motivo de "dominio de muerte" del mismo contenidos en la composición.

Los diversos motivos de "dominio de muerte" de las proteínas que los contienen pueden utilizarse para el diseño y la síntesis de péptidos complementarios y moléculas orgánicas que serán moduladoras de estas proteínas.

Sumario de la invención

La presente invención está basada en el descubrimiento sorprendente e inesperado de que existe un denominado motivo de "dominio de muerte" en un amplio intervalo de proteínas, algunas de las cuales están relacionadas y otras que no están relacionadas. Por ejemplo, este motivo de "dominio de muerte" se ha encontrado en TNF-R p55, FAS-R, NGF-R, MORT1, RIP y TRADD, que están relacionadas entre sí, así como en la proteína no relacionada anquirina
1.

Como se observó anteriormente, el motivo "dominio de muerte" de las proteínas que contienen este motivo está localizado en el dominio regulador intracelular de estas proteínas. Por tanto, el motivo de "dominio de muerte" parece estar implicado en una función reguladora asociada a la viabilidad celular (muerte celular), así como en la forma/conformación celular, estando efectuada esta función en (concretamente en el caso de receptores que contienen este motivo) o cerca de (concretamente en el caso de proteínas intracelulares estructurales, por ejemplo anquirina) la superficie celular. Además, la observación según la presente invención de que el motivo de "dominio de muerte" está conservado entre un amplio intervalo de proteínas relacionadas y no relacionadas indica que este motivo puede tener una función reguladora importante.

Puede proporcionarse un modulador de eventos celulares reguladores de origen intracelular que están mediados por proteínas reguladoras que contienen un motivo de "dominio de muerte", que es una parte reguladora de dichas proteínas, siendo capaz dicho modulador de interaccionar con uno o más de los motivos de "dominio de muerte" contenidos en dichas proteínas reguladoras y de afectar la acción reguladora de una o más de dichas proteínas reguladoras.

Los ejemplos de dichos moduladores incluyen:

(i) Un modulador, en el que dicho modulador se selecciona del grupo que comprende proteínas y péptidos de unión al motivo de "dominio de muerte" derivado naturalmente y análogos y derivados de los mismos capaces de interaccionar con uno o más de dichos motivos de "dominio de muerte".

(ii) Un modulador, en el que dicho modulador se selecciona del grupo de péptidos complementarios producidos sintéticamente, sintetizados utilizando como sustratos las secuencias del motivo de "dominio de muerte" de dichas proteínas reguladoras que contienen motivos de "dominio de muerte", siendo capaces dichos péptidos complementarios de interaccionar con uno o más de dichos motivos de "dominio de muerte".

(iii) Un modulador, en el que dicho modulador se selecciona del grupo que comprende anticuerpos o fragmentos activos de los mismos capaces de interaccionar con uno o más de dichos motivos de "dominio de muerte".

(iv) Un modulador, en el que dicho modulador se selecciona del grupo de compuestos orgánicos capaces de interaccionar con uno o más de dichos motivos de "dominio de muerte", derivando dichos compuestos orgánicos de compuestos conocidos y seleccionados utilizando dichos motivos de "dominio de muerte" como sustrato en un ensayo de unión, o sintetizándose utilizando dichos motivos de "dominio de muerte" como sustrato para diseñar y sintetizar dichos compuestos orgánicos.

(v) Un modulador, en el que dicho modulador se selecciona del grupo de péptidos o polipéptidos derivados de secuencias de motivo de "dominio de muerte" de origen natural, siendo capaces dichos péptidos o polipéptidos de interaccionar con uno o más de dichos motivos de "dominio de muerte", y análogos y derivados de dichos péptidos o polipéptidos capaces de interaccionar con uno o más de dichos motivos de "dominio de muerte".

(vi) Un modulador de uno cualquiera de (i)-(v), en el que dicho modulador se caracteriza adicionalmente por ser capaz de reconocer los rasgos de secuencia del motivo de "dominio de muerte" generales comunes a los motivos de "dominio de muerte" de proteínas que contienen el motivo de "dominio de muerte", y por ser capaces de reconocer uno o más de los motivos de "dominio de muerte" específicos de dichas proteínas, siendo específicos dichos rasgos de secuencia específicos de cada secuencia de motivo de "dominio de muerte" de cada una de dichas proteínas.

(vii) Un modulador de uno cualquiera de (i)-(vi), en el que dicho modulador es capaz de interaccionar con uno o más de los motivos de "dominio de muerte" contenidos en las proteínas que pertenecen al grupo que comprende TNF-R p55, FAS-R, NGF-R, MORT-1, RIP, TRADD y anquirina 1.

(viii) Un modulador de (vii), en el que dicho modulador se caracteriza adicionalmente por ser capaz de interaccionar con rasgos de secuencia comunes de los motivos de "dominio de muerte" de dicho grupo de proteínas, comprendiendo dichos rasgos de secuencia comunes el grupo de residuos aminoacídicos comunes W (triptófano), L (leucina), I (isoleucina), A (alanina), D (ácido aspártico), E (ácido glutámico), T (treonina), R (arginina) e Y (tirosina) en la localización en dichos motivos de "dominio de muerte" mostrada en la Fig. 1.

Según una primera realización de la invención, se proporciona un anticuerpo específico del dominio de muerte de una proteína reguladora que contiene un dominio de muerte, o un fragmento de uno de dichos anticuerpos, que es capaz de unirse a dicho dominio de muerte, siendo la proteína reguladora NGF-R.

En un aspecto de la primera realización, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo es capaz adicionalmente de unirse al dominio de muerte de una o ambas proteínas reguladoras que contienen dominio de muerte MORT-1 y anquirina 1.

En un aspecto adicional de la primera realización, el anticuerpo o fragmento es capaz adicionalmente de unirse al dominio de muerte de al menos una proteína reguladora seleccionada de TNF-R p55, FAS-R, RIP y TRADD.

En la realización y aspectos anteriores, el anticuerpo puede comprender un anticuerpo monoclonal.

Puede proporcionarse una secuencia de ADN que codifica un modulador que es una proteína, péptido o polipéptido o un análogo de uno cualquiera de (i), (ii) y (vii).

Un ejemplo de esta secuencia de ADN es una secuencia de ADN que codifica una proteína o péptido derivado naturalmente seleccionado del grupo constituido por:

(a) una secuencia de ADNc derivada de la región de codificación de una proteína o péptido de unión al motivo de "dominio de muerte" nativo;

(b) secuencias de ADN capaces de hibridación con una secuencia (a) en condiciones moderadamente estrictas y que codifican una proteína o péptido de unión al motivo de "dominio de muerte" biológicamente activo; y

(c) secuencias de ADN que son degeneradas como resultado del código genético con las secuencias de ADN definidas en (a) y (b), y que codifican una proteína o péptido de unión al motivo de "dominio de muerte" biológicamente activo.

Son otros ejemplos de esta secuencia de ADN:

(i) Secuencia de ADN que codifica una proteína o péptido de unión al motivo de "dominio de muerte" capaz de unirse al motivo de "dominio de muerte" de una o más de las proteínas del grupo que comprende TNF-R p55, FAS-R, NGF-R, MORT-1 y anquirina 1.

(ii) Secuencia de ADN que codifica un péptido o polipéptido derivado de la secuencia del motivo de "dominio de muerte" de origen natural de proteínas que contienen el motivo de "dominio de muerte".

(iii) Secuencia de ADN que codifica un péptido o polipéptido derivado de la secuencia del motivo de "dominio de muerte" de una cualquiera de las proteínas del grupo que comprende TNF-R p55, FAS-R, NGF-R, MORT-1, RIP, TRADD y anquirina 1.

Además, puede proporcionarse también:

(a) Una proteína, péptido o polipéptido y análogos de uno cualquiera de los mismos codificado por una secuencia de ADN de la invención, siendo capaz dicha proteína, péptido, polipéptido y análogos de unirse a o de interaccionar con uno o más de los motivos de "dominio de muerte" de una o más proteínas que contienen el motivo de "dominio de muerte".

(b) Un vector que comprende una secuencia de ADN de la invención.

(c) Un vector de (b) capaz de expresarse en una célula hospedadora eucariótica.

(d) Un vector de (b) capaz de expresarse en una célula hospedadora procariótica.

(e) Células hospedadoras eucarióticas o procarióticas transformadas que contienen un vector de (b), (c) o (d).

(f) Un método para producir la proteína, péptido, polipéptido o análogos de (a) que comprende hacer crecer las células hospedadoras transformadas de (e) en condiciones adecuadas para la expresión de dicha proteína, péptido, polipéptido o análogos, efectuar las modificaciones postraduccionales de dicha proteína, péptido, polipéptido o análogos según sea necesario para la obtención del mismo, y extraer dicha proteína, péptido, polipéptido o análogos del medio de cultivo de dichas células transformadas o de extractos celulares de dichas células transformadas.

(g) Anticuerpos o fragmentos activos de derivados de los mismos, específicos de la proteína, péptido, polipéptido o análogos de (a).

Puede proporcionarse también un método para la modulación del efecto de TNF o ligando de FAS-R sobre células mediado por TNF-R p55 y FAS-R, o las funciones mediadas en células por NGF-R, MORT-1, RIP, TRADD, anquirina 1 o por otras proteínas que contienen un motivo de "dominio de muerte", que comprende tratar dichas células con una o más proteínas, péptidos, polipéptidos o análogos seleccionados del grupo constituido por las proteínas, péptidos, polipéptidos o análogos especificados en la parte (a) anterior, siendo todos capaces de unirse a o interaccionar con el motivo de "dominio de muerte" y modular la actividad de dichas proteínas que contienen el motivo de "dominio de muerte", comprendiendo dicho tratamiento de dichas células introducir en dichas células una o más proteínas, péptidos, polipéptidos o análogos en una forma adecuada para la introducción intracelular de los mismos, o introducir en dichas células una secuencia de ADN que codifica una o más de dichas proteínas, péptidos, polipéptidos o análogos en forma de un vector adecuado portador de dicha secuencia, siendo capaz dicho vector de efectuar la inserción de dicha secuencia en dichas células de modo que dicha secuencia se exprese en dichas células.

Es un ejemplo del método anterior un método en el que dicho tratamiento de dichas células es mediante transfección de dichas células con un vector viral animal recombinante, que comprende las etapas de:

(a) construir un vector viral animal recombinante portador de una secuencia que codifica una proteína de superficie viral (ligando) que es capaz de unirse a un receptor de superficie celular específico en la superficie de dicha célula a tratar, y una segunda secuencia que codifica una proteína seleccionada de las proteínas, péptidos, polipéptidos y análogos de la invención, siendo capaz dicha proteína, péptido, polipéptido o análogo, cuando se expresa en dichas células, de modular la actividad de dicha proteína que contiene el motivo de "dominio de muerte"; y

(b) infectar dichas células con dicho vector de (a).

Otro método es un método para modular el efecto de TNF o ligando de FAS-R sobre células mediado por TNF-R p55 y FAS-R, o las funciones mediadas en células por NGF-R, MORT-1, RIP, TRADD, anquirina 1 o por otras proteínas que contienen un motivo de "dominio de muerte", que comprende tratar dichas células con anticuerpos o fragmentos activos o derivados de los mismos como se especifica en la parte (g) anterior, siendo dicho tratamiento mediante aplicación de una composición adecuada que contiene dichos anticuerpos, fragmentos activos o derivados de los mismos a dichas células, estando formulada dicha composición para aplicación intracelular.

Es aún otro método un método para modular el efecto de TNF o ligando de FAS-R sobre células mediado por TNF-R p55 y FAS-R, o las funciones mediadas en células por NGF-R, MORT-1, RIP, TRADD, anquirina 1 o por otras proteínas que contienen un motivo de "dominio de muerte", que comprende tratar dichas células con una secuencia oligonucleotídica seleccionada de una secuencia que codifica una secuencia sin sentido de al menos parte de la secuencia de la invención como se observa anteriormente, siendo capaz dicha secuencia oligonucleotídica de bloquear la expresión de al menos una de las proteínas o péptidos de unión al motivo de "dominio de muerte".

Es un ejemplo del método anterior un método en el que dicha secuencia oligonucleotídica se introduce en dichas células mediante un vector viral como se observa anteriormente, codificando dicha segunda secuencia de dicho virus dicha secuencia oligonucleotídica.

Son otros métodos:

(i) Un método para tratar células tumorales o células infectadas por VIH u otras células enfermas, que comprende:

(a) construir un vector viral animal recombinante portador de una secuencia que codifica una proteína de superficie viral que es capaz de unirse a un receptor de superficie de célula tumoral específico o receptor de superficie de célula infectada por VIH o receptor portado por otras células enfermas, y de una secuencia que codifica una proteína seleccionada de las proteínas, péptidos, polipéptidos y análogos dados a conocer en la presente memoria, siendo capaz dicha proteína, péptido, polipéptido o análogo, cuando se expresa en dicho tumor, célula infectada por VIH u otras células enfermas, de destruir dicha célula; y

(b) infectar dicho tumor o células infectadas por VIH u otras células enfermas con dicho vector de (a).

(ii) Un método para modular el efecto de TNF o ligando de FAS-R sobre células mediado por TNF-R p55 y FAS-R, o las funciones mediadas en células por NGF-R, MORT-1, RIP, TRADD, anquirina 1 o por otras proteínas que contienen un motivo de "dominio de muerte", que comprende aplicar el procedimiento de ribozima, en el que un vector que codifica una secuencia de ribozima capaz de interaccionar con una secuencia de ARNm celular que codifica una proteína o péptido de la invención se introduce en dichas células en una forma que permite la expresión de dicha secuencia de ribozima en dichas células, y en el que cuando dicha secuencia de ribozima se expresa en dichas células, interacciona con dicha secuencia de ARNm celular y escinde dicha secuencia de ARNm, dando como resultado la inhibición de la expresión de dicha proteína o péptido en dichas células.

(iii) Un método para aislar e identificar proteínas, péptidos, factores o receptores capaces de unirse a proteínas o péptidos de unión al motivo de "dominio de muerte" dado a conocer en la presente memoria, que comprende aplicar el procedimiento de cromatografía de afinidad, en el que dicha proteína o péptido se une a la matriz de cromatografía de afinidad, se pone en contacto dicha proteína unida con un extracto celular y proteínas, factores o receptores de extracto celular que, unidos a dicha proteína unida, después se eluyen, se aíslan y se analizan.

(iv) Un método para aislar e identificar proteínas capaces de unirse a las proteínas o péptidos de unión al motivo de "dominio de muerte" dados a conocer en la presente memoria, que comprende aplicar el procedimiento de dos híbridos de levadura, en el que una secuencia que codifica dicha proteína de unión al motivo de "dominio de muerte" es portada por un vector híbrido y una secuencia de una biblioteca de ADNc o ADN genómico es portada por el segundo vector híbrido, utilizándose después los vectores para transformar células hospedadoras de levadura, y aislándose las células transformadas positivas, seguido de extracción del segundo vector híbrido para obtener una secuencia que codifica una proteína que se une a dicha proteína de unión al motivo de "dominio de muerte".

Puede proporcionarse también una composición farmacéutica para la modulación del efecto de TNF o ligando de FAS-R sobre células mediado por TNF-R p55 y FAS-R, o las funciones mediadas en células por NGF-R, MORT-1, RIP, TRADD, anquirina 1 o por otras proteínas que contienen un motivo de "dominio de muerte" que comprende, como ingrediente activo, un modulador de la invención.

Los ejemplos de dichas composiciones farmacéuticas incluyen:

(i) Una composición farmacéutica para modular el efecto de TNF o ligando de FAS-R sobre células mediado por TNF-R p55 y FAS-R, o las funciones mediadas en células por NGF-R, MORT-1, RIP, TRADD, anquirina 1 o por otras proteínas que contienen un motivo de "dominio de muerte", que comprende como ingrediente activo un vector viral animal recombinante que codifica una proteína capaz de unirse a un receptor de superficie celular y codificar una proteína o péptido o análogos del mismo como se da a conocer en la presente memoria.

(ii) Una composición farmacéutica para modular el efecto de TNF o ligando de FAS-R sobre células mediado por TNF-R p55 y FAS-R, o las funciones mediadas por células en NFG-R, MORT-1, RIP, TRADD, anquirina 1 o por otras proteínas que contienen un motivo de "dominio de muerte", que comprende como ingrediente activo una secuencia oligonucleotídica que codifica una secuencia sin sentido de la secuencia dada a conocer en la presente memoria.

Es aún otro método un método para aislar e identificar una proteína capaz de unirse a motivos de "dominio de muerte" de proteínas que contienen el motivo de "dominio de muerte", que comprende aplicar el procedimiento de hibridación Southern no estricto seguido por clonación por PCR, en el que se utiliza una secuencia como se da a conocer en la presente memoria o partes de la misma como sonda para unir secuencias de una biblioteca de ADNc o ADN genómico que tiene al menos una homología parcial con la misma, amplificándose después dichas secuencias unidas y clonándose mediante el procedimiento de PCR, proporcionando clones que codifican proteínas que tienen al menos homología parcial con dichas secuencias.

Además, se proporciona también un método para diseñar fármacos que son capaces de modular la actividad de proteínas que contienen el motivo de "dominio de muerte", que comprende los procedimientos descritos en la presente memoria en los ejemplos 3 y 4.

Se proporcionan también otros aspectos y realizaciones de la presente invención que surgen de la siguiente descripción detallada de la invención.

Debe observarse que, cuando se utilizan a lo largo del documento, se entiende que las siguientes expresiones: "Modulación/mediación del efecto de TNF o ligando de FAS-R sobre células mediado por TNF-R p55 y FAS-R, o las funciones mediadas en células por NGF-R, MORT-1, RIP, TRADD, anquirina 1 o por otras proteínas que contienen un motivo de ``dominio de muerte''" abarcan tanto tratamiento in vitro como in vivo.

Además, cuando se utilizan a lo largo del documento, los anticuerpos de la invención y los métodos que utilizan estos anticuerpos incluyen los denominados anticuerpos "humanizados" o el uso de los mismos.

Breve descripción de los dibujos

La Fig. 1 describe esquemáticamente la homología de secuencia del motivo de "dominio de muerte" en MORT-1, TNF-R p55, Fas/APO1 (FAS-R), receptor de NGF de baja afinidad (NGF-R) y la parte C-terminal del dominio regulador en anquirina 1 (anquirina 1), como se describe en el ejemplo 1.

La Fig. 2 describe interacciones de los "dominios de muerte" de p55-R, Fas/APO1, MORT-1, TRADD y RIP en un ensayo de dos híbridos de levadura, y el efecto de mutaciones de tipo lpr^{cg} en estas proteínas sobre sus interacciones. La evaluación de la interacción de constructos de híbrido Gal4 abarca las siguientes proteínas humanas, truncadas cadena arriba de sus motivos de DM: p55-R (residuos 326-426), FAS-R (residuos 210-319), MORT-1 (residuos 92-208), TRADD (residuos 195-312) y RIP (residuos 261-372), así como los siguientes mutantes puntuales de estas proteínas: p55-R L351N, FAS-R V238N, MORT-1 V121N y RIP F308N, cuyos sitios de mutación en los DM corresponden a los encontrados en el FAS-R de ratones lpr^{cg}. Cada inserto de ADNc se introdujo tanto en constructos del dominio de unión de ADN de Gal4 (DUA) como del dominio de activación de Gal4 (DA) (pGBT9 y pGAD-GH), y se evaluó la unión de los insertos en ambos constructos con todos los demás insertos en levaduras SFY526 transfectadas mediante un ensayo de filtro de expresión de \beta-galactosidasa. Los resultados se presentan en términos del tiempo necesario para el desarrollo de un color fuerte. ND= no realizado.

La Fig. 3 es un diagrama ilustrativo de las interacciones de DM observadas en los ensayos de dos híbridos de levadura. Las longitudes y grosores de las flechas que conectan los iconos de DM se corresponden con la intensidad de las interacciones observadas en el experimento descrito en la Fig. 2.

La Fig. 4 describe interacciones de MORT-1, TRADD y RIP en células HeLa transfectadas. Se expresaron MORT-1 (nucleótidos 19-753 con el número de acceso GenBank U24231), condensada en su terminación N con octapéptidos FLAG, y los DM de TRADD (aminoácidos 195-312) y RIP (aminoácidos 261-372), condensados en sus terminaciones N con octapéptido FLAG o epítopo HA (Field et al., 1988), solos o en mezclas de dos en células HeLa y marcados metabólicamente con [^{35}S]-Cys y [^{35}S]-Met. Se realizó la inmunoprecipitación cruzada de las proteínas coexpresadas utilizando los anticuerpos indicados. Se analizaron las proteínas mediante electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida (15% de acrilamida), seguido de autorradiografía. En lisados celulares que contenían MORT-1 y RIP, pudo obtenerse la coinmunoprecipitación de ambas proteínas utilizando anticuerpos contra cualquiera de ellas. Sin embargo, en lisados que contenían TRADD y RIP, se observó coinmunoprecipitación de las dos proteínas sólo cuando se utilizó anticuerpo contra RIP, y en lisados que contenían TRADD y MORT-1, sólo con un anticuerpo contra TRADD, aparentemente debido a impedimento estérico.

Descripción detallada de la invención

Pueden proporcionarse nuevas proteínas o péptidos que son capaces de unirse a uno o más motivos de "dominio de muerte" de proteínas que contienen el motivo de "dominio de muerte" mediante el reconocimiento de rasgos de secuencia comunes a los motivos de "dominio de muerte" en estas proteínas. Por tanto, las proteínas o péptidos de unión al motivo de "dominio de muerte" se consideran mediadores o moduladores de este grupo de proteínas que contienen el motivo de "dominio de muerte". Este grupo de proteínas que contienen el motivo de "dominio de muerte" incluye: (i) miembros de la familia de receptores de TNF/NGF tales como, por ejemplo, TNF-R p55, FAS-R (Fas/APO1) y el receptor de baja afinidad de NGF (NGF-R); (ii) otras proteínas relacionadas tales como, por ejemplo, la proteína recientemente descubierta denominada MORT-1 (o HF1) (por "mediador de la toxicidad mediada por receptor") que, entre sus características, es capaz de autoasociación y unión específica al dominio intracelular de FAS-R; así como (iii) proteínas aparentemente no relacionadas tales como, por ejemplo, la proteína citoesquelética anquirina 1. El motivo de "dominio de muerte" y algunas de sus características se han dado a conocer con respecto a TNF-R p55, FAS-R y MORT-1 en las solicitudes israelíes pendientes de tramitación nº 109632, 111125, 112002 y 112692. El motivo de "dominio de muerte" presente en NGF-R y anquirina 1 se ha descubierto según la presente invención (véase el ejemplo 1).

En las solicitudes pendientes de tramitación anteriormente observadas, se describe una serie de proteínas capaces de unirse específicamente a los dominios intracelulares de TNF-R p55 y/o FAS-R, incluyendo dichas proteínas MORT-1. Sin embargo, en contraposición, se describen por la presente proteínas o péptidos que se unen específicamente al motivo de "dominio de muerte" de una o más de las proteínas anteriormente citadas que pertenecen al grupo caracterizado por tener dicho motivo de "dominio de muerte", siendo la unión/interacción entre estas proteínas o péptidos y el motivo de "dominio de muerte" mediante rasgos de secuencia comunes a los diversos motivos de "dominio de muerte". Por tanto, estas proteínas o péptidos se caracterizan por ser capaces de modular o mediar la actividad de uno o más de los miembros de este grupo de proteínas mediante el reconocimiento de rasgos comunes con los motivos de "dominio de muerte".

En consecuencia, existe un gran grupo de proteínas o péptidos que se unen a los diversos motivos de "dominio de muerte", en el que algunas de las proteínas o péptidos se unen a motivos de "dominio de muerte" específicos de proteínas o receptores específicos, mientras que otros se unen a más de uno de dichos motivos o a más de uno de dichas proteínas/receptores. De la Fig. 1 se deduce que los rasgos de secuencia comunes de los motivos de "dominio de muerte" en proteínas que contienen el motivo de "dominio de muerte" tales como TNF-R p55, FAS-R, NGF-R, MORT1 y anquirina 1 incluyen residuos aminoacídicos comunes (residuos marcados con un fondo negro) tales como W (triptófano), L (leucina), I (isoleucina), A (alanina), D (ácido aspártico) y E (ácido glutámico), así como T (treonina), R (arginina) e Y (tirosina), en la localización mostrada en la Fig. 1

Las proteínas o péptidos dados a conocer en la presente memoria pueden obtenerse como se describe en las solicitudes de patente pendientes de tramitación anteriormente observadas (véase también el ejemplo 3), mediante el uso del procedimiento de dos híbridos de levadura en el que el motivo de "dominio de muerte" de, por ejemplo, TNF-R p55, FAS-R, MORT-1, NGF-R, anquirina 1, se utilizará como sondas o "cebos" para aislar de bibliotecas genómicas o de ADNc clones que expresen proteínas o péptidos capaces de unirse a uno o más de estos motivos de "dominio de muerte". Como alternativa, puede sintetizarse una secuencia de ADN sintética en la que se incluyan todos los rasgos de secuencia comunes de los motivos de "dominio de muerte" de TNF-R p55, FAS-R, MORT-1, NGF-R, anquirina 1 (véase la Fig. 1), proporcionando una secuencia de motivo de "dominio de muerte" común o "universal", que a su vez puede utilizarse en el procedimiento de dos híbridos de levadura para aislar e identificar clones a partir de bibliotecas de ADNc o genómicas que codifiquen proteínas o péptidos capaces de unirse a esta secuencia de motivo de "dominio de muerte".

Otros enfoques para obtener las proteínas y péptidos incluyen procedimientos estándar bien conocidos tales como, por ejemplo, cromatografía de afinidad en la que, por ejemplo, se unen péptidos o fragmentos de proteína que tienen la secuencia del motivo de "dominio de muerte" de TNF-R p55, FAS-F, MORT-1, NGF-R y anquirina 1; o un péptido del motivo de "dominio de muerte" producido sintéticamente que tiene rasgos de secuencia comunes a todos los motivos de "dominio de muerte" anteriormente citados (véase la Fig. 1), al sustrato o matriz cromatográfico y se ponen en contacto con extractos o lisados celulares (de origen humano/mamífero), y se aíslan así proteínas o péptidos que son capaces de unirse a uno o más de estos motivos de "dominio de muerte". Igualmente, pueden emplearse otros procedimientos químicos estándar y de ADN recombinante empleados habitualmente para aislar proteínas o péptidos capaces de unión a una secuencia aminoacídica específica (secuencia de motivo de "dominio de muerte") para obtener las proteínas y péptidos necesarios.

Por tanto, el enfoque anterior se refiere también a secuencias de ADN que codifican las proteínas y péptidos de la invención y a las proteínas y péptidos codificados por estas secuencias.

Además, el enfoque anterior se refiere también a secuencias de ADN que codifican análogos y derivados biológicamente activos de estas proteínas y péptidos, y a los análogos y derivados codificados por las mismas. La preparación de dichos análogos y derivados es mediante procedimiento estándar (véase, por ejemplo, Sambrook et al., 1989), en el que en las secuencias de ADN que codifican estas proteínas pueden eliminarse, añadirse o sustituirse por otro uno o más codones, proporcionando análogos que tienen al menos un cambio de residuo aminoacídico con respecto a la proteína nativa. Son análogos aceptables aquellos que retienen al menos la capacidad de unirse al motivo de "dominio de muerte" de uno o más de los miembros del grupo anteriormente citado de proteínas que contienen el motivo de "dominio de muerte", o que pueden mediar cualquier otra actividad de unión o enzimática, por ejemplo, análogos que se unen al motivo de "dominio de muerte" pero que no señalizan, concretamente no se unen a un receptor, proteína u otro factor cadena abajo adicional, o que no catalizan una reacción dependiente de la señal. De dicha manera, pueden producirse análogos que tienen el denominado efecto dominante negativo, es decir, un análogo que es defectivo en la unión al motivo de "dominio de muerte" o en la señalización posterior después de dicha unión. Dichos análogos pueden utilizarse, por ejemplo, para inhibir el efecto mediado por TNF, ligando de FAS, NGF-R, MORT-1 y anquirina 1 al competir con las proteínas de unión a IC naturales.

Igualmente, pueden producirse los denominados análogos positivos dominantes que servirían para potenciar, por ejemplo, el efecto mediado por TNF, ligando de FAS, NGF-R, MORT-1 y anquirina 1. Estos tendrían las mismas propiedades de unión al motivo de "dominio de muerte" o mejores y las mismas propiedades de señalización o mejores que las proteínas de unión al motivo de "dominio de muerte" natural. De forma similar, pueden prepararse derivados mediante modificaciones estándar de los grupos laterales de uno o más residuos aminoacídicos de las proteínas, o mediante conjugación de las proteínas a otra molécula, por ejemplo, un anticuerpo, enzima, receptor, etc., como son bien conocidas en la técnica.

Estas nuevas proteínas y péptidos de unión al motivo de "dominio de muerte", por ejemplo, las proteínas y péptidos capaces de unirse a uno o más de los motivos de "dominio de muerte" de TNF-R p55, FAS-R, MORT-1, NGF-R y anquirina 1, así como RIP y TRADD, tienen una serie de usos posibles, por ejemplo:

(i) Pueden utilizarse para imitar o potenciar la función de TNF o ligando de FAS-R, o las funciones mediadas por NGF-R, MORT-1, RIP, TRADD y anquirina 1 u otras proteínas que contienen el motivo de "dominio de muerte" en situaciones en las que se desea dicho efecto potenciado, tales como en aplicaciones antitumorales, antiinflamatorias o anti-VIH o de otras enfermedades/trastornos en los que se desea una actividad potenciada. En este caso, las proteínas o péptidos pueden introducirse en las células mediante procedimientos estándar conocidos per se. Por ejemplo, ya que es necesario que las proteínas o péptidos actúen intracelularmente, concretamente, se unan a/interaccionen con motivos de "dominio de muerte" localizados intracelularmente, y se desea que se introduzcan sólo en las células en que su efecto es deseado, es necesario un sistema para la introducción específica de estas proteínas en las células. Un modo de hacer esto es creando un virus animal recombinante, por ejemplo, un derivado de Vaccinia, en cuyo ADN se introducirán los siguientes dos genes: el gen que codifica un ligando que se une a proteínas de superficie celular expresadas específicamente por las células, por ejemplo, tales como la proteína gp120 de virus del SIDA (VIH) que se une específicamente a algunas células (linfocitos CD4 y leucemias relacionadas), o un ligando que se une específicamente a eritrocitos o tejido nervioso (en el caso de la anquirina 1), o un ligando que se une específicamente a células caracterizadas por expresar otros miembros del grupo de proteínas que contienen el motivo de "dominio de muerte", por ejemplo aquellas que expresan MORT-1, RIP, TRADD o cualquier otro ligando que se una específicamente a células portadoras de un TNF-R, FAS-R o NGF-R, de tal modo que el vector viral recombinante sea capaz de unirse a dichas células; y el gen que codifica la nueva proteína o péptido de unión al motivo de "dominio de muerte". Por tanto, la expresión de la proteína de unión a la superficie celular sobre la superficie del virus dirigirá específicamente el virus a la célula tumoral, a células infectadas por VIH u otras células, después de lo cual la secuencia que codifica la proteína o péptido de unión al motivo de "dominio de muerte" se introducirá en las células mediante el virus, y una vez expresada en las células, dará como resultado la potenciación de, por ejemplo, el efecto mediado por TNF, ligando de FAS-R, NGF-R, MORT-1, RIP y TRADD o anquirina 1 que conduce, por ejemplo, a la muerte de las células tumorales u otras células portadoras de TNF-R o FAS-R que se desea destruir. La construcción de dichos virus animales recombinantes es mediante procedimientos estándar (véase, por ejemplo, Sambrook et al., 1989). Otra posibilidad es introducir las secuencias de las nuevas proteínas o péptidos en forma de oligonucleótidos que pueden absorberse por las células y expresarse en las mismas.

(ii) Pueden utilizarse para inhibir, por ejemplo, el efecto mediado por TNF, ligando de FAS-R, NGF-R, MORT-1 y anquirina 1, por ejemplo, en casos tales como lesión de tejido en shock séptico, reacción de injerto contra hospedador, hepatitis aguda u otras enfermedades/trastornos en caso de que se desee bloquear la señalización intracelular de TNF-R inducida por TNF, de FAS-R inducida por ligando de FAS-R, o de NGF-R inducida por NGF, o eventos intracelulares mediados por MORT-1, RIP, TRADD y anquirina 1. En esta situación, es posible, por ejemplo, introducir en las células mediante procedimientos estándar oligonucleótidos que tienen la secuencia de codificación sin sentido de estas nuevas proteínas o péptidos que bloquearían eficazmente la traducción de los ARNm que codifican estas proteínas, y bloquearían así su expresión y conducirían a la inhibición deseada anteriormente observada de los efectos mediados por proteínas que contienen el motivo de "dominio de muerte".

Dichos oligonucleótidos pueden introducirse en las células utilizando el enfoque de virus recombinante anterior, siendo la segunda secuencia portada por el virus la secuencia oligonucleotídica. Es otra posibilidad utilizar anticuerpos específicos de estas proteínas o péptidos para inhibir su actividad de señalización intracelular (mediante su unión a los motivos de "dominio de muerte").

Es aún otro modo de inhibir el efecto mediado por TNF, ligando de FAS-R, NGF-R, MORT-1, RIP y TRADD-1 o anquirina, 1 o efectos mediados por otras proteínas que contienen el motivo de "dominio de muerte", mediante el enfoque de ribozima recientemente desarrollado. Las ribozimas son moléculas de ARN catalíticas que escinden específicamente ARN. Las ribozimas pueden modificarse por ingeniería genética para escindir ARN diana de elección, por ejemplo, los ARNm que codifican las nuevas proteínas o péptidos de la invención. Dichas ribozimas tendrían una secuencia específica del ARNm de elección y serían capaces de interaccionar con él (unión complementaria) seguido de escisión del ARNm, dando como resultado una reducción (o pérdida completa) de la expresión de la proteína o péptido que se desea inhibir, dependiendo el nivel de expresión reducida del nivel de expresión de ribozima en la célula diana. Para introducir ribozimas en las células de elección, puede utilizarse cualquier vector adecuado, por ejemplo, vectores de plásmido, virus animal (retrovirus), que se utilizan habitualmente con este fin (véase también (i) anterior, en el que el virus tiene, como segunda secuencia, un ADNc que codifica la secuencia de ribozima de elección). Además, pueden construirse ribozimas que tienen múltiples dianas (ribozimas multidiana) que pueden utilizarse, por ejemplo, para inhibir la expresión de una o más de las proteínas o péptidos de la invención (para revisiones, métodos, etc., referentes a ribozimas, véanse Chen et al., 1992; Zhao y Pick, 1993; Shore et al., 1993; Joseph y Burke, 1993; Shimayama et al., 1993; Cantor et al., 1993; Barinaga, 1993; Crisell et al., 1993 y Koizumi et al.,
1993).

(iii) Pueden utilizarse para aislar, identificar y clonar otras proteínas o péptidos que son capaces de unirse a ellos, por ejemplo, otras proteínas o péptidos implicados en el proceso de señalización intracelular que están cadena abajo de las proteínas que contienen el motivo de "dominio de muerte". En esta situación, estas opciones, a saber, las secuencias de ADN que las codifican, pueden utilizase en el sistema de dos híbridos de levadura (véase el ejemplo 2 siguiente), en el que la secuencia de estas proteínas o péptidos se utilizará como "cebo" para aislar, clonar e identificar a partir de bibliotecas de ADNc o ADN genómico otras proteínas que codifican secuencias ("presas") que pueden unirse a estas nuevas proteínas de unión a motivo de "dominio de muerte". Del mismo modo, puede determinarse también si las proteínas o péptidos específicos que se unen al motivo de "dominio de muerte" de TNF-R p55, FAS-R, NGF-R, MORT-1 y anquirina pueden unirse también a otros receptores o proteínas. Además, este enfoque puede tomarse también para determinar si estas proteínas o péptidos son capaces de unirse a otros receptores o proteínas conocidos en cuya actividad puedan tener un papel funcional, concretamente, otros receptores o proteínas que contienen el motivo de "dominio de muerte" aún no identificados.

(iv) Las nuevas proteínas pueden utilizarse también para aislar, identificar y clonar otras proteínas de la misma clase, concretamente, aquellas que se unen a motivos de "dominio de muerte" de los diversos receptores o proteínas enumerados anteriormente o a receptores o proteínas funcionalmente relacionados, e implicados en su modulación/mediación. En esta aplicación, puede utilizarse el sistema de dos híbridos de levadura observado anteriormente, o puede utilizarse un sistema recientemente desarrollado (Wilks et al., 1989) que emplea la hibridación Southern no estricta seguida de clonación por PCR. En la publicación de Wilks et al., se describe la identificación y clonación de dos supuestas proteína tirosina quinasas mediante la aplicación de hibridación Southern no estricta seguida de clonación por PCR basada en la secuencia conocida del motivo de quinasa, una secuencia de quinasa conocida. Puede utilizarse este enfoque utilizando las secuencias de las nuevas proteínas o péptidos para identificar y clonar aquellas proteínas o péptidos de unión al motivo de "dominio de muerte" relacionados capaces también de unirse a receptores o proteínas que contienen el motivo de "dominio de muerte".

(v) Es aún otro enfoque para utilizar estas nuevas proteínas, utilizarlas en métodos de cromatografía de afinidad para aislar e identificar otras proteínas o factores con los que son capaces de unirse, por ejemplo, otros receptores relacionados con TNF-R (superfamilia de receptores de TNF/NGF) u otras proteínas o factores (por ejemplo relacionados con MORT-1, anquirina 1) implicados en el proceso de señalización intracelular o de regulación estructural. En esta aplicación, las proteínas pueden unirse individualmente a matrices de cromatografía de afinidad y ponerse después en contacto con extractos celulares o proteínas o factores aislados sospechosos de estar implicados en el proceso de señalización intracelular o de regulación estructural. Después del procedimiento de cromatografía de afinidad, las otras proteínas o factores que se unen a las nuevas proteínas pueden eluirse, aislarse y caracterizarse.

(vi) Como se observó anteriormente, las nuevas proteínas y péptidos pueden utilizarse también como inmunógenos (antígenos) para producir anticuerpos específicos de los mismos. Estos anticuerpos pueden utilizarse también con fines de purificación de las nuevas proteínas o péptidos a partir de extractos celulares o de estirpes celulares transformadas que las producen. Además, estos anticuerpos pueden utilizarse con fines de diagnóstico para identificar trastornos relacionados con el funcionamiento anormal de, por ejemplo, el sistema de TNF, ligando de FAS-R, NGF-R, MORT-1 o anquirina 1, por ejemplo, un efecto celular superactivo o subactivo inducido por TNF o ligando de FAS-R, o efectos celulares mediados por NGF-R, MORT-1 o anquirina 1. Por tanto, dichos trastornos deben estar relacionados con un mal funcionamiento del sistema de señalización intracelular o de regulación estructural que implica las nuevas proteínas o anticuerpos, sirviendo dichos anticuerpos como una importante herramienta de diagnóstico.

Los péptidos complementarios que pueden sintetizarse mediante procedimientos estándar bien conocidos en la técnica son capaces de unirse a o interaccionar específicamente con uno o más de los motivos de "dominio de muerte" del grupo anteriormente citado de proteínas que contienen el motivo de "dominio de muerte". Estos péptidos complementarios se sintetizarán utilizando, por ejemplo, las secuencias de motivo de "dominio de muerte" de TNF-R p55, FAS-R, MORT-1, RIP, TRADD, NGF-R, anquirina 1 como sustratos, y sintetizando mediante medios químicos estándar péptidos de secuencia complementaria con estas secuencias de motivo de "dominio de muerte". Es un péptido complementario adecuado aquel que sea capaz de unirse a uno o más de estos motivos de "dominio de muerte", y ser capaz así de modular o mediar la actividad de proteínas que contienen el motivo de "dominio de muerte".

Los péptidos complementarios pueden generarse utilizando como sustrato una o más de las secuencias de motivo de "dominio de muerte" dadas a conocer en la Fig. 1, o pueden generarse utilizando un péptido sintético (véase anteriormente) que tiene una secuencia que incluye todos los rasgos de secuencia comunes de las secuencias de motivo de "dominio de muerte" conocidas, por ejemplo, los residuos aminoacídicos anteriormente citados, W, L, I, A, D, E, T, R e Y.

Pueden emplearse los péptidos complementarios así generados, e igualmente las secuencias de ADN que los codifican, que pueden producirse fácilmente mediante procedimientos estándar, como se observó anteriormente en cualquiera de los usos (i) -(vi), concretamente para potenciar (aumentar la función) o inhibir la actividad de proteínas o receptores que contienen un motivo de "dominio de muerte", o pueden utilizarse para generar anticuerpos específicos de los mismos con fines de modulación/mediación, aislamiento o diagnóstico.

Debe observarse también que se incluyen en la presente invención los anticuerpos específicos de las proteínas designadas en el primer aspecto de la invención. Estos anticuerpos pueden utilizase para modular/mediar directamente la actividad de proteínas o receptores que contienen motivos de "dominio de muerte" o para el aislamiento, identificación y caracterización (incluyendo aplicaciones de diagnóstico, como se observa anteriormente) de otras proteínas y receptores que contienen dichos motivos de "dominio de muerte".

Con respecto a los anticuerpos citados a lo largo de la presente memoria, el término "anticuerpo" se pretende que incluya anticuerpos policlonales, anticuerpos monoclonales (mAb), anticuerpos quiméricos, anticuerpos antiidiotípicos (anti-Id) contra anticuerpos que pueden estar marcados en forma soluble o unida, así como fragmentos de los mismos proporcionados mediante cualquier técnica conocida tal como, pero sin limitación, escisión enzimática, síntesis peptídica o técnicas recombinantes.

Los anticuerpos policlonales son poblaciones heterogéneas de moléculas de anticuerpo derivadas de sueros de animales inmunizados con un antígeno. Un anticuerpo monoclonal contiene una población sustancialmente homogénea de anticuerpos específicos de antígenos, conteniendo dichas poblaciones sitios de unión a epítopo sustancialmente similares. Los mAb pueden obtenerse mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica. Véanse, por ejemplo, Kohler y Milstein, Nature, 256: 495-497 (1975); patente de EE.UU. nº 4.376.110; Ausubel et al., ed. Harlow y Lane "ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL", Cold Spring Harbor Laboratory (1988); y Colligan et al., ed., Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. y Wiley Interscience, N.Y. (1992, 1993). Dichos anticuerpos pueden ser de cualquier clase de inmunoglobulina, incluyendo IgG, IgM, IgE, IgA, GILD y cualquier subclase de las mismas. Puede cultivarse in vitro, in situ o in vivo un hibridoma productor de un mAb de la presente invención. La producción de altas titulaciones de mAb in vivo o in situ hace a éste el método actualmente preferido de producción.

Los anticuerpos quiméricos son moléculas cuyas diferentes partes derivan de diferentes especies animales, tales como los que tienen la región variable derivada de un mAb de múrido y una región constante de inmunoglobulina humana. Los anticuerpos quiméricos se utilizan principalmente para reducir la inmunogenicidad en la aplicación y para aumentar los rendimientos en la producción, por ejemplo, cuando los mAb de múrido tienen rendimientos mayores de hibridomas pero mayor inmunogenicidad en seres humanos, de tal modo que se utilizan mAb quiméricos humanos/de múrido. Son conocidos en la técnica anticuerpos quiméricos y métodos para su producción (Cabilly et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 3273-3277 (1984); Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855 (1984); Boulianne et al., Nature 312: 643-646 (1984); Cabilly et al., solicitud de patente europea 125023 (publicada el 14 de noviembre de 1984); Neuberger et al., Nature 314: 268-270 (1985); Taniguchi et al., solicitud de patente europea 171496 (publicada el 19 de febrero de 1985); Morrison et al., solicitud de patente europea 173494 (publicada el 5 de marzo de 1986); Neuberger et al., solicitud PCT WO 8601533 (publicada el 13 de marzo de 1986); Kudo et al., solicitud de patente europea 184187 (publicada el 11 de junio de 1986); Sahagan et al., J. Immunol., 137: 1066-1074 (1986); Robinson et al., solicitud de patente internacional nº WO 8702671 (publicada el 7 de mayo de 1987); Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 3439-3443 (1987); Sun et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 214-218 (1987); Better et al., Science 240: 1041-1043 (1988); y Harlow y Lane, "ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL", supra.

Un anticuerpo anti-idiotípico (anti-Id) es un anticuerpo que reconoce determinantes únicos asociados generalmente al sitio de unión a antígeno de un anticuerpo. Un anticuerpo Id puede prepararse inmunizando un animal de la misma especie y tipo genético (por ejemplo, cepa de ratón) como fuente del mAb con el mAb con el que está preparado un anti-Id. El animal inmunizado reconocerá y responderá a determinantes idiotípicos del anticuerpo inmunizante produciendo un anticuerpo contra estos determinantes idiotípicos (el anticuerpo anti-Id). Véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. nº 4.699.880.

El anticuerpo anti-Id puede utilizarse también como "inmunógeno" para inducir una respuesta inmune en aún otro animal, produciendo el denominado anticuerpo anti-anti-Id. El anti-anti-Id puede ser epitópicamente idéntico al mAb original que indujo el anti-Id. Por tanto, utilizando anticuerpos contra los determinantes idiotípicos de un mAb, es posible identificar otros clones que expresan anticuerpos de especificidad idéntica.

En consecuencia, pueden utilizarse mAb generados contra los péptidos que contienen el motivo de "dominio de muerte", proteínas o péptidos de unión al "dominio de muerte" o péptidos complementarios de la unión al "dominio de muerte", análogos o derivados de los mismos como se dan a conocer en la presente memoria, para inducir anticuerpos anti-Id en animales adecuados, tales como ratones BALB/C. Se utilizan células de bazo de dichos ratones inmunizados para producir hibridomas anti-Id que secretan mAb anti-Id. Además, los mAb anti-Id pueden acoplarse con un vehículo tal como hemocianina de lapa de bocallave (KLH) y utilizarse para inmunizar ratones BALB/C adicionales. Los sueros de estos ratones contendrán anticuerpos anti-anti-Id que tienen las propiedades de unión del mAb original específico de un epítopo de las proteínas, péptidos, análogos o derivados anteriores.

Los mAb anti-Id tienen por tanto sus propios epítopos idiotípicos o "idiótopos" estructuralmente similares al epítopo que se está evaluando, tal como la proteína-\alpha de GRB.

El término "anticuerpo" se pretende que incluya también tanto moléculas intactas como fragmentos de las mismas tales como, por ejemplo, Fab y F(ab')_{2}, que son capaces de unirse a antígeno. Los fragmentos Fab y F(ab')_{2} carecen del fragmento Fc del anticuerpo intacto, se eliminan más rápidamente de la circulación y pueden tener menos unión a tejido no específico que un anticuerpo intacto (Wahl et al., J. Nucl. Med. 24: 316-325, (1983)).

Se apreciará que Fab y F(ab')_{2} y otros fragmentos de los anticuerpos útiles en la presente invención pueden utilizarse para la detección y cuantificación de las proteínas o péptidos de unión al "dominio de muerte" según los métodos dados a conocer en la presente memoria para moléculas de anticuerpo intacto. Dichos fragmentos se producen típicamente mediante escisión proteolítica, utilizando enzimas tales como papaína (para producir fragmentos Fab) o pepsina (para producir fragmentos F(ab')_{2}).

Se dice que un anticuerpo es "capaz de unirse" a una molécula si es capaz de reaccionar específicamente con la molécula para unirse así la molécula al anticuerpo. El término "epítopo" se pretende que designe aquella parte de cualquier molécula capaz de unirse a un anticuerpo que puede reconocerse también por ese anticuerpo. Los epítopos o "determinantes antigénicos" consisten habitualmente en agrupaciones de moléculas de superficie químicamente activa tales como aminoácidos o cadenas laterales de azúcar, y tienen características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga específicas.

Un "antígeno" es una molécula o una parte de una molécula capaz de unirse a un anticuerpo que es adicionalmente capaz de inducir a un animal a producir anticuerpo capaz de unirse a un epítopo de ese antígeno. Un antígeno puede tener uno o más epítopos. La reacción específica designada anteriormente se pretende que indique que el antígeno reaccionará, de manera altamente selectiva, con su correspondiente anticuerpo y no con la multitud de otros anticuerpos que pueden provocarse por otros antígenos.

Los anticuerpos, incluyendo fragmentos de anticuerpos, útiles en la presente invención pueden utilizarse para detectar cuantitativa o cualitativamente las proteínas o péptidos de unión al motivo de "dominio de muerte" (incluyendo péptidos complementarios) en una muestra, o para detectar la presencia de células que expresan las proteínas o péptidos de unión al motivo de "dominio de muerte" de la presente invención. Esto puede conseguirse mediante técnicas de inmunofluorescencia empleando un anticuerpo marcado fluorescentemente (véase a continuación) acoplado con detección por microscopía óptica, por citometría de flujo o fluorométrica.

Los anticuerpos (o fragmentos de los mismos) útiles en la presente invención pueden emplearse histológicamente, como en microscopía de inmunofluorescencia o inmunoelectrónica, para la detección in situ de proteínas o péptidos de unión al motivo de "dominio de muerte" como se da a conocer en la presente memoria. La detección in situ puede conseguirse retirando una muestra histológica de un paciente y proporcionando el anticuerpo marcado de la presente invención a dicha muestra. El anticuerpo (o fragmento) se proporciona preferiblemente aplicando a o cubriendo con el anticuerpo marcado (o fragmento) una muestra biológica. Mediante el uso de dicho procedimiento, es posible determinar no sólo la presencia de proteínas o péptidos de unión al motivo de "dominio de muerte", sino también su distribución en el tejido examinado. Utilizando la metodología anterior, los expertos en la técnica observarán fácilmente que puede modificarse cualquiera de una amplia variedad de métodos histológicos (tales como procedimientos de tinción) para conseguir dicha detección in situ.

Dichos ensayos de proteínas de unión al motivo de "dominio de muerte" de la presente invención comprenden típicamente incubar una muestra biológica, tal como un fluido biológico, un extracto de tejido, células recién recogidas tales como linfocitos o leucocitos, o células que se han incubado en cultivo de tejido, en presencia de un anticuerpo marcado detectablemente capaz de identificar las proteínas o péptidos de unión al motivo de "dominio de muerte", y detectar el anticuerpo mediante cualquiera de una serie de técnicas bien conocidas en la técnica.

La muestra biológica puede tratarse con un soporte o vehículo en fase sólida, tal como nitrocelulosa u otro soporte o vehículo sólido que sea capaz de inmovilizar células, partículas celulares o proteínas solubles. El soporte o vehículo puede lavarse después con tampones adecuados seguido de tratamiento con un anticuerpo marcado detectablemente según la presente invención, como se observa anteriormente. El soporte o vehículo en fase sólida puede lavarse después con el tampón una segunda vez para retirar el anticuerpo no unido. La cantidad de marcaje unida sobre dicho soporte o vehículo sólido puede detectarse después por medios convencionales.

Por "soporte en fase sólida", "vehículo en fase sólida", "soporte sólido", "vehículo sólido", "soporte" o "vehículo" se pretende cualquier soporte o vehículo capaz de unirse a antígeno o anticuerpos. Los soportes o vehículos bien conocidos incluyen vidrio, poliestireno, polipropileno, polietileno, dextrano, amilasas de nailon, celulosas naturales y modificadas, poliacrilamidas, gabros y magnetita. La naturaleza del vehículo puede ser soluble en cierta medida o insoluble con los fines de la presente invención. El material de soporte puede tener virtualmente cualquier configuración estructural posible siempre que la molécula acoplada sea capaz de unirse a un antígeno o anticuerpo. Por tanto, la configuración del soporte o vehículo puede ser esférica, como en una perla, cilíndrica, como en la superficie interior de un tubo de ensayo, o la superficie exterior de una barra. Como alternativa, la superficie puede ser plana tal como una lámina, tira de ensayo, etc. Los soportes o vehículos preferidos incluyen perlas de poliestireno. Los expertos en la técnica conocerán muchos otros vehículos adecuados para unión a anticuerpo o antígeno, o podrán determinar los mismos mediante el uso de experimentación rutinaria.

La actividad de unión de un lote dado de anticuerpos de la invención, como se observa anteriormente, puede determinarse según métodos bien conocidos. Los expertos en la técnica podrán determinar las condiciones de ensayo operativas y óptimas para cada determinación empleando experimentación rutinaria.

Otras de dichas etapas como lavado, agitación, agitación mecánica, filtración y similares pueden añadirse a los ensayos como sea habitual o necesario para la situación particular.

Uno de los modos en que un anticuerpo según la presente invención puede marcarse detectablemente es ligando el mismo a una enzima y utilizándolo en un inmunoensayo enzimático (EIA). Esta enzima, a su vez, cuando se expone a continuación a un sustrato apropiado, reaccionará con el sustrato de tal manera que producirá un resto químico que puede detectarse, por ejemplo, por medios espectrofotométricos, fluorométricos o visuales. Las enzimas que pueden utilizarse para marcar detectablemente el anticuerpo incluyen, pero sin limitación, malato deshidrogenasa, nucleasa estafilocóccica, delta-5-esteroide isomerasa, alcohol deshidrogenasa de levadura, alfa-glicerofosfato deshidrogenasa, triosa fosfato isomerasa, peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, asparaginasa, glucosa oxidasa, beta-galactosidasa, ribonucleasa, ureasa, catalasa, glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, glucoamilasa y acetilcolinesterasa. La detección puede conseguirse mediante métodos colorimétricos que emplean un sustrato cromogénico para la enzima. La detección puede conseguirse también mediante la comparación visual de la extensión de la reacción enzimática de un sustrato en comparación con patrones preparados similarmente.

La detección puede conseguirse utilizando cualquiera de una serie de otros inmunoensayos. Por ejemplo, marcando radiactivamente los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo, es posible detectar la R-PTPasa mediante el uso de un radioinmunoensayo (RIA). Puede encontrarse una buena descripción del RIA en "Laboratory Techniques and Biochemistry in Molecular Biology" de Work, T.S. et al., North Holland Publishing Company, NY (1978), con referencia particular al capítulo titulado "An Introduction to Radioimmune Assay and Related Techniques", por Chard, T., incorporado como referencia a la presente memoria. El isótopo radiactivo puede detectarse mediante modos tales como el uso de un contador \gamma o un contador de centelleo o mediante autorradiografía.

También es posible marcar un anticuerpo según la presente invención con un compuesto fluorescente. Cuando se expone un anticuerpo marcado fluorescentemente a luz de longitud de onda apropiada, su presencia puede detectarse entonces debido a la fluorescencia. Entre los compuestos de marcaje fluorescente más habitualmente utilizados están isotiocianato de fluoresceína, rodamina, ficoeritrina, ficocianina, aloficocianina, o-ftaldehído y fluorescamina.

El anticuerpo puede marcarse detectablemente también utilizando metales emisores de fluorescencia tales como ^{152}Eu u otros de la serie lantánida. Estos metales pueden unirse al anticuerpo utilizando grupos quelantes de dicho metal, como ácido dietilentriaminopentaacético (ETPA).

El anticuerpo puede marcarse detectablemente también acoplándolo a un compuesto quimioluminiscente. La presencia del anticuerpo marcado quimioluminiscentemente se determina después detectando la presencia de luminiscencia que surge durante el transcurso de una reacción química.

Son ejemplos de compuestos de marcaje quimioluminiscente particularmente útiles luminol, isoluminol, éster teromático de acridinio, imidiazol, sal de acridinio y éster oxalato.

Igualmente, puede utilizarse un compuesto bioluminiscente para marcar el anticuerpo de la presente invención. La bioluminiscencia es un tipo de quimioluminiscencia encontrada en sistemas biológicos, en los que una proteína catalítica aumenta la eficacia de la reacción quimioluminiscente. La presencia de una proteína bioluminiscente se determina detectando la presencia de luminiscencia. Son compuestos bioluminiscentes importantes con fines de marcaje luciferina, luciferasa y aequorina.

Una molécula de anticuerpo de la presente invención puede adaptarse para utilización en un ensayo inmunométrico, también conocido como un ensayo de "dos sitios" o "sándwich". En un ensayo inmunométrico típico, se une una cantidad de anticuerpo no marcado (o fragmento de anticuerpo) a un soporte o vehículo sólido y se añade una cantidad de anticuerpo soluble marcado detectablemente para permitir la detección y/o cuantificación del complejo ternario formado entre anticuerpo en fase sólida, antígeno y anticuerpo marcado.

Los ensayos inmunométricos típicos y preferidos incluyen ensayos "directos", en los que el anticuerpo unido a la fase sólida se pone en contacto primero con la muestra que se está ensayando para extraer el antígeno de la muestra mediante la formación de un complejo binario anticuerpo-antígeno en fase sólida. Después de un periodo de incubación adecuado, se lava el soporte sólido o vehículo para retirar el residuo de la muestra fluida, incluyendo antígeno no reaccionado, si lo hay, y se pone en contacto con la solución que contiene una cantidad desconocida de anticuerpo marcado (que funciona como "molécula informadora"). Después de un segundo periodo de incubación para permitir al anticuerpo marcado complejarse con el antígeno unido al soporte o vehículo sólido a través del anticuerpo no marcado, se lava el soporte o vehículo sólido una segunda vez para retirar el anticuerpo marcado no
reaccionado.

En otro tipo de ensayo "sándwich", que puede ser también útil con los antígenos de la presente invención, se utilizan los denominados ensayos "simultáneo" e "inverso". Un ensayo simultáneo implica una sola etapa de incubación en la que el anticuerpo unido al soporte o vehículo sólido y el anticuerpo marcado se añaden ambos a la muestra que se está ensayando al mismo tiempo. Después de completar la incubación, se lava el soporte o vehículo sólido para retirar el residuo de la muestra fluida y del anticuerpo marcado no complejado. La presencia de anticuerpo marcado asociado al soporte o vehículo sólido se determina después como se haría en un ensayo de sándwich "directo" convencional.

En el ensayo "inverso", se utiliza la adición por etapas en primer lugar de una solución de anticuerpo marcado a la muestra fluida, seguido de la adición de anticuerpo no marcado unido a un soporte sólido o vehículo después de un periodo de incubación adecuado. Después de una segunda incubación, se lava la fase sólida de modo convencional para liberarla del residuo de la muestra que se está ensayando y de la solución de anticuerpo marcado no reaccionado. La determinación de anticuerpo marcado asociado a un soporte o vehículo sólido se determina después como en los ensayos "simultáneo" y "directo".

Las nuevas proteínas y péptidos designados anteriormente, una vez aislados, identificados y caracterizados mediante cualquiera de los procedimientos de examen estándar, por ejemplo el método de dos híbridos de levadura, cromatografía de afinidad y cualquier otro método bien conocido en la técnica, pueden producirse entonces mediante cualquier procedimiento de ADN recombinante estándar (véase, por ejemplo, Sambrook et al., 1989) en el que se transforman células hospedadoras eucarióticas o procarióticas adecuadas mediante vectores eucarióticos o procarióticos apropiados que contienen las secuencias que codifican las proteínas. En consecuencia, dichos vectores de expresión y hospedadores transformados pueden utilizarse para la producción de estas proteínas. Como se citó anteriormente, estas proteínas incluyen también sus análogos y derivados biológicamente activos, y por tanto los vectores que los codifican incluyen también vectores que codifican análogos de estas proteínas, y los hospedadores transformados incluyen aquellos productores de dichos análogos. Los derivados de estas proteínas son los derivados producidos mediante la modificación estándar de las proteínas o sus análogos, producidos por los hospedadores transformados.

Pueden utilizarse diversos motivos de "dominio de muerte" diferentes o el motivo de "dominio de muerte" "universal" producido sintéticamente (que tiene rasgos estructurales comunes con muchos motivos de "dominio de muerte" diferentes) como agentes para potenciar (aumentar la función) el efecto intracelular mediado por proteínas que contienen el motivo de "dominio de muerte" natural. En este aspecto, los motivos de "dominio de muerte" se utilizarán en forma de péptidos que contienen todo el motivo de "dominio de muerte", o partes activas del mismo e introducidos en las células como se citó anteriormente (por ejemplo, el enfoque de virus Vaccinia). A este respecto, debe observarse que la expresión "dominio de muerte" se acuñó después del descubrimiento (véanse las solicitudes de patente pendientes de tramitación observadas anteriormente) de que esta región de los dominios intracelulares de TNF-R p55 y FAS-R era la región implicada en la autoasociación independiente de ligando e inducción de citotoxicidad celular mediada por estos receptores. De hecho, el "dominio de muerte" libre de TNF-R p55 (p55DM) es capaz de autoasociarse e inducir citotoxicidad celular. Además, tras el descubrimiento de que la proteína MORT-1 es una proteína de unión a FAS-R, se encontró también que esta proteína es capaz de autoasociación e inducción, de manera independiente de ligando e independiente de FAS-R, de efectos citotóxicos sobre células. Se observó posteriormente que la proteína MORT-1 contenía un motivo de "dominio de muerte" homólogo de los "dominios de muerte" o motivos de "dominio de muerte" de TNF-R p55 y FAS-R (véase la Fig. 1), estando implicado dicho "dominio de muerte" en la asociación de MORT-1 con FAS-R, y estando asociado con la capacidad de la proteína MORT-1 de inducir efectos citotóxicos celulares.

Por tanto, utilizando los motivos de "dominio de muerte" de proteínas tales como TNF-R p55, FAS-R y MORT-1, y cualquier otra proteína implicada en la inducción de efectos citotóxicos del modo descrito anteriormente, es posible potenciar los efectos citotóxicos mediados normalmente por las contrapartidas de origen natural de estas proteínas, concretamente, sería posible potenciar la destrucción de células tales como células tumorales, células infectadas por VIH u otras células enfermas, cuya destrucción está habitualmente mediada por TNF-R p55, FAS-R, MORT1, RIP o TRADD, introduciendo en dichas células los motivos de "dominio de muerte" de estos receptores/proteínas.

Además, también es posible producir análogos de estos motivos de "dominio de muerte" que proporcionarán una potenciación aún mejor de su acción, concretamente, una citotoxicidad celular potenciada, teniendo estos análogos uno o más aminoácidos añadidos, eliminados o reemplazados con respecto a las secuencias de origen natural.

De modo similar, también es posible con los medios descritos anteriormente en la presente memoria introducir motivos de "dominio de muerte", o análogos de los mismos, de NGF-R o anquirina 1 en células en las que se desea potenciar los efectos intracelulares mediados por NGF-R o anquirina 1.

Igualmente, la presente invención se refiere también al bloqueo específico de los efectos mediados por proteínas que contienen el motivo de "dominio de muerte" mediante el bloqueo de la actividad de los motivos de "dominio de muerte" de estas proteínas, por ejemplo, mediante la introducción de oligonucleótidos sin sentido en células (como se citó anteriormente) que bloquearían la expresión de los motivos de "dominio de muerte".

Pueden proporcionarse compuestos orgánicos, por ejemplo compuestos heterocíclicos, que son capaces de unirse específicamente a los motivos de "dominio de muerte" de una o más proteínas que contienen el motivo de "dominio de muerte". Estos compuestos orgánicos son bien conocidos en el campo de la farmacia y se utilizan ampliamente como agentes terapéuticos que son capaces de entrar en células (compuestos hidrofóbicos/lipofílicos) y unirse a diversas proteínas intracelulares o partes intracelulares de proteínas transmembrana y ejercer así su efecto. Estos compuestos orgánicos pueden examinarse e identificarse fácilmente utilizando los motivos de "dominio de muerte" de proteínas que contienen el motivo de "dominio de muerte", por ejemplo, aquellos de TNF-R p55, FAS-R, NGF-R, MORT-1, anquirina 1, en procedimientos estándar de cromatografía de afinidad u otros métodos bien conocidos en la técnica.

Debe citarse también que el motivo de "dominio de muerte" consiste tanto en rasgos estructurales generales comunes a todos dichos diversos motivos, concretamente un esqueleto común, así como rasgos estructurales específicos, específicos de cada uno de los motivos de "dominio de muerte". En consecuencia, un fármaco o molécula farmacéuticamente activa preferido contendrá como ingrediente activo proteínas o péptidos de origen natural; proteínas o péptidos producidos sintéticamente, incluyendo péptidos complementarios; anticuerpos; o compuestos químicos obtenidos mediante examen o diseño, todos los cuales se caracterizan por ser capaces de reconocer los rasgos generales del "dominio de muerte" y uno o más de los rasgos específicos del "dominio de muerte".

Pueden proporcionarse composiciones farmacéuticas que comprenden vectores virales animales recombinantes que codifican proteínas o péptidos de unión al motivo de "dominio de muerte" o las secuencias mismas del motivo de "dominio de muerte", codificando dicho vector también una proteína de superficie viral capaz de unirse a proteínas de superficie de células diana específicas (por ejemplo, células cancerosas) para dirigir la inserción de las secuencias de proteína o péptido de unión al motivo de "dominio de muerte" en las células. Igualmente, pueden proporcionarse composiciones farmacéuticas que comprenden compuestos orgánicos capaces de unirse a motivos de "dominio de muerte" de proteínas que contienen el motivo de "dominio de muerte".

La invención se describirá ahora con más detalle en los siguientes ejemplos no limitantes y los dibujos adjuntos:

Ejemplo 1 El motivo de "dominio de muerte" común a los receptores TNF-R p55, FAS-R y NGF-R y a las proteínas MORT-1 y anquirina 1

Tras el descubrimiento de MORT-1 (véanse los documentos pendientes de tramitación IL 109632, IL 112002 y 112692), se descubrió también que MORT-1 contiene una región que tiene homología con los "dominios de muerte" anteriormente identificados de TNF-R p55 y FAS-R (p55DM y FAS-DM, respectivamente), véanse los documentos IL 109632 e IL 111125). Este sorprendente descubrimiento de un motivo de "dominio de muerte" en una proteína anteriormente desconocida condujo a la búsqueda de la existencia de dicho motivo de "dominio de muerte" en otras proteínas. Sorprendentemente, se descubrió dicho motivo de "dominio de muerte" en el NGF-R de baja afinidad y en la proteína citoesquelética aparentemente no relacionada anquirina 1. Los motivos de "dominio de muerte" de todas estas proteínas diferentes comparten una notable homología, como se da a conocer esquemáticamente en la Fig. 1, que muestra una comparación de secuencia de los motivos de "dominio de muerte" de TNF-R p55, FAS-R, MORT-1, NGF-R de baja afinidad y la parte C-terminal del dominio regulador en anquirina 1 (todos de origen humano). La homología de estos motivos de "dominio de muerte" se definió mediante los programas LINEUP y PRETTY del paquete GCG. Se recuadran los residuos idénticos y similares en tres o más de las proteínas. Los huecos introducidos para maximizar el alineamiento se designan por puntos. Se confirmó la importancia de esta homología de la manera siguiente: (a) el alineamiento múltiple de secuencias del motivo de "dominio de muerte" utilizando el programa HSSP de PredictProtein Service (Sander y Schneider, 1991) mostró identidades de secuencia de 21-38% y similitudes de secuencia de 30-48%. (b) La búsqueda en el banco de datos Swiss-Prot con un perfil creado (utilizando los programas PILEUP, LINEUP y PROFILEMAKE del paquete GCG) a partir de consensos de secuencias del motivo de "dominio de muerte" en las secuencias conocidas de p55 R y FAS-R (humano, de ratón, de rata), receptor de NGF (humano, de rata y pollo) y anquirinas (anquirina 1 humana y de ratón y anquirinas c y g humanas) y en MORT-1, proporcionó altas puntuaciones sólo en aquellas secuencias que se utilizaron para crear el perfil (puntuaciones Z> 8,5 para todos ellos en la búsqueda con "Bioaccelerator", Compugen, Israel).

La búsqueda de homología anterior utilizando el PredictProtein Service (PHDsec) y el programa PRODOM del paquete CGC reveló una similitud significativa entre una región de aproximadamente 65 residuos de MORT-1, en la parte de la molécula que se une a FAS-R, y una región de la misma longitud en los "dominios de muerte" de FAS-R y p55-R (Fig. 1). Esta parte del "dominio de muerte" muestra también similitud con una región en el dominio intracelular del receptor de NGF de baja afinidad (Johnson et al., 1986), un receptor cuyo dominio extracelular es conocido por contener otro motivo de secuencia conservado común con FAS-R, TNF-R y otros miembros de la familia de receptores de TNF/NGF. Se reveló también una similitud anteriormente no observada entre esta parte del "dominio de muerte" y una región conservada en las anquirinas, que son proteínas estructurales que ligan proteínas esqueléticas de membrana basadas en espectrina con los dominios citoplasmáticos de proteínas de membrana plasmática integral (Lux et al., 1990; Lambert y Bennett, 1993). Esa región está localizada en la parte N-terminal del dominio regulador de anquirina, justo cadena arriba de la parte del dominio cuya expresión está sujeta a modulación por ayuste alternativo, y por debajo de los dominios de unión a espectrina y unión a membrana. (Este último dominio contiene otro motivo de secuencia conocido, la "repetición de anquirina"). El motivo de "dominio de muerte" es distinto del motivo de repetición de anquirina que se encuentra en el dominio de unión a membrana de las anquirinas.

El descubrimiento de un motivo de "dominio de muerte" en proteínas que tienen efectos intracelulares diferentes sugiere que este motivo desempeña un papel más general que el implicado por el nombre "dominio de muerte", concretamente, este motivo aparece en receptores tales como TNF-R p55, FAS-R y la proteína relacionada MORT-1, que median la citotoxicidad celular, así como en NGF-R que, cuando induce la muerte, lo hace sólo en ausencia de ligando (Rabizadeh et al., 1993) y en proteínas tales como anquirinas citoesqueléticas, no asociadas a efectos citotóxicos celulares. Es un tipo de actividad general de este motivo de "dominio de muerte", encontrado hasta ahora en tres de las proteínas que lo contienen, concretamente FAS-R, TNF-R p55 y MORT-1, la capacidad de autoasociarse o interaccionar con otras proteínas que contienen este motivo.

El descubrimiento del motivo de "dominio de muerte" en dicho amplio intervalo de diferentes proteínas proporciona el modo de obtención (como se observó anteriormente en la presente memoria y posteriormente en el ejemplo 2) de proteínas o péptidos capaces de unirse a los diferentes motivos de "dominio de muerte" (uno o más), pudiendo utilizarse dichas proteínas y péptidos como moduladores/mediadores de un amplio grupo de proteínas reguladoras, al ser receptores de citocina implicados en efectos citotóxicos celulares (TNF-R p55, FAS-R) o de crecimiento (NGF-R) o proteínas relacionadas implicadas en efectos citotóxicos celulares (MORT-1) o porciones reguladoras de proteínas estructurales implicadas en la regulación de forma/conformacional de células (anquirinas). De modo similar, los motivos de "dominio de muerte" de estas diversas proteínas pueden utilizarse también directamente para modulación/mediación de proteínas que contienen dichos motivos.

Ejemplo 2 Interacción de "dominios de muerte" de TNF-R p55, FAS-R, TRADD, MORT-1 y RIP humanos a) Procedimientos experimentales Ensayos de expresión de \beta-galactosidasa en dos híbridos

Se clonaron insertos de ADNc por PCR, o bien de ADNc completos clonados anteriormente en el laboratorio, o bien de bibliotecas de ADNc adquiridas. La numeración de residuos en las proteínas codificadas por los insertos de ADNc es como en el banco de datos Swiss-Prot. Se produjeron mutantes puntuales mediante mutagénesis dirigida a oligonucleótido (Kunkel, 1994). Se evaluó la expresión de \beta-galactosidasa en levaduras (cepa informadora SFY526 (Bartel et al., 1993)) transformada con estos ADNc en los vectores pGBT-9 y pGAD-GH (constructos del dominio de unión a ADN (DUA) y dominio de activación (DA), respectivamente) mediante un ensayo de filtro (Boldin et al., 1995). Cuando se expresaron en el vector pGAD-GH, RIP y su DM tuvieron cierto efecto citotóxico sobre las levaduras, manifestado en un bajo rendimiento de colonias de levadura. No tuvieron dicho efecto citotóxico cuando se expresaron (en menor extensión) en el vector pGBT-9.

Expresión inducida, marcaje metabólico e inmunoprecipitación de proteínas

Puesto que la similitud de tamaño de los DM hace difícil distinguir entre ellos en electroforesis en gel, se eligió examinar la interacción de MORT-1, TRADD y RIP mediante coexpresión de la proteína MORT-1 completa con los DM de TRADD y RIP. Las proteínas ligadas por N al octapéptido FLAG (Eastman-Kodak, New Haven, CT), o a un epítopo de hemaglutinina de gripe (epítopo HA, YPYDVPDYA (Field et al., 1998)) se expresaron en células HeLa utilizando un vector de expresión controlado por tetraciclina y marcado metabólicamente con [^{35}S]-Met (55 \muCi/ml) y [^{35}S]-Cys (10 \muCi/ml) (EXPRE^{35}S^{35}S Protein Labeling Mix, DuPont, Wilmington, DE), como se describe anteriormente (Boldin et al., 1995). Se lisaron después las células en tampón RIPA (1 ml/5 x 10^{5} células) y se preclarificaron los lisados mediante incubación con antisuero de conejo irrelevante (3 \mul/ml) y perlas de Protein G Sepharose (Pharmacia, Uppsala, Suecia; 6 \mul/ml). Se realizó la inmunoprecipitación mediante incubación durante 1 h a 4ºC de alícuotas de 0,3 ml de lisado con anticuerpos monoclonales de ratón (5 \mu/alícuota) contra el octapéptido FLAG (M2, Eastman Kodak), el epítopo HA (12CA5, Field et al., 1988)) o TNF-R p75 (nº 9; (Bigda et al., 1994)) como control, seguido de una incubación adicional de 1 h con perlas de Protein G Sepharose (30 \mul/alícuota). Se lavaron los inmunoprecipitados 3 veces con tampón RIPA y se analizaron por electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida.

b) Evaluación

Se evaluaron las interacciones de los DM de TNF-R p55, FAS-R, TRADD, MORT-1 y RIP humanos en primer lugar mediante un ensayo de dos híbridos de levadura. Se expresaron los ADNc que codifican estos dominios en forma de proteínas de fusión con los dominios de unión a ADN de Gal4 y activación (constructos DUA y DA) en la cepa de levadura informadora SFY526, y se determinó la unión de estas proteínas de fusión entre sí determinando la expresión de \beta-galactosidasa por las levaduras. Los resultados de estos ensayos se resumen en la Fig. 1 y se ilustran en forma de diagrama en la Fig. 3.

Los DM de TNF-R p55, FAS-R, TRADD y RIP fueron capaces de autoasociarse. El DM de MORT-1 carecía de esta capacidad, aunque la proteína MORT-1 completa se autoasocia (Boldin et al., 1995), aparentemente mediante una interacción que implica la región cadena arriba de su DM.

El DM de TRADD se unió al DM de TNF-R p55, pero no al DM de FAS-R, mientras que el DM de MORT-1 se comportaba de modo inverso.

El DM de RIP, como la proteína RIP completa (Stanger et al., 1995), fue capaz de unirse tanto a los DM de FAS-R como de TNF-R p55. La unión era significativamente más débil, sin embargo, que la de los DM de TRADD y MORT-1 a estos receptores. Aunque RIP se identificó inicialmente mediante su unión en un examen de dos híbridos a FAS-R (Stanger et al., 1995), esta unión es bastante débil, y podía observarse sólo cuando el DM de RIP estaba altamente expresado en las levaduras, introduciéndolo en el constructo de DA. No hubo unión mensurable cuando se introdujo el DM de RIP en el constructo de DUA, que tiene una eficacia de expresión menor. Un inserto de RIP más largo, correspondiente a los aminoácidos 161-372 de la proteína, no se unió más eficazmente a FAS-R (no mostrado).

Aparte de su unión observada a los DM de TNF-R p55 o FAS-R, los DM de cada una de las tres proteínas intracelulares ensayadas se unían también entre sí. Estas interacciones eran todas eficaces. Notablemente, la eficacia de la unión del DM de RIP a los DM de MORT-1 y TRADD era significativamente mayor que la de su unión a los DM de TNF-R p55 y FAS-R.

Se observó un patrón de interacción similar en la cepa informadora de levadura HF7c, utilizada regularmente en el laboratorio de los inventores para exámenes de dos híbridos. Es más, en un intento reciente de clonar proteínas que se unen a MORT-1 mediante un examen de dos híbridos, se encontró que una proporción significativa del ADNc clonado codifica TRADD o RIP (no mostrado).

En ensayos de especificidad para el ensayo de dos híbridos, no se observó unión de los motivos de DM a ninguna de una serie de proteínas irrelevantes, incluyendo SNF1, el dominio intracelular del receptor de TNF p75 humano, lamina, ciclina D y el DM del receptor de NGF de baja afinidad de rata (no mostrado). Para evaluar adicionalmente la especificidad de unión, se introdujeron mutaciones puntuales en los DM de TNF-R p55, FAS-R, MORT-1 y RIP, en sitios correspondientes a I-225 en la secuencia FAS-R de ratón. Una mutación de reemplazo de origen natural de este residuo, encontrada en ratones lpr^{cg}, anula la señalización por FAS-R (Itoh y Nagata, 1993; Watanabe-Fukunaga et al., 1992), así como su interacción con MORT-1 (Boldin et al., 1995; Chinnalyan et al., 1995). La mutación de los correspondientes residuos en los DM de TNF-R p55 humano (L351N) y FAS-R (V238N) tuvo un efecto similar. Las proteínas mutadas no fueron capaces de autoasociarse ni de unirse a TRADD, MORT-1 ni RIP. Además, la introducción de una mutación de reemplazo en el DM de RIP en el sitio correspondiente al de la mutación lpr^{cg} (F308N) dio como resultado la pérdida de su capacidad de unirse a FAS-R, MORT-1 y TRADD, así como de autoasociarse, aunque la proteína mutada se unió al DM de RIP normal. Por otro lado, en MORT-1, la mutación de tipo lpr^{cg} (V121N) tuvo sólo un efecto limitado. Dio como resultado una unión menos eficaz a FAS-R que, por alguna razón, se observó sólo cuando se introdujo la proteína mutada en el constructo de DA pero no en el constructo de DUA.

Para ensayar si las interacciones observadas entre TRADD, MORT-1 y RIP en los ensayos de dos híbridos de levadura aparecen también en células eucarióticas, se coexpresaron MORT-1 y los DM de TRADD y RIP en células HeLa transfectadas y se intentó inmunoprecipitarlas de los lisados celulares. La inmunoprecipitación dio como resultado la precipitación de las proteínas coexpresadas, indicando que se unen entre sí en las células HeLa (Fig. 4).

Aunque la evidencia es indirecta en gran medida, TRADD, MORT-1 y RIP parecen desempeñar papeles importantes en la iniciación del efecto citocida de TNF-R p55 y FAS-R (Cleveland e Ihle, 1995). La unión de estas proteínas a los receptores, que aparece a través de sus DM, aparentemente es necesaria para su contribución a la señalización. Un estudio reciente que muestra que la estimulación de FAS-R en células provoca la unión de MORT-1 a este receptor, sugiere que las interacciones de DM observadas en levaduras transfectadas aparecen también en células de mamífero, y forman parte del proceso de inducción de la señalización (Kischkel et al., 1995). Aunque los DM de todas las proteínas examinadas tienen la capacidad de unirse a otros DM, existe una clara especificidad en esta interacción. Los DM de TRADD se unen a los de TNF-R p55, pero no a los DM de FAS-R. El DM de MORT-1 se une al DM de FAS-R, pero no se une al DM de TNF-R p55. Esta especificidad en la acción de proteínas que forman parte de la actividad de señalización de TNF-R p55 y FAS-R puede contribuir mucho a las diferencias en la función de los dos receptores.

Además de su unión diferencial a los DM de TNF-R p55 y FAS-R, los DM de TRADD y MORT-1 son también capaces de unirse eficazmente entre sí, y ambos son capaces de unirse al DM de RIP más eficazmente que los DM de FAS-R o TNF-R p55. Por tanto, aunque distintas, las cascadas de señalización afectadas por TRADD y MORT-1 pueden resultar coordinarse bien mediante sus interacciones mutuas. La naturaleza de esta coordinación puede variar, dependiendo del modo en que las diferentes interacciones de los DM en una proteína dada se afectan entre sí. Estas interacciones pueden aparecer unidas o ser exclusivas; pueden modularse también entre sí. Un modo posible de dicha modulación está indicado por la aparición en RIP de motivos de secuencia característicos de proteína quinasas. Si esta proteína misma posee actividad proteína quinasa, puede resultar capaz de fosforilar MORT-1 y TRADD tras su unión a ellas, modulando así su función. Una consecuencia plausible de la asociación de TRADD y MORT-1, y de la unión de RIP a ambas proteínas, es la integración de sus efectos, al menos en parte. Esta integración puede dar cuenta del hecho de que la inducción de la muerte celular por TNF-R p55 y FAS-R exhibe, además de rasgos distintos, también ciertas similitudes; esto podría dar como resultado también compartir otras actividades de los dos receptores.

Ejemplo 3 Clonación y aislamiento de proteínas que se unen a motivos de "dominio de muerte" de proteínas que contienen el motivo de "dominio de muerte"

Para aislar proteínas que interaccionan con los motivos de "dominio de muerte" o proteínas que contienen el motivo de "dominio de muerte", por ejemplo, los motivos de "dominio de muerte" de TNF-R p55, FAS-R, NGF-R, MORT-1 y anquirina 1, puede utilizarse el sistema de dos híbridos de levadura (Fields y Song, 1989) como se describe en las solicitudes de patente de Israel pendientes de tramitación nº 109632, 112002 y 112692. Brevemente, este sistema de dos híbridos es un ensayo genético basado en levadura para detectar interacciones proteína-proteína in vivo específicas mediante la restauración de un activador transcripcional eucariótico tal como GAL4 que tiene dos dominios separados, un dominio de unión a ADN y otro de activación, siendo capaces dichos dominios, cuando se expresan y se unen conjuntamente para formar una proteína GAL4 restaurada, de unirse a una secuencia activadora cadena arriba que a su vez activa un promotor que controla la expresión de un gel informador, tal como lacZ o HIS3, cuya expresión se observa fácilmente en las células cultivadas. En este sistema, los genes de las proteínas de interacción candidatas se clonan en vectores de expresión separados. En un vector de expresión, se clona la secuencia de una proteína candidata en fase con la secuencia del dominio de unión a ADN de GAL4 para generar una proteína híbrida con el dominio de unión a ADN de GAL4, y en el otro vector se clona la secuencia de la segunda proteína candidata en fase con la secuencia del dominio de activación de GAL4 para generar una proteína híbrida con el dominio de activación de GAL4. Los dos vectores híbridos se cotransforman después en una cepa hospedadora de levadura que tiene un gen informador lacZ o HIS3 bajo el control de sitios de unión a GAL4 cadena arriba. Sólo aquellas células hospedadoras transformadas (cotransformantes) en las que se expresan las dos proteínas híbridas y son capaces de interaccionar entre sí, serán capaces de expresión del gen informador. En el caso del gen informador lacZ, las células hospedadoras que expresan este gen se volverán de color azul cuando se añada X-Gal a los cultivos. Por tanto, las colonias azules son indicativas del hecho de que dos proteínas candidatas clonadas son capaces de interaccionar entre
sí.

Utilizando este sistema de dos híbridos, los motivos de "dominio de muerte" pueden clonarse, separadamente, en el vector pGBT9 (portador de la secuencia de unión a ADN de GAL4, proporcionado por CLONTECH, EE.UU., véase a continuación), para crear proteínas de fusión con el dominio de unión a ADN de GAL4. Una vez es conocida la secuencia del motivo de "dominio de muerte", por ejemplo aquellas mostradas en la Fig. 1, la secuencia de ADN que codifica estos motivos puede aislarse y clonarse fácilmente mediante procedimientos estándar en el vector pGBT9 utilizando la región de sitio de clonación múltiple (SCM) del vector.

Los vectores híbridos anteriores pGBT9 (quiméricos) pueden cotransfectarse después (separadamente, una cotransfección con cada híbrido que contiene motivo de "dominio de muerte" junto con una biblioteca de ADNc o ADN genómico de origen humano o de otro mamífero, por ejemplo, una biblioteca de ADNc de células HeLa humanas clonadas en el vector pGAD GH, portador del dominio activador de GAL4, en la cepa hospedadora de levadura HF7c (todos los vectores anteriormente observados, pGBT9 y pGAD GH portadores de la biblioteca de ADNc de células HeLa, y la cepa de levadura son adquiribles en Clontech Laboratories, Inc., EE.UU., como parte del MATCHMAKER Two-Hybrid System, nº PT1265-1). Las levaduras cotransfectadas se seleccionan después por su capacidad de crecer en medio que carece de histidina (medio His^{-}), siendo indicativo el crecimiento de colonias de transformantes positivos. En los clones de levadura seleccionados se ensayó después su capacidad de expresar el gen lacZ, concretamente, su actividad LAC Z, y esto añadiendo X-Gal al medio de cultivo, que se cataboliza para formar un producto de color azul por \beta-galactosidasa, la enzima codificada por el gen lacZ. Por tanto, las colonias azules son indicativas de un gen lacZ activo. Para la actividad del gen lacZ, es necesario que esté presente el activador de la transcripción de GAL4 en forma activa en los clones transformados, es decir, que el dominio de unión a ADN de GAL4 codificado por uno de los vectores híbridos anteriores se combine apropiadamente con el dominio de activación de GAL4 codificado por el otro vector híbrido. Dicha combinación es sólo posible si las dos proteínas condensadas con cada uno de los dominios de GAL4 son capaces de interaccionar establemente (unirse) entre sí. Por tanto, las colonias His^{+} y azules (LAC Z^{+}) que se aíslan son colonias que se han transfectado con un vector que codifica un motivo de "dominio de muerte" y un vector que codifica un producto proteico, por ejemplo de origen de célula HeLa humana, que es capaz de unirse establemente al motivo de "dominio de muerte".

El ADN de plásmido de las colonias de levadura His^{+}, LAC Z^{+} anteriores puede aislarse después y someterse a electroporación en la cepa HB101 de E. coli mediante procedimientos estándar, seguido por la selección de transformantes Leu^{+} y resistentes a ampicilina, siendo estos transformantes los que portan el vector híbrido pGAD GH que tiene tanto las secuencias de codificación Amp^{R} como Leu^{2}. Dichos transformantes son por lo tanto clones que portan las secuencias que codifican proteínas o péptidos recién identificados capaces de unirse a los motivos del "dominio de muerte". Se aisló después ADN de plásmido a partir de estas E. coli transformadas y se reensayó:

(a) retransformándolas con plásmidos híbridos que contienen el motivo de "dominio de muerte" original en la cepa HF7 de levadura como se da a conocer anteriormente en la presente memoria. Como controles, pueden utilizarse vectores portadores de secuencias que codifican proteínas irrelevantes, por ejemplo pACT-lamina o pGBT9 solos, para contransformación con los plásmidos que codifican la proteína o péptido de unión al motivo de "dominio de muerte". En las levaduras cotransformadas puede ensayarse después el crecimiento en medio His^{-} solo, o con diferentes niveles de 3-aminotriazol, y

(b) retransformando el ADN de plásmido y los plásmidos híbridos de motivo de "dominio de muerte" original y plásmidos control descritos en (a) en células hospedadoras de levadura de cepa SFY526, y determinando la actividad LAC Z^{+} (eficacia de la formación de \beta-gal, concretamente formación de color azul). Debe observarse que los ensayos de expresión de \beta-galactosidasa (\beta-gal) anteriormente observados pueden realizarse también mediante un ensayo de filtro estándar.

Ejemplo 4 Evaluación de la implicación de los rasgos de secuencia característicos del motivo de "dominio de muerte" en la unión de las proteínas clonadas

El ADNc que codifica la proteína que contiene el motivo de "dominio de muerte" se mutará en los diversos aminoácidos que constituyen este motivo. Por ejemplo, el triptófano 380 en el dominio intracelular del receptor de factor de crecimiento nervioso de baja afinidad humano (NGF-R) se reemplazará por alanina. Dicha mutación puede realizarse, por ejemplo, mediante el procedimiento de mutagénesis dirigida a oligonucleótido de Kunkel. Las proteínas mutadas, así como las de tipo silvestre, pueden producirse en bacterias en forma de fusiones con glutation-S-transferasa (GST). La unión de la proteína clonada in vitro a la fusión de GST con el NGF-R mutado se comparará con su unión con la fusión de GST-dominio intracelular de NGF-R de tipo silvestre. La anulación de la unión por la mutación indicará que la proteína clonada sí que reconoce rasgos de secuencia que están implicados en el motivo de "dominio de muerte". Se tomará un enfoque similar para evaluar la implicación de los rasgos de secuencia característicos del dominio de "muerte" en la función de los demás reactivos que interaccionan con proteínas que contienen este motivo, a saber, anticuerpos, péptidos o compuestos orgánicos (véase el ejemplo 4).

Ejemplo 5 Diseño de fármacos que afectan a proteínas que contienen el motivo de "dominio de muerte" mediante su capacidad de interaccionar con el "dominio de muerte"

Se definirán las moléculas orgánicas o péptidos que interaccionan con el motivo de "dominio de muerte" de una de las proteínas que contienen este motivo mediante examen o mediante diseño. Se introducirán después cambios adicionales en esta molécula para aumentar la eficacia de su interacción con ese "dominio de muerte" específico y la capacidad del compuesto diseñado de afectar (potenciar o interferir) la función de la proteína que contiene el "dominio de muerte". Una vez creada dicha molécula y definido el rasgo de secuencia del "dominio de muerte" que reconoce (véase el ejemplo 3) así como los rasgos conformacionales del "dominio de muerte" implicados en este reconocimiento (por RMN, cristalografía de rayos X, etc.), este conocimiento puede aplicarse como punto de partida para diseñar fármacos que afecten a otras proteínas que contienen el motivo de "dominio de muerte". Para hacer esto, deben introducirse en el péptido o molécula orgánica diseñado, además de rasgos estructurales que permitan el reconocimiento de aquellos rasgos estructurales que son comunes al "dominio de muerte", también rasgos estructurales que dictarán el reconocimiento específico de la proteína que contiene el "dominio de muerte" específico.

Ejemplo 6 Análisis de la actividad biológica de proteínas, péptidos, anticuerpos o moléculas orgánicas de unión al motivo de "dominio de muerte"

Una vez se han aislado las proteínas o péptidos de unión al motivo de "dominio de muerte", por ejemplo mediante el procedimiento del ejemplo 1, puede ensayarse su actividad biológica. En las solicitudes pendientes de tramitación IL 109632, 111125, 112002 y 112692, se describe uno de dichos procedimientos que ensaya el efecto de proteínas de unión al dominio intracelular sobre los efectos citotóxicos mediados por TNF-R p55, FAS-R y MORT-1 (HF1).

Por tanto, utilizando procedimientos similares, es posible, en primer lugar, determinar la capacidad de dichas proteínas o péptidos de unión al motivo de "dominio de muerte" de asociarse in vitro con proteínas que contienen el motivo de "dominio de muerte", tales como TNF-R p55, FAS-R, NGF-R, MORT-1, RIP, TRADD y anquirina 1; y en segundo lugar, evaluar in vivo, utilizando ensayos de citotoxicidad celular estándar, si dichas proteínas o péptidos de unión al motivo de "dominio de muerte" son capaces de potenciar o inhibir la citotoxicidad celular inducida por receptores tales como TNF-R p55 o FAS-R o proteínas tales como MORT-1.

Igualmente, pueden aplicarse los mismos ensayos para ensayar compuestos orgánicos (obtenidos mediante examen o diseño, véase el ejemplo 4); péptidos producidos sintéticamente (véase el ejemplo 4); y anticuerpos capaces unirse a motivos de "dominio de muerte".

Referencias

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(1) INFORMACIÓN GENERAL

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(i)

SOLICITANTE:

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(A)

NOMBRE: Yeda Research and Development Co., Ltd.

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(B)

CALLE: P.O. Box 95

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(C)

CIUDAD: Rehovot

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(E)

PAÍS: Israel

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(F)

CÓDIGO POSTAL (ZIP): 76100

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(G)

TELÉFONO: 011-972-8-382609

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(H)

TELEFAX: 011-972-8-407297

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(A)

NOMBRE: WALLACH, David

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(B)

CALLE: 24, Borochov Street

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(C)

CIUDAD: Rehovot

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(E)

PAÍS: Israel

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(F)

CÓDIGO POSTAL (ZIP):

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(A)

NOMBRE: BOLDIN, Mark P.

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(B)

CALLE: Zelenograd 927-53

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(C)

CIUDAD: Moscú

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(E)

PAÍS: Federación rusa

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(F)

CÓDIGO POSTAL (ZIP): 103575

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(A)

NOMBRE: VARFOLOMEEV, Eugene E.

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(B)

CALLE: P.O. Box 26

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(C)

CIUDAD: Rehovot

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(E)

PAÍS: Israel

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(F)

CÓDIGO POSTAL (ZIP): 76100

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(A)

NOMBRE: PANCER, Zeev

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(B)

CALLE: Duesbergweg 6

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(C)

CIUDAD: Mainz

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(E)

PAÍS: Alemania

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(F)

CÓDIGO POSTAL (ZIP): D55099

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(A)

NOMBRE: METT, Igor

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(B)

CALLE: 60 Levin Epstein Street

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(C)

CIUDAD: Rehovot

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(E)

PAÍS: Israel

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(F)

CÓDIGO POSTAL (ZIP):

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\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: GONCHAROV, Tanya M.

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(B)

CALLE: 154 Saphira Street, Apt. 14

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(C)

CIUDAD: Ashkelon

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(E)

PAÍS: Israel

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(F)

CÓDIGO POSTAL (ZIP): 78210

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\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: WEINWURZEL, Henry

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(B)

CALLE: Herzl Street, 43

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(C)

CIUDAD: Raanana

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(E)

PAÍS: Israel

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(F)

CÓDIGO POSTAL (ZIP): 43353

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\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: MODULADORES DE PROTEÍNAS REGULADORAS

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(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 5

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(iv)

FORMA DE LECTURA INFORMÁTICA:

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(A)

TIPO DE MEDIO: disquete

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(B)

ORDENADOR: compatible con PC de IBM

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(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

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(D)

SOFTWARE: PatentIn Release nº 1.0, versión nº 1.30, (OEP)

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(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 1:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 63 aminoácidos

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(B)

TIPO: aminoácido

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(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº ID 1:

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1

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(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 63 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: aminoácido

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(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº ID 2:

2

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(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 3:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 64 aminoácidos

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(B)

TIPO: aminoácido

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(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

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(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº ID 3:

3

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(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 56 aminoácidos

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(B)

TIPO: aminoácido

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(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

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(ix)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº ID 4:

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4

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(2) INFORMACIÓN DE LA SEC Nº ID 5:

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(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A)

LONGITUD: 62 aminoácidos

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(B)

TIPO: aminoácido

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(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

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(D)

TOPOLOGÍA: lineal

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(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: péptido

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(ix)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC Nº ID 5:

5

Claims (4)

1. Un anticuerpo específico del dominio de muerte de una proteína reguladora que contiene dominio de muerte, o un fragmento de uno de dichos anticuerpos que es capaz de unirse a dicho dominio de muerte, siendo la proteína reguladora NGF-R.

2. Un anticuerpo o fragmento según la reivindicación 1, que es capaz adicionalmente de unirse al dominio de muerte de una o ambas proteínas reguladoras que contienen dominio de muerte MORT-1 y anquirina 1.

3. Un anticuerpo o fragmento según la reivindicación 1, que es capaz adicionalmente de unirse al dominio de muerte de al menos una proteína reguladora seleccionada de TNF-R p55, FAS-R, RIP y TRADD.

4. Un anticuerpo según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende un anticuerpo monoclonal.