ES2242230T3 - Inhibidores de elastana marcados. - Google Patents
Inhibidores de elastana marcados.Info
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Abstract
INHIBIDOR DE ELASTASA DE LEUCOCITOS HUMANOS (HLE) MARCADO MEDIANTE UNA FRACCION DE DETECCION, QUE ES SINTETICA Y TIENE UN PESO MOLECULAR INFERIOR A 2.000. DICHO INHIBIDOR ES UTIL PARA LA FORMACION DE IMAGENES DE DIAGNOSTICO DE LUGARES DE INFLAMACION O DE INFECCION IN VIVO, PARA MARCAR LEUCOCITOS IN VITRO O PARA LA RADIOTERAPIA DE LA ARTRITIS. DICHO INHIBIDOR DE HLE ES PREFERENTEMENTE UNA BE - LACTAMA O UNA ACETIDINONA.
Description
Inhibidores de elastasa marcados.
La presente invención se refiere a una clase de
compuestos útiles para el diagnóstico o radioterapia de infección,
inflamación o trombos, a formulaciones farmacéuticas que los
contienen, a su uso en el diagnóstico de enfermedades y a métodos
para su preparación.
El diagnóstico por imagen de la infección o
inflamación en la práctica clínica típicamente usa el citrato de
^{67}Ga radiofarmacéutico, o células sanguíneas blancas
(leucocitos) radiomarcadas, ya que se sabe que los leucocitos se
acumulan en sitios de infección/inflamación. ^{111}In o ^{99m}Tc
son los radioisótopos usados normalmente para marcar los
leucocitos.
Los leucocitos marcados se han convertido en el
método elegido en la práctica clínica habitual para el diagnóstico
por imagen de sitios de infección/inflamación. Con las
características favorables de formación de imágenes del ^{99m}Tc,
la especificidad de los leucocitos marcados y el buen aclaramiento
del fondo, este enfoque conduce por sí mismo al diagnóstico de
lesiones intestinales tales como enfermedad inflamatoria intestinal
o apendicitis. Dichas enfermedades no pueden diagnosticarse con
agentes no específicos debido a los altos niveles de fondo del
intestino. El problema con el enfoque de leucocitos marcados ex
vivo es que los agentes actuales usados para marcar células no
son específicos. Esto significa que los leucocitos tienen que
separarse en primer lugar del exceso de células rojas sanguíneas en
la sangre extraída al paciente del que se quieren tomar las
imágenes. La separación de las células es una operación muy
trabajosa que necesita un operador experto para conseguir la
separación eficaz sin comprometer la integridad de la célula.
También está el peligro intrínseco asociado con la manipulación de
muestras de sangre. Ha habido, por lo tanto, un interés considerable
en el campo del desarrollo de un agente que podría usarse para crear
imágenes de sitios de infección que no necesitan esta onerosa
separación de células antes de marcarlas y administrarlas al
paciente.
La elastasa de leucocito humano (HLE) es una
potente enzima endopeptidasa capaz de hidrolizar los enlaces amida
de diversas proteínas y péptidos, incluyendo las proteínas
estructurales elastina, colágeno y fibronectina [R. L. Stein et
al, Ann. Rep. Med. Chem., 20, 237 (1985); P. D. Edwards y
P. R. Bernstein, Med. Chem. Rev., 14, 127 (1994)]. En los
sitios de infección o inflamación los leucocitos activados liberan
HLE y provoca la destrucción del tejido. También se sabe que los
leucocitos se acumulan en trombos y que la elastasa se libera
durante la coagulación de la sangre. Se ha demostrado que la
elastasa liberada es importante en la fibrinogenolisis [E. F. Plow,
J. Clin. Invest., 69, 564-572 (1982)].
El documento EP 0595557 A1 (Merck) describe que
los siguientes compuestos son útiles como inhibidores de HLE para el
tratamiento de patologías inflamatorias tales como enfisema o
artritis reumatoides:
en la
que:
R es alquilo C_{1-6};
R^{1} es alquilo C_{1-6} o
alcoxi C_{1-6}-alquilo
C_{1-6};
M es H, alquilo C_{1-6},
hidroxialquilo, alcoxialquilo, haloalquilo o alquenilo
C_{2-6};
Ra y Rb son H, Hal, OH, Ph, COOH o alquilo
C_{1-6}, alcoxi o éster;
R^{2} y R^{3} son H, Hal, COOH, Ph, OH, CN,
amino, alquilo C_{1-6}, alcoxi o éster, o
amida
R^{4} es amida o éster con un grupo espaciador
alquilo opcional.
Los inhibidores de HLE radiomarcados se han
estudiado poco. Moser et al. [Am. J. Med., 84 (Suppl.
6A), 70 (1988)] informan que la
\alpha_{1}-antitripsina marcada con ^{131}I
persiste en el pulmón humano hasta una semana después de la
inyección con poca o ninguna captación en el hígado o en el bazo. El
documento no analiza, sin embargo, las aplicaciones potenciales de
\alpha_{1}-antitripsina radiomarcada. Se ha
usado un inhibidor de HLE sintético marcado con tritio para estudiar
la farmacocinética del inhibidor de HLE en ratas y monos [J. B.
Doherty et al, Proc. Acad. Sci. USA, 90,
8727-31 (1993)]. Se ha preparado un inhibidor de HLE
sintético marcado con ^{13}C para estudiar la interacción del
inhibidor con HLE in vitro [B. G. Green et al,
Biochem. 34, 14331-14355 (1995)]. Ninguna de
las publicaciones describe el uso de inhibidores de HLE marcados
para diagnóstico por imagen de infección, inflamación o trombos ni
^{3}H o ^{13}C son restos de marcaje adecuados para diagnóstico
por imágenes externo. Rusckowski et al [J. Nucl. Med.,
resumen P667 (1996)] informan sobre un inhibidor de HLE proteico
modificado genéticamente llamado
EPI-hNE-2 (peso molecular 6759) que
puede radiomarcarse con ^{99m}Tc mediante un quelato bifuncional.
La proteína radiomarcada se presenta como que muestra algo de
captación en un modelo de infección de ratón.
EPI-hNE-2 es un oligopéptido y puede
sufrir los mismos problemas inmunogénicos que Fab' o fragmentos
mayores de anticuerpos. Además, el tamaño de la molécula limita la
migración a través de las membranas celulares (por ejemplo, las de
granulocitos), por lo que el HLE intracelular no sería una diana
usando este enfoque.
Blaszczak et al [J. Lab. Composición.
Radiopharm., 27, 401-406 (1989)] han descrito
la preparación de penicilina V radiomarcada con ^{125}I (es decir,
una \beta-lactama bicíclica) para usar en el
ensayo in vitro de la proteína de unión a penicilina. El
documento no sugiere aplicaciones de formación de imágenes in
vivo y el ^{125}I no sería un radioisótopo preferido para
formación de imágenes externas.
Ahora se ha descubierto que los inhibidores de
HLE sintéticos marcados son útiles en la detección de sitios de
infección o inflamación. El uso de un producto sintético en
contraposición a un inhibidor proteico o polipeptídico tiene las
ventajas significativas de que la naturaleza química del agente
puede definirse totalmente, y se evitan las preocupaciones
potenciales sobre inmunogenicidad. Además, la posición de la
etiqueta se conoce de manera no ambigua, y a diferencia de los
péptidos quimiotácticos o interleuquinas, no es necesario que el
inhibidor de elastasa marcado tenga una actividad específica muy
alta porque hay un exceso de elastasa presente tanto en el interior
de los granulocitos como en los sitios de infección/inflamación. Los
inhibidores de HLE marcados también son útiles en la detección de
trombos.
Por lo tanto, la presente invención se refiere a
agentes de diagnóstico para la detección de sitios de infección o
inflamación o trombos en el cuerpo humano. Los agentes comprenden un
inhibidor de elastasa de leucocito humano (HLE) que tiene un peso
molecular menor de 2000 Dalton y que se marca con un resto
detectable adecuado para formación de imágenes externas (por
ejemplo, por escintigrafía o MRI), tales como un radionúclido o un
ión de metal paramagnético. El agente actúa dirigiendo HLE hacia el
interior de los leucocitos (in vivo o in vitro), o
hacia sitios de liberación de HLE tales como sitios de infección,
inflamación o trombos. Se ha demostrado que los inhibidores de HLE
radiomarcados marcan selectivamente granulocitos humanos in
vitro y que se dirigen a sitios de infección/inflamación in
vivo en un modelo de animal de esta patología.
El "resto detectable" es una sustancia
adecuada para formación de imágenes externas después de
administración a seres humanos tal como un radionúclido que emite
radiación que puede penetran el tejido blando; un resto
paramagnético como agente de contraste para MRI (por ejemplo,
ciertos iones metálicos tales como gadolinio (III) o manganeso
(III); un resto radioopaco tal como lopamidol para formación de
imágenes por contraste con rayos X (tomografía asistida por
ordenador) o un agente de contraste de ultrasonidos.
Preferiblemente, el resto detectable es un radionúclido que es tanto
un emisor de positrones (tal como ^{18}F, ^{11}C, ^{15}O,
^{13}N, ^{68}Ga o ^{64}Cu) o un emisor \gamma tal como
^{123}I, ^{99m}Tc, ^{111}In, ^{113m}In o ^{67}Ga. Los
radionúclidos más preferidos son los emisores \gamma,
especialmente ^{123}I y ^{99m}Tc. ^{3}H y ^{14}C no tienen
emisiones radiactivas adecuadas para formación de imágenes externas
y, por lo tanto, están fuera del alcance de la presente invención.
Se prevé también que ciertos radionúclidos confieran propiedades
radioterapéuticas útiles a los inhibidores de HLE marcados. Así, por
ejemplo, podrían usarse inhibidores de HLE marcados con ^{90}Y,
^{89}Sr, ^{186}Re, ^{125}I o ^{131}I en el tratamiento de
artritis reumatoide y otras infecciones/inflamaciones óseas. En
dichas aplicaciones el efecto terapéutico se debería a la dosis
radiactiva diana local suministrada a células específicas, en
contraposición a cualquier efecto terapéutico debido al inhibidor.
Sea cual sea el resto detectable elegido, se prefiere en gran medida
que esté unido al inhibidor de HLE sintético de manera que no
experimente un metabolismo superficial en la sangre (in vivo
o in vitro) con el resultado de que la biodistribución del
resto detectable no refleja por más tiempo la del inhibidor de
HLE.
Los datos presentados en este documento
demuestran que los inhibidores de HLE sintéticos radiomarcados
ofrecen un método nuevo y conveniente para dirigirse a sitios de
infección/inflamación o trombosis. Se cree que el mecanismo implica
la unión de la HLE presente en el interior de granulocitos
circulantes en la corriente sanguínea (que después se concentra en
el sitio de la patología), o la unión a HLE libre, extracelular en
los sitios de la patología. Dicho compuesto de formación de imágenes
para infección/inflamación inyectable directamente ofrece ventajas
significativas sobre los productos radiofarmacéuticos existentes y
propuestos. La especificidad para HLE significa que los agentes
deberían ser capaces, como en los leucocitos marcados ex
vivo, de crear imágenes de lesiones asociadas con la
infiltración de leucocitos tales como apendicitis o enfermedad
inflamatoria intestinal. El uso de una molécula sintética
relativamente pequeña significa que se evitan los problemas de
aclaramiento de fondo asociados con las macromoléculas, y que los
sustituyentes pueden variar fácilmente de una forma controlada para
ajusta la lipofilicidad, unión a proteínas del plasma y tasa de
aclaramiento.
Las siguientes clases de inhibidores de HLE
sintéticos con un peso molecular de menos de 2000 son adecuadas para
la presente invención:
\bullet Péptidos de cadena corta
(3-5 mer) y análogos de péptidos (por ejemplo
péptidos trifluoroacetilo), inhibidores hidrófobos (por ejemplo,
elasnina y análogos sintéticos).
\bullet Inhibidores contra la histidina del
sitio activo (por ejemplo, péptidos clorometil cetonas).
\bullet Inhibidores covalentes (por ejemplo,
péptidos aldehídos, péptidos cetonas, halometilcetonas, péptidos de
ácidos borónicos) y agentes acilantes (sulfonil fluoruros,
aminoalquil fosfono fluoridatos, ésteres de nitrofenil azapéptidos,
carbamatos activados e isocianatos latentes,
benzoxazin-4-onas,
3-alcoxil-4-cloroisocurarinas,
anhídridos isatoicos, acil sacarinas).
\bullet Inhibidores basados en el mecanismo
(por ejemplo, cloropironas y cloroisocuraminas,
7-amino-4-cloroisocumacinas,
inenol lactonas y \beta-lactamas).
Los inhibidores preferidos para su uso en la
presente invención son los inhibidores basados en el mecanismo,
especialmente \beta-lactamas que pueden ser
monocíclicas (por ejemplo, azetidinonas) o tener más de un anillo
condensado (tales como análogos de penicilinas, cefalosporinas o
ácido clavulánico) e ilenol lactonas. Las más preferidas son
\beta-lactamas, especialmente
\beta-lactamas monocíclicas (es decir,
azetidinonas).
Las \beta-lactamas preferidas
tiene la fórmula:
en la
que
R^{1} es R^{8}, XR^{8},
(CRR)_{n}(C=X)R^{8} o
(C=X)NR^{8}_{2}
X es O u S
n es 0-3
R^{8} es H, OH, un anillo carbocíclico o
heterocíclico C_{3-12}sustituido o no sustituido
que puede ser saturado o insaturado, alquilo
C_{1-10}, arilo C_{3-12},
alquilarilo C_{4-12}, alquenilo
C_{2-10}, alquinilo C_{2-10},
alcoxi C_{1-10}, alcoxialquilo
C_{1-10}, hidroxialquilo
C_{1-10}, aminoalquilo C_{1-10},
perfluoroalquilo C_{1-10}, haloalquilo
C_{1-10}, carboxialquilo
C_{1-10}, amidoalquilo C_{1-10}
o cetoalquilo C_{1-10}.
R^{2}, R^{3} son el mismo o diferente y cada
un H, alquilo C_{1-4}, alquenilo
C_{2-4}, alquinilo C_{2-4},
alcoxialquilo C_{1-4}, hidroxialquilo
C_{1-4}, aminoalquilo C_{1-4},
perfluoroalquilo C_{1-4}, haloalquilo
C_{1-4}, Hal, carboxialquilo
C_{1-4}, OR, SR,
NRR(CH_{2})_{n}CONRR, NR(CO)R o
(CH_{2})_{n}CO_{2}R.
R^{4} es un grupo saliente elegido entre Hal,
XR^{8}, X(C=X)R^{8}, OSOR^{8}, OSO_{2}R^{8}
OSO_{2}Hal, SOR^{8}SO_{2}R^{8}, SO_{2}NR^{8}_{2}
NRSO_{2}R, (C=X)R^{8}, (C=X)NR^{8}_{2},
(C=X)R^{8}, NO_{2}, CN, PO_{n}R^{8}_{2} o
XC_{6}H_{4-n}Y_{n}.
Y es el mismo o diferente y es R, NO_{2}, Hal,
CONR^{8}_{2}, SO_{2}NR^{8}_{2} o CO_{2}R.
R^{5} es R o R^{4}
R es el mismo o diferente y es H, alquilo
C_{1-4}, alquenilo C_{2-4},
alquinilo C_{2-4}, alcoxi
C_{1-4}, alcoxialquilo C_{1-4},
hidroxialquilo C_{1-4}, aminoalquilo
C_{1-4}, perfluoroalquilo
C_{1-4}, haloalquilo C_{1-4} o
carboxialquilo C_{1-4}.
en el que dos o más de los grupos R^{1},
R^{2}, R^{3}, R^{4} y R^{5} puede combinarse para forman un
anillo carbocíclico o heterocarbocíclico sustituido o no sustituido
que puede estar saturado o insaturado.
caracterizado porque la
\beta-lactama contiene al menos, o está
covalentemente unido al mismo, un resto detectable y con la
condición de que cuando R^{4} sea XR^{8}, X sea S, y R^{1} y
R^{4} se combinen para formar un grupo carboxialquilo cíclico, en
el que el resto detectable no es ^{125}I.
Las azetidinonas preferidas tiene la fórmula:
en la
que
R^{1} es R^{8}, XR^{8},
(CRR)_{n}(C=X)R^{8} o
(C=X)NR^{8}_{2}
X es O u S
n es 0-3
R^{8} es H, OH, un anillo carbocíclico o
heterocíclico C_{3-12}sustituido o no sustituido
que puede estar saturado o insaturado, alquilo
C_{1-10}, arilo C_{3-12},
alquilarilo C_{4-12}, alquenilo
C_{2-10}, alquinilo C_{2-10},
alcoxi C_{1-10}, alcoxialquilo
C_{1-10}, hidroxialquilo
C_{1-10}, aminoalquilo C_{1-10},
perfluoroalquilo C_{1-10}, haloalquilo
C_{1-10}, carboxialquilo
C_{1-10}, amidoalquilo C_{1-10}
o cetoalquilo C_{1-10}.
R^{2}, R^{3} son el mismo o diferente y cada
uno es H, alquilo C_{1-4}, alquenilo
C_{2-4}, alquinilo C_{2-4},
alcoxialquilo C_{1-4}, hidroxialquilo
C_{1-4}, aminoalquilo C_{1-4},
perfluoroalquilo C_{1-4}, haloalquilo
C_{1-4}, Hal, carboxialquilo
C_{1-4}, OR, SR,
NRR(CH_{2})_{n}CONRR, NR(CO)R o
(CH_{2})_{n}CO_{2}R.
R^{4} es un grupo saliente elegido entre Hal,
XR^{8}, X(C=X)R^{8}, OSOR^{8}, OSO_{2}R^{8}
OSO_{2}Hal, SOR^{8}SO_{2}R^{8}, SO_{2}NR^{8}_{2}
NRSO_{2}R, (C=X)R^{8}, (C=X)NR^{8}_{2},
(C=X)R^{8}, NO_{2}, CN, PO_{n}R^{8}_{2} o
XC_{6}H_{4-n}Y_{n}.
Y es el mismo o diferente y es R, NO_{2}, Hal,
CONR^{8}_{2}, SO_{2}NR^{8}_{2} o CO_{2}R.
R^{5} es R o R^{4}
R es el mismo o diferente y es H, alquilo
C_{1-4}, alquenilo C_{2-4},
alquinilo C_{2-4}, alcoxi
C_{1-4}, alcoxialquilo C_{1-4},
hidroxialquilo C_{1-4}, aminoalquilo
C_{1-4}, perfluoroalquilo
C_{1-4}, haloalquilo C_{1-4} o
carboxialquilo C_{1-4}.
caracterizado porque la azetidinona contiene la
menos, o está unida covalentemente al mismo, un resto
detectable.
Se prefiere menos la unión del resto detectable a
la posición R^{4} ya que se cree que la
\beta-lactama pierde este grupo como consecuencia
de la unión covalente al sitio activo de la enzima elastasa. Los
grupos R^{2} y R^{3} de la \beta-lactama son
responsables de la unión al sitio S_{1} de la enzima, y evidencias
publicadas sugieren que estos grupos necesitan ser relativamente
pequeños (por ejemplo, el tamaño de un resto etilo). De ahí que es
más que probable que sólo un intervalo limitado de restos
detectables puedan unirse con éxito a las posiciones
R^{2}/R^{3}. El resto detectado, por lo tanto, se une más
preferiblemente a la posición R^{1} de la
\beta-lactama o azetidinona.
Los grupos R^{1} preferidos son aquellos de
fórmula:
donde R^{6} es un grupo alquilo o
fenilo opcionalmente sustituido al que está unido el resto
detectable y R^{7} es H o un grupo alquilo
C_{1-6}.
Cuando el resto detectable es un metal radiactivo
o paramagnético, el metal siempre está quelado, es decir, se usan un
conjugado quelato-inhibidor HLE. No son parte de la
presente invención complejos metálicos del inhibidor HLE sólo (es
decir, inhibidores HLE sin al menos un sustituyente diseñado para
coordinarse con átomos de metal). El término conjugado
quelato-HLE cubre las situaciones en las que el
agente quelante se une a una entidad química específica (es decir,
como un simple sustituyente del inhibidor HLE) y cuando dos o mas
átomos donadores de metales se unen como sustituyentes en distintas
posiciones de la molécula de HLE. El conjugado
quelato-inhibidor de HLE está complejado con iones
metálicos (tales como tecnecio, gadolinio o itrio) dando un complejo
metálico del agente quelante que se une con el inhibidor sintético
de HLE. El agente quelante preferiblemente es polidentado y/o
macrocíclico de modo que se forma un complejo metálico estable que
puede aguantar el desafío de competir con ligandos endógenos por el
metal in vivo tales como transferrina o proteínas del plasma.
Cuando la diana es HLE intracelular, el complejo metálico es
preferiblemente neutro ya que esto facilita el transporte del
conjugado del inhibidor marcado a través de las membranas celulares
tales como las de los granulocitos. Cuando la diana es la HLE
extracelular liberada en los sitios de infección/inflamación o en
trombos entonces la permeabilidad de la membrana es de menor
importancia y puede ser deseable un complejo metálico cargado para
facilitar el aclaramiento del fondo. El complejo metálico también
puede ser preferiblemente de baja lipofilicidad (ya que a menudo la
alta lipofilicidad se relaciona con captación no específica) y
muestra una baja actividad de unión a proteínas del plasma (PPB)
puesto que una vez más el marcaje unido al plasma contribuye a un
alto fondo no específico en la sangre no deseado para el agente de
imagen.
Ejemplos de agentes quelantes apropiados para
tecnecio son diaminodioximas (documento US 4615876) y donadores
amida que incorporan estos ligandos (documento WO 94/08949); los
ligandos tetradentados del documento WO 94/22816; diaminoditioles,
tetraaminas o ditiosemicarbazonas. Los complejos de tecnecio
estables también se forman con ligandos de aminas macrocíclicas o
amidas tales como ciclam, oxociclam (que forma un complejo neutro de
tecnecio) o dioxociclam. Los ligandos adecuados para indio, itrio y
gadolinio se describen en Sandoz WO 91/01144, los preferidos son
ligandos aminocarboxilato macrocíclico y ácido aminofosfónico. Se
conocen complejos metálicos no iónicos (es decir, neutros) de
gadolinio y se describen ejemplos en el documento US 4885363.
Cuando el resto detectable es un isótopos
radiactivo de yodo, el átomo de radioyodo preferiblemente se une
mediante un enlace covalente directo a un anillo aromático tal como
un anillo de benceno, o un grupo vinilo ya que se conoce que los
átomos de yodo unidos a sistemas alifáticos saturados tienden a
metabolizarse in vivo y, de ahí que pierdan el resto
detectable.
Los compuestos de la presente invención pueden
prepararse como sigue:
Cuando el resto detectable es yodo radiactivo, se
eligen los grupos R^{1-5} para incluir un átomo de
halógeno no radiactivo (para permitir el intercambio con el
radioyodo), un anillo arilo activado (por ejemplo, un grupo fenol) o
un compuesto precursor organometálico tal como una trialquiltina,
trialquilsililo u otro resto similar conocido por los especiales en
la técnica. A continuación se dan ejemplos de los grupos
R^{1-5}adecuados a los que puede unirse el yodo
radiactivo:
Ambos contienen sustituyentes que permiten una
fácil sustitución del radioyodo en el anillo aromático.
Sustituyentes alternativos que contiene yodo radiactivo puede
sintetizarse por yodación directa mediante intercambio de
radiohalógeno, por ejemplo.
Cuando el resto detectable es un ión metálico
radiactivo o paramagnético, el metal preferiblemente se une como un
complejo metálico, es decir, se une un agente quelante al inhibidor
de HLE sintético dando un conjugado
quelato-inhibidor de HLE. Estos conjugados
quelato-inhibidor de HLE pueden prepararse usando el
enfoque del quelato bifuncional. De este modo, se conoce bien como
preparar agentes quelantes que tiene unidos a ellos un grupo
funcional ("quelatos bifuncionales"). Los grupos funcionales
que se han unido a agentes quelantes incluyen: amina, tiocianato,
maleimida y éster activo tal como
N-hidroxisuccinimida. Estos quelatos bifuncionales
pueden reaccionar con grupos funcionales adecuados en el inhibidor
de HLE para formar el conjugado deseado. En el documento 95/19187 se
dan ejemplos de conjugados quelato-amina para
ligandos diaminodioxima. En el caso particular de las
\beta-lactamas, puede unirse un agente quelante a
la posición R_{1} como sigue. Primer se convierte un conjugado
quelato-amina en un conjugado
quelato-isocianato usando fosgeno,
triclorometilcloroformato o similares. Opcionalmente, el agente
quelante puede estar protegido con grupos protectores conocidos por
los especialistas en la técnica. El conjugado resultante
quelato-NCO (isocianato) puede entonces reaccionar
con la amina NH de una amina secundaria del anillo azetidinona dando
un agente quelante unido a R_{1} mediante un enlace urea. De forma
similar, puede convertirse un conjugado
quelato-amina en un agente quelante con un grupo
isotiocianato colgante (como por ejemplo se describe en los
documentos US 5006643 o WO 91/01144) y reaccionar después con una
azetidinona para dar un conjugado agente
quelante-azetidinona unido mediante un enlace
tiourea. De forma alternativa, la reacción de un conjugado
quelato-éster activo con la amina NH de un anillo de azetidinona
podría dar un conjugado quelato-azetidinona unido
mediante un enlace amida. Un enfoque adicional para un conjugado
unido por amida podría ser unir el grupo amina de un conjugado
quelato-amina con el grupo carboxilo colgante de una
azetidinona funcionalizada con carboxilo. Los especialistas en la
técnica reconocerán que son posibles muchas síntesis alternativas de
conjugados quelato-inhibidor de HLE en base a esta
descripción.
La presente invención también se refiere a kits
para la preparación de inhibidores sintéticos de HLE marcados con un
resto detectable. Los kits se diseñan para dar productos estériles
para su administración a humanos, por ejemplo, mediante inyección en
la corriente sanguínea. A continuación se describen posibles
realizaciones. Cuando el resto detectable es ^{99m}Tc, el kit
puede comprende un vial que contiene el conjugado
quelato-inhibidor de HLE junto con un agente
reductor farmacéuticamente aceptable tal como ditionito sódico,
bisulfito sódico, ácido ascórbico, ácido formamidina sulfónico, ión
estannoso, Fe(II) o Cu(I), preferiblemente un sal de
estaño tal como cloruro estannoso o tartrato estannoso. De forma
alternativa, el conjugado agente quelante-inhibidor
de HLE puede presentar como un complejo metálico que, tras la
adición del radiometal, sufre una transmetalación (es decir,
intercambio de ligando), dango el producto deseado. El kit
preferiblemente se liofiliza y se diseña para reconstituirse con
^{99m}Tc-pertecnetato (TcO_{4}^{-}) a partir
de un generador de radioisótopo ^{99m}Tc para dar una solución
adecuada para su administración en humanos sin manipulación
adicional.
Los agentes de la presente invención también
pueden proporcionar una forma de unidad de dosis lista para su
inyección en humanos y puede, por ejemplo, suministrarse en una
jeringa estéril previamente rellena. Cuando el resto detectable es
un isótopo radiactivo tal como 99mTc, la jeringa que contiene la
unidad de dosis también podría suministrarse dentro de una jeringa
protegida (para proteger al operador de una dosis potencialmente
radiactiva).
Los kits anteriores o las jeringas previamente
rellenas opcionalmente pueden contener ingredientes adicionales
tales como tampones; solubilizadores farmacéuticamente aceptables
(por ejemplo, ciclodextrinas o tensioactivos tales como Pluronic,
Tween o fosfolípidos); estabilizados/antioxidantes farmacéuticamente
aceptables (tales como ácido ascórbico, ácido gentísico o ácido
para-aminobenzoico) o agentes de volumen para
liofilización (tales como cloruro sódico o manitol).
Las estructuras de los compuestos
1-52 en particular se presentan a continuación. La
preparación de estos compuestos se describe en los ejemplos 1 a 12.
Los datos de RMN de los compuestos se dan en las tablas 1 a 19. Las
propiedades biológicas de los compuestos 4, 4a, 4b, 16, 17, 24, 28,
38, 42, 48, 49, 51 y 52 se muestran en los ejemplo 13 a 17 y en las
tablas 20 a 25.
\newpage
En un aspecto de la presente invención, se
requiere que el agente deseado marque selectivamente granulocitos
humanos en sangre completa (tanto in vitro como in
vivo). En sangre humana normal, los eritrocitos superar en
número a los granulocitos en un factor de al menos 100:1, pero los
eritrocitos no se acumulan en los sitios de infección/inflamación
por lo que los compuestos marcados han de mostrar una alta
selectividad por granulocitos. Estudios de captación de las células
de sangre humana in vitro de inhibidores de HLE
\beta-lactama marcados con ^{123}I o marcados
con ^{99m}Tc, han demostrado una captación selectiva en
granulocitos humanos (véase el ejemplo 14 y la tabla 23). La tabla
23 muestra que los todos compuestos 4, 4a, 4b, 16, 17, 24, 28, 38,
42, 48, 49, 51 y 52 manifiestan algún grado de selectividad por
granulocitos sobre una mezcla de monocitos/linfocitos cuando están
presentes aproximadamente números equivalentes de
monocitos/linfocitos y granulocitos. Puesto que los granulocitos
humanos contienen niveles significativos de HLE mientras que los
eritrocitos (células rojas de la sangre), monocitos y linfocitos
(subpoblaciones de la población de células blancas o leucocitos)
esencialmente no contiene HLE, esta selectividad es un fuerte
indicador de que está implicada la afinidad por HLE. Además, la
tabla 23 muestra que existe una correlación entre la potencia in
vitro (medida para los compuestos no marcados con yodo
radiactivo y para los conjugados de quelato no marcados, compuestos
38, 42, 48, 51 y 52) y la selectividad por granulocitos: La
implicación es que la retención en el granulocito se debe a la unión
a la elastasa intracelular. Los inhibidores sintéticos de HLE
preferidos de la presente invención son, por lo tanto, aquellos con
una potencia in vitro (K_{inact}/Ki) mayor de 10.000
M/s.
La sangre completa también contiene proteínas
plasmáticas que son capaces de unirse a un amplio intervalo de
sustancias y, por lo tanto, pueden competir de forma eficaz por el
compuesto una vez que éste se introduce en la sangre. Por lo tanto,
el agente preferido también ha de mostrar baja capacidad de unión a
proteínas del plasma (PPB). Los compuestos preferidos tiene una PPB
de menos del 95%. Más preferiblemente, tiene un PPB de menos del
60%. Puesto que los compuestos lipófilos son especialmente
susceptibles para unirse con proteínas del plasma no específicas,
los compuestos preferidos tiene un coeficiente de partición
octano/agua (LogP) \leq 2. Cuando la diana es HLE intracelular y,
por consiguiente, el agente ha de ser capaz de atravesar las
membranas de las células, se prefieren compuestos con un coeficiente
de partición octanol/agua (P) mínimo de 0,3. La tabla 23 demuestra
que, en la sangre humana completa, los compuestos 4, 16 y 24
muestran una captación equivalente en granulocitos y en eritrocitos.
Esto supone un factor selectivo para granulocitos con respecto a
eritrocitos de al menos 1000:1 y muestra que los compuestos de la
presente invención son capaces de marcar con éxito granulocitos en
la sangre humana completa a pesar de la competencia del exceso de
eritrocitos y de las proteínas plasmáticas. Se cree que la
selectividad superior por granulocitos del compuesto 4 puede deberse
a una combinación de la potencia de HLE y la unión reducida no
específica a las células rojas de la sangre o a las proteínas del
plasma. Se postula que el sustituyente amina facilita la retención
selectiva en granulocitos debido a la difusión en la célula del
inhibidor no cargado y su posterior atrapamiento mediante la
protonación de la amina piperazina básica en el medio más ácido de
los gránulos azurófilos del granulocito. El inhibidor protonado no
puede difundir fácilmente de vuelta a través de la membrana del
granulocito. Estos entornos más ácidos no se presentan en
eritrocitos, monocitos o linfocitos.
En virtud del sustituyente único de la posición 4
del anillo azetidinona, el compuesto 4 tiene un centro quiral. Se
han resuelto los enantiómeros (ejemplo 1, etapa F) y se ha
encontrado que uno (4a) muestra una potencia in vitro y
selectividad por granulocito notablemente superiores (tabla 23)
comparado con el otro (4b). De este modo, esta eficacia es altamente
sensible a los efectos estereoquímicos, es decir, a la quiralidad.
Por lo tanto, la presente invención también abarca a los compuestos
quirales.
Se han obtenido mejoras adicionales en la
potencia introduciendo sustituyentes alquilo en la posición R_{1}
del homo-quiral benzílico, demostrado por los
compuestos 24 y 28, ya que se conoce que éstos dan inhibidores de
HLE más potentes (documento EP 0595557 A1), por ejemplo:
También se han estudiado los inhibidores de HLE
\beta-lactama marcados radiactivamente de la
presente invención in vivo en un modelo de
inflamación/infección en rata. Los resultados de estos estudios se
dan en la tabla 24. Se demostró que el agente de
inflamación/infección ^{99m}Tc-HMPAO, del que se
sabe que marca leucocitos humanos ex vivo, se localizaba en
el sitio de la infección en el modelo usado. Se usaron células rojas
de la sangre marcados con ^{99m}Tc como agente control negativo de
comparación. Se pudo ver que los compuestos 4/4a marcados con
^{123}I mostraban una captación significativamente mejor en las
regiones infectadas que el control ^{99m}Tc-rbc, y
tenían características que recordaban más de cerca al agente de
infección de eficacia probada ^{99m}Tc-wbc.
Cuando el compuesto 4 marcado con ^{123}I se usa para marcar
leucocitos ex vivo, la proporción infectado/normal es mayor
que la obtenida por inyección directa. Se cree que las proporciones
de la diana con respecto al fondo obtenidas en el modelo de
infección/inflamación de rata ciertamente subestiman la situación en
humanos, ya que se conoce que la potencia de inhibidores
\beta-lactama similares para la elastasa de rata
es hasta 2 órdenes de magnitud menor que para la elastasa de
leucocitos
humana.
humana.
Se han realizado experimentos con coágulos de
plasma humano in vitro como se describe en el ejemplo 17. En
coágulos enriquecidos con granulocitos, a una concentración final de
10^{6}/ml, se dio un aumento en la captación de un potente
inhibidor de la elastasa de aproximadamente 7-9
veces, comparado con aquellos coágulos formados sin células
añadidas. Esta observación indica el potencial de los inhibidores de
HLE \beta-lactama para entran de forma específica
en los trombos y en otras lesiones donde hay un acúmulo activo de
granulocitos.
La tabla 25 compara la captación tiroidea de los
compuestos de radioyodo de la presente invención con la del ión
^{123}I-yodo libre. La falta de captación tiroidea
demuestra que los compuestos no experimentan desyodinación
metabólica in vivo. No hubo evidencias de la liberación de
pertecnetato en animales dosificados con inhibidores de HLE marcados
con ^{99m}Tc. Esto implica que el tecnecio no se libera in
vivo a partir del conjugado quelado.
| HLE = | elastasa de leucocito humano |
| PPB = | unión a proteínas plasmáticas |
| rbc = | células rojas sanguíneas |
| wbc = | células blancas sanguíneas |
| ACD = | citrato ácido de dextrosa |
| HBSS = | solución salina balanceada de Hanks |
| RCP = | pureza radioquímica |
| Me = | metilo |
| Et = | etilo |
| t-Bu = | butilo terciario |
| Ph = | fenilo |
| Bn = | bencilo |
| Ac = | acetilo |
| Ts = | tosilo, es decir, para-toluenosulfonilo |
| Ar = | arilo |
| DMF = | N,N-dimetilformamida |
| DMSO = | dimetilsulfóxido |
| THF = | tetrahidrofurano |
| LDA = | diisopropilamiduro de litio |
| PAA = | ácido peracético |
| TFA = | ácido trifluoroacético |
| BOC = | butoxicarbonilo terciario |
| HBTU = | hexafluorufosfato de O-(1H-benzotriazol-1-il)-N, N, N', N'-tetrametiluronio |
| DMAP = | 4-(N, N-dimetilamino)piridina |
| MCPBA = | ácido meta-cloroperbenzoico |
Etapa
A
A una solución de trifosgeno (1,27 g, 4,28
mmoles) en acetato de etilo a reflujo (20 ml) en una atmósfera de
nitrógeno, se le añadió una solución de
4-yodobencilamina (1,0 g, 4,29 mmoles) en
diclorometano (40 ml) gota a gota, durante 2 horas. La mezcla de
reacción de calentó a reflujo durante otras 3 horas, se filtró en
caliente y el filtrado se concentró a vacío para obtener el
compuesto del título (1,10 g, 99%) en forma de un aceite
amarillo.
Etapa
B
De acuerdo con el método de Shrenik et al
(J.Med.Chem., 35, 3745-3754 (1992)),
4-yodobencilisocianato (1,10 g, 4,25 mmoles) y
4-[4-[(1,1,-dimetiletoxi)carbonil]fenoxi-3,
3-dietil-2-azetidinona
(J.Med.Chem., 35, 3745-3754 (1992)) (0,62 g,
1,96 mmoles) daban, tras la purificación por cromatografía
ultrarrápida en columna (gradiente desde petróleo a EtOAc/petróleo,
1:3), el compuesto del título (0,72 g, 64%) en forma de un
sólido.
Etapa
C
De acuerdo con el método de Shrenik et al
(J.Med.Chem, 35 3745-3754 (1992)),
4-[4-[(1,1-dimetiletoxi)carbonil]fenoxi]-1-[(4-yodo)bencilaminocarbonil]-3,3-dietil-2-azetidinona
(0,72 g, 1,2, mmoles) daba, tras recristalización
(Et_{2}O/EtOAc), el compuesto del título (0,44 g, 68%) en forma de
un sólido.
Etapa
D
De acuerdo con el método de Doherty et al
(documento EP 0 595 557 A1),
4-[4-carboxi)fenoxi]-3,3-dietil-1-[4-yodo)bencilamino
carbonil]-2-azetidinona (0,44 g,
0,84 mmoles) daba, tras la purificación por cromatografía
ultrarrápida en columna (gradiente de EtOAc a MeOH/EtOAc, 1:4), el
compuesto del título (0,31 g, 79%) en forma de un aceite
amarillo.
Etapa
E
Se disolvió
4-[-4-[[(4-Metil)piperazin-1-il]carbonil]fenoxi]-1-[(4-yodo)bencilaminocarbonilo]-3,3-dietil-2-azetidinona
(0,02 g, 0,033 mmoles) en tolueno seco (5 ml) en una atmósfera de
argón y se calentó a reflujo. Se añadieron cantidades catalíticas de
Pd(PPh_{3})_{4} (20 mg) y
bis(tributil)tin (100 ml, 0,198 mmoles) y la mezcla
resultante se calentó a reflujo durante 5,5 horas. La mezcla de
reacción se enfrió hasta temperatura ambiente y se filtró a través
de un lecho de celite. El filtrado se concentró a vacío y el
producto se purificó por cromatografía ultrarrápida en columna
(MeOH/Et_{3}N/EtOAc, 10:1.89) para dar el compuesto del título (5
mg, 20%).
Etapa
F
El compuesto 4 se separó en sus dos enantiómeros,
4a y 4b, por HPLC quiral usando el sistema G para HPLC del ejemplo
12, produciendo el isómero 4a a partir de la fracción recogida entre
los 14 y 15 minutos y el isómero 4b entre los 18 y 19 minutos. Se
retiraron los disolventes a vacío y cada producto se extrajo del
residuo resultante en diclorometano (4 x 20 ml), se secó
(MgSO_{4}) y se concentró al vacío para dar cada enantiómero en
forma de un sólido. Ambos productos se analizaron de nuevo por HPLC
quiral. Se demostró que las purezas de los enantiómeros eran mayores
del 75%.
Etapa
G
Se añadió
4-[4-[[(4-Metil)piperazin-1-il]carbonil]fenoxi]-1-[[4-tri-(n-butil)estannil]bencilaminocarbonil]-3,3-dietil-2-azetidinona
en MeOH (50 \mug, 0,6 x 10^{-7} moles, 50 \mul) a tampón
acetato amónico (pH 4, 0,2 M, 200 \mul) en un vial Eppendorf de 1
ml, seguido de Na ^{127}I acuoso en NaOH 0,01 M (7,5 \mug, 0,5 x
10^{-7} moles, 10 \mul) y Na ^{123}I (50 \mul, sin vehículo,
50-100 MBq). La solución se mezcló bien y se añadió
PAA (0,01 M, ca. 1 x 10^{-7} moles, 10 \mul). La solución se
mezcló bien otra vez, y se incubó a la temperatura ambiente del
laboratorio durante al menos 5 minutos y el producto deseado se
purificó por HPLC usando el sistema B del ejemplo 12. Se retiró el
componente del eluyente orgánico en la muestra purificada y la
muestra se diluyó con tampón fosfato sódico (pH 7,4, volumen
variable) para asegurar que el componente purificado estaba presente
en un medio biológicamente aceptable para su ensayo. La pureza
radioquímica del compuesto 4 purificado (racemato) se midió usando
el sistema B para HPLC del ejemplo 12 antes y después del ensayo
in vitro o in vivo. Los resultados de las medidas de
RCP se muestran en la Tabla 20. La identidad de las especies
^{123}I se confirmó por elución conjunta en HPLC con los análogos
^{127}I químicamente caracterizados. (Ejemplo 1, etapa D). Los
tiempos de retención de las especies ^{123}I y ^{127}I se
muestran en la Tabla 21.
Etapa
H
Se sintetizó una muestra de
^{123}I-compuesto 4 racemato y se purificó de
acuerdo con el método de HPLC detallado en el sistema C del ejemplo
12. Esto se hizo para asegurar que el pH del compuesto racémico
purificado era compatible con el material de la columna de HPLC
usada para la purificación de los isómeros ópticos (a continuación).
El eluyente orgánico de HPLC se retiró al vacío a la temperatura
ambiente del laboratorio y después la muestra se diluyó con tampón
fosfato sódico (pH 6,0) para obtener un volumen total de aprox. 1
ml. Los dos isómeros ópticos se purificaron a partir del racemato
usando el sistema D de HPLC del ejemplo 12. Se recogieron los dos
enantiómeros, 4a y 4b, se retiró el eluyente orgánico de HPLC al
vacío y se midió la pureza radioquímica (quiral) después del ensayo
usando el sistema D de HPLC del ejemplo 12. Los resultados del
ensayo de RCP se muestran en la Tabla 20.
y
Etapa
A
Se disolvió tiramina (0,20 g, 1,46 mmoles) en
metanol (5 ml) a temperatura ambiente en una atmósfera de nitrógeno.
Se añadió una solución de
di-terc-butildicarbonato
(0,318 g, 1,46 mmoles) en metanol (1 ml) seguida de trietilamina
(200 ml, 1,46 mmoles). La mezcla de reacción se agitó durante 4,5
horas y después se retiró el disolvente al vacío. El residuo se
repartió entre acetato de etilo y agua. La capa orgánica se separó,
se secó (Na_{2}SO_{4}) y se concentró al vacío para dar el
producto bruto. La purificación por cromatografía ultrarrápida en
columna (petróleo/EtOAc, 1:1) daba el compuesto del título (0,34 g,
98%) en forma de un aceite amarillo.
Etapa
B
Se resuspendió hidróxido sódico (0,046 g, 1,14
mmoles) en THF seco (5 ml) a temperatura ambiente en una atmósfera
de nitrógeno. Se añadió gota a gota una solución de
N-t-butoxicarbonil(4-hidroxi)-2-feniletilamina
(0,27 g, 1,14 mmoles) en THF seco (5 ml) a la mezcla de reacción
durante 20 minutos. Se añadió bromuro de bencilo (135 \mul, 1,14
mmoles) como una alícuota única y la mezcla resultante se agitó
durante 24 horas. La reacción se interrumpió añadiendo agua (50 ml)
y la capa acuosa se extrajo con éter dietílico (3 x 20 ml). Los
extractos orgánicos combinados se secaron (MgSO_{4}) y se
concentraron al vacío. El producto bruto se purificó por
cromatografía ultrarrápida en columna (petróleo/Et_{2}O, 8:1) para
obtener el compuesto del título (0,217 g, 58%) en forma de un
sólido.
Etapa
C
N-t-Butoxicarbonil(4-benciloxi)-2-feniletilamina
(0,199 g, 0,608 mmoles) se disolvió en una solución de ácido
clorhídrico 3 M en acetato de etilo (10 ml) y la mezcla se agitó
durante 1 hora a temperatura ambiente. El precipitado se aisló por
filtración para dar un sólido blanco (0,056 g) y el filtrado se
concentró al vacío para obtener un sólido amarillo pálido (0,079 g).
Ambos productos se mezclaron para dar una muestra total del
compuesto del título (0,135 g, 84%) en forma de un sólido amarillo
pálido.
Etapa
D
La sal clorhidrato de
(4-benciloxi)-2-feniletilamina
(1,413 g, 5,35 mmoles) se absorbió en acetato de etilo (15 ml) y en
hidróxido sódico acuoso 2 M (3 ml) y la mezcla resultante se agitó a
temperatura ambiente durante 1 hora. La capa acuosa se separó y se
extrajo con diclorometano (3 x 20 ml). Los extractos orgánicos se
combinaron y se concentraron al vacío para obtener la amina libre
(1,32 g, 97%). De acuerdo con el procedimiento dado en la etapa A
del ejemplo 1, una porción de esta amina (0,19 g, 0,84 mmoles) daba
el compuesto del título (0,187 g, 88%) en forma de un sólido.
Etapa
E
Al cloruro de tosilo (50,0 g, 0,263 moles) a 0ºC
y en una atmósfera de nitrógeno se le añadió diclorometano anhidro
(80 ml), piridina anhidra (23 ml, 24,3 g, 0,29 moles),
2-metoxietanol (21,0 ml, 20,0 g, 0,263 moles) y una
cantidad catalítica de DMAP. Después de 10 minutos, la mezcla se
calentó a temperatura ambiente, a la cual se agitó durante 16 horas.
Se añadieron diclorometano (100 ml) y ácido clorhídrico acuoso 1 M
(50 ml). Se aisló la capa orgánica y se lavó con ácido clorhídrico
acuoso 1 M (4 x 30 ml) y agua (4 x 30 ml), se secó
(Na_{2}SO_{4}) y se concentró al vacío para dar el compuesto del
título (51,68 g, 85%) en forma de un aceite.
Etapa
F
A hidruro sódico (2,17 g, 0,09 moles) en una
atmósfera de nitrógeno se le añadió THF anhidro (50 ml). La mezcla
se enfrió a 0ºC y se añadió trifenilmetilmercaptano gota a gota
durante 15 minutos (24,88 g, 0,09 moles) en THF anhidro (50 ml).
Después de otros 10 minutos a 0ºC la mezcla se calentó a temperatura
ambiente, a la cual se agitó durante 1 hora. Después la mezcla se
enfrió de nuevo a 0ºC y se añadió el tosilato de éter metílico de
etilenglicol (20,72 g, 0,09 moles) en THE seco (50 ml) gota a gota
durante 15 minutos. Tras calentar hasta la temperatura ambiente, la
mezcla se dejó agitar durante 16 horas. La mezcla se filtró y el
precipitado se lavó con diclorometano. Los filtrados combinados se
concentraron al vacío. El residuo se disolvió en diclorometano, se
lavó con agua (3 x 50 ml), se secó (Na_{2}SO_{4}) y concentró al
vacío. La purificación por cromatografía ultrarrápida en columna
(gradiente de petróleo al 100% a EtOAc al 100%) y la
recristalización (petróleo) daban el compuesto (12,39 g, 41%) en
forma de un sólido marrón pálido.
Etapa
G
A S-trifenilmetil
2-metoxietanetiol (1,37 g, 4,2 mmoles) en
dicrolometano (30 ml) en una atmósfera de nitrógeno se le añadió
trietilsilano (0,953 g, 1,31 ml, 8,2 mmoles) y ácido tricloroacético
(0,632 ml, 0,935 g, 8,2 mmoles). La mezcla se agitó a temperatura
ambiente durante 16 horas. Se añadió acetona (50 ml) y la mezcla se
neutralizó con hidróxido sódico acuoso 2M. Después se añadieron
hidróxido sódico acuoso 1M (24 ml, 24 mmoles),
4-acetoxi-3,3-dietil-2-azetidinona
(J.Med.Chem., 35, 3745.3754 (1992)) (0,690 g, 6,00 mmoles) y
acetona (10 ml) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante
23 horas, Los disolventes se retiraron al vacío y se añadió agua al
residuo (50 ml) y diclorometano (50 ml). Se aisló la capa orgánica y
la capa acuosa se extrajo adicionalmente con diclorometano (3 x 30
ml). Las 4 capas orgánicas se combinaron y se lavaron con agua (30
ml) y salmuera saturada (30 ml), se secaron (Na_{2}SO_{4}) y se
concentraron al vacío. La purificación por cromatografía
ultrarrápida en columna (gradiente desde petróleo/EtOAc, 9:1 a
EtOAc) daba el compuesto del título (0,51 g, 63%) en forma de un
aceite.
Etapa
H
De acuerdo con el método de Shrenik et al
(J.Med.Chem., 35, 3745-3754 (1992))
4-[2-metoxietiltio]-3,3-dietil-2-azetidinona
(550 mg, 2,53 mmoles) y
(4-benciloxi)-2-feniletilisocianato,
preparado como en la etapa D del ejemplo 2 (1,366 g, 5,39 mmoles)
daban, seguido de purificación por cromatografía ultrarrápida en
columna (EtOAc/petróleo, 7:3), el compuesto del título (391 mg, 33%)
en forma de un aceite.
Etapa
I
A
4-[2-metoxietiltio]-1-[(4-benciloxi)feniletilaminocarbonil]-3,3-dietil-2-azetidinona
(358 mg, 0,76 mmoles) en diclorometano (10 ml) se le añadió un
exceso de ácido meta-cloroperoxibenzoico
(MCPBA) (aproximadamente 50% de pureza, 525 mg) y la mezcla se agitó
a temperatura ambiente durante 16 horas. La mezcla se vertió en una
solución acuosa que contenía bicarbonato sódico al 8% (p/v) y
sulfito sódico al 8% (p/v) y se agitó vigorosamente a temperatura
ambiente durante 30 minutos. Se aisló la capa orgánica y se lavó con
salmuera saturada (5 ml) y agua (5 ml). La capa acuosa se extrajo
con diclorometano (20 ml). Las capas orgánicas se combinaron, se
secaron (Na_{2}SO_{4}) y se concentraron al vacío. La
purificación por cromatografía ultrarrápida en columna
(petróleo/EtOAc, 7:3) daba el compuesto del título (314 mg, 84%) en
forma de un aceite.
Etapa
J
Se añadió ciclohexano (400 \mul, 3,95 mmoles) a
una solución de
4-[2-metoxietilsulfonil]-1-(4-benciloxi)feniletilaminocarbonil]-3,3-dietil-2-azetidinona
(195 mg, 0,39 mmoles) en etanol seco (7 ml) a temperatura ambiente
en una atmósfera de argón. Se añadió paladio al 10% sobre carbón
(202 mg) y la mezcla de reacción se calentó a reflujo durante 4
horas. Después se permitió que la mezcla de reacción se enfriara
hasta la temperatura ambiente, se filtró a través de un lecho de
celite, se lavó con etanol (15 ml) y el filtrado se concentró al
vacío. El producto bruto se purificó por cromatografía ultrarrápida
en columna (petróleo/EtOAc, 1:1) para dar el compuesto del título
(127 mg, 79%) en forma de un aceite.
Etapa
K
A
4-[2-metoxietilsulfonil]-1-[(4-hidroxi)feniletilaminocarbonil]-3,3-dietil-2-azetidinona
(52 mg, 1,3 x 10^{-4} moles) disuelto en MeOH (10 ml) se le
añadió NaI (19 mg, 1,3 x 10^{-4} moles) y PAA acuosa (0,1 M, 1,3 x
10^{-4} moles, 1,27 ml). La solución se agitó a la temperatura
ambiente del laboratorio y se añadieron más equivalentes molares de
PAA aproximadamente a 1 y 2 horas después de la adición de la
primera alícuota de PAA. El producto disuelto se purificó por HPLC
usando el sistema E del ejemplo 12. Las fracciones purificadas por
HPLC se concentraron al vacío para dar el compuesto del título (21
mg, 30%).
Etapa
L
A
4-[2-metoxietilsulfonil)-1-[(4-hidroxi)feniletilaminocarbonil]-3,3-dietil-2-azetidinona
(13 mg, 3,1 x 10^{-5} moles) se le añadió NaI (5 mg, 3,1 x
10^{-5} moles) y PAA acuoso (0,3 ml, 3,1 x 10^{-5} moles). La
solución se volvió inmediatamente naranja/marrón con la adición de
ácido peracético y se agitó a la temperatura ambiente del
laboratorio. Se añadieron más alícuotas de NaI (3,1 x 10^{-5}
moles) y PAA (0,3 ml, 3,1 x 10^{-5} moles) aproximadamente a las
2½ horas y a las 4 horas después del inicio de la reacción. El
producto disuelto se purificó por HPLC usando el sistema E del
ejemplo 12. Las fracciones purificadas se concentraron al vacío para
dar el compuesto del título (4,4 mg,
21%).
21%).
Etapa
M
4-[2-Metoxietilsulfonil]-1-[(4-hidroxi)feniletilaminocarbonil]-3,3-dietil-2-azetidinona
en MeOH (50 \mug, 1 x 10-7 moles, 50 \mul) se
marcó con yodo de acuerdo con el procedimiento descrito en la etapa
G del ejemplo 1. El producto se purificó por HPLC usando el sistema
A del ejemplo 12 y se diluyó con tampón fosfato sódico (pH 7,4) de
manera idéntica a la que se detalla en la etapa G del ejemplo 1. Las
medidas de RCP se detallan en la tabla 20. La identidad de las
especias ^{123}I se confirmó por elución conjunta en HPLC con los
análogos ^{127}I químicamente caracterizados (ejemplo 2, etapa K).
Los tiempos de retención de las especies ^{123}I y ^{127}I se
muestran en la Tabla 21.
Etapa
N
La síntesis del compuesto del título fue idéntica
a la del método usado en la etapa G del ejemplo 1. Este método
produce una mezcla (aproximadamente 50:50) de especies
mono-yodo y di-yodo. El producto
deseado se purificó por HPLC usando el sistema A del ejemplo 12, se
retiró el eluyente orgánico y la muestra se diluyó con tampón
fosfato sódico acuoso antes de su ensayo, como se detalla en la
etapa G del ejemplo 1. La pureza radioquímica del compuesto
purificado se midió antes y después del análisis usando el sistema A
del ejemplo 12 para HPLC. Los resultados de las medidas de RCP se
detallan en la tabla 20. La identidad de las especies ^{123}I se
confirmó por elución conjunta con el análogo ^{127}I caracterizado
químicamente (ejemplo 2, etapa L). Los tiempos de retención de las
especies ^{123}I y ^{127}I se muestran en la Tabla 21.
Etapa
A
De acuerdo con el método de Finke et al
(Solicitud de Patente del Reino Unido GB 2 280 673 A), el ácido
4-bromofenilacético (17,24 g, 0,08 moles) y
1-bromopropano (14,5 ml, 0,16 moles) daban, tras la
purificación por cromatografía ultrarrápida en columna (gradiente de
petróleo/ácido acético, 99:1 a petróleo/EtOAc/ácido acético,
64:33.1), ácido
\alpha-n-propil-(4-bromo)fenilacético
(15,49 g, 75%). Al ácido racémico se le añadió
R-(+)-\alpha-metilbencilamina y la
sal resultante se recristalizó tres veces a partir de acetato de
etilo. La sal se absorbió en HCl acuoso 2 M (100 ml) y se extrajo en
diclorometano (100 ml). La capa orgánica se secó (Na_{2}SO_{4})
y se concentró al vacío para dar el compuesto del título (3,72 g) en
forma de un aceite.
Etapa
B
De acuerdo con el método de Finke et al
(Solicitud de Patente del Reino Unido GB 2 280 673 A), el ácido
R-\alpha-n-propil-(4-bromo)fenilacético
(2,00 g, 7,78 mmoles) daba el compuesto del título (1,90 g, 96%) en
forma de un aceite.
\newpage
Etapa
C
De acuerdo con el método de Shrenik et al
(J.Med.Chem., 35, 3745-3754 (1992)),
R-\alpha-n-propil-(4-bromo)fenilmetil
isocianato (1,9 g, 7,48 mmoles) y
4-[4-[(1,1-dimetiletoxi)carbonil]fenoxi]-3,3-dietil-2-azetidinona
(J.Med.Chem., 35, 3745-3754 (1992)) (1,28 g,
4,0 mmoles) daban, tras la purificación por cromatografía
ultrarrápida en columna (gradiente de petróleo al 100% a
petróleo/EtOAc 1:1), el compuesto del título (0,73 g, 32%) en forma
de un
aceite.
aceite.
Etapa
D
De acuerdo con el método de Shrenik et al
(J.Med.Chem., 35, 3745-3754 (1992)),
4S-[4-[(1,1-dimetiletoxi)cabonil]fenoxi]-1-[(R-\alpha-n-propil)-(4-bromo)bencilaminocarbonil]-3,3-dietil-2-azetidinona
(0,73 g, 1,27 mmoles) daba el título del compuesto (0,66 g, 100%) en
forma de un sólido.
Etapa
E
De acuerdo con el método de Doherty et al
(documento EP 0595 557 A1),
4S-[(4-carboxi)fenoxi]-1-[(R-\alpha-propil)-(4-bromo)bencilaminocarbonil]-3,3-dietil-2-azetidinona
(0,66 g, 1,27 mmol) daba, tras purificación por cromatografía
ultrarrápida en columna (gradiente de hexano a EtOAc/hexano, 1:1 a
MeOH/EtOAc, 1:9) y recristalización (éter dietílico/petróleo), el
compuesto del título (0,37 g, 60%) como cristales blancos.
Etapa
F
De acuerdo con el procedimiento descrito en la
etapa E del ejemplo 1,
4S-[4-[[(4-metil)piperazin-1-il]carbonil]fenoxi]-1-[(R-\alpha-n-propil)-(4-bromo)bencilaminocarbonil]-3,3-dietil-2-azetidinona
(80 mg, 0,13 mmoles) daba, tras la purificación por HPLC usando el
sistema J del ejemplo 12, el compuesto del título (15,5 mg, 15%) en
forma de un aceite.
Etapa
G
De acuerdo con el procedimiento descrito en la
etapa G del ejemplo 1,
4S-[4-[[(4-metil)piperazin-1-il]carbonil]fenoxi]-1-[(R-\alpha-n-propil)-[4-[tri-(n-butil)-estannil]bencilaminocarbonil]-3,3-dietil-2-azetidinona
(50 \mug, 6,18 x 10^{-8} moles) daba el compuesto del
título.
Etapa
A
De acuerdo con el método de Shrenik et al
(J.Med.Chem., 35, 3745-3754 (1992)),
3-hidroxipiridina (0,598 g, 6,291 moles) y
4-acetoxi-3,3-dietil-2-azetidinona
(J.Med.Chem., 35, 3745-3754 (1992))(1,00 g,
5,40 moles) daban, tras purificación por cromatografía ultrarrápida
en columna (MeOH/EtOAc, 1:4), el compuesto del título (900 mg, 76%)
en forma de un aceite.
Etapa
B
De acuerdo con el método de Shrenik et al
(J.Med.Chem., 35, 3745-3754 (1992)),
R-\alpha-n-propil-(4-bromo)fenilmetil
isocianato, preparado como en la etapa B del ejemplo 3 (1,32 g, 5,19
mmoles) y
4-(piridil-3-oxi)-3,3-dietil-2-azetidinona
(0,573 mg, 2,60 mmoles) daban tras la purificación por
cromatografía ultrarrápida en columna (gradiente de éter
dietílico/petróleo, 1:1 a éter dietílico/petróleo, 7:1 a éter
dietílico/petróleo, 9:1), el compuesto del título (0,35 g, 28%) en
forma de un aceite.
Etapa
C
De acuerdo con el procedimiento descrito en la
etapa E del ejemplo 1,
4S-(piridil-3-oxi)-1-[(R-\alpha-n-propil)-(4-bromo)bencilaminocarbonil]-3,3-dietil-2-azetidinona
(90 mg, 0,19 mmoles) daba, tras la purificación por cromatografía
ultrarrápida en columna (gradiente de EtOAc/petróleo, a 1:4
EtOAc/petróleo 1:1 a EtOAc/petróleo, 7:3), el compuesto del título
(29 mg, 22%) en forma de un aceite.
Etapa
D
De acuerdo con el procedimiento descrito en la
etapa G del ejemplo 1,
4S-(piridil-3-oxi)-1-[(R-\alpha-n-propil)-[[4-tri-(n-butil)-estannil]bencilaminocarbonil]-3,3,-dietil-2-azetidinona
(50 \mug, 7,31 x 10^{-8} moles) daba el compuesto del
título.
Etapa
A
A una solución de ácido
4-(aminometil)benzoico (1 g, 6,62 mmoles) en NaOH 4 M (21 ml)
a temperatura ambiente se le añadió
di-terc-butildicarbonato
(1,67 ml, 7,28 mmoles) y la mezcla se agitó durante 19 horas. La
reacción se acidificó hasta pH 2,0 con ácido clorhídrico concentrado
y la mezcla se extrajo con acetato etílico (3 x 50 ml). Los
extractos orgánicos combinados se secaron (Na_{2}SO_{4}) y se
concentraron al vacío para dar el compuesto del título (1,136 g,
69%) en forma de un sólido.
Etapa
B
A una mezcla de ácido
4-(N-Boc-aminometil)benzoico
(500 mg, 1,99 mmoles), DMAP (cantidad catalítica), alcohol bencílico
(226 \mul, 2,39 mmoles) y diclorometano (20 ml) se le añadió
diciclohexilcarbodiimida (solución 1 M en diclorometano, 2,29 ml,
2,19 mmoles) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 60
horas. El precipitado se retiró por centrifugación y el filtrado se
concentró al vacío. Se añadió al residuo éter dietílico (50 ml), el
precipitado resultante se eliminó por filtración y el filtrado se
concentró al vacío. La purificación por cromatografía ultrarrápida
en columna (petróleo/EtOAc, 3.1) daba el compuesto del título (412
mg, 61%) en forma de un
sólido.
sólido.
Etapa
C
De acuerdo con el procedimiento descrito en la
etapa C del ejemplo 2, el éste bencílico del ácido
4-(N-Boc-aminometil)benzoico
(398 mg, 1,17 mmoles) daba el compuesto del título (288 mg, 93%) en
forma de un sólido.
Etapa
D
De acuerdo con el método de Doherty et al.
(Documento EP 0 595 557 A1), el ácido benciloxibenzoico (15,22 g,
0,06 moles) daba el compuesto del título (18,93 g, 99%) en forma de
un sólido amarillo pálido.
\newpage
Etapa
E
De acuerdo con el procedimiento descrito en la
etapa J del ejemplo 2, la
4-benciloxi-(1-N-metilpiperazin)benzamida
(4,555 g, 0,015 moles) daba, tras la purificación por cromatografía
ultrarrápida en columna (MeOH/EtOAc, 1:9), el compuesto del título
(2,41 g, 73%) en forma de un sólido.
Etapa
F
De acuerdo con el método de Shrenik et al
(J.Med.Chem., 35, 3745-3754 (1992)),
4-hidroxi-(1-N-metilpiperazin)benzamida
(2,41 g, 0,011 moles) y
4-acetoxi-3,3-dietil-2-azetidina
(J.Med.Chem., 35, 3745-3754 (1992)), seguido
de una adición más después de 60 horas de
4-acetoxi-3,3-dietil-2-azetidinona
(0,95 g, 5,31 mmoles) daban, tras la purificación por cromatografía
ultrarrápida en columna (gradiente de petróleo/EtOAc, 1:1 a
MeOH/EtOAc, 1:9 a MeOH/EtOAc, 9:1), el compuesto del título (1,60 g,
42%) en forma de un aceite.
Etapa
G
A la sal clorhidrato del éster bencílico del
ácido 4-(aminometil)benzoico, preparada como en la etapa C
del ejemplo 5 (288 mg, 1,04 mmoles) a 0ºC se añadió NaHCO_{3}
acuoso saturado (15 ml) y diclorometano (20 ml). Tras 20 minutos se
paró la agitación y se permitió que se separaran las dos capas. Se
añadió fosgeno (solución al 20% en tolueno, 1,1 ml, 2,18 mmoles)
rápidamente a la capa inferior y se volvió a agitar inmediatamente.
Después de 1 hora, se aisló la capa orgánica. La capa acuosa se
extrajo con diclorometano (3 x 20 ml). Las cuatro capas orgánicas se
combinaron, se secaron (Na_{2}CO_{4}) y se concentraron al vacío
para dar el compuesto del título (261 mg, 94%) en forma de un
aceite.
aceite.
Etapa
H
De acuerdo con el método de Shrenik et al
(J.Med.Chem., 35, 3745-3754 (1992)),
4-[4-[[(4-metil)piperazin-1-il]carbonil]fenoxi]-3,3-dietil-2-azetidinona
(160 mg, 0,463 mmoles) y
4-(benciloxicarbonil)bencilisocianato (261 mg, 0,98 mmoles)
daban, tras la purificación en cromatografía ultrarrápida en columna
(MeOH/EtOAc, 1:4), el compuesto del título (171 mg, 60%) en forma de
un aceite.
Etapa
I
De acuerdo con el procedimiento descrito en la
etapa J del ejemplo 2,
4-[[(4-metil)piperazin-1-il]carbonil]fenoxi]-1-[4-(benciloxicarbonil)
bencilaminocarbonil]-3,3-dietil-2-azetidinona
(159 mg, 0,26 mmoles) daba en compuesto del título (107 mg, 79%) en
forma de un sólido.
Etapa
J
A
4-[4-[[(4-Metil)piperazin-1-il]carbonil]fenoxi]-1-[(4-carboxi)bencilaminocarbonil]-3,3,-dietil-2-azetidinona
(30 mg, 0,057 mmoles), DMAP (cantidad catalítica) y
N-hidroxisuccinimida (7 mg, 0,063 mmoles) en una
mezcla de diclorometano (1 ml) y acetonitrilo (1 ml) se les añadió
diciclohexilcarbodiimida (solución 1M en diclorometano, 0,63 ml,
0,063 mmoles) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente en una
atmósfera de nitrógeno durante 19 horas. Se añadió una solución de
3,3,6,9,9-pentametil-6-aminometil-4,8-diazaundecano-2,10-dionadioxima
(documento WO 95/19187, 27 mg, 0,086 mmoles) en acetonitrilo (1 ml)
y la mezcla se agitó durante 5 horas más. La mezcla se filtró, se
diluyó con acetonitrilo (1 ml) y se purificó por HPLC usando el
sistema H del ejemplo 12 para dar el compuesto del título (2 mg, 4%)
en forma de un sólido.
Etapa
A
De acuerdo con el procedimiento descrito en la
etapa G del ejemplo 5, \beta-alanina
benciléster-p-toluenosulfonato (3 g,
8,53 mmoles) daba el compuesto del título (1,44 g, 94%) como un
líquido.
Etapa
B
De acuerdo con el método de Shrenik et al
(J.Med.Chem., 35, 3745-3754 (1992)),
4-[4-[[(4-metil)piperazin-1-il]carbonil]fenoxi]-3,3-dietil-2-azetidinona,
preparada como en la etapa F del ejemplo 5 (0,68 g, 1,97 mmoles) e
isocianato de 2-(benciloxicarbonil)etilo (0,705 g, 3,94
mmoles) daban, tras la purificación por cromatografía ultrarrápida
en columna (gradiente de petróleo/EtOAc, 1:1 a MeOH/EtOAc, 1:9 a
MeOH/EtOAc, 1:1), el compuesto del título (840 mg, 78%) en forma de
un aceite.
Etapa
C
De acuerdo con el procedimiento descrito en la
etapa J del ejemplo 2,
4-[4-[[(4-metil)piperazin-1-il]carbonil]fenoxi]-1-[2-(benciloxicarbonil)etilaminocarbonil]-3,3-dietil-2-azetidinona
(420 mg, 076 mmoles) daba el compuesto del título (280 mg, 80%) en
forma de un sólido.
Etapa
D
De acuerdo con el procedimiento descrito en la
etapa J del ejemplo 5,
4[4-[[(4-metil)piperazin-1-il]carbonil]fenoxi]-1-[(2-carboxi)etilaminocarbonil]-3,3-dietil-2-azetidinona
(100 mg, 0,22 mmoles) y
3,3,6,9,9-pentametil-6-aminometil-4,8-diazaundecano-2,10-dionadioxima
(documento WO 95/19187, 82 mg, 0,26 mmoles) daban, tras la
purificación por HPLC usando el sistema H del ejemplo 12, el
compuesto del título (4 mg, 3%) en forma de un
aceite.
aceite.
Etapa
A
De acuerdo con el procedimiento de la etapa B del
ejemplo 5, el ácido N-Boc aminocaproico (1,0 g, 4,32
mmoles) daba, tras la purificación por cromatografía ultrarrápida en
columna (petróleo/EtOAc, 4:1), el compuesto del título (1,34 g, 96%)
como un líquido.
Etapa
B
Al éster bencílico del ácido
N-Boc-aminocaproico (1,125 g, 3,50
mmoles) en diclorometano (4 ml) se le añadió ácido trifluoroacético
(8 ml) y la mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 10
minutos. Los disolventes se retiraron al vacío para dar el compuesto
del título (1,17 g, 100%) en forma de un aceite.
\newpage
Etapa
C
De acuerdo con el procedimiento descrito en la
etapa G del ejemplo 5, el éster bencílico del ácido aminocaproico
(1,17 g, 3,50 mmoles) daba el compuesto del título (0,922g, 100%) en
forma de un aceite.
Etapa
D
De acuerdo con el método de Shrenik et al
(J.Med.Chem., 35, 3745-3754 (1992)),
4[4-[[(4-metil)piperazin-1-il]carbonil]fenoxi]-3,3-dietil-2-azetidinona,
preparado como en la etapa F del ejemplo 5, (316 mg, 0,91 mmoles) y
5-(benciloxicarbonil)pentilisocianato (922 mg, 3,50 mmoles)
daban, tras la purificación en cromatografía ultrarrápida en columna
(MeOH/EtOAc, 1:3) el compuesto del título (0,53 g, 98%) como un
compuesto amarillo pálido.
Etapa
E
De acuerdo con el procedimiento descrito en la
etapa J del ejemplo 2,
4[4-[[(4-metil)piperazin-1-il]carbonil]fenoxi]-1-[5-(benciloxicarbonil)etilaminocarbonil]-3,3-dietil-2-azetidinona
(421 mg, 0,71 mmoles) daba el compuesto del título (320 mg, 90%) en
forma de un sólido.
Etapa
F
De acuerdo con el procedimiento descrito en la
etapa J del ejemplo 5,
4[4-[[(4-metil)piperazin-1-il]carbonil]fenoxi]-1-[(5-carboxi)pentilaminocarbonil]-3,3-dietil-2-azetidinona
(98 mg, 0,20 mmoles) y
3,3,6,9,9-pentametil-6-aminometil-4,8-diazaundecano-2,10-dionadioxima
(documento WO 95/19187, 76 mg, 0,24 mmoles) daban, tras la
purificación por HPLC usando el sistema H del ejemplo 12, el
compuesto del título (19,7 mg, 12%) en forma de un aceite.
Etapa
A
De acuerdo con el procedimiento descrito en la
etapa J del ejemplo 5,
4-[(4-carboxi)fenoxi]-1-[bencilami-
nocarbonil]-3,3-dietil-2-azetidinona (J. Med. Chem., 35, 3745-3754 (1992), 100 mg, 0,25 mmoles) y 3,3,6,9,9-pentametil-6-aminometil-4,8-diazaundecano-2,10-dionadioxima (documento WO 95/19187, 95 mg, 0,30 mmoles) daban, tras la purificación por HPLC usando el sistema H del ejemplo 12, el compuesto del título (18 mg, 10%) en forma de un aceite.
nocarbonil]-3,3-dietil-2-azetidinona (J. Med. Chem., 35, 3745-3754 (1992), 100 mg, 0,25 mmoles) y 3,3,6,9,9-pentametil-6-aminometil-4,8-diazaundecano-2,10-dionadioxima (documento WO 95/19187, 95 mg, 0,30 mmoles) daban, tras la purificación por HPLC usando el sistema H del ejemplo 12, el compuesto del título (18 mg, 10%) en forma de un aceite.
Etapa
A
A tris (2-aminoetil)amina
(4ml, 0,027 moles), acetonitrilo (70 ml) y NaHCO_{3} (7,4 g, 0,088
mmoles) se les añadió
3-cloro-3-metil-2-nitroso-butano
(Solicitud de Patente Europea 0 179 608 A2, 2,5 g, 0,019 moles) en
acetonitrilo (50 ml) gota a gota durante 20 minutos. La mezcla se
agitó a temperatura ambiente durante 20 horas, se filtró y se
concentró al vacío. El producto bruto se purificó por HPLC usando el
sistema I del ejemplo 12 para dar el compuesto del título (700 mg,
8%) en forma de un aceite.
Etapa
B
A una mezcla de
4[4-[[(4-metil)piperazin-1-il]carbonil]fenoxi]-1-[(2-carboxi)etilaminocarbonil]-3,3-dietil-2-azetidinona,
preparado como en la etapa C del ejemplo 6, (100 mg, 0,22 mmoles),
3,3,11,11-tetrametil-7-aminometil-4,7,10-triazatridecano-2,12-dionadioxima
(75 mg, 0,22 mmoles) y HBTU (82 mg, 0,22 mmoles) en una atmósfera de
nitrógeno se le añadió DMF anhidro (1 ml). La mezcla se agitó a
temperatura ambiente y se añadió diisopropiletilamina (100 \mul,
1,09 mmoles) y se agitó de forma continuada durante 40 horas. Tras
la dilución con MeOH/H_{2}O, 1:1 (4 ml) la mezcla se purificó por
HPLC usando el sistema H del ejemplo 12 para dar el compuesto del
título (54,2 mg, 32%) en forma de un aceite.
Etapa
A
De acuerdo con el procedimiento descrito en la
fase B del ejemplo 9,
4-[(4-carboxi)fenoxi]-1-[bencilami-
nocarbonil]-3,3-dietil-2-azetidinona (J. Med. Chem., 35, 3745-3754 (1992), 100 mg, 0,253 mmoles) y 3,3,11,11-tetrametil-7-aminometil-4,7,10-triazatridecano-2,12-dionadioxima, preparado como en la etapa A del ejemplo 9 (87 mg, 0,253 mmoles) daba, tras la purificación por HPLC usando el sistema K del ejemplo 12, el título del compuesto (110 mg, 60%) en forma de un sólido.
nocarbonil]-3,3-dietil-2-azetidinona (J. Med. Chem., 35, 3745-3754 (1992), 100 mg, 0,253 mmoles) y 3,3,11,11-tetrametil-7-aminometil-4,7,10-triazatridecano-2,12-dionadioxima, preparado como en la etapa A del ejemplo 9 (87 mg, 0,253 mmoles) daba, tras la purificación por HPLC usando el sistema K del ejemplo 12, el título del compuesto (110 mg, 60%) en forma de un sólido.
Una solución del compuesto para marcaje en
metanol (250 \mug en 50 \mul) se transfirió a un vial P6 de 10
ml relleno de N_{2} seguido de metanol, (1 ml), solución salina
desoxigenada (9,9% p/v, 1ml) e hidróxido sódico acuoso (0,1 M, 18
\mul). A esta solución se le añadió eluato del generador de
tecnecio-99m (1 ml, aproximadamente 0,5 GBq) y
después SnCl_{2} acuoso (0,1 ml, 10 \mug). El pH de marcaje fue
de 8,0-8,5. Los viales se incubaron a temperatura
ambiente de 1 a 2 horas y el producto marcado con ^{99m}Tc se
purificó por HPLC usando el sistema A del ejemplo 12, recogiéndose
el producto en un vial de Schott recubierto de plasma que contenía
compuesto no marcado (200 \mug en 250 \mul de metanol). El
eluyente orgánico se eliminó al vacío y la muestra se diluyó con
tampón como se ha describo en la etapa G del ejemplo 1. La pureza
radioquímica de los compuestos purificados se midió usando el
sistema A del ejemplo 12 para HPLC (los resultados están en la tabla
22) y los sistemas de cromatografía en capa fina (TLC) descritos a
continuación.
TLC
i) ITLC SG, 2cm x 20cm, eluida con solución
salina al 0,9% p/v
ii) ITLC SG, 2cm x 20cm, eluida con
butan-2-ona
iii) Whatman Nº 1, 2cm x 20cm, eluido con
acetronitrilo:H_{2}O 50:50 v/v
donde ITLC SG =cromatografía en capa fina
instantánea, placas impregnadas gel de sílice obtenidas de
Gelman.
Los compuestos 38, 42, 48, 49, 51 y 52 permanecen
en el origen, o cerca, del sistema de TLC (i), entre el origen y el
frente del sistema (ii) y cerca del frente del disolvente en el
sistema (iii).
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\newpage
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\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
La potencia de inhibición contra HLE se describe
por el parámetro K_{inact}/K_{i} como previamente se ha
publicado [Knight et al., Biochem.,
8160-8170, (1992)]. La enzima liofilizada se
reconstituyó con tampón Tris-HCl, 100 mM, NaCl 0,5 M
a 0,05 unidades/ml (concentración aproximadamente nanomolar) en un
volumen final de reacción de 1 ml al cual se añadió el sustrato
metoxisuc-ala-ala-pro-val-pNA
(1 mM) y el inhibidor de la elastasa disuelto en DMSO. La reacción
se siguió detectando el cambio de absorción a 410 nm (hidrólisis del
sustrato que libera p-nitroanilina) durante una
escala de tiempo de 25 minutos, Los valores de
K_{inact}/K_{i} se estimaron de acuerdo con el método de
Knight et al.
Los resultados se dan en las tablas 23 y 24.
Sangre recién extraída (30-120
ml) se mantuvo sin coagular con una solución de ACD al 1,5% y se
sedimentó con la adición de 2 ml de Hespan por cada 10 ml de sangre
durante 90 minutos a temperatura ambiente. El plasma sobrenadante
rico en plaquetas y leucocitos se retiró y se centrifugó a 150 g
durante 5 minutos, rindiendo un sedimento rico en leucocitos y un
plasma rico en plaquetas (PRP). El PRP se centrifugó a 4000g para
sedimentar las plaquetas dejando un plasma sin células (CFP). El
sedimento de leucocitos se resuspendió en una mezcla de HBSS y CFP
al 50:50 y se incubó con el compuesto radiactivo durante 30 minutos
a 37ºC. Después, el material radiactivo libre se retiró de las
células añadiendo un exceso de HBSS:CFP y centrifugando los
leucocitos a 150g durante 7 minutos. Se contó la radiactividad en el
sobrenadante y el sedimento celular para calcular el porcentaje de
captación celular. La distribución de la radiactividad en el
sedimento celular se calculó separando los tipos celulares usando la
centrifugación en un gradiente de densidad de Percoll (Percoll la
38%, 55% y 73% en gradientes por etapas de HBSS). El plasma residual
y la actividad libre se recuperó a partir de la parte superior del
gradiente, las células mononucleares (linfocitos y monocitos) de la
interfase entre el 38% y el 55%, y los granulocitos se recuperaron a
partir de la interfase entre el Percoll al 55% y al 73%. Los
resultados se dan en la tabla 23.
El compuesto radiactivo también se incubó con una
preparación de leucocitos aislados a la cual se le había añadido de
nuevo una fracción de eritrocitos. Los eritrocitos empaquetados
obtenidos tras la sedimentación de la sangre, se lavaron dos veces
con HBSS y después se resuspendieron en su volumen original de
sangre con HBSS Los leucocitos obtenidos a partir de 30 ml de sangre
se resuspendieron en 0,5 ml de suspensión de eritrocitos y en 0,5 ml
de CFP. Después, la suspensión celular se incubó con el compuesto
como anteriormente. El análisis de la distribución de la actividad
en el sedimento celular en presencia de células rojas sanguíneas se
realizó usando gradientes discontinuos de densidad de
Ficoll-Hypaque (densidades de las etapas de
Histopaque 1,04, 1,077 y 1,119 g/ml). Los resultados se dan en la
tabla 23.
El compuesto radiactivo se añadió a 1 ml de
sangre completa con anticoagulante ACD y se incubó a 37ºC durante 1
hora. La sangre se diluyó con HBSS y el componente celular se separó
por centrifugación. La distribución de la actividad en el sedimento
celular se calculó separando la fracción celular en gradientes de
Ficoll-Hypaque como anteriormente. Los resultados se
dan en la tabla 23.
| \hskip0,1cm donde: |
| \hskip1cm Mon = monocitos + linfocitos |
| \hskip1cm Gran = granulocitos |
| \hskip1cm Erit = eritrocitos |
Las figuras son % de captación en cada fracción
celular.
El modelo: en el músculo gracilis (muslo)
derecho de ratas macho Wistar (250-325 g) se inyectó
1 ml/kg de una suspensión de E. coli que contenía >> de
5 x 10^{8}organismos/ml. Durante las próximas 24 horas, se
desarrollaron abscesos purulentos en el lugar del ganglio linfático
poplíteo, mostrando también el músculo de alrededor signos de
inflamación. Estas observaciones visibles se confirmaron por
histología.
Validación: El modelo se validó usándolo
en el desarrollo de agentes de diagnóstico por imagen de infección o
inflamación, por la inyección intravenosa de wbc humanas marcadas
ex vivo con ^{99m}Tc-HMPAO o de
^{67}Ga-citrato cuando los abscesos tenían 24
horas. Los animales se diseccionaron entre las 4 y 24 horas tras la
inyección. Se usaron como control negativo células rojas marcadas
con ^{99m}Tc.
Análisis en ratas infectadas con E.
coli : 0,2-10 MBq de inhibidores de elastasa
marcados con ^{123}I o con ^{99m}Tc diluidos en solución salina
tamponada con fosfato (pH = 7,4), se inyectaron por vía intravenosa
en el caudal venoso de ratas que tenían abscesos de 24 horas. Los
animales se sacrificaron a las 4 ó 24 horas tras la inyección y se
diseccionaron los tejidos pertinentes.
Una población mixta de leucocitos humanos se
incubó con inhibidor de la elastasa durante 30 minutos a 37ºC.
Después, las células se centrifugaron y se resuspendieron en un
volumen conocido de plasma de rata para su inyección intravenosa en
ratas que tenían abscesos de 24 horas. Los animales se diseccionaron
a las 4 y 24 horas posinyección. Los resultados se muestran en la
tabla 24.
La estabilidad in vivo de los inhibidores
de HLE radioyodados se siguió determinando el porcentaje de
captación en el tiroides en función del tiempo tras la
administración. De esta manera, los compuestos radioyodados y el
yoduro libre ^{123}I se inyectaron en ratas Wistar macho. Los
porcentajes de las dosis inyectadas distribuidas en el tiroides se
calcularon por disección a las 4 y 24 horas posinyección y se
contaron.
Los resultados se dan en la tabla 25.
Se añadió 1 \muM de un potente inhibidor de
elastasa \beta-lactama
(K_{inact}/K_{i}>3000000 M/s) a alícuotas de plasma
humana recogido conjuntamente a partir de 6 voluntarios. La muestra
de ensayo contenía plasma con granulocitos añadidos (véase el
ejemplo 14 para el método de aislamiento). La muestra control
consistía en plasma y tampón Tris sin calcio. Se permitió que se
formaran coágulos durante 60 minutos tras la adición de 4 unidades
de trombina bovina y una varilla de vidrio rugoso para inducir la
formación del coágulo.
Tras la incubación (aprox. 20ºC), la reacción se
paró con la adición de \approx400 \mul de sal sódica del ácido
etilendiaminotetraacético 33,5 mM. Las soluciones se filtraron en
filtros de 0,45 \mu (previamente enjuagado en albúmina de suero
bovino al 1,5%/solución salina tamponada con Tris, pH 7,5 que
contenía Tween 20 al 0,1%) usando un colector al vacío y se lavaron
con el mismo tampón sin BSA.
La fracción de radiactividad retenida en el
filtro, tras la sustracción de la unión no específica, es la medida
del % de incorporación en los coágulos filtrados.
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
Los parámetros se definen como sigue:
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\+#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
1) \+ \begin{minipage}[t]{147mm} Proporción infectada/normal:
la proporción del % identificado de dosis inyectada (id) por gramo
de tejido en el área infectada relativa a la observada en un área
control tomada del muslo de la extremidad
opuesta.\end{minipage} \cr 2) \+
\begin{minipage}[t]{147mm} Proporción infectada/sangre: la
proporción del %/g en el área infectada relativa a la actividad en
sangre. Una proporción baja indica que el acúmulo en el área
inyectada puede verse enmascarado por la actividad en el total de la
sangre.\end{minipage} \cr 3) \+
\begin{minipage}[t]{147mm} La concentración relativa de agente
en el área infectada. Ésta puede definirse como el % de la dosis
inyectada en un % de peso corporal. Por ejemplo, 1% de la dosis
inyectada en un tejido que es el 1% del peso corporal tendría una
concentración relativa de
1.\end{minipage} \cr}
Claims (20)
1. Un inhibidor de la elastasa de leucocito
humano (HLE) marcado con un resto detectable donde el inhibidor es
sintético y tiene un peso molecular menor de 2000 y donde el resto
detectable es una sustancia adecuada para creación de imágenes
externas tras la administración a humanos.
2. El inhibidor de HLE marcado de la
reivindicación 1 donde el resto detectable es un isótopo
radiactivo.
3. El inhibidor de HLE marcado de la
reivindicación 1 donde el resto detectable es un ión
paramagnético.
4. El inhibidor de HLE marcado de la
reivindicación 1 donde el resto detectable en un compuesto
radioopaco.
5. El inhibidor de HLE marcado de la
reivindicación 2 donde el isótopo radiactivo es un emisor gamma.
6. El inhibidor de HLE marcado de la
reivindicación 5 donde el isótopo radiactivo es ^{123}I,
^{99m}Tc, ^{111}In o ^{67}Ga.
7. El inhibidor de HLE marcado de las
reivindicaciones 1-6 donde el inhibidor es una
\beta-lactama.
8. El inhibidor de HLE marcado de las
reivindicaciones 1-6 donde el inhibidor es una
inenol lactona.
9. El inhibidor de HLE marcado de las
reivindicaciones 1-6 donde el inhibidor es un
péptido trifluoroacetilo.
10. El inhibidor de HLE marcado de las
reivindicaciones 1-6 donde el inhibidor es un
péptido cetona.
11. El inhibidor de HLE marcado de las
reivindicaciones 1-6 donde el inhibidor es una
benzoxazin-4-ona.
12. El inhibidor de HLE marcado de la
reivindicación 7 donde la \beta-lactama tiene la
fórmula general:
en la
que:
en la que R^{1} es R^{8}, XR^{8},
(CRR)_{n}(C=X)R^{8} o
(C=X)NR^{8}_{2}
X es O u S
n es 0-3
R^{8} es H, OH, un anillo carbocíclico o
heterocíclico C_{3-12}sustituido o no sustituido
que puede ser saturado o insaturado, alquilo
C_{1-10}, arilo C_{3-12},
alquilarilo C_{4-12}, alquenilo
C_{2-10}, alquinilo C_{2-10},
alcoxi C_{1-10}, alcoxialquilo
C_{1-10}, hidroxialquilo
C_{1-10}, aminoalquilo C_{1-10},
perfluoroalquilo C_{1-10}, haloalquilo
C_{1-10}, carboxialquilo
C_{1-10}, amidoalquilo C_{1-10}
o cetoalquilo C_{1-10}.
R^{2}, R^{3} son el mismo o diferente y cada
un H, alquilo C_{1-4}, alquenilo
C_{2-4}, alquinilo C_{2-4},
alcoxialquilo C_{1-4}, hidroxialquilo
C_{1-4}, aminoalquilo C_{1-4},
perfluoroalquilo C_{1-4}, haloalquilo
C_{1-4}, Hal, carboxialquilo
C_{1-4}, OR, SR,
NRR(CH_{2})_{n}CONRR, NR(CO)R o
(CH_{2})_{n}CO_{2}R.
R^{4} es un grupo saliente elegido entre Hal,
XR^{8}, X(C=X)R^{8}, OSOR^{8}, OSO_{2}R^{8}
OSO_{2}Hal, SOR^{8}SO_{2}R^{8}, SO_{2}NR^{8}_{2}
NRSO_{2}R, (C=X)R^{8}, (C=X)NR^{8}_{2},
(C=X)R^{8}, NO_{2}, CN, PO_{n}R^{8}_{2} o
XC_{6}H_{4-n}Y_{n}.
Y es el mismo o diferente y es R, NO_{2}, Hal,
CONR^{8}_{2}, SO_{2}NR^{8}_{2} o CO_{2}R.
R^{5} es R o R^{4}
R es el mismo o diferente y es H, alquilo
C_{1-4}, alquenilo C_{2-4},
alquinilo C_{2-4}, alcoxi
C_{1-4}, alcoxialquilo C_{1-4},
hidroxialquilo C_{1-4}, aminoalquilo
C_{1-4}, perfluoroalquilo
C_{1-4}, haloalquilo C_{1-4} o
carboxialquilo C_{1-4}.
en el que dos o más de los grupos R^{1},
R^{2}, R^{3}, R^{4} y R^{5} puede combinarse para forman un
anillo carbocíclico o heterocarbocíclico sustituido o no sustituido
que puede estar saturado o insaturado.
caracterizado porque la
\beta-lactama contiene, o está covalentemente
unido a éste, al menos un resto detectable y a condición de que
cuando R^{4} sea XR^{8}, X sea S y R^{1} y R^{4} se combinen
para formar un grupo carboxialquilo cíclico, en el que el resto
detectable no es ^{125}I.
13. El inhibidor de HLE marcado de la
reivindicación 7 donde el inhibidor es una azetidinona.
14. El inhibidor de HLE marcado de la
reivindicación 10 donde la azetidinona tiene la fórmula:
en la
que:
en la que R^{1} es R^{8}, XR^{8},
(CRR)_{n}(C=X)R^{8} o
(C=X)NR^{8}_{2}
X es O u S
n es 0-3
R^{8} es H, OH, un anillo carbocíclico o
heterocíclico C_{3-12}sustituido o no sustituido
que puede estar saturado o insaturado, alquilo
C_{1-10}, arilo C_{3-12},
alquilarilo C_{4-12}, alquenilo
C_{2-10}, alquinilo C_{2-10},
alcoxi C_{1-10}, alcoxialquilo
C_{1-10}, hidroxialquilo
C_{1-10}, aminoalquilo C_{1-10},
perfluoroalquilo C_{1-10}, haloalquilo
C_{1-10}, carboxialquilo
C_{1-10},amidoalquilo C_{1-10} o
cetoalquilo C_{1-10}.
R^{2}, R^{3} son el mismo o diferente y cada
uno es H, alquilo C_{1-4}, alquenilo
C_{2-4}, alquinilo C_{2-4},
alcoxialquilo C_{1-4}, hidroxialquilo
C_{1-4}, aminoalquilo C_{1-4},
perfluoroalquilo C_{1-4}, haloalquilo
C_{1-4}, Hal, carboxialquilo
C_{1-4}, OR, SR,
NRR(CH_{2})_{n}CONRR, NR(CO)R o
(CH_{2})_{n}CO_{2}R.
R^{4} es un grupo saliente elegido entre Hal,
XR^{8}, X(C=X)R^{8}, OSOR^{8}, OSO_{2}R^{8}
OSO_{2}Hal, SOR^{8}SO_{2}R^{8}, SO_{2}NR^{8}_{2}
NRSO_{2}R, (C=X)R^{8}, (C=X)NR^{8}_{2},
(C=X)R^{8}, NO_{2}, CN, PO_{n}R^{8}_{2} o
XC_{6}H_{4-n}Y_{n}.
Y es el mismo o diferente y es R, NO_{2}, Hal,
CONR^{8}_{2}, SO_{2}NR^{8}_{2} o CO_{2}R.
R^{5} es R o R^{4}
R es el mismo o diferente y es H, alquilo
C_{1-4}, alquenilo C_{2-4},
alquinilo C_{2-4}, alcoxi
C_{1-4}, alcoxialquilo C_{1-4},
hidroxialquilo C_{1-4}, aminoalquilo
C_{1-4}, perfluoroalquilo
C_{1-4}, haloalquilo C_{1-4} o
carboxialquilo C_{1-4}.
caracterizado porque la azetidinona
contiene, o está unida covalentemente a éste, al menos un resto
detectable
15. El inhibidor de HLE marcado de la
reivindicación 11 donde el resto detectable está unido a la posición
R_{1}.
16. El inhibidor de HLE marcado de la
reivindicación 11 donde al menos uno de los grupos
R_{1-5} lleva un sustituyente amino.
17. El inhibidor de HLE marcado de las
reivindicaciones 1-13 para su uso en el diagnóstico
por imagen de sitios de inflamación o infección in vivo.
18. Uso del inhibidor de HLE marcado de las
reivindicaciones 1-13 para marcar leucocitos in
vitro.
19. El inhibidor de HLE marcado de las
reivindicaciones 1-13 para su uso en el diagnóstico
por imagen de trombos in vivo.
20. El inhibidor de HLE marcado de las
reivindicaciones 2 y 5-13 para su uso en la
radioterapia de artritis o infecciones óseas u otras enfermedades
hiperproliferativas.
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