ES2242214T3 - Compuestos y metodos inmunosupresores. - Google Patents

Abstract

SE DESCRIBEN COMPUESTOS Y PROCEDIMIENTOS PARA USO EN TRATAMIENTO INMUNOSUPRESOR Y ANTIINFLAMATORIO, Y PARA INHIBIR LA FECUNDIDAD MASCULINA. LOS COMPUESTOS SON ANALOGOS DE LA TRIPTOLIDA CON MEJOR SOLUBILIDAD EN AGUA Y ESCASA TOXICIDAD.

Description

Compuestos y métodos inmunosupresores.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a compuestos y métodos para su uso en el tratamiento inmunosupresor y antiinflamatorio, y para reducir la fertilidad masculina.

Bibliografía

Bradley, L., en SELECTED METHODS IN CELLULAR IMMUNOLOGY, W.H. Freeman and Company, San Francisco, págs. 162-164 (1980).

Briggs, J.D., Immunol. Lett. 29(1-2):89-94 (1991).

Hasan, R. et al., Transplantation 54:408 (1992).

Kennedy, M.S. et al., Am. J. Med. 78:978 (1983).

Keown, P.A., Clin. Transplants 205-223 (1991).

Kocienski, P.J., PROTECTING GROUPS, Georg Thieme Verlag, Stuttgart (1994).

Kupchan, S.M. et al., J. Am. Chem. Soc. 94:7194 (1972).

Kupchan, S.M. et al., patente de los EE.UU. número 4.005.108 (1977).

Lipsky, P.E. et al., patente de los EE.UU. número 5.294.443 (1994).

Ma, P-C. et al., J. Chin. Pharm. Sci. 1:12 (1992).

Mishell, B. et al., Eds., en SELECTED METHODS IN CELLULAR IMMUNOLOGY W.H Freeman and Co., San Francisco, CA (1980).

Morris, R.E., Transplant Proc. 23(6):2722-2724 (1991).

Morris, R.E. et al., Transplant Proc. 23(1):238-240 (1991).

Mossmann, T., J. of Immunological Methods 65:55 (1983).

Murase, N. et al., Transplantation 55:701 (1993).

O'Gara, A. y Defrance, T., en LABORATORY METHODS IN IMMUNOLOGY, Zola, H., Ed., CRC Press (1990).

Ono y Lindsey, J. Thor. Cardiovasc. Surg. 57(2):225-29 (1969).

Platt, J.L. et al., Immunology Today 11(12):450 (1990).

Pu, L. et al., Zhongguo Yaoli Xuebao 11:76 (1990).

Roberts, J.P. et al., Ann. Rev. Med. 40:287 (1989).

Schumacher, H.R., Ed., en PRIMER ON THE RHEUMATIC DISEASES, Novena Ed., Arthritis Foundation (Fundación para la artritis), Atlanta. GA (1988).

Storb, R., "Pathophysiology and Prevention of Graft-Versus-Host Disease," en ADVANCES IN IMMUNOBIOLOGY: BLOOD CELL ANTIGENS AND BONE MARROW TRANSPLANTATION, McCullogh, J., y Sandler, S.G., Editores,

Alan R. Liss, Inc., Nueva York, pág. 337 (1984).

Storb, R., Blood 66:698 (1985).

Storb, R. et al., N. Engl. J. Med. 314:729 (1986).

Thomas, E.D. et al., N. Engl. J. Med. 292:832 (1975).

Wang, J., y Morris, R.E., Transplantation Proc. 23:699 (1991).

Weiden, P.L. et al., "Graft-Versus-Host Disease in Allogeneic Marrow Transplantation," en BIOLOGY OF BONE-MARROW TRANSPLANTATION, Gale, R.P. y Fox, C.F., Eds., Academic Press, Nueva York, pág. 37 (1980).

Zheng, J. et al., Zhongguo Yixue Kexueyuan Xuebao 13:391 (1991).

Zheng, J. et al., Zhongguo Yixue Kexueyuan Xuebao 16:24 (1994).

Antecedentes de la invención

El sistema inmunitario funciona como la principal defensa del organismo frente a enfermedades producidas por microorganismos invasores. Este complejo sistema lucha contra la enfermedad destruyendo a invasores tales como bacterias, virus, parásitos o células cancerosas mientras deja intactos los tejidos normales del organismo. La capacidad del sistema inmunitario para distinguir los tejidos normales del organismo, o propios, de tejido extraño o canceroso, o no propio, es una característica esencial de la función normal del sistema inmunitario. Una segunda característica esencial es la memoria, la capacidad para recordar un invasor extraño particular y montar una respuesta defensiva aumentada cuando vuelve el invasor con el que se encontró previamente. La pérdida de reconocimiento de un tejido particular como propio y la posterior respuesta inmunitaria dirigida contra ese tejido produce una enfermedad grave.

Una enfermedad autoinmunitaria resulta del ataque del sistema inmunitario contra órganos o tejidos del propio organismo, produciendo un estado clínico asociado a la destrucción de ese tejido. Un ataque autoinmunitario dirigido contra el tejido de revestimiento de una articulación da como resultado artritis reumatoide; un ataque contra las fibras conductoras del sistema nervioso da como resultado esclerosis múltiple. Lo más probable es que las enfermedades autoinmunitarias compartan una patogenia común y la necesidad de un tratamiento seguro y eficaz.

La artritis reumatoide es una de las enfermedades autoinmunitarias más comunes. Los tratamientos actuales utilizan tres clases generales de fármacos (Schumacher, 1988): agentes antiinflamatorios (aspirina, fármacos antiinflamatorios no esteroideos y corticosteroides a dosis baja); fármacos antirreumáticos modificadores de la enfermedad, conocidos como "FARME" (antipalúdicos, sales de oro, penicilamina y sulfasalazina) y agentes inmunosupresores (azatioprina, clorambucilo, corticosteroides a dosis alta, ciclofosfamida, metotrexato, mostaza nitrogenada, 6-mercaptopurina, vincristina, hidroxiurea y ciclosporina A). Ninguno de los fármacos disponibles es completamente eficaz y la mayoría están limitados por una grave toxicidad.

Además de su uso en el tratamiento de estados autoinmunitarios, los agentes inmunosupresores también se han utilizado en el tratamiento o la prevención del rechazo de un trasplante. El trasplante de órganos en el que participan donantes de órganos humanos y receptores humanos (aloinjertos) y donantes primates no humanos y receptores humanos (xenoinjertos) ha recibido una considerable atención médica y científica (Roberts, 1989; Platt, 1990; Keown, 1991; Wang y Morris, 1991; Hasan, 1992; Murase, 1993). En gran medida, estos esfuerzos se han dirigido a eliminar, o al menos reducir, el problema de rechazo del órgano trasplantado. En ausencia de un tratamiento inmunosupresor adecuado, el órgano transplantado lo destruye el sistema inmunitario del huésped.

Otro obstáculo en el trasplante, que ha limitado los trasplantes de médula ósea (TMO) en particular, es la enfermedad de injerto contra huésped (EICH). La EICH es un estado en el que las células de médula trasplantadas atacan a las células del receptor (Thomas, 1075; Storb, 1984). Muchos pacientes con TMO que reciben una médula de HLA (antígenos de histocompatibilidad leucocitaria) idénticos que dan negativo en la prueba de reacción mixta de linfocitos (MLR) desarrollan todavía EICH, presumiblemente debido a una discrepancia entre el receptor y el donante en los determinantes polimórficos no HLA. Una gran proporción de los individuos afectados por EICH fallecen como resultado de EICH (Weiden et al., 1980).

Actualmente, los agentes utilizados más comúnmente para prevenir el rechazo de un trasplante incluyen corticosteroides, fármacos antimetabolitos que reducen la proliferación de linfocitos inhibiendo la síntesis de ADN y ARN, tales como azatioprina, fármacos inmunosupresores tales como ciclosporina A, que inhibe específicamente la activación de células T y anticuerpos específicos dirigidos contra linfocitos T o receptores de superficie que median su activación (Briggs, 1991; Kennedy, 1983; Storb, 1985; Storb et al., 1986). Todos estos tratamientos farmacológicos son limitados en su eficacia, en parte debido a que las dosis necesarias para el tratamiento eficaz del rechazo del trasplante pueden aumentar la sensibilidad del paciente a la infección por una variedad de invasores oportunistas y en parte debido a la toxicidad directa y otros efectos secundarios. Por ejemplo, la ciclosporina A, actualmente el agente usado más comúnmente, es significativamente tóxica para el riñón. Esta nefrotoxicidad limita la cantidad de fármaco que puede administrarse de manera segura.

Recientemente, se ha identificado que varios compuestos de la planta medicinal china Tripterygium Wilfordii (TW) tienen actividad inmunosupresora. Los compuestos representativos que se han aislado de TW incluyen triptólido, 16-hidroxitriptólido, triptofenólido, tripdiólido y celastrol, tal como se describe, por ejemplo, en Lipsky et al. (1994) y Zheng et al. (1991; 1994). Sin embargo, la administración y eficacia terapéutica de estos compuestos han estado limitadas por su baja solubilidad en agua.

Un enfoque para mejorar la eficacia de estos compuestos es formularlos en mezclas de etanol y aceite de ricino polietoxilado (por ejemplo, "CREMOPHOR EL"), lo que permite la posterior dilución en solución salina para la administración intravenosa. Sin embargo, tales formulaciones han padecido una alta toxicidad, debido a la alta concentración de agente solubilizante requerida para disolver estos compuestos. Por ejemplo, la razón de agente solubilizante (etanol más "CREMOPHOR EL") con respecto a triptólido en tales formulaciones es normalmente del orden de 1000:1 o superior, debido a la escasa solubilidad de triptólido (Morris, 1991: Morris et al., 1991). La normalización de las cantidades de dosificación es también más problemática con una suspensión que con una disolución.

Por tanto, sería deseable proporcionar compuestos inmunosupresores que tengan una solubilidad en agua mejorada y baja toxicidad. Además, sería deseable que tales compuestos muestren actividad inmunosupresora en su forma soluble en agua o que puedan convertirse en una forma inmunosupresora mediante procesos metabólicos in vivo. Sería deseable además proporcionar compuestos que tengan solubilidades en agua mejoradas, que sean útiles como anticonceptivos.

Sumario de la invención

La invención incluye, en un aspecto, un compuesto que tiene la estructura representada por la fórmula 1 siguiente,

1

en la que X^{1} es OH u OR^{1}, y X^{2} y X^{3} son independientemente OH, OR^{1} o H, con la condición de que al menos uno de X^{1}, X^{2} y X^{3} sea OR^{1}, y al menos uno de X^{2} y X^{3} sea H; y

R^{1} es -C(O)-Y-Z, en el que

Y es una cadena de alquilo o alquenilo C_{1}-C_{6} ramificado o no ramificado; y

Z es COOR^{2}, NR^{3}R^{3'} o +NR^{4}R^{4'}R^{4''}, en los que R^{2} es un catión; R^{3} y R^{3'} son independientemente H o alquilo C_{1}-C_{6} ramificado o no ramificado, hidroxialquilo o alcoxialquilo, o R^{3} y R^{3'} tomados juntos forman un anillo heterocíclico de 5 a 7 miembros, cuyos átomos de anillo se seleccionan del grupo que consiste en carbono, nitrógeno, oxígeno y azufre, en el que los átomos de anillo incluyen de 2 a 6 átomos de carbono, uno o más átomos de nitrógeno y opcionalmente uno o más átomos de oxígeno o azufre, y en el que el anillo no está sustituido o está sustituido con uno o más grupos seleccionados de R^{5}, OR^{5}, NR^{5}R^{6}, SR^{5}, NO_{2}, CN, C(O)R^{5}, C(O)NR^{5}R^{6}, OC(O)R^{5}, OC(O)NR^{5}R^{6}, y halógeno (flúor, cloro, bromo o yodo), en los que R^{5} y R^{6} son independientemente hidrógeno, alquilo inferior o alquenilo inferior; y R^{4}, R^{4'} y R^{4''} son independientemente alquilo C_{1}-C_{6} ramificado o no ramificado, hidroxialquilo o alcoxialquilo.

En una realización general, el compuesto es un derivado de triptólido, en el que X_{1} es OH u OR, tal como se definieron anteriormente, y X^{2} y X^{3} son H. En una segunda realización general, el compuesto es un derivado de 16-hidroxitriptólido, en el que X_{1} y X_{3} son OH u OR_{1}, y X_{2} es H. En una tercera realización general, el compuesto es un derivado de tripdiólido (2-hidroxitriptólido), en el que X_{1} y X_{2} son OH u OR_{1} y X^{3} es H.

En una realización preferida, Z es COOH o COOR^{2}, en el que R^{2} es un ion metálico, preferiblemente Na^{+} o K^{+}. En una realización alternativa, R^{2} es una amina cargada positivamente, preferiblemente lisina, trietilamina o tris(hidroximetil)aminometano. Preferiblemente, R^{2} es Na^{+}, tris(hidroximetil)aminometano o lisina, e Y es una cadena de alquilo C_{1}-C_{4}.

En otra realización preferida, Z es NR^{3}R^{3'}, en el que R^{3} y R^{3'} son independientemente H o alquilo C_{1}-C_{6} ramificado o no ramificado, o forman juntos un anillo heterocíclico de 5 a 7 miembros que contiene de 2 a 6 átomos de carbono, uno o más átomos de nitrógeno y opcionalmente uno o más átomos de oxígeno o azufre. Preferiblemente, Z es dimetilamino, dietilamino o N-morfolino e Y es una cadena de alquilo C_{1}-C_{4}.

Cuando Z es un grupo amino terciario protonado o cuaternario, el compuesto también incluye un contraión aniónico. El contraión aniónico es preferiblemente un ion haluro o un ion que contiene carboxilato, sulfonato o sulfato. Más preferiblemente, el contraión es cloruro, bromuro, acetato, oxalato, maleato, fumarato, metanosulfonato o toluenosulfonato.

En otro aspecto, la invención incluye un método de producción de inmunosupresión en un sujeto, en el que se administra la composición descrita anteriormente a un sujeto que necesita tal tratamiento. El método es útil para inhibir el rechazo de un aloinjerto, el rechazo de un xenoinjerto y la enfermedad de injerto contra huésped, y para tratar enfermedades autoinmunitarias tales como la artritis reumatoide.

Las composiciones y el método de la invención son también útiles para el tratamiento del asma, tanto manifestaciones intrínsecas como extrínsecas. Para el tratamiento del asma, la composición se administra preferiblemente mediante inhalación. La composición y el método también pueden utilizarse para el tratamiento de otros estados inflamatorios, tales como la inflamación traumática, incluyendo la inflamación traumática que acompaña al traumatismo craneoencefálico o cervical.

La invención también proporciona un método de reducción de la fertilidad masculina en un mamífero macho, particularmente en seres humanos, administrando al mamífero un compuesto según la fórmula 1 anterior, en una cantidad eficaz para inhibir la fertilidad del mamífero.

En otros aspectos, la invención incluye composiciones farmacéuticas y medicamentos para el tratamiento inmunosupresor, el tratamiento antiinflamatorio y para reducir la fertilidad masculina. Tales composiciones incluyen un compuesto según la fórmula 1 anterior, en un vehículo farmacéuticamente aceptable. En realizaciones preferidas, el vehículo es un excipiente acuoso.

Estos y otros objetos y características de la invención resultarán evidentes de manera más completa, cuando se lea la siguiente descripción detallada de la invención junto con los dibujos adjuntos.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 muestra un esquema para preparar un compuesto de triptólido carboxilado según la invención;

la figura 2 muestra un esquema para preparar aminoderivados de triptólido según la invención;

la figura 3 muestra un esquema para preparar derivados de mono y diaminoéster de 16-hidroxitriptólido;

la figura 4 muestra un esquema para preparar un derivado de 14-aminoéster de 16-hidroxitriptólido por medio de la protección y desprotección del grupo 16-hidroxilo;

la figura 5A muestra una representación del tiempo de supervivencia del trasplante de aloinjerto para animales no tratados (cuadrados rellenos) y animales tratados con dos cantidades diferentes de la sal de tris(hidroximetil)-aminometano del succinato de triptólido (YM-273) (círculos en blanco y rellenos);

la figura 5B muestra una representación del tiempo de supervivencia del trasplante de aloinjerto para animales no tratados (cuadrados rellenos) y animales tratados con dos cantidades diferentes de la sal sódica del succinato de triptólido (YM-274) (triángulos en blanco y rellenos);

la figura 6 muestra una representación del tiempo de supervivencia del trasplante de aloinjerto para animales no tratados (cuadrados rellenos) y para animales tratados con triptólido (T10, cuadrados en blanco), sal de tris(hidroximetil)aminometano del succinato de triptólido (YM-273, círculos rellenos) y sal sódica del succinato de triptólido (YM-274, triángulos rellenos):

la figura 7 muestra el efecto de tratar a ratones macho con dosis variables de succinato de triptólido (YM-272) sobre el peso de los testículos (columna central y de la derecha), comparado con ratones no tratados (columna de la izquierda), que muestra la media (regiones sombreadas) y el error estándar de la media (EE, regiones vacías) para grupos de 5 - 6 ratones; y

la figura 8 muestra el efecto de tratar a ratones macho con dosis variables de succinato de triptólido (YM-272) sobre el tiempo transcurrido desde el inicio de la cohabitación hasta el primer nacimiento de crías, comparado con ratones no tratados, que muestra la media y el error estándar de la media (EE) para grupos de 5 ratones.

Descripción detallada de la invención I. Definiciones

Los términos de más adelante tienen los siguientes significados, a menos que se indique lo contrario.

"Derivados de triptólido" o "análogos de triptólido" se refiere a derivados de triptólido, 16-hidroxitriptólido y tripdiólido (2-hidroxitriptólido) que se derivatizan en uno o más grupos hidroxilo, tal como se describió anterior-
mente.

"Alquilo" se refiere a una radical monovalente o divalente, totalmente saturado que contiene carbono e hidrógeno, y que puede ser cíclico, ramificado o una cadena lineal (no ramificada). Ejemplos de grupos alquilo son metilo, etilo, n-butilo, n-heptilo, isopropilo, 2-metilpropilo, ciclopropilo, ciclopropilmetilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclopentiletilo y ciclohexilo.

"Alquilo inferior" se refiere a un radical alquilo de uno a cuatro átomos de carbono, tal como se pone como ejemplo mediante metilo, etilo, n-propilo, i-propilo, n-butilo, i-butilo y t-butilo.

"Alquenilo" se refiere a un radical monovalente o divalente insaturado, preferiblemente monoinsaturado, radical que contiene carbono e hidrógeno, y que puede ser cíclico, ramificado o una cadena lineal. "Alquenilo inferior" se refiere a tal radical que tiene de uno a cuatro átomos de carbono.

Un "anillo heterocíclico de 5 a 7 miembros, cuyos átomos de anillo se seleccionan del grupo que consiste en carbono, nitrógeno, oxígeno y azufre, en el que los átomos de anillo incluyen de 2 a 6 átomos de carbono y uno o más átomos de nitrógeno" se refiere a un anillo heterocíclico cuyos átomos de anillo incluyen uno o más átomos de nitrógeno y, opcionalmente, uno o más átomos de oxígeno o azufre. Ejemplos son la piperidina, piperazina, morfolina, pirrolidina, tiomorfolina e imidazol.

"Alcoxialquilo" se refiere a un grupo alquilo tal como se definió anteriormente, que contiene adicionalmente un sustituyente alcoxilo. Preferiblemente, la parte de alquilo en el sustituyente alcoxialquilo es un grupo alquilo inferior.

El término "mamífero" pretende que tenga su significado habitual e incluye seres humanos, perros, gatos, vacas, ovejas, ratones, ratas y similares.

Para los fines de la presente descripción, se utiliza el siguiente esquema de numeración para triptólido y análogos de triptólido:

2

II. Síntesis de análogos de triptólido

Esta sección describe la síntesis de compuestos según la presente invención, definidos por la fórmula 1 anterior. En general, los compuestos son derivados de éster de triptólido, tripdiólido o 16-hidroxitriptólido, en los que los sustituyentes éster unidos incluyen uno o más grupos amino o carboxilato. Los compuestos tienen mayor solubilidad en agua que los compuestos de partida no derivatizados y son útiles como profármacos para aplicaciones inmunosupresoras, antiinflamatorias y de anticoncepción masculina.

Los compuestos de la invención pueden prepararse a partir de triptólido, tripdiólido o 16-hidroxitriptólido obtenidos del xilema de la raíz de la planta medicinal china Tripterygium Wilfordii (TW) o de otras fuentes conocidas. La planta TW se encuentra en la provincia de Fujiang y otras provincias del sur de China; el material de la planta TW puede obtenerse generalmente en China o a través de fuentes comerciales en los Estados Unidos. Se conocen en la técnica métodos para preparar triptólido, tripdiólido o 16-hidroxitriptólido y se describen, por ejemplo, en Kupchan et al. (1972); Kupchan et al. (1977); Lipsky et al. (1994); Pu et al. (1990) y Ma et al. (1992).

Los esquemas sintéticos para preparar derivados carboxilados de triptólido según la invención se muestran en la figura 1. Con referencia al camino de reacción superior mostrado en la figura, se hace reaccionar triptólido (1) con un exceso de un ácido dicarboxílico de la forma HO_{2}C(CH_{2})_{m}CO_{2}H, en la que m es de 1 a 4, en presencia de un agente de acoplamiento tal como diciclohexilcarbodiimida (DCC) y una cantidad catalítica de un catalizador de acilación, tal como 4-(dimetilamino)piridina (DMAP). Las condiciones de reacción son eficaces para activar uno o ambos grupos carboxilato en el ácido dicarboxílico hacia la reacción con el grupo 14-hidroxilo de (1), de tal manera que se forma un producto de éster (2). Cualquier DCC residual unida al carboxilo libre en (2) puede liberarse mediante la adición de agua, preferiblemente en condiciones básicas.

Un segundo método para preparar derivados carboxilados de (1) se muestra en el camino de reacción inferior en la figura 1. En este enfoque, (1) se hace reaccionar con un anhídrido de ácido dicarboxílico seleccionado, en condiciones eficaces para que el grupo 14-hidroxilo de (1) ataque uno de los grupos carbonilo del anhídrido para producir el producto (2). Pueden encontrarse condiciones a modo de ejemplo para este enfoque en el ejemplo 1.

Más generalmente, los métodos ilustrados en la figura 1 pueden utilizarse para preparar derivados de triptólido según la fórmula 1 anterior, en los que X_{2} y X_{3} son H y X_{1} es -C(O)-Y-Z (es decir, R_{1} en la fórmula 1), en el que Y es una cadena de alquilo o alquenilo C_{1}-C_{6} ramificado o no ramificado, y Z es COOR^{2}, en el que R^{2} es un catión.

La figura 2 ilustra un método para preparar derivados de aminoéster de triptólido. Se hace reaccionar triptólido (1) con un ácido carboxílico aminosustituido, R_{N}CO_{2}H, en presencia de un agente de acoplamiento (por ejemplo, DCC) y un catalizador de acilación (por ejemplo, DMAP). Estas condiciones de reacción pueden utilizarse para preparar varios aminoderivados, dependiendo del material de partida de aminoácido. Por ejemplo, la reacción de (1) con N,N-dimetilglicina produce el producto de éster (3a), mostrado en la figura 2 y descrito en el ejemplo 5. De manera similar, la reacción de (1) con ácido 3-(N,N-dietilamino)propiónico, ácido 4-pirrolidinobutírico o ácido 5-morfolinopentanoico produce el producto (3b), (3c) o (3d), respectivamente, tal como se detalla en los ejemplos 7 - 9. Las sales de amina según la invención se preparan rápidamente mediante tratamiento con un ácido seleccionado, como en el ejemplo 6, o utilizando una forma de sal de amonio de R_{N}CO_{2}H en la etapa de acoplamiento, como en los ejemplos 7 y 8.

Por tanto, se observará que el enfoque de la figura 2 puede utilizarse para preparar aminoderivados según la estructura (3) de la figura 2, utilizando los materiales de partida apropiados, en los que R_{N} tiene la forma de Y-Z definida en el sumario de la invención. Y es una cadena de alquilo o alquenilo C_{1}-C_{6} ramificado o no ramificado, Z es NR^{3}R^{3'} o +NR^{4}R^{4'}R^{4''}, R^{3} y R^{3'} son independientemente H o alquilo C_{1}-C_{6} ramificado o no ramificado, hidroxialquilo o alcoxialquilo, o tomados juntos forman un anillo heterocíclico de 5 a 7 miembros que contiene de 2 a 6 átomos de carbono, uno o más átomos de nitrógeno y opcionalmente uno o más átomos de oxígeno o azufre, y en el que el anillo no está sustituido o está sustituido con uno o más grupos seleccionados de R^{5}, OR^{5}, NR^{5}R^{6}, SR^{5}, NO_{2}, CN, C(O)R^{5}, C(O)NR^{5}R^{6}, OC(O)R^{5}, OC(O)NR^{5}R^{6}, y halógeno (flúor, cloro, bromo o yodo), en los que R^{5} y R^{6} son independientemente hidrógeno, alquilo inferior o alquenilo inferior; y R^{4}, R^{4'} y R^{4''} son independientemente alquilo C_{1}-C_{6} ramificado o no ramificado, hidroxialquilo o alcoxialquilo. En el caso en el que Z es NR^{3}R^{3'}, en el que R^{3} y R^{3'} forman juntos un anillo heterocíclico, los anillos preferidos incluyen morfolina, piperidina, pirrolidina y piperazina.

Además, aunque las figuras 1 y 2 ilustran esquemas de reacción que utilizan triptólido como material de partida, se apreciará que pueden utilizarse esquemas de reacción sintéticos similares para preparar los correspondientes derivados de éster de 16-hidroxitriptólido y tripdiólido.

La figura 3 ilustra enfoques sintéticos para preparar derivados de mono y diéster de 16-hidroxitriptólido (4), un compuesto que contiene dos grupos hidroxilo libres. Tal como puede observarse a partir de la figura, el compuesto (4) contiene un grupo hidroxilo en la posición 14 que está unido a un átomo de carbono secundario y un segundo grupo hidroxilo en la posición 16 que está unido a un átomo de carbono primario. Puesto que el grupo hidroxilo en la posición 16 es más reactivo que el grupo hidroxilo en la posición 14 por razones estéricas, pueden prepararse selectivamente los derivados de mono y diéster utilizando las condiciones de reacción apropiadas.

Tal como se muestra en el camino de reacción superior de la figura 3, la reacción de (4) con una cantidad estequiométrica de un ácido carboxílico seleccionado produce el monoéster (5) derivatizado en la posición 16, con el grupo 14-hidroxilo restante libre. Por el contrario, tal como se muestra en el camino de reacción inferior, la reacción de (4) con un exceso del ácido carboxílico es eficaz para derivatizar ambos grupos hidroxilo, produciendo el diéster (6).

Los derivados de monoéster de 16-hidroxitriptólido (4) en la posición 14, en lugar de en la posición 16, pueden prepararse mediante el enfoque general mostrado en la figura 4. Este enfoque se aprovecha de la mayor reactividad del grupo 16-hidroxilo hacia los electrófilos, mediante lo cual el 16-hidroxilo puede protegerse selectivamente con un grupo protector (PRT), tal como se muestra en la primera etapa de la figura 4. El compuesto protegido (7) se hace entonces reaccionar con un ácido carboxílico (RCO_{2}H) seleccionado para esterificar el grupo 14-hidroxilo, formando el compuesto (8). Entonces, se elimina el grupo protector en una desprotección, para producir el 14-monoéster (9) deseado. Se conocen grupos protectores de hidroxilo adecuados para los fines del esquema de protección/desprotección de la figura 4 y se describen, por ejemplo, por Kocienski (1994). Un grupo protector preferido es un bencil éter, que puede eliminarse mediante hidrogenación catalítica (Kocienski, 1994, pág. 46). Alternativamente, puede utilizarse un t-butildimetil silil éter. Este grupo puede eliminarse, por ejemplo, mediante tratamiento con fluoruro de tetrabutilamonio (TBAF).

La derivatización individual selectiva de tripdiólido (2-hidroxitriptólido) es más difícil debido a las reactividades similares de los dos hidroxilos secundarios. En consecuencia, los 2 y 14-monoésteres puede prepararse como una mezcla, o bien (1) haciendo reaccionar tripdiólido con una cantidad comparable de ácido carboxílico (por ejemplo, de 1 a 3 equivalentes) o bien (2) haciendo reaccionar brevemente tripdiólido con un exceso de ácido carboxílico seguido rápidamente por la adición de alcohol (por ejemplo, etanol) en exceso para extinguir el exceso de ácido carboxílico. En cualquier caso, puede obtenerse una mezcla de las formas de mono y diéster que entonces puede separarse mediante métodos cromatográficos habituales, tales como HPLC.

Las sales metálicas y las sales de amina de los compuestos de amino y carboxiéster de la invención se preparan fácilmente mediante la reacción o el intercambio con un contraión apropiado, tal como se describe en los ejemplos 2-4 y 6. En el caso de los compuestos de carboxiéster tales como (2), los contraiones adecuados incluyen iones sodio y potasio, así como aminas orgánicas tales como mono, di, tri o tetraalquilaminas en las que los grupos alquilo son grupos alcoxilo o alquilo inferior.

III. Estabilidad de los derivados de triptólido

El succinato de triptólido sódico, designado como YM-274, se disolvió en D_{2}O y la disolución acuosa se guardó a temperatura ambiente. Se tomaron espectros de RMN de protón a intervalos, tal como se describe en el ejemplo 10A, y mostraron que el compuesto permanecía inalterado tras tres meses en disolución. Tras cinco meses, se observó cierta descomposición.

Se determinó la estabilidad del succinato de triptólido en suero sanguíneo tal como se detalla en el ejemplo 10B. En este estudio, se mezcló una disolución de succinato de triptólido (YM-262, ácido libre) en DMSO con suero de rata y se incubó a 37ºC. La mezcla se sometió a ensayo periódicamente mediante cromatografía en capa fina (CCF) para seguir la hidrólisis del succinato de triptólido con el tiempo. En el plazo de los primeros 3 a 5 minutos, permanecía la mayor parte del succinato de triptólido (R_{f} = 0,45). Tras 15 minutos, había desaparecido la mancha de succinato de triptólido y había aparecido una nueva mancha correspondiente a triptólido (R_{f} = 0,60). Finalmente, tras 45 minutos, también había desaparecido la mancha de triptólido y sólo quedaba material de R_{f} bajo (componentes del suero sanguíneo y productos de descomposición). Estos resultados indican que el éster de triptólido se hidroliza en suero para liberar triptólido libre en menos de una hora.

IV. Actividad biológica

Se examinaron varios derivados de sal de succinato según la presente invención para determinar su actividad inmunosupresora utilizando varios ensayos biológicos. Los compuestos probados fueron ésteres carboxilados de triptólido preparados mediante succinilación de triptólido seguido por la formación de la sal, tal como se detalla en los ejemplos 1 a 4, con las siguientes designaciones: ácido libre, YM-262; sal de tris(hidroximetil)aminometano (tris), YM-273; sal sódica, YM-274; y sal de L-(+)-lisina, YM-276. También se probó el succinato de triptólido (ácido libre, YM-262) para determinar sus efectos anticonceptivos.

A. Inhibición de la acción de IL-1

Se examinó la capacidad de los compuestos anteriores para inhibir el efecto de proliferación celular de IL-1\beta in vitro (O'Gara, 1990), tal como se describe en el ejemplo 11. Se estimularon timocitos de ratón en cultivo con IL-1\beta en presencia de fitohemaglutinina (FHA) y concentraciones crecientes de triptólido (control) y derivados de triptólido. Las células se cultivaron durante 72 horas y, durante las ultimas 18 horas, se incubaron con timidina tritiada. Se evaluó la síntesis de ADN midiendo la incorporación de timidina radiomarcada. Los resultados expresados en cuanto a CI_{50} (concentración eficaz para producir una inhibición del 50% de la proliferación) se muestran en la tabla I.

TABLA I Ensayo de IL-1

Compuesto	CI_{50}	Toxicidad
	(ng/ml)	(nmol/ml)	(ng/ml)
Triptólido	1,9	0,0053	> 12500
YM-262	181	0,393	> 12500
YM-273	462	0,8	12000
YM-274	181	0,376	> 12500
YM-276	144	0,238	> 12500

Con referencia a la columna 3 en la tabla I, el triptólido mostró un valor de CI_{50} de aproximadamente 0,005 nmol/ml, lo que indica que el compuesto libre (no derivatizado) es un potente inhibidor de la acción de IL-1\beta. Las formas de ácido libre y de sal del 14-succiniléster de triptólido mostraron valores de CI_{50} que fueron aproximadamente de 45 a 150 veces superiores a los del triptólido libre en este ensayo in vitro. Todos los derivados de éster mostraron baja toxicidad (tabla II, columna 4), medida mediante el ensayo de MTT (bromuro de 3-(4,5-dimetil-2-tiazolil)-2,5-difeniltetrazoilo) (ejemplo 13).

B. Reacción mixta de linfocitos (MLR)

Se sometió a ensayo la inhibición de la proliferación celular por los compuestos objeto en la reacción mixta de linfocitos (MLR) (Bradley, 1980; Mishell, 1980). Se prepararon células de bazo de ratones C57BL/6 hembra, las células "que responden", y se cocultivaron solas o en presencia de concentraciones variables de los compuestos de prueba, con células de bazo irradiadas preparadas a partir de ratones Balb/C hembra, las células "estimuladoras". Antes de la irradiación de las células estimuladoras, se hizo que fuesen incapaces de proliferar. También se irradió una muestra de las células que responden para su uso como control. Las células que responden no irradiadas proliferan en presencia de las células estimuladoras alogénicas. Tras una incubación de 78 horas, se añadió timidina tritiada a los cultivos de células mixtas y se midió la incorporación del nucleótido marcado en el ADN, como índice de la proliferación celular. Los resultados se muestran en la tabla II.

TABLA II Ensayo de MLR

Compuesto	CI_{50}	Toxicidad
	(ng/ml)	(nmol/ml)	(ng/ml)
Triptólido	0,9	0,0025	13,3
YM-262	86	0,187	2258
YM-273	180	0,31	5529
YM-274	90	0,187	2498
YM-276	63	0,104	1936

Tal como puede observarse, los datos de este ensayo in vitro fueron similares cualitativamente a los obtenidos con el ensayo de IL-1 en la tabla I anterior, porque las formas de ácido libre y de sal del 14-succiniléster de triptólido mostraron valores de CI_{50} que eran aproximadamente de 40 a 125 veces superiores a los del triptólido libre. Tal como se muestra en la tabla II, todos estos derivados de éster mostraron baja toxicidad, y una toxicidad mucho menor que el triptólido libre, medido mediante el ensayo de MTT (ejemplo 13).

C. Supervivencia de un aloinjerto cardiaco

El tratamiento del rechazo de un trasplante, según la invención, se ilustra para el rechazo de un aloinjerto mediante el modelo de trasplante de corazón in vivo utilizado en el ejemplo 14. El método supone un sistema de modelo de rata bien caracterizado (Ono y Lindsey, 1969), en el que se une un corazón trasplantado a los grandes vasos abdominales de un animal receptor alogénico y se evalúa la viabilidad del corazón trasplantado mediante la capacidad del corazón para latir en el animal receptor.

En un estudio, a los animales se les administró mediante inyecciones intraperitoneales, desde un día antes hasta 14 días tras el trasplante de corazón, o bien disolución control (etanol al 5%, 10 ml/kg), triptólido (designado como T10) o bien dos concentraciones de cada uno de YM-273 e YM-274. Había tres animales en cada grupo, excepto en el grupo control en el que se utilizaron cinco animales. Los resultados se muestran en las figuras 5A y 5B.

Tal como puede observarse a partir de la figura 5A, YM-273 a un nivel de dosificación de 0,1 mg/kg (círculos en blanco) dio un tiempo medio de supervivencia de 7 días, similar a los resultados obtenidos con el grupo control. Sin embargo, una dosificación de 0,4 mg/kg (círculos rellenos) mostró una mejora sustancial sobre el control, con un tiempo medio de supervivencia de 24 días.

Con referencia a la figura 5B, YM-274 administrado a un nivel de dosificación de 0,0837 mg/kg (triángulos en blanco) dio un tiempo medio de supervivencia de 10 días, mientras que una dosificación de 0,33 mg/kg (triángulos rellenos) mostró un tiempo medio de supervivencia de aproximadamente 50 días.

La figura 6 compara el efecto inmunosupresor de las dosis superiores de YM-273 e YM-274, descritas anteriormente, con dosis equivalentes (en cuanto a moles) de triptólido (T-10). Tal como puede observarse, el tiempo medio de supervivencia obtenido tras la administración de los derivados de succinato YM-273 (sal tris) fue algo mejor que el observado con el triptólido no derivatizado y fue sustancialmente mejor (50 \pm 7 días) en el caso del derivado de succinato YM-274 (sal sódica).

Los resultados anteriores indican que los compuestos de éster solubles en agua de la invención tienen actividad inmunosupresora significativa in vivo. Tal como se describe en la sección III, anteriormente, el succinato de triptólido se hidrolizó en suero sanguíneo para dar triptólido en un plazo de aproximadamente 15 minutos. Es probable que los compuestos de la invención actúen como profármacos, porque los grupos éster se escinden in vivo para producir el compuesto de triptólido no derivatizado, más activo.

D. Inhibición de la fertilidad masculina

Los compuestos de la invención también son eficaces en la reducción o inhibición de la fertilidad masculina, en la que la administración de un compuesto de la invención a un mamífero macho es eficaz para reducir la potencia de su semen masculino, reduciendo o bloqueando así la fertilización. Se probó el succinato de triptólido (YM-262) para determinar la inhibición de la fertilidad en ratones BDF1 macho, según los protocolos descritos en el ejemplo 15. El compuesto se administró por vía intraperitoneal (IP) en una solución salina, utilizando un ciclo de administración diaria durante 5 días seguido por un cese de dos días del tratamiento. Los niveles de dosis fueron de 0,04 o 0,13 mg/kg/día. El ciclo se repitió durante 5 semanas antes de la evaluación de los efectos fisiológicos (peso de los testículos) y función reproductora.

Tal como se muestra en la figura 7, la administración de 0,13 mg/kg/día de YM-262, según el programa anterior, produjo una reducción en el peso de los testículos de aproximadamente el 13% en comparación con el grupo control tratado con solución salina.

Se probó el efecto del compuesto sobre la fertilidad con grupos de cinco ratones macho tratados según el mismo programa. Cada macho se alojó con dos hembras comenzando el día 32, tras la finalización del tratamiento con YM-262.

En la figura 8, se muestra el tiempo desde el comienzo de la cohabitación hasta el nacimiento de una camada. El grupo tratado con solución salina (control) produjo la primera camada tras una media de 24 días, cuatro días más tarde que el periodo de gestación esperado (aproximadamente de 20 días), como se encontró para el grupo control de solución salina. El valor para el grupo que recibió YM-262 a 0,04 mg/kg/día fue de 28 días (un retraso del 17%), lo que indica un periodo de aproximadamente 4 días de apareamiento improductivo. Para el grupo que recibió YM-262 a 0,13 mg/kg/día, el tiempo desde la cohabitación hasta el nacimiento fue de 45 días, un aumento del 88% en el tiempo de gestación comparado con el grupo control.

Estos resultados indican que el tratamiento con YM-262 durante un periodo de 32 días retrasó la recuperación de la fertilidad, tras la finalización del tratamiento, de 21 días. Además, el efecto anticonceptivo fue reversible, puesto que el cese de la administración del fármaco estuvo seguido por gestaciones satisfactorias. Se apreciará que pueden conseguirse periodos más prolongados de esterilidad masculina mediante la administración continuada de compuestos de triptólido según la presente invención. Los compuestos pueden administrarse con otros agentes anticonceptivos para efectos mejorados.

V. Composiciones terapéuticas

Las formulaciones que contienen los análogos de triptólido de la invención pueden tomar la forma de formas de dosificación sólidas, semisólidas, de polvo liofilizado o líquidas, tales como por ejemplo, comprimidos, píldoras, cápsulas, polvos, formulaciones de liberación sostenida, disoluciones, suspensiones, emulsiones, supositorios, enemas de retención, cremas, pomadas, lociones, aerosoles o similares, preferiblemente en formas de dosis unitarias adecuadas para la sencilla administración de dosis precisas.

Las composiciones incluyen normalmente un vehículo o excipiente farmacéutico convencional y pueden incluir adicionalmente otros agentes medicinales, vehículos, adyuvantes y similares. Preferiblemente, la composición será aproximadamente del 0,5% al 75% en peso de un compuesto o compuestos de la invención, consistiendo el resto en excipientes farmacéuticos adecuados. Para la administración oral, tales excipientes incluyen calidades farmacéuticas de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, talco, celulosa, glucosa, gelatina, sacarosa, carbonato de magnesio y similares. Si se desea, la composición también puede contener cantidades minoritarias de sustancias auxiliares no tóxicas tales como agentes humectantes, agentes emulsionantes o tampones.

Las composiciones líquidas pueden prepararse disolviendo o dispersando el análogo de triptólido (aproximadamente del 0,5% a aproximadamente el 20%) y adyuvantes farmacéuticos opcionales, en un vehículo, tal como por ejemplo, solución salina acuosa, dextrosa acuosa, glicerol o etanol, para formar una disolución o suspensión.

La composición puede administrarse a un sujeto por vía oral, transdérmica o parenteral, por ejemplo, mediante inyección intravenosa, subcutánea, intraperitoneal o intramuscular. Para su uso en la preparación líquida oral, la composición puede prepararse como una disolución, suspensión, emulsión o jarabe, suministrándose en forma líquida o una forma secada adecuada para su hidratación con agua o solución salina normal. Para la administración parenteral, una composición inyectable para la administración parenteral contendrá normalmente el análogo de triptólido en una disolución intravenosa adecuada, tal como solución salina fisiológica estéril. Cuando la composición se emplea en la forma de preparaciones sólidas para la administración oral, las preparaciones pueden ser comprimidos, gránulos, polvos, cápsulas o similares. En una formulación en comprimidos, la composición se formula normalmente con aditivos, por ejemplo, un excipiente tal como una preparación de sacárido o celulosa, un aglutinante tal como pasta de almidón o metilcelulosa, una carga, un disgregante y otros aditivos utilizados típica y normalmente en la fabricación de preparaciones médicas.

La alta solubilidad en agua de los compuestos de la invención los hace particularmente ventajosos para administrarlos en disolución acuosa, por ejemplo, mediante inyección intraperitoneal. Los estudios de disolución realizados en apoyo de la presente invención han mostrado que los compuestos de la presente invención se disuelven rápidamente en disolución acuosa, cuando los compuestos se preparan en forma de polvo. Por tanto, los compuestos son particularmente adecuados para las formulaciones de comprimido o cápsula. La composición o medicamentos según la invención también pueden formularse como una suspensión en un lípido (por ejemplo, un triglicérido o aceite de ricino polietoxilado tal como "CREMOPHOR EL") o un fosfolípido, en una suspensión liposomal, o en una emulsión acuosa.

El compuesto también puede administrarse por inhalación, en la forma de partículas de aerosol, o bien sólidas o bien líquidas, preferiblemente de tamaño respirable. Tales partículas son lo suficientemente pequeñas para atravesar la boca y la laringe tras la inhalación y llegar al interior de los bronquios y alveolos de los pulmones. En general, las partículas que oscilan desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 10 micras de tamaño y preferiblemente inferiores a 5 micras de tamaño, son respirables.

Las composiciones que contienen partículas secas respirables de principio activo micronizado pueden prepararse moliendo el principio activo seco y haciendo pasar la composición micronizada a través de un tamiz de 400 de malla para romper o separar los aglomerados grandes. La forma de material particulado sólido del principio activo puede contener un dispersante para facilitar la formación de un aerosol. Un dispersante adecuado es la lactosa, que puede mezclarse con el principio activo en cualquier razón adecuada (por ejemplo, una razón en peso de 1:1).

Puede utilizarse cualquier generador de aerosoles para medicamentos particulados sólidos para administrar las partículas sólidas. Tales generadores, tales como el nebulizador DeVilbiss (DeVilbiss Co., Somerset, Pa.), producen partículas que son respirables, tal como se explicó anteriormente, y generan un volumen de aerosol que contiene una dosis medida predeterminada de un medicamento en una razón adecuada para la administración humana. Las composiciones líquidas para inhalación comprenden el principio activo disperso en un vehículo acuoso, tal como solución salina estéril libre de pirógenos o agua estéril libre de pirógenos. Si se desea, la composición puede mezclarse con un propelente para ayudar a la pulverización de la composición y la formación de un aerosol.

Se conocen métodos para preparar tales formas farmacéuticas o serán evidentes para los expertos en la técnica; por ejemplo, véase Remington's Pharmaceutical Sciences (1980). La composición que va a administrarse contendrá una cantidad del compuesto seleccionado en una cantidad farmacéuticamente eficaz para realizar la inmunosupresión, o la reducción de la fertilidad, en un sujeto.

V. Método de tratamiento

Las composiciones de la presente invención pueden utilizarse en un tratamiento de inmunosupresión, en particular, un tratamiento para tratar una enfermedad autoinmunitaria, la enfermedad de injerto contra huésped (EICH) o el rechazo de un trasplante, particularmente el rechazo de un aloinjerto o el rechazo de un xenoinjerto. Las composiciones también son útiles para inhibir la fertilidad masculina, para el tratamiento de las formas tanto intrínsecas como extrínsecas de asma y para el tratamiento de otros estados inflamatorios, tales como la inflamación traumática.

La tabla III de a continuación facilita una lista de enfermedades autoinmunitarias que son apropiadas para la inmunoterapia.

TABLA III

Enfermedades autoinmunitarias
Enfermedad	Tejido afectado
Enfermedad de Addison	suprarrenal
Alergias	células inflamatorias
Asma	bronquios
Aterosclerosis	paredes de los vasos
Enfermedad de Crohn	intestino

TABLA III (continuación)

Enfermedad	Tejido afectado
Diabetes (tipo 1)	páncreas
Enfermedad de Graves	tiroides
Síndrome de Guillain-Barré	células nerviosas
Enfermedad inflamatoria del intestino	intestino
Lupus eritematoso sistémico	múltiples tejidos
Esclerosis múltiple	células nerviosas
Miastenia grave	unión neuromuscular
Psoriasis	piel
Cirrosis biliar primaria	hígado
Artritis reumatoide	revestimiento de la articulación
Uveítis	ojo

Al tratar un estado autoinmunitario, al paciente se le administra la composición de manera periódica, por ejemplo, 1 - 2 veces a la semana a un nivel de dosificación suficiente para reducir los síntomas y mejorar la comodidad del paciente.

Para tratar la artritis reumatoide, la composición puede administrarse mediante inyección intravenosa o mediante inyección directa en la articulación afectada. El paciente puede tratarse a intervalos repetidos de al menos 24 horas, durante un periodo de varias semanas tras la aparición de los síntomas de la enfermedad en un paciente.

Para el tratamiento del lupus eritematoso sistémico (LES), como otro ejemplo, la composición puede administrarse mediante administración oral o parenteral, tal como administración intravenosa (IV).

La dosis que se administra está preferiblemente en el intervalo de 1 a 25 mg/kg de peso corporal del paciente por día, prefiriéndose cantidades inferiores para la administración parenteral, y prefiriéndose cantidades superiores para la administración oral. Las dosificaciones óptimas pueden determinarse mediante la experimentación de rutina según métodos conocidos en la técnica.

Para el tratamiento en el rechazo de trasplantes, tal como el rechazo de un aloinjerto o un xenoinjerto, el método se destina particularmente para el tratamiento del rechazo de trasplantes de corazón, riñón, hígado, celulares y de médula ósea. El método puede utilizarse también en el tratamiento de la enfermedad de injerto contra huésped (EICH), en la que las células inmunitarias trasplantadas atacan al huésped alogénico. El tratamiento inicial se administra de manera perioperatoria. Además, la composición puede administrarse como un tratamiento prolongado de múltiples dosis para prevenir el rechazo de un injerto o para tratar episodios agudos de rechazo tardío del injerto. Como anteriormente, la dosis administrada es preferiblemente de 1 a 25 mg/kg de peso corporal del paciente por día, prefiriéndose cantidades inferiores para la administración parenteral, y prefiriéndose cantidades superiores para la administración oral. La dosis puede aumentarse o disminuirse de manera apropiada, dependiendo de la respuesta del paciente, y durante el periodo de tratamiento, de la capacidad del paciente para resistir la infección.

El tratamiento se inicia normalmente de manera perioperatoria, justo antes o justo después del procedimiento de trasplante quirúrgico y se continúa con una pauta posológica diaria, durante un periodo de al menos varias semanas, para el tratamiento del rechazo agudo de un trasplante. Durante el periodo de tratamiento, el paciente puede someterse a prueba periódicamente para determinar el nivel de inmunosupresión, por ejemplo, mediante una reacción mixta de linfocitos en la que participan linfocitos alogénicos, o realizando una biopsia del tejido trasplantado.

En otro aspecto, para tratamientos inmunosupresores tal como se trató anteriormente, la invención incluye un método de supresión del rechazo de un aloinjerto, el rechazo de un xenoinjerto o la enfermedad de injerto contra huésped en un sujeto huésped, en el que se administra un compuesto de la presente invención simultáneamente con otro fármaco inmunosupresor. El método incluye administrar al sujeto, un fármaco inmunosupresor tal como ciclosporina A, FK506, azatioprina, rapamicina, ácido micofenólico o un glucocorticoide, en una cantidad que sea sustancialmente inferior a la dosis necesaria para conseguir la supresión eficaz del rechazo de un aloinjerto, cuando el compuesto se administra solo. Se administra un potenciador, que comprende un análogo de triptólido de fórmula 1, tal como se describió anteriormente, en una cantidad eficaz para suprimir el rechazo de un aloinjerto, el rechazo de un xenoinjerto o EICH en el huésped, cuando se administra en combinación con el compuesto inmunosupresor. Por "una cantidad que sea sustancialmente inferior a la dosis necesaria para conseguir la supresión del rechazo de un aloinjerto (o rechazo de un xenoinjerto o rechazo debido a EICH), cuando el compuesto se administra solo" se quiere significar una cantidad de fármaco inmunosupresor que sea inferior al 50%, y preferiblemente inferior al 33% de la cantidad que se administraría, si se utilizara sin un análogo de triptólido de la invención. El rechazo de aloinjerto o xenoinjerto se "suprime eficazmente" o "suprime" en un huésped si el tiempo de supervivencia del trasplante o injerto en el huésped se extiende en un periodo estadísticamente significativo sobre el tiempo de supervivencia en el huésped en ausencia de tratamiento inmunosupresor. Normalmente, una supresión eficaz del rechazo de un injerto es un periodo de al menos o más semanas, y puede ser de hasta varios meses o más. Alternativamente, el compuesto de triptólido ("potenciador") y el fármaco inmunosupresor se administran en cantidades tales que la inmunosupresión resultante sea superior a la que se esperaría o a la que se obtendría de la suma de los efectos obtenidos con el fármaco inmunosupresor y el compuesto de triptólido utilizados solos.

El fármaco inmunosupresor y el potenciador pueden administrarse ambos a intervalos regulares durante un periodo de tiempo de al menos 2 semanas y pueden administrarse por vía oral o por vía parenteral. La cantidad de fármaco inmunosupresor administrada está normalmente entre aproximadamente el 20% y el 100% de la cantidad de fármaco necesaria para suprimir el rechazo en el huésped.

En el método de tratamiento inmunosupresor potenciado de la invención, puede administrarse un análogo de triptólido de la fórmula 1 anterior con un fármaco inmunosupresor, juntos en la misma formulación, o por separado en formulaciones distintas. Cuando se utilizan formulaciones distintas, el análogo o compuesto de triptólido y el fármaco inmunosupresor pueden administrarse por vías diferentes.

El fármaco inmunosupresor que se administra con el análogo de triptólido es preferiblemente uno de los siguientes:

(a)

Ciclosporina A o ciclosporina C ("ciclosporina"), un oligopéptido cíclico apolar;

(b)

FK506, un inmunosupresor de macrólido fúngico;

(c)

azatioprina, o 6-[(1-metil-4-nitro-1H-imidazol-5-il)tio]1H-purina;

(d)

metotrexato;

(e)

rapamicina, un inmunosupresor de macrólido fúngico;

(f)

ácido micofenólico, o ácido 6-(1,3-dihidro-4-hidroxi-6-metoxi-7-metil-3-oxi-5-isobenzofuranil)-4-metil-4- hexanoico; y

(g)

un glucocorticoide inmunosupresor, tal como prednisona o dexametasona.

Las proporciones de los dos componentes (análogo de triptólido y fármaco inmunosupresor) están preferiblemente en el intervalo de 1:50 a 50:1 en peso. El compuesto de triptólido es preferiblemente ciclosporina A, administrada en una cantidad inferior a 1/3 de la dosis supresora habitual.

Para la inhibición de la fertilidad masculina, el compuesto puede administrarse mediante inyección intraperitoneal (IP) o intravenosa o, preferiblemente, mediante administración oral, a una dosificación y frecuencia eficaces para reducir o bloquear la fertilidad del sujeto. La dosis útil varía en función de la vía de administración. Para sujetos humanos, la dosis variará, por ejemplo, desde 0,1 hasta 15 mg/kg por día en un sujeto adulto, cuando se administra por vía oral.

En el tratamiento del asma, se prefieren generalmente la administración intranasal (gotas o spray), la inhalación de un aerosol a través de la boca o la administración oral convencional. El principio activo puede aplicarse también al epitelio respiratorio nasal como un medicamento líquido aplicado tópicamente. Si el paciente es incapaz de tragar, o la absorción oral está asimismo afectada, la vía de administración sistémica preferida será la parenteral, intranasal o tópica.

Los compuestos de la invención también pueden administrarse a un individuo tras la aparición de asma, para reducir la dificultad para respirar, o pueden administrarse profilácticamente, es decir, antes de que comience el broncoespasmo en un ataque de asma, para prevenir o minimizar su aparición.

Los siguientes ejemplos pretenden ilustrar, pero en ningún caso limitar, la invención.

Ejemplo 1 Succinato de triptólido (YM-262)

Se trató triptólido (100 mg) en 10 ml de piridina con anhídrido succínico (150 mg) a temperatura ambiente. La reacción se llevó a cabo a 85ºC durante 30 horas bajo una atmósfera de nitrógeno. Se añadió hexano (50 ml) a la mezcla resultante para precipitar un producto bruto, que se recogió por filtración y se lavó con hexano. El producto bruto se recristalizó en éter/hexano para producir 90 mg (70%) de succinato de triptólido (YM-262), p.f. 111-
113ºC.

IR(KBr): 3431,8, 2974,6, 1743,8, 1375,5, 1159,4, 1022,4 cm^{-1}. ^{1}H-RMN (CDCl_{3}): 5,08 (1H, s, 14-CH), 4,67 (2H, s, 19-CH_{2}), 3,82 (1H, d, 11-CH), 3,50 (1H, d, 12-CH), 3,43 (1H, d, 7-CH), 2,75 (5H, m, CH_{2}CH_{2}, 5-CH), 2,30 (1H, d-m, 15-CH), 2,15 (2H, m, 6-CH_{a}, 2- CH_{a}), 1,88 (2H, m, 2-CH_{b}, 6-CH_{b}B), 1,55 (1H, m, 1-CH_{b}), 1,20 (1H, m, 1-CH_{a}), 1,05 (3H, s, 20-CH_{3}), 0,95 (3H, d, 16-CH_{3}), 0,83 (3H, d, 17-CH_{3}) ppm. EM (m/z): 461 (M+ 1).

Ejemplo 2 Sal tris del succinato de triptólido (YM-273)

Se mezcló succinato de triptólido (20 mg) con tris(hidroximetil)aminometano (5,3 mg) en 20 ml de agua y se agitó durante una hora. Se filtró la disolución y se liofilizó el filtrado para producir 24 mg (96%) de polvo blanco.

IR(KBr): 3391, 2937,96, 1745,80, 1562,9, 1411,67, 1159, 1066,57, 1024,57 cm^{-1}. ^{1}H-RMN (D_{6}-DMSO, ppm): 5,00 (1H, s, 14-CH), 4,85 (2H, d, 19-CH_{2}), 3,95 (1H, d, 11-CH), 3,70 (1H, d, 12-CH), 3,55 (1H, d, 7-CH), 3,30 (6H, s, 3CH_{2}O), 2,65 (1H, m, 5H), 2,45 (2H, m, CH_{2}), 2,20 (3H, m, CH_{2}, 15-CH), 1,90 (4H, m, 6-CH_{2}, 2-CH_{2}), 1,34 (2H, a, 1-CH_{2}), 0,95 (3H, s, 20-CH_{3}), 0,88 (3H, d, 16-CH_{3}), 0,75 (3H, d, 17-CH_{3}).

Ejemplo 3 Sal sódica del succinato de triptólido (YM-274)

Se mezcló succinato de triptólido (20 mg) con bicarbonato de sodio (3,65 mg) en 20 ml de agua y se agitó durante 30 min. La disolución acuosa se filtró y se liofilizó el filtrado para producir 20 mg (95%) de polvo blanco.

IR(KBr): 3431,8, 2975,56, 1743,87, 1577,97, 1419,79, 1163,22, 1022,40 cm^{-1}. ^{1}H-RMN (D6-DMSO, ppm): 5,00 (1H, s, 14-CH), 4,85 (2H, d, 19-CH_{2}), 3,95 (1H, d, 11-CH), 3,70 (1H, d, 12-CH), 3,55 (1H, d, 7-CH), 2,58 (1H, m, 5H), 2,45 (2H, m, CH_{2}), 2,20 (3H, m, CH_{2}, 15-CH), 1,90 (4H, m, 6-CH_{2}, 2-CH_{2}), 1,34 (2H, a, 1-CH_{2}), 0,95 (3H, s, 20-CH_{3}), 0,88 (3H, d, 16-CH_{3}), 0,75 (3H, d, 17-CH_{3}).

Ejemplo 4 Sal de lisina del succinato de triptólido (YM-276)

Se agitó succinato de triptólido (20 mg) mezclado con L-(+)-lisina (6,3 mg) en 20 ml de agua, durante una hora. La disolución se filtró y se liofilizó el filtrado para producir 25 mg (95%) polvo blanco.

IR(KBr): 3431,8, 2934,0, 1743,9, 1560,6, 1399,9, 1147,6, 1018,6 cm^{-1}. ^{1}H-RMN (D_{6}-DMSO, ppm): 5,00 (1H, s, 14-CH), 4,85 (2H,d,19-CH_{2}), 3,95 (1H,d,11-CH), 3,78 (1H, d, 12-CH), 3,55 (1H, d, 7-CH), 3,50 (6H, a, 2NH_{3}), 3,15 (1H, m, -CH), 2,70 (1H, m, 5H), 2,65 (1H, m, CH_{2}), 2,4 (2H, m, CH_{2}), 2,20 (3H, m, CH_{2}, 15-CH), 1,90 (4H, m, 6-CH_{2}, 2-CH_{2}), 1,40 (6H, m, CH_{2}CH_{2}CH_{2}), 1,34 (2H, a, 1-CH_{2}), 0,95 (3H, s, 20-CH_{3}), 0,88 (3H, d, 16-CH_{3}), 0,75 (3H, d, 17-CH_{3}) ppm.

Ejemplo 5 Síntesis del éster de 14-N,N-dimetilglicinato de triptólido

En un matraz de fondo redondo de 100 ml seco, se pone 1 eq. de triptólido y 2 eq. de cada uno de N,N-dimetilglicina y DCC (diciclohexilcarbodiimida). El matraz se pone bajo una atmósfera de nitrógeno, y se añade CH_{2}Cl_{2} anhidro (secado sobre P_{2}O_{5}), seguido por una cantidad catalítica de DMAP (4-dimetilaminopiridina). La disolución se agita durante la noche a temperatura ambiente. La reacción se trata finalmente eliminando por filtración la diciclohexilurea, eliminando el disolvente por evaporación y sometiendo a cromatografía el sólido obtenido, sobre gel de sílice.

Ejemplo 6 Síntesis de la sal de ácido metanosulfónico del éster de 14-N,N-dimetilglicinato de triptólido

En un matraz de fondo redondo seco, se pone 1 eq. del éster de 14-N,N-dimetilglicinato de triptólido, preparado en el ejemplo 5. El compuesto se disuelve en CH_{2}Cl_{2} anhidro (destilado de P_{2}O_{5}), y a la disolución resultante se le añade 1 eq. de una disolución madre de ácido metanosulfónico en dietil éter. El disolvente se elimina inmediatamente para producir un sólido blanco.

Ejemplo 7 Síntesis de la sal de ácido clorhídrico del éster de 14-(3-(N,N-dimetilamino)propionato) de triptólido

En un matraz de fondo redondo de 100 ml seco, se pone 1 eq. de triptólido y 2 eq. de cada uno de ácido N,N-dimetilaminopropiónico y DCC (diciclohexilcarbodiimida). El matraz se pone bajo una atmósfera de nitrógeno, y se añade CH_{2}Cl_{2} anhidro (secado sobre P_{2}O_{5}), seguido por una cantidad catalítica de DMAP (4-dimetilaminopiridina). La disolución se agita durante la noche a temperatura ambiente. Se elimina por filtración la diciclohexilurea, y se elimina el disolvente por evaporación. El producto bruto se somete entonces a cromatografía sobre gel de sílice.

Ejemplo 8 Síntesis de la sal de ácido clorhídrico del éster de 14-(4'-(N-pirrolidino)butirato) de triptólido

En un matraz de fondo redondo seco, se pone 1 eq. de triptólido, 2 eq. de la sal de ácido clorhídrico del ácido 4-pirrolidinobutírico, y CH_{2}Cl_{2} anhidro (destilado de P_{2}O_{5}). La disolución resultante se pone bajo una atmósfera de nitrógeno, y se añaden 2 eq. de DCC y una cantidad catalítica de DMAP. La disolución se agita durante la noche a temperatura ambiente. La reacción se trata finalmente eliminando por filtración la diciclohexilurea, eliminando el disolvente por evaporación y sometiendo a cromatografía el sólido obtenido, sobre gel de sílice.

Ejemplo 9 Síntesis del éster de bis-N,N-dimetilglicinato de 16-hidroxitriptólido

El compuesto del título se sintetiza mediante la reacción de 1 eq. de 16-hidroxitriptólido, 3 eq. de N,N-dimetilglicina, 3,3 eq. de DCC, y 0,16 eq. de DMAP en CH_{2}Cl_{2} anhidro, seguido por el tratamiento final descrito en el ejemplo anterior.

El éster de bis-N,N-dimetilglicinato en las posiciones 2 y 14 de triptólido se prepara de una manera similar a partir de tripdiólido (2-hidroxitriptólido).

Ejemplo 10 Estabilidad de succinato de triptólido (YM-262) A. Estabilidad en agua

Se preparó una disolución de succinato sódico de triptólido (YM-274) en D_{2}O a una concentración de 3 mg/ml y se guardó a temperatura ambiente. La disolución se analizó mediante ^{1}H-RMN a intervalos de 1, 3, 5, 15, 45, 90, 180 minutos; 1, 7, 14 días; y 1, 2, 3, y 5 meses. No hubo un cambio apreciable en el espectro de RMN durante los tres primeros meses. Fue evidente cierta descomposición después de 5 meses.

B. Estabilidad en suero sanguíneo

Se preparó una disolución de succinato de triptólido (ácido libre; YM-262) en DMSO a una concentración de 25 mg/ml, y se mezcló 0,1 ml de esta disolución con 0,5 ml de suero de rata. Se incubó la mezcla a 37ºC. Se tomaron alícuotas de la muestra a 1, 3, 5, 15, 45 minutos y 18 horas y se analizaron mediante cromatografía en capa fina (CCF). Se desarrollaron las placas de CCF en CH_{2}Cl_{2}/Et_{2}O 1:5. Tras el desarrollo, se trataron las placas con vapor de yodo y se examinaron bajo una lámpara UV. Se utilizaron triptólido y succinato de triptólido como compuestos de referencia (R_{f} = 0,60 y 0,45, respectivamente). Después de 3 minutos, sólo se detecto el succinato de triptólido mediante CCF. Tras 15 minutos, había desaparecido la mancha succinato de triptólido (R_{f} = 0,45), y apareció una nueva mancha correspondiente a triptólido (R_{f} = 0,60). Tras 45 minutos, también desapareció la mancha de triptólido, y sólo quedó material de bajo R_{f} (componentes del suero sanguíneo y productos de descomposi-
ción).

Ejemplo 11 Inhibición de la acción de IL-1 sobre timocitos murinos

Se prepararon timocitos de ratón C3H/HeN y se midió la acción de IL-1 junto con FHA, que estimulan la proliferación de timocitos, mediante técnicas habituales (O'Gara, 1990; Mishell, 1980). Se sacrificaron ratones macho C3H/HeN de tres a seis semanas (Simonson Laboratory, Gilroy, CA) mediante inhalación de CO_{2}. Se extirparon los timos, se separaron del tejido no tímico adherente, se homogeneizaron en solución salina equilibrada de Hank (HBSS, Gibco) utilizando un homogeneizador de vidrio y se centrifugaron a 200 X g, durante 10 minutos, a 15ºC. Tras un lavado adicional en HBSS, se resuspendieron los timocitos en medio RPMI 1640 que contenía 2-mercaptoetanol 50 \muM,
glutamina 2 mM, piruvato de sodio 1 mM, aminoácidos no esenciales, penicilina 100 U/ml, estreptomicina 100 \mug/ml y 10% de suero bovino fetal inactivado por calor.

Se cultivaron las células en placas de cultivo tisular, de microtitulación de 96 pocillos de fondo redondo, 6 X 10^{5} células/pocillo, en un volumen de 100 \mul. Se añadieron IL-1\beta recombinante humana (R & D Systems nº 201-LB) junto con fitohemaglutinina P (FHA, Pharmacia) a las células en un volumen de 25 \mul por pocillo, para obtener una concentración final de 0,08 ng/ml y 10 \mug/ml, respectivamente. Se disolvieron muestras en DMSO (10 mg/ml), luego se diluyeron con medio de cultivo. Se añadieron veinticinco microlitros de la muestra de prueba a cada pocillo para obtener las concentraciones de compuesto finales para cada experimento. Las células con FHA junto con IL-1 sirvieron como controles. El volumen total de cada pocillo fue de 150 \mul.

Las placas se incubaron a 37ºC en un incubador con 5% de CO_{2} durante 72 horas. Se añadieron cincuenta microlitros de medio de cultivo que contenía 0,5 \muCi de (^{3}H)-timidina (Amersham, 49 Ci/mmol) a cada pocillo antes de las últimas 18 horas de incubación. Se recogieron y contaron las células. Los resultados se notifican como cuentas por minuto (cpm) por 6 X 10^{5} células.

Se utilizó la fórmula siguiente para calcular el porcentaje de supresión de la actividad de IL-1 y se utilizó la CI_{50} (concentración de muestra que produce una supresión del 50% de la proliferación) para indicar la actividad supresora de la muestra.

% supresión de l actividad de IL-1 = (1 - cpm de la muestra/(cpm de IL-1 + control de FHA) X 100

Los resultados se muestran en la tabla I anterior.

Ejemplo 12 Ensayo de la reacción mixta de linfocitos (MLR)

En este estudio, las células que responden (R) fueron células de bazo de ratones C57BL/6 hembra y las células estimuladoras (S) fueron células de bazo de ratones Balb/C hembra de 6 a 8 semanas de edad (Jackson, Bar Harbor, Maine). Se extirparon asépticamente los bazos de los ratones y se pusieron en 10 ml de HBSS frío en una placa Petri estéril. El bazo se cortó por la mitad y se presionó suavemente entre los extremos helados de 2 portaobjetos estériles. La suspensión celular se filtró entonces a través de una malla de nylon estéril (Nytex, Tetco nºHD-3-85) en un tubo de centrífuga de polipropileno cónico y se centrifugó a 200 x g, durante 10 minutos en una centrífuga de mesa (rotor GH-3.7). Tras un lavado adicional con HBSS, se resuspendieron las células de bazo en medio RPMI 1640 que contenía 2-mercaptoetanol 50 \muM, glutamina 2 mM, penicilina 100 U/ml, estreptomicina 100 \mug/ml y 10% de suero bovino fetal inactivado por calor.

Se diluyeron las células estimuladoras (S) y parte de las células que responden (R) a 10 X 10^{6} células/ml y se irradiaron a 20 cGy con un irradiador de cesio (Departamento de Oncología y Radiación, Universidad de Standford, CA) para inhibir la proliferación. Las células irradiadas se lavaron una vez para eliminar cualquier radical libre tóxico y sus productos que resultan de la irradiación. Las células que responden (R), las células estimuladoras irradiadas (Sx) y las células que responden irradiadas (Rx) se diluyeron todas hasta 4 X 10^{6} células/ml.

En el ensayo, se cocultivaron 4 X 10^{5} células de R con 4 X 10^{5} células de Sx en 200 \mul de medio, en placas de cultivo tisular, de 96 pocillos de fondo redondo. Se añadieron cincuenta microlitros de las muestras de prueba, a diversas concentraciones, a las células. Los pocillos que no recibieron muestras de prueba conseguirán la proliferación máxima. Se utilizaron varios controles en el ensayo. Las células que responden irradiadas (Rx) también se añadieron a las células que responden con y sin las muestras de prueba. Se comprobaron Rx o Sx solas para asegurarse de que no se producía proliferación tras la irradiación. También se midió la proliferación espontánea de R.

Se incubaron las placas de cultivo a 37ºC, en un incubador con 5% de CO_{2}, durante cuatro días. Las células se marcaron con 1 \muCi de (^{3}H)-timidina (Amersham, 49 Ci/mmol) en 20 \mul de medio, durante las últimas 18 horas. Entonces, se recogieron y contaron las células. Los resultados se notifican como cuentas por minuto (cpm) por pocillo. Se utilizó el porcentaje de supresión y la CI_{50} (concentración de muestra que produce una supresión del 50% de la proliferación) para indicar la actividad supresora de la muestra. Las cpm de la muestra se calcularon como cpm(R + Sx + muestra) - cpm(R + Rx + muestra); las cpm control se calcularon como cpm(R + Sx) - cpm(R + Rx). Se calculó el porcentaje de supresión de la actividad de MLR como (1 - cpm de la muestra/cpm del control) X 100. Se determinó la CI_{50} a partir de la supresión en porcentaje para indicar la actividad supresora de la muestra. Los resultados se muestran en la tabla II anterior.

Ejemplo 13 Evaluación de la citotoxicidad

Se evaluó la citotoxicidad potencial de las muestras de prueba con la medición de su efecto sobre la reducción de MTT (bromuro de 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazolio) por las células cultivadas. MTT, un compuesto de color amarillo, se reduce mediante las enzimas mitocondriales para formar el producto de reacción cristalino morado, formazano, proporcionando un índice de respiración celular en las células viables y un ensayo sensible para la citotoxicidad (Mossmann, 1983).

Se evaluó la citotoxicidad en CMSP (células mononucleares de sangre periférica) humanas y timocitos de ratón cultivados. Se preparó una disolución madre de MTT (Sigma) a 5 mg/ml en solución salina tamponada con fosfato, pH 7,4, y se guardó en la oscuridad a 4ºC. Se cultivaron las CMSP o los timocitos con diversas concentraciones de las muestras de prueba en placas de cultivo tisular, de 96 pocillos de fondo plano (Costar) en las mismas condiciones que las descritas anteriormente, pero los estimulantes (X-35 o IL-1 + FHA) se sustituyeron por un medio apropiado. Se utilizaron células no tratadas con medio solo y sin las muestras de prueba, como controles. Tras incubación durante 21 horas, se añadieron 25 \mul de disolución de MTT a cada pocillo. Tras tres horas adicionales de incubación, se terminó el experimento mediante la adición de una disolución de dodecilsulfato de sodio al 10% en HCl 0,01 N. Tras la incubación durante la noche a 37ºC para solubilizar los cristales de formazano, se determinó la densidad óptica a 570 - 650 nm en un lector de microplacas. Se utilizó la siguiente fórmula para calcular el % de toxicidad:

% de toxicidad = (1 - DO de la muestra/DO del control) X 100

Las muestras se definieron como citotóxicas cuando la toxicidad fue superior al 25% en el sistema de ensayo utilizado. Los resultados se muestran en las tablas I y II anteriores.

Ejemplo 14 Tratamiento del rechazo de trasplante de corazón

Se realizó un trasplante heterotópico de corazón completo según el método habitual (Ono y Lindsey, 1969). Los donantes (ratas Brown Norway, 200 - 255 g, Charles River, Wilmington, MA) y los receptores (ratas Lewis macho adultas, 225 - 275 g, Charles River) se anestesiaron con pentobarbital sódico (40 mg/kg). Tras la anticoagulación adecuada del donante utilizando heparina, se extirpó el injerto de corazón y se guardó a 4ºC en solución de irrigación PhysioSol (Abbott Laboratories, N. Chicago, IL). Se realizó una transección de la aorta ascendente y la arteria pulmonar y se ligaron la vena cava y las venas pulmonares. Se dejaron al descubierto la aorta abdominal y la vena cava inferior del receptor mediante una incisión abdominal media. Se realizó una anastomosis término-lateral de la aorta y la arteria pulmonar del corazón del donante a la aorta abdominal infrarrenal y la vena cava inferior del receptor, respectivamente, con sutura continua de nylon monofilamento de 8-0 (Ethilon, Inc., Somerville, NJ). Debido a las propiedades funcionales de la válvula aórtica, la sangre no entró en el ventrículo izquierdo sino que en su lugar fluyó a través de las arterias coronarias hasta la aurícula derecha, la arteria pulmonar y la vena cava del receptor. El tiempo de isquemia en frío de todos los injertos cardiacos fue inferior a los 45 minutos. Se monitorizó el latido cardiaco del injerto mediante palpación abdominal. Se midió el periodo de supervivencia funcional del injerto como el número de días durante los cuales pudieron detectarse contracciones del injerto cardiaco mediante palpación abdominal. Los resultados se confirmaron mediante visualización directa con laparotomía.

Los animales receptores del trasplante de corazón preparados tal como se describió anteriormente (3 - 5 animales/grupo) se trataron con (i) disolución control (etanol al 5%, 10 ml/kg), (ii) YM-273 a 0,10 mg/kg y 0,40 mg/kg (figura 5A), (iii) YM-274 a 0,084 y 0,33 mg/kg (figura 5B) y (iv) T10 (triptólido) 0,25 mg/kg (figura 6). Además de mostrar los resultados para T10, la figura 6 repite los resultados de las figuras 5A-5B para YM-273 e YM-274 a 0,40 y 0,33 mg/kg, respectivamente, de tal manera que sus concentraciones fueron equimolares con respecto a T10. Todos los compuestos se administraron por vía intraperitoneal. El tratamiento comenzó el día antes de la cirugía y continuó diariamente hasta el día 14 posoperatorio, o hasta el fin de la supervivencia de un injerto. Los resultados se muestran en las figuras 5A-5B y 6.

Ejemplo 15 Efecto del succinato de triptólido sobre la fertilidad en ratones macho

Se probó el succinato de triptólido (YM-262) para determinar el control de la fertilidad en ratones BDF1 macho, utilizando un ciclo de administración diaria durante 5 días, seguido por un cese de dos días del tratamiento. El ciclo se repitió durante cinco semanas, con dosificación en los días 0 - 4, 7 - 11, 14 - 18, 21 - 25 y 28 - 32 antes de la evaluación de los efectos fisiológicos y la función reproductora.

Se preparó una disolución de dosificación de YM-262 una vez a la semana a partir de una disolución madre en solución salina a 1,0 mg/ml y se guardó a 4ºC. Se trató a los ratones por vía intraperitoneal (IP) con el vehículo de solución salina o con YM-262 a 0,04 ó 0,13 mg/kg/día, en solución salina, utilizando una jeringa de 1 ml de plástico desechable, estéril y una aguja hipodérmica estéril de calibre 25 ó 26. Se administró el compuesto en un volumen correspondiente a 0,1 ml por 10 g de peso corporal del ratón.

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A. Efecto sobre el peso de los testículos

En el día 32, se sacrificaron cinco de los seis ratones de cada grupo de dosificación y se extirparon los testículos y guardaron en formalina para el análisis histológico y la determinación del peso. Se calculó el promedio para ambos testículos para cada ratón y se determinaron la media y el error estándar de la media (E.E.). Estos datos se muestran en la figura 7.

En comparación con el grupo control tratado con solución salina, se observó una disminución moderada (aproximadamente del 13%) en el peso de los testículos con los ratones que recibieron 0,1 mg/kg/día de YM-262.

B. Efecto sobre la fertilidad

Se probó la fertilidad con cinco ratones macho adicionales en cada grupo de tratamiento. Se alojaron los machos con dos hembras por macho en el día 32, momento tras el cual no se les administraron tratamientos adicionales con YM-262. Se sacó la primera hembra en cada jaula que tuvo una camada, a una jaula separada con su camada, y la hembra restante se alojó con el macho. Todos los ratones macho engendraron una camada con ambas hembras con las que cohabitaron. Se enumeraron las crías en cuanto a la fecha de nacimiento, sexo y color del pelaje.

Se evaluó el tiempo desde el inicio de la cohabitación hasta el nacimiento de las camadas y se muestra en la figura 8. De nuevo, se muestran la media y el error estándar de la media (E.E.). El grupo tratado con solución salina (control) produjo la primera camada tras una media de 24 días. El valor para el grupo que recibió YM-262 a 0,03 mg/kg/día fue de 28 días, un retraso del 17%. Sin embargo, el tiempo desde la cohabitación hasta el nacimiento fue de 45 días para el grupo que recibió YM-262 a 0,1 mg/kg/día, un aumento del 88% comparado con el grupo control.

Estos resultados indican que el tratamiento con YM-262 a 0,1 mg/kg/día durante un periodo de 32 días retrasó la recuperación de la fertilidad, tras la finalización del tratamiento en 21 días. Además, el control de la fertilidad fue reversible, y se espera que el tratamiento continuado mantenga este control de la fertilidad demostrado.

Aunque esta invención se ha descrito con referencia a métodos y realizaciones específicos, se apreciará que pueden realizarse diversas modificaciones sin apartarse de la invención.

Claims (18)

1. Compuesto que tiene la estructura:

3

en la que

X^{1} es OH u OR^{1}, y X^{2} y X^{3} son independientemente OH, OR^{1} o H, con la condición de que al menos uno de X^{1}, X^{2} y X^{3} sea OR^{1}, y al menos uno de X^{2} y X^{3} sea H; y

R^{1} es -C(O)-Y-Z, en el que

Y es una cadena de alquilo o alquenilo C_{1}-C_{4} ramificado o no ramificado; y

Z es COOH o COOR^{2}, NR^{3}R^{3'} o +NR^{4}R^{4'}R^{4''}, en los que

R^{2} es un catión;

R^{3} y R^{3'} son independientemente H o alquilo C_{1}-C_{6} ramificado o no ramificado, hidroxialquilo o alcoxialquilo, o R^{3} y R^{3'} tomados juntos forman un anillo heterocíclico de 5 a 7 miembros, cuyos átomos de anillo se seleccionan del grupo que consiste en carbono, nitrógeno, oxígeno y azufre, en el que los átomos de anillo incluyen de 2 a 6 átomos de carbono, uno o más átomos de nitrógeno y opcionalmente uno o más átomos de oxígeno o azufre, y en el que el anillo no está sustituido o está sustituido con uno o más grupos seleccionados de R^{5}, OR^{5}, NR^{5}R^{6}, SR^{5}, NO_{2}, CN, C(O)R^{5}, C(O)NR^{5}R^{6}, OC(O)R^{5}, OC(O)NR^{5}R^{6}, y halógeno, en los que R^{5} y R^{6} son independientemente hidrógeno, alquilo inferior o alquenilo inferior; y

R^{4}, R^{4'} y R^{4''} son independientemente alquilo C_{1}-C_{6} ramificado o no ramificado, hidroxialquilo o alcoxialquilo.

2. Compuesto según la reivindicación 1, en el que X^{2} = X^{3} = H.

3. Compuesto según la reivindicación 1, en el que X^{2} o X^{3} = H.

4. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que Z es COOH.

5. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que Z es COOR^{2} y R^{2} es un ion metálico o una amina orgánica.

6. Compuesto según la reivindicación 5, en el que el ion metálico es Na^{+} o K^{+}.

7. Compuesto según la reivindicación 5, en el que la amina orgánica es lisina, trietilamina o tris(hidroximetil)-aminoetano.

8. Compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que Z es NR^{3}R^{3'} y R^{3} y R^{3'} son independientemente H o alquilo C_{1}-C_{6} ramificado o no ramificado.

9. Compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que Z es NR^{3}R^{3'} en forma protonada o +NR^{4}R^{4'}R^{4''}, y dicho compuesto incluye un contraión aniónico.

10. Compuesto según la reivindicación 9, en el que el contraión aniónico es cloruro o bromuro o contiene un ion carboxilato, un ion sulfonato o un ion sulfato o es acetato, oxalato, maleato, fumarato, metanosulfonato o toluenosulfonato.

11. Compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que Y es una cadena de alquilo C_{1}-C_{4}, y Z es COOR^{2} o dimetilamino o N-morfolino.

12. Compuesto según la reivindicación 11, en el que R^{2} es Na^{+} o tris(hidroximetil)aminometano o lisina.

13. Composición farmacéutica que comprende un compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en un vehículo farmacéuticamente aceptable.

14. Composición farmacéutica según la reivindicación 13, en el que el vehículo es un excipiente acuoso.

15. Uso de un compuesto según una cualquiera de las reivindicaciones 1-12, para la preparación de una composición farmacéutica para realizar inmunosupresión, reducir la fertilidad de un mamífero macho o tratar el asma.

16. Uso según la reivindicación 15, en el que dicha inmunosupresión comprende la inhibición del rechazo de un trasplante, la inhibición de la enfermedad de injerto contra huésped o el tratamiento de una enfermedad autoinmunitaria.

17. Uso según la reivindicación 16, en el que dicha enfermedad autoinmunitaria es artritis reumatoide.

18. Uso según la reivindicación 15, en el que la composición farmacéutica para tratar asma es para su administración a través de inhalación.