ES2271004T3 - Uso de taci como agente antitumoral. - Google Patents
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Abstract
Uso de un reactivo de TACI en la fabricación de un medicamento para la prevención o tratamiento de un tumor sólido, donde dicho medicamento prolonga el tiempo medio de supervivencia y/o reduce el tamaño del tumor sólido, donde dicho reactivo de TACI puede aumentar o disminuir la unión de ligandos a TACI y donde dicho reactivo de TACI es un polipéptido de fusión que comprende al menos dos segmentos, donde un primer segmento comprende un polipéptido de TACI o fragmento del mismo seleccionado del grupo que consiste en: (a) restos de aminoácidos 1-166 de SEQ ID NO:1; (b) restos de aminoácidos 1-160 de SEQ ID NO:1; (c) restos de aminoácidos 1-114 de SEQ ID NO: 1; (d) restos de aminoácidos 32-114 de SEQ ID NO:1; (e) un polipéptido que tiene al menos 80% de identidad de la secuencia de aminoácidos con los restos de aminoácidos 1-166 de SEQ ID NO: 1; (f) un polipéptido que tiene al menos 80% de identidad de la secuencia de aminoácidos con los restos de aminoácidos 1-160 de SEQ ID NO: 1; (g) un polipéptido que tiene al menos 80% de identidad de la secuencia de aminoácidos con los restos de aminoácidos 1-114 de SEQ ID NO:1; y (h) un polipéptido que tiene al menos 80% de identidad de la secuencia de aminoácidos con los restos de aminoácidos 32-114 de SEQ ID NO:1, y un segundo segmento que comprende un polipéptido inmunoglobulínico.
Description
Uso de TACI como agente antitumortal.
La presente invención se refiere en general a
métodos de tratamiento de un mamífero que padece una enfermedad
asociada a la proliferación celular no deseada, incluido el
cáncer.
Los miembros de la familia de citocinas que
constituyen los factores de necrosis tumoral (TNF) están
involucrados en un abanico cada vez más amplio de funciones
biológicas críticas. Cada miembro de la familia TNF actúa fijándose
a uno o más miembros de una familia paralela de proteínas
receptoras, a saber la familia de proteínas que constituyen los
receptores de TNF. Receptores de TNF que, a su vez, transducen
señales al interior de la célula para inducir un espectro de
respuestas fisiológicas o de crecimiento. Muchas de las señales
transducidas por los receptores de TNF influyen en el destino de la
célula, y a menudo desencadenan una diferenciación celular
terminal. Ejemplos de diferenciación celular incluyen proliferación,
maduración, migración y muerte.
En la patente de EE.UU. 5,969,102, se describe
TACI (proteína que interacciona con CAML y activa la transmembrana,
del inglés, Transmembrane Activator CAML Interactor protein), una
nueva proteína que actúa como receptor para miembros de la familia
TNF. Sin embargo, el correspondiente miembro de la familia TNF que
es ligando de TACI no se conocía.
La presente invención describe que el miembro
APRIL de la familia TNF, que se describe en el documento WO
99/12965, es un ligando para TACI. También es un descubrimiento de
la presente invención que los reactivos de TACI son particularmente
útiles en el tratamiento de un mamífero que padece una enfermedad
asociada con la proliferación no deseada de células, incluido, por
ejemplo, el cáncer.
La presente invención se refiere al uso de un
reactivo de TACI en la fabricación de un medicamento para la
prevención o tratamiento de un tumor sólido, donde dicho medicamento
prolonga el tiempo medio de supervivencia y/o reduce el tamaño del
tumor sólido, donde dicho reactivo de TACI puede aumentar o
disminuir la unión de ligandos a TACI y donde dicho reactivo de TACI
es un polipéptido de fusión que comprende al menos dos segmentos,
donde un primer segmento comprende un polipéptido de TACI o
fragmento del mismo seleccionado del grupo que consiste en:
(a) restos de aminoácidos 1-166
de SEQ ID NO: 1;
(b) restos de aminoácidos 1-160
de SEQ ID NO: 1;
(c) restos de aminoácidos 1-114
de SEQ ID NO: 1;
(d) restos de aminoácidos 32-114
de SEQ ID NO:1;
(e) un polipéptido que tiene al menos 80% de
identidad de la secuencia de aminoácidos con los restos de
aminoácidos 1-166 de SEQ ID NO: 1;
(f) un polipéptido que tiene al menos 80% de
identidad de la secuencia de aminoácidos con los restos de
aminoácidos 1-160 de SEQ ID NO: 1;
(g) un polipéptido que tiene al menos 80% de
identidad de la secuencia de aminoácidos con los restos de
aminoácidos 1-114 de SEQ ID NO: 1; y
(h) un polipéptido que tiene al menos 80% de
identidad de la secuencia de aminoácidos con los restos de
aminoácidos 32-114 de SEQ ID NO: 1, y
un segundo segmento comprende un polipéptido
inmunoglobulínico. Tales tumores sólidos incluyen pero sin limitarse
a ellos, cáncer, y concretamente cáncer de células renales, sarcoma
de Kaposi, cáncer de próstata, cáncer de mama, sarcoma, carcinoma de
ovario, cáncer rectal, cáncer de garganta, melanoma, cáncer de
colon, cáncer de vejiga, mastocitoma, cáncer de pulmón,
adenocarcinoma de mama, carcinoma faríngeo de células escamosas,
cáncer gastrointestinal y cáncer de estómago.
Hay que entender que la descripción general
anterior y la descripción detallada siguiente son ilustrativas y
explicativas y pretenden proporcionar una explicación detallada de
la invención reivindicada.
Los dibujos adjuntos se incluyen para
proporcionar un entendimiento adicional de la invención, se
incorporan en esta memoria descriptiva y constituyen una parte de
ella, ilustran varias realizaciones de la invención, y junto con la
descripción sirven para explicar los principios, de la
invención.
La Figura 1 es una representación esquemática de
la secuencia de ácidos nucleicos (SEQ ID NO:2) de un cDNA para TACI
humana y su secuencia de aminoácidos derivada (SEQ ID NO:1)
cartografiada en el vector pCA336.
La Figura 2 es una representación esquemática
del inserto de secuencia de ácido nucleico en pJST552 que codifica
TACI de longitud completa, humana, con etiqueta FLAG en el extremo
N-terminal.
La Figura 3 es una representación esquemática de
la secuencia de DNA (SEQ ID NO: 5) y su secuencia de aminoácidos
derivada (SEQ ID NO:6) del dominio extracelular de TACI con una
región tallo (en inglés stalk) truncada fusionada a Fc de IgG
humana. Ésta se ensambló como el plásmido pJST572. La secuencia
señal de IgG-kappa murina, nucleótidos
1-69 (aminoácidos 1-23), se fusionó
en marco con el dominio extracelular de TACI humana (aminoácidos
1-114 de SEQ ID NO: 1) como nucleótidos
70-411 (aminoácidos 24-137) que se
fusionó en marco al Fc de hIgGl como nucleótidos
412-1098 (aminoácidos 138-366). El
sitio señal predicho para la escisión por peptidasa está después del
aminoácido 20.
La Figura 4 es una representación esquemática de
la secuencia de DNA (SEQ ID NO:7) y su secuencia de aminoácidos
derivada (SEQ ID NO: 8) del dominio extracelular de TACI con una
región tallo truncada que comienza después de la segunda metionina
fusionada a Fc de IgG humana. Ésta se ensambló como el plásmido
pJST591. La secuencia señal de IgG-kappa murina,
nucleótidos 1-66 (aminoácidos 1-22),
se fusionó en marco con el dominio extracelular de TACI humana
(aminoácidos 32-114 de SEQ ID NO: 1) como
nucleótidos 67-315 (aminoácidos
23-105), que se fusionó en marco con el Fc de hIgG1
como nucleótidos 316-1002 (aminoácidos
106-334). El sitio predicho en la señal para la
escisión por peptidasa está después del aminoácido 20.
La Figura 5 es una representación esquemática de
la secuencia de ácidos nucleicos y su secuencia derivada de
aminoácidos del dominio extracelular completo de TACI fusionada a la
secuencia de Fc de IgG humana, como está ensamblada en el plásmido
PS882, donde hay una secuencia señal-(HA) corta de hemaglutinina en
marco con la metionina nativa (aminoácido 18) y la secuencia del
dominio extracelular de TACI a través del aminoácido 177 (valina,
que es el aminoácido 160 de TACI) después de lo cual hay un
constructo Fc de IgG humana en marco.
La Figura 6 es una representación esquemática de
la secuencia de ácidos nucleicos (SEQ ID NO:4) y su secuencia de
aminoácidos derivada (SEQ ID NO:3) de un constructo de APRIL murina
con etiqueta myc para expresión en células de Pichia
pastoris, como se indica en el mapa del plásmido pCMM276, que
incluye la secuencia señal del factor de cruzamiento alfa, que se
separa por escisión; el epitopo de myc (los 11 primeros aminoácidos
después de la secuencia señal; subrayados); una región enlazadora
corta (los 8 aminoácidos siguientes); y el dominio extracelular
soluble de la secuencia codificante de APRIL murina desde el
aminoácido 20, que es una alanina, hasta el primer codón de
parada.
La Figura 7 es una representación esquemática de
la secuencia de ácidos nucleicos del dominio extracelular soluble
con etiqueta FLAG, de APRIL murina, y la correspondiente secuencia
de aminoácidos, cartografiada en el plásmido PS784 de expresión en
mamíferos, también conocido como LT032, donde hay una secuencia
señal de HA (en la caja), el epitopo de FLAG (subrayado), una
secuencia enlazadora corta, y después la secuencia de APRIL murina
soluble (flecha que empieza en alanina).
La Figura 8 es una representación esquemática de
APRIL murina purificada con etiqueta myc, que se une a células
transfectadas con TACI. Se transfectaron células 293EBNA con el
plásmido de expresión pJST552 que expresaba TACI humana de longitud
completa con etiqueta FLAG. Las células se recogieron 48 horas más
tarde usando EDTA 5 mM y se tiñeron con APRIL murina con etiqueta
myc a diversas concentraciones. Ningún control proteínico se tiñó
con reactivos de detección (APRIL antimurina de conejo y PE
anti-conejo de burro (Jackson Immunoresearch)). La
tinción en FL1 de la proteína codificada por el plásmido de
expresión GFP ilustra la eficacia de la expresión.
La Figura 9 es una representación esquemática de
la secuencia de DNA del dominio extracelular soluble con etiqueta
FLAG de APRIL humana (SEQ ID NO: 9) y la correspondiente secuencia
de aminoácidos (SEQ ID NO: 10) clonada en el vector LT033 de
expresión en mamíferos. Este constructo contiene una etiqueta de
secuencia señal de HA (en caja), la etiqueta del epitopo de FLAG
(subrayado), y una secuencia enlazadora corta fusionada a APRIL
humano soluble (flecha, que empieza en alanina).
La Figura 10 es una serie de representaciones de
transferencias Western que delinean la inmunoprecipitación de APRIL
murina con etiqueta FLAG usando la proteína de fusión de TACI humana
(1-160)-Ig
(hTACI(1-160)-Ig). La Figura
10A es una representación de una transferencia Western que muestra
tinción con Ponceau-S de cargas de proteína para los
ligandos. La Figura 10B es una representación de una transferencia
Western que indica la cantidad de
hTACI(1-160)-Ig usada en las
inmunoprecipitaciones por revelado de la porción Fc de IgG. La
Figura 10C es una representación de una transferencia Western que
indica que sólo la APRIL inmunoprecipitó con
hTACI(1-160)-Ig, como se
evidencia revelando la etiqueta FLAG.
La Figura 11 indica los resultados de la
inhibición del crecimiento tumoral in vivo de células de
adenocarcinoma de colon HT29 por
hTACI(1-114)-Ig.
La Figura 12 indica los resultados de la
inhibición del crecimiento tumoral in vivo de células de
carcinoma de pulmón A594 por
hTACI(1-114)-Ig.
La Figura 13 muestra una superposición de
histogramas de la unión de
hTACI(1-114)-Ig y
hTACI(32-114)-Ig a células
que expresan establemente APRIL murina de superficie.
La Figura 14 muestra una representación gráfica
de un análisis ELISA de la unión de APRIL murina y humana a
hTACI(32-114)-Ig.
Ahora se ha descubierto inesperadamente que TACI
es un receptor para APRIL (del inglés, A Proliferation
Inducing Ligand; en español, ligando inductor de
proliferación). También es un descubrimiento inesperado de la
presente invención que los reactivos TACI se pueden usar en la
fabricación de un medicamento para tratar una enfermedad asociada a
tumores sólidos en mamíferos. Tal medicamento prolonga el tiempo
medio de supervivencia de dicho mamífero en aproximadamente 10%,
15%, 20%, 25% o más, comparado con la ausencia de administración del
medicamento para dicha enfermedad. Además, es un descubrimiento
inesperado de la presente invención que los medicamentos se pueden
utilizar para reducir el tamaño de un tumor localizado sobre o
dentro de un mamífero, donde dicho medicamento reduce el tamaño de
dicho tumor en aproximadamente 10%, 15%, 20%, 23% o más si se
compara con la no administración del medicamento.
Tal como se utiliza aquí, "tratar o
tratamiento" significa una estrategia para obtener resultados
clínicos beneficiosos o deseados. Para los fines de esta invención,
resultados clínicos beneficiosos o deseados incluyen, pero sin
limitarse a ellos, uno o más de los siguientes: alivio de síntomas,
disminución de la extensión de la enfermedad, estabilizaación de la
enfermedad (v.g., no empeoramiento) de la enfermedad,
prevención de la diseminación (v.g., metástasis) de la
enfermedad, prevención de la incidencia o recurrencia de la
enfermedad, retraso o aminoración del avance de la enfermedad,
mejoría del estado de enfermedad y remisión (ya sea parcial o
total). El término "tratamiento" también abarca una reducción
de las consecuencias patológicas de una enfermedad asociada con una
proliferación celular no deseada, incluyendo específicamente el
cáncer.
"Mamífero" como se utiliza aquí, significa
cualquier mamífero incluyendo seres humanos, vacas, caballos,
perros, ratas, ratones y gatos. En una realización preferida de la
invención, el mamífero es un ser humano.
"Una enfermedad asociada con proliferación
celular no deseada" como se usa aquí, incluye pero no se limita a
cáncer, específicamente, enfermedades que comprenden al menos un
tumor sólido, incluyendo, pero sin limitarse a ellos, cáncer de
células renales, sarcoma de Kapoel, cáncer de mama, sarcoma,
carcinoma de ovarios, cáncer rectal, cáncer de garganta, melanoma,
cáncer de colon, cáncer de vejiga, mastocitoma, cáncer de pulmón,
adenocarcinoma de mama, carcinoma faríngeo de células escamosas,
cáncer gastrointestinal o cáncer de estómago. Preferiblemente, el
cáncer es mastocitoma, melanoma, linfoma, adenocarcinoma mamario,
cáncer de próstata y mama. También se contemplan otras condiciones
asociadas con la proliferación celular no deseada, incluyendo pero
sin limitarse a hiperproliferación celular (hiperplasia),
seleccionada del grupo que consiste en, por ejemplo, escleroderma,
queratitis superficial crónica debida a artritis reumatoide,
cicatrices postquirúrgicas y fibrosis de pulmón, hígado y útero.
Como se utiliza aquí "administrar"
significa que el medicamento se puede administrar a solas o en
combinación con otros agentes farmacéuticos y se puede combinar con
un vehículo fisiológicamente aceptable para el mismo. La cantidad
eficaz y el método de administración del medicamento particular
puede variar en función del mamífero individual y del estadío de la
enfermedad y otros factores evidentes para un experto en la técnica.
La(s) ruta(s) de administración útiles en una
aplicación particular son evidentes para un experto en la
técnica.
Las rutas de administración incluyen pero no se
limitan a la transdérmica, parenteral, gastrointestinal,
transbronquial y transalveolar. La administración tópica se lleva a
cabo utilizando una crema, un gel, un colutorio, etc. aplicado
tópicamente que contiene un conjugado oligonucleotídico. La
administración transdérmica se lleva a cabo por aplicación de una
crema, colutorio, gel, etc., capaz de dejar que el medicamento
penetre en la piel y entre en la circulación sanguínea. Las rutas
parenterales de administración incluyen, pero no se limitan a
inyección eléctrica o directa tal como inyección directa en un
conducto venoso central, o inyección intravenosa, intramuscular,
intraperitoneal o subcutánea. Las rutas gastrointestinales de
administración incluyen pero no se limitan a ingestión y
administración rectal. Las rutas transbronquial y transalveolar de
administración incluyen, pero no se limitan a, inhalación, ya sea
por la boca o por la nariz.
Una "cantidad eficaz" tal como se utiliza
aquí es una cantidad suficiente para producir resultados clínicos
beneficiosos o deseados (Stites et al., BASIC & CLINICAL
IMMUNOLOGY, Lange Medical Publications, Los Altos, California,
1982). Se puede administrar una cantidad eficaz en una o más
administraciones como se describe aquí. Para los fines de esta
invención, una cantidad eficaz de un medicamento que comprende un
reactivo de TACI es una cantidad suficiente para alargar el tiempo
medio de supervivencia de un mamífero en al menos un 10%,
alternativamente 13%, 20% o 25%, en comparación con la supervivencia
media en ausencia de la administración de dicho medicamento. La
detección y medición de indicadores de eficacia se basan
generalmente en la medición de síntomas clínicos asociados con el
estado de enfermedad, tal como una mayor esperanza de vida media
después del tratamiento con un medicamento que comprende un reactivo
de TACI.
Una cantidad eficaz de un medicamento que
comprende un reactivo de TACI para reducir el tamaño de un tumor
sobre la superficie o en el interior de un mamífero es una cantidad
suficiente para reducir el tamaño del tumor sobre la superficie o en
el interior del mamífero en al menos un 10%, alternativamente 15%,
20% o 25% más que en ausencia de la administración de dicho
medicamento. Los métodos para medir el tamaño de un tumor en un
mamífero son conocidos para los expertos en la técnica y se pueden
medir por procedimientos no invasivos, incluyendo, pero sin
limitarse a ellos, el uso de un micrómetro para medir el diámetro
del tumor, si el tumor está localizado en la superficie exterior de
un mamífero. Alternativamente, si el tumor está localizado en el
interior del mamífero, se puede usar MRI para medir el diámetro del
tumor. Los procedimientos invasivos incluyen extirpar
quirúrgicamente el tumor del mamífero y pesar el tumor y comparar el
tamaño del tumor antes del tratamiento y con el medicamento que
comprende el reactivo de TACI.
Como se utiliza aquí "un reactivo de TACI"
significa aquellos reactivos que pueden influir en como es
interpretada la señal de TACI dentro de la célula, incluyendo
reactivos de TACI antagonistas que pueden disminuir la unión del
ligando a TACI, incluyendo por ejemplo, proteínas de fusión con
TACI, tal como TACI-Fc de IgG. También se contemplan
reactivos TACI agonistas que pueden aumentar la unión del ligando a
TACI, incluyendo, por ejemplo, anticuerpos frente a TACI tales como
anticuerpos monoclonales anti-TACI. El término
dominio Fc se refiere a una parte de la molécula que comprende los
dominios bisagra, CH2 y CH3, pero que carece de los sitios para que
se una el antígeno. Se entiende que el término incluye las regiones
equivalentes de una IgG, una IgM y otros isotipos de
anticuerpos.
Como se utiliza aquí, "prolongar el tiempo
medio de supervivencia" significa que la esperanza de vida media
asociada con una enfermedad particular asociada con la proliferación
celular no deseada aumenta por término medio. La esperanza de vida
media es conocida por los expertos en la técnica para diversas
formas de cáncer en diversas formas de mamíferos, incluidas diversas
formas de cáncer en seres humanos, y diversas formas de cáncer en
roedores, incluyendo ratones. Adicionalmente, como se utiliza aquí,
un tiempo medio de supervivencia prolongado, por ejemplo, de
aproximadamente 10% o más en comparación con el tiempo medio de
supervivencia en ausencia de administración de un medicamento que
comprende un reactivo de TACI, significa, por ejemplo, que para un
paciente humano con una forma de cáncer que tiene un tiempo medio de
supervivencia de aproximadamente 365 días (1 año) en ausencia de
tratamiento, dicho medicamento incrementaría su esperanza de vida
media en aproximadamente 10% de 365 días o más, durante un total de
aproximadamente 400 días de supervivencia total.
Por "reactivo de TACI soluble" se entiende
una forma soluble de una proteína TACI o fragmento de la misma en la
que el dominio transmembranario ha sido escindido o mutado por
técnicas bioquímicas o de DNA recombinante para que sea soluble. Por
lo tanto, la invención proporciona el uso de un reactivo de TACI en
la fabricación de un medicamento para la prevención o tratamiento de
un tumor sólido, donde dicho medicamento prolonga el tiempo medio de
supervivencia y/o reduce el tamaño del tumor sólido, donde dicho
reactivo de TACI puede aumentar o disminuir la unión de ligandos a
TACI y donde dicho reactivo de TACI es un polipéptido de fusión que
comprende al menos dos segmentos, donde un primer segmento comprende
un polipéptido de TACI o fragmento del mismo seleccionado del grupo
que consiste en:
(a) restos de aminoácidos 1-166
de SEQ ID NO:1;
(b) restos de aminoácidos 1-160
de SEQ ID NO:; 1;
(c) restos de aminoácidos 1-114
de SEQ ID NO: 1;
(d) restos de aminoácidos 32-114
de SEQ ID NO: 1;
(e) un polipéptido que tiene al menos 80% de
identidad de la secuencia de aminoácidos con los restos de
aminoácidos 1-166 de SEQ ID NO: 1;
(f) un polipéptido que tiene al menos 80% de
identidad de la secuencia de aminoácidos con los restos de
aminoácidos 1-160 de SEQ ID NO: 1;
(g) un polipéptido que tiene al menos 80% de
identidad de la secuencia de aminoácidos con los restos de
aminoácidos 1-114 de SEQ ID NO: 1; y
(h) un polipéptido que tiene al menos 80% de
identidad de la secuencia de aminoácidos con los restos de
aminoácidos 32-114 de SEQ ID NO:1, y
un segundo segmento que comprende un polipéptido
inmunoglobulínico.
En ciertas realizaciones, la invención
reivindicada incluye el uso de fragmentos de TACI que tienen la
capacidad de unirse a APRIL. Los fragmentos de TACI se pueden
producir de varios modos, v.g., recombinantemente, por PCR,
por digestión proteolítica o por síntesis química. Los fragmentos
internos o terminales de un polipéptido se pueden generar separando
uno o más nucleótidos de uno o ambos extremos de un ácido nucleico
que codifica el polipéptido. La expresión del DNA tratado por
mutagénesis produce fragmentos polipeptídicos.
Los fragmentos polipeptídicos también se pueden
sintetizar químicamente usando técnicas conocidas en el estado de la
técnica tales como la química f-moc o
t-boc en fase sólida de Merrifield convencional. Por
ejemplo, los péptidos y las secuencias de DNA de la presente
invención se pueden dividir arbitrariamente en fragmentos de
longitud deseada sin solapamiento del fragmento, o dividir en
fragmentos solapantes de una longitud deseada. Métodos de esta clase
se describen con más detalle más adelante.
Las formas solubles de TACI a menudo pueden
señalizar eficazmente y, por ello, se pueden administrar como un
fármaco que ahora simula la forma de membrana natural. Es posible
que la TACI citada aquí sea secretada de forma natural como
citoquinas solubles, sin embargo, si no es así, se puede reconstruir
el gen para forzar la secreción. Para crear una forma secretada
soluble de TACI, habría que eliminar a nivel de DNA las regiones
transmembranarias del extremo N terminal, y alguna porción de la
región tallo, y reemplazarlas por una secuencia líder de tipo I o
alternativamente de tipo II que permitiera una escisión proteolótica
eficiente en el sistema de expresión elegido. Un experto en la
técnica podría variar la cantidad de la región tallo retenida en el
constructo de expresión y secreción para optimizar tanto las
propiedades de unión al ligando como la eficacia de secreción. Por
ejemplo, se podrían preparar los constructos que contienen todas las
posibles longitudes tallo, es decir, truncaciones
N-terminales. En ciertas realizaciones, se producen
las proteínas que comienzan en los aminoácidos 1 a 32.La secuencia
tallo de longitud óptima sería el resultado de este tipo de
análisis.
Por "sustancialmente puro" o
"sustancialmente purificado" se entiende un compuesto
(v.g., una molécula de ácido nucleico o una proteína) que se
ha separado de sus componentes (v.g., moléculas de ácido
nucleico, proteínas, lípidos y/o hidratos de carbono), que la
acompañan de forma natural. Agua, tampones y otras moléculas
pequeñas (v.g., moléculas con un peso molecular menor que
aproximadamente 1000 daltons) pueden acompañar a un compuesto
sustancialmente puro de la invención. Preferiblemente, un compuesto
sustancialmente purificado está al menos en 70%, en peso, libre de
componentes que lo acompañan de forma natural. Más preferiblemente,
un compuesto sustancialmente purificado está al menos en 75%, en
peso, libre de componentes que lo acompañan de forma natural;
todavía más preferiblemente al menos en 80%, en peso, libre; más
preferiblemente aún al menos en 85%, en peso, libre; y aun más
preferiblemente, al menos en 90%, en peso, libre de componentes que
lo acompañan de forma natural. Lo más preferiblemente, un compuesto
sustancialmente purificado está al menos en 95%, en peso, libre de
componentes que lo acompañan de forma natural. En ciertas
realizaciones de la
El "dominio extracelular de TACI" se
refiere a una proteína o polipéptido de TACI que está libre de
dominios transmembranario y citoplásmico de TACI. Normalmente, el
dominio extracelular de TACI se extiende a lo largo de los
aminoácidos 1 a aproximadamente 166 de SEQ ID NO: 1. Es entendido
por un experto en la técnica que el dominio transmembranario
identificado para el fragmento de proteína o polipéptido de TACI de
la presente invención se identifica atendiendo a los criterios
empleados rutinariamente en la técnica para identificar ese tipo de
dominio hidrofóbico. Los límites exactos de un dominio
transmembranario varían pero lo más probable es que no varíen en más
de aproximadamente cinco aminoácidos en cualquier extremo del
dominio mencionado aquí específica-
mente.
mente.
"Identidad de secuencia" con respecto a las
secuencias de aminoácidos de TACI identificadas aquí se define como
el porcentaje de restos de aminoácidos en una secuencia candidata
que son idénticos a los restos de aminoácidos en la secuencia de
aminoácidos de TACI, después de alinear las secuencias e introducir
mellas, si es necesario, para obtener la máxima identidad de
secuencia porcentual, y sin considerar ninguna sustitución
conservativa como parte de la identidad de secuencia. Para los fines
de determinar la identidad porcentual de la secuencia de
aminoácidos, la alineación se produce de varios modos que son bien
conocidos por el experto en la técnica, por ejemplo, utilizando
programas de ordenador disponibles para el público tales como BLAST,
ALIGN, or Megalign (DNASTAR). El experto en la técnica determinará
los parámetros apropiados para medir la alineación local, incluido
cualquier algoritmo necesario para obtener alineación máxima a lo
largo de la longitud completa de las secuencias que están siendo
comparadas, para detectar relaciones entre secuencias que comparten
sólo regiones aisladas de similitud. (Altschul et al. (1990)
J. Mol. Biol. 215:403-410).
Por "proteína de fusión" se entiende una
proteína que comprende al menos dos segmentos de un fragmento
polipeptídico o proteico unidos entre sí por cualquier medio,
incluido, sin limitación, un enlace covalente (v.g. un enlace
peptídico, un enlace no covalente (v.g., enlace iónico o
puente de hidrógeno) o por un agente de entrecruzamiento químico.
También se puede generar cualquier gama de proteínas de fusión
portadoras de sólo el dominio extracelular de la proteína TACI.
Ejemplos no limitantes incluyen una proteína de fusión que comprende
el dominio extracelular de la proteína TACI y un polipéptido
inmunoglobulínico, incluido, por ejemplo, el polipéptido
inmunoglobulínico IgG.
Además, se pueden utilizar técnicas clásicas de
DNA recombinante para alterar las afinidades de unión de los
anticuerpos recombinantes con sus antígenos por alteración de los
restos de aminoácidos en la vecindad de los sitios de unión al
antígeno. La afinidad de unión al antígeno de un anticuerpo
humanizado se puede incrementar por mutagénesis basada en modelación
molecular. (Queen et al., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 86:10029-10033) que se incorpora aquí como
referencia.
El medicamento que comprende un polipéptido de
TACI puede incluir un excipiente farmacéuticamente aceptable. Los
vehículos adecuados para el medicamento, por ejemplo, y sus
formulaciones, se describen en REMINGTON' PHARMACEUTICAL SCIENCES,
16^{th} ed., Oslo et al. Eds., Mack Publishing Co., 1980.
Típicamente, se utiliza una cantidad apropiada de una sal
farmacéuticamente aceptable en la formulación para hacer la
formulación isotónica. Ejemplos del vehículo incluyen tampones tales
como solución salina, solución Ringer y solución de dextrosa.
Preferiblemente, el pH de la solución es de aproximadamente 5 a
aproximadamente 8, y más preferiblemente de aproximadamente 7,4 a
aproximadamente 7,8. Vehículos adicionales incluyen preparaciones de
liberación sostenida tales como matrices semipermeables de polímeros
hidrófobos sólidos, cuyas matrices están en forma de artículos
conformados, v.g., liposomas, películas o micropartículas.
Será evidente para los expertos en la técnica que ciertos vehículos
pueden ser más preferibles dependiendo de, por ejemplo, la ruta de
administración y la concentración del medicamento que se está
administrando.
La administración se puede efectuar por
inyección (v.g., intravenosa, intraperitoneal, subcutánea,
intramuscular) o por otros métodos tales como infusión que
garanticen la liberación al flujo sanguíneo de una forma eficaz.
Los medicamentos que comprenden reactivos TACI
se administran en una cantidad eficaz que se puede extrapolar
fácilmente por los datos experimentales con animales, proporcionados
aquí por métodos conocidos por los expertos en la técnica
(v.g., basados en el peso corporal, en la superficie
corporal). Además, es competencia del médico experto aumentar o
disminuir las cantidades del medicamento que comprende un reactivo
de TACI para producir los efectos deseados sin causar efectos
secundarios indeseables.
Los siguientes Ejemplos se proporcionan para
ilustrar la presente invención y no deberán interpretarse como
limitantes de la misma.
Los siguientes métodos y materiales se
utilizaron en los Ejemplos descritos aquí a continuación.
El vector de expresión pCCM276 (Figura 4), fue
construido por reacción en cadena de polimerasa usando
pCCM213.10 (muAPRIL H98 con etiqueta Myc) como molde y los oligonucleótidos sintéticos CDL620 y LTB619 como cebadores directo e inverso, respectivamente. El cebador directo CDL620 retroañade 10 aminoácidos de secuencia de APRIL murina para representar la forma escindida nativa, junto con un motivo KEL derivado de ligando FAS y un sitio Sacl. Los fragmentos amplificados resultantes fueron digeridos con Sacl y Notl, purificados y ligados en los mismos sitios de restricción de pCCM2I3.10. Este constructo de expresión contiene la secuencia señal del factor de cruzamiento alfa de levadura directamente fusionado a la etiqueta de epitopo de myc, el motivo KEL y el inicio de APRIL murina en Alanina 88. pCCM2786 se linealizó con StuI, se electroporó en la cepa GS115 (his4-) y se cultivó en medio mínimo que contenía dextrosa. Los transformantes HIS4 se analizaron en busca de expresión proteica inoculando una sola colonia representativa en medio rico (BMGY) y dejándolos crecer a densidad durante 48 horas a 30°C. Los cultivos se centrifugaron y los sedimentos celulares se resuspendieron (1:5) en un medio de inducción rico que contenía 2% de metanol (BMMY). Después de dos días de inducción a 30°C, se aplicaron sobre geles de SDS-PAGE y se evaluó la presencia de muAPRIL. La tinción con azul Coomassie y el análisis de transferencia Western (Western Blot) (con el mAB 9E10 anti-myc) confirmó la presencia de APRIL murina con etiqueta myc A88 glicosilada.
pCCM213.10 (muAPRIL H98 con etiqueta Myc) como molde y los oligonucleótidos sintéticos CDL620 y LTB619 como cebadores directo e inverso, respectivamente. El cebador directo CDL620 retroañade 10 aminoácidos de secuencia de APRIL murina para representar la forma escindida nativa, junto con un motivo KEL derivado de ligando FAS y un sitio Sacl. Los fragmentos amplificados resultantes fueron digeridos con Sacl y Notl, purificados y ligados en los mismos sitios de restricción de pCCM2I3.10. Este constructo de expresión contiene la secuencia señal del factor de cruzamiento alfa de levadura directamente fusionado a la etiqueta de epitopo de myc, el motivo KEL y el inicio de APRIL murina en Alanina 88. pCCM2786 se linealizó con StuI, se electroporó en la cepa GS115 (his4-) y se cultivó en medio mínimo que contenía dextrosa. Los transformantes HIS4 se analizaron en busca de expresión proteica inoculando una sola colonia representativa en medio rico (BMGY) y dejándolos crecer a densidad durante 48 horas a 30°C. Los cultivos se centrifugaron y los sedimentos celulares se resuspendieron (1:5) en un medio de inducción rico que contenía 2% de metanol (BMMY). Después de dos días de inducción a 30°C, se aplicaron sobre geles de SDS-PAGE y se evaluó la presencia de muAPRIL. La tinción con azul Coomassie y el análisis de transferencia Western (Western Blot) (con el mAB 9E10 anti-myc) confirmó la presencia de APRIL murina con etiqueta myc A88 glicosilada.
APRIL murina con etiqueta Myc
(myc-muAPRIL) se expresó en P. pastoris. La
proteína tiene un punto isoeléctrico de aproximadamente 7,45. 175 ml
de sobrenadante de Pichia se dializaron en PBS durante una
noche con una membrana de diálisis que corta a 30kD. Después, el
dializado se hizo pasar a través de una columna de sepharose Q.
myc-muAPRIL se recogió en el material eluido de la
columna, mientras que los contaminantes quedaron unidos a ella. La
myc-muAPRIL eluida se concentró a un volumen 20
veces menor y después se cromatografió sobre una columna de
filtración en gel superdex 75. Después de la filtración en gel, se
recuperaron 8 mg de myc-muAPRIL que tenía una OD
(densidad óptica) de 1,0AU-1 mg de
myc-muAPRIL. El gel de SDS-PAGE
sometido a tinción Coomassie presentó una preparación homogénea de
myc-muAPRIL con dos bandas que migraban a pesos
moleculares de aproximadamente 22 kD y 18 kD. El análisis de
transferencia Western usando el anticuerpo monoclonal de ratón 9E10
(anti-myc) indicó que ambas bandas observadas eran
inmunoreactivas. El extremo N esperado de la
myc-muAPRIL purificada se verificó por degradación
de Edman de la proteína sometida a transferencia. La secuenciación
del terminal N y la inmunorreactividad frente a 9E 10 demuestran que
la etiqueta myc estaba presente en los terminales N de
myc-muAPRIL.
El plásmido PS784 (también llamado LT032)
(Figura 7) se utilizó para transfectar temporalmente células 293 T
usando reactivo de lipofectamina (Gibco-BRL) y medio
libre de suero. El plásmido, construido en el vector de expresión de
mamíferos PCR3 (Invitrogen) codifica el dominio soluble de APRIL
murina que se une al receptor, con una etiqueta FLAG
N-terminal, en el medio de cultivo celular. La
proteína FLAG-APRIL se purificó en medio libre de
suero utilizando una columna mAb M2 anti-FLAG y
exceso de péptido FLAG purificado, siguiendo las instrucciones de
los fabricantes (Kodak). Alternativamente, APRIL murino y otros
ligandos etiquetados con FLAG se analizaron directamente en los
medios acondicionados.
Se utilizó un plásmido que codifica
hTACI(1-160)-Ig (PS882;
Figura 5) soluble para transfectar temporalmente células 293. Se usó
medio acondicionado de células 293 que sobreexpresan
hTACI(1-160)-Ig en el
análisis de inmunoprecipitación para detectar la unión a la proteína
APRIL.
Un plásmido que codifica TACI de longitud
completa con etiqueta flag (pJST552; Figura 2) se transfectó
temporalmente en células 293. La forma de longitud completa de la
molécula se retiene sobre la superficie celular. Estas células
transfectadas se usaron en análisis FACS para detectar la unión a
proteína APRIL.
El plásmido LT033 (Figura 9) se utilizó para
transfectar temporalmente células 293 T usando reactivo
lipofectamina (Gibco-BRL) y medio libre de suero. El
plásmido, construido en el vector de expresión de mamíferos PCR3
(Invitrogen) codifica el dominio soluble de APRIL humana que se une
al receptor, con una etiqueta FLAG N-terminal, y la
proteína expresada se secreta en el medio de cultivo celular.
FLAG-APRIL humana fue analizada directamente en el
sobrenadante del cultivo.
Se cotransfectaron células 293EBNA con plásmidos
que expresan TACI humana con etiqueta FLAG en el terminal N
(pJST552) (véase Figura 2), y un marcador GFP, (AN050). Las
transfecciones se realizaron usando Lipofectamina 2000
(LifeTechnologies) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
El medio de transfección era DMEM enriquecido con 10% de FBS, 4 mM
de glutamina, y 50 \muM de Z-VAD (BACHEM
Bioscience Inc.). Se recogieron las células con PBS enriquecido con
5 mM de EDTA 24 horas después de la transfección. Las células se
lavaron en tampón FACS (PBS-10% de
FBS-0,02% de NaN_{3}) y se resuspendieron a una
densidad de 5 x 10^{6} células/mL. La expresión de TACI se
verificó por tinción de 100 microlitros de células transfectadas con
mAb anti-FLAG a 5 \mug/ml sobre hielo durante 30
minutos, seguido de IgG anti-ratón de
burro-PE 1:100 (Jackson ImmunoResearch). Las células
se analizaron para determinar su capacidad de unirse a APRIL a lo
largo de un intervalo de concentraciones de 3 \mug/ml a 300 ng/ml
por incubación sobre hielo en tampón FACS durante 30 minutos. La
unión se reveló usando Rb1532, un Ab policlonal de conejo generado
frente a mAPRIL (1:100), seguido de IgG anti-conejo
de burro-PE (1:100, Jackson ImmunoResearch). Se
incluyó 7-AAD en la mancha terminal y se usó para
recolectar las células muertas. Las muestras se analizaron por FACS
y se representaron gráficamente (Figura 8). La recolección de
células analizadas se muestra como R1. La tinción específica se ve a
las tres concentraciones diferentes de la proteína APRIL murina con
etiqueta myc mostrada, en comparación con el control no proteico
(Figura 8).
250 \mul de Optimem que contenía
hTACI(1-160)-Ig se mezclaron
con varios ligandos FLAG de la familia TNF. Algunos de los ligandos
estaban en Optimem mientras que otros fueron
anti-FLAG (mAb M2)-purificados. La
característica común fue que la cantidad usada era empíricamente la
misma (500 ng para ligandos purificados, es decir, hBAFF, muBAFF,
TRAIL, FasL, EDA). Los ligandos fueron producidos en bacterias
(hBAFF, TRAIL) o expresados transitoriamente en células 293 EBNA
(todos los demás). Los Receptores-Fc control fueron
usados en su mayor parte como sobrenadantes Optimem, excepto TNFR1,
OX40, LTBR, que se purificaron en columnas de proteína A. Se usó 1
\mug de receptores purificados. Las proteínas
Receptor-Fc (aproximadamente 1 \mug) fueron
mezcladas con ligandos FLAG (aproximadamente 500 ng). El volumen se
ajustó a 1,2 ml con PBS y se añadieron 5 \mul de proteína
A-Sepharose. La incubación se efectuó durante 1 h a
4°C sobre una rueda. Se recogieron glóbulos por centrifugación y se
cargaron en una minicolumna (puntas amarillas con una frita de 1 mm
de diámetro). Se hicieron lavados aplicando vacío en el fondo de la
columna para aspirar medio y se hicieron 2 lavados con 400 \mul de
PBS. Los glóbulos secos se eluyeron con 20 \mul de
Citrato-NaOH pH 2,7 y el eluato se neutralizó con 6
\mul de Tris-HCl 1M pH 9,0. Se añadió tres veces
tampón de muestra, 10 \mul cada vez, más DTT, la muestra se
mantuvo a ebullición y se cargaron 22 \mul para el análisis por
transferencia Western. La membrana secuencialmente se coloreó con
Ponceau-S, se bloqueó en 4% de leche, 0,5%
Tween-20, después se incubó con 1 \mug/ml de M2 en
tampón de bloqueo, se lavó y se reveló con IgG
anti-ratón de cabra-peroxidasa
(1/5000 en tampón de bloqueo). Se usó ECL para iluminar la señal. La
actividad de peroxidasa se retiró con azida, la membrana se lavó y
después se indagó de nuevo con peroxidasa antihumana
de burro.
de burro.
Los resultados Western de la
co-inmunoprecipitación indican que sólo
flag-muAPRIL es capaz de
co-inmunoprecipitar por
TACI(1-160)-Ig. La unión de
TACI(1-160)-Ig a muAPRIL
parece ser específica ya que ninguno de los 14 ligandos de la
familia TNF solubles restantes etiquetados con flag fueron capaces
de interaccionar con
TACI(1-160)-Ig.
En Celis et al., CELL BIOLOGY, A
LABORATORY HANDBOOK, Volumen uno, Academic Press, San Diego, CA, se
describen ejemplos de la preparación e inoculación de células
transformadas para estimar el crecimiento de células tumorales.
1997. Las células tumorales se obtuvieron a partir de diversas
fuentes, incluyendo los bancos de células tumorales extensivos
mantenidos por ATCC (Bethesda, MD), líneas de células
inmortalizadas, líneas de células primarias inmortalizadas, líneas
de células establemente transfectadas, tejido tumoral obtenido a
partir de fuentes mamíferas, incluyendo humanas. La fuente del
tejido es un determinante principal de elección de animales
inmunodeficientes o normales (Celis et al., ibid.). Además,
hay una amplia variedad de técnicas para la inducción de crecimiento
tumoral en diversos modelos animales usando insultos carcinogénicos
o de otra clase.
Se desarrollaron modelos que utilizan el
crecimiento tumoral en ratones inmunodeficientes como medio para
determinar la actividad de nuevos ligandos sobre la biología de los
tumores (Hahne et al. (1998) J. Exp. Med.
188:1185-1190). En estos sistemas, se ensayaron
tanto ligandos como sus antagonistas, v.g., Kashii et
al. (1999) J. Immunol. 163:5358-5366;
Zhai et al. (1999) FASEB J.
13:181-189). Un mAb antagonista para un miembro de
la familia de receptores TNF (LTBR) afectó profundamente al
crecimiento de células tumorales y se demostró supervivencia
(Browning et al. (1996) J. Exp. Med.
183:867-878).
Se implantaron líneas de células tumorales en
ratones inmunodeficientes subcutáneamente y la velocidad de
crecimiento de tumores en ratones tratados con
TACI-Ig fue similar a la velocidad de crecimiento de
tumores en ratones tratados aproximadamente con 5 mg/kg/semana de
CBE11, es decir, un crecimiento tumoral mucho más lento si se
compara con la velocidad de crecimiento en los tratamientos control
dados a ratones.
Se utilizó otra variación de estos modelos como
células fuente de tumores que se saben que inducen metástasis en
animales inmunodeficientes o singénicos. Por ejemplo, la ATCC
(Bethesda, MD) proporcionó numerosas líneas tumorales humanas con
potencial metastásico conocido a una gama de tejidos, y estas líneas
se utilizan para examinar el efecto de actividad o antagonismo de
TACI sobre la metástasis. Estos modelos han sido utilizados y se
siguen utilizando actualmente (v.g., por el NCI) para evaluar
el potencial para el tratamiento de pacientes humanos.
Para formar un inhibidor de receptores para uso
en seres humanos, se usó la secuencia del cDNA del receptor humano
del dominio extracelular de TACI (SEQ ID NO:2). Con la secuencia de
cDNA humano, se diseñaron cebadores oligonucleotídicos para
amplificar por PCR el dominio extracelular del receptor en ausencia
de los dominios transmembranarios e intracelulares. Típicamente, un
experto en la técnica incluiría la mayoría de los aminoácidos entre
el último "dominio de TNF" unido por puente disulfuro y el
dominio transmembranario. Alternativamente, la cantidad de región
"tallo" se varió para optimizar la potencia del receptor
soluble resultante. Este fragmento amplificado se sometió a
tratamientos de ingeniería para que incluyera sitios de restricción
adecuados para permitir la clonación en varios vectores quiméricos
de fusión con Ig en la región C-terminal.
Alternativamente, se insertó una señal de parada en el extremo 3'
para hacer una forma soluble del receptor sin recurrir al uso de una
estrategia quimérica de fusión con Ig. Los vectores resultantes se
expresaron en casi todos los sistemas usados en biotecnología,
incluyendo levadura, células insectiles, bacterias y células de
mamíferos, y existen ejemplos para todos los tipos de expresión. Se
unieron varios dominios Fc humanos para optimizar o eliminar FcR y
complementar las interacciones en caso deseado. Alternativamente, se
usaron formas mutadas de estos dominios Fc para retirar
selectivamente FcR o complementar interacciones o la unión de
azúcares unidos por N al dominio Fc, lo que tiene ciertas
ventajas.
Usando la proteína de fusión
receptor-Ig, se puede rastrear cualquier colección
combinatoria escrutada en busca de moléculas que se unen al receptor
directamente. Estas moléculas se ensayan después en un ensayo con
formato ELISA usando la proteína de fusión
receptor-Ig y una forma soluble del ligando en busca
de la capacidad de inhibir la interacción
receptor-ligando. Este ELISA se usa directamente
para escrutar varias colecciones de productos naturales, etc.
para compuestos inhibidores. El receptor se transfecta en una línea
celular tal como la línea HT29 para formar un ensayo biológico (en
este caso citotoxicidad) que después forma el ensayo de escrutinio
para demostrar adicionalmente bloqueo.
El número de células tumorales inyectadas
subcutáneamente (s.c.) se puede determinar en estudios de titulación
antes de iniciar el trabajo con antagonistas. Por ejemplo, la línea
de tumor sólido del adenocarcinoma de colon SW480 y la línea del
fibrosarcoma NIH 3T3, que crecen agresivamente, 8 x 10^{5} células
y 5 x 10^{6} células, respectivamente, se pueden implantar en
ratones inmunodeficientes. La dosificación con proteínas
TACI-Ig o control se puede iniciar justo antes del
implante, con dosis subsiguientes cada 7 días a partir de entonces.
La dosis puede ser, por ejemplo, 100 \mug/ratón.
Después se mide el diámetro del tumor usando un micrómetro, y se calcula el volumen usando la fórmula
Después se mide el diámetro del tumor usando un micrómetro, y se calcula el volumen usando la fórmula
\hbox{V = 4/3 \pi R ^{3} .}
El número de células tumorales inyectadas s.c.
en ratones (nu/nu) inmunodeficientes fue determinado en estudios
previos de respuesta a la dosis. Para los estudios que usaban HT29,
se implantaron 1 x 10^{6} células por ratón. HT29 se deriva de un
adenocarcinoma de colon humano, y tiene características de
crecimiento similares a algunas otras líneas de adenocarcinoma de
colon humano (v.g., SW480) tales como la formación rápida del tumor
y el crecimiento rápido del tumor. Los ratones implantados con
células HT29 fueron tratados el día del implante y a partir de
entonces cada semana con 100 \mug de
hTACI(1-114)-Ig administrados
intraperitonealmente (i.p.). Los controles negativos incluyeron las
proteínas irrelevantes hIgG y mAb MOPC21 policlonales. Los
controles positivos incluyeron BCMA-Ig, otro
inhibidor de la unión a APRIL, y CBE11, un mAb frente a
mLTb-R que se sabe que ralentiza el crecimiento del
tumor adenocarcinómico (Browning et al. (1996) J. Exp.
Med. 183:867-878). Se midió el diámetro del
tumor usando un micrómetro, y se calculó el volumen usando la
fórmula V = 4/3\piR^{3}.
Para estudios con el carcinoma de pulmón A549,
se implantaron 1 x 10^{6} células/ratón. Los ratones fueron
tratados con 100 \mug de
TACI(1-114)-Ig, 100 \mug de
BCMA-Ig, 100 \mug de hIgG, o 100 \mul de PBS
comenzando el día del implante y a partir de entonces se trataron
semanalmente. Se midió el diámetro del tumor usando un micrómetro, y
se calculó el volumen usando la fórmula V = 4/3\piR^{3}.
Los resultados que presentan inhibición del
crecimiento del tumor del adenocarcinoma de colon HT29 se muestran
en la Figura 11. Los resultados que presentan inhibición del
crecimiento del tumor del carcinoma de pulmón A549 se muestran en la
Figura 12. En ambos experimentos, se obtiene una ralentización
significativa del crecimiento del tumor. Ya que tanto el tamaño del
tumor como la supervivencia están directamente relacionadas en estos
modelos, el tratamiento con TACI-Ig también tiene
impacto sobre la supervivencia del animal. Por ejemplo, 95 días
después del implante del tumor, el 50% de los ratones tratados con
hIgG se puntuaron como terminales, en comparación con sólo el 12,5%
de los ratones tratados con TACI-Ig. Esto representa
un incremento de 4 veces en la supervivencia en este punto de tiempo
en fase terminal.
Este ejemplo muestra la unión titulable de
proteínas de fusión TACI-Ig a una línea celular
estable que expresa muAPRIL sobre su superficie. 25 \mul o bien 5
\mul de medio acondicionado de células 293EBNA transfectadas
temporalmente con plásmidos que expresan
hTACI(1-114)-Ig,
hTACI(32-114) o hFN14-Fc se
diluyeron en tampón FACS hasta un volumen final de 50 \mul y se
incubaron durante 1 hora sobre hielo con 2,5 x 10^{5} células 293
que expresaban establemente el dominio de unión al receptor de
muAPRIL sobre su superficie. Después de lavar con tampón FACS, las
células se incubaron entonces con IgG antihumana-PE
(1:100, Jackson ImmunoResearch) durante 30 minutos en hielo. Las
células se lavaron de nuevo, se fijaron en 1% de paraformaldehido y
se analizaron por FACS. La Figura 13 muestra un desplazamiento FL2
que indica una tinción titulable de muAPRIL de superficie por
HTACI(1-114)-Ig y
hTACI(32-114)-Ig. No se
observó ninguna tinción con el control de sólo la segunda etapa. No
se observó tinción con o bien dilución de una Ig control, una
proteína de fusión FN14-Ig, ambas de las cuales
migraban conjuntamente con el histograma de sólo la segunda
etapa.
Se revistieron placas de ELISA (Coming) con 5
\mug/ml de control mLTbR-Ig o
hTACI(32-114)-Ig en tampón
bicarbonato a pH = 9,6 durante una noche, y después se lavaron en
solución de PBS/0,05% de Tween-20 antes de bloquear
durante 2 h a 37°C con PBS/2% de seralbúmina bovina (BSA). Se
añadieron preparaciones de proteína APRIL en el intervalo de 0,0048
a 3 \mug/ml, diluidas en PBS/2% de BSA. La detección de la unión
específica a APRIL se hizo con antisueros de conejo
anti-APRIL murina (R1532) y HRP
anti-conejo de burro (Jackson Immunoresearch) o con
mAb M2 anti FLAG acoplado a HRP (Kodak). El desarrollo enzimático se
hizo con TMA y H_{2}O_{2} y se paró con H_{2}SO_{4},
siguiendo protocolos clásicos. El color amarillo desarrollado se
leyó a 450 nm en un lector de placas. Los resultados se muestran en
la Figura 14.
El mRNA de APRIL se expresa preferentemente en
muestras de tumores. El análisis de las colecciones de cDNA
recogidas por Incyte Inc., y mostradas en la Tabla I demuestran que
APRIL se expresa extensamente en numerosas muestras neoplásicas y de
tumores sólidos, pero se expresan con mucha menos frecuencia en
muestras de tejidos sanos. La expresión en tejido enfermo es
ocasionalmente prominente.
<110> Biogen, Inc.
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Taci como agente antitumoral
\vskip0.400000\baselineskip
<130> BIOG0078
\vskip0.400000\baselineskip
<140> PCT/US01/40626
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
2001-04-27
\vskip0.400000\baselineskip
<150> USSN 60/199,946
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2000-04-27
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 293
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 882
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 249
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus músculo
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 788
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Mus músculos
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1101
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1101)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 366
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1005
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(1005)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 334
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 531
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(531)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 177
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1470
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (119)..(1021)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1025)..(1054)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 301
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Met Gly Val Ser Gly Arg Ser Arg Pro
Ala}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1304
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (42)..(1253)
\vskip0.400000\baselineskip
<223>
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 404
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Mus músculos
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<213> Homo sapiens
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\sa{Met Gly Val Ser Gly Arg Ser Arg Pro
Ala}
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<211> 1304
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<400> 17
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Claims (12)
1. Uso de un reactivo de TACI en la fabricación
de un medicamento para la prevención o tratamiento de un tumor
sólido, donde dicho medicamento prolonga el tiempo medio de
supervivencia y/o reduce el tamaño del tumor sólido, donde dicho
reactivo de TACI puede aumentar o disminuir la unión de ligandos a
TACI y donde dicho reactivo de TACI es un polipéptido de fusión que
comprende al menos dos segmentos, donde un primer segmento comprende
un polipéptido de TACI o fragmento del mismo seleccionado del grupo
que consiste en:
(a) restos de aminoácidos 1-166
de SEQ ID NO:1;
(b) restos de aminoácidos 1-160
de SEQ ID NO:1;
(c) restos de aminoácidos 1-114
de SEQ ID NO: 1;
(d) restos de aminoácidos 32-114
de SEQ ID NO:1;
(e) un polipéptido que tiene al menos 80% de
identidad de la secuencia de aminoácidos con los restos de
aminoácidos 1-166 de SEQ ID NO: 1;
(f) un polipéptido que tiene al menos 80% de
identidad de la secuencia de aminoácidos con los restos de
aminoácidos 1-160 de SEQ ID NO: 1;
(g) un polipéptido que tiene al menos 80% de
identidad de la secuencia de aminoácidos con los restos de
aminoácidos 1-114 de SEQ ID NO:1; y
(h) un polipéptido que tiene al menos 80% de
identidad de la secuencia de aminoácidos con los restos de
aminoácidos 32-114 de SEQ ID NO:1, y
un segundo segmento que comprende un polipéptido
inmunoglobulínico.
2. El uso de la reivindicación 1, en donde el
tiempo medio de supervivencia se prolonga hasta aproximadamente un
15% más.
3. El uso de la reivindicación 1, en donde el
tiempo medio de supervivencia se prolonga hasta aproximadamente un
20% más.
4. El uso de la reivindicación 1, en donde el
tiempo medio de supervivencia se prolonga hasta aproximadamente un
25% más.
5. El uso de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, donde dicho tumor es un cáncer seleccionado
entre cáncer de células renales, sarcoma de Kaposi, cáncer de
próstata, cáncer de mama, sarcoma, carcinoma de ovario, cáncer
rectal, cáncer de garganta, melanoma, cáncer de colon, cáncer de
vejiga, mastocitoma, cáncer de pulmón, adenocarcinoma de mama,
carcinoma faríngeo de células escamosas, cáncer gastrointestinal y
cáncer de estómago.
6. El uso de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, donde dicho tumor sólido es padecido por un
ser humano, una vaca, un caballo, un perro, un ratón, una rata o un
gato.
7. El uso de la reivindicación 1, en donde dicho
tumor sólido se reduce en tamaño hasta en aproximadamente 10%.
8. El uso de la reivindicación 1, en donde dicho
tumor sólido se reduce en tamaño hasta en aproximadamente 15%.
9. El uso de la reivindicación 1, en donde dicho
tumor sólido se reduce en tamaño hasta en aproximadamente 20%.
10. El uso de la reivindicación 1, en donde
dicho tumor sólido se reduce en tamaño hasta en aproximadamente 25%
o más.
11. El uso de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 10, donde dicho polipéptido inmunoglobulínico
es un dominio Fc.
12. El uso de la reivindicación 11, donde dicho
dominio Fc es un dominio Fc de IgG.
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