ES2243259T3 - Metodo para tratar la fibrosis utilizando un antagonista de la subunidad alfa 4 de la integrina. - Google Patents

Abstract

Uso de una composición que comprende un homólogo de anticuerpo que es un antagonista de una interacción entre una integrina que lleva la subunidad alfa 4 y un ligando para una integrina que lleva la subunidad alfa 4, para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de la fibrosis en un sujeto.

Description

Método para tratar la fibrosis utilizando un antagonista de la subunidad alfa 4 de la integrina.

Antecedentes de la invención

La fibronectina y el colágeno son proteínas que son esenciales para mantener la integridad de la matriz extracelular que se encuentra en los tejidos conjuntivos. La producción de estas proteínas es un proceso sumamente regulado y su alteración puede conducir al desarrollo de fibrosis tisular. Aunque la formación de fibrosis tisular es parte del proceso beneficioso normal de curación tras una lesión, en algunas circunstancias existe una acumulación anómala de materiales fibrosos de tal manera que, en última instancia, conduce a un fallo orgánico (Border et al . (1994) New Engl. J. Med. 331:1286-1292). La lesión de cualquier órgano conduce a una respuesta fisiológica estereotípica: hemostasia inducida por plaquetas, seguida por una afluencia de células inflamatorias y fibroblastos activados. Las citocinas derivadas de estos tipos celulares conducen la formación de la nueva matriz extracelular y los vasos sanguíneos (tejido de granulación). La generación del tejido de granulación es un programa cuidadosamente orquestado en el que la expresión de inhibidores de proteasas y proteínas de la matriz extracelular está regulado por incremento y la expresión de proteasas se reduce, lo que conduce a la acumulación de matriz extracelular.

Fundamental para el desarrollo de estados fibróticos, ya sean inducidos o espontáneos, es la estimulación de la actividad de los fibroblastos. La afluencia de células inflamatorias y fibroblastos activados al órgano lesionado depende de la capacidad de estos tipos celulares para interaccionar con la matriz intersticial compuesta principalmente por fibronectina y colágeno. Estas interacciones célula-célula o célula-matriz extracelular están mediadas a través de varias familias de moléculas de adhesión celular, una de tales familias incluye las integrinas. Las integrinas son glucoproteínas relacionadas estructuralmente y funcionalmente que consisten en diversos dominios de receptores transmembrana heterodiméricos alfa (alfa 1, alfa 2 hasta alfa 11 en la actualidad) y beta (beta 1 y beta 7) que se encuentran en diversas combinaciones en prácticamente cada tipo celular de los mamíferos. (para revisiones véase: E. C. Butcher, Cell, 67, 1033 (1991)); D. Cox et al ., "The Pharmacology of the Integrins". Medicinal Research Rev. Vol. 195 (1994) y V. W. Engleman et al ., "Cell Adhesion Integrins as Pharmaceutical Targets" en Ann, Revs. Medicinal Chemistry, Vol. 31, J. A. Bristol, Ed.; Acad. Press, NY, 1996, pág. 191). Se han descrito integrinas que contienen 2 subunidades alfa 4 y se designan alfa 4-beta 1 (VLA-4) y alfa 4-beta 7.

La fibrosis pulmonar intersticial (FPI) es el camino final de muchas enfermedades pulmonares intersticiales que conduce a una reducción de la distensibilidad pulmonar y alteración de la función vital de intercambio de gases. Independientemente de la etiología, la FPI se caracteriza por cambios inflamatorios y fibroproliferativos del pulmón y una acumulación en exceso de colágeno en el intersticio. Los pacientes con FPI generalmente demuestran una presencia de células inflamatorias e inmunitarias reclutadas durante la fibrosis pulmonar activa, lo que indica que la fibrosis pulmonar es el resultado de una reparación aberrante tras una lesión inflamatoria inicial. Es probable que las células inflamatorias reclutadas estén involucradas en la lesión inicial en muchos casos. Además, estas células pueden desempeñar un papel complejo en la regulación del proceso de reparación. En cualquier caso, el reclutamiento de las células inmunitarias e inflamatorias en el pulmón puede desempeñar un papel importante en la determinación de la respuesta fibrótica. La afluencia de las células inflamatorias y los fibroblastos activados en el pulmón lesionado depende de la capacidad de estos tipos celulares para interaccionar con los componentes de la MEC. El tráfico y estado de activación de los leucocitos se modula mediante diversas integrinas. La prevención de la afluencia de células inflamatorias en los pulmones puede ser crítica en contener la posterior respuesta fibrótica.

Muchas de las enfermedades asociadas con la proliferación de tejido fibroso son tanto crónicas como a menudo debilitantes, incluyendo por ejemplo, enfermedades cutáneas tales como esclerodermia. Algunas, incluyendo la fibrosis pulmonar, pueden ser mortales debido en parte al hecho de que los tratamientos disponibles actualmente para esta enfermedad tienen efectos secundarios significativos y generalmente no son eficaces en ralentizar o detener la progresión de la fibrosis [Nagler et al . 1996, Am. J. Respir. Crit. Care Med, 154:1082-86]. En consecuencia, existe una necesidad continua de nuevos agentes antifibróticos.

- El documento WO-A-97 18838 describe métodos de tratamiento que utilizan inmunoglobulinas humanizadas que se unen específicamente a la integrina alfa 4 y que pueden utilizarse en el tratamiento de trastornos tales como la lesión pulmonar mediada por leucocitos (pág. 25).

- El documento WO 97/11718 da a conocer el uso de un anticuerpo neutralizante que es específico para el sitio de reconocimiento RGD de las integrinas y que puede ser un anticuerpo neutralizante específico para el receptor de integrinas.

- Kidney International, 1996, 49:127-134 da a conocer que no existe una fuerte asociación entre la expresión glomerular de LFA-1, VLA-4, ICAM-1, VCAM-1 y la infiltración de macrófagos glomerular y el daño histológico crónico.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona antagonistas de una interacción entre una integrina que lleva la subunidad 4 para la preparación de una composición farmacéutica útil para tratar la fibrosis en un sujeto. Se ha investigado el posible papel desempeñado por los antagonistas de las integrinas que contienen la subunidad alfa 1 y alfa 4 en la patogenia de la fibrosis administrando un antagonista de una integrina que contiene la subunidad alfa 1 o alfa 4 a ratones con fibrosis pulmonar. El efecto beneficioso que estos antagonistas tienen tanto sobre la acumulación global de colágeno como sobre la extensión de lesiones fibróticas pulmonares, tal como se muestra en la presente comunicación, sugiere que las integrinas que contienen la subunidad alfa 1 y/o alfa 4 pueden ser una diana razonable para el tratamiento antifibrótico. Un aspecto de la invención es el uso de una composición que comprende un antagonista de una interacción entre una integrina que lleva la subunidad 4 y un ligando para una integrina que lleva la subunidad 4, para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de un sujeto que tiene un estado fibrótico. El antagonista es un agente de unión a la integrina alfa 4 o un agente de unión al ligando de la integrina alfa 4. Los agentes de unión a la integrina alfa 4 preferidos se seleccionan del grupo que consiste en: a) un homólogo de anticuerpo que antagoniza la interacción tanto de VLA-4 como de alfa 4-beta 7 con sus respectivos ligandos alfa 4; b) un homólogo de anticuerpo que antagoniza la interacción de VLA-4 con su ligando de alfa 4; y c) un homólogo de anticuerpo que antagoniza la interacción de alfa 4-beta 7 con su ligando de alfa 4. En otras realizaciones, el homólogo de anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en un anticuerpo humano, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado y fragmentos de los mismos.

Otro aspecto de la presente invención es el uso de un antagonista de una interacción entre la integrina que lleva la subunidad 4 y un ligando para una integrina que lleva la subunidad 4, para la preparación de una composición farmacéutica para disminuir los aumentos de los leucocitos inducidos por el estado fibrótico en una muestra de líquido de lavado broncoalveolar de un sujeto que tiene un estado fibrótico.

En ciertas realizaciones de la invención, el agente de unión a la integrina alfa 4 está codificado por una secuencia de ácido nucleico que comprende un ácido nucleico que se híbrida en varias condiciones de rigurosidad con secuencias de ácido nucleico seleccionadas del grupo de secuencias de la tabla 6 de la patente de los EE.UU. 5.840.299 o el complemento de dichas secuencias de ácido nucleico. En otros aspectos del método, el agente de unión a la integrina alfa 4 está codificado por una secuencia de ácido nucleico que comprende un ácido nucleico que se híbrida en varias condiciones de rigurosidad con una secuencia de ácido nucleico que codifica para una secuencia polipeptídica seleccionada del grupo que consiste en ciertos polipéptidos definidos que se encuentran en la patente de los EE.UU. 5.932.214 o producidos por la línea celular ATCC CRL 11175.

Descripción detallada de la invención I. Definiciones

Con el fin de especificar de manera más clara y concisa la materia de la invención que se reivindica, se proporcionan las siguientes definiciones de términos específicos utilizados en la siguiente descripción escrita y en las reivindicaciones adjuntas.

Se describirá ahora la invención con referencia a la siguiente descripción detallada de la que se incluyen las siguientes definiciones:

La superfamilia de los antígenos de expresión muy tardía de las integrinas (VLA) se compone de glucoproteínas relacionadas estructuralmente y funcionalmente que consisten en moléculas receptoras transmembrana heterodiméricas (alfa y beta) que se encuentran en diversas combinaciones en prácticamente cada tipo celular de los mamíferos. (para revisiones véase: E. C. Butcher, Cell, 67, 1033 (1991); D. Cox et al ., "The Pharmacology of the Integrins". Medicinal Research Rev. (1994) y V. W. Engleman et al ., "Cell Adhesion Integrins as Pharmaceutical Targets" en Ann. Report in Medicinal Chemistry, Vol. 31, J. A. Bristol, Ed.; Acad. Press, NY, 1996, pág. 191). Las integrinas de la familia VLA incluyen (en la actualidad) VLA-1, -2, -3, -4, -5, -6, -9 y -11, en las que cada una de las moléculas comprende una cadena \beta1 unida de manera no covalente a una cadena alfa (\alpha1, \alpha2, \alpha3, \alpha4, \alpha5, \alpha6 y similares), respectivamente.

La integrina alfa 4-beta 1 (\alpha4\beta1) es un receptor de la superficie celular para VCAM-1, fibronectina y posiblemente otros ligandos (estos últimos ligandos denominados individual y colectivamente "ligando(s) alfa 4"). El término integrina \alpha4\beta1 (utilizándose indistintamente "integrina VLA-4" o "a4b1" o "alfa 4-beta 1") en el presente documento se refiere a los polipéptidos que son capaces de unirse a VCAM-1 y a miembros de las proteínas de la matriz extracelular, más particularmente la fibronectina, o a homólogos o fragmentos de las mismas, aunque expertos en la materia apreciarán que puedan existir otros ligandos para VLA-4 y pueden ser analizados utilizando métodos convencionales. No obstante, es sabido que la subunidad alfa 4 se asociará con otras subunidades beta además de beta 1, con lo que se puede definir el término "integrina alfa (\alpha) 4" o "integrina que contiene una subunidad alfa (\alpha) 4" como aquellas integrinas cuya subunidad alfa 4 se asocia con una u otra de las subunidades beta. Otro ejemplo de una integrina "alfa 4" además de VLA4 es alfa 4-beta 7 (véase Lobb y Adams, arriba). De modo similar, una "integrina alfa 1" o una "integrina que contiene una subunidad alfa 1" son aquellas integrinas cuya subunidad alfa 1 se asocia con una u otra de las subunidades beta.

Un "antagonista" de integrinas incluye cualquier compuesto que inhibe a las integrinas que contienen una subunidad alfa 1 y/o alfa 4 de unirse con un ligando y/o receptor de integrina. Son útiles las proteínas que contienen homólogos de anticuerpos o anticuerpos anti-integrina (que se comentan a continuación) así como otras moléculas tales como formas solubles de las proteínas de ligandos para las integrinas. Las formas solubles de las proteínas de ligandos para integrinas que contienen la subunidad alfa 4 incluyen VCAM-1 soluble, proteínas de fusión VCAM-1, o proteínas de fusión bifuncionales VCAM-1/Ig. Por ejemplo, puede administrarse una forma soluble de un ligando de integrina o un fragmento del mismo para unirse a la integrina, y preferiblemente para competir por un sitio de unión de la integrina en las células, llevando así a efectos similares a la administración de antagonistas tales como anticuerpos anti-integrina (por ejemplo, VLA-1, VLA-4). Particularmente, se incluyen dentro del alcance de la invención los mutantes de integrina solubles que se unen a los ligandos pero que no provocan señales dependientes de integrina. Tales mutantes de la integrina pueden actuar como inhibidores competitivos de la proteína de integrina de tipo natural y se consideran "antagonistas". Otros antagonistas que se utilizan en los métodos de la invención son "moléculas pequeñas", tal como se definen a continuación.

Se incluye también en la invención el uso de moléculas que antagonizan la acción de más de una integrina que contiene la subunidad alfa 4, tales como moléculas pequeñas u homólogos de anticuerpos que antagonizan tanto a VLA-4 como a alfa 4-beta 7 u otras combinaciones de integrinas que contienen la subunidad alfa 4. También se incluye el uso de moléculas que antagonizan la acción de más de una integrina que contiene la subunidad alfa 1. También se incluye en el ámbito de la invención el uso de una combinación de moléculas tales que la combinación antagoniza la acción de más de una integrina, tal como el uso de varias moléculas pequeñas u homólogos de anticuerpo que, en combinación, antagonizan tanto a VLA-4 como a alfa 4-beta 7 u otras combinaciones de integrinas que contienen la subunidad alfa 4.

Tal como se trata en el presente documento, ciertos antagonista de integrinas pueden fusionarse, o en caso contrario conjugarse con, por ejemplo, un homólogo de un anticuerpo tal como una inmunoglobulina o un fragmento de ésta, y no se limitan a un tipo o estructura específica de una integrina o un ligando u otra molécula. Por consiguiente, para los propósitos de la invención, cualquier agente capaz de formar una proteína híbrida (tal como se describe a continuación) y capaz de unirse a ligandos de las integrinas y que bloquea o cubre de manera eficaz integrinas que contienen la subunidad alfa 4 y/o alfa 1 se considera que es un equivalente de los antagonistas utilizados en los ejemplos de el presente documento.

Los "homólogos de anticuerpos" incluyen anticuerpos intactos que consisten en cadenas ligeras y pesadas de inmunoglobulina unidas mediante enlaces disulfuro. El término "homólogo de anticuerpos" pretende también englobar una proteína que comprende uno o más polipéptidos seleccionados de cadenas ligeras de inmunoglobulina, cadenas pesadas de inmunoglobulina y fragmentos de las mismas que se unen a antígenos que son capaces de unirse a uno o más antígenos (es decir, ligandos de integrina o integrina). Los polipéptidos que componen un homólogo de anticuerpo compuesto por más de un polipéptido puede estar opcionalmente unido mediante enlaces disulfuro, o por el contrario reticulado mediante enlaces covalentes. Por consiguiente, los "homólogos de anticuerpos" incluyen inmunoglobulinas intactas de tipos IgA, IgG, IgE, IgD, IgM (así como subtipos de las mismas), en las que las cadenas ligeras de la inmunoglobulina pueden ser de los tipos kappa o lambda. Los "homólogos de anticuerpos" incluyen también porciones de anticuerpos intactos que conservan la especificidad de unión a los antígenos, por ejemplo, fragmentos Fab, fragmentos Fab', fragmentos F(ab')2, fragmentos F(v), monómeros o dímeros de cadenas ligeras o pesadas o mezclas de los mismos.

Los "homólogos de anticuerpos humanizados" son homólogos de anticuerpos producidos mediante la tecnología del ADN recombinante, en los que algunos o todos los aminoácidos de una cadena ligera o pesada de inmunoglobulina humana que no son necesarios para unirse al antígeno se han sustituido por los aminoácidos correspondientes de una cadena de inmunoglobulina ligera o pesada de mamífero no humano. Un "homólogo de anticuerpo humanizado" es un homólogo de anticuerpo en el que todos los aminoácidos de una cadena ligera o pesada de inmunoglobulina (independientemente de si son o no necesarios para la unión al antígeno) provienen de un origen humano.

Tal como se usa en el presente documento, un "homólogo de anticuerpo humanizado" es un homólogo de anticuerpo producido mediante la tecnología del ADN recombinante, en el que todos los aminoácidos de una cadena ligera o pesada de inmunoglobulina provienen de un origen humano.

Un "antagonista" de integrinas incluye cualquier compuesto que activa el ligando de la integrina.

Un "aminoácido" es una unidad monomérica de un péptido, polipéptido o una proteína. Se encuentran veinte aminoácidos en péptidos, polipéptidos o proteínas que se producen de manera natural, todos los cuales son isómeros L. El término incluye también análogos de los aminoácidos e isómeros D de los aminoácidos de proteínas y sus análogos.

"Acoplado covalentemente" - significa que los restos especificados de la invención (por ejemplo, antagonista de integrinas alfa 1 y/o alfa 4 PEGilado, fragmento de inmunoglobulina/ antagonista de integrinas alfa 4 o alfa 1) están o bien directamente unidos entre sí covalentemente o bien unidos entre sí covalentemente, indirectamente mediante un resto o restos intermedios tales como un resto o restos separadores. El resto o restos intermedios se denominan un "grupo de enlace". El término "conjugados" se utiliza indistintamente de "acoplados covalentemente". En este aspecto un "separador" se refiere a un resto que puede insertarse entre un aminoácido u otro componente de un antagonista de integrina o un fragmento y el resto de la molécula. Un separador puede proporcionar separación entre el aminoácido u otro componente y el resto de la molécula, para así evitar que la modificación interfiera con la función de la proteína y/o para hacerle más fácil al aminoácido u otro compuesto el unirse con otro resto.

\newpage

La "secuencia de control de la expresión" - es una secuencia de polinucleótidos que controla y regula la expresión de los genes cuando están unidos operativamente a esos genes.

El "vector de expresión" - es un polinucleótido, tal como un plásmido o un fago de ADN (entre otros ejemplos comunes) que permite la expresión de al menos un gen cuando se introduce el vector de expresión en una célula hospedadora. El vector puede, o no, ser capaz de replicarse en una célula.

Una "cantidad eficaz" de un agente de la invención es aquella cantidad que produce un resultado o que ejerce una influencia sobre la condición específica que se esté tratando.

Un "equivalente funcional" de un residuo de aminoácido es (i) un aminoácido que tiene propiedades de reacción similares al residuo de aminoácido que se sustituyó por el equivalente funcional; (ii) un aminoácido de un antagonista de la invención, teniendo el aminoácido propiedades similares al residuo de aminoácido que se sustituyó por el equivalente funcional; (iii) una molécula que no es un aminoácido que tiene propiedades similares al residuo de aminoácido que se sustituyó por el equivalente funcional.

Un primer polinucleótido que codifica para un antagonista proteico de la invención es "funcionalmente equivalente" por comparación con otro segundo polinucleótido que codifica para la proteína antagonista si satisface al menos una de las siguientes condiciones:

(a): el "equivalente funcional" es un primer polinucleótido que se híbrida con el segundo polinucleótido en condiciones normales de hibridación y/o se degrada a la primera secuencia de polinucleótido. Más preferiblemente, codifica una proteína mutante que tiene la actividad de una proteína antagonista de integrinas;

(b): el "equivalente funcional" es un primer polinucleótido que codifica en la expresión para una secuencia de aminoácido codificada por el segundo polinucleótido.

Los antagonistas de integrinas que se utilizan en la invención incluyen, pero no se limitan a, los agentes que se enumeran en el presente documento así como sus equivalentes funcionales. Tal como se usa en el presente documento, el término "equivalente funcional" se refiere, por lo tanto, a un antagonista de integrinas o a un polinucleótido que codifica para el antagonista de integrinas que tiene un efecto beneficioso igual o mejorado sobre el receptor que el antagonista de integrinas del que se considera un equivalente funcional. Como se apreciará por aquellos con experiencia habitual en la técnica, una proteína funcionalmente equivalente puede producirse por técnicas recombinantes, por ejemplo, por la expresión de un "ADN funcionalmente equivalente". Por consiguiente, la invención engloba proteínas de integrina codificadas por ADN natural, así como por ADN no natural que codifica para la misma proteína codificada por el ADN natural. Debido a la degradación de las secuencias que codifican para los nucleótidos, pueden utilizarse otros polinucleótidos para codificar la proteína integrina. Estos incluyen todas, o porciones de las secuencias anteriores alteradas por la sustitución de diferentes codones que codifican el mismo residuo de aminoácido dentro de la secuencia, produciendo así un cambio silencioso. Tales secuencias alteradas se consideran como equivalentes de estas secuencias. Por ejemplo, se codifica para Phe (F) mediante dos codones, TTC o TTT, se codifica para Tyr (Y) mediante TAC o TAT, y se codifica para His (H) mediante CAC o CAT. Por el contrario, se codifica para Trp (W) mediante un único codón, TGG. Por consiguiente, se apreciará que para una secuencia dada de ADN que codifica para una integrina en especial habrá muchas secuencias degradadas de ADN que codificarán para ella. Se consideran estas secuencias degradadas de ADN dentro del alcance de esta invención.

El término "híbrido" cuando se refiere a un antagonista de la invención, significa que el antagonista comprende un enlace (reticulación química o covalente o de otro tipo) de dos o más proteínas que tienen estructuras distintas y/o que tienen distintas fuentes de origen. Así, un antagonista híbrido de integrinas alfa 4 puede incluir un resto que es un fragmento o antagonista de integrinas alfa 4, y otro resto que no es un antagonista de integrinas alfa 4. Un antagonista híbrido de integrinas alfa 1 puede incluir un resto que es un fragmento o antagonista de integrinas alfa 1, y otro resto que no es un antagonista de integrinas alfa 1.

Una especie de proteína "híbrida" es una "fusión" o una "proteína de fusión" que se refiere a un enlace covalente o colineal de dos o más proteínas o fragmentos de éstas mediante sus respectivos esqueletos de péptidos, más preferiblemente a través de la expresión genética de una molécula de polinucleótido que codifica para estas proteínas. Así, las proteínas de fusión preferidas son proteínas híbridas que incluyen un fragmento o antagonista de integrinas alfa 4 (o alfa 1) unido covalentemente a un segundo resto que no es un antagonista de integrinas alfa 4 (o alfa 1). Las proteínas de fusión preferidas de la invención pueden incluir porciones de anticuerpos intactos que conservan la especificidad de unión con los antígenos, por ejemplo, fragmentos Fab, fragmentos Fab', fragmentos F(ab')2, fragmentos F(v), monómeros o dímeros de cadena pesada, monómeros o dímeros de cadena ligera, dímeros que consisten en una cadena pesada y otra ligera, y similares.

Las proteínas de fusión más preferidas son híbridas y comprenden un resto de antagonista de integrinas fusionado o por el contrario unido a todas o partes de las regiones de bisagra y constantes de una cadena ligera de inmunoglobulina, una cadena pesada de inmunoglobulina, o ambas. Así, esta invención ofrece una molécula que incluye: (1) un resto antagonista de integrinas, (2) un segundo péptido, por ejemplo, uno que aumenta la solubilidad o el tiempo de vida in vivo del resto del antagonista de integrinas, por ejemplo, un miembro de la superfamilia de la inmunoglobulina, o un fragmento o una porción de los mismos, por ejemplo, una porción o un fragmento de IgG, por ejemplo, la región constante de la cadena pesada humana IgGI, por ejemplo, CH2, CH3, y las regiones bisagra. Específicamente, una "fusión de antagonista de integrinas/Ig" es una proteína que comprende una molécula de la invención antagonista de integrinas biológicamente activa (por ejemplo, un ligando VLA-4 o VLA-1 soluble, o un fragmento biológicamente activo de los mismos unido a un extremo N-terminal de una cadena de inmunoglobulina en la que una porción del extremo N-terminal de la inmunoglobulina se sustituye con el antagonista de integrinas. Una especie de fusión de antagonista de integrinas/Ig es una "fusión integrina/Fc", que es una proteína que comprende un antagonista de integrinas de la invención unido a al menos parte del dominio constante de una inmunoglobulina. Una fusión Fc preferida comprende un antagonista de integrinas de la invención unido a un fragmento de un anticuerpo que contiene el dominio del extremo C-terminal de las cadenas pesadas de la inmunoglobulina.

El término "proteína de fusión" significa también un antagonista de integrinas unido químicamente mediante una molécula mono o heterofuncional a un segundo resto que no es un antagonista de integrinas (resultando en una molécula "híbrida") y que se hace de novo a partir de una proteína purificada tal como se describe a continuación. Así, un ejemplo de una molécula híbrida unida químicamente, a diferencia de unida de modo recombinante, que es una molécula de fusión, puede comprender: (1) un resto que tiene como objetivo una subunidad de integrina alfa 4, por ejemplo, un resto de VCAM-1 capaz de unirse con VLA-4) en la superficie de células portadoras de VLA-4; (2) una segunda molécula que aumenta la solubilidad o el tiempo de vida in vivo del resto que tiene como objetivo una subunidad de integrina alfa 4, por ejemplo, un polímero de polialquilenglicol tal como un polietilenglicol (PEG). El resto que tiene como objetivo una subunidad de integrina alfa 4 puede ser cualquier ligando natural de alfa 4 o un fragmento de éste, por ejemplo, un péptido VCAM-1 o una secuencia de aminoácidos similar sustituida de manera conservativa.

Un "promotor heterólogo" - tal como se utiliza en el presente documento es un promotor que no está naturalmente asociado con un gen o con un ácido nucleico purificado.

La "homología" - tal como se utiliza en el presente documento es sinónima con el término "identidad", y se refiere a la similitud de las secuencias entre dos polipéptidos, moléculas o entre dos ácidos nucleicos. Cuando una posición en ambas secuencias de la comparación está ocupada por la misma base o subunidad de monómero de aminoácido (por ejemplo, si una posición en ambas moléculas de ADN está ocupada por adenina, o una posición en ambos polipéptidos está ocupada por una lisina), entonces las respectivas moléculas son homólogas en esa posición. El porcentaje de homología entre dos secuencias es una función del número de posiciones homólogas o que coinciden que comparten las dos secuencias, dividido entre el número de posiciones comparadas x 100. Por ejemplo, si 6 de las 10 posiciones en dos secuencias coinciden o son homólogas, entonces las dos secuencias son homólogas en un 60%. A modo de ejemplo, las secuencias de ADN CTGACT y CAGGTT comparten un 50% de homología (3 de las 6 posiciones totales coinciden). De manera general, se hace una comparación después de alinear dos secuencias, para dar la homología máxima. Tal alineación puede proporcionarse utilizando, por ejemplo, el método de Karlin y Altschul descrito a continuación en más detalle.

Las secuencias homólogas comparten residuos de aminoácidos idénticos o similares, en los que los residuos similares son sustituciones conservativas para, o "mutaciones puntuales permitidas" de, residuos de aminoácidos correspondientes en una secuencia de referencia alineada. A este respecto, una "sustitución conservativa" de un residuo en una secuencia de referencia son aquellas sustituciones que son física o funcionalmente similares a los residuos de referencia correspondientes, por ejemplo, que tengan un tamaño, forma, carga eléctrica, o propiedades químicas similares, incluyendo la capacidad de formar enlaces covalentes o puentes de hidrógeno, o similares. Sustituciones conservadoras particularmente preferidas son aquellas que cumplen el criterio definido por una "mutación puntual permitida", en Dayhoff et al ., 5: Atlas of Protein Sequence and Structure, 5: Suppl. 3, capítulo 22: 354-352, Nat. Biomed. Res. Foundation, Washington, D.C. (1978).

"Homología" e "identidad" son intercambiables en el presente documento y se refieren cada una a la similitud entre dos secuencias de polipéptidos. La homología y la identidad pueden determinarse comparando una posición en cada secuencia que puede estar alineada para fines comparativos. Cuando una posición en la secuencia comparada está ocupada por el mismo residuo de aminoácido, entonces los polipéptidos pueden denominarse idénticos en esa posición; cuando el sitio equivalente está ocupado por el mismo aminoácido (por ejemplo, idéntico) o un aminoácido similar (por ejemplo, similar en naturaleza estérica y/o electrónica), entonces las moléculas pueden denominarse homólogas en esa posición. Un porcentaje de homología o identidad entre secuencias es una función del número de posiciones coincidentes u homólogas que comparten las secuencias. Una secuencia "no relacionada" o "no homóloga" comparte menos del
40% de identidad, aunque preferiblemente menos de un 25% de identidad, con una secuencia de la presente invención.

Se determina el "porcentaje de homología" de dos secuencias de aminoácidos o dos secuencias de ácidos nucleicos utilizando el algoritmo de alineación de Karlin y Altschul (Proc. Nat. Acad. Sci., EE.UU. 87: 2264 (1990)) tal como se modificó en Karlin y Altschul (Proc. Nat. Acad. Sci., EE.UU. 90: 5873 (1993)). Se incorpora tal algoritmo en los programas NBLAST o XBLAST de Altschul et al ., J. Mol. Biol. 215: 403 (1990). Se realizan búsquedas BLAST con el programa NBLAST, puntuación (score) = 100, longitud de palabra (wordlength) = 12, para obtener secuencias de nucleótidos homólogas a un ácido nucleico de la invención. Se realizan búsquedas BLAST de proteínas con el programa XBLAST, puntuación (score) = 50, longitud de palabra (wordlength) = 3, para obtener secuencias de aminoácidos homólogas a un polipéptido de referencia. Para obtener alineaciones con huecos para las comparaciones, se utiliza Gapped-BLAST para tal fin, tal como se describe en Altschul et al ., Nucleic Acid Res., 25: 3389 (1997). Cuando se utilizan BLAST y Gapped-BLAST se utilizan los parámetros por defecto de los respectivos programas (XBLAST y NBLAST). Véase http://www.ncbi.nlm.nih.gov.

"Aislado" (utilizado indiferentemente con "sustancialmente puro") cuando se aplica a un ácido nucleico, es decir, secuencias de polinucleótidos que codifican para antagonista de integrinas, significa un polinucleótido de ADN o ARN, una porción de polinucleótido genómico, ADNc o un pulinucleótido sintético, los cuales, en virtud de su origen o por manipulación: (i) no están asociados con todo un polinucleótido con el que se asocian en la naturaleza (por ejemplo, está presente en una célula hospedadora como vector de expresión, o como una porción del mismo); o (ii) está vinculado a un ácido nucleico u otro resto químico diferente de aquél al que se vincularía en la naturaleza; o (iii) no aparece en la naturaleza. Por "aislado" se quiere decir, además, una secuencia de polinucleótido que está: (i) amplificada in vitro mediante, por ejemplo, una reacción en cadena de la polimerasa (PCR); (ii) sintetizada químicamente; (iii) producida de manera recombinante por clonación; o (iv) purificada, por ejemplo por escisión y separación en gel. Así, un "ácido nucleico sustancialmente puro" es un ácido nucleico que no está inmediatamente contiguo con una o ambas secuencias de codificación con las que está contiguo normalmente en el genoma natural del organismo del cual procede el ácido nucleico. ADN sustancialmente puro incluye también un ADN recombinante que es parte de un gen híbrido que codifica para secuencias adicionales de integrina.

"Aislado" (utilizado indiferentemente con "sustancialmente puro") cuando se aplica a los polipéptidos significa un polipéptido o una porción del mismo que, en virtud de su origen o por manipulación: (i) está presente en una célula hospedadora como el producto de la expresión de una porción de un vector de expresión; o (ii) está vinculado a una proteína u otro resto químico diferente a aquél con el que se vincula en la naturaleza; o (iii) no aparece en la naturaleza, por ejemplo, una proteína manipulada químicamente agregando o añadiendo al menos un radical hidrófobo a la proteína de modo que la proteína está un una forma que no se encuentra en la naturaleza. "Aislado" significa, además, que una proteína está: (i) sintetizada químicamente; o (ii) expresada en una célula hospedadora y purificada lejos de proteínas asociadas y contaminantes. En general el término significa un polipéptido que se ha separado de otras proteínas y ácidos nucleicos con los que aparece de manera natural. Preferiblemente, el polipéptido se separa también de sustancias tales como anticuerpos o matrices de geles (poliacrilamida) que se utilizan para purificarlo.

"Complejo de proteínas multivalente" - se refiere a una pluralidad de antagonista de integrinas (es decir, una o más). Un homólogo de un anticuerpo anti-integrina o un fragmento puede reticularse o vincularse con otro homólogo de anticuerpo o fragmento. Cada proteína puede ser igual o diferente y cada homólogo de anticuerpo o fragmento puede ser igual o diferente.

"mutante" - cualquier cambio en el material genético de un organismo, en particular cualquier cambio (es decir, deleción, sustitución, adición o alteración) en una secuencia de polinucleótido de tipo natural o cualquier cambio en una proteína de tipo natural. El término "muteína" se utiliza de manera intercambiable con "mutante".

"operativamente unido" - una secuencia de polinucleótido (ADN, ARN) está operativamente unida a una secuencia de control de la expresión cuando la secuencia de control de la expresión controla y regula la transcripción y traducción de esa secuencia de polinucleótido. El término "operativamente unido" incluye tener una señal de inicio apropiada (por ejemplo, ATG) delante de la secuencia de polinucleótido que va a expresarse, y mantener el marco de lectura correcto para permitir la expresión de la secuencia de polinucleótido bajo el control de la secuencia de control de la expresión, y la producción del polipéptido deseado codificado por la secuencia de polinucleótido.

Un "agente farmacológico" se define como uno o más compuestos o moléculas u otras entidades químicas administradas a un sujeto (además de los antagonistas de la invención) que afecta a la acción del antagonista. El término "agente farmacológico" tal como se utiliza en el presente documento se refiere a un(os) agente(s) que se administra(n) durante el "tratamiento de combinación" en el que se administra el antagonista de la invención o bien antes de, o bien después, o bien simultáneamente con, la administración de uno o más agentes farmacológicos.

"proteína" - cualquier polímero que consiste esencialmente en cualquiera de los 20 aminoácidos. Aunque "polipéptido" se utiliza a menudo con referencia a polipéptidos relativamente grandes, y "péptido" se utiliza a menudo con referencia a polipéptidos pequeños, el uso de estos términos en la técnica coincide en parte y es variado. El término "proteína" tal como se utiliza en el presente documento se refiere a péptidos, proteínas y polipéptidos, a menos que se indique lo contrario.

Los términos "péptido(s), proteína(s) y polipéptido(s)" se utilizan de manera intercambiable en el presente documento. Los términos "secuencia de polinucleótido" y "secuencia de nucleótido" también se utilizan de manera intercambiable en el presente documento.

"Recombinante", tal como se utiliza en el presente documento, significa que una proteína se deriva de sistemas de expresión recombinantes de mamíferos. Puesto que la integrina no está glucosilada ni contiene enlaces disulfuro, puede expresarse en la mayor parte de sistemas de expresión procariotas y eucariotas.

"molécula pequeña" - tiene la definición de la sección A2.

La frase "aminoácido de superficie" significa cualquier aminoácido que está expuesto al disolvente cuando se pliega una proteína en su forma nativa.

"condiciones de hibridación" significa generalmente las condiciones salinas y de temperatura sustancialmente equivalentes a desde 0,5 X SSC hasta aproximadamente 5 X SSC y 65ºC tanto para la hibridación como para el lavado. El término "condiciones de hibridación habituales" tal como se utiliza en el presente documento es, por tanto, una definición operacional y engloba un intervalo de condiciones de hibridación. No obstante, las condiciones de "alta rigurosidad" incluyen la hibridación con tampón de detección de placas (0,2% de polivinilpirrolidona, 0,2% de Ficoll 400; 0,2% de albúmina de suero bovino, Tris-HCl 50 mM (pH 7,5); NaCl 1 M; 0,1% de pirofosfato de sodio; 1% de SDS); 10% de sulfato de dextrano y 100 \mug/ml de ADN de esperma de salmón sonicado y desnaturalizado a 65ºc durante 12 - 20 horas y lavado con NaCl 75 mM / citrato de sodio 7,5 mM (0,5 x SSC) / 1% de SDS a 65ºC. Las condiciones de "baja rigurosidad" incluyen la hibridación con tampón de detección de placas; 10% de sulfato de dextrano y 110 \mug/ml de ADN de esperma de salmón sonicado y desnaturalizado a 55ºc durante 12 - 20 horas y lavado con NaCl 300 mM / citrato de sodio 30 mM (2 x SSC) / 1% de SDS a 55ºC. Véase también Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc. Nueva York, secciones 6.3.1-6.3.6, (1989).

Una "composición terapéutica" tal como se utiliza en el presente documento se define que comprende los antagonistas de la invención y otros componentes biológicamente compatibles. La composición terapéutica puede contener excipientes tales como agua, minerales y vehículos tales como una proteína.

Un "sujeto que tiene un estado fibrótico" se refiere, pero no se limita a, sujetos aquejados de fibrosis de un órgano interno, sujetos aquejados de un trastorno fibroso dérmico y sujetos aquejados de estados fibróticos oculares. La fibrosis de los órganos internos (por ejemplo, pulmón, hígado, riñón, vasos sanguíneos cardiacos, tracto gastrointestinal) se produce en trastornos tales como la fibrosis pulmonar, mielofibrosis, cirrosis hepática, glomerulonefritis mesangial proliferativa, glomerulonefritis semilunar, nefropatía diabética, fibrosis renal intersticial, fibrosis renal en pacientes que reciben ciclosporina, y nefropatía asociada al VIH. Los trastornos fibrosos dérmicos incluyen, pero no se limitan a, esclerodermia, morfea, queloides, cicatrices hipertróficas, colagenoma cutáneo familiar y nevos de tejido conjuntivo del tipo de colágeno. Los estados fibróticos oculares incluyen estados tales como la retinopatía diabética, cicatrices posquirúrgicas (por ejemplo, tras cirugía de filtración para el glaucoma y tras cirugía de estrabismo convergente) y vitreorrerinopatía proliferativa. Estados fibróticos adicionales que pueden tratarse mediante los métodos de la presente invención incluyen; artritis reumatoide, enfermedades asociadas con el dolor articular prolongado y articulaciones deterioradas; esclerosis sistémica progresiva, polimiositis, dermatomiositis, fascitis eosinofílica, morfea, síndrome de Raynaud y poliposis nasal. Además, los estados fibróticos que pueden tratarse con los métodos de la presente invención también incluyen inhibir la sobreproducción de cicatrización patológica en pacientes que se sabe que forman queloides o cicatrices hipertróficas, inhibir o prevenir las cicatrices o la sobreproducción de cicatrización patológica debida a la curación de diversos tipos de heridas incluyendo incisiones quirúrgicas, heridas abdominales quirúrgicas y laceraciones por traumatismo, prevenir o inhibir la cicatrización patológica y el nuevo cierre de arterias tras la angioplastia coronaria, prevenir o inhibir las cicatrices en exceso o la formación de tejido fibroso asociado con la fibrosis cardiaca tras un infarto y en la vasculopatía por hipersensibilidad.

Una "cantidad eficaz" es una cantidad suficiente para lograr resultados beneficiosos o deseados. Una cantidad eficaz puede administrarse en una o más administraciones. En cuanto al tratamiento, una "cantidad eficaz" de un antagonista para su uso en la presente invención es una cantidad suficiente para paliar, mejorar, estabilizar, revertir, ralentizar o retrasar la progresión de un estado fibrótico según los niveles aceptables para los trastornos que van a tratarse. Pueden medirse la detección y medición de indicadores de eficacia mediante varias herramientas de diagnóstico disponibles, incluyendo por ejemplo, mediante la exploración física que incluye análisis de sangre, pruebas de la función pulmonar y radiografías torácicas; exploración mediante TAC; broncoscopia; lavado broncoalveolar; biopsia pulmonar y exploración mediante TAC.

La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique lo contrario, las técnicas convencionales de biología celular, cultivo celular, biología molecular, microbiología, ADN recombinante, química de proteínas, farmacología e inmunología, que están dentro de las habilidades de la técnica. Tales técnicas se describen en la bibliografía.

II. Descripción de las realizaciones preferidas

La presente solicitud se refiere al descubrimiento de que los antagonistas para las integrinas que contienen la subunidad alfa 1 y/o alfa 4 y fragmentos de las mismas pueden utilizarse para el tratamiento de fibrosis pulmonar.

A. Antagonistas de las integrinas

Para los fines de la invención, un antagonista de las integrinas puede ser un antagonista de cualquier interacción entre una integrina y su ligando o receptor relacionado de tal manera que se altera la función normal inducida por las interacciones ligando-receptor (es decir, prevenir o ralentizar o modificar de otra manera). Una realización preferida de un antagonista de las integrinas es un antagonista de interacciones de integrinas alfa 4 con sus ligandos, tales como la interacción VCAM-1/VLA-4. Este es un agente, por ejemplo, un polipéptido u otra molécula, que puede inhibir o bloquear la unión mediada por VCAM-1 y/o VLA-4 o que de otra manera puede modular la función de VCAM-1 y/o VLA-4, es decir, mediante la inhibición o el bloqueo de la transducción de la señal de VLA-4 mediada por el ligando de VLA-4 o la transducción de la señal de VCAM-1 mediada por el ligando VCAM-1 y que es eficaz en el tratamiento de lesión cerebral aguda, preferiblemente del mismo modo que con los anticuerpos anti-VLA-4.

Un antagonista de la interacción VCAM-1/VLA-4 es un agente que tiene una o más de las siguientes propiedades: (1) recubre o se une a VLA-4 en la superficie de una célula que lleva VLA-4 (por ejemplo, una célula endotelial) con especificidad suficiente para inhibir un interacción ligando de VLA-4/VLA-4, por ejemplo, la interacción VCAM-1/VLA-4; (2) recubre o se une a VLA-4 en la superficie de una célula que lleva VLA-4 (es decir, un linfocito) con suficiente especificidad para modificar, y preferiblemente para inhibir, la transducción de una señal mediada por VLA-4, por ejemplo, la señalización mediada por VLA-4/VCAM-1; (3) recubre, o se une, a un ligando de VLA-4 (por ejemplo, VCAM-1) en las células endoteliales con especificidad suficiente para inhibir la interacción VLA-4/VCAM-1; (4) recubre o se une a un ligando de VLA-4 (por ejemplo, VCAM-1) con suficiente especificidad para modificar, y preferiblemente para inhibir, la transducción de la señalización de VLA-4 mediada por el ligando de VLA-4 , por ejemplo, la señalización de VLA-4 mediada por VCAM-1. En realizaciones preferidas, el antagonista tiene una o ambas de las propiedades 1 y 2. En otras realizaciones preferidas, el antagonista tiene una o ambas de las propiedades 3 y 4. Además, puede utilizarse más de un antagonista, por ejemplo, puede combinarse un agente que se une a VLA-4 con una agente que se une a VCAM-1.

Otra realización de un antagonista de integrinas es un antagonista de interacciones de integrinas alfa 1 con sus ligandos, tal como la interacción colágeno/VLA-1. Este es un agente, por ejemplo, un polipéptido u otra molécula que puede inhibir o bloquear la unión mediada por colágeno y/o VLA-1 o que puede modular de otra manera la función del colágeno y/o VLA, por ejemplo, inhibiendo o bloqueando la transducción de señal de VLA-1 mediada por el ligando de VLA-1 o la transducción de la señal de colágeno mediada por colágeno. Un antagonista de la interacción colágeno/VLA-1 es un agente que tiene una o más de las siguientes propiedades: (1) recubre o se une a VLA-1 en la superficie de una célula que lleva VLA-1 (por ejemplo, colágeno) con especificidad suficiente para inhibir un interacción ligando de VLA-1/VLA-1, por ejemplo, la interacción colágeno/VLA-1; (2) recubre o se une a VLA-1 en la superficie de una célula que lleva VLA-1 con suficiente especificidad para modificar, y preferiblemente para inhibir, la transducción de una señal mediada por VLA-1, por ejemplo, la señalización mediada por VLA-1/colágeno; (3) recubre o se une a un ligando de VLA-1 (por ejemplo, colágeno) con especificidad suficiente para inhibir la interacción VLA-1/colágeno; (4) recubre o se une a un ligando de VLA-1 con suficiente especificidad para modificar, y preferiblemente para inhibir, la transducción de la señalización de VLA-1 mediada por el ligando de VLA-1, por ejemplo, la señalización de VLA-1 mediada por colágeno. En las realizaciones preferidas, el antagonista de alfa 1 tiene una o ambas de las propiedades 1 y 2. En otras realizaciones preferidas, el antagonista de alfa 1 tiene una o ambas de las propiedades 3 y 4. Además, puede administrarse más de un antagonista a un paciente, por ejemplo, un agente que se une a VLA-1 puede combinarse con un agente que se une a colágeno.

Tal como se trata en el presente documento, los antagonistas utilizados en la invención no se limitan a un tipo o estructura particular de molécula de modo que, para los fines de la invención y a modo de ejemplo solamente, cualquier agente que pueda unirse a las integrinas alfa 4 (por ejemplo, VLA-4) en la superficie de las células o a un ligando de alfa 4 tal como VCAM-1 en la superficie de células que llevan el ligando de alfa 4 y que bloquean o recubren de manera eficaz la integrina alfa 4 (por ejemplo, VLA-4) o el ligando de alfa 4 (por ejemplo, VCAM-1), denominado "agente de unión a la integrina alfa 4" y "agente de unión al ligando de la integrina alfa 4", respectivamente, se considera que es un equivalente de los antagonistas utilizados en los ejemplos del presente documento.

Por ejemplo, los anticuerpos u homólogos de anticuerpo (tratados a continuación) así como las formas solubles de las proteínas de unión naturales para VLA-4 y VCAM-1 son útiles. Las formas solubles de las proteínas de unión naturales para VLA-4 incluyen péptidos de VCAM-1 solubles, proteínas de fusión de VCAM-1, proteínas de fusión de VCAM-1/Ig bifuncionales (por ejemplo, moléculas "híbridas", tratadas anteriormente), fibronectina, fibronectina que tiene un segmento de conexión no de tipo III de corte y empalme alternativo, y péptidos de fibronectina que contienen la secuencia de aminoácidos EILDV o una secuencia de aminoácidos sustituida similar de manera conservativa. Las formas solubles de las proteínas de unión naturales para VCAM-1 incluyen péptidos de VLA-4 solubles, proteínas de fusión de VLA-4, proteínas de fusión de VLA-4/Ig bifuncionales y similares. Tal como se utiliza en el presente documento, un "péptido de VLA-4 soluble" o un "péptido de VCAM-1 soluble" es un polipéptido de VLA-4 o VCAM-1 que no puede anclarse por sí mismo a una membrana. Tales polipéptidos solubles incluyen, por ejemplo, polipéptidos de VLA-4 y VCAM que carecen de una parte suficiente de su dominio transmembrana para anclar el polipéptido o se modifican de tal manera que el dominio transmembrana es no funcional. Estos agentes de unión pueden actuar compitiendo con la proteína de unión a la superficie celular para VLA-4 o alterando de otra manera la función de VLA-4. Por ejemplo, puede administrarse una forma soluble de VCAM-1 (véase, por ejemplo, Osborn et al . 1989, Cell, 59:1203-1211) o un fragmento del mismo para unirse a VLA-4 y preferiblemente competir por un sitio de unión a VLA-4 en las células que llevan VCAM-1, conduciendo así a efectos similares a la administración de antagonistas tales como pequeñas moléculas o anticuerpos anti-VLA-4.

1. Homólogos de anticuerpo anti-integrina

En otras realizaciones preferidas, los antagonistas utilizados en la invención para unirse a, incluyendo bloquear o recubrir, una integrina alfa 1 y/o alfa 4 de la superficie celular (tal como VLA-1, VLA-4 o alfa 4-beta 7) y/o un ligando de la superficie celular para una integrina alfa 1 y/o alfa 4 (tal como colágeno o VCAM-1, respectivamente) es un anticuerpo u homólogo de anticuerpo, monoclonal anti-VLA-1 o anti-VLA-4 y/o anti-colágeno y/o anti-VCAM-1, tal como se definió anteriormente. Los anticuerpos y homólogos de anticuerpos preferidos para el tratamiento, en particular para el tratamiento humano, incluyen homólogos de anticuerpo humano, homólogos de anticuerpo humanizado, homólogos de anticuerpo híbrido, fragmentos de anticuerpo Fab, Fab', F(ab')_{2} y F(v) y monómeros o dímeros de cadenas pesadas o ligeras de anticuerpo o mezclas de los mismos. Los anticuerpos monoclonales contra VLA4 son un agente de unión preferido en el método de la invención.

2. Antagonistas de las integrinas de molécula pequeña

El término antagonista de integrina de "molécula pequeña" se refiere a agentes químicos (es decir, moléculas orgánicas) que pueden perturbar la interacción integrina/ligando de integrina mediante, por ejemplo, el bloqueo de interacciones VLA-4/VCAM uniéndose a VLA-4 en la superficie de las células o uniéndose a VCAM-1 en la superficie de las células. Tales moléculas pequeñas también pueden unirse a los respectivos receptores de VLA-4 y VCAM-1. Los inhibidores de molécula pequeña de VLA-4 y VCAM-1 pueden ser ellos mismos péptidos, compuestos semipeptídicos o compuestos no peptídicos, tales como pequeñas moléculas orgánicas que son antagonistas de la interacción VCAM-1/VLA-4. Una "molécula pequeña", tal como se define en el presente documento, no pretende englobar un anticuerpo u homólogo de anticuerpo. El peso molecular de las moléculas pequeñas a modo de ejemplo es generalmente inferior a 1000.

Por ejemplo, pueden emplearse moléculas pequeñas tales como oligosacáridos que imitan el dominio de unión de un ligando de VLA-4 y se ajustan al dominio del receptor de VLA-4. (Véase, J. J. Devlin et al ., 1990, Science 249:400-406 (1990), J. K. Scott y G. P. Smith, 1990, Science 249:386-390 y la patente de los EE.UU. 4.833.092 (Geysen).

Por el contrario, pueden emplearse moléculas pequeñas que imitan el dominio de unión de un ligando VCAM-1 y se ajustan al dominio del receptor de VCAM-1.

Ejemplos de otras moléculas pequeñas útiles en la invención pueden encontrarse en Komoriya et al . ("The Minimal Essential Sequence for a Major Cell Type-Specific Adhesion Site (CS1) Within the Alternatively Spliced Type III Connecting Segment Domain of Fibronectin Is Leucine-Aspartic Acid-Valine", J. Biol. Chem., 266 (23), págs. 15075-79 (1991)). Identificaron la secuencia de aminoácidos activa mínima necesaria para unirse a VLA4 y sintetizaron una variedad de péptidos solapantes basados en la secuencia de aminoácidos de la región CS-1 (el dominio de unión a VLA-4) de una especie particular de fibronectina. Identificaron un péptido de 8 aminoácidos, Glu-Ile-Leu-Asp-Val-Pro-Ser-Thr, así como dos pentapéptidos solapantes más pequeños, Glu-Ile-Leu-Asp-Val y Leu-Asp-Val-Pro-Ser, que tenían actividad inhibidora frente a la adhesión celular dependiente de fibronectina. Ciertos péptidos más grandes que contienen la secuencia LVD mostraron posteriormente ser activos in vivo (T. A. Ferguson et al ., "Two Integrin Binding Peptides Abrogate T-cell-Mediated Immune Responses in vivo", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, págs. 8072-76 (1991); y S. M. Wahl et al ., "Synthetic Fibronectin Peptides Suppress Arthritis in Rats by Interrupting Leukocyte Adhesion and Recruitment", J. Clin. Invest., 94, págs. 655-62 (1994)). También se ha descrito un pentapéptido cíclico, Arg-Cys-Asp-TPro-Cys (en el que TPro representa 4-tioprolina), que puede inhibir la adhesión tanto de VLA-4 como de VLA-5 a fibronectina. (Véase, por ejemplo, D.M. Nowlin et al . "A Novel Cyclic Pentapeptide Inhibits Alpha4Beta1 Integrin-mediated Cell Adhesion", J. Biol. Chem., 268(27), págs. 20352-59 (1993); y la publicación PCT PCT/US91/04862). Este pentapéptido se basa en la secuencia del tripéptido Arg-Gly-Asp de fibronectina que se ha sabido que es un motivo común en el sitio de reconocimiento para varias proteínas de la matriz extracelular. Se han notificado ejemplos de otros inhibidores de VLA-4, por ejemplo, en Adams et al . "Cell Adhesion Inhibitors", el documento PCT US97/13013, que describe compuestos de peptidilo lineales que contienen beta-aminoácidos que tienen actividad inhibidora de la adhesión celular. Las solicitudes de patente internacional WO 94/15958 y WO 92/00995 describen compuestos de péptido cíclico y peptidomiméticos con actividad inhibidora de la adhesión celular. Las solicitudes de patente internacional WO 93/08823 y WO 92/08464 describen compuestos inhibidores de la adhesión celular que contienen guanidinilo, urea y tiourea. La patente de los EE.UU. número 5.260.277 describe compuestos de modulación de la adhesión celular de guanidinilo. Se han descrito otros antagonistas de peptidilo de VLA-4 en D. Y. Jackson et al ., "Potent \alpha4\beta1 peptide antagonists as potential anti-inflammatory agents", J. Med. Chem., 40, 3359 (1997); H. Shroff et al ., "Small peptide inhibitors of \alpha4\beta7 mediated MadCAM-1 adhesion to lymphocytes", Bio. Med, Chem. Lett., 1 2495 (1996); patente de los EE.UU. 5.510.332, publicaciones PCT WO 98/53814, WO97/03094, WO97/02289, WO96/40781, WO96/22966, WO96/20216, WO96/01644, WO96106108 y WO95/15973, y otras.

Tales agentes de molécula pequeña puede producirse sintetizando una pluralidad de péptidos (por ejemplo, de 5 a 20 aminoácidos de longitud), compuestos semipeptídicos o compuestos orgánicos no peptídicos, y luego seleccionando aquellos compuestos según su capacidad para inhibir la interacción VLA-1/colágeno o VLA-4/VCAM-1 apropiada. Véase, en general, la patente de los EE.UU. número 4.833.092, Scott y Smith, "Searching for Peptide Ligands with an Epitope Library", Science, 249, págs. 386-90 (1990), y Devlin et al ., "Random Peptide Libraries: A Source of Specific Protein Binding Molecules", Science, 249, págs. 40407 (1990).

B. Métodos de preparación de homólogos de anticuerpo anti-integrina

Se conoce bien la tecnología para producir anticuerpos monoclonales, incluyendo por ejemplo, anticuerpos monoclonales anti-integrina. Véase, por ejemplo, Mendrick et al . 1995, Lab. Invest. 72:367-375 (mAc contra anti-\alpha1\beta1 y anti-\alpha2\beta1 murinos); Sonnenberg et al . 1987 J. Biol. Chem. 262:10376-10383 (mAc contra anti-\alpha6\beta1 murino); Yao et al . 1996, J Cell Sci 1996 109:3139-50 (mAc anti-\alpha7\beta1 murino); Hemler et al . 1984, J Immunol 132:3011-8 (mAc contra \alpha1\beta1 humano); Pischel et al . 1987 J Immunol 138:226-33 (mAc contra \alpha2\beta1 humano); Wayner et al . 1988, J Cell Biol 107:1881-91 (mAc contra \alpha3\beta1 humano); Hemler et al . 1987 J Biol Chem 262:11478-85 (mAc contra \alpha4\beta1 humano); Wayner et al . 1988 J Cell Biol 107:1881-91 (mAc contra \alpha5\beta1 humano); Sonnenberg et al . 1987, J. Biol. Chem. 262:10376-10383 (mAc contra \alpha6\beta1 humano); A Wang et al . 1996 Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 15:664-672 (mAc contra \alpha9\beta1 humano); Davies et al . 1989 J Cell Biol 109:1817-26 (mAc contra \alphaV \beta1 humano); Sanchez-Madrid et al . 1982, Proc Natl Acad Sci U S A 79:7489-93 (mAc contra \alphaL \beta2 humano); Diamond et al . 1993, J Cell Biol 120:1031-43 (mAc contra \alphaM\beta2 humano); Stacker et al . 1991 J Immunol 146:648-55 (mAc contra \alphaX\beta2 humano); Van der Vieren et al 1995 Immunity 3:683-90 (mAc contra \alphaD\beta2 humano); Bennett et al . 1983 Proc Natl Acad Sci U S A 80:2417-21 (mAc contra \alphaIIb\beta3 humano); Hessle et al . 1984, Differentiation 26:49-54 (mAc contra \alpha6\beta4 humano); Weinacker et al . 1994 J Biol Chem 269:6940-8 (mAc contra \alphaV\beta5 humano); Weinacker et al . 1994 J Biol Chem 269:6940-8 (mAc contra \alphaV\beta6 humano); Cerf-Bensussan et al 1992 Eur J Immunol 22:273-7 (mAc contra \alphaE\beta7 humano); Nishimura et al . 1994 J Biol Chem 269:28708-15 (mAc contra \alphaV\beta8 humano); Bossy et al . 1991 EMBO J 10:2375-85 (antisuero monoclonal contra \alpha8\beta1 humano); Camper et al . 1998 J. Biol. Chem. 273:20383-20389 (antisuero policlonal contra \alpha10\beta1 humano).

Los antagonistas de las integrinas preferidos contemplados en el presente documento pueden expresarse a partir de ADNc o genómico, intacto o truncado, o a partir de ADN sintéticos en células huésped procariotas o eucariotas. Las proteínas diméricas pueden aislarse a partir de medios de cultivo y/o volver a plegarse y dimerizarse in vitro para formar composiciones biológicamente activas. Pueden formarse heterodímeros in vitro combinando cadenas polipeptídicas separadas, distintas. Alternativamente, pueden formarse heterodímeros en una única célula coexpresando ácidos nucleicos que codifican para cadenas polipeptídicas separadas, distintas. Véase, por ejemplo, el documento WO93/09229 o la patente de los EE.UU. número 5.411.941, para varios protocolos de producción de proteínas heterodiméricas recombinantes a modo de ejemplo. Las células huésped preferidas actualmente incluyen, sin limitación, procariotas incluyendo E. coli, o eucariotas incluyendo levaduras, Saccharomyces, células de insectos o células de mamíferos, tales como células CHO, COS o BSC. Un experto habitual en la técnica apreciará que pueden utilizarse otras células huésped con ventaja.

Por ejemplo, los anticuerpos anti-VLA-4 pueden identificarse mediante inmunoprecipitación de lisados celulares marcados con 125I procedentes de células que expresan VLA-4. (Véase Sanchez-Madrid et al . 1986, Eur. J. Immunol., 16: 1343-1349 y Hemler et al . 1987, J. Biol. Chem., 262, 11478-11485). Los anticuerpos anti-VLA-4 también pueden identificarse mediante citometría de flujo, por ejemplo, midiendo la tinción fluorescente de células Ramos incubadas con un anticuerpo que se cree que reconoce VLA-4 (véase, Elices et al ., 1990 Cell, 60:577-584). Los linfocitos utilizados en la producción de células de hibridoma normalmente se aíslan de mamíferos inmunizados cuyos sueros ya dan positivo en la prueba para detectar la presencia de anticuerpos anti-VLA-4 utilizando tales ensayos de selección.

Normalmente, la línea celular inmortal (por ejemplo, una línea celular de mieloma) se deriva de la misma especie de mamífero que los linfocitos. Las líneas celulares inmortales preferidas son líneas celulares de mieloma de ratón que son sensibles al medio de cultivo que contiene hipoxantina, aminopterina y timidina ("medio HAT"). Normalmente, las células de mieloma de ratón sensibles a HAT se fusionan a esplenocitos de ratón utilizando polietilenglicol de 1500 de peso molecular ("PEG 1500"). Las células de hibridoma que resultan de la fusión se seleccionan entonces utilizando medio HAT, que destruye las células de mieloma no fusionadas y fusionadas de manera improductiva (los esplenocitos no fusionados mueren tras varios días debido a que no están transformados). Los hibridomas que producen un anticuerpo deseado se detectan seleccionando los sobrenadantes de cultivo del hibridoma. Por ejemplo, los hibridomas preparados para producir anticuerpos anti-VLA-4 pueden seleccionarse probando el sobrenadante de cultivo del hibridoma para detectar anticuerpos secretados que tengan la capacidad de unirse a una línea celular que expresa la subunidad alfa 4 recombinante (véase, Elices et al ., anteriormente).

Para producir homólogos de anticuerpo anti-VLA-4 que son inmunoglobulinas intactas, las células de hibridoma que han dado positivo en tales ensayos de selección se cultivaron en un medio nutritivo en condiciones y durante un tiempo suficiente para permitir que las células del hibridoma secreten los anticuerpos monoclonales en el medio de cultivo. Se conocen bien técnicas de cultivo y medios de cultivo tisulares adecuados para las células de hibridoma. El sobrenadante de cultivo del hibridoma condicionado puede recogerse y opcionalmente purificarse adicionalmente los anticuerpos anti-VLA-4 mediante métodos bien conocidos.

Alternativamente, el anticuerpo deseado puede producirse inyectando células de hibridoma en la cavidad peritoneal de un ratón no inmunizado. Las células de hibridoma proliferan en la cavidad peritoneal, secretando el anticuerpo que se acumula en el líquido ascítico. El anticuerpo puede cultivarse extrayendo el líquido ascítico de la cavidad peritoneal con una jeringa.

Previamente se han descrito varios anticuerpos monoclonales anti-VLA-4 de ratón. Véase, por ejemplo, Sanchez-Madrid et al ., 1986, anteriormente; Hemler et al ., 1987, anteriormente; Pulido et al ., 1991, J. Biol. Chem., 266 (16), 10241-10245); Issekutz y Wykretowicz, 1991, J. Immunol., 147: 109 (mAc TA-2). Estos anticuerpos monoclonales anti-VLA-4 y otros anticuerpos anti-VLA-4 (por ejemplo, la patente de los EE.UU. 5.888.507 - Biogen, Inc. y las referencias citadas en ese documento) que pueden reconocer la cadena alfa y/o beta de VLA-4 serán útiles en los métodos de tratamiento según la presente invención. Se prefieren los anticuerpos anti-VLA-4 que reconocerán los epítopos de la cadena alfa 4 de VLA-4 que participan en la unión a los ligandos VCAM-1 y de fibronectina (es decir, los anticuerpos que pueden unirse a VLA-4 en un sitio que participa en el reconocimiento del ligando y bloquea la unión a VCAM-1 y fibronectina). Tales anticuerpos se han definido como anticuerpos específicos del epítopo B (B1 o B2) (Pulido et al ., 1991, anteriormente) y son también anticuerpos anti-VLA-4 según la presente invención.

Los homólogos de anticuerpo monoclonal totalmente humano contra VLA-4 son otro agente de unión preferido que puede bloquear o recubrir los ligandos de VLA-4 en el método de la invención. En su forma intacta, éstos pueden prepararse utilizando esplenocitos humanos preparados in vitro, tal como describe Boerner et al ., 1991, J. Immunol., 147, 86-95. Alternativamente, pueden prepararse mediante la clonación de repertorio descrita por Persson et al ., 1991, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 88: 2432-2436 o por Huang y Stollar, 1991, J. Immunol. Methods 141, 227-236, patente de los EE.UU. 5.798.230 (25 de agosto de 1998, "Process for the preparation of human monoclonal antibodies and their use") quienes describen la preparación de anticuerpos monoclonales humanos a partir de células B humanas. Según este procedimiento, las células B que producen anticuerpos humanos se inmortalizan mediante infección con un virus Epstein-Barr, o un derivado del mismo, que expresa el antígeno 2 nuclear del virus Epstein-Barr (EBNA2). La función de EBNA2, que se requiere para la inmortalización, se bloquea posteriormente, lo que da como resultado un aumento de la producción de anticuerpos.

Todavía en otro método para producir anticuerpos totalmente humanos, la patente de los EE.UU. 5.789.650 (4 de agosto de 1998, "Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies") describe animales no humanos transgénicos que pueden producir anticuerpos heterólogos y animales no humanos transgénicos que tienen inactivados los genes de inmunoglobulinas endógenas. Los genes de inmunoglobulinas endógenas se inhiben mediante polinucleótidos antisentido y/o mediante un antisuero dirigido contra las inmunoglobulinas endógenas. Los anticuerpos heterólogos están codificados por genes de inmunoglobulinas que no se encuentran normalmente en el genoma de esas especies de animal no humano. Se introducen uno o más transgenes que contienen secuencias de cadenas pesadas de inmunoglobulinas humanas heterólogas no reorganizadas en un animal no humano, formándose así un animal transgénico que puede reorganizar de manera funcional secuencias de inmunoglobulinas transgénicas y producir un repertorio de anticuerpos de diversos isotipos codificados por genes de inmunoglobulinas humanos. Tales anticuerpos humanos heterólogos se producen en células B que se inmortalizan posteriormente, por ejemplo, fusionándolas con una línea celular inmortalizada tal como un mieloma o manipulando tales células B mediante otras técnicas para perpetuar una línea celular que puede producir un homólogo de anticuerpo monoclonal, heterólogo, totalmente
humano.

También pueden utilizarse grandes bibliotecas de despliegue en fagos humanos no inmunizados para aislar anticuerpos de alta afinidad que pueden desarrollarse como agentes terapéuticos para seres humanos utilizando la tecnología de fagos habitual (Vaughan et al , 1996).

Todavía otro agente de unión preferido que puede bloquear o recubrir ligandos de integrina en el método de la invención es un homólogo de anticuerpo recombinante humanizado que tiene especificidad anti-integrina. Siguiendo los métodos iniciales para la preparación de verdaderos "anticuerpos híbridos" (en los que las regiones constantes enteras y variables entera se derivan de diferentes orígenes), se describió un nuevo enfoque en el documento EP 0239400 (Winter et al .) en el que los anticuerpos se alteran mediante sustitución (dentro de una región variable dada) de sus regiones determinantes de la complementariedad (CDR) para una especie por las de otra. Este procedimiento puede utilizarse, por ejemplo, para sustituir las CDR de los dominios de la región variable de Ig de cadena ligera y pesada por CDR alternativas de dominios de la región variable murina. Estas regiones variables de Ig alteradas pueden combinarse posteriormente con regiones constantes de Ig humana para crear anticuerpos que son de composición totalmente humana, excepto por las CDR murinas sustituidas. Tales anticuerpos con CDR sustituidas se pronosticaría que va a ser menos probable que provoquen una respuesta inmunitaria en los seres humanos comparado con los verdaderos anticuerpos híbridos, debido a que los anticuerpos con CDR sustituidas contienen considerablemente menos componentes no humanos. El procedimiento para humanizar anticuerpos monoclonales a través del "injerto" de CDR se ha denominado "reformado" ("reshaping"). (Riechmann et al ., 1988, Nature 332, 323-327; Verhoeyen et al ., 1988, Science 239, 1534-1536).

Normalmente, las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de un anticuerpo murino se trasplantan a las regiones correspondientes de un anticuerpo humano, ya que son las CDR (tres en las cadenas pesadas del anticuerpo, tres en las cadenas ligeras) las regiones del anticuerpo de ratón que se unen a un antígeno específico. El transplante de las CDR se consigue mediante ingeniería genética, mediante lo cual se determinan las secuencias de ADN para CDR mediante la clonación de segmentos del gen para la región variable (V) de las cadenas pesadas y ligeras murinas, y luego se transfieren a las correspondientes regiones V humanas mediante mutagénesis dirigida al sitio. En la fase final del procedimiento, se añaden segmentos del gen de la región constante humana del isotipo deseado (normalmente gamma I para CH y kappa para CL) y los genes de las cadenas pesadas y ligeras humanizadas se coexpresan en células de mamífero para producir un anticuerpo humanizado soluble.

La transferencia de estas CDR a un anticuerpo humano confiere a este anticuerpo las propiedades de unión a antígeno del anticuerpo murino original. Las seis CDR en el anticuerpo murino se montan estructuralmente en una región de "armazón" de la región V. El motivo de que el injerto de CDR sea satisfactorio es que las regiones de armazón entre los anticuerpos de ratón y humano pueden tener estructuras 3D muy similares con puntos de unión similares para las CDR, de tal manera que pueden intercambiarse las CDR. Tales homólogos de anticuerpo humanizado pueden prepararse, tal como se pone como ejemplo en Jones et al ., 1986, Nature 321, 522-525; Riechmann, 1988, Nature 332, 323-327; Queen et al ., 1989, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86, 10029; y Orlandi et al ., 1989, Procedimiento. Nat. Acad. Sci. USA 86, 3833.

No obstante, se cree que ciertos aminoácidos dentro de las regiones de armazón interaccionan con CDR y que influyen en la afinidad global de unión al antígeno. La transferencia directa de CDR procedentes de un anticuerpo murino para producir un anticuerpo humanizado recombinante sin ninguna modificación de los armazones de la región V humana a menudo da como resultado una pérdida parcial o completa de la afinidad de unión. En varios casos, parece crítico alterar residuos en las regiones de armazón del anticuerpo aceptor con el fin de obtener actividad de unión.

Queen et al ., 1989 (anteriormente) y el documento WO 90/07861 (Protein Design Labs) han descrito la preparación de un anticuerpo humanizado que contiene residuos modificados en las regiones de armazón del anticuerpo aceptor combinando las CDR de un MAc murino (anti-Tac) con regiones constantes y de armazón de inmunoglobulina humana. Han demostrado una solución al problema de la pérdida de afinidad de unión que a menudo resulta de la transferencia directa de CDR sin ninguna modificación de los residuos del armazón de la región V humana; su solución supone dos etapas clave. En primer lugar, las regiones de armazón de la región V humana se eligen mediante analistas informáticos para una homología óptima de la secuencia de la proteína con el armazón de la región V del anticuerpo murino original, en este caso, el MAc anti-Tac. En la segunda etapa, se hace un modelo por ordenador de la estructura terciaria de la región V murina con el fin de visualizar los residuos de aminoácidos del armazón que es probable que interaccionen con las CDR murinas y estos residuos de aminoácidos murinos se superponen entonces sobre el armazón humano homólogo. Véanse también las patentes de los EE.UU. 5.693.762; 5.693.761; 5.585.089 y 5.530.101 (Protein Design Labs).

Puede utilizarse un enfoque diferente (Tempest et al ., 1991, Biotechnology 9, 266-271) y utilizarse, como patrón, los armazones de la región V derivados de las cadenas pesadas y ligeras de NEWM y REI, respectivamente, para el injerto de CDR sin la introducción radical de residuos de ratón. Una ventaja de utilizar el enfoque de Tempest et al., para construir anticuerpos humanizados basados en NEWM y REI es que las estructuras tridimensionales de las regiones variables de NEWM y REI se conocen a partir de la cristalografía de rayos X y, por tanto, puede hacerse un modelo de las interacciones específicas entre los residuos del armazón de la región V y las CDR.

Independientemente del enfoque tomado, los ejemplos de los homólogos de anticuerpo humanizado iniciales preparados hasta la fecha han mostrado que no es un procedimiento sencillo. Sin embargo, incluso admitiendo que tales cambios del armazón pueden ser necesarios, no es posible predecir, basándose en la técnica anterior disponible cuál, si alguno, de los residuos del armazón será necesario alterar para obtener anticuerpos recombinantes humanizados funcionales de la especificidad deseada. Los resultados hasta ahora indican que los cambios necesarios para conservar la especificidad y/o afinidad son para la mayor parte únicos para un anticuerpo dado y no pueden predecirse basándose en la humanización de un anticuerpo diferente.

Ciertos antagonistas de integrinas que contienen la subunidad alfa 4 útiles en la presente invención incluyen homólogos de anticuerpo recombinante híbrido y humanizado (es decir, inmunoglobulinas intactas y partes de las mismas) con especificidad por el epítopo B que se han preparado y descrito en la patente de los EE.UU. 5.932.214 (mAc HP1/2). El material de partida para la preparación de homólogos de anticuerpo anti-integrina híbrido (variable de ratón - constante de ser humano) y humanizado puede ser un anticuerpo anti-integrina monoclonal murino descrito previamente, un anticuerpo anti-integrina monoclonal disponible comercialmente (por ejemplo, HP1/2, Amae International, Inc., Westbrook, Maine) o un anticuerpo anti-integrina monoclonal preparado según las enseñanzas del presente documento. Otros homólogos de anticuerpo anti-VLA-4 humanizado preferidos se describen por Athena Neurosciences, Inc. en el documento PCT/US95/01219 (27 de julio de 1995) y la patente de los EE.UU. 5.840.299.

Estos anticuerpos anti-VLA-4 humanizados comprenden una cadena ligera humanizada y una cadena pesada humanizada. La cadena ligera humanizada comprende tres regiones determinantes de la complementariedad (CDR1, CDR2 y CDR3) que tienen las secuencias de aminoácidos procedentes de las correspondientes regiones determinantes de la complementariedad de una cadena ligera de inmunoglobulina 21 - 6 de ratón y un armazón de región variable procedente de una secuencia de armazón de región variable de cadena ligera kappa humana, excepto en al menos una posición en la que la posición de aminoácido está ocupada por el mismo aminoácido presente en la posición equivalente del armazón de región variable de cadena ligera de inmunoglobulina 21 - 6 de ratón. La cadena pesada humanizada comprende tres regiones determinantes de la complementariedad (CDR1, CDR2 y CDR3) que tienen las secuencias de aminoácidos procedentes de las correspondientes regiones determinantes de la complementariedad de una cadena pesada de inmunoglobulina 21 - 6 de ratón y un armazón de región variable procedente de una secuencia de armazón de región variable de cadena pesada humana, excepto en al menos una posición en la que la posición de aminoácido está ocupada por el mismo aminoácido presente en la posición equivalente del armazón de región variable de cadena pesada de inmunoglobulina 21 - 6 de ratón.

La presente invención puede utilizar antagonistas codificados por secuencias de ácido nucleico que se hibridan en condiciones rigurosas con secuencias de ácido nucleico que codifican para anticuerpos dirigidos contra las integrinas que contienen la subunidad alfa 4. Por ejemplo, un antagonista de la presente invención puede ser una proteína en la que el ácido nucleico del que procede se hibrida en condiciones de alta rigurosidad con una o más de las secuencias de ácido nucleico que se encuentran en la tabla 6 de la patente de los EE.UU. 5.840.299 o la complementaria de una o más de tales secuencias. Los antagonistas también pueden ser una proteína en la que el ácido nucleico del que procede se hibrida en condiciones de alta rigurosidad con un ácido nucleico que codifica para la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 4 que se encuentran en la patente de los EE.UU. 5.932.214. Además, los antagonistas también puede ser una proteína en la que el ácido nucleico del que procede se hibrida en condiciones de alta rigurosidad con un ácido nucleico que codifica para un dominio variable del anticuerpo producido mediante la línea celular ATCC CRL 11175.

Alternativamente, un antagonista de la presente invención puede ser una proteína en la que el ácido nucleico del que procede se hibrida en condiciones de baja rigurosidad con una o más de las secuencias de ácido nucleico que se encuentran en la tabla 6 de la patente de los EE.UU. 5.840.299 o la complementaria de una o más de tales secuencias. Los antagonistas también pueden ser una proteína en la que el ácido nucleico del que procede se hibrida en condiciones de baja rigurosidad con un ácido nucleico que codifica para la SEQ ID NO: 2 o la SEQ ID NO: 4 que se encuentran en la patente de los EE.UU. 5.932.214. Además, los antagonistas también pueden ser una proteína en la que el ácido nucleico del que procede se hibrida en condiciones de baja rigurosidad con un ácido nucleico que codifica para un dominio variable del anticuerpo producido mediante la línea celular ATCC CRL 11175.

C. Producción de fragmentos y análogos

También pueden producirse eficazmente fragmentos de antagonistas de una integrina alfa-4 aislada (por ejemplo, fragmentos de homólogos de anticuerpos descritos en el presente documento) mediante métodos recombinantes, mediante digestión proteolítica o mediante síntesis química utilizando métodos conocidos por los expertos en la técnica. En los métodos recombinantes, pueden generarse fragmentos internos o terminales de un polipéptido eliminando uno o más nucleótidos de un extremo (para un fragmento terminal) o de ambos extremos (para un fragmento interno) de una secuencia de ADN que codifica para el polipéptido hedgehog aislado. La expresión de ADN mutagenizado produce fragmentos de polipéptido. La digestión con endonucleasas de "recorte de extremos" ("end nibbling") también puede generar ADN que codifican para un conjunto de fragmentos. Los ADN que codifican para fragmentos de una proteína también pueden generarse mediante cizalladura al azar, digestión de restricción o una combinación o ambas. Los fragmentos de proteína pueden generarse directamente a partir de las proteínas intactas. Pueden escindirse específicamente péptidos mediante enzimas proteolíticas incluyendo, pero sin limitarse a, plasmina, trombina, tripsina, quimotripsina o pepsina. Cada una de estas enzimas es específica para el tipo de enlace peptídico que ataca. La tripsina cataliza la hidrólisis de enlaces peptídicos en los que el grupo carbonilo procede de un aminoácido básico, normalmente arginina o lisina. La pepsina y quimotripsina catalizan la hidrólisis de enlaces peptídicos procedentes de aminoácidos aromáticos, tales como triptófano, tirosina y fenilalanina. Se generan conjuntos alternativos de fragmentos de proteína escindidos evitando la escisión en un sitio en el que es sensible a una enzima proteolítica. Por ejemplo, la reacción del grupo \varepsilon-amino ácido de lisina con trifluorotioacetato de etilo en una disolución ligeramente básica produce residuos de aminoácidos bloqueados cuyo enlace peptídico adyacente ya no es sensible a la hidrólisis por tripsina. Las proteínas pueden modificarse para crean enlaces peptídicos que sean sensibles a las enzimas proteolíticas. Por ejemplo, la alquilación de los residuos de cisteína con \beta-haloetilaminas produce enlaces peptídicos que se hidrolizan por tripsina (Lindley, (1956) Nature 178, 647). Además, pueden utilizarse reactivos químicos que escinden las cadenas peptídicas en residuos específicos. Por ejemplo, el bromuro de cianógeno escinde los péptidos en los residuos de metionina (Gross y Witkip, (1961) J. Am. Chem. Soc. 83, 1510). Por tanto, tratando las proteínas con diversas combinaciones de modificadores, enzimas proteolíticas y/o reactivos químicos, las proteínas pueden dividirse en fragmentos de la longitud deseada sin solapamiento de los fragmentos o dividirse en fragmentos solapantes de una longitud deseada.

Los fragmentos también pueden sinterizarse químicamente utilizando técnicas conocidas en la técnica tales como la química F-moc o t-Boc en fase sólida de Merrifield. Merrifield, Recent Progress in Hormone Research 23:451 (1967).

Se tratan a continuación ejemplos de los métodos de la técnica anterior que permiten la producción y prueba de fragmentos y análogos. Estos métodos o análogos pueden utilizarse para preparar y seleccionar fragmentos y análogos de un antagonista de una integrina alfa 4 aislado que puede haber mostrado actividad biológica. Un método a modo de ejemplo para probar si los fragmentos y análogos de los antagonistas de la integrina que contiene la subunidad alfa 4 tienen actividad biológica se encuentra en la sección IV y los ejemplos.

D. Producción de ADN y secuencias peptídicas alteradas: métodos aleatorios

Pueden prepararse variantes de secuencias de aminoácidos de una proteína mediante mutagénesis aleatoria de ADN que codifica para la proteína o una parte particular de la misma. Los métodos útiles incluyen mutagénesis por PCR y mutagénesis de saturación. También puede generarse una biblioteca de variantes de secuencias de aminoácidos aleatorias mediante la síntesis de un conjunto de secuencias de oligonucleótidos degeneradas. Los métodos de generación de variantes de secuencias de aminoácidos de una proteína dada que utilizan ADN y péptidos alterados se conocen bien en la técnica. Los siguientes ejemplos de tales métodos no pretenden limitar el alcance de la presente invención, sino que sirven meramente para ilustrar técnicas representativas. Las personas que tienen experiencia habitual en la técnica reconocerán que otros métodos son también útiles a este respecto.

Mutagénesis por PCR: Véase, por ejemplo, Leung et al ., (1989) Technique 1, 11 - 15.

Mutagénesis de saturación: Se describe generalmente un método en Mayers et al ., (1989) Science 229, 242.

Mutagénesis de oligonucleótidos degenerados: Véase, por ejemplo, Harang, S. A., (1983) Tetrahedron 39, 3; Itakura et al ., (1984) Ann. Rev. Biochem. 53, 323 e Itakura et al ., Recombinant DNA, Proc. 3rd Cleveland Symposium on Macromolecules, págs. 273-289 (A.G. Walton, ed.), Elsevier, Amsterdam, 1981.

E. Producción de ADN y secuencias peptídicas alteradas: métodos directos

La mutagénesis no aleatoria, o dirigida, proporciona secuencias o mutaciones específicas en partes específicas de una secuencia polinucleotídica que codifica para un polipéptido aislado, para proporcionar variantes que incluyen deleciones, inserciones o sustituciones de residuos de la secuencia de aminoácidos conocida del polipéptido aislado. Los sitios de mutación pueden modificarse individualmente o en serie, por ejemplo mediante: (1) la sustitución en primer lugar por aminoácidos conservados y luego por elecciones de más radicales dependiendo de los resultados obtenidos; (2) la deleción del residuo objetivo; o (3) la inserción de residuos de la misma clase o una diferente adyacentes al sitio localizado, o combinaciones de las opciones 1 - 3.

Claramente, tales métodos dirigidos al sitio son una manera en la que puede introducirse una cisteína N-terminal (o un equivalente funcional) en una secuencia polipeptídica dada para proporcionar el sitio de unión para un resto hidrófobo.

Mutagénesis de barrido de alanina: Véase Cunningham y Wells, (1989) Science 244, 1081-1085).

Mutagénesis mediada por oligonucleótidos: Véase, por ejemplo, Adelman et al ., (1983) DNA 2, 183.

Mutagénesis por casete: Véase, Wells et al ., (1985) Gene 34, 315.

Mutagénesis combinatoria: Véase, por ejemplo, Ladner et al ., WO 88/06630

Estrategias de despliegue de fagos: Véase, por ejemplo, la revisión de Marks et al ., J. Biol. Chemistry: 267 16007-16010 (1992).

F. Otras variantes de los antagonistas de las integrinas

Las variantes pueden diferir de otros antagonistas de las integrinas descritos en el presente documento en la secuencia de aminoácidos o de maneras que no impliquen la secuencia, o ambas. Los polipéptidos más preferidos de la invención tienen modificaciones que no son de la secuencia preferidas que incluyen la derivatización química in vivo o in vitro (por ejemplo, de su extremo N-terminal) así como posibles cambios en acetilación, metilación, fosforilación, amidación, carboxilación o glucosilación.

Otros análogos incluyen una proteína o sus fragmentos biológicamente activos cuyas secuencias difieren de las encontradas en las patentes de los EE.UU. 5.840.299 o el documento U.S. 5.888.507; documentos U.S. 5.932.214 o PCT US/94/00266 en una o más sustituciones de aminoácidos conservativos o en una o más sustituciones de aminoácidos no conservativos, o por deleciones o inserciones que no suprimen la actividad biológica de la proteína aislada. Las sustituciones conservativas incluyen normalmente la sustitución de un aminoácido por otro con características similares tales como sustituciones dentro de los siguientes grupos: valina, alanina y glicina; leucina e isoleucina; ácido aspártico y ácido glutámico; asparagina y glutamina; serina y treonina; lisina y arginina; y fenilalanina y tirosina. Los aminoácidos hidrófobos apolares incluyen alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptófano y metionina. Los aminoácidos neutros polares incluyen glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina y glutamina. Los aminoácidos cargados positivamente (básicos) incluyen arginina, lisina e histidina. Los aminoácidos cargados negativamente (ácidos) incluyen ácido aspártico y ácido glutámico. Otras sustituciones conservativas pueden conocerse fácilmente por los trabajadores de experiencia habitual. Por ejemplo, para el aminoácido alanina, una sustitución conservativa puede tomarse de uno cualquiera de D-alanina, glicina, beta-alanina, L-cisteína y D-cisteína. Para lisina, una sustitución puede ser una cualquiera de D-lisina, arginina, D-arginina, homo-arginina, metionina, D-metionina, ornitina o D-ornitina.

Otros análogos utilizados en la presente invención son aquellos con modificaciones que aumentan la estabilidad del péptido. Tales análogos pueden contener, por ejemplo, uno o más enlaces no peptídicos (que sustituyen a los enlaces peptídicos) en la secuencia peptídica. También se incluyen: análogos que incluyen residuos diferentes a los L-aminoácidos que se producen de manera natural, tales como D-aminoácidos o aminoácidos que no se producen de manera natural o sintéticos tales como beta o gamma-aminoácidos y análogos cíclicos. La incorporación de D-aminoácidos en lugar de L en el polipéptido hedgehog aislado puede aumentar su resistencia a las proteasas. Véase, la patente de los EE.UU. 5.219.990, anteriormente.

Los homólogos de anticuerpo preferidos incluyen una secuencia de aminoácidos al menos un 60%, 80%, 90%, 95%, 98% o 99% homóloga a una secuencia de aminoácidos del anticuerpo PS/2 (véase el ejemplo) o incluyen una secuencia de aminoácidos al menos un 60%, 80%, 90%, 95%, 98% o 99% homóloga a una secuencia de aminoácidos descrita en la patente de los EE.UU. 5.840.299 (SEQ ID NO 15 - región variable de cadena ligera o SEQ ID NO: 17 - región variable de cadena pesada) o la patente de los EE.UU. 5.932.214 (SEQ ID NO: 2 ó 4); y la solicitud de patente publicada WO94/16094 (aquellas secuencias encontradas en el anticuerpo anti-VLA-4 de la línea celular depositada ATCC CRL 11175).

G. Formas conjugadas poliméricas

Dentro del amplio alcance de la presente invención, puede emplearse una única molécula de polímero para la conjugación con un antagonista de una integrina alfa 1 o alfa 4, aunque también se contempla que pueda también unirse más de una molécula de polímero. Las composiciones de antagonista de integrina alfa 4 conjugado de la invención también pueden encontrar utilidad tanto en aplicaciones in vivo como in vitro. Adicionalmente, se reconocerá que el polímero de conjugación puede utilizar cualquier otro grupo, resto u otra especia conjugada, según sea apropiado para la aplicación de uso final. A modo de ejemplo, puede ser útil en algunas aplicaciones unir covalentemente al polímero un resto funcional que le confiera resistencia frente a la degradación UV, o antioxidación, u otras propiedades o características al polímero. Como un ejemplo adicional, puede ser ventajoso en algunas aplicaciones funcionalizar el polímero para hacerlo reactivo y permitir que se reticule a una molécula de fármaco, para potenciar diversas propiedades o características del material conjugado global. En consecuencia, el polímero puede contener cualquier funcionalidad, grupos repetidos, enlaces u otras estructuras constituyentes que no impidan la eficacia de la composición de antagonista de la integrina alfa 4 conjugado para su fin destinado. Otros objetivos y ventajas de la presente invención serán evidentes con más detalle a partir de la siguiente descripción y las reivindicaciones adjuntas.

Los polímeros ilustrativos que pueden emplearse de manera útil para conseguir estas características deseables se describen en el presente documento, a continuación, en esquemas de reacción a modo de ejemplo. En conjugados de antagonista / polímero unidos covalentemente, el polímero puede funcionalizarse y luego acoplarse a aminoácido(s) libre(s) del antagonista para formar enlaces lábiles.

Los antagonistas contra integrinas que contienen la subunidad alfa 4 o alfa 1 se conjugan más preferiblemente a través de un grupo reactivo terminal en el polímero, aunque las conjugaciones también pueden ramificarse a partir de grupos reactivos no terminales. El polímero con el (los) grupo(s) reactivo(s) se designa en el presente documento como "polímero activado". El grupo reactivo reacciona selectivamente con grupos amino libres u otros grupos reactivos en la molécula de antagonista. El (los) polímero(s) activado(s) se hace(n) reaccionar de modo que se produzca la unión en cualquier grupo amino disponible del antagonista de la integrina alfa 4, tal como grupos alfa-amino o los grupos épsilon-amino de las lisinas. Los grupos carboxílicos libres, grupos carbonilo activados adecuadamente, hidroxilo, guanidilo, restos de hidratos de carbono oxidados y grupos mercapto del antagonista de la integrina alfa 4 (si están disponibles) también pueden utilizarse como sitios de unión.

Aunque el polímero puede unirse en cualquier parte de la molécula del antagonista de integrinas, un sitio preferido para el acoplamiento del polímero a los antagonistas de integrinas (particularmente aquellos que son proteínas) es el extremo N-terminal del antagonista de integrinas. El (los) sitio(s) secundario(s) está(n) en o próximos al extremo C-terminal y a través de restos de azúcar (si los hay). Por tanto, la invención contempla: (i) conjugados poliméricos acoplados en el extremo N-terminal de antagonistas de integrinas alfa 1 y alfa 4; (ii) conjugados poliméricos acoplados en el extremo C-terminal de antagonistas de integrinas alfa 1 y alfa 4; (iii) conjugados acoplados a azúcar; (iv) así como conjugados poliméricos acoplados a N, C y azúcar de antagonistas de integrinas alfa 1 y alfa 4.

Generalmente, se emplean desde aproximadamente 1,0 hasta aproximadamente 10 moles de polímero activado por mol de antagonista, dependiendo de la concentración de antagonista. La cantidad final es un equilibrio entre maximizar la extensión de la reacción mientras se minimizan las modificaciones no específicas del producto y, al mismo tiempo, definir químicas que mantendrán una actividad óptima, mientras que al mismo tiempo se optimiza, si es posible, la semivida del antagonista. Preferiblemente, se conserva al menos aproximadamente el 50% de la actividad biológica del antagonista, lo más preferido se conserva el 100%.

Las reacciones pueden tener lugar mediante cualquier método adecuado reconocido en la técnica utilizado para hacer reaccionar materiales biológicamente activos con polímeros inertes. Generalmente, el procedimiento supone preparar un polímero activado (que puede tener al menos un grupo hidroxilo terminal) y posteriormente hacer reaccionar el antagonista con el polímero activado para producir la proteína soluble adecuada para la formulación. La reacción de modificación anterior puede realizarse mediante varios métodos, que pueden suponer una o más etapas.

Tal como se mencionó anteriormente, ciertas realizaciones de la invención utilizan el extremo N-terminal de un antagonista de integrinas como el enlace al polímero. Están disponibles métodos convencionales adecuados para obtener selectivamente un antagonista de integrina alfa 1 o alfa 4 modificado en el extremo N-terminal. Se pone como ejemplo de un método, un método de alquilación reductora que se aprovecha de la reactividad diferencial de los diferentes tipos de grupos amino primarios (los grupos épsilon-amino en la lisina frente a los grupos amino en una metionina N-terminal) disponibles para la derivatización en un antagonista de integrinas adecuado. En las condiciones de selección apropiadas, puede conseguirse la derivatización sustancialmente selectiva de un antagonista de integrinas adecuado en un extremo N-terminal del mismo con un polímero que contiene un grupo carbonilo. La reacción se realiza a un pH que permita aprovecharse de las diferencias de pKa entre los grupos épsilon-amino de los residuos de lisina frente al grupo alfa-amino de un residuo N-terminal del antagonista de integrinas. Este tipo de química se conoce bien por las personas con experiencia habitual en la técnica.

Una estrategia para dirigir un polímero de polialquilenglicol tal como PEG al extremo C-terminal de un antagonista de una integrina alfa 1 o alfa 4 (por ejemplo, como una proteína) sería unir químicamente o modificar por ingeniería genética un sitio que puede utilizarse para dirigir el resto de polímero. Por ejemplo, la incorporación de una Cys en un sitio que está en o próximo al extremo C-terminal de una proteína permitiría la modificación específica utilizando derivados activados de de polialquilenglicol (por ejemplo, PEG), maleimida, vinilsulfona o haloacetato reconocidos en la técnica. Estos derivados pueden utilizarse específicamente para la modificación de las cisteínas alteradas por ingeniería genética debido a la alta selectividad de estos reactivos por Cys. Otras estrategias tales como la incorporación de una cola de histidinas que pueden dirigirse (Fancy et al ., (1996) Chem. & Biol. 3:551) o un sitio de glucosilación adicional en una proteína, representan otras alternativas para modificar el extremo C-terminal de un antagonista de integrinas de la invención.

También se conocen métodos para seleccionar como objetivo azúcares como sitios para la modificación química y, por tanto, es probable que un polímero de polialquilenglicol pueda añadirse directa y específicamente a azúcares (si los hay) en un antagonista de integrinas, que se han activado a través de oxidación. Por ejemplo, puede generarse una polietilenglicol-hidrazida que forma enlaces hidrazona relativamente estables mediante condensación con aldehídos y cetonas. Esta propiedad se ha utilizado para la modificación de proteínas a través de enlaces con oligosacáridos oxidados. Véase, Andresz, H. et al ., (1978), Makromol. Chem. 179:301. En particular, el tratamiento de PEG-carboximetilhidrazida con nitrito produce PEG-carboximetilazida que es un grupo activo de manera electrófila, reactivo frente a grupos amino. Esta reacción puede utilizarse para preparar también proteínas modificadas con polialquilenglicol. Véanse las patentes de los EE.UU. 4.101.380 y 4.179.337.

Puede usarse una química mediada por una molécula de unión de tiol reconocida en la técnica para facilitar adicionalmente la reticulación de las proteínas para formar composiciones de antagonista de las integrinas alfa 1 o alfa 4 multivalentes. En particular, pueden generarse aldehídos reactivos en restos de hidratos de carbono con peryodato de sodio, formándose conjugados de cistamina a través de los aldehídos e induciéndose la reticulación a través de los grupos tiol de las cistaminas. Véase Pepinsky, B. et al ., (1991), J. Biol. Chem., 266:18244-18249 y Chen, L. L. et al ., (1991) J. Biol. Chem., 266:18237-18243. Por tanto, este tipo de química también sería apropiada para la modificación con polímeros de polialquilenglicol en los que se incorpora una molécula de unión al azúcar y se une el polímero de polialquilenglicol a la molécula de unión. Aunque las moléculas de unión que contienen aminotiol o hidrazina permitirán la adición de un único grupo polimérico, puede variarse la estructura de la molécula de unión de modo que pueden añadirse múltiples polímeros y/o que se cambia la orientación espacial del polímero con respecto al antagonista de integrinas.

En la práctica de la presente invención, pueden incorporarse ventajosamente residuos de polialquilenglicol de residuos de alquilpolialquilenglicoles C1-C4, preferiblemente polietilenglicol (PEG), o residuos de poli(oxi)alquilenglicol de tales glicoles en los sistemas poliméricos de interés. Por tanto, el polímero al que se une la proteína puede ser un homopolímero de polietilenglicol (PEG) o es un poliol polioxietilado, siempre que en todos los casos el polímero sea soluble en agua a temperatura ambiente. Los ejemplos no limitantes de tales polímeros incluyen homopolímeros de poli(óxido de alquileno) tales como PEG o polipropilenglicoles, glicoles polioxietilenados, copolímeros de los mismos y copolímeros de bloque de los mismos, siempre que se mantenga la solubilidad en agua del copolímero de bloque. Ejemplos de los polioles polioxietilados incluyen, por ejemplo, glicerol polioxietilado, sorbitol polioxietilado, glucosa polioxietilada, o similares. El esqueleto de glicerol del glicerol polioxietilado es el mismo esqueleto que se produce de manera natural en, por ejemplo, animales y seres humanos en los mono, di y triglicéridos. Por tanto, esta ramificación no debería considerarse necesariamente como un agente extraño en el organismo.

Como alternativa a los poli(óxidos de alquileno), pueden utilizarse dextrano, polivinilpirrolidonas, poliacrilamidas, polivinilalcoholes, polímeros basados en hidratos de carbono y similares. Los expertos habituales en la técnica reconocerán que la lista anterior es meramente ilustrativa y que se contemplan todos los materiales poliméricos que tienen las cualidades descritas en el presente documento.

El polímero no necesita tener ningún peso molecular particular, pero se prefiere que el peso molecular esté entre aproximadamente 300 y aproximadamente 100.000; más preferiblemente entre 10.000 y 40.000. En particular, son mejores los tamaños de 20.000 o más para evitar la pérdida del producto debida a la filtración en los riñones.

La derivatización con polialquilenglicol tiene varias propiedades ventajosas en la formulación de conjugados de polímero-antagonista de integrinas en la práctica de la presente invención, como las asociadas con las siguientes propiedades de los derivados de polialquilenglicol: mejora de la solubilidad acuosa, mientras que al mismo tiempo no provoca ninguna respuesta antigénica o inmunogénica; grados elevados de biocompatibilidad; ausencia de degradación in vivo de los derivados de polialquilenglicol; y facilidad de excreción por los organismos vivos.

Además, en otro aspecto de la invención, puede utilizarse un antagonista de las integrinas alfa 1 o alfa 4 unido covalentemente al componente polimérico, en el que la naturaleza de la conjugación supone enlaces químicos covalentes escindibles. Esto permite el control en cuanto al transcurso de tiempo en el que el polímero puede escindirse del antagonista de integrinas. Este enlace covalente entre el antagonista de integrinas y el polímero puede escindirse mediante una reacción química o enzimática. El producto de polímero-antagonista de integrinas conserva una cantidad aceptable de actividad. Simultáneamente, están presentes partes de polietilenglicol en el polímero de conjugación para dotar al conjugado de polímero-antagonista de integrinas de una alta solubilidad acuosa y capacidad de circulación sanguínea prolongada. Como resultado de estas características mejoradas, la invención contempla la administración parenteral, nasal y oral tanto de la especie activa de polímero-antagonista de la integrina alfa 4 como, tras la escisión hidrolítica, la biodisponibilidad del antagonista de integrinas per se, en aplicaciones in vivo.

Debe entenderse que los esquemas de reacción descritos en el presente documento se proporcionan con fines de ilustración solamente y no deben ser limitantes con respecto a las reacciones y estructuras que pueden utilizarse en la modificación del antagonista de integrinas alfa 1 o alfa 4, por ejemplo, para conseguir solubilidad, estabilización y afinidad por la membrana celular para la administración parenteral y oral. La actividad y estabilidad de estos conjugados de antagonistas de integrinas pueden variarse de varias maneras, utilizando un polímero de diferente peso molecular. Las solubilidades de los conjugados pueden variarse cambiando la proporción y el tamaño del fragmento de polietilenglicol incorporado en la composición polimérica.

\newpage

III. Utilidades

La cantidad de principio activo que puede combinarse con los materiales vehículo para producir una forma farmacéutica individual variará dependiendo del sujeto tratado y del modo de administración particular. Sin embargo, debe entenderse que un régimen de tratamiento y una dosificación específicos para cualquier sujeto particular dependerá de una variedad de factores, incluyendo la actividad del compuesto específico empleado, la edad, peso corporal, salud general, sexo, dieta, momento de administración, velocidad de excreción, combinación farmacológica y el criterio del médico que le trata y la gravedad de la enfermedad particular que se está tratando. La cantidad de principio activo también puede depender del agente terapéutico o profiláctico, si lo hay, con el que se coadministra el principio activo.

Según esta invención, los antagonistas de la presente invención van a administrarse al sujeto en una cantidad eficaz. Las dosis del uso según la invención son una cantidad eficaz, no tóxica. Las personas expertas en la técnica de utilizar pruebas clínicas rutinarias pueden determinar las dosis óptimas para la enfermedad particular que se esté tratando.

Preparaciones farmacéuticas

Según la invención, los antagonistas de la invención pueden administrarse por vía parenteral. El término "parenteral" tal como se utiliza en el presente documento incluye técnicas de infusión o inyección subcutánea, intravenosa, intramuscular, intraarticular, intrasinovial, intraesternal, intratecal, intrahepática, intralesional e intracraneal . La dosis deseada va a administrarse a un sujeto una o más veces al día por vía intravenosa, por vía oral, por vía rectal, por vía parenteral, por vía intranasal, tópicamente o mediante inhalación. La dosis deseada también puede administrarse mediante infusión intravenosa continua.

Los homólogos de anticuerpo se administran preferiblemente como una composición farmacéutica estéril que contiene un vehículo farmacéuticamente aceptable que puede ser cualquiera de los numerosos vehículos conocidos, tales como agua, solución salina, solución salina tamponada con fosfato, dextrosa, glicerol, etanol y similares, o combinaciones de los mismos. Los compuestos de la presente invención pueden utilizarse en forma de sales farmacéuticamente aceptables derivadas de ácidos y bases inorgánicos u orgánicos. Incluidos entre tales sales de ácidos están las siguientes: acetato, adipato, alginato, aspartato, benzoato, bencenosulfonato, bisulfato, butirato, citrato, canforato, canforsulfonato, ciclopentanopropionato, digluconato, dodecilsulfato, etanosulfonato, fumarato, glucoheptanoato, glicerofosfato, hemisulfato, heptanoato, hexanoato, clorhidrato, bromhidrato, yodhidrato, 2-hidroxietanosulfonato, lactato, maleato, metanosulfonato, 2-naftalenosulfonato, nicotinato, oxalato, pamoato, pectinato, persulfato, 3-fenil-propionato, picrato, pivalato, propionato, succinato, tartrato, tiocianato, tosilato y undecanoato. Las sales de bases incluyen sales de amonio, sales de metales alcalinos, tales como sales de sodio y potasio, sales de metales alcalinotérreos, tales como sales de calcio y magnesio, sales con bases orgánicas, tales como sales de diciclohexilamina, N-metil-D-glucamina, tris(hidroximetil)metilamina y sales con aminoácidos tales como arginina, lisina, etcétera. Además, los grupos que contienen nitrógeno básico pueden cuaternizarse con agentes tales como haluros de alquilo inferior, tales como cloruros, bromuros y yoduros de metilo, etilo, propilo y butilo; sulfatos de dialquilo, tales como sulfatos de dimetilo, dietilo, dibutilo y diamilo, haluros de cadena larga tales como cloruros, bromuros y yoduros de decilo, laurilo, miristilo y estearilo, haluros de aralquilo, tales como bromuros de bencilo y fenetilo y otros. De este modo se obtienen productos dispersables o que son solubles en agua o aceite.

Las composiciones farmacéuticas de esta invención comprenden cualquiera de los compuestos de la presente invención o derivados farmacéuticamente aceptables de los mismos, junto con un vehículo farmacéuticamente a aceptable. El término "vehículo" tal como se utiliza en el presente documento incluye adyuvantes y vehículos aceptables. Vehículos farmacéuticamente aceptables que pueden utilizarse en las composiciones farmacéuticas de esta invención incluyen, pero no se limitan a, intercambiadores de iones, alúmina, estearato de aluminio, lecitina, proteínas de suero, tales como albúmina de suero humano, sustancias tampón tales como fosfatos, glicina, ácido sórbico, sorbato de potasio, mezclas de glicéridos parciales de ácidos grasos vegetales saturados, agua, sales o electrolitos, tales como sulfato de protamina, hidrogenofosfato de disodio, hidrogenofosfato de potasio, cloruro de sodio, sales de zinc, sílice coloidal, trisilicato de magnesio, polivinilpirrolidona, sustancias a base de celulosa, polietilenglicol, carboximetilcelulosa sódica, poliacrilatos, ceras, polímeros de bloque de polietileno-polioxipropileno, polietilenglicol y grasa de lana.

Según esta invención, las composiciones farmacéuticas pueden estar en forma de una preparación inyectable estéril, por ejemplo, una suspensión acuosa u oleaginosa inyectable estéril. Esta suspensión puede formularse según las técnicas conocidas en la técnica que utilizan agentes de dispersión o humectantes y agentes de suspensión adecuados. La preparación inyectable estéril también puede ser una disolución o una suspensión inyectable estéril en un diluyente o disolvente no tóxico y aceptable por vía parenteral, por ejemplo, como una disolución en 1,3-butanodiol. Entre los vehículos y los disolventes aceptables que pueden emplearse están el agua, solución de Ringer y disolución isotónica de cloruro de sodio. Además, los aceites estériles, fijos se emplean convencionalmente como un disolvente o medio de suspensión. Para este fin, puede emplearse cualquier aceite fijo insípido incluyendo mono y diglicéridos sintéticos. Los ácidos grasos, tales como el ácido oleico y sus derivados de glicéridos, son útiles en la preparación de aceites inyectables, como lo son los farmacéuticamente aceptables naturales, tales como el aceite de oliva o el aceite de ricino, especialmente en sus versiones polioxietiladas.

Las composiciones farmacéuticas de esta invención pueden administrarse por vía oral. Si se administran por vía oral, pueden administrarse en cualquier forma farmacéutica aceptable por vía oral incluyendo, pero sin limitarse a, cápsulas, comprimidos, suspensiones o disoluciones acuosas. En el caso de comprimidos para uso oral, los vehículos que se utilizan comúnmente incluyen lactosa y almidón de maíz. Los agentes lubricantes, tales como el estearato de magnesio, también se añaden normalmente. Para la administración oral en forma de cápsula, los diluyentes útiles incluyen lactosa y almidón de maíz seco. Cuando se requieren suspensiones acuosas para uso oral, el principio activo se combina con agentes emulsionantes y de suspensión. Si se desea, también pueden añadirse ciertos agentes edulcorantes, aromatizantes o colorantes.

Composiciones particulares para su uso en la presente invención son aquellas en las que el antagonista se formula en vesículas tales como composiciones que contienen liposomas. Los liposomas son vesículas formadas por moléculas anfipáticas tales como lípidos polares, por ejemplo, fosfatidilcolinas, etanolaminas y serinas, esfingomielinas, cardiolipinas, plasmalógenos, ácidos fosfatídicos y cerebrósidos. Los liposomas se forman cuando se permite que moléculas anfipáticas adecuadas se hinchen en agua o disoluciones acuosas para formas cristales líquidos normalmente de estructura multicapa compuestos por muchas bicapas separadas entre sí por material acuoso (también denominados liposomas gruesos). Otro tipo de liposoma que se sabe que consiste en una única bicapa que encapsula material acuoso se denomina vesícula unilaminar. Si se incluyen materiales solubles en agua en la fase acuosa durante el hinchamiento de los lípidos, se quedan atrapados en la fase acuosa entre las bicapas lipídicas.

Un método particularmente conveniente para la preparación de formas formuladas en liposomas de los presentes antagonistas es el método descrito en el documento EP-A-253.619.

En este método, se preparan liposomas de bicapa única que contienen principios activos encapsulados mediante la disolución del componente lipídico en un medio orgánico, la inyección de la disolución orgánica del componente lipídico a presión en un componente acuoso mientras que se mezclan simultáneamente los componentes orgánicos y acuosos en un homogeneizador de alta velocidad o medio de mezclado, con lo que los liposomas se forman espontáneamente. Los liposomas de bicapa única que contienen el principio activo encapsulado pueden emplearse directamente o pueden emplearse en un vehículo farmacéuticamente aceptable adecuado para la administración tópica. La viscosidad de los liposomas puede aumentarse mediante la adición de uno o más agentes espesantes adecuados tales como, por ejemplo, goma xantano, hidroxipropil-celulosa, hidroxipropilmetilcelulosa y mezclas de las mismas. El componente acuoso puede consistir en agua sola o puede contener electrolitos, sistemas tamponados y otros componentes, tales como por ejemplo, conservantes. Los electrolitos adecuados que pueden emplearse incluyen sales metálicas tales como sales de metales alcalinos y de metales alcalinotérreos. Las sales metálicas preferidas son cloruro de calcio, cloruro de sodio y cloruro de potasio. La concentración del electrolito puede variar desde cero hasta 260 mM, preferiblemente desde 5mM hasta 160 mM. El componente acuoso se coloca en un recipiente adecuado que puede adaptarse para llevar a cabo la homogeneización produciendo una gran turbulencia durante la inyección del componente orgánico. La homogeneización de los dos componentes puede llevarse a cabo dentro del recipiente o, alternativamente, los componentes acuosos y orgánicos pueden inyectarse por separado en un medio de mezclado que está situado fuera del recipiente. En éste último caso, los liposomas se forman en el medio de mezclado y entonces se transfieren a otro recipiente con el fin de su recogida.

El componente orgánico consiste en un disolvente farmacéuticamente aceptable, no tóxico tal como, por ejemplo, etanol, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol, y un fosfolípido adecuado que es soluble en el disolvente. Los fosfolípidos adecuados que pueden emplearse incluyen lecitina, fosfatidilcolina, fosfatidilserina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilinositol, lisofosfatidilcolina y fosfatidilglicerol, por ejemplo. Pueden emplearse otros aditivos lipófilos con el fin de modificar selectivamente las características de los liposomas. Ejemplos de tales otros aditivos incluyen estearilamina, ácido fosfatídico, tocoferol, colesterol y extractos de lanolina.

Además, pueden añadirse al componente orgánico otros componentes que puedan evitar la oxidación de los fosfolípidos. Ejemplos de tales otros componentes incluyen tocoferol, hidroxianisol butilado, hidroxitolueno butilado, palmitato de ascorbilo y oleato de ascorbilo. También pueden añadirse conservantes tales como ácido benzoico, metilparabeno y propilparabeno.

Aparte de las composiciones descritas anteriormente, puede hacerse uso de protecciones, por ejemplo, escayolas, vendas, apósitos, almohadillas de gasa y similares, que contienen una cantidad apropiada de un anticuerpo anti-VLA terapéutico. En algunos casos, puede hacerse uso de escayolas, vendas, apósitos, almohadillas de gasa y similares, que se han impregnado con una formulación tópica que contiene la formulación terapéutica.

Las composiciones farmacéuticas de esta invención también pueden administrarse mediante un aerosol nasal o inhalación a través del uso de un nebulizador, un inhalador de polvo seco o un inhalador de dosis medida. Tales composiciones se preparan según técnicas bien conocidas en la técnica de la formulación farmacéutica y pueden prepararse como disoluciones en solución salina, empleando alcohol bencílico u otros conservantes adecuados, promotores de la absorción para potenciar la biodisponibilidad, fluorocarbonos y/u otros agentes solubilizantes o dispersantes convencionales.

Según otra realización, las composiciones que contienen un compuesto de esta invención también pueden comprender un agente adicional seleccionado del grupo que consiste en corticosteroides, antiinflamatorios, inmunosupresores, antimetabolitos e inmunomoduladores. Pueden seleccionarse compuestos específicos dentro de cada clase de cualquiera de los enumerados bajo los encabezamientos de grupos apropiados en "Comprehensive Medicinal Chemistry", Pergamon Press, Oxford, Inglaterra, págs. 970-986 (1990), cuya descripción se incorpora como referencia al presente documento. También se incluyen dentro de este grupo compuestos tales como teofilina, sulfasalazina y aminosalicilatos (antiinflamatorios); ciclosporina, FK-506 y rapamicina (inmunosupresores); ciclofosfamida y metotrexato (antimetabolitos); esteroides (inhalados, orales o tópicos) e interferones (inmunomoduladores).

La dosificación y la tasa de dosis de los compuestos de esta invención eficaces para producir los efectos deseados dependerán de una variedad de factores, tales como la naturaleza del antagonista, el tamaño del sujeto, el objetivo del tratamiento, la naturaleza de la patología que va a tratarse, la composición farmacéutica específica utilizada y el criterio del médico que le trata.

Los niveles de dosificación de entre aproximadamente 0,001 y aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal al día, preferiblemente entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 50 mg/kg de peso corporal al día del compuesto del principio activo son útiles. De la manera más preferida, el agente de unión a VLA-4, ya sea un anticuerpo o derivado de anticuerpo, se administrará a una dosis que oscila entre aproximadamente 0,1 mg/kg de peso corporal/día y aproximadamente 20 mg/kg de peso corporal/día, preferiblemente que oscila entre aproximadamente 0,1 mg/kg de peso corporal/día y aproximadamente 10 mg/kg de peso corporal/día y a intervalos de cada 1 - 14 días. Para agentes de unión que no son anticuerpos o de molécula pequeña: el intervalo de dosis debe estar preferiblemente entre las cantidades molares equivalentes a estas cantidades de anticuerpo. Preferiblemente, se administra una composición de anticuerpo en una cantidad eficaz para proporcionar un nivel plasmático de anticuerpo de al menos 1 mg/ml. Puede determinarse la optimización de las dosificaciones mediante la administración de agentes de unión, seguido por la evaluación del recubrimiento de células positivas para las integrinas por el agente con el tiempo tras administrarse a una dosis dada in vivo.

La presencia del agente administrado puede detectarse in vitro (o ex vivo) mediante la incapacidad o la disminución de la capacidad de las células del individuo para unirse al mismo agente que ha sido marcado (por ejemplo, mediante un fluorocromo). La dosificación preferida debe producir un recubrimiento detectable de la amplia mayoría de las células positivas para las integrinas. Preferiblemente, el recubrimiento es sostenido en el caso de un homólogo de anticuerpo durante un periodo de 1 - 14 días.

Las personas que tienen experiencia habitual en la técnica pueden probar fácilmente si un antagonista de la invención está teniendo su efecto pretendido. Se emplearán las pruebas habituales para la recuperación clínica (por ejemplo, lavado y barrido por FACS para la unión de anticuerpos; mejora de la capacidad pulmonar vital forzada) por los expertos para determinar la eficacia. Por ejemplo, se tratan con una sonda las células contenidas en una muestra del tejido pulmonar del individuo para detectar la presencia del agente in vitro (o ex vivo) utilizando un segundo reactivo para detectar el agente administrado. Por ejemplo, éste puede ser un anticuerpo marcado con fluorocromo específico para el agente administrado, que se mide entonces mediante análisis por FACS (citometría de flujo activada por fluorescencia) habitual. Alternativamente, la presencia del agente administrado se detecta in vitro (o ex vivo) mediante la incapacidad o la disminución de la capacidad de las células del individuo para unirse al mismo agente que ha sido marcado (por ejemplo, mediante un fluorocromo). La dosificación preferida debe producir un recubrimiento detectable de la amplia mayoría de las células positivas para las integrinas. Preferiblemente, el recubrimiento es sostenido en el caso de un homólogo de anticuerpo durante un periodo de 1 - 14 días.

Los siguientes ejemplos se facilitan para ilustrar la presente invención y no deben considerarse como limitantes de la misma.

Ejemplo I

Modelos de animales con fibrosis pulmonar

Muchas pruebas han documentado la participación de células y mediadores inflamatorios en la fibrosis pulmonar en los modelos ampliamente utilizados de roedores con bleomicina (BL). Este modelo es atractivo porque produce un cuadro característico de fibrosis con muchos de los componentes de la enfermedad humana y porque la fibrosis pulmonar inducida por BL es un efecto adverso bien reconocido en la quimioterapia humana. La instilación endotraqueal (ET) de BL en roedores se ha utilizado ampliamente para estudiar los mecanismos de fibrogénesis y para detectar compuestos antifibróticos potencialmente deseables. Aunque la causa inicial de toxicidad pulmonar inducida por BL se atribuye a la generación de especies reactivas de oxígeno (ERO), una vez que se une al hierro y al ADN, el proceso que conduce hasta la manifestación final de la fibrosis pulmonar implica la liberación de diversos mediadores inflamatorios (Giri y Wang., Comments Toxicol., 3: 145-176 (1989)). La patogenia de la lesión pulmonar inducida por BL se presenta inicialmente con edema, hemorragia y un infiltrado celular predominado por neutrófilos y macrófagos. Una acumulación en exceso de los leucocitos inflamatorios en los espacios vasculares, intersticiales y alveolares del pulmón podrían ocasionar una lesión vascular y parenquimatosa mediante la generación de ERO y enzimas proteolíticas. Los neutrófilos contienen cantidades sustanciales de mieloperoxidasa (MPO) que pueden oxidar Cl^{-} a ácido hipocloroso (HOCl) en una reacción con H_{2}O_{2} y se sabe que el HOCl derivado de neutrófilos puede producir toxicidad celular. Las ERO derivadas de macrófagos y neutrófilos puede estimular la producción de citocinas proinflamatorias y fibrogénicas que median una intensificación de la respuesta fibroproliferativa (Phan y Kunkel., Exp. Lung Res., 18: 29-43 (1992)). Además de una gran infiltración celular inflamatoria, el proceso fibrótico se caracteriza adicionalmente por una respuesta hiperproliferativa de fibroblastos activados. Las células similares a fibroblastos son responsables principalmente de un aumento absoluto en el contenido pulmonar de colágeno y de una anomalía en el aspecto ultraestructural y la distribución espacial de los tipos de colágeno.

Ejemplo 2

Inhibición de fibrosis con antagonistas contra las integrinas que contiene la subunidad alfa 4 Materiales y métodos

Se utilizaron un anticuerpo de control no específico (IE6) y un anticuerpo contra las integrinas que contienen la subunidad alfa 4 (PS2). IE6 es un anticuerpo monoclonal IgG1 de ratón anti-LFA3 (dominio 1) humano. Véase Miller, Hochman, Meier, Tizard, Bixler, Rosa, y Wallner (1992) J. Exp. Med. 178: 211-222. PS/2 se produce mediante el método de Miyake et al ., J. Exp. Med., 173: 599-607 (1991).

Se adquirieron ratones C57BL/6 macho sin enfermedad respiratoria crónica que pesaban 25 - 30 g a Charles River Laboratory. El sulfato de bleomicina (como Blenoxane de marca registrada) fue un regalo de Bristol Laboratories, (Syracuse, NY). La L-[3,4-3 H]prolina para el marcado del sustrato de procolágeno de prolilhidroxilasa se obtuvo de NEN Life Science Products (Boston, MA). Z-fix, una formalina al zinc acuosa tamponada, se adquirió a Anatech, LTD (Battle Creek, MI). Todos los demás reactivos fueron de calidad para reactivo o de pureza superior y se obtuvieron de fuentes comerciales habituales.

Tratamiento de los animales

Se alojaron 4 ratones por jaula y se atendieron según las directrices de NIH para el bienestar de los animales. Se dejó que los ratones se aclimataran a las instalaciones durante una semana antes de todos los tratamientos. Se mantuvo un ciclo de 12h / 12h de luz/oscuridad y tuvieron acceso a agua y a Rodent Laboratory Chow (comida de laboratorio para roedores) a voluntad. Los animales se dividieron aleatoriamente en 4 grupos experimentales: 1) SA + SA; 2) BL + IE6; 3) BL + SA y 4) BL + PS2. A los ratones se les inyectó por vía endotraqueal (ET) una dosis única de solución salina o BL a 0,08 unidades/100 microlitros/ratón con anestesia de xilazina y ketamina. Después de instilación ET, los ratones recibieron una inyección IP de IE6, SA o PS2 (100 microgramos en 0,2 ml/ratón) tres veces a la semana. Veintiún días después de la instilación de BL, los ratones se sacrificaron con anestesia de pentobarbital para realizar los análisis del líquido de lavado broncoalveolar (LLBA), bioquímicos e histopatológicos.

Preparación del LLBA y tejido pulmonar

Después de la anestesia, se abrió la cavidad abdominal seguido por exsanguinación de la aorta abdominal descendente. Los pulmones se prepararon para el lavado mediante canulación de la traquea con una aguja roma unida a una jeringa. El lavado pulmonar se llevó a cabo con 3 mL de solución salina isotónica fría administrada en alícuotas de 1 mL. Se dividió una alícuota del LLBA para el recuento celular total. El LLBA restante se centrifugó a 1500 g durante 20 min. a 4ºC, el sobrenadante resultante se dividió en alícuotas y luego se almacenó a -70ºC. Después del LLBA, los lóbulos pulmonares se diseccionaron rápidamente, liberándolos de tejido no parenquimatoso, se congelaron inmediatamente en nitrógeno líquido y se almacenaron a -70ºC.

Después, los pulmones congelados se descongelaron y se homogeneizaron en KCl 0,1 M, Tris 0,02 M (pH 7,6) con un homogeneizador Polytron (Brinkmann Instruments Inc., Westbury, NY). El homogeneizado se mezcló perfectamente mediante inversiones repetidas y se anotaron los volúmenes finales de homogeneizado (4 - 5 mL). El homogeneizado se dividió en varias alícuotas y se almacenaron a -70ºC para realizar las mediciones bioquímicas.

Determinación del equivalente de malondialdehído y el contenido de hidroxiprolina en los pulmones

El equivalente de malondialdehído en los pulmones se estimó a partir de la cantidad total de productos de reacción con ácido tiobarbitúrico en homogeneizado no fraccionado mediante el método de Ohkawa et al ., Anal. Biochem., 95: 351 (1979). Para el ensayo de hidroxiprolina en los pulmones, se precipitó 1 mL de homogeneizado con 0,25 mL de ácido tricloroacético al 50% (p/v) frío en hielo, se centrifugó y se hidrolizó el precipitado en 2 mL de HCl 6 N durante 18 horas a 110ºC. El contenido en hidroxiprolina se midió mediante la técnica descrita por Woessner, J.F., Arch. Biochem. Biophys., 93: 440 (1961).

Determinación de la actividad de la prolilhidroxilasa (EC 1.14.11.2)

La preparación de sustrato de prolilhidroxilasa (procolágeno) y el método para el ensayo de prolilhidroxilasa se describen en Giri, S.N. et al ., Exp. Mol. Pathol. 39: 317 (1983). En resumen, se marcaron tibias recién aisladas de embriones de pollo de diez días con [3H]-prolina en medio de cultivo sin prolina a 37ºC durante 6 h. Después de eliminar el marcador no incorporado mediante lavado, el tejido se homogeneizó y centrifugó a 3000 g durante 20 min. a 4ºC. El sobrenadante resultante se dializó ampliamente para eliminar el marcador no incorporado. El sustrato de procolágeno marcado se dividió en alícuotas y se almacenó a -70ºC. La mezcla de incubación para realizar el ensayo enzimático en un volumen total de 2 mL consistió en sulfato amónico ferroso (0,1 mmol/l), ácido alfa-cetoglutárico (0,1 mmol/l), [3H]-prolina-procolágeno (200.000 dpm, (desintegraciones por minuto)), homogeneizado pulmonar (0,2 mL), ácido ascórbico (0,5 mmol/l) y tampón Tris-ácido clorhídrico (0,1 mol/l, pH 7,8). Se añadieron a la reacción 0,2 mL de ácido tricloroacético al 50% después de 30 min. a 37ºC en un agitador metabólico Dubnoff. Durante la reacción, se libera agua tritiada en una proporción estequiométrica con respecto a la hidroxilación del prolilo y se utiliza como una medida de la actividad enzimática. El agua tritiada del sistema de reacción se separó mediante destilación a vacío de la mezcla de reacción completa y se contó para determinar la radioactividad. La actividad enzimática se expresó como dpm de agua tritiada liberada por pulmón total en 30 min.

Determinación de recuentos celulares del LLBA

El numero total de células en el LLBA se determinó tal como se describe en Wang, Q. et al ., Lab. Invest., 67: 234-242 (1992). El número total de leucocitos en el LLBA se estimó mediante un contador Coulter (modelo F, Coulter Electronics, Inc., Hialeah, FL), según el manual de usuario.

Ensayo de proteínas en el LLBA

El contenido de proteínas en el sobrenadante del LLBA se determinó usando el ensayo de proteínas Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA) y como patrón se utilizó albúmina de suero bovino.

Análisis histopatológico e inmunohistoquímico

Se eligieron aleatoriamente de tres a cuatro animales de cada grupo de tratamiento para la evaluación histopatológica e inmunohistoquímica al final del experimento. Se abrió la cavidad abdominal del animal seguido por exsanguinación de la aorta abdominal descendente. Inmediatamente después, el tejido pulmonar se preparó para el análisis histológico tal como se describe en Wang et al , anteriormente. Después de canular la tráquea con una aguja roma, se abrió la cavidad torácica y entonces se extirparon en bloque tanto el corazón como los pulmones. Los pulmones se fijaron con disolución Z-fix a través de la traquea a una presión de 30 cm de agua. Los lóbulos caudales y craneales derechos y el lóbulo izquierdo se bloquearon más tarde, se embebieron en parafina, se cortaron en secciones de 7 micras y se tiñeron con hematoxilina y eosina. En la tinción inmunohistoquímica para determinar la alfa-SMA, se desparafinaron las secciones de tejido pulmonar y se bloqueó la peroxidasa endógena. Las secciones que iban a teñirse se trataron entonces con suero de cabra de bloqueo durante 30 min. y se incubaron durante 16 h con el anticuerpo anti-alfa-SMA monoclonal primario (Sigma Chemical Co., St Louis, MO).

Análisis estadístico de los datos

Los datos de los animales se expresaron partiendo de una base por pulmón total y se notificaron como la media \pm error estándar (EE). Los datos se compararon dentro de los cuatro grupos usando análisis de la varianza de dos vías (SIGMASTAT) y el método de Student-Newman-Keuls. Un valor de P \leq 0,05 se consideró significativo.

Resultados Peroxidación lipídica en el pulmón de ratón

Se determinó en diversos grupos de ratones el equivalente de malondialdehído en los pulmones como un índice de peroxidación lipídica. La instilación de BL aumentó significativamente el contenido equivalente de malondialdehído en los pulmones de los ratones tanto en los grupos BL+IE6 como BL+SA comparado con los grupos SA+SA y BL+PS2 (datos no representados). El tratamiento con PS2 bloqueó eficazmente la peroxidación lipídica pulmonar inducida por BL ya que el nivel del equivalente de malondialdehído en los pulmones en el grupo BL+PS2 no es diferente del nivel del grupo SA+SA.

Contenido pulmonar de hidroxiprolina en el pulmón de ratón

La hidroxiprolina pulmonar, el índice clave del nivel de colágeno pulmonar, se determino en los cuatro grupos de ratones. La instilación ET de BL elevó significativamente el nivel de hidroxiprolina pulmonar en los grupos BL+IE6 y BL+SA hasta el 185% y el 205% del grupo control SA+SA, respectivamente. El aumento inducido por BL en el nivel de hidroxiprolina pulmonar en el grupo BL+PS2 disminuyó significativamente en un 35% mediante el tratamiento con PS2 comparado con el grupo BL+SA. El nivel de hidroxiprolina pulmonar en el grupo BL+TR no era significativamente superior que el del grupo (SA+SA) control de SA ET.

Actividad de la prolilhidroxilasa en el pulmón de ratón

Las actividad de la prolilhidroxilasa en los pulmones de diversos grupos mostraron que la BL sola aumentaba significativamente la actividad de la prolilhidroxilasa pulmonar en el grupo BL+SA hasta el 207% del grupo control SA+SA. La PS2 disminuía significativamente la actividad de la prolilhidroxilasa elevada por el tratamiento con BL en el grupo BL+SA.

Recuentos celulares del LLBA total en el pulmón de ratón

El número de células totales en el LLBA de diversos grupos a los 21 días después de la instilación ET de solución salina o de BL mostraron que el tratamiento con BL aumentaba los recuentos celulares totales en el LLBA de los grupos BL+IE6 y BL+SA comparado con el grupo control (SA+SA) de solución salina, aunque sólo el grupo BL+IE6 tuvo niveles significativamente superiores que el grupo SA+SA. El recuento celular en el LLBA en el grupo BL+PS2 no fue diferente del recuento del grupo SA+SA.

Contenido en proteínas en el LLBA

El contenido en proteínas del sobrenadante del LLBA para los 4 grupos experimentales reveló que la instilación ET de BL aumentaba significativamente el contenido en proteínas en el LLBA de todos los grupos tratados con BL, comparado con el grupo SA+SA. Sin embargo, el tratamiento con PS2 en el grupo BL+PS2 disminuyó el aumento inducido por BL en las proteínas del sobrenadante de LLBA, aunque la diferencia no era estadísticamente significativa.

Histopatología del pulmón de ratón

El examen histológico de los pulmones de ratón reveló tejido parenquimatoso pulmonar normal en el grupo SA+SA. Sin embargo, los pulmones de los grupos BL+IE6 y BL+SA mostraron alveolitis no uniforme y fibrosis intersticial multifocal que contenían una acumulación de fibras extracelulares. Los pulmones de los ratones en estos grupos tenían tabiques interalveolares engrosados y células inflamatorias en los espacios aéreos adyacentes. En comparación con los grupos BL+IE6 y BL+SA, los pulmones del grupo BL+PS2 tenían muchas menos lesiones fibróticas, aunque algunos lóbulos todavía mostraban un grado leve de fibrosis intersticial.

Tinción inmunohistoquímica para alfa-SMA en el pulmón de ratón

Para determinar la acumulación de fibroblastos y células similares a fibroblastos en ratones después del tratamiento con BL, se examinó la expresión de (XSMA en el tejido pulmonar usando un anticuerpo frente a (XSMA. En los pulmones control, la inmunopositividad se produjo en las capas de músculo liso vascular y bronquial. En los pulmones tratados con BL y anticuerpo control o solución salina, hubo una inmunotinción extensa e intensa sin zonas fibróticas, tanto en el intersticio como en la pleura. Sin embargo, los pulmones tratados con BL y PS2 mostraron una inmunotinción muy reducida de alfa-SMA, comparado con los grupos BL+IE6 y BL+SA.

Discusión

La FPI es una atroz enfermedad y responde mal al tratamiento actual. En el presente estudio, se proporcionan pruebas de que la integrina que contiene la subunidad alfa 4 es otra diana posible en el manejo de la FPI. Generalmente se supone que los leucocitos del pulmón participan en la evolución de la fibrosis pulmonar mediante la secreción de ERO, citocinas fibrogénicas y factores de crecimiento. El tráfico y el estado de activación de los leucocitos están modulados por diversas proteínas de superficie tales como las integrinas. Es evidente que las interacciones célula-célula, además de las interacciones célula-MEC son críticas para la patogenia de la fibrosis pulmonar. Un hallazgo sistemático en los pacientes con fibrosis pulmonar activa y en modelos de animales de enfermedades pulmonares fibróticas es la acumulación de un número aumentado de células inmunitarias e inflamatorias en zonas que experimentan fibrosis.

La VLA-4 se expresa en todos los leucocitos circulantes y se une a la molécula de adhesión celular vascular (VCAM-1), un miembro de la superfamilia del gen de las Ig que se expresa en células endoteliales activadas por citocinas, y a la fibronectina proteica de la matriz. La alfa 4-beta 7 se expresa en un subconjunto de células T y B, células natural killer y eosinófilos. Se une a la adresina vascular de mucosas (MAdCAM-1), un miembro de las familias de moléculas de adhesión de Ig y similares a mucina, además de a VCAM-1 y fibronectina. Los estudios in vitro han demostrado que la interacción de VLA-4 con VCAM-1 participa en la adhesión de leucocitos mononucleares y eosinófilos al endotelio y en la migración transendotelial y se cree que la alfa 4-beta 7 participa principalmente en el reclutamiento de leucocitos al tejido linfoide asociado al intestino.

En el presente estudio, el tratamiento con PS2 disminuyó los aumentos inducidos por BL en los leucocitos totales en el LLBA. La disminución de leucocitos en los pulmones de los ratones BL+PS2 puede ser responsable de la reducción de la lesión inflamatoria y de la fibrosis en los pulmones de los animales tratados con BL. La lesión pulmonar inducida por BL se redujo significativamente mediante el tratamiento con PS2 tal como se indica mediante la medición de la peroxidación lipídica pulmonar. El aumento de colágeno en el pulmón se ha asociado con un número aumentado de fibroblastos en el intersticio y en el propio espacio alveolar. Muchas de estas células similares a fibroblastos son miofibroblastos que tienen un fenotipo característico que incluye la expresión de alfa-SMA, una proteína contráctil que se encuentra normalmente en las células del músculo liso y que se cree que es importante en la fibrogénesis y la curación de heridas. Un hallazgo importante del presente estudio fue que el tratamiento con PS2 atenuaba la proliferación de miofibroblastos inducida por BL. Sin desear restringirse a ninguna teoría particular, la administración de anticuerpo contra las integrinas alfa puede haber reducido el nivel de factores de crecimiento en el pulmón liberados por leucocitos infiltrantes o haber afectado directamente al comportamiento de los miofibroblastos. En cualquier caso, la reducción de miofibroblastos proliferantes podría conducir a una disminución de la acumulación de colágeno pulmonar en los animales tratados con BL en el grupo BL+PS2.

Ejemplo 3

Inhibición de la fibrosis con antagonistas de integrinas que contienen la subunidad alfa 1 Tratamiento de los animales

Se alojaron ratones C57/BL6 macho que pesaban 28 - 30 g en jaulas de plástico, en grupos de 4, en instalaciones aprobadas por la American Association for Accreditation of Laboratory Animal Care (Asociación Americana para la Acreditación del Cuidado de Animales de Laboratorio). Se dejó que los animales se aclimataran durante una semana a las condiciones de laboratorio antes de empezar los experimentos. Tuvieron acceso a Rodent Laboratory Chow 5001 (Purina Mills, Inc., St. Louis, MO) y agua a voluntad y se colocaron en una habitación que tenía aire filtrado y que tenía un ciclo de 12 h de luz / 12 h de oscuridad. Los ratones se asignaron a los siguientes grupos:

Grupo	Tratamiento
A	Solución salina + solución salina tamponada con fosfato
B	Solución salina + IgG de anticuerpo control
C	Bleomicina + IgG de anticuerpo control
D	Bleomicina + anticuerpo anti-integrina \alpha1 \beta1

Se disuelve sulfato de bleomicina en solución salina isotónica estéril libre de pirógenos justo antes de la instilación endotraqueal(ET). Con anestesia de metoxiflurano, los ratones en los grupos apropiados recibieron mediante administración endotraqueal o bien 100 \mul de solución salina isotónica estéril o bien 0,08 unidades de disolución de bleomicina en 100 \mul. Los anticuerpos (4 mg/kg) se administraron mediante inyección intraperitoneal a los ratones en los grupos apropiados tres veces a la semana durante 21 días después de la instilación. Después, se sacrificaron los animales de cada grupo mediante una sobredosis de pentobarbital sódico (100-125 mg/kp i.p.) y sus pulmones se trataron para el lavado broncoalveolar, los estudios bioquímicos e histopatológicos.

Determinación del número total de células y niveles de proteínas en el lavado broncoalveolar

Después de la canulación de la traquea, los pulmones se lavan con 5 mL de solución salina isotónica, facilitada en cinco alícuotas de 1 mL. La solución salina se administra con una jeringa a través de la cánula, se masajea cuidadosamente la pared torácica y se extrae el líquido. El líquido se centrifuga a 1500 g durante 20 minutos a 4ºC y se resuspende en solución salina isotónica. El contenido en proteínas del sobrenadante de las muestras de lavado broncoalveolar se determina mediante un método de Lowry et al ., J Biol. Chem. 1193: 265-275 (1951), con albúmina de suero bovino como patrón. El recuento total de leucocitos de las células en la suspensión se determina en un contador Coulter (Coulter Electronics, Hialeah, FL).

Determinación de hidroxiprolina

Los pulmones de los animales utilizados para los estudios bioquímicos se perfunden in situ a través del ventrículo derecho con solución salina isotónica fría en hielo para eliminar por lavado la sangre de la vasculatura pulmonar a través de una abertura en la aurícula izquierda. Los lóbulos pulmonares se diseccionan rápidamente, liberándose de tejido no parenquimatoso, se ponen en nitrógeno líquido para un congelación rápida y luego se almacenan a -80ºC. Los pulmones congelados se descongelan más tarde y se homogeneizan en KCl 0,1 M, tampón Tris 0,02 M (pH 7,6) con un homogeneizador Polytron. Se cuantifica el contenido de hidroxiprolina del homogeneizado pulmonar como una medida del contenido de colágeno mediante las técnicas de Woessner, Arch. Biochem. Biophys. 93: 440-447
(1961).

Estudio histopatológico

Después del lavado pulmonar, se abre la cavidad torácica y se extirpan en bloque el corazón y los pulmones. Los pulmones se instilan con un fijador de glutaraldehído-paraformaldehído al 1% en tampón cacodilato 0,12 M a 400 mOsm a una presión de 30 cm de H_{2}O. Los pulmones se fijan por medio de esta presión durante aproximadamente 2 horas y luego se almacenan en fijador con las traqueas ocluidas. Antes de la inclusión, los pulmones se aíslan del corazón y de todo el tejido no pulmonar mediante disección roma y se extirpan. Los bloques de tejido se cortan a partir de al menos dos placas sagitales (2 - 3 mm de espesor) de los lóbulos pulmonares craneal derecho, caudal derecho, e izquierdo de cada pulmón. Cada bloque se corta con una superficie de aproximadamente 1 cm^{2}. Los bloques se deshidratan en una serie escalonada de etanol y se incluyen en parafina. Se cortan secciones (5 \mum de espesor) a partir de los bloques de parafina y se tiñen con hematoxilina y eosina para las evaluaciones histológicas.

Análisis e interpretación de los datos

Los datos se analizaron en lo referente a los valores promedio con sus desviaciones estándar y errores estándar de las medias. Se aplican la prueba de la t de Student, las distribuciones chi-cuadrado, el coeficiente de correlación, el análisis de la varianza (ANOVA) y la prueba de comparaciones múltiples para juzgar la significación de las diferencias entre los grupos control y de tratamiento usando un paquete estadístico informático (SAS/STAT Guide, 6ª ed. Cary, N.C. págs. 183-260 (1985)).

Resultados

En este estudio se probó la hipótesis de que el anticuerpo neutralizante contra la integrina \alpha1 \beta1 (anti-\alpha1\beta1) reduce la fibrosis pulmonar inducida por bleomicina (BL) in vivo. Se inyecta a ratones C57/BL6 macho por vía endotraqueal (ET) solución salina (SA) o BL a 0,08 U en 0,1 mL, seguido por inyección intraperitoneal (i.p.) del anticuerpo (100 \mug en 0,2 mL) tres veces a la semana. Veintiún días después de la instilación ET, se sacrifican los ratones para realizar el lavado broncoalveolar (LBA), los análisis bioquímicos e histopatológicos.

Examen histopatológico de los pulmones

Se espera que los ratones tratados con solución salina e IgG control no tengan lesiones visibles y manifiesten tabiques interalveolares con un aspecto delgado normal. Por el contrario, los ratones tratados con bleomicina e IgG control tendrán lesiones variables con localizaciones multifocales en los ácinos proximales con respecto a una distribución difusa que ocasionalmente implica a la pleura. se espera que los pulmones de los ratones tratados con bleomicina y anticuerpos anti-integrina alfa 1 parezcan más similares a los del grupo B (anteriormente). Se espera que los animales del grupo D presenten sólo un número limitado de lesiones fibróticas, con un leve engrosamiento de los tabiques multifocal y pequeños agregados de células monocucleares.

Aunque la invención anterior se ha descrito en cierto detalle a modo de ilustración y ejemplo con fines de claridad de comprensión, será evidente para los expertos en la técnica que podrán practicarse ciertos cambios y modificaciones. Por tanto, la descripción y los ejemplos no deben interpretarse como limitantes del alcance de la invención, que se define en las reivindicaciones adjuntas.

Claims (13)

1. Uso de una composición que comprende un homólogo de anticuerpo que es un antagonista de una interacción entre una integrina que lleva la subunidad alfa 4 y un ligando para una integrina que lleva la subunidad alfa 4, para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de la fibrosis en un sujeto.

2. Uso según la reivindicación 1, en el que la fibrosis es fibrosis de un órgano interno.

3. Uso según la reivindicación 2, en el que el órgano interno es el hígado, pulmón, riñón, vasos sanguíneos cardiacos o tracto gastrointestinal.

4. Uso según la reivindicación 1, en el que el sujeto padece fibrosis pulmonar, mielofibrosis, cirrosis hepática, glomerulonefritis mesangial proliferativa, glomerulonefritis semilunar, nefropatía diabética, fibrosis renal intersticial o nefropatía asociada al VIH.

5. Uso según la reivindicación 1, en el que la fibrosis es fibrosis dérmica.

6. Uso según la reivindicación 5, en el que el sujeto padece esclerodermia, morfea, queloides, cicatrices hipertróficas, colagenoma cutáneo familiar o nevos del tejido conjuntivo del tipo de colágeno.

7. Uso según la reivindicación 1, en el que fibrosis es fibrosis ocular.

8. Uso según la reivindicación 7, en el que el sujeto padece retinopatía diabética, cicatrización patológica posquirúrgica o vitreorretinopatía proliferativa.

9. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes 1 a 8, en el que la composición comprende un homólogo del anticuerpo anti-alfa 4.

10. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el homólogo del anticuerpo es un homólogo de anticuerpo humanizado, humano o híbrido.

11. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes 1 a 10, en el que la composición farmacéutica está configurada para administrarse:

(a) a una dosis de desde 0,1 mg/kg al día hasta 10 mg/kg al día;

(b) durante un periodo de dosificación de desde uno hasta catorce días; y

(c) en una cantidad suficiente para mantener un nivel plasmático del homólogo de anticuerpo de 1 mg/ml o superior.

12. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes 1 a 11, en el que el homólogo de anticuerpo es un anticuerpo 21-6 de ratón humanizado.

13. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes 1 a 12, en el que el sujeto es un ser humano.