ES2242956T3 - Cck-2, un receptor de tirosina quinasa. - Google Patents
Cck-2, un receptor de tirosina quinasa.Info
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Abstract
LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A UNA NUEVA FAMILIA DE QUINASAS DE TIROSINA DEL RECEPTOR, AQUI DENOMINADA MCK-10, A LAS SECUENCIAS DE NUCLEOTIDOS Y A VECTORES DE EXPRESION QUE CODIFICAN LAS MCK, ASI COMO A PROCEDIMIENTOS PARA INHIBIR LA ACTIVIDAD DE LAS MCK. LA INVENCION SE REFIERE PARTICULARMENTE A UN MIEMBRO DE LA FAMILIA DE QUINASAS DE TIROSINA DEL RECEPTOR MCK-10, LA QUINASA DE LA TIROSINA DEL RECEPTOR CCK-2. LAS CELULAS HUESPED DISPUESTAS GENETICAMENTE, QUE EXPRESAN CCK-2 PUEDEN UTILIZARSE PARA EVALUAR Y CLASIFICAR DROGAS QUE INTERVIENEN EN LA ACTIVACION Y REGULACION DE LA CCK-2. LA INVENCION SE REFIERE IGUALMENTE AL USO DE DICHAS DROGAS, EN EL TRATAMIENTO DE TRASTORNOS PROLIFERATIVOS, INCLUIDO EL CANCER O LOS TRASTORNOS NEUROLOGICOS, A TRAVES DE LA MODULACION DE LA ACTIVIDAD DE LA CCK-2.
Description
CCK-2, un receptor de tirosina
quinasa.
La presente invención se refiere a un nuevo
miembro (CCK-2) de la familia de tirosina quinasas
receptoras, a las que se hace referencia aquí como
MCK-10, a secuencias de nucleótidos y a vectores de
expresión que codifican CCK-2, y a métodos para
examinar e identificar antagonistas o agonistas de
CCK-2. Pueden usarse células hospedantes diseñadas
genéticamente que expresan CCK-2 para evaluar y
examinar fármacos implicados en la activación y regulación de
CCK-2.
Las tirosina quinasas receptoras comprenden una
gran familia de receptores transmembrana que están constituidos por
un dominio de unión de ligando extracelular y un dominio de
tirosina-quinasa intracelular responsable de mediar
en la actividad receptora. Las tirosina quinasas receptoras están
implicadas en una variedad de respuestas de células normales que
incluyen proliferación, alteraciones de la expresión de genes y
cambios de la forma celular.
La unión de ligando a su receptor cognado induce
la formación de dímeros receptores que conducen a la activación de
la actividad de quinasa receptora. La activación de la actividad de
quinasa produce fosforilación de múltiples sustratos celulares
implicados en la cascada de sucesos que conducen a respuestas
celulares tales como proliferación de células.
Se han enlazado alteraciones genéticas de caminos
de señalización mediados por factor de crecimiento a un cierto
número de enfermedades diferentes, incluyendo cáncer humano. Por
ejemplo, se ha encontrado que los homólogos normales de muchos
oncogenes codifican factores de crecimiento o receptores de factores
de crecimiento. Esto se ilustra por el descubrimiento de que la
cadena B de PDGF humano es homóloga de la proteína transformante de
virus de sarcoma de simios (SSV), el receptor de EGF (factor de
crecimiento epidérmico) de erb B; el receptor de CSF (factor
estimulante de colonias) de fms; y el receptor de NGF (factor
de crecimiento de nervios) de T2k. Además, se encuentran a
menudo receptores de factores de crecimiento multiplicados y/o
sobreexpresados en células cancerosas, de lo que es ejemplo la
observación de que el receptor de EGF se encuentra a menudo
multiplicado o sobreexpresado en carcinomas y glioblastomas de
células escamosas. De modo similar, se ha detectado la
multiplicación y sobreexpresión del gen met, que codifica el
receptor de HGF, en carcinomas de estómago.
Recientemente, se ha identificado un cierto
número de cADNs que codifican tirosina quinasas receptoras. Un clon
así, al que se hace referencia como DDR (receptor de dominio de
discoidina), se aisló de una genoteca de cADN de carcinoma de pecho
(Johnson et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90,
5677-5681) y es homólogo de MCK-10.
Además, se ha clonado y caracterizado recientemente un homólogo de
ratón de MCK-10 (Zerlin, M. et al., 1993,
Oncogene, 8:2731-2739).
El descubrimiento de nuevos receptores tirosina
quinasas receptoras, cuya expresión está asociada con enfermedades
proliferativas tales como cáncer, proporcionará oportunidades para
el desarrollo de nuevos reactivos de diagnóstico. Además, la
identificación de tirosina quinasas receptoras expresadas
aberrantemente conducirá al desarrollo de aplicaciones terapéuticas
diseñadas para inhibir la actividad de ese receptor, que pueden ser
útiles para el tratamiento de enfermedades proliferativas tales como
cáncer.
La presente invención se refiere a un nuevo
miembro (CCK-2) de la familia de tirosina quinasas
receptoras, a las que se hace referencia aquí como
MCK-10 (quinasa de carcinoma mamario 10). En
particular, a nuevas secuencias de nucleótidos y vectores de
expresión que codifican CCK-2, y a métodos para
examinar e identificar antagonistas o agonistas de
CCK-2. La invención se basa en el aislamiento de
clones de cADN de una genoteca de cADN de adenocarcinoma colónico
humano que codifica la nueva tirosina quinasa receptora
CCK-2.
CCK-2 es un nuevo miembro de la
familia MCK-10 de receptores tirosina quinasas,
definidos como los receptores que contienen un dominio de tirosina
quinasa intracelular y secuencias de consenso cerca del término N
extracelular de la proteína para la familia de proteínas tipo
discoidina I.
La presente invención proporciona un polipéptido
aislado que comprende
(a) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4;
o
(b) una secuencia de aminoácidos consistente en
uno o más de los siguientes dominios de SEQ ID NO: 4: el dominio de
discoidina I extracelular y el dominio de tirosina quinasa
intracelular.
La presente invención proporciona además una
molécula de ácido nucleico aislado que comprende:
(a) una secuencia de nucleótidos que codifica un
polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:
4;
(b) una secuencia de nucleótidos complementaria
de la secuencia de nucleótidos de (a);
(c) una secuencia de nucleótidos que codifica uno
o más de los siguientes dominios de SEQ ID NO: 4: el dominio de
discoidina I extracelular y el dominio de tirosina quinasa
intracelular; o
(d) una secuencia de nucleótidos complementaria
de la secuencia de nucleótidos de (c).
La presente invención proporciona además un
método para producir polipéptido de CCK-2
recombinante según la presente invención que comprende:
(a) cultivar una célula hospedante transformada
con un vector recombinante o de expresión que contiene una molécula
de ácido nucleico aislado que comprende:
- (i)
- una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4;
- (ii)
- una secuencia de nucleótidos complementaria de la secuencia de nucleótidos de (i);
- (iii)
- una secuencia de nucleótidos que codifica uno o más de los siguientes dominios de SEQ ID NO: 4: el dominio de discoidina I extracelular y el dominio de tirosina quinasa intracelular; o
- (iv)
- una secuencia de nucleótidos complementaria de la secuencia de nucleótidos de (iii)
y que expresa el polipéptido
aislado de la presente invención;
y
(b) recuperar el polipéptido del cultivo de
células.
Las propiedades de los nuevos productos
CCK-2 de la presente invención pueden describirse
aquí con relación a las propiedades de las secuencias de ácidos
nucleicos de MCK-10 conocidas y a los productos
codificados de ellas. No se pretende que MCK-10
forme parte de la presente invención.
Adicionalmente, el análisis de manchas de
Northern y la hibridación in situ indican que
CCK-2 se expresa en una amplia variedad de linajes
celulares de cáncer y tejido de tumores. Por tanto, la presente
invención se refiere a un método para examinar e identificar
inhibidores de la actividad de receptor CCK-2 que
pueden tener valor terapéutico en el tratamiento de enfermedades
proliferativas tales como cáncer.
Los moduladores de la actividad de la quinasa
receptora CCK-2 pueden incluir anticuerpos a
epítopes de receptor CCK-2 expresado
recombinantemente que pueden regular la actividad del receptor. Así,
en un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona un
anticuerpo que se une específicamente a un epítope del polipéptido
aislado de la presente invención, como se ha descrito anteriormente.
El anticuerpo puede ser un anticuerpo monoclonal y/o estar enlazado
a un agente citotóxico o radioisótopo. En otra realización de la
invención, pueden diseñarse oligonucleótidos
anti-sentido de CCK-2 para inhibir
la síntesis de las proteínas codificadas mediante la inhibición de
la traducción. Así, en un aspecto adicional de la presente
invención, se proporciona un oligonucleótido que codifica una
secuencia antisentido complementaria de la molécula de ácido
nucleico aislada de la presente invención, en la que la molécula de
ácido nucleico aislada comprende:
(a) una secuencia de nucleótidos que codifica un
polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:
4;
(b) una secuencia de nucleótidos complementaria
de la secuencia de nucleótidos de (a);
(c) una secuencia de nucleótidos que codifica uno
o más de los siguientes dominios de SEQ ID NO: 4: el dominio de
discoidina I extracelular y el dominio de tirosina quinasa
intracelular; o
(d) una secuencia de nucleótidos complementaria
de la secuencia de nucleótidos de (c) y en el que dicho
oligonucleótido inhibe la traducción del nucleótido en una
célula.
Además, pueden examinarse genotecas de péptidos
aleatorios usando proteína de CCK-2 producida
recombinantemente para identificar péptidos, compuestos sintéticos y
productos naturales que pueden actuar como agonistas y/o
antagonistas de la actividad biológica de los receptores mediante
unión a los lugares de unión del ligando u otros dominios
funcionales del receptor CCK-2. Así, en un aspecto
adicional todavía de la presente invención, se proporciona un método
para examinar e identificar antagonistas o agonistas del polipéptido
aislado de la presente invención que comprende:
(a) poner en contacto el polipéptido con una
genoteca de péptidos aleatorios de tal modo que el polipéptido
reconozca y se una a una o más especies de péptidos dentro de la
genoteca;
(b) aislar la combinación
polipéptido/péptido;
(c) determinar la secuencia del péptido aislado
en la etapa (c); y
(d) determinar si el compuesto de ensayo modula
la actividad enzimática endógena del polipéptido, en el que el
polipéptido aislado comprende:
- (i)
- la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4; o
- (ii)
- una secuencia de aminoácidos consistente en uno o más de los siguientes dominios de SEQ ID NO: 4: el dominio de discoidina I extracelular y el dominio de tirosina quinasa intracelular.
La referencia a MCK-10 aquí debe
entenderse que es sólo con fines comparativos. No se pretende que
MCK-10 forme parte de la invención.
Figuras 1A, 1B y 1C. Secuencia de nucleótidos de
MCK-10-3 humano y secuencia de
aminoácidos deducida. Las regiones de interés incluyen la secuencia
señal (aminoácidos (aa) 1-18); el dominio de tipo
discoidina I (aa 31-185); el lugar de división del
precursor putativo (aa 304-307); la región
transmembrana (aa 418-439); la secuencia I empalmada
alternativamente (aa 505-541); la secuencia II
empalmada alternativamente (aa 666-671); y las
secuencias de reconocimiento de anticuerpo del péptido:
NT\alpha:aa 26-42, NT\beta:aa
309-321, CT\beta:aa 902-919.
Figura 2A. Variantes de empalme de
MCK-10.
Figura 2B. Alineamiento de
MCK-10, MCK-10-2 y
MCK-10-1. El motivo NPXY en la
región de inserción del MCK-10-1
está subrayado con línea fina y el lugar de unión de SH3 putativo
con líneas gruesas. La secuencia TYAXPXXXPG está sobrerrayada.
Figuras 3A, 3B, C y 3D. Secuencia de nucleótidos
de CCK-2 humano y secuencia de aminoácidos
deducida.
Figura 4A. Comparación de las secuencias de
aminoácidos de CCK-2 y
MCK-10-2 deducidas. El dominio de
tipo discoidina I está enmarcado con residuos de consenso del motivo
de discoidina I sombreados. Se indican con triángulos oscuros los
lugares de glicosilación de CCK-2
N-enlazados, y están marcados con triángulos claros
los residuos de tirosina que son lugares posibles de
autofosforilación e incorporación de sustrato. El motivo de división
de proteasa RXRR está subrayado y la región transmembrana putativa
está sobrerrayada con una línea gruesa. Los asteriscos indican los
residuos de consenso del lugar de unión de ATP. Las posiciones de
inserciones de empalme alternativas de
MCK-10-1 y
MCK-10-2 están indicadas por
flechas.
Figura 4B. Estructuras esquemáticas de
CCK-2 y MCK-10. El porcentaje de
identidad de aminoácidos entre CCK-2 y
MCK-10 está indicado para el dominio de discoidina
I, parte del dominio extracelular (ECD), el dominio yuxtamembrana
(JM) y la región de tirosina quinasa (TK). TM: región transmembrana.
CT: cola carboxilo-terminal. La punta de flecha
indica la posición del lugar de división de proteasa predicho RXRR,
que divide la proteína de MCK-10 en los fragmentos
\alpha N-terminal y \beta
C-terminal.
Figura 4C. Lugar de unión del dominio SH3
putativo en MCK-10-1. Se comparan
lugares de unión de SH3 establecidos y predichos de diversas
proteínas. X: posición no conservada. *: preferencia fuerte por
residuos hidrófobos. P: posición invariable para prolina. p:
posición con preferencia para prolina.
Figura 5A. Análisis de manchas de Northern de
mARN de MCK-10 en diferentes tejidos humanos. Se
cargaron por pista tres microgramos de poli (A)^{+} ARN. La
mancha se hibrida con un fragmento de restricción de cADN
correspondiente a los nucleótidos 278 a 1983 de
MCK-10-2 (Figuras 1A, 1B y 1C)
(excluyendo la inserción de 111 pb). Como testigo, se rehibridó la
mancha con una sonda de cADN de gliceraldehído fosfato
deshidrogenasa (GAPDH) (panel inferior).
Figura 5B. Análisis de manchas de Northern del
gen de MCK-10 en diversos linajes celulares de
cáncer de pecho humano. Se analizaron muestras que contenían tres
microgramos de poli (A)^{+} ARN aislado de diferentes
linajes celulares de cáncer de pecho humano. Se indica la posición
de ARNs ribosómicos 28S y 18S, el panel inferior muestra la
rehibridación con una sonda de cADN de GAPDH.
Figura 5C. Análisis de manchas de Northern de
mARN de MCK-10 en diferentes tejidos humanos y
linajes celulares de origen tumoral. Los marcadores de tamaños están
indicando los ARNs ribosómicos 28S y 18S (panel superior). La
rehibridación se realiza con una sonda de cADN de GAPDH (panel
inferior).
Figura 5D. Análisis de manchas de Northern de
mARN de CCK-2 y MCK-10. Se muestra
la expresión de mARN de CCK-2 y
MCK-10 en diferentes linajes celulares de carcinoma
humano. Se cargaron por pista tres microgramos de poli
(A)^{+} ARN. Las manchas se hibridaron con un fragmento de
restricción de cADN correspondiente a la región extracelular de
CCK-2 (panel superior) y MCK-10
(panel intermedio). Los marcadores de tamaños de ARN se indican en
kb. Con el fin de calibrar las cantidades relativas de ARNs
cargados, se rehibridan las manchas con una sonda de cADN de GAPDH
(panel inferior).
Figura 6A. Fosforilación con tirosina de
MCK-10 sobreexpresado. Los cADNs de codificación de
MCK-10-1 y
MCK-10-2 se clonaron en un vector de
expresión y se sobreexpresaron transitoriamente en el linaje celular
293 (fibroblastos de riñón embriónico humano, ATCC CRL 1573). Se
separaron porciones de lisado de células de células transfectadas
con MCK-10-1 o -2 o células
transfectadas con plásmido testigo (simulado) en un gel de
poliacrilamida del 10% y se transfirieron a nitrocelulosa y sondaron
con anticuerpos anti-fosfotirosina (\alphaPY). La
incubación de células con ortovanadato sódico 1 mM 90 min antes de
la lisis se indica por -/+; (panel izquierdo). Después de separar el
anticuerpo \alphaPY, se resondó la mancha con un antisuero
policlonal purificado por afinidad generado contra el octapéptido
C-terminal de MCK-10 (\alpha
MCK-10-C); (panel derecho). Los
marcadores de tamaños moleculares se indican en kD.
Figura 6B. Distinta glicosilación de variantes de
empalme de MCK-10 sobreexpresado. Se transfectaron
células 293 con MCK-10-1 y -2 como
antes, se marcaron metabólicamente con
[^{35}S]-L-metionina y se trataron
con 10 \mug/ml de tunicamicina durante la noche como se indica
(+), se lisaron y se inmunoprecipitaron con antisueros generados
contra los péptidos N-terminal y
C-terminal de MCK-10 (\alpha
MCK-10-N y \alpha
MCK-10-C). Se muestra la
autorradiografía del análisis de SDS-PAGE. Los
marcadores de tamaños moleculares se indican en kD.
Figura 6C. Sobreexpresión transitoria de
proteínas receptoras de CCK-2 y
MCK-10. Las regiones de codificación de cADN de
MCK-10-2 y MCK-10
codificante se clonaron en un vector de expresión basado en
citomegalovirus y se sobreexpresaron transitoriamente en el linaje
celular 293 de fibroblasto de riñón embriónico humano. Se separaron
lisados de células de células transfectadas con
MCK-10-2 o CCK-2 en
un gel de poliacrilamida del 7,5%, se transfirieron a nitrocelulosa
y se sondaron con anticuerpo antifosfotirosina (\alphaPY). La
incubación de células con ortovanadato sódico 1 mM 90 minutos antes
de la lisis se indica por -/+.
Figura 6D. Identificación de isoformas de
proteína de MCK-10 en linajes celulares de carcinoma
humano. La fracción de glicoproteína de cantidades iguales de
lisados de células se unió a
concanavalina-A-Sepharose y, tras
elución, se separó por SDS-PAGE. Se manchó con el
gel nitrocelulosa y se sondó con el anticuerpo policlonal
\alphaMCK-10-N. Se usaron como
testigos lisados de células 293 que sobreexpresan
MCK-10-1 y
MCK-10-2. Los marcadores de tamaños
moleculares se indican en kDa.
Figuras 7A y 7B. Transcriptos de genes de
CCK-2 y MCK-10 en secciones de
adenocarcinomas humanos. Se analizaron secciones adyacentes de
adenocarcinoma papilar del adenocarcinoma de ovario
(A-D) y bronquioalveolar del pulmón
(E-H) por hibridación in situ usando sondas
de MCK-10 y CCK-2 antisentido. Las
células tumorales se indican por flechas largas (C, D) que infiltran
el tejido conectivo como se indica por flechas cortas (A, B). Como
se ve en el campo oscuro, las señales de hibridación de
CCK-2 se ven específicamente en células del tejido
conectivo (A, E), mientras que la expresión de
MCK-10 está restringida a células tumorales (C, G).
Las secciones B, D, F y H muestran iluminación de campo brillante de
secciones adyacentes respectivas.
La presente invención se refiere a un nuevo
miembro (CCK-2) de la familia de tirosina quinasas
receptoras, a las que se hace referencia aquí como
MCK-10.
Las propiedades de los nuevos productos
CCK-2 de la presente invención pueden describirse
aquí con relación a propiedades de las secuencias de ácidos
nucleicos de MCK-10 conocidas y a productos
codificados de ellas. No se pretende que MCK-10
forme parte de la presente invención. La invención se refiere a la
expresión y producción de la nueva proteína de
CCK-2, así como a un método para examinar e
identificar inhibidores de la actividad receptora de
CCK-2.
Por claridad de discusión, se describe la
invención en las subsecciones que siguen a modo de ejemplo para el
gen de MCK-10 representado en las Figuras 1A, 1B y
1C y el gen de CCK-2 representado en las Figuras 3A,
3B, 3C y 3D. No obstante, los principios pueden aplicarse
análogamente a otros miembros de la familia de receptores
MCK-10, tales como CCK-2. No se
pretende que el propio MCK-10 forme parte de la
presente invención.
La secuencia de codificación de nucleótidos y la
secuencia de aminoácidos deducida del gen de MCK-10
humano se representa en las Figuras 1A, 1B y 1C (SEQ ID NO. 1) sólo
por comparación. En adelante, se hará referencia a la totalidad de
tales variantes de la secuencia de nucleótidos de
MCK-10, incluyendo CCK-2 salvo
indicación en contrario, como secuencia de ADN de
MCK-10.
Como se muestra en las Figuras 1A, 1B y 1C y las
Figuras 3A, 3B, 3C y 3D sólo por comparación, MCK-10
tiene todas las características de un receptor PTK: el codón de
iniciación es seguido por una extensión de aminoácidos esencialmente
hidrófobos, que puede servir como péptido señal. Los aminoácidos
418-439 también son de naturaleza hidrófoba, con las
características de una región transmembrana. El dominio extracelular
abarca 4 lugares de N-glicosilación de consenso
(AnXSer/Thr) y 7 residuos de cisteína. La región extracelular es más
corta que la familia receptora de insulina y no muestra homología
con otras tirosina quinasas receptoras, pero contiene cerca del
término N una región de aproximadamente 150 aminoácidos de longitud
con una homología notable con discoidina I, una lectina del moho del
limo Dictyostelium discoideum (Poole et al., 1981, J.
Mol. Biol. 153:273-289; Alexander., 1992,
Differentiation 51:149-161). Un papel para este
motivo en interacción célula-célula se sugiere por
su identificación previa en los factores de coagulación V y VIII,
que median en la agregación de plaquetas por unión a lípidos
aniónicos en la superficie celular (Gilbert et al., 1991, J.
Biol. Chem. 266:17261-17268). Consistente con un
papel en la interacción célula-célula otro factor
que participa de este motivo, la proteína de Xenopus A5, está
implicado en el reconocimiento de células durante el desarrollo del
sistema nervioso de anfibios (Takagi et al., 1991, Neuron
7:295-307).
Además, MCK-10 contiene la
secuencia de consenso RXRR en posición 304-307, lo
que representa una señal de división posible para la endopeptidasa
furina, sugiriendo que MCK-10 se sintetiza como un
polipéptido precursor. Los productos de traducción principales no
glicosilados de prorreceptores
MCK-10-1 y
MCK-10-2, con pesos moleculares
predichos de 101,13 y 97,17 kD, respectivamente, pueden subdividirse
así en una subunidad \alpha de 34,31 kD y subunidades \beta de
66,84 y 62,88 kD que contienen la homología de tirosina quinasa y
lugares de empalme alternativos.
La secuencia de consenso para un motivo de unión
de ATP está situada en posiciones 617-627 (Figuras
1A, 1B y 1C). Cuando se compara con otras quinasas, el dominio de
unión de ATP tiene además 176 aminoácidos (incluyendo los 37
aminoácidos adicionales) del dominio transmembrana que cualquier
otra tirosina quinasa. Los 37 aminoácidos adicionales están situados
en la región yuxtamembrana (JM) larga y rica en prolina/glicina y
contiene una secuencia NPAY (en la que A puede intercambiarse por
cualquier aminoácido), que se encuentra en dominios citoplásmicos de
varias proteínas de la superficie celular, incluyendo RTKs de las
familias receptoras de EGF e insulina (Chen et al., 1990, J.
Biol. Chem., 265:3116-3123). Este motivo de consenso
es seguido por la secuencia TYAXPXXXPG, que se repite aguas abajo en
MCK-10 en el dominio yuxtamembrana en posiciones
585-595. Se ha mostrado recientemente que este
motivo está suprimido en la región yuxtamembrana citoplásmica del
receptor de activina, serina/treonina quinasa, produciendo una
afinidad de unión de ligando reducida (Attisano et al., 1992,
Cell, 68:97-108).
En comparación con otras RTKs, el dominio
catalítico muestra la más alta homología con el receptor TrkA. Los
motivos YY-(posición 802/803) y la tirosina en posición 798, que
representan lugares de autofosforilación putativos, caracterizan
MCK-10 como un miembro de la familia de receptores
de insulina (Figuras 1A, 1B y 1C). El MCK-10
participa de homología con la subfamilia de receptores de
neurotrofina Trk de tirosina quinasa receptora con su característica
cola corta carboxilo-terminal de 9 aminoácidos.
Varios residuos de tirosina en los dominios de
quinasa y JM de MCK-10-2 están
flanqueados por secuencias de consenso que sugieren un papel como
lugares de autofosforilación e incorporación de sustrato. Las
secuencias que flanquean Tyr-844 en
MCK-10 (YELM) en la región
COOH-terminal del domonio núcleo de quinasa
contienen el motivo de unión YXXM para asociación de la subunidad
p85 de fosfatidilinositol 3'-quinasa
(P13-quinasa). Otro lugar de unión de sustrato
potencial se encuentra 12 aminoácidos aguas arriba en posición Tyr
832 en MCK-10-2 (YLSR). Además,
análogo a TrK, Tyr-506 (YSGO) en la región JM
de MCK-10-2 podría servir como lugar
de unión de receptor para SHC, una molécula oncogénica que contiene
dominio SH2(Obermeier et al. 1993, J. Biol. Chem.
268:22963-22966), y secuencias que flanquean Tyr 510
(YMEP) en MCK-10 califican como lugar de unión para
la proteína que activa GTPasa (GAP) por la similitud con el lugar de
unión de GAP en el receptor de factor del crecimiento derivado de
plaquetas (PDGF-R).
Sólo con fines de comparación, usando una sonda
de hibridación que comprende el fragmento de cADN de 1694 pb 5' de
MCK-10 (excluyendo el inserto de 111 pb), que abarca
los dominios extracelular, transmembrana y yuxtamembrana, el gen de
MCK-10 reveló la existencia de tamaños de
transcriptos múltiples con una forma principal de 4,3 kb. La
expresión más alta de mARN de MCK-10 se detectó en
el pulmón, se encontraron niveles intermedios en el riñón, colon,
estómago, placenta y cerebro, niveles bajos en el páncreas y no se
detectó mARN de MCK-10 en el hígado (FIG. 5A). La
Figura 5B ilustra los niveles de expresión de MCK-10
en una variedad de linajes celulares de cáncer de pecho y la Figura
5C presenta los niveles de expresión de MCK-10 en
diferentes linajes celulares de tumores. Un sumario de los modelos
de expresión de MCK-10 en diferentes linajes
celulares se presenta en la
\hbox{Tabla 1.}
| Expresión de MCK-10 en diferentes linajes celulares | |
| Linajes celulares de cáncer de pecho | |
| BT-474 | + |
| T-47D | ++++ |
| BT-20 | +++ |
| Expresión de MCK-10 en diferentes linajes celulares | |
| Linajes celulares de cáncer de pecho | |
| MDA-MB-453 | ++ |
| MDA-MB-468 | ++ |
| MDA-MB-435 | ++ |
| Linajes celulares hematopoyéticos | |
| EB3 | - |
| CEM | - |
| MOLT4 | - |
| DAUDI | - |
| RAJI | - |
| MEG01 | - |
| KG1 | - |
| K562 | - |
El análisis de hibridación in situ con las
1865 pb 5' de MCK-10-2 indicó que
MCK-10 se expresaba específicamente en células
epiteliales de diversos tejidos, incluyendo:
\bullet células epiteliales cuboidales que
revisten el túbulo renal distal
\bullet células epiteliales columnares que
revisten el tracto del intestino grueso
\bullet capa profunda de células epiteliales
que revisten el estómago
\bullet células epiteliales que revisten los
conductos mamarios
\bullet células de islotes del páncreas
\bullet células epiteliales de la glándula
tiroides, que producen hormonas tiroideas
No se observó expresión detectable de
MCK-10 en tejidos conectivos, células endoteliales,
adipocitos, células musculares o células hemopoyéticas.
La expresión de MCK-10 se detectó
también en todos los tumores investigados, que incluían:
\bullet adenocarcinoma del colon
\bullet adenocarcinoma del estómago
\bullet adenocarcinoma del pulmón
\bullet carcinoma conductal infiltrante del
pecho
\bullet cistadenoma del ovario
\bullet tumor multi endocrino del páncreas
\bullet tumor carcinoide del páncreas
\bullet células tubulares de carcinoma de
células renales
\bullet carcinoma de células transicionales (un
tumor epitelial maligno de la vejiga)
\bullet tumor meningiotelial
\bullet meduloblastoma con núcleos atípicos
hipercromáticos y citoplasma suplementario (sólo se ve expresión de
MCK-10 en células con citoplasma bien
desarrollado)
\bullet glioblastoma (un tumor del tejido
neuroepitelial)
Sólo con fines comparativos, los experimentos de
hibridación in situ revelaron la más alta expresión de
MCK-10 en células malignas del carcinoma de pecho
conductal, en las células tumorales de un tumor
multi-endocrino y en las células tumorales de un
carcinoma de células transicionales de la vejiga).
La presente invención se refiere a un nuevo
miembro (CCK-2) de la familia MCK-10
de quinasas receptoras. Los miembros de la familia
MCK-10 se definen aquí como los receptores que
contienen un dominio de tirosina quinasa intracelular y una
secuencia de discoidina I extracelular situada cerca del extremo
amino-terminal de la proteína. El dominio de
discoidina I se define como la región de MCK-10
situada entre los aminoácidos 31-185 como se
presenta en la Figura 4A.
En una realización específica de la invención
descrita aquí, se clonó y caracterizó un nuevo miembro adicional
(CCK-2) de la familia MCK-10 de
tirosina quinasas receptoras. En un aspecto de la presente
invención, se proporciona un polipéptido aislado que comprende:
(a) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4;
o
(b) una secuencia de aminoácidos consistente en
uno o más de los siguientes dominios de SEQ ID NO:4: el dominio de
discoidina I extracelular y el dominio de tirosina quinasa
intracelular.
En un aspecto adicional de la presente invención
se proporciona una molécula de ácido nucleico aislado que
comprende:
(a) una secuencia de nucleótidos que codifica un
polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:
4;
(b) una secuencia de nucleótidos complementaria
de la secuencia de nucleótidos de (a);
(c) una secuencia de nucleótidos que codifica uno
o más de los siguientes dominios de SEQ ID NO: 4: el dominio de
discoidina I extracelular y el dominio de tirosina quinasa
intracelular; o
(d) una secuencia de nucleótidos complementaria
de la secuencia de nucleótidos de (c)
En particular, la secuencia de codificación de
nucleótidos y la secuencia de aminoácidos deducida de la nueva
tirosina quinasa receptora, CCK-2, se presentan en
las Figuras 3A, 3B, 3C y 3D. Según la invención, cualquier secuencia
de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos del producto
génico de CCK-2 puede usarse para generar moléculas
recombinantes que dirigen la expresión de CCK-2.
Además, pueden usarse también para expresar productos génicos con
actividad de CCK-2 realizaciones de la invención,
secuencias de nucleótidos que codifican el dominio de discoidina I
extracelular o el dominio de tirosina quinasa intracelular como se
muestra en las Figuras 3A, 3B, 3C, 3D y 4A (SEQ. ID NOS: 3 y 4).
El análisis de la secuencia de
CCK-2 reveló homología significativa con la región
transmembrana extracelular e intracelular del receptor
MCK-10, lo que indicó que era un miembro de la
familia de receptores MCK-10. La homología
compartida entre CCK-2 y MCK-10 se
representa en las Figuras 4A y 4B.
El análisis de hibridación de manchas de Northern
indicó que el mARN de MCK-10 se expresaba altamente
en linajes celulares de origen epitelial tumoral (Figura 5D). Como
contraste, se encontró que mARN de CCK-2 se
expresaba en tipos de células tales como fibroblastos (Figura 5D).
Los estudios de hibridación in situ comparativos revelaron un
modelo de expresión aún más definido en rebanadas de tejido. La
expresión de MCK-10 se restringió a subgrupos de
células epiteliales, en los que no se detectó señal de hibridación
de CCK-2, lo que era particularmente evidente en el
páncreas, en el que sólo presentaban expresión de
MCK-10 tipos de células endocrinas de los islotes de
Langerhans, pero no acini (fondos de saco excretores) exocrinos.
La distinta especificidad para tejidos de la
expresión de MCK-10 y CCK-2 se
confirmó y demostró aún más claramente en diversas secciones de
carcinomas humanos primarios. Ambos receptores se expresaron de una
manera aparentemente mutuamente exclusiva en diferentes tipos de
células del mismo tumor. El CCK-2 se encontró
principalmente en todas las células estromales, que proporcionan un
ambiente que conduce a proliferación, invasión e incluso metástasis
de células epiteliales, mientras que la expresión de
MCK-10 se confinó intensamente a las propias células
neoplásticas. Los distintos modelos de expresión para
MCK-10 y CCK-2 sugieren que estos
receptores estrechamente relacionados están implicados en
interacciones entre células epiteliales neoplásticas y estroma
circundante durante la progresión del tumor, y la presencia del
motivo de discoidina I en sus dominios extracelulares indica
intensamente un papel importante para estos receptores en procesos
implicados en comunicaciones célula-célula.
Según la invención, pueden usarse secuencias de
nucleótidos de CCK-2 que codifican
CCK-2, dominio de discoidina I extracelular o
dominio de tirosina quinasa extracelular de CCK-2 o
proteínas de fusión de CCK-2 para generar moléculas
de ADN recombinante que dirigen la expresión de proteína de
CCK-2 en células hospedantes apropiadas.
En otra realización de la invención, la secuencia
de CCK-2 puede ligarse a una secuencia heteróloga
para codificar una proteína de fusión. Por ejemplo, para examinar
genotecas de péptidos puede ser útil codificar una proteína de
CCK-2 quimérica que exprese un epítope heterólogo
que se reconozca por un anticuerpo disponible comercialmente.
También puede diseñarse una proteína de fusión para contener un
lugar de división situado entre la secuencia de
CCK-2 y la secuencia de proteína heteróloga, de modo
que el CCK-2 pueda dividirse fuera del resto
heterólogo.
En una realización alternativa de la invención,
se proporciona un polipéptido de CCK-2 aislado que
comprende:
(a) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4;
o
(b) una secuencia de aminoácidos consistente en
uno o más de los siguientes dominios de SEQ ID NO:4: el dominio de
discoidina I extracelular y el dominio de tirosina quinasa
intracelular, que podría sintetizarse usando métodos químicos muy
conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Caruthers et
al., 1980, Nuc. Acids Res. Symp. Ser.
7:215-233; Crea y Horn, 180, Nuc. Acids Res.
9(10):2331; Matteuci y Caruthers, 1980, Tetrahedron Letters
21:719; y Chow y Kempe, 1981, Nuc. Acids Res.
9(12):2807-2817. Alternativamente, podría
producirse la propia proteína usando métodos químicos para
sintetizar la secuencia de aminoácidos de CCK-2. Por
ejemplo, pueden sintetizarse péptidos mediante técnicas en fase
sólida, dividirse de la resina y purificarse por cromatografía
líquida de alta eficacia preparativa. (Véase, por ejemplo,
Creighton, 1983, Proteins Structures and Molecular Principles, W.H.
Freeman and Co., N.Y. págs. 50-60). La composición
de los péptidos sintéticos puede confirmarse por análisis o
determinación de secuencias de aminoácidos (por ejemplo, el
procedimiento de degradación de Edman; véase Creighton, 1983,
Proteins, Structures and Molecular Principles, W.H. Freeman and Co.,
N.Y., págs. 34-49.
Con el fin de expresar un CCK-2
biológicamente activo, se inserta la secuencia de nucleótidos que
codifica CCK-2 en un vector de expresión apropiado,
es decir, un vector que contenga los elementos necesarios para la
transcripción y traducción de la secuencia de codificación
insertada. Los productos génicos de CCK-2 así como
células hospedantes o linajes celulares transfectados o
transformados con vectores de expresión de CCK-2
recombinante pueden usarse para una variedad de fines. Éstos
incluyen, aunque sin limitarse a ellos, generar anticuerpos (es
decir, monoclonal o policlonal) que se unan al receptor, incluyendo
los que inhiben competitivamente la unión de ligando de
CCK-2 y "neutralizan" la actividad de
CCK-2 y examinar y seleccionar fármacos que actúen
mediante el receptor de CCK-2; etc.
Pueden usarse métodos que son muy conocidos por
los expertos en la técnica para construir vectores de expresión que
contengan la secuencia de codificación de CCK-2 y
señales de control de transcripción/traducción apropiadas. Estos
métodos incluyen técnicas de ADN recombinante in vitro,
técnicas sintéticas y recombinación in vivo/recombinación
genética. Véanse, por ejemplo, las técnicas descritas en Maniatis
et al., 1989, Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold
Spring Harbor Laboratory, N.Y. y Ausubel et al., 1989,
Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates
and Wiley Interscience, N.Y.
Puede utilizarse una variedad de sistemas de
hospedante-vector de expresión para expresar la
secuencia de codificación de CCK-2. Éstos incluyen,
aunque sin limitarse a ellos, microorganismos tales como bacterias
transformados con vectores de expresión de ADN bacteriófago, ADN
plásmido o ADN cósmido recombinantes que contienen la secuencia de
codificación de CCK-2; levadura transformada con
vectores de expresión de levadura recombinantes que contienen la
secuencia de codificación de CCK-2; sistemas de
células de insectos infectados con vectores de expresión de virus
recombinantes (por ejemplo, baculovirus) que contienen la
secuencia de codificación de CCK-2; sistemas de
células de plantas infectados con vectores de expresión de virus
recombinantes (por ejemplo, virus del mosaico de la coliflor, CaMV;
virus del mosaico del tabaco, TMV) o transformados con vectores de
expresión de plásmidos recombinantes (por ejemplo, plásmido Ti) que
contienen la secuencia de codificación de MCK-10; o
sistemas de células de animales. Los elementos de expresión de estos
sistemas varían en su fuerza y especificidades. Dependiendo del
sistema hospedante/vector utilizado, puede usarse en el vector de
expresión cualquiera entre un cierto número de elementos de
transcripción y traducción adecuados, incluyendo promotores
constitutivos e inducibles. Por ejemplo, cuando se clona en sistemas
bacterianos, pueden usarse promotores inducibles tales como pL de
bacteriófago \lambda, plac, ptrp, ptac (promotor híbrido de
ptrp-lac) y similares; cuando se clona en sistemas
de células de insectos, pueden usarse promotores tales como el
promotor polihedrina de baculovirus; cuando se clona en sistemas de
células de plantas, pueden usarse promotores derivados del genoma de
células de plantas (por ejemplo, promotores de golpe de calor; el
promotor para la pequeña subunidad de RUBISCO; el promotor para la
proteína de unión a/b de clorofila) o de virus de plantas (por
ejemplo, el promotor de 35S ARN de CaMV; el promotor de proteína de
revestimiento de TMV); cuando se clona en sistemas de células de
mamíferos, pueden usarse promotores derivados del genoma de células
de mamíferos (por ejemplo, promotor metalotioneina) o de virus de
mamíferos (por ejemplo, el promotor tardío de adenovirus; el
promotor de 7,5 K del virus de viruela); cuando se generan linajes
celulares que contienen copias múltiples del ADN de
CCK-2, pueden usarse vectores basados en SV40, BPV y
EBV con un marcador seleccionable apropiado.
En sistemas bacterianos, puede seleccionarse
ventajosamente un cierto número de vectores de expresión dependiendo
del uso pretendido para el CCK-2 expresado. Por
ejemplo, cuando han de producirse grandes cantidades de
CCK-2 para la generación de anticuerpos o para
examinar genotecas de péptidos, pueden ser deseables vectores que
dirigen la expresión de altos niveles de productos de proteínas de
fusión que se purifican fácilmente. Tales vectores incluyen, aunque
sin limitarse a ellos, el vector de expresión de E. coli
pUR278 (Ruther et al., 1983, EMBO J. 2:1791), en el que la
secuencia de codificación de MCK-10 puede ligarse al
vector enmarcado con la región de codificación de lac Z de manera
que se produce una proteína de AS-lac Z híbrida;
vectores pIN (Inouye & Inouye, 1985, Nucleic acids Res.
13:3101-3109; Van Heeke & Schuster, 1989, J.
Biol. Chem. 264:5503-5509); y similares. Pueden
usarse también vectores pGEX para expresar polipéptidos extraños
como proteínas de fusión con glutationa
S-transferasa (GST). En general, tales proteínas de
fusión son solubles y pueden purificarse fácilmente a partir de
células lisadas por adsorción en perlas de
glutationa-agarosa seguida por elución en presencia
de glutationa libre. Los vectores pGEX se diseñan para incluir
lugares de división de trombina o proteasa de factor Xa de manera
que pueda liberarse el polipéptido clonado de interés del resto de
GST.
En levadura, puede usarse un cierto número de
vectores que contienen promotores constitutivos o inducibles. Como
reseña, véase Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 2, 1988,
Red. Ausubel et al., Greene Publish. Assoc. & Wiley
Interscience, Cap. 13; Grant et al., 1987, Expression and
Secretion Vectors for Yeast, en Methods in Enzymology, Reds. Wu
& Grossman, 1987, Acad. Press, N.Y., Vol. 153, págs.
516-544; Glover, 1986, DNA Cloning, Vol. II, IRL
Press, Wash., D.C., Cap. 3; y Bitter, 1987, Heterologous Gene
Expression in Yeast, Methods in Enzymology, Reds. Berger &
Kimmel, Acad. Press, N.Y., Vol. 152, págs. 673-684;
y The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces, 1982, Reds.
Strathern et al., Cold Spring Harbor Press, Vols. I y II.
En los casos en que se usan vectores de expresión
de plantas, puede manejarse la expresión de la secuencia de
codificación de CCK-2 por cualquiera de un cierto
número de promotores. Por ejemplo, pueden usarse promotores víricos
tales como los promotores 35S ARN y 19S ARN de CaMV (Brisson et
al., 1984, Nature 310:511-514) o el promotor de
proteína de revestimiento de TMV (Takamatsu et al., 1987,
EMBO J. 6:307-311); alternativamente, pueden usarse
promotores de plantas tales como la pequeña subunidad de RUBISCO
(Coruzzi et al., 1984, EMBO J. 3:1671-1680;
Broglie et al., 1984, Science 224:838-843); o
promotores de golpe de calor, por ejemplo, hsp17.5-E
o hsp17.3-B de soja (Gurley et al., 1986,
Mol. Cell. Biol. 6:559-565). Estas construcciones
pueden introducirse en células de plantas usando plásmidos Ti,
plásmidos Ri, vectores de virus de plantas, transformación directa
de ADN, microinyección, electroporación, etc. Como reseñas de tales
técnicas, véanse, por ejemplo, Weissbach & Weissbach, 1988,
Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, NY, Sección
VIII, págs. 421-463; y Grierson & Corey, 1988,
Plant Molecular Biology, 2ª Ed., Blackie, Londres, Caps.
7-9.
Un sistema de expresión alternativo que podría
usarse para expresar CCK-2 es un sistema de
insectos. En un sistema tal, se usa como vector virus de
polihidrosis nuclear de Autographa californica (AcNPV) para
expresar genes extraños. El virus crece en células de Spodoptera
frugiperda. La secuencia de codificación de
CCK-2 puede clonarse en regiones no esenciales (por
ejemplo, el gen de polihedrina) del virus y ponerse bajo el control
de un promotor de AcNPV (por ejemplo, el promotor de polihedrina).
La inserción con éxito de la secuencia de codificación de
CCK-2 producirá inactivación del gen de polihedrina
y producción de virus recombinante no ocluido (es decir, virus que
carece del revestimiento proteínico codificado por el gen de
polihedrina). Estos virus recombinantes se usan después para
infectar células de Spodoptera frugiperda en las que se
expresa el gen insertado. (Por ejemplo, véase Smith et al.,
1983, J. Viol. 46:584; Smith, Patente de los EE.UU. Nº
4.215.051).
En células hospedantes de mamíferos, puede
utilizarse un cierto número de sistemas de expresión basados en
virus. En los casos en que se use un adenovirus como vector de
expresión, la secuencia de codificación de CCK-2
puede ligarse a un complejo de control de transcripción/traducción
de adenovirus, por ejemplo, el promotor tardío y la secuencia líder
tripartita. Este gen quimérico puede insertarse después en el genoma
del adenovirus por recombinación in vitro o in vivo.
La inserción en una región no esencial del genoma vírico (por
ejemplo, región E1 o E3) producirá un virus recombinante que es
viable y capaz de expresar CCK-2 en hospedantes
infectados. (Por ejemplo, véase Logan & Sheik, 1984, Proc. Natl.
Acad. Sci. (USA) 81:3655-3659). Alternativamente,
puede usarse el promotor de 7,5 K de la viruela. (Véase, por
ejemplo, Mackett et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA)
79:7415-7419; Mackett et al., 1984, J. Virol.
49:857-864; Panicalli et al., 1982, Proc.
Natl. Acad. Sci. 79:4927-4931).
Pueden requerirse también señales de iniciación
específicas para una traducción eficaz de secuencias de codificación
de CCK-2 insertadas. Estas señales incluyen el codón
de iniciación ATG y secuencias adyacentes. En los casos en que se
inserta el gen de CCK-2 completo, incluyendo su
propio codón de iniciación y secuencias adyacentes, en el vector de
expresión apropiado, pueden no necesitarse señales de control de
traducción. Sin embargo, en aquellos casos en los que sólo se
inserta una porción de la secuencia de codificación de
CCK-2, por ejemplo en los que la porción de
CCK-2 consiste en uno o más entre el dominio de
discoidina I extracelular y/o el dominio de tirosina quinasa
intracelular de la SEQ ID NO 4, deben proporcionarse secuencias de
nucleótidos que codifican tal dominio y secuencias complementarias
del mismo, señales de control de traducción exógenas, incluyendo el
codón de iniciación ATG. Además, el codón de iniciación debe estar
en fase con el marco de lectura de la secuencia de codificación de
CCK-2 para asegurar la traducción del inserto
completo. Estas señales de control de traducción exógenas y codones
de iniciación pueden ser de una variedad de orígenes, naturales y
sintéticos. La eficacia de expresión puede aumentarse por inclusión
de elementos mejoradores de transcripción apropiados, terminadores
de transcripción, etc. (véase Bittner et al., 1987, Methods
in Enzymol. 153:516-544).
Además, puede escogerse una cepa de células
hospedantes que module la expresión de las secuencias insertadas, o
modifique y elabore el producto génico de la manera específica
deseada. Tales modificaciones (por ejemplo, glicosilación) y
elaboración (por ejemplo, división) de productos proteínicos puede
ser importante para la función de la proteína. Diferentes células
hospedantes tienen mecanismos característicos y específicos para la
elaboración post-traducción y modificación de
proteínas. Pueden escogerse linajes celulares o sistemas de
hospedantes apropiados para asegurar la modificación y elaboración
correctas de la proteína extraña expresada. Con este fin, pueden
usarse células hospedantes eucariotas que posean la maquinaria
celular para la elaboración apropiada de la transcripción principal,
glicosilación y fosforilación del producto génico. Tales células
hospedantes de mamíferos incluyen, aunque sin limitarse a ellas,
CHO, VERO, BHK, HeLa, COS, MDCK, 293, WI38, etc.
Para la producción a largo plazo y con alto
rendimiento de proteínas recombinantes, se prefiere la expresión
estable. Por ejemplo, pueden diseñarse linajes celulares que
expresen establemente el CCK-2. Antes que usar
vectores de expresión que contienen orígenes víricos de replicación,
pueden transformarse células hospedantes con el ADN de
MCK-10 controlado por elementos de control de
expresión apropiados (por ejemplo, promotor, mejorador, secuencias,
terminadores de transcripción, lugares de poliadenilación, etc.) y
un marcador seleccionable. Tras la introducción de ADN extraño,
puede permitirse crecer células diseñadas durante
1-2 días en un medio enriquecido, y cambiarse
después a un medio selectivo. El marcador seleccionable en el
plásmido recombinante confiere resistencia a la selección y permite
a las células integrar establemente el plásmido en sus cromosomas y
crecer para formar focos que pueden clonarse y expandirse a su vez
en linajes celulares. Este método puede usarse ventajosamente para
diseñar linajes celulares que expresen el CCK-2 en
la superficie celular. Tales linajes celulares diseñados son
particularmente útiles para examinar fármacos que afecten a
CCK-2.
Puede usarse un cierto número de sistemas de
selección, incluyendo aunque sin limitarse a ellos los genes de
timidina quinasa del virus de herpes simples (Wigler et al.,
1977, Cell 11:223), hipoxantina-guanina
fosforribosiltransferasa (Szybalska & Szybalski, 1962, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 48:2026) y genes de adenina
fosforribosiltransferasa (Lowy et al., 1980, Cell 22:817)
pueden emplearse en células tk, hgprt o aprt, respectivamente.
También puede usarse resistencia antimetabolitos como base de
selección para genes de dhfr, que confiere resistencia a metotrexato
(Wigler et al., 1980, Natl. Acad. Sci. USA 77:3567; O'Hare
et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1527); gpt, que
confiere resistencia a ácido micofenólico (Mulligan & Berg,
1981), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2072); neo, que confiere
resistencia al aminoglicósido G-418
(Colberre-Garapin et al., 1981, J. Mol. Biol.
150:1) e hygro, que confiere resistencia a higromicina (Santerre
et al., 1984, Gene 30:147). Recientemente, se han descrito
genes seleccionables adicionales, a saber, trpB, que permite a las
células utilizar indol en lugar de triptófano; hisD, que permite a
las células utilizar histinol en lugar de histidina (Hartman &
Mulligan, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:8047) y ODC (ornitina
descarboxilasa) que confiere resistencia al inhibidor de ornitina
descarboxilasa,
2-(difluorometil)-DL-ornitina, DFMO
(McConlogue L., 1987, en: Current Communications in Molecular
Biology, red. Cold Spring. Harbor Laboratory).
En una realización de la invención, puede usarse
el receptor CCK-2 y/o linajes celulares que expresan
el receptor CCK-2 para examinar anticuerpos,
péptidos u otros ligandos que actúan como agonistas o antagonistas
del receptor CCK-2. Por ejemplo, un método para
examinar e identificar antagonistas o agonistas del polipéptido de
la presente invención comprende:
(a) poner en contacto el polipéptido con una
genoteca de péptidos aleatorios de tal modo que el polipéptido
reconozca y se una a una o más especies de péptidos dentro de la
genoteca;
(b) aislar la combinación
polipéptido/péptido;
(c) determinar la secuencia del péptido aislado
en la etapa (b); y
(d) determinar si el compuesto de ensayo modula
la actividad enzimática endógena del polipéptido, en el que un
polipéptido aislado comprende:
- (i)
- la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4; o
- (ii)
- una secuencia de aminoácidos consistente en uno o más de los siguientes dominios de SEQ ID NO: 4: el dominio de discoidina I extracelular y el dominio de tirosina quinasa intracelular.
Además, pueden usarse anticuerpos anti
CCK-2 para inhibir la función de
CCK-2. Alternativamente, puede ser útil el examen de
genotecas de péptidos con proteína de CCK-2 soluble
expresada recombinantemente o linajes celulares que expresan
proteína de CCK-2 para identificar moléculas
terapéuticas que funcionan modulando la actividad biológica de
CCK-2. Los usos del receptor MCK-10
y linajes celulares diseñados, descritos en las siguientes
subsecciones, pueden emplearse igualmente bien para la familia
MCK-10 de tirosina quinasas receptoras, incluyendo
CCK-2.
En una realización de la invención, pueden
utilizarse linajes celulares diseñados que expresan la región de
codificación de CCK-2 completa o su dominio de unión
de ligando para examinar e identificar antagonistas así como
agonistas de ligandos. Pueden examinarse de un cierto número de
formas compuestos sintéticos, productos naturales y otras fuentes de
materiales potencialmente activos biológicamente.
Pueden usarse genotecas de péptidos consistentes
en todas las combinaciones posibles de aminoácidos incorporados a un
soporte en fase sólida para identificar péptidos que sean capaces de
unirse al lugar de unión de ligando de un receptor dado u otros
dominios funcionales de un receptor tales como dominios de quinasa
(Lam, K.S. et al., 1991, Nature 354:82-84).
El examen de genotecas de péptidos puede tener valor terapéutico en
el descubrimiento de agentes farmacéuticos que actúen para inhibir
la actividad biológica de receptores a través de sus interacciones
con el receptor dado.
La identificación de moléculas que sean capaces
de unirse al CCK-2 puede conseguirse examinando una
genoteca de péptidos con proteína de CCK-2 soluble
recombinante. Se describen métodos para expresar y purificar
CCK-2 en las Secciones 5.3 y 5.3.1, y pueden usarse
para expresar CCK-2 de longitud completa
recombinante o el dominio de discoidina I extracelular o el dominio
de tirosina quinasa intracelular de CCK-2,
dependiendo de los dominios funcionales de interés.
Para identificar y aislar el péptido/soporte en
fase sólida que interactúa y forma un complejo con
CCK-2, es necesario marcar o "etiquetar" la
molécula de CCK-2. La proteína de
CCK-2 puede conjugarse a enzimas tales como
fosfatasa alcalina o peroxidasa de rábano picante o a otros
reactivos tales como marcas fluorescentes que pueden incluir
isotiocianato de fluoresceína (FITC), ficoeritrina (PE) o rodamina.
La conjugación de cualquier marca dada a CCK-2 puede
realizarse usando técnicas que son rutinarias en la técnica.
Alternativamente, pueden diseñarse vectores de expresión de
CCK-2 para expresar una proteína de
CCK-2 quimérica que contenga un epítope para el que
exista un anticuerpo disponible comercialmente. El anticuerpo
específico para el epítope puede etiquetarse usando métodos muy
conocidos en la técnica incluyendo marcado con enzimas, colorantes
fluorescentes o perlas coloreadas o magnéticas.
El conjugado de CCK-2
"etiquetado" se incuba con la genoteca de péptidos aleatorios
durante 30 minutos a una hora a 22ºC para permitir la formación de
complejo entre CCK-2 y especies de péptidos dentro
de la genoteca. Se lava después la genoteca para separar toda
proteína de CCK-2 no unida. Si se ha conjugado
CCK-2 a fosfatasa alcalina o peroxidasa de rábano
picante, se vierte la genoteca completa en una placa petri que
contenga sustratos para fosfatasa alcalina o peroxidasa, por
ejemplo, fosfato de
5-bromo-4-cloro-3-indoilo
(BCIP) o 3,3',4,4''-diaminobencidina (DAB),
respectivamente. Después de incubar durante varios minutos, el
complejo de péptido/fase
sólida-CCK-2 cambia de color, y
puede identificarse fácilmente y aislarse físicamente bajo un
microscopio de disección con un micromanipulador. Si se ha usado una
molécula de CCK-2 etiquetada fluorescente, pueden
aislarse complejos por elección activada fluorescente. Si se ha
usado una proteína de CCK-2 quimérica que expresa un
epítope heterólogo, la detección del complejo
péptido/MCK-10 puede conseguirse usando un
anticuerpo específico para el epítope marcado. Una vez aislado, la
identidad del péptido incorporado al soporte en fase sólida puede
determinarse por determinación de secuencia de péptido.
Además de usar moléculas de CCK-2
solubles, es posible detectar péptidos que se unan a receptores de
la superficie celular usando células intactas. Se prefiere el uso de
células intactas para utilizar con receptores que sean
multi-subunidades o lábiles o con receptores que
requieran el dominio de lípidos de la membrana celular para ser
funcionales. Se describen métodos para generar linajes celulares que
expresan CCK-2 en las Secciones 5.3 y 5.3.1. Las
células usadas en esta técnica pueden ser vivas o fijas. Las células
se incuban con la genoteca de péptidos aleatorios y se unen a
ciertos péptidos de la genoteca para formar una "roseta" entre
las células objetivo y el soporte en fase sólida/péptido pertinente.
La roseta puede aislarse a continuación por centrifugación
diferencial o separarse físicamente bajo un microscopio de
disección.
Como alternativa a ensayos de células completas
para receptores unidos a membrana o receptores que requieren el
dominio de lípidos de la membrana celular para ser funcionales, las
moléculas receptoras pueden reconstituirse en liposomas en los que
puede incorporarse la marca o "etiqueta".
Pueden usarse diversos procedimientos conocidos
en la técnica para la producción de anticuerpos para epítopes del
receptor CCK-2 producido recombinantemente. Tales
anticuerpos incluyen, aunque sin limitarse a ellos, policlonal,
monoclonal, quimérico, de cadena sencilla, fragmentos Fab y
fragmentos producidos por una genoteca de expresión de Fab. Se
prefieren especialmente para diagnóstico y terapéutica anticuerpos
neutralizantes, es decir, aquellos que compiten por el lugar de
unión de ligando del receptor.
Los anticuerpos monoclonales que se unen a
CCK-2 pueden marcarse radioactivamente, permitiendo
seguir su localización y distribución en el cuerpo tras la
inyección. Pueden usarse anticuerpos etiquetados con radioactividad
como herramienta de diagnóstico no invasiva para formar imagen de
células de tumores y metástasis de novo.
También pueden diseñarse inmunotoxinas con
agentes citotóxicos objetivo a lugares específicos en el cuerpo. Por
ejemplo, anticuerpos monoclonales específicos para
CCK-2 de alta afinidad pueden acomplejarse
covalentemente a toxinas bacterianas o de plantas, tales como toxina
de la difteria, abrina o ricina. Un método general de preparación de
anticuerpo/moléculas híbridas puede implicar el uso de
tiol-reactivos de reticulación tales como SPDP, que
atacan a los grupos amino primario del anticuerpo y, por intercambio
de disulfuro, incorporan la toxina al anticuerpo. Los anticuerpos
híbridos pueden usarse para eliminar específicamente células
tumorales que expresan CCK-2.
Para la producción de anticuerpos, pueden
inmunizarse diversos animales hospedantes por inyección con la
proteína de CCK-2, incluyendo, aunque sin limitarse
a ellos, conejos, ratones, ratas, etc. Pueden usarse diversos
coadyuvantes para aumentar la respuesta inmunológica, dependiendo de
la especie de hospedante, incluyendo, aunque sin limitarse a ellos,
Freund (completo e incompleto), geles minerales tales como hidróxido
de aluminio, sustancias tensioactivas tales como lisolecitina,
polioles plurónicos, polianiones, péptidos, emulsiones en aceite,
hemocianina de lapa ojo de cerradura, dinitrofenol y coadyuvantes
humanos potencialmente útiles tales como BCG (bacilos
Calmette-Guerin) y Corynebacterium
parvum.
Pueden prepararse anticuerpos monoclonales para
CCK-2 usando cualquier técnica que proporcione la
producción de moléculas de anticuerpo por linajes celulares
continuos en cultivo. Éstas incluyen, aunque sin limitarse a ellas,
la técnica de hibridoma descrita originalmente por Kohler y Milstein
(Nature, 1975, 256:495-497), la técnica de hibridoma
de células B humanas (Kosbor et al., 1983, Immunology Today,
4:72; Cote et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci.,
80:2026-2030) y la técnica de
EBV-hibridoma (Cole et al., 1985, Monoclonal
Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., págs.
77-96). Además, pueden usarse técnicas desarrolladas
para la producción de "anticuerpos quiméricos" (Morrison et
al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci., 81:6851-6855;
Neuberger et al., 1984, Nature, 312:604-608;
Takeda et al., 1985, Nature, 314:452-454)
empalmando los genes a partir de una molécula de anticuerpo de ratón
de especificidad para antígeno apropiada junto con genes de una
molécula de anticuerpo humano de actividad biológica apropiada.
Alternativamente, pueden adaptarse técnicas descritas para la
producción de anticuerpos de cadena sencilla (Patente de los EE.UU.
Nº 4.946.778) para producir anticuerpos de cadena sencilla
específicos para MCK-10.
Pueden generarse por técnicas conocidas
fragmentos de anticuerpos que contienen lugares de unión específicos
de CCK-2. Por ejemplo, tales fragmentos incluyen,
aunque sin limitarse a ellos: los fragmentos F(ab')_{2} que
pueden producirse por digestión con pepsina de la molécula de
anticuerpo y los fragmentos Fab que pueden generarse reduciendo los
puentes disulfuro de los fragmentos F(ab')_{2}.
Alternativamente, pueden construirse genotecas de expresión de Fab
(Huse et al., 1989, Science, 246:1275-1281)
para permitir una identificación rápida y fácil de fragmentos Fab
monoclonales con la especificidad deseada para
MCK-10.
La secuencia de codificación de
CCK-2 puede usarse con fines de diagnóstico para
detectar la expresión de CCK-2. Se incluye en el
alcance de la invención un oligonucleótido que codifica una
secuencia antisentido complementaria de la secuencia de nucleótidos
aislada de la presente invención, en la que la molécula de ácido
nucleico aislada comprende:
(a) una secuencia de nucleótidos que codifica un
polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:
4;
(b) una secuencia de nucleótidos complementaria
de la secuencia de nucleótidos de (a);
(c) una secuencia de nucleótidos que codifica uno
o más de los siguientes dominios de SEQ ID NO: 4: el dominio de
discoidina I extracelular y el dominio de tirosina quinasa
intracelular; o
(d) una secuencia de nucleótidos complementaria
de la secuencia de nucleótidos de (c);
y en el que dicho oligonucleótido inhibe la
traducción de la secuencia de nucleótidos en una célula. Además, la
presente invención incluye oligonucleótidos, que se han descrito
anteriormente y que son complementarios de la secuencia de
nucleótidos que codifica la región aminoterminal de la secuencia de
la molécula de ácido nucleico aislada de la presente invención.
También dentro del alcance cde la invención hay
secuencias de oligorribonucleótidos, que incluyen ARN
anti-sentido y moléculas de ADN complementarias de
la molécula de ácido nucleico aislada que comprenden:
(a) una secuencia de nucleótidos que codifica un
polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:
4;
(b) una secuencia de nucleótidos complementaria
de la secuencia de nucleótidos de (a);
(c) una secuencia de nucleótidos que codifica uno
o más de los siguientes dominios de SEQ ID NO: 4: el dominio de
discoidina I extracelular y el dominio de tirosina quinasa
intracelular; o
(d) una secuencia de nucleótidos complementaria
de la secuencia de nucleótidos de (c);
que funcionan inhibiendo la traducción de mARN de
CCK-2. El ARN anti-sentido y las
moléculas de ADN actúan bloqueando directamente la traducción de
mARN uniéndose a mARN fijado como objetivo y previniendo la
traducción de proteína.
El ARN anti-sentido y las
moléculas de ADN de la invención pueden prepararse por cualquier
método conocido en la técnica para la síntesis de moléculas de ARN.
Éstas incluyen técnicas para sintetizar químicamente
oligodesoxirribonucleótidos muy conocidas en la técnica tales como,
por ejemplo, síntesis química de fósforoamidita en fase sólida.
Alternativamente, pueden generarse moléculas de ARN por
transcripción in vitro e in vivo de secuencias de ADN
que codifican la molécula de ARN antisentido. Tales secuencias de
ADN pueden incorporarse a una amplia variedad de vectores que
incorporan promotores de polimerasa de ARN adecuados tales como los
promotores de polimerasa T7 o SP6. Alternativamente, pueden
introducirse establemente en linajes celulares construcciones de
cADN antisentido que sintetizan ARN antisentido constitutiva o
induciblemente, dependiendo del promotor usado.
Pueden introducirse diversas modificaciones a las
moléculas de ADN como medio para aumentar la estabilidad
intracelular y la vida media. Las modificaciones posibles incluyen,
aunque sin limitarse a ellas, la adición de secuencias flanqueantes
de ribo-o desoxi-nucleótidos a los
extremos 5' y/o 3' de la molécula o el uso de fósforotioato o 2'
O-metilo en lugar de enlaces fosfodiesterasa dentro
de la cadena principal de oligodesoxirribonucleótido.
Los siguientes ejemplos que se refieren a
MCK-10 no se pretende que formen parte de la
presente invención y son sólo con fines comparativos.
La siguiente subsección describe el aislamiento y
caracterización de clones de un cADN que codifican la tirosina
quinasa receptora denominada MCK-10 e isoformas
empalmadas diferencialmente de MCK-10.
Se lisaron placas confluentes del linaje celular
de cáncer de pecho humano MCF7 (American Type Culture Collection
HTB22) por tratamiento con tiocianato de guanidinio según Chirgwin
et al. (1979, Biochemistry 18:5294-5299). Se
aisló ARN total por centrifugación con gradiente de CsCl. Se
sintetizó cADN de primera cadena a partir de 20 \mug de ARN total
con transcriptasa inversa de virus de la mieloblastosis de aves
(AMV) (Boehringer Mannheim).
Se usó el cADN en una reacción en cadena de
polimerasa en condiciones estándares (PCR
Technology-Principles and Applications for DNA
Amplifications, H.E. Erlich, red., Stockton Press, Nueva York
1989). Se usó para la multiplicación la siguiente agrupación de
cebadores:
Correspondiente a la secuencia de aminoácidos
HRDLAA
Correspondiente a la secuencia de aminoácidos
SDVWS F/Y
Se realizaron treinta y cinco ciclos de PCR
usando 8 \mug (0,8 \mug) de los cebadores agrupados.
(Reasociación 55ºC, 1 min; Extensión 72ºC, 2 min; Desnaturalización
94ºC, 1 min). El producto de reacción se sometió a electroforesis en
gel de poliacrilamida. Se aislaron fragmentos del tamaño esperado
(\sim210 pb), se digirieron con la enzima de restricción EcoRI y
se subclonaron en el vector pBluescript (Stratagene) usando
técnicas estándares (Current Protocols in Molecular Biology,
reds. F.M. Ausubel et al., John Wiley & Sons, Nueva York,
1988).
Los plásmidos recombinantes se transformaron en
la cepa de E. coli competente denominada 298.
Se determinó la secuencia de los productos de PCR
subclonados por el método de Sanger et al. (Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 74, 5463-5467) usando Sequenase (United
States Biochemical, Cleveland, Ohio 44111 EE.UU.). Un clon,
denominado MCK-10, se identificó como nueva RTK.
La secuencia de cADN parcial de la nueva RTK
MCK-10, que se identificó por PCR, se usó para
examinar una genoteca \lambdagt11 de cADN de cerebro fetal humano
(Clontech) (complejidad de 1x10^{10} fagos recombinantes). Se
pusieron en placa un millón de clones de fagos independientes y se
transfirieron a filtros de nitrocelulosa siguiendo procedimientos
estándares (Sambrook, H.J., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor
Laboratory Press, EE.UU., 1989). Los filtros se hibridaron con el
fragmento de EcoRI/EcoRI del clon MCK-10, que se
había marcado radioactivamente usando 50 \muCi
[\alpha^{32}P]ATP y el juego de marcado de ADN cebado
aleatoriamente (Boehringer Mannheim). El inserto de cADN más largo
(8) de \sim3500 pb se digirió con las enzimas de restricción
EcoRI/SacI para obtener una sonda de extremo 5' de \sim250 pb.
Esta sonda se usó para reexaminar la genoteca de cerebro fetal
humano y se aislaron varios clones solapantes. El cuerpo compuesto
de los clones de cADN se muestra en las Figuras 1A, 1B y 1C. Algunos
de los clones tenían una supresión de 6 aminoácidos en posición 2315
de la secuencia de MCK-10.
Los 1,75 millones de clones de fagos
independientes de una genoteca de placenta humana, \lambdaZAP, se
pusieron en placa y examinaron con la sonda de extremo 5'
(EcoRI/SacI) del clon 8. Dos clones eran de longitud completa con un
extremo 5' más corto partiendo en posición 278 de la secuencia de
nucleótidos mostrada en las Figuras 1A, 1B y 1C. La subclonación de
clones de bacteriófagos positivos en el vector pBluescript se hizo
por el protocolo de excisión in vivo (Stratagene).
La secuencia de cADN compuesta y la secuencia de
aminoácidos predicha de MCK-10 se muestran en las
Figuras 1A, 1B y 1C. En la Figura 2A se presentan diferentes
variaciones de secuencias de cADN de MCK-10.
Se aisló ARN total de los siguientes tejidos
humanos: pulmón, páncreas, estómago, riñón, bazo, hígado, colon y
placenta. Se aisló también ARN de diversos linajes celulares de
cáncer de pecho y linajes celulares de origen tumoral.
Se aisló poliA^{+} ARN en una columna de oligo
(dT) (Aviv y Leder, 1972, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69,
1408-1412). El ARN se separó en un gel de agarosa
que contenía formaldehído 2,2 M y se manchó con él un filtro de
nitrocelulosa (Schleicher y Schuell). Se cargaron por pista 3 \mug
de poliA^{+} ARN. Se hibridaron los filtros con un fragmento de
EcoRI marcado con ^{32}P/EcoRI ADN obtenido por PCR o mediante un
fragmento de cADN de 1694 pb de
MC-K-10-2
(excluyendo el inserto de 111 pb) que abarca el dominio
extracelular, transmembrana y yuxtamembrana. A continuación, se
expuso el filtro a película de rayos X a -70ºC con una pantalla
intensificante. Los resultados se representan en las Figuras 5A, 5B
y 5C.
Se generaron antisueros contra péptidos
sintéticos correspondientes a la secuencia de aminoácidos de
MCK-10-2. Se generaron antisueros
\alphaMCK-10-N contra el siguiente
péptido N-terminal situado entre los aminoácidos
26-42:
H-F-D-P-A-K-D-C-R-Y-A-L-G-M-Q-D-R-T-I.
Se generaron antisueros
\alphaMCK-10-c contra el siguiente
péptido C-terminal situado entre los aminoácidos
902-919:
R-P-P-F-S-Q-L-H-R-F-L-A-E-D-A-L-N-T-V:
Se generaron antisueros
\alphaMCK-10-\beta contra el
siguiente péptido cerca del lugar de elaboración de la subunidad
\beta de MCK-10 situado entre los aminoácidos
309-322:
P-A-M-A-W-E-G-E-P-M-R-H-N-L.
Se generaron antisueros
\alphaMCK-10-C2 contra el péptido
C-terminal situado entre los aminoácidos
893-909:
C-W-S-R-E-S-E-Q-R-P-P-F-S-Q-L-H-R.
Se acoplaron péptidos a hemocianina de lapa ojo
de cerradura e inyectaron con coadyuvante de Freund en conejos
Chinchilla. Después del segundo aumento, se sangraron los conejos y
se ensayaron los antisueros en inmunoprecipitaciones usando lisados
de células 293 que sobreexpresaban transitoriamente
MCK-10-1 y
MCK-10-2.
Las muestras se cargaron en un gel de
poliacrilamida del 7,5% y se transfirieron después de electroforesis
a un filtro de nitrocelulosa (Schleicher y Schuell). Se sondó la
mancha con diferentes anticuerpos como antes y se reveló usando el
sistema de detección de manchas de Western ECL según las
instrucciones del fabricante (Amersham Internacional Nº de cat. RPN
2108, R.U.).
Se subclonó el fragmento de cADN situado 5'
correspondiente a los nucleótidos 278-1983 del clon
MCK-10-2, excluyendo el inserto de
111 pares de bases, en el bluescript SK+ (Stratagene). Para
hibridación in situ, se preparó una sonda de ADN antisentido
de cadena sencilla como se describe por Schnürch y Risau
(Development 1991, 111, 1143-1154). El plásmido se
linealizó en el extremo 3' del cADN y se sintetizó un transcripto
sentido usando polimerasa de ARN SP6 (Boehringer). El ADN se degradó
usando DNasa (preparación exenta de RNasa, Boehringer Mannheim). Con
el transcripto, se realizó una síntesis de cADN cebado
aleatoriamente con \alpha-^{35}S ATP (Amersham)
por transcripción inversa con transcriptasa inversa de MMLV (BRL).
Para obtener pequeños fragmentos de cADN de aproximadamente 100 pb
como media, adecuados para hibridación in situ, se usó un
exceso elevado de cebador. A continuación, el transcripto de ARN se
hidrolizó parcialmente en NaOH 100 nM durante 20 min a 70ºC, y la
sonda se neutralizó con la misma cantidad de HCl y se purificó con
una columna de Sephadex-G50. Después de precipitar
en etanol, se disolvió la sonda con una actividad específica final
de 5x10^{5} cpm. Para hibridación testigo, se preparó una sonda
sentido usando el mismo método.
El seccionamiento, la
post-fijación y la hibridación se realizaron
esencialmente según Hogan et al. (1986, Manipulating the
Mouse Embryo: A Laboratory Manual, Nueva York, Cold Spring Harbor
Laboratory Press). Se cortaron secciones de 10 \mum de espesor a
-18ºC en un criostato Leitz. Para tratamiento de hibridación, no se
realizó incubación con HCl 0,2 M para separar las proteínas básicas.
Se incubaron secciones con la sonda de ^{35}S-cADN
(5x10^{4} cpm/\mul) a 52ºC en un tampón que contenía 50% de
formamida, NaCl 300 mM, Tris.HCl 10 mM, NaPO_{4} 10 mM (pH 6,8),
EDTA 5 mM, 2% de Ficoll 400, 0,2% de polivinilpirrolidona, 0,02% de
BSA, 10 mg/ml de ARN de levadura, 10% de sulfato de dextrano y DTT
10 mM. El lavado post-hibridación se hizo con alta
rigurosidad (50% de formamida, NaCl 300 mM, Tris-HCl
10 mM, NaPO_{4} 10 mM (pH 6,8), EDTA 5 mM, DTT 10 mM a 52ºC).
Para autorradiografía, se crearon platinas con emulsión de película
Kodak NTB2 y se expusieron durante ocho a diez días. Después de
revelar, se colorearon de contraste con azul de toluidina.
Para identificar nuevas tirosina quinasas
receptoras (RTKs) que se expresan en linajes celulares de carcinomas
mamarios, los inventores usaron la reacción en cadena de polimerasa
en combinación con dos agrupamientos de cebadores de
oligonucleótidos degenerados basados en secuencias altamente
conservadas dentro del dominio de quinasa de RTKs, correspondientes
a la secuencia de aminoácidos HRDLAA (cebador sentido) y SDVWS/FY
(cebador antisentido) (Hanks et al. 1988, Science 241,
42-52), conjuntamente con cADN sintetizado por
transcripción inversa de poli A ARN del linaje celular de carcinoma
mamario humano MCF7. Se identificó una nueva RTK, denominada
MCK-10 (quinasa de carcinoma mamario 10), que dentro
del dominio de tirosina quinasa presentaba similitud de secuencia
extensiva con la familia de receptores de insulina. El fragmento de
PCR se usó para examinar una genoteca lambda gt11 de cADN de cerebro
fetal humano (Clontech). Se identificaron varios clones solapantes y
su secuencia compuesta se muestra en las Figuras 1A, 1B y 1C.
Además, el examen de una genoteca de placenta humana produjo dos
clones de cADN que codificaban la proteína de MCK-10
completa pero cuya secuencia de nucleótidos 5' comenzaba en el
nucleótido 278 de la secuencia mostrada en la Figura 1. El
análisisis de secuencias de los dos clones reveló una identidad
completa con la excepción de 111 nucleótidos adicionales dentro del
dominio yuxtamembrana, entre los nucleótidos 1832 y 1943. Uno de los
clones aislados de la genoteca de cerebro fetal humano contenía 18
nucleótidos adicionales en el dominio de tirosina quinasa. Estas
secuencias estaban enmarcadas con el marco de lectura abierto de
MCK-10 y no contenían ningún codón de detención. Se
denominaron a estas isoformas de empalme de MCK-10
MCK-10-1 (con los 111 pb
adicionales), MCK-10-2 (sin ninguna
inserción), MCK-10-3 (con los 111 pb
y 18 pb adicionales) y MCK-10-4 (con
los 18 pb adicionales). Esta nueva tirosina quinasa receptora se ha
descrito recientemente por Johnson et al. (1993, Proc. Natl.
ZAcad. Sci. USA, 90, 5677-5681) como DDR.
Como se muestra en la Figura 1, la
MCK-10 tiene todas las características de una PTK
receptora: el codón de iniciación es seguido por una extensión de
aminoácidos esencialmente hidrófobos, que pueden servir como péptido
señal. Los aminoácidos 418-439 son también de
naturaleza hidrófoba con las características de una región
transmembrana. El dominio extracelular abarca 4 lugares de
N-glicosilación de consenso (AsnXSer/Thr) y 7
residuos de cisterna. La región extracelular es más corta que la de
la familia de receptores de insulina y no muestra homología con
otras tirosina quinasas receptoras, pero contiene cerca del término
N las secuencias de consenso para la familia de tipo discoidina 1
(Poole et al. 1981, J. Mol. Biol. 153,
273-289), que están situadas como repeticiones en
tándem en MGP y BA46, dos proteínas de membrana de glóbulos de grasa
de leche (Stubbs et al. 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87,
8417-8421, Larocca et al. 1991, Cancer Res.
51, 4994-4998), en las cadenas ligeras de factor V
(Kane et al. 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83,
6800-6804) y VIII (Toole et al. 1984, Nature,
312, 342-347) y en la proteína A5 (Takagi et
al. 1987, Dev. Biol., 122, 90-100).
La cadena principal de proteína de prorreceptores
de MCK-10-1 y
MCK-10-2, con pesos moleculares
predichos de 101,13 y 97,17 kD, respectivamente, puede subdividirse
así en una subunidad \alpha de 34,31 kD y una subunidad \beta de
66,84 kD y una de 62,88 kD, respectivamente, que contienen la
homología de tirosina quinasa y lugares de empalme alternativos.
La secuencia de consenso para el motivo de unión
de ATP está situada en posiciones 617-627 (Figuras
1A, 1B y 1C). Cuando se compara con otras quinasas, el dominio de
unión de ATP tiene 176 aminoácidos (incluyendo los 37 aminoácidos
adicionales) adicionales del dominio transmembrana que cualquier
otra tirosina quinasa. Los 37 aminoácidos adicionales están situados
en la región yuxtamembrana larga y rica en prolina/glicina y
contienen una secuencia NPAY (en la que A puede intercambiarse por
cualquier aminoácido), que se encuentra en dominios citoplásmicos de
varias proteínas de la superficie celular, incluyendo RTKs de las
familias receptoras de EGF e insulina (Chen et al. 1990, J.
Biol. Chem., 265, 3116-3123). Este motivo de
consenso es seguido por la secuencia TYAXPXXXPG, que se repite aguas
abajo en MCK-10 en el dominio yuxtamembrana en
posiciones 585-595. Se ha mostrado recientemente que
este motivo está suprimido en la región yuxtamembrana citoplásmica
del receptor de activina, una serina/treonina quinasa, produciendo
una afinidad de unión de ligando reducida (Attisano et al.
1992, Cell, 68, 97-108).
En comparación con otras RTKs, el dominio
catalítico muestra la más alta homología con el receptor TrkA. Los
motivos yy- (posición 802/803) y la tirosina en posición 798, que
representan lugares de autofosforilación putativos, caracterizan a
MCK-10 como miembro de la familia de receptores de
insulina (Figuras 1A, 1B y 1C). Finalmente, MCK-10
comparte con las Trk quinasas su característica cola corta
carboxi-terminal de 9 aminoácidos.
Para determinar si los 111 nucleótidos
adicionales presentes en MCK-10-1 y
-3 se expresaban ubicuamente o se expresaban sólo en tejidos humanos
específicos, se realizó PCR en diferentes cADNs humanos usando
cebadores de oligonucleótidos correspondientes a secuencias que
flanqueaban el lugar de inserción. Se realizaron multiplicaciones de
PCR paralelas en ADNs plásmidos de
MCK-10-1/MCK-10-2
como testigos. La expresión de ambas isoformas se identificó en
cerebro, páncreas, placenta, colon y riñón, y en los linajes
celulares Caki-2 (ca de riñón), SW48 (ca de colon) y
HBL-100 y T-47D (ca de pecho). Los
productos de PCR se subclonaron en el vector Bluescript para
confirmar la secuencia de nucleótidos.
Usando como sonda de hibridación un fragmento de
cADN de 1694 pb 5' de MCK-10 (excluyendo el inserto
de 111 pares de bases), que abarca los dominios extracelular,
transmembrana y yuxtamembrana, el gen de MCK-10
reveló la existencia de tamaños de transcriptos múltiples, con una
forma principal de 4,3 kb. La mayor expresión de mARN de
MCK-10 se detectó en el pulmón, se encontraron
niveles intermedios en el riñón, colon, estómago, placenta y
cerebro, niveles bajos en el páncreas, y no se detectó mARN de
MCK-10 en el hígado (FIG. 5A). Se detectó también
mARN de MCK-10 en una variedad de diferentes linajes
celulares de tumores como se representa en la Figura 5B y en la
Figura 5C. Se realizó análisis de manchas de Northern con el gen de
GAPDH como testigo.
Para determinar qué células en los diferentes
tejidos humanos contienen transcriptos de MCK-10, se
realizó hibridación in situ de diversos tejidos humanos y de
tejidos de diferentes tumores. Los análisis de hibridación con los
1694 pb 5' de MCK-10 (excluyendo el inserto de 111
pares de bases) indicaron que se detectaba específicamente expresión
de MCK-10 en células epiteliales de diversos
tejidos:
\bullet células epiteliales cuboidales que
revisten el túbulo renal distal
\bullet células epiteliales columnares que
revisten el tracto del intestino grueso
\bullet capa profunda de células epiteliales
que revisten el estómago
\bullet células epiteliales que revisten los
conductos mamarios
\bullet células de islotes del páncreas
\bullet células epiteliales de la glándula
tiroides, que produce hormonas tiroideas
No se observó expresión detectable de
MCK-10 en tejidos conectivos, células endoteliales,
adipocitos, células musculares o células hemopoyéticas.
La expresión de MCK-10 se detectó
también en todos los tumores investigados, que incluían:
\bullet adenocarcinoma del colon
\bullet adenocarcinoma del estómago
\bullet adenocarcinoma del pulmón
\bullet carcinoma conductal infiltrante del
pecho
\bullet cistadenoma del ovario
\bullet tumor multi endocrino del páncreas
\bullet tumor carcinoide del páncreas
\bullet células tubulares de carcinoma de
células renales
\bullet carcinoma de células transicionales (un
tumor epitelial maligno de la vejiga)
\bullet tumor meningiotelial
\bullet meduloblastoma con núcleos atípicos
hipercromáticos y citoplasma suplementario (sólo se ve expresión de
MCK-10 en células con citoplasma bien
desarrollado)
\bullet glioblastoma (un tumor del tejido
neuroepitelial)
Estos experimentos de hibridación in situ
revelaron la más alta expresión de MCK-10 en células
malignas del carcinoma de pecho conductal, en las células tumorales
de un tumor multi-endocrino y en las células
tumorales de un carcinoma de células transicionales de la
vejiga).
Para analizar con detalle la proteína de
MCK-10, se usó el sistema de células 293 para
sobreexpresión transitoria. Los cADNs de
MCK-10-1 y
MCK-10-2 se clonaron en un vector de
expresión. Se transfectaron células por duplicado con las dos
variantes de empalme o un plásmido testigo y se subalimentaron
durante la noche. Una parte se incubó antes de la lisis con
ortovanadato sódico 1 mM durante 90 min. Se sabe que este agente es
un inhibidor potente de fosfotirosina fosfatasas, aumentando por
ello la fosforilación con tirosina de una proteína celular.
El precursor y la subunidad \beta de
MCK-10 mostraron fuerte fosforilación con tirosina
después del tratamiento con ortovanadato (Fig. 6A, panel izquierdo).
Sorprendentemente, el MCK-10-1, que
contiene la inserción de 37 aminoácidos, presentaba menor actividad
de quinasa que MCK-10-2. El resondar
la misma mancha con un anticuerpo péptido generado contra el término
C de MCK-10 reveló cantidades iguales de receptor
expresado y un ligero cambio del precursor y la subunidad \beta de
MCK-10 debido a los 37 aminoácidos adicionales de la
inserción (FIG. 6A, panel derecho).
Se analizó adicionalmente la glicosilación
N-enlazada de las variantes de empalme. Se trataron
células transfectadas durante la noche con tunicamicina, que inhibe
la maduración de proteínas por glicosilación. Se usaron dos
anticuerpos purificados por afinidad generados contra secuencia de
péptidos de término N y C, respectivamente, de
MCK-10 para inmunoprecipitaciones subsiguientes.
Ambos anticuerpos precipitaron los polipéptidos de 101 kD o 97 kD
predichos de células tratadas con tunicamicina (FIG. 6B). De manera
interesante, el tamaño de las formas totalmente glicosiladas de
MCK-10-1 y
MCK-10-2 sugirió que este último
estaba glicosilado más extensamente que la forma de empalme
alternativa putativa.
En resumen, los experimentos de sobreexpresión
transitoria demuestran efectos significativos de la inserción de 37
aminoácidos en la función del receptor. La actividad de quinasa
receptora y la glicosilación extracelular parecían ser afectadas
significativamente por las secuencias adicionales presentes en
MCK-10-1, que pueden influir en la
unión de ligando. Aunque la fosforilación con tirosina inducida por
ortovanadato se redujo para la forma de 124 kD así como para el
producto de división de 63 kD, representando posiblemente una
subunidad \beta, el receptor de tipo
MCK-10-1 era sorprendentemente
glicosilado menos extensamente que la isoforma
MCK-10-2, lo que produjo un peso
molecular aparente aproximadamente igual para las formas maduras de
ambas variantes. Este último fenómeno puede ser mediado por alguno o
todos los motivos de unión de proteína, y puede conducir, mediante
la interacción con componentes citoesqueléticos para los que se ha
sugerido la implicación de dominios de NXXY y SH3 (Reszka et
al. 1992, J. Cell. Biol. 117:1321-1330;
Musacchio et al., 1992, cartas FEBS
307:55-61), a elección diferencial, modificación e
incluso posiblemente localización celular. Además, las diferencias
resultantes en el modelo de modificación de cadenas secundarias de
hidratos de carbono extracelulares puede afectar a la unión de
ligandos y, por tanto, a la autofosforilación de formas de empalme
alternativas de MCK-10.
Una diversidad potencialmente aún mayor de
productos génicos de MCK-10 que se sugería por los
resultados de clonación de cADN se hizo evidente mediante el
análisis de inmunomanchas de linajes celulares de tumores humanos,
que indicaban diferencias cuantitativas y cualitativas
características de linajes celulares. La complejidad del modelo de
expresión revelada por el anticuerpo de
MCK-10-N específica para el dominio
extracelular puede ser el resultado de glicosilación diferencial o
de la existencia de variantes de empalme alternativas adicionales o
de ambas. Esta complejidad destacable de isoformas de
MCK-10 en células tumorales conjuntamente con la
presencia de un dominio de discoidina I potencialmente implicado en
adhesión de células, y la posibilidad de conexiones mediadas por
proteína SH3 con el citoesqueleto sugiere un papel regulado
intrincadamente de MCK-10 en interacción
célula-célula y posiblemente invasión o metástasis
de tumores. De manera interesante, la división del dominio
extracelular de MCK-10 en la secuencia de consenso
RXRR, produciendo una subunidad \alpha de 54 kD soluble con
propiedades de adhesión putativas debidas a la presencia del dominio
tipo discoidina I puede representar otro mecanismo regulador en la
progresión de tumores, cuando las células cancerosas se adhieren a,
así como se separan de, la matriz extracelular. Se ha mostrado una
elaboración post-traducción similar por división de
endoproteasa para moléculas de adhesión de células tales como
Ng-CAM (Burgoon et al., 1992, J. Cell Biol.
112:1017-1029) y para las fosfatasas receptoras
PTP\mu y PTP\kappa, que median en interacciones intercelulares
hemofílicas (Brady-Kalnay et al., 1993, J.
Cell Biol. 122:961-972; Jiang et al., 1993,
Mol. Cell Biol. 13:2942-2951; Sap et al.,
1994, Mol. Cell Biol. 14:1-9).
La siguiente subsección describe métodos para
aislamiento y caracterización del gen de CCK-2, un
miembro adicional de la familia de genes de tirosina quinasa
receptora.
Se sintetizó cADN usando transcriptasa inversa de
virus de la mieloblastosis de aves y 5 \mug de poli A^{+} ARN
preparado a partir de tejido de un adenocarcinoma colónico primario,
colon sigmoide, grado II moderadamente bien diferenciado, fase pT3,
pN1, separado de una hembra blanca de 69 años de edad de sangre tipo
0 Rh positivo. La paciente no había recibido terapia.
El tejido se picó y lisó por tratamiento con
tiocianato de guanidinio según Chirgwin, J.M. et al. (1979,
Biochemistry 18:5294-5299). Se aisló ARN total por
extracción con tiocianato de
guanidinio-fenol-cloroformo
(Chomczyrski et al. 1987, Anal. Biochem.
162:156-159). Se aisló poli A^{+} ARN en una
columna de oligo-dT (Aviv y Leder, 1972, Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 69:1408-1412).
Un décimo del cADN se sometió a la reacción en
cadena de polimerasa usando condiciones estándares (PCR
Technology-Principles and Applications for DNA
Amplifications, H.E. Erlich, red. Stockton Press, Nueva York, 1989)
y el mismo agrupamiento de cebadores usados para multiplicación de
MCK-10 (véase Sección 6.1.1, página 26 líneas 31 a
final, página 27, de inicio a línea 4. Se realizaron treinta y cinco
ciclos (reasociación 55ºC, 1 min; extensión 72ºC, 2 min:
desnaturalización 94ºC, 1 min). Los productos de reacción se
sometieron a electroforesis en gel de poliacrilamida. Se aislaron
fragmentos del tamaño esperado, se digirieron con la enzima de
restricción EcoRI y se subclonaron en vector pBluescript
(Stratagene) usando técnicas estándares (Current Protocols in
Molecules Biology, reds. M. Ausubel et al., John Wiley &
Sons, Nueva York, 1988). Se determinó la secuencia de los productos
de PCR subclonados por el método de Sanger et al. (1977,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467) usando
polimerasa T7 (Boehringer Mannheim).
El fragmento de PCR de CCK-2 se
usó para examinar una genoteca de placenta humana en lambda ZAP. El
inserto de cADN más largo, \sim1300 pb, se digirió con las enzimas
de restricción EcoRI/Ncol para obtener una sonda de extremo 5' de
200 pb. El reexamen de la genoteca de placenta humana produjo un
clon de cADN que codificaba la proteína de CCK-2
completa (la subclonación de clones de bacteriófagos positivos en
vector pBluescript se hizo por el protocolo de excisión in
vivo (Stratagene)). La secuencia de ADN y la secuencia de
aminoácidos deducida de CCK-2 se muestra en la
Figura 3.
Los 1260 pb de CCK-2 situados 5'
se subclonaron en el vector pBluescript SK^{+} (pBSK^{+};
Stratagene). Para análisis de manchas de Northern, se preparó la
sonda marcando el fragmento de cADN con
\alpha-^{32}PdATP usando un juego de cebado de
hexanucleótidos aleatorios (United States Biochemical) y se purificó
con columna de Sephadex-G50.
Para hibridación in situ, se prepararon
sondas de ADN antisentido de cadena sencilla como se describe por
Schnürch & Risau (1991 Development
111:1143-1154). El plásmido de CCK-2
pBSK^{+} se linealizó en el extremo 3' del cADN por digestión con
restricción con EcoRI, y se sintetizaron transcriptos antisentido
usando polimerasa de ARN SP6 (Boehringer). Se degradó el ADN usando
ADNasa (preparación exenta de ARNasa, Boehringer Mannheim). Con los
transcriptos, se realizó síntesis de cADN cebada aleatoriamente con
\alpha-^{35}S ATP (Amersham) por transcripción
inversa con transcriptasa inversa de MMLV (BRL). Se usó un alto
exceso de cebador para obtener pequeños fragmentos de cADN de
aproximadamente 100 pb como media. A continuación, los transcriptos
de ARN se hidrolizaron parcialmente en NaOH 100 nM durante 20
minutos a 70ºC, se neutralizaron con la misma cantidad de HCl y se
purificaron con una columna de Sephadex-G50. Tras
precipitación en etanol, se disolvieron las sondas con una actividad
específica final de 5x10^{5} cpm. Se prepararon usando el mismo
método sondas sentido para hibridación testigo.
El inserto de cADN que contenía el marco de
lectura abierto entero de CCK-2 se subclonó en un
plásmido de expresión basado en promotor citomegalovirus y se
transfectó linaje celular 293 de fibroblasto de riñón embriónico
humano semiconfluente. Los lisados celulares de células
transfectadas con CCK-2 se separaron en un gel del
7,5% de poliacrilamida, se transfirieron a nitrocelulosa y se
sondaron con el anticuerpo monoclonal 5E2 contra antifosfotirosina
(\alpha PY). La incubación de células con ortovanadato sódico 1 mM
se realizó 90 minutos antes de la lisis.
Un miembro adicional de la familia de tirosina
quinasas receptoras MCK-10 se identificó usando una
reacción en cadena de polimerasa y cADN preparado a partir de ARN de
adenocarcinoma colónico. La secuencia de nucleótidos del nuevo
receptor, denominado CCK-2, se presenta en las
Figuras 3A, 3B, 3C y 3D. El análisis del CCK-2, la
secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos codificada
indicaban una homología significativa con MCK-10 por
toda la región extracelular, transmembrana e intracelular del
receptor MCK-10. Las regiones de homología entre
CCK-2 y MCK-10 se extienden a la
secuencia de consenso del término N para la familia de proteínas de
tipo discoidina I. (Poole et al. 1981, J. Mol. Biol. 153,
273-289). La homología entre CCK-2 y
MCK-10-2 se esquematiza en las
Figuras 4A y 4B.
Entre las dos RTKs, la región yuxtmembrana es la
región de divergencia de secuencias más extensa. La importancia de
esta región para la capacidad de señalización de la subclase
MCK-10/CCK-2 de RTKs se acentúa
adicionalmente por varios criterios estructurales y funcionales. El
CCK-2 muestra una extensión rica en serina entre los
aminoácidos 430 y 470 que incluye, entre otros posibles lugares de
fosforilación, un lugar de sustrato de proteína quinasa C potencial
en posición 433 (EKASRR). Aunque una secuencia similar que incluye
un residuo de serina se encuentra en aproximadamente la misma
localización en MCK-10-2 (Ser 448,
RRLLSKAERR), el contenido de serina de su dominio JM es
comparativamente más bajo, pero presenta en su lugar un número
destacadamente alto de residuos de prolina. Éstos están dispuestos
en repeticiones PXXP o PXXXP, sugiriendo una estructura helicoidal
aleatoria para esta región altamente hidrófila, que es probablemente
un dominio principal para interacciones con sustratos celulares y
otras proteínas reguladoras y puede ser por tanto la homóloga
funcional de la región de cola C del EGF-R, el
dominio de inserción de quinasa del PDGF-R, y el
factor de transmisión de señal auxiliar IRS-1 del
receptor de insulina (para reseña, véase Williamson et al.,
1994, Biochem J., 297:249-260). Las diferencias
patentes entre MCK-10 y CCK-2 en
esta región sugieren que determinantes dentro de esta región definen
sus distintas funciones biológicas. Esta predicción es soportada por
la inserción de MCK-10-2 de 37
aminoácidos, que incluye motivos "señal" para internalización
(NPXY), modulación de unión de ligandos (TYAXPXXXPG) e interacción
de dominio SH3 (PXPPXP). Este último motivo es muy similar al lugar
de unión de SH3 de la proteína 3BP2 de ratón (Ren et al.,
1993, Science 259:1157-1161) e iguala a la
estructura de unión de SH3 más favorable propuesta por Yu et
al. (1994, Cell 76:933-945) (Figura 4C). El
empalme alternativo de esta secuencia reguladora puede definir
distintas interacciones de proteínas y modular por ello la función
del receptor y finalmente la respuesta de la célula. Además, las
secuencias ricas en prolina que flanquean la inserción de 37
residuos en MCK-10 son distintas de las del dominio
JM de CCK-2 y, por tanto, pueden jugar un papel en
la función característica de RTK. Se han encontrado previamente
lugares de atraque de dominio SH3 putativos similares en tirosina
quinasas del tipo no receptor tales como Fgr. ack y Fak (Figura 4C;
Naharro et al., 1984, Science, 233:63-66;
Manser et al., 1993, Nature 363:364-367;
Andre & Becker-André, 1993, Biochem. Biophys.
Res. Comm. 190:140-147) pero se describen aquí por
primera vez en RTKs.
La expresión de CCK-2 en linajes
celulares de tumores humanos se investigó usando análisis de manchas
de Northern. Aunque se detectaron niveles variables de expresión de
mARN de MCK-10 de 4,3 kb en linajes celulares de
tumores de tipo epitelial T-470,
MDA-MB-231, CAKi-2,
Caco-2 y SNW-C2B, la sonda de
CCK-2 se hibridaba principalmente con ARNs múltiples
en SK-Mel-2,
Wi-26VA4 y Wi-38VA13, que expresaban
sólo bajos niveles de mARN de MCK-10 (Fig. 5D).
Para un análisis de expresión más detallado, se
realizó hibridación in situ en tejidos humanos normales y de
tumores usando fragmentos de ADN de CCK-2
antisentido de cadena sencilla. El análisis de hibridación in
situ de carcinomas humanos de diferente origen reveló un modelo
notablemente distinto de expresión de mARN de CCK-2
y MCK-10, como se demuestra por hibridación in
situ en secciones en serie. Ambos receptores se expresaron de
una manera aparentemente mutuamente exclusiva en diferentes tipos de
células del mismo tumor. Se encontró principalmente
CCK-2 en todas las células estromales, lo que
proporciona un ambiente conducente a proliferación, invasión e
incluso metástasis de células epiteliales, mientras que la expresión
de MCK-10 se limitaba firmemente a las propias
células neoplásticas (Liotta et al., 1983, Laboratory
Investigation 49:636-649; Iozzo y Cohen, 1993,
Experientia 49:447-455). Como se muestra en la
Figura 23A, el mARN de MCK-10 era abundante en
células tumorales epiteliales de un adenocarcinoma papilar del
ovario de grado III, escasamente diferenciado, mientras que la
expresión del gen de CCK-2 sólo se detectó en
células estromales dentro del tumor. Las señales de hibridación de
CCK-2 parecían ser más dispersas, de acuerdo con el
hecho de que las células del tejido conectivo, que contienen una
gran cantidad de matriz extracelular, están más separadas, en
contraste con el epitelio tumoral, en el que las células están
estrechamente asociadas. Se encontró un modelo de expresión similar
en un adenocarcinoma bronquioalveolar del pulmón de grado II,
moderadamente diferenciado (Fig. 23B). Consecuente con la
distribución de señal de hibridación en el carcinoma de ovario, el
mARN de MCK-10 se restringió a células tumorales
epiteliales, mientras que las señales de hibridación positivas de
CCK-2 se observaron sólo en células estromales,
aunque en un nivel menor que en el carcinoma de ovario. Estos
hallazgos son paralelos a las observaciones de Zerlin et al.
(1993, Oncogene 8:2731-2739), quienes demostraron
que NEP, el homólogo de ratón de MCK-10, era
abundante en células neuroepiteliales proliferantes en embriones y
significativamente más bajo o ausente en células diferenciadas que
habían migrado fuera de zonas proliferantes. La idea de que células
de cáncer invasoras pueden usar el mismo sistema de señalización que
células neuroepiteliales durante la embriogénesis sostiene además un
papel para MCK-10 en la proliferación y migración
mediadas por el reconocimiento de células. En células epiteliales
normales y tumorales, MCK-10 puede promover la
adhesión de células de manera hemofílica, similar al homólogo de
Drosophila de Trk, Dtrk (Pulido et al., 1992, EMBO J.
11:391-404), uniéndose al mismo receptor expresado
en células adyacentes o interactuando heterofílicamente con otras
moléculas implicadas en interacción célula-célula,
tales como CCK-2.
La transfección de células 293 con
CCK-2 de pCMV produjo una banda simple de 126 kDa
que se fosforiló, incluso en ausencia de ortovanadato, representando
presumiblemente la proteína de receptor CCK-2
glicosilada (Figura 6C).
En resumen, el distinto modelo de expresión de
CCK-2 y MCK-10 sugiere que estos
receptores estrechamente relacionados están implicados en
interacciones entre células epiteliales neoplásticas y estroma
circundante durante la progresión de tumores, y la presencia del
motivo de discoidina I en sus dominios extracelulares indica que
estos receptores juegan un papel importante en procesos implicados
en comunicaciones célula-célula.
Los siguientes organismos se depositaron en la
American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive,
Rockville, Maryland 20852.
| Denominación de la cepa | Contiene | Nº de admisión |
| CCK-2 | pCCK-2 | 69468 |
| MCK-10-1 | pMCK-10-1 | 69464 |
| MCK-10-2 | PMCK-10-2 | 69465 |
| MCK-10-3 | pMCK-10-3 | 69466 |
| MCK-10-4 | pMCK-10-4 | 69467 |
La presente invención no está limitada en su
alcance por las realizaciones puestas como ejemplo o los organismos
depositados, que se pretenden como ilustraciones de aspectos simples
de la invención, y cualesquiera clones, ADN o secuencias de
aminoácidos que sean funcionalmente equivalentes están dentro del
alcance de la invención. Realmente, diversas modificaciones de la
invención, además de las descritas aquí, serán evidentes para los
expertos en la técnica a partir de la descripción anterior y de los
dibujos que se acompañan. Tales modificaciones se pretende que estén
dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.
También se entenderá que todos los tamaños de
pares de bases dados para nucleótidos son aproximados y se usan con
fines de descripción.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: Ullrich, Axel
\hskip4cmAlves, Fraude
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: CCK-2, una nueva tirosina quinasa receptora
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 4
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESTINATARIO: PENNIE & EDMONDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 1155 Avenue of the Americas
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Nueva York
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: NY
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: EE.UU.
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- ZIP: 10036-2711
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMA LEIBLE EN ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Floppy disk
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatentIn Release 1.0, Versión 1.25
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- MÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIÓN DE APODERADO/AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Coruzzi, Laura A.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO: 30.742
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: 7683-065
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: (212) 790-9090
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TELEFAX: (212) 869-8864/9741
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TELEX: 66141 PENNIE
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 3962 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CARÁCTER DE LA CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: ambas
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cADN a mARN
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Homo sapiens
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO DE TEJIDO: Carcinoma mamario
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 919 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 3157 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CARÁCTER DE LA CADENA: ambos
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: ambas
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: cADN a mARN
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- FUENTE ORIGINAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Homo sapiens
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- TIPO DE TEJIDO: Adenocarcinoma colónico primario
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 855 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (21)
1. Un polipéptido aislado que comprende
(a) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4;
o
(b) una secuencia de aminoácidos consistente en
uno o más de los siguientes dominios de SEQ ID NO:4: el dominio de
discoidina I extracelular y el dominio de tirosina quinasa
intracelular.
2. Una proteína de fusión que comprende el
polipéptido de la reivindicación 1ª enlazado a un polipéptido
heterólogo.
3. El polipéptido de la reivindicación 1ª, que es
codificado por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 3.
4. Una molécula de ácido nucleico aislado que
comprende
(a) una secuencia de nucleótidos que codifica un
polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO:
4;
(b) una secuencia de nucleótidos complementaria
de la secuencia de nucleótidos de (a);
(c) una secuencia de nucleótidos que codifica uno
o más de los siguientes dominios de SEQ ID NO: 4: el dominio de
discoidina I extracelular y el dominio de tirosina quinasa
intracelular; o
(d) una secuencia de nucleótidos complementaria
de la secuencia de nucleótidos de (c).
5. La molécula de ácido nucleico aislado de la
reivindicación 4ª, que comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ
ID NO: 3.
6. Un anticuerpo que se une específicamente a un
epítope del polipéptido de la reivindicación 1ª.
7. El anticuerpo de la reivindicación 6ª, que
está enlazado a un agente citotóxico.
8. El anticuerpo de la reivindicación 6ª, que
está enlazado a un radioisótopo.
9. El anticuerpo de las reivindicaciones 6ª-8ª,
que es un anticuerpo monoclonal.
10. Un vector recombinante que contiene la
molécula de ácido nucleico de la reivindicación 4ª.
11. Un vector de expresión según la
reivindicación 10ª, en el que la molécula de ácido nucleico está
asociada operativamente con una secuencia de nucleótidos reguladora
que contiene información reguladora de transcripción y traducción
que controla la expresión de la molécula de ácido nucleico en una
célula hospedante.
12. Una célula hospedante diseñada genéticamente
que comprende el vector de las reivindicaciones 10ª o 11ª.
13. Una célula hospedante diseñada genéticamente
según la reivindicación 12ª, en la que la molécula de ácido nucleico
está asociada operativamente con una secuencia de nucleótidos
reguladora que contiene información reguladora de transcripción y
traducción que controla la expresión de la molécula de ácido
nucleico en una célula hospedante.
14. El vector recombinante de la reivindicación
10ª, en el que el vector es un vector de retrovirus.
15. Un linaje celular diseñado que contiene el
vector recombinante de la reivindicación 14ª y produce partículas de
retrovirus infeccioso que expresan el polipéptido de la
reivindicación 1ª.
16. La célula hospedante diseñada genéticamente
de las reivindicaciones 12ª, 13ª o 15ª, en el que la célula
hospedante es eucariota.
17. Un método para examinar e identificar
antagonistas o agonistas del polipéptido de la reivindicación 1ª,
que comprende:
(a) poner en contacto el polipéptido con una
genoteca de péptidos aleatorios de tal modo que el polipéptido
reconozca y se una a una o más especies de péptidos dentro de la
genoteca;
(b) aislar la combinación
polipéptido/péptido;
(c) determinar la secuencia del péptido aislado
en la etapa (b); y
(d) determinar si el compuesto de ensayo modula
la actividad enzimática endógena del polipéptido de la
reivindicación 1ª.
18. El método según la reivindicación 17ª, en el
que el polipéptido está diseñado genéticamente.
19. Un método para producir polipéptido
recombinante según la reivindicación 1ª, que comprende:
(a) cultivar una célula hospedante transformada
con el vector recombinante o de expresión de las reivindicaciones
10ª, 11ª o 14ª y que expresa el polipéptido de la reivindicación 1ª;
y
(b) recuperar el polipéptido del cultivo de
células.
20. Un oligonucleótido que codifica una secuencia
antisentido complementaria de la secuencia de nucleótidos según la
reivindicación 4ª y que inhibe la traducción de la secuencia de
nucleótidos en una célula.
21. El oligonucleótido de la reivindicación 20ª,
que es complementario de una porción de la secuencia de nucleótidos
que codifica la región amino terminal de la secuencia de
nucleótidos.
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