ES2645663T3 - Proteínas de unión específica y uso de las mismas - Google Patents

Abstract

Anticuerpo anti-receptor de factor de crecimiento epidérmico (EGFR) aislado para utilizar en el tratamiento de un cáncer residente en el cerebro en un mamífero, en el que el cáncer residente en el cerebro se selecciona del grupo que consiste en glioblastoma, meduloblastoma, meningioma, astrocitoma neoplásica y malformación arteriovenosa neoplásica, y en el que el anticuerpo comprende una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 164, comprende una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos establecida en la SEQ ID NO: 166 y se conjuga a un agente seleccionado del grupo que consiste en un agente de ablación química, toxina, inmunomodulador, citoquina, agente citotóxico, agente quimioterapéutico y fármaco.

Description

imagen1

imagen2

imagen3

imagen4

imagen5

imagen6

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

FACS. Los datos representan la internalización media en cada punto de tiempo ± SE de 3 (DH8.3) o 4 (mAb806) experimentos separados.

Las Figuras 4A y 4B ilustran la biodistribución (% ID/g tejido de tumor) de (a) mAb806-I125 y (b) DH8.3-I131 radiomarcados en ratones desnudos que portan xenoinjertos U87MG y U87MG.Δ2-7. Cada barra representa la media de 5 ratones ± SE excepto para 1 hora donde n = 4.

Las Figuras 5A y 5B ilustran la biodistribución de los anticuerpos mAb806-I125 (barra vacía) y DH8.3-I131 (barra opaca) radiomarcados expresada como las propartes (a) tumor:sangre o (b) tumor:hígado en ratones desnudos que portan xenoinjertos U87MG.Δ2-7. Cada barra representa la media de 5 ratones ± SE excepto para 1 hora donde n =

4.

Las Figuras 6A-C ilustran el análisis de citometría de flujo de líneas celulares que contienen la amplificación del gen de EGFR. Las células A431 se tiñeron con mAb806, DH8.3 o 528 (histogramas en negro) y se compararon con un anticuerpo IgG2b irrelevante (histograma vacío).

Las Figuras 7A y 7B ilustran la biodistribución (% ID/g tejido de tumor) de (a) mAb806-I125 y (b) 528-I131 radiomarcados en ratones desnudos que portan xenoinjertos U87MG.Δ2-7 y A431.

Las Figuras 8A-8D ilustran la biodistribución de los anticuerpos mAb806-I125 (barra vacía) y 528-I131 (barra opaca) y expresada en forma de propartes (A,B) tumor:sangre o (C,D) tumor:hígado en ratones desnudos que portaban (A,C) xenoinjertos U87MGΔ2-7 y (B,D) xenoinjertos A431.

Las Figuras 9A y 9B ilustran el efecto anti-tumoral de mAb806 sobre las velocidades de crecimiento de xenoinjerto

(A) U87MG y (B) U87MG.Δ2-7 en un modelo preventivo. Se inyectaron s.c. 3 x 106 células U87MG o U87MG.Δ2-7 en ambos flancos de ratones desnudos BALB/c de 4-6 semanas de edad, (n=5) el día 0. Se inyectaron a los ratones

i.p. o bien 1 mg de mAb806 (●); 0,1 mg de mAb806 (▲); o bien vehículo (O) empezando un día antes de la inoculación de las células tumorales. Se les administraron inyecciones tres veces por semana durante dos semanas según se indica mediante flechas. Los datos se expresan como el volumen medio del tumor ± S.E.

Las Figuras 10A, 10B y 10C ilustran el efecto anti-tumoral de mAb806 sobre xenoinjertos (A) U87MG, B) U87MG.Δ27 y (C) U87MG.wtEGFR en un modelo establecido. Se inyectaron s.c. 3 x 106 células de U87MG, U87MG.Δ2-7, o U87MG.wtEGFR, en ambos flancos de ratones BALB/c desnudos de 4-6 semanas de edad, (n=5). Se inyectaron i.p. a los ratones dosis de 1 mg de mAb 806 (●); dosis de 0,1 mg de mAb806 (▲); o vehículo (O) empezando cuando los tumores habían alcanzado un volumen medio de tumor de 65 -80 mm3. Las inyecciones se administraron tres veces por semana durante dos semanas según se indica mediante flechas. Los datos se expresan como el volumen medio del tumor ± S.E.

Las Figuras 11A y 11B ilustran el efecto anti-tumoral de mAb806 sobre xenoinjertos A431 en modelos (A) preventivos y

(B) establecidos. Se inyectaron s.c. 3 x 106 células A431 en ambos flancos de ratones BALB/c desnudos de 4-6 semanas de edad (n=5). Se inyectaron a los ratones i.p. o bien dosis de 1 mg de mAb806 (●); o bien vehículo (O), empezando un día antes de la inoculación de las células tumorales en el modelo preventivo, o cuando los tumores habían alcanzado un volumen medio de tumor de 200 mm3. Las inyecciones se administraron tres veces por semana durante dos semanas como se indica mediante flechas. Los datos se expresan como el volumen medio del tumor ±

S.E.

La Figura 12 ilustra el efecto anti-tumoral del tratamiento con mAb806 combinado con el tratamiento con AG1478 sobre xenoinjertos A431 en un modelo preventivo. Los datos se expresan como el volumen medio del tumor ± S.E.

La Figura 13 describe la unión de mAb806 a células A431 en presencia de concentraciones crecientes de AG1478 (0,5 μMy5 μM).

Las Figuras 14A y 14B ilustran (A) la secuencia de ácidos nucleicos y la (B) traducción a aminoácidos de la misma del gen de la cadena VH de 806 (SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2, respectivamente).

Las Figuras 15A y 15 B ilustran (A) la secuencia de ácidos nucleicos y la (B) traducción a aminoácidos de la misma del gen de la cadena VL de 806 (SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4, respectivamente).

La Figura 16 muestra la secuencia de cadena VH (SEQ ID No: 2) numerada según Kabat con las CDR (SEQ ID NO: 15, 16 y 17) subrayadas. Los restos clave de la secuencia de la cadena de VH (SEQ ID NO: 2) son el 24, 37, 48, 67 y 78.

8

imagen7

imagen8

imagen9

imagen10

5

15

25

35

45

55

65

los cambios de aminoácidos de las figuras 59 y 60, así como los cambios de ácidos nucleicos conservativos que no condujeron a un cambio en el aminoácido. El intrón entre la señal y la cadena VH en hu806 se ha eliminado para facilitar la visualización. Se subrayan la secuencia señal y CDR. La secuencia de aminoácidos correspondiente (SEQ ID NO: 42) se ha superpuesto en la alineación.

La figura 63 muestra la unión del anticuerpo hu806 purificado obtenido de células 293 transfectantes transitorias a EGFR-ECD recombinante tal como se determina por Biacore. No se observó unión a EGFR-ECD con anticuerpo de control IgG1 humana purificada.

La figura 64 muestra el documento de texto con formato GenBank de la secuencia (SEQ ID NO: 41) y anotaciones de plásmido que codifican hu806 IgG1.

La figura 65 muestra la alineación de secuencias de aminoácidos para CDR de mAb806 (SEQ ID NOS: 15-18, 20 y 193) y mAb175 (SEQ IDNOS: 130-132, 135 y 194-195). Están en negrita las diferencias de secuencia entre los dos anticuerpos.

Las figuras 66A y 66B muestran la tinción inmunohistoquímica de líneas celulares y de hígado humano normal con mAb175. (A) Se utilizó mAb175 biotinilado para teñir secciones preparadas a partir de bloques que contienen las células A431 (sobreexpresan el wtEGFR), células U87MG.Δ2-7 (expresar el Δ2-7EGFR) y células U87MG (expresar el wtEGFR en niveles modestos). (B) Tinción de hígado humano normal (400x) con mAb175 (panel izquierdo), control de isotipo (panel central) y el control de anticuerpo secundario (panel derecho). No se observó tinción específica sinusoidal o de hepatocitos.

Las figuras 67A, 67B, y 67C muestran la reactividad de mAb806 y mAb175 con fragmentos del EGFR expresado en levadura. (A) Histogramas de citometría de flujo representativas que representan la señal de fluorescencia media del marcaje de mAb175 y mAb806 de los fragmentos de EGFR expresados en levadura. Con la expresión en levadura hay un porcentaje de células que no expresan la proteína en su superficie dando lugar a 2 picos en el histograma. El anticuerpo 9E10 se utiliza como control positivo ya que todos los fragmentos contienen una etiqueta c-myc Cterminal lineal. (B) Resumen de la unión de anticuerpos a varios fragmentos de EGFR. (C) Los fragmentos de EGFR se desnaturalizaron por calentamiento de gránulos de levadura a 800ºC durante 30 min. La etiqueta c-myc todavía fue reconocida por el anticuerpo 9E10 anti-myc en todos los casos, lo que demuestra que el tratamiento térmico no compromete la proteína expresada en la superficie de levadura. Se utilizó el anticuerpo de EGFR mAb225 sensible a la conformación para confirmar la desnaturalización.

Las figuras 68A, 68B, 68C, y 68D muestran los efectos antitumorales de mAb175 en xenoinjertos de cáncer de próstata y cerebral. (A) Los ratones (n = 5) que llevan xenoinjertos U87MG.Δ2-7 se inyectaron i.p. con PBS, 1 mg de mAb175 o mAb806 (control positivo), tres veces por semana durante dos semanas en los días 6, 8, 10, 13, 15 y 17 cuando el volumen del tumor de partida fue de 100 mm3. Los datos se expresan como el volumen tumoral medio +/-SE. (B) Las células se tiñeron con dos anticuerpos irrelevantes (azul sólido y verde hueco), mAb 528 para EGFR total (rosa, sólido), mAb806 (azul claro, hueco) y mAb175 (naranja, hueco) y a continuación se analizaron por FACS.

(C)

Las células DU145 se lisaron, se sometieron a IP con mAb 528, mAb806, mAb175 o dos anticuerpos irrelevantes independientes y a continuación se inmunotransfirieron para EGFR. (D) Los ratones (n = 5) que llevan xenoinjertos DU145 se inyectaron i.p. con PBS, 1 mg de mAb175 o mAb806, diariamente en los días 18-22, 25-29 y 39-43 cuando el volumen del tumor de partida fue 85 mm3. Los datos se expresan como el volumen medio del tumor +/-SE.

Las figuras 69A, 69B, 69C, 69D, 69E y 69F muestran las estructuras cristalinas de péptido EGFR 287-302 unido a los fragmentos Fab (A) Representación de Fab 806, con la cadena ligera, de color rojo; cadena pesada, azul; péptido unido, amarillo; y el EGFR 287-302 superpuesto de EGFR, púrpura. (B) Representación de Fab 175 con la cadena ligera, de color amarillo; cadena pesada, verde; péptido unido, lila; y EGFR 287-302 de EGFR (DI-3), púrpura.

(C)

Detalle de (B) que muestra la similitud de EGFR 287-302 en el receptor con el péptido unido a FAb 175. Los esqueletos peptídicos se muestran como trazas Cα y las cadenas laterales que interactúan como palos. Átomos de O son de color rojo; N, azul; S, naranja y C, para la cadena principal. (D) Superposición de EGFR con el complejo Fab175:péptido que muestra la superposición espacial. Coloración como en (C) con la superficie de EGFR187-286 de color turquesa. (E) Vista ortogonal a (D) con EGFR187-286 mostrado en azul opaco y la superficie de las cadenas ligera (naranja) y pesada (verde) transparentes. (F) Estereovista detallada del complejo de 175 Fab que mira en el sitio de unión al antígeno. Colorante como en (C) y los enlaces de hidrógeno de la cadena lateral en puntos en negro. Las moléculas de agua escondidas en la formación del complejo se muestran como esferas de color rojo.

Las figuras 70A, 70B, 70C, y 70D muestran la influencia de la unión de cisteína 271-283 en la unión de mAb806 a EGFR. (A) Células transfectadas con wtEGFR, EGFR-C271A, EGFR-C283A o el mutante C271A/C283A se tiñeron con mAb528 (histograma rosa sólido), mAb806 (línea azul) o sólo el anticuerpo secundario (púrpura) y después se analizaron por FACS. La ganancia se creó utilizando un anticuerpo irrelevante emparejado por clase. (B) Las células BaF3 que expresan el EGFR-C271A o C271/283A EGFR fueron examinadas por su respuesta a EGF en un ensayo de MTT tal como se ha descrito. Se derivaron EC50S mediante el ajuste de Bolzman de los puntos de datos. Los

13

imagen11

5

15

25

35

45

55

65

La figura 82 muestra el análisis de gel por enfoque isoeléctrico de hu806 transfectante purificado GS CHO 40A10 (5 µg) después de la producción de 15L. Las proteínas se detectaron por tinción con Coomassie azul. El carril 1, marcadores de pI; Carril 2, hu806 (tres isoformas, pI 8,66 a 8,82); Carril 3, marcadores de pI.

La figura 83 muestra la unión a las células A431: análisis de citometría de flujo de preparaciones de anticuerpos hu806 purificados por proteína A (20 µg/ml), e isotipo de control huA33 (20 µg/ml). Los controles incluyen anticuerpo secundario solo (verde) y ch806 (rojo). Las construcciones Hu806 se produjeron mediante cultivo a pequeña escala.

La figura 84 muestra la unión a células A431: análisis de citometría de flujo de preparaciones de anticuerpos mAb806, ch806 y hu806 40A10 purificados (20 µg/ml) que se unen -10% de EGFR de tipo salvaje en la superficie celular, 528 (se une a EGFR tanto de tipo salvaje como de2 -7EGFR) y el anticuerpo control irrelevante (20 µg/ml) tal como se indica.

La figura 85 muestra la unión a células de glioma U87MG.de2-7. Análisis por citometría de preparaciones de anticuerpos mAb806, ch806 y hu806 40A10 purificados (20 µg/ml) y anti-EGFR 528 y el anticuerpo control irrelevante (20 µg/ml).

La figura 86 muestra la unión específica de constructos de anticuerpo 806 radiomarcado con 125I a: (A) células de glioma U87MG.de2-7 y (B) células de carcinoma A431.

La figura 87 muestra los análisis Scatchard: constructos de anticuerpos (A) ch806 y (B) hu806 radiomarcados con 125I que se unen a células U87MG.de2-7.

La figura 88 muestra los análisis Scatchard: constructos de anticuerpos (A) ch806 y (B) hu806 radiomarcados con 125I que se unen a células A431.

La figura 89 muestra el análisis de BIAcore de la unión a epítopo del péptido287-302 EGFR 806 mediante el paso de

(A) hu806 y (B) ch806 sobre el péptido inmovilizado en concentraciones crecientes de 50 nM, 100 nM, 150 nM, 200 nM, 250 nM y 300 nM.

La figura 90 muestra la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo mediada por ch806 y hu806 en células A431 diana determinada en (A) 1 µg/ml de cada anticuerpo en un intervalo de propartes de efector a células diana (E:T = 0,78:1 a 100:1); (B) a E:T = 50:1 en un intervalo de concentraciones de cada anticuerpo (3,15 ng/ml -10 µg/ml) en A431 diana.

La figura 91 muestra el tratamiento de xenoinjertos A431 establecidos en ratones Balb/c desnudos. Grupos de 5 ratones recibieron dosis de 6 X 1 mg durante 2 semanas de terapia con anticuerpos tal como se indica (flechas). La media de +/-SEM del volumen del tumor se presenta hasta la terminación del estudio.

La figura 92 muestra el tratamiento de xenoinjertos U87MG.de2-7 establecidos en ratones Balb/c desnudos. Grupos de 5 ratones recibieron dosis de 6 X 1 mg durante 2 semanas de terapia con anticuerpos tal como se indica (flechas). La media de +/-SEM del volumen del tumor se presenta hasta la terminación del estudio.

La figura 93 muestra desviaciones de los valores de desplazamiento químico de “random coil” para el péptido mAb806 (A) N, (B) y HN (C) HA. El péptido se preparó en una solución de H2O que contiene 5% H2O2, NaCl 70 mM y NaPO4 50 mM a pH 6,8. Todos los espectros utilizados para las asignaciones secuenciales fueron adquiridas a 298K en un Bruker Avance500.

Las figuras 94A, 94B, 94C, 94D, 94E y 94F muestran imágenes de cámara gamma de cuerpo completo del paciente 7 A) anterior, y B) posterior, Día 5 después de la infusión de 111In-ch806. La alta captación de 111In-ch806 en las lesiones metastásicas en los pulmones (flechas) es evidente. C) y D) muestran lesiones metastásicas (flechas) en TAC. E) Imágenes de espectros 3D de tórax, y F) imágenes transaxiales registradas de SPECT y TAC que muestra la captación específica de 111In-ch806 en lesiones metastásicas.

Las figuras 95A, 95B, 95C, 95D, 95E y 95F muestran imágenes planas de la cabeza y el cuello del paciente 8 obtenidas A) Día 0, D) Día 3 y C) Día 7 después de la infusión de 111In-ch806. La actividad de la acumulación de sangre inicial se considera en el día 0, y la captación de 111In-ch806 en un astrocitoma anaplásico en el lóbulo frontal derecho es evidente antes del día 3 (flecha), y aumenta antes del Día 7. La captación específica de 111In-ch806 se confirma en D) la imagen de SPECT del cerebro (flecha), en el lugar del tumor (flecha) evidente en E) 18F-FDG PET, y F) MRI.

Las figuras 96A, 96B, 96C, y 96D muestran que la captación similar de 111In-ch806 en el tumor es evidente en el paciente 3 en comparación con el paciente 4, a pesar de las diferencias en la expresión del antígeno de 806 en muestras de tumores seleccionadas. A) Localización de 111In-ch806 en la metástasis pulmonar (flecha) en la imagen transaxial SPECT en el Paciente 4, con la actividad de acumulación de sangre cardíaca (B) evidente. B) TAC correspondiente. Se mostró que el tumor archivado tenía <10% de positividad para la expresión de 806. C)

15

imagen12

imagen13

5

15

25

35

45

55

65

de TNF mostrada en el documento U.S.S.N. 60/355,838 presentado el 13 de Febrero de 2002) o una toxina (por ejemplo, ricina) o un agente o factor anti-mitótico o apoptótico.

[0072] Las partes Fab y F(ab’)2 de las moléculas de anticuerpo se pueden preparar mediante reacción proteolítica con papaína y pepsina, respectivamente, en moléculas de anticuerpo sustancialmente intactas mediante métodos que son bien conocidos. Véase por ejemplo, la Patente de los Estados Unidos No. 4.342.566 de Theofilopolous et al. Las partes de la molécula de anticuerpo Fab’ también son bien conocidas y son producidas a partir de partes F(ab’)2 seguido de reducción de los enlaces disulfuro que unen las dos partes de la cadena pesada como con mercaptoetanol, y seguido de alquilación del mercaptano de la proteína resultante con un reactivo tal como yodoacetamida. En el presente documento se prefiere un anticuerpo que contiene moléculas de anticuerpo intacto.

[0073] La expresión “anticuerpo monoclonal” en sus diferentes formas gramaticales hace referencia a un anticuerpo que tiene solamente una especie de sitio de combinación del anticuerpo capaz de inmunorreaccionar con un antígeno concreto. Un anticuerpo monoclonal presenta de ese modo habitualmente una única afinidad de unión por cualquier antígeno con el que inmunorreacciona. Un anticuerpo monoclonal también puede contener una molécula de anticuerpo que tenga una pluralidad de sitios de combinación de anticuerpos, cada uno inmunoespecífico para un antígeno diferente; por ejemplo, un anticuerpo monoclonal biespecífico (quimérico).

[0074] El término “dominio de unión al antígeno” describe la parte de un anticuerpo que comprende la zona que se une específicamente y es complementaria a una parte o a todo un antígeno. Cuando un antígeno es grande, un anticuerpo se puede unir a una parte concreta del antígeno solamente, cuya parte se denomina epítopo. Un dominio de unión a antígeno puede ser proporcionado por uno o más dominios variables de un anticuerpo. Preferiblemente, un dominio de unión a un antígeno comprende una región variable de cadena ligera del anticuerpo (VL) y una región variable de una cadena pesada de un anticuerpo (VH).

[0075] “Modificación post-traduccional” puede abarcar una modificación cualquiera o una combinación de modificaciones, incluyendo una modificación covalente, que experimenta una proteína una vez que la traducción se ha completado y después de haber sido liberada desde el ribosoma o sobre el polipéptido naciente cotraduccionalmente. La modificación post-traduccional incluye, pero no está limitada, a fosforilación, miristilación, ubicuitinación, glicosilación, unión de coenzima, metilación y acetilación. La modulación post-traduccional puede modular o influir en la actividad de una proteína, en su destino intracelular o extracelular, en su estabilidad o vida media, y/o su reconocimiento por ligandos, receptores u otras proteínas. La modificación post-traduccional se puede producir en orgánulos celulares, en el núcleo o citoplasma o extracelularmente.

[0076] El término “específico” se puede utilizar para hacer referencia a la situación en la que un miembro de un par de unión específica no mostrará ninguna unión significativa con moléculas distintas de su pareja o parejas de unión específica. El término también es aplicable, por ejemplo, cuando un dominio de unión al antígeno es específico para un epítopo concreto que es portado por numerosos antígenos, en cuyo caso el miembro de unión específica que lleva el dominio de unión al antígeno será capaz de unirse a los diferentes antígenos que lleven el epítopo.

[0077] El término “comprende” se utiliza generalmente en el sentido de incluye, es decir que permite la presencia de una o más características o componentes.

[0078] El término “que consiste sustancialmente en” hace referencia a un producto, particularmente una secuencia peptídica, de un número definido de residuos que no está unido covalentemente a un producto más grande. En el caso del péptido de la invención referido anteriormente, los expertos en la técnica entenderán que se pueden contemplar, sin embargo, modificaciones menores en el extremo N o C del péptido, tales como la modificación química del extremo para añadir un grupo protector o similar, por ejemplo la amidación del extremo C.

[0079] El término “aislado” hace referencia al estado en el que estarán los miembros de unión específica de la invención, o el ácido nucleico que codifica tales miembros de unión, según la presente invención. Los miembros y el ácido nucleico estarán libres o sustancialmente libres de material con el cual están asociados naturalmente, tales como otros polipéptidos o ácido nucleicos que se encuentran en su entorno natural, o el entorno en el cual se preparan (por ejemplo cultivo celular) cuando dicha preparación es mediante tecnología de ADN recombinante practicada in vitro o in vivo. Los miembros y ácidos nucleicos se pueden formular con diluyentes o coadyuvantes e incluso con fines prácticos pueden ser aislados -por ejemplo los miembros se mezclarán normalmente con gelatina u otros portadores si se utilizan para recubrir placas de microtitulación para su uso en inmunoensayos, o se mezclarán con portadores o diluyentes farmacéuticamente aceptables cuando se utilicen en diagnóstico o terapia. Los miembros de unión específica pueden estar glicosilados, de forma natural o por medio de sistemas de células eucarióticas heterólogas, o pueden no estar glicosilados (por ejemplo, si se producen mediante la expresión en una célula procariótica).

[0080] Además, tal como se utiliza en el presente documento, los términos “glicosilación” y “glicosilado” incluyen y abarcan la modificación post-traduccional de las proteínas, denominadas glicoproteínas, mediante la adición de oligosacáridos. Los oligosacáridos se añaden en sitios de glicosilación de las glicoproteínas, incluyendo particularmente oligosacáridos unido a N y oligosacáridos unidos O. Los oligosacáridos unidos a N se añaden a un

18

imagen14

imagen15

imagen16

imagen17

imagen18

imagen19

imagen20

imagen21

imagen22

imagen23

imagen24

imagen25

imagen26

imagen27

imagen28

imagen29

imagen30

imagen31

imagen32

imagen33

imagen34

imagen35

imagen36

imagen37

imagen38

imagen39

imagen40

imagen41

imagen42

imagen43

imagen44

imagen45

imagen46

Sí

Sí

++++ ++ ++

*tinción focal

Ejemplo 13

Inmunoreactividad de EGFR en tejido normal

5 [0327] Con el fin de determinar si el EGFR de2-7 se expresa en tejido normal, se llevó a cabo un estudio inmunohistoquímico con mAb806 y DH8.3 en un panel de 25 tejidos. No hubo una fuerte inmunorreactividad con cualquiera de mAb806 o DH8.3 en cualquier tejido probado, lo que sugiere que el EGFR de2-7 está ausente en tejidos normales (Tabla 3). Hubo algo de tinción variable presente en las amígdalas con mAb806 que se limitó a la

10 capa de células basales de la epidermis y las células escamosas de la mucosa del epitelio. En placenta, se observó una inmunotinción ocasional del epitelio trofoblasto. Curiosamente, dos tejidos que expresan altos niveles endógenos de wtEGFR, el hígado y la piel, no mostraron ninguna reactividad significativa de mAb806. No se observó reactividad con las muestras de hígado en absoluto, y se detectó una reactividad focal sólo débil e inconsistente ocasionalmente (en no más de 10% de todas las muestras estudiadas) en los queratinocitos basales

15 en muestras de piel y en el epitelio escamoso de la mucosa de las amígdalas, demostrando además que este anticuerpo no se une al wtEGFR expresado en la superficie de células en un grado significativo (Tabla 3). Todos los tejidos fueron positivos para el wtEGFR como lo demuestra la tinción universal observada con el anticuerpo 528 (Tabla 3).

20 Tabla 3

Reactividad de 582, DH8.3 y 806 en tejidos normales

Tejido

528 DH8.3 806

Esófago

pos - -

Estómago

pos - -

Duodeno

pos - -

Intestino delgado/Duodeno

Pos - -

Colon

Pos - -

Hígado

Pos - -

Glándulas salivares (parótida)

pos - -

Riñón

Pos - -

Vejiga urinaria

Pos - -

Próstata

Pos - -

Testículos

Pos - -

Útero (cx/endom)

Pos -* -

Trompa de Falopio

Pos - -

Ovario

Pos - -

Mama

Pos -* -

Placenta

Pos - -

Nervio periférico

Pos - -

Músculo esquelético

Pos - -

Glándula tiroides

Pos - -

Nódulo linfático

Pos - -

Bazo

Pos - -

Amígdalas

Pos - -reactivdad ocasional débil de la capa basal de epitelio escamoso

Corazón

Pos - -

Pulmón

Pos - -

Piel

Pos - -reactivdad ocasional débil de la capa basal de epitelio escamoso

*cierto tinción estromal en varios tejidos

Ejemplo 14 25 Inmunoreactividad de EGFR en varios tumores [0338] Se examinó el grado de EGFR de2-7 en otros tipos de tumores usando un panel de 12 tumores malignos diferentes. El anticuerpo 528 mostró tinción homogénea frecuente en muchos tumores analizados, excepto el

52

imagen47

[0333] Caso # 3 también reveló una mutación (designada A2 en la Tabla 5), que incluía las secuencias de la mutación de2-7 pero esto no parecía ser la deleción de2-7 clásica con la pérdida de las 801 bases (datos no mostrados). Este caso fue negativo para la reactividad de DH8.3, pero mostró reactividad con 806, lo que indica que 806 puede reconocer una mutación de EGFR adicional y posiblemente única.

Tabla 5

Análisis inmunohistoquímico de 46 glioblastomas no seleccionados con mAb 528, 806 y DH8.3

#

528 806 DH8.3 EGFR Amp.* 5’MUT

1

++++ ++++ ++ A 5’MUT

2

++++ ++++ ++++ N WT

3

++++ ++++ (det.) Neg. N A2

4

++++ ++++ Neg. N WT

5

++++ ++++ ++++ N 5’MUT

6

++++ ++++ Neg. A WT

7

++++ ++++ ++++ N 5’MUT

8

++++ ++++ ++++ A 5’MUT

9

++++ ++++ Neg. A WT

10

++++ Neg- Neg. N WT

11

++ ++ ++ A 5’MUT

12

++++ ++ Neg. A 5’MUT

13

++++ ++++ Neg. N WT

14

++ Neg. Neg. Nd nd

15

++ ++ Neg. N WT

16

+ Neg. Neg. N nd

17

++++ Neg. Neg. N WT

18

++++ ++++ Neg. A 5’MUT

19

++++ ++++ Neg. N WT

20

++++ Neg. Neg. N WT

21

++++ ++++ Neg. N WT

22

+++ Neg. Neg. N WT

23

++++ ++++ ++ N 5’MUT

24

++++ ++++ Neg. A WT

25

++++ Neg. Neg. N WT

26

++++ ++++ +++ A 5’MUT

27

Neg. Neg. Neg. N WT

28

+++ Neg. Neg. N WT

29

Neg. Neg. Neg. N WT

30

++++ ++++ Neg. N WT

31

++++ par det Neg. Neg. N nd

32

++ +++ ++ N 5’MUT

33

+++ ++++ ++++ A 5’MUT

34

++++ +++ ++++ N WT

35

++++ Neg. ++++ A 5’MUT

36

+++ ++ +++ A 5’MUT

37

++++ + + A 5’MUT

38

++++ Neg. Neg. N WT

39

++ Neg. Neg. N 5’MUT

40

++++ ++++ + A WT

41

++ Neg. Neg. N WT

42

++++ ++++ Neg. A WT

43

++++ Neg. Neg. nd nd

44

++++ Neg. Neg. N WT

45

++++ Neg. Neg. N WT

46

++++ Neg. Neg. N Nd

*N = no amplificado, A amplificado +WT = tipo salvaje, 5’-mut nd = no realizado

[0334] La reactividad del anticuerpo 806 se cotipó con EGFR amplificado o mutante de2-7 en 19/27 o más del 70% de los casos. Es destacable que 2 de estos 8 casos también fueron reactivos con DH8.3.

Ejemplo 16

54

imagen48

imagen49

imagen50

imagen51

imagen52

imagen53

imagen54

imagen55

imagen56

imagen57

imagen58

imagen59

imagen60

imagen61

imagen62

imagen63

imagen64

imagen65

imagen66

imagen67

imagen68

imagen69

imagen70

imagen71

imagen72

imagen73

imagen74

[0526] mAb175 se unió al EGFR 287-302 en todas las orientaciones (Tabla 6). La afinidad de mAb175 para EGFR 287302 varió de 35 nM para el acoplamiento Pms-serina a 154 nM para el acoplamiento de amina. En todos los casos, la afinidad de unión de mAb175 para EGFR287-302 fue menor que la obtenida para mAb806 (Tabla 6). También se determinó la afinidad de mAb175 a dos fragmentos extracelulares diferentes del EGFR. mAb175 se unió al 5 fragmento 1-501 con una afinidad similar a la obtenida usando el péptido (16 nM frente a 35 nM) (Tabla 6). Como era de esperar, la afinidad de mAb175 frente al dominio extracelular de longitud completa 1-621, que puede formar la conformación unida, fue mucho menor (188 nM). Aunque mAb806 y mAb 175 tienen afinidades similares para EGFR 287-302, mAb175 parece mostrar una mayor afinidad por el dominio extracelular del EGFR (Tabla 6). Claramente, el epítopo de mAb175 está contenido dentro del EGFR 287-302 y, como mAb806, la afinidad de unión

10 al dominio extracelular del EGFR es dependiente de la conformación.

Tabla 6

Determinación BIAcore de afinidades de anticuerpo para la unión de mAb806 y mAb175 a epítopos de EGFR

Fragmento de EGFR

KD para mAb175 KD para mAb806 (nM)

287-302 (acoplamiento Pms-Ser)

35 16

287-302 (acoplamiento de tiol)

143 84

287-302 (acoplamiento de amina)

154 85

1-501 (incapaz de formar unión)

16 34

1-621 (puede formar unión)

188 389

15 [0527] El panel de mutantes del fragmento 273-621 de EGFR, expresado en la superficie de levadura (Chao et al (2004) J. Mol Biol 342, 539-550; Johns et al (2004) J. Biol. Chem. 279, 30.375-30.384), se utilizó para caracterizar la estructura fina del epítopo de mAb175. mAb175 y mAb806 mostraron un patrón casi idéntico de reactividad a los mutantes (Tabla 7). La alteración del enlace disulfuro 287-302 sólo tuvo un efecto moderado sobre la reactividad del epítopo como el anticuerpo unido a todos los mutantes en C287 y a algunos, pero no todos los mutantes en C302

20 (Tabla 7). Los aminoácidos esenciales para la unión de mAb175 incluyen E293, G298, V299, R300 y C302 (Tabla 7). mAb175 pareció moderadamente más sensible a las mutaciones V299 y D297 pero mAb806 también mostró una unión reducida a algunas mutaciones en estos sitios (Tabla 7). Una vez más, el epítopo de mAb175 parece ser esencialmente el mismo que el epítopo reconocido por mAb806.

25 Tabla 7

Expresión de mutaciones 287-302 de epítopo de EGFR en levadura y las puntuaciones de unión para mAb806 y mAb175

Mutante de EGFR

Unión de mAb806 Unión de mAb175

C287A

+ +

C287G

+ +

C287R

+ +

C287S

+ +

C287W

+ +

C287Y

+ +

G288A

++ ++

A289K

++ ++

D290A

++ ++

S291A

++ ++

Y292A

++ ++

E293A

+ +

E293D

+ +

E293G

+ +

E293K

- -

M294A

++ ++

E295A

++ ++

E296A

++ ++

D297A

++ + en contacto

D297Y

+ +

G298A

+ +

G298D

- -

G298S

- -

V299A

++ + en contacto

V299D

- -

V299K

++ + en contacto

R300A

++ ++

R300C

+ +

82

imagen75

imagen76

Tabla 8

Reactividad de mAb806 con células que expresan el EGFR de tipo salvaje o C271A/C283A

Relaciones de unión de anticuerpo

Línea celular

mAb 528/M2 mAb806/M2 mAb806/mAb 528

wtEGFR-FLAG

1,37 0,11 0,08

Wt-EGFR

- - 0,07

C271/283*

1,08 ± 0,10 1,09 ± 0,38 1,01 ± 0,13

*Promedio para cuatro clones independientes

[0538] La mutación de las dos cisteínas no comprometía la unión de EGF o la función del receptor. Las células BaF3

5 que expresan el mutante C271A/C283A EGFR proliferan en presencia de EGF (Figura 70B). Se observó de manera reproducible un desplazamiento a la izquierda de la curva dosis-respuesta para EGF en células que expresan las mutaciones C271A/C283A, lo que sugiere una mayor afinidad por el ligando, o una potencial señalización mejorada para el receptor mutante. El análisis de transferencia de Western confirmó que el mutante C271A/C283A se expresa en niveles similares a la wtEGFR y se fosforila la tirosina en respuesta a la estimulación de EGF (Figura 70C). En

10 concordancia con estudios anteriores en otras líneas celulares, mAb806 no tiene ningún efecto sobre la proliferación inducida por EGF in vitro de células Ba/F3 que expresan el wtEGFR, mientras que el ligando que bloquea mAb528 inhibe completamente la proliferación inducida por EGF de estas células (Figura 70D, panel izquierdo). En cambio, mAb806 anuló totalmente la proliferación inducida por EGF en las células BaF3 que expresan el mutante C271A/C283A (Figura 70D, panel derecho). Cuando se altera el bucle de cisteínas 271-283, no sólo mAb806 se une

15 de manera más eficaz, sino que una vez unido, mAb806 impide la proliferación inducida por ligando.

Tabla 9

Recogida de datos

Recogida de datos y estadística de refinamiento

806 (nativo)

806 (péptido) 175 (nativo) 175 (péptido)

Dimensiones de celda del grupo espacial (Å)

P21212 P21 P212121 P212121

A

140,37 35,92 36,37 83,17

B

74,62 83,16 94,80 69,26

C

83,87 72,21 β = 92,43 108,90 71,47

Fuente

interna BNL X29 interna Interna

Longitud de onda (Å)

1,542 1,1 1,542 1,542

Intervalo de resolución (Å)

29,7-2,2 (2,27-2,20) 50-2,0 (2,07-2,0) 50-2,8 (2,87-2,8) 14,18-1,59 (1,65-1,59)

Rmezcla (%)

6,4 (26,7) 6,6 (28,2) 8,6 (30,0)

I/σl

12,2 (3,2) 22 (3,15) 10,2 (2,2)

Completación (%)

98,3 (91,3) 96,6 (79,2) 98,4 (90,5) 78,8 (11,8) 98,1 a 1,89 Å

Reflejos totales

156497 98374 205401

Reflejos únicos

44905 27692 9171 43879

Refinamiento

Intervalo de resolución (Å)

Reflejos

20-2,3 72,17-2,00 50-2,6 14,18-1,6

Rcrist

37397 26284 9171 41611

Rlibre

0,225 0,226 0,210 0,203

Átomos de proteína

6580 3294 3276 3390

Átomos de disolvente

208 199 46 247

Longitud de enlace r.m.s.d. (Å)

0,022 0,007 0,015 0,014

Longitud de enlace r.m.s.d. (o)

1,70 1,12 1,77 1,48

Factor B promedio (Å2)

40,3 33,6 37,5 20,7

Factores B

-1,52 2,42 0,20 1,13

85

imagen77

Discusión

[0539] Los estudios estructurales con el epítopo EGFR 287-302 muestran que tanto mAb806 cmo mAb175 reconocieron el mismo motivo estructural 3D en las estructuras wtEGFR, lo que indica que esta conformación del esqueleto también se produce en y se expone en el Δ2-7EGFR. Fundamentalmente, sin embargo, la orientación del epítopo en estas estructuras impediría el acceso del anticuerpo a los aminoácidos pertinentes. Esto es consistente con la observación experimental de que mAb806 no se une a wtEGFR expresado en la superficie celular a niveles fisiológicos.

[0540] Los resultados con el mutante EGFRC271A/C283A indican que el dominio CR1 puede abrirse para permitir que mAb806 y mAb175 se unan estequiométricamente a este receptor mutante. Este receptor mutante todavía puede adoptar una conformación nativa, ya que es totalmente sensible a la estimulación de EGF, pero, a diferencia del wtEGFR, está completamente inhibida por mAb806. Si existiera una forma mal plegada del EGFR con este enlace disulfuro roto en la superficie de las células cancerosas, los datos muestran claramente que sería capaz de iniciar la señalización celular y debe ser inhibida por cualquiera de mAb806 o mAb175.

[0541] Otra explicación de los datos es que durante la activación de ligando, la reorganización estructural del receptor podría inducir el desplegamiento local en las proximidades del epítopo, permitiendo que el receptor adopte una conformación que permite la unión. En las estructuras de cristal, el epítopo se encuentra cerca del centro físico del ectodominio de EGFR y el acceso al epítopo está bloqueado por el dominio CR1 plegado y la estructura cuaternaria del ectodominio de EGFR. En las conformaciones unidas y no unidas, la integridad del dominio CR1 se estabiliza mediante interacciones adicionales, ya sea con ligando L1:dominidos L2 (no unido) o dominios L2:CR2 (unido). Sin embargo, la región del epítopo tiene algunos de los parámetros térmicos más altos encontrados en el ectodominio: el epítopo de mAb806/175 es estructuralmente lábil. Durante la activación del receptor, cuando el receptor experimenta una transición entre las conformaciones unida y no unida, mAb806 y mAb175 pueden acceder al epítopo. Por lo tanto a nivel molecular, estos mecanismos podrían contribuir a la insignificante unión de mAb806 y mAb175 a las células normales y los niveles sustancialmente más altos de unión a las células tumorales que tienen EGFR sobreexpresado y/o activado.

Ejemplo 24

Anticuerpos monoclonales 124 y 1133

[0542] Como se ha expuesto en el Ejemplo 1 anterior, mAb124 y mAb1133 se generaron al mismo tiempo que mAb806 y se encontró que muestran propiedades similares, en particular, la especificidad para el EGFR de tipo salvaje sobrexpresado, a las propiedades únicas de mAb806 discutidas en el presente documento.

[0543] Se llevaron a cabo cribados iniciales en Nueva York (Jungbluth et al. (2003) A monoclonal Antibody Recognizing Human Cancers with Amplification/Over-EXpression of the Human Epidermal Growth Factor Receptor PNAS. 100, 639-644. Las evaluaciones de competición en ELISA y los análisis de Biacore se llevaron a cabo para determinar si mAb124 y/o mAb1133 reconocen un epítopo idéntico al mAb806 o un determinante de EGFR alternativo.

Análisis FACS

[0544] La unión del anticuerpo a células U87MG.Δ2-7, A431 y HN5 se evaluó por FACS. Todos los anticuerpos mostraron una especificidad similar a la de mAb806 con fuerte unión al EGFR de2-7 y una unión de baja al EGFR de tipo salvaje sobreexpresado.

ELISA de competición

[0545] Se realizaron una serie de pruebas ELISA de competición para determinar si los anticuerpos 124 y 1133 competían con el epítopo de mAb806. Brevemente, el dominio soluble desnaturalizado del EGFR (sEGFR) recubrió placas de ELISA. Anticuerpos 124 o 1133 no marcados se añadieron a continuación a través de la placa en concentraciones crecientes. Después del lavado, se añadió mAb806 biotinilado a cada pocillo para determinar si todavía podría unirse al sEGFR. La detección de mAb806 unido se consiguió utilizando HRP conjugada a estreptavidina. Si un anticuerpo se une al mismo epítopo (o se solapa), entonces no se espera la unión de mAb806.

[0546] Los resultados se resumen en la Tabla 10. Se observó un efecto de unión inhibidor dependiente de la concentración para mAb124 y mAb113: la unión a mAb806 aumentó a medida que la concentración de anticuerpo no marcado disminuyó, lo que sugiere que los anticuerpos 124 y 1133 reconocen un epítopo idéntico a mAb806 o uno muy próximo.

86

imagen78

imagen79

imagen80

2. Resultados

Pacientes

5 [0567] Ocho pacientes (1 mujer y 7 varones, con una edad promedio de 61 años (rango 44-75)) completaron el ensayo (tabla 16). Los sitios de tumor primario, el historial de terapia anterior, y los sitios de la enfermedad al inicio del estudio también se muestran en la Tabla 16. Los 8 pacientes tenían positividad de antígeno de 806 en tumores almacenados (tabla 16).

10 [0568] Todos los pacientes cumplieron los criterios de inclusión y, a excepción de paciente 8 (que tenía un tumor cerebral primario), todos tenían enfermedad metastásica al inicio del estudio. Los sitios de la enfermedad clasificados como lesiones diana incluían: pulmón (5 pacientes), cerebro (1 paciente), ganglios linfáticos (1 paciente), supraglotis (1 paciente). Otros sitios de enfermedad metastásica (lesiones no diana) incluían una una

15 masa suprarrenal, hueso y nódulos linfáticos (tabla 16). El estado funcional de Karnofsky mediana fue de 90 (rango 80 a 100).

Tabla 16

Características del paciente

Pt No.

Nivel de dosis (mg/m2) Edad (años) Sexo KPS (%) Sitio de tumor primario IHC de células positivas (%) Terapias previas Sitios de enfermedad a la entrada del estudio Respuesta del tumor a ch806

1

5 71 M 10 NSCLC 50-75 RT Pulmón, adrenal PD

8

5 44 M 90 Astrocitoma anaplásico >75* Cirugía, RT, CT Cerebro SD

2

10 49 F 80 SCC Ano <10 Quimio, RT LN, pulmón, hueso SD

3

10 75 M 90 NSCLC 50-75 Cirugía RT Pulmón SD

4

20 52 M 100 Colon <10† Cirugía, CT Pulmón, LN PD

5

20 65 M 80 Mesotelioma >75 RT, CT Pulmón SD

6

40 59 M 80 SCC cuerda vocal >75 Cirugía, RT, CT Tejido blando SD

7

40 71 M 80 SCC piel 50-75 Cirugía, CT Pulmón, LN PD

Abreviaturas: F = hembra; M = macho; NSCLC = carcinoma de pulmón no microcítico; SCC = carcinoma de células escamosas; RT = radioterapia; CT = quimioterapia; LN = nódulos linfáticos; PD = enfermedad progresiva; SD = enfermedad estable * positivo para la expresión de de2-7EGFR † positivo para la amplificación del gen de EGFR

20 Eventos adversos y HACA

[0569] Los eventos adversos relacionados con ch806 se enumeran en las Tablas 17 y 18. No se observaron eventos adversos relacionados con la infusión. No hubo DLT, y por lo tanto no se alcanzó MTD. Las principales toxicidades 25 que, en opinión del investigador, fueron posiblemente atribuible a ch806 fueron: prurito transitorio, náusea leve, fatiga/letargo, y los posibles efectos sobre los niveles séricos de ALP y GGT. Se observó una elevación de CTC de grado 2 en el nivel de GGT en el Paciente 5, sin embargo, esto fue sobre un fondo de una línea de base de elevación de grado 1, y era de naturaleza transitoria. Se describieron tres eventos adversos graves (SAE), pero ninguno se atribuyó a ch806. En general, ch806 fue seguro y bien tolerado en todas las dosis observándose

30 toxicidades menores generalmente predecibles y manejables. No se realizó un escalado adicional de la dosis debido a la cantidad limitada de GMPc ch806 disponible para la prueba.

[0570] Se observó una respuesta inmune positiva a ch806 (con la concordancia de ambos métodos ELISA y BIAcore) en sólo uno de los ocho pacientes (paciente 1). 35 Tabla 17

Aparición de eventos adversos relacionados con ch806

Nivel de dosis (mg/m2)*

Número total de episodios de cada evento

Evento adverso

5 10 20 40

90

imagen81

imagen82

imagen83

alcanzar un mayor efecto terapéutico. Además, la posibilidad de liberación de carga útil (debido a la rápida internalización de mAb 806 en las células tumorales), y el tratamiento de combinación con otros agentes biológicos, tales como anticuerpos de EGFR e inhibidores de la tirosina quinasa, donde la toxicidad se combina, probable se minimiza, están fuertemente apoyados por los datos de esta prueba. Este estudio proporciona evidencia clara de la

5 capacidad para reconocer un epítopo en EGFR que es específico para el tumor, y el desarrollo clínico de este enfoque único para la terapia del cáncer está en curso.

Ejemplo 26

10 Comparación de secuencias

[0585] Las CDR de cadena VH y cadena VL para cada uno de mAb806, mAb175, mAb124, mAb1133 y hu806 se exponen y se comparan en este documento. Tabla 13 15

Comparaciones (Kabat)1 de isotipo y secuencia CDR de anticuerpo murino A. Cadena ligera variable

CDR1

CDR2 CDR3

806 (IgG2b)

HSSQDINSNIG (SEQ ID NO:18) HGTNLDD (SEQ ID NO:19) VQYAQFPWT (SEQ ID NO:20)

124 (IgG2a)

HSSQDINSNIG (SEQ ID NO:28) HGTNLDD (SEQ ID NO:29) VQYGQFPWT (SEQ ID NO:30)

175

HSSQDISSNIG (SEQ ID NO:135) HGTNLED (SEQ ID O:136) VQYGQFPWT (SEQ ID NO:137)

1133 (IgG2a)

HSSQDINSNIG (SEQ ID NO:38) HGTNLDD (SEQ ID NO:39) VQYGQFPWT (SEQ ID NO:40)

B. Cadena pesada variable

CDR1

CDR2 CDR3

306 (IgG2b)

SDFAWN (SEQ ID NO:15) YISYSGNTRYNPSLKS (SEQ ID NO:16) VTAGRGFPY (SEQ ID NO:17)

124 (IgG2a)

SDYAWN (SEQ ID NO:23) YISYSANTRYNPSLKS (SEQ ID NO:24) ATAGRGFPY (SEQ ID NO:25)

175 (IgG2a)

SDYAWN (SEQ ID NO:130) YISYSANTRYNPSLKS (SEQ ID NO:131) ATAGRGFPY (SEQ ID NO:132

1133 (IgG2a)

SDYAWN (SEQ ID NO:33) YISYSGNTRYNPSLRS (SEQ ID NO:34) ATAGRGFPY (SEQ ID NO:35

1diferencias con las secuencias de CDR de mAb806 están subrayadas

[0586] Las CDR proporcionadas anteriormente para los respectivos isotipos de anticuerpos se basan en un análisis de Kabat. Como será evidente para los expertos en la técnica, las CDR pueden también definirse en base a otros análisis, por ejemplo una composición de las definiciones de Kabat y de Chothia. Por ejemplo, aplicando un análisis

20 compuesto de Kabat y Chothia a los isotipos anteriores, las secuencias de las CDR de la cadena VL y las CDR de la cadena VH para los respectivos isotipos son como se exponen en la Tabla 14.

Tabla 14

Comparaciones de isotipo y secuencia CDR de anticuerpo murino (composición Kabat y Chothia)1 A. Cadena ligera variable

CDR1

CDR2 CDR3

806 (IgG2b)

HSSQDINSNIG (SEQ ID NO:18)2 HGTNLDD (SEQ ID NO:139)2 VQYAQFPWT (SEQ ID NO:20)2

124 (IgG2a)

HSSQDINSNIG (SEQ ID NO:28) HGTNLDD (SEQ ID NO:140) VQYGQFPWT (SEQ ID NO:30)

175

HSSQDISSNIG (SEQ ID NO:135) HGTNLED (SEQ ID NO:141) VQYGQFPWT (SEQ ID NO:137)

1133 (IgG2a)

HSSQDINSNIG (SEQ ID NO:38) HGTNLDD (SEQ ID NO:142) VQYGQFPWT (SEQ ID NO:40)

94

imagen84

imagen85

imagen86

imagen87

imagen88

imagen89

imagen90

imagen91

Claims (1)

1. imagen1

   imagen2