RS50086B

RS50086B - Upotreba antagonista subjedinica alfa-4 integrina za pripremanje farmaceutskog preparata za tretiranje fibroze

Info

Publication number: RS50086B
Application number: YUP-749/01A
Authority: RS
Inventors: Philip Gotwals; Roy R. Lobb
Original assignee: Biogen Idec Ma Inc.,
Priority date: 1999-04-22
Filing date: 2000-04-21
Publication date: 2009-01-22
Also published as: EE200100549A; JP2002542300A; CY1106046T1; YU74901A; EA006681B1; IL206830A; CN1679935A; IL145898A; CN1332714C; BG66149B1; JP5483515B2; GEP20063844B; DE60020955D1; CA2370814C; KR100746522B1; NZ541431A; TR200200027T2; US6652856B2; BG106118A; NZ515053A

Abstract

Upotreba preparata koji sadrži homolog antitela koji je antagonist interakciji između integrina koji nosi alfa 4 podjedinicu i liganda za integrin koji nosi alfa 4 podjedinicu za pripremu farmaceutskog preparata za lečenje fibroze kod pacijenta.Prijava sadrži još 12 zavisnih patentnih zahteva.

Description

POZADINA PRONALASKA

Fibronektin i kolagen su proteini koji su neophodni za održavanje integriteta izvanćelijskog matriksa nađenog u vezivnim tkivima. Produkcija ovih proteina je visoko regulisan proces i njeno narušavanje može dovesti do razvića tkivnog fibrozisa. Dok je formiranje vlaknastog tkiva deo normalnog korisnog procesa zarastanja nakon povrede, u nekim okolnostima javlja se nenormalna akumulacija fibroznog materijala tako da to može u krajnjem slučaju dovesti do otkazivanja organa (Border i sar. (1994;New Engl. J. Med.331:1286-1292). Povreda bilo kog organa dovodi do stereotipnog fiziološkog odgovora: homeostazis indukovan krvnim pločicama, praćen prilivom inflamatornih ćelija i aktiviranim fibroblastima. Citokineza proistekla iz tih tipova ćelija vodi formiranje novog izvanćelijskog matriksa i krvnih sudova (granulaciono tkivo). Nastanak granulacionog tkiva je pažljivo orkestriran program u kojem je ekspresija inhibitora proteaze i proteina izvanćelijskom matriksa regulisana, a ekspresija proteaza je redukovana, vodeći akumulaciji izvanćelijskog matiksa.

Centralna stvar u razviću fibrotičnih stanja, bilo indukovanih iii spontanih, je stimulacija aktivnosti fibroblasta. Ulivanje inflamatornih ćelija i aktiviranih fibroblasta u povređene organe zavisi od sposobnosti ovih tipova ćelija da reaguju sa intersticijalnim matriksom primarno sastavljenim od fibrinonektina i kolagena. Ove interakcije ćelija-ćelija ili ćelija-izvanćelijski matriks posredovane su putem nekoliko porodica molekula ćelijske adhezije, od kojih jedna takva porodica uključuje integrine. Integrini su strukturno i funkcionalno srodni glikoproteini koji se sastoje od različitih alfa (alfal, alfa2, trenutno sve do alfa 11) i beta (beta 1 i beta 7) heterodimernih transmembranskih receptorskih domena nađenih u različitim kombinacijama u gotovo svim tipovima sisarske ćelije (za pregled vidi: E. C. Butcher, Cell, 67, 1033 (1991); D. Cox i sar., "Farmakologija integrina." Medicinal Research Rev. vol. 195 (1994) i V.W. Engleman

i sar., "Athezija ćelijskih integrina kao farmaceutskih ciljeva" u Ann. Revs. Medicinal Chemistn/, vol. 31, J.A. Bristol, Ed.; Acad. Press, NY, 1996, p. 191). Dve alfa4 subjedinice koje sadrže integrine opisane su i označene alfa4beta1 (VLA-4) i alfa4beta7.

Intersticijalni plućni fibrozis (IPF) je konačni put mnogih intersticijalnih plućnih bolesti koje vode redukciji plućne podobnosti i oštećenju vitalne funkcije razmene gasa. Bez obzira na etiologiju, IPF je okarakterisan inflamatornim i fibroproliferativnim promenama pluća i dodatnoj akumulaciji kolagena u interstcijumu. Pacijenti sa IPF generalno pokazuju prisustvo regrutovanih imunih i inflamatornih ćelija tokom aktivnog plućnog fibrozisa ukazujući da je plućni fibrozis rezultat aberantnog obnavljanja nakon početne plućne povrede. Regrutovane infiamatorne ćelije su u mnogim slučajevima verovatno uključene u primarnu povredu. Sem toga, ove ćelije mogu imati složenu ulogu u regulaciji procesa popravke. U bilo kom slučaju, regrutovanje imunih i inflamatornih ćelija pluća može imati, važnu ulogu u određivanju fibrotičkog odgovora. Ulivanje Inflamatornih ćelija i aktiviranih fibroblasta u povređena pluća zavisi od sposobnosti ovih ćelija da međusobno reaguju sa komponentama EGM. Promet i stanje aktivacije leukocita su posredovani sa različitim integrinima. Prevencija ulivanja inflamatornih ćelija u pluća može biti kritična za sleđeći fibrotični odgovor.

Mnoge od bolesti koje su u povezane sa proliferacijom fibroznog tkiva su i hronične i često oslabljujuće, uključujući, na primer, kožne bolesti kao što je skleroderma. Neke, uključujući plućni fibrozis, mogu biti fatalne zahvaljujući delom činjenici da trenutno dostupni tretmani za ovu bolest imaju značajne sporedne efekte i generalno nisu efikasni u usporavanju ili zaustavljanju napredovanja fibrozisa [Nagfer i sar., 1966,Am. J. Respir. Crit. Care. Med,154:1082-86]. Prema tome, postoji stalna potreba za novim anti-fibrotičnim agensima.

SAŽETAK PRONALASKA

Predmetni pronalazak obezbeđuje metode za tretiranje fibrozisa kod subjekta. Mi smo ispitali moguću ulogu antagonista integrina koji sadrže alfal i alfa 4 subjedinice u patogenezi fibrozisa putem davanja antagonista integrina koji sadrže alfal ili alfa 4 subjedinice miševima sa plućnim fibrozisom. Korisni efekti koje ti antagonisti imaju i na ukupnu akumulaciju kolagena i obim plućnih fibrotičnih lezija sugerišu da integrini koji sadrže alfal i/iii alfa 4 subjedinicu mogu biti razuman cilj za antifibroznu terapiju, kao što je to prikazano u predmetnom saopštenju. Jedan aspekt pronalaska je metod koji sadrži davanje efektivne količine jedinjenja koje sadrži antagonist interakcije između integrina koji sadrži alfa 4 subjedinicu i veznika za integrin koji sadrži alfa 4 subjedinicu subjektu koji ima fibrotičko stanje. Antagonist je agens koji vezuje integrin alfa 4 ili agens koji vezuje integrin alfa 4 veznik. Poželjni agensi vezivanja alfa 4 integrina odabrani su iz grupe koja se sastoji od; a) homologa koji antagonizuje interakciju i VLA-4 i alfa4 beta 7 sa njihovim respektivnim alfa4 veznicima; b) homologa antitela koje antagonizira interakciju VLA-4 sa alfa4 veznikom; i c) homologa antitela koji antagonizuje interakciju alfa4beta7 sa alfa4 veznikom. U drugim oblicima homolog antitela odabran je iz grupe koja se sastoji od humanog antitela, himeričnog antitela, humanizovanog antitela i njihovih fragmenata.

Drugi aspekt predmetnog pronalaska je metod za smanjivanje povećanja leukocita u uzorku ispirane bronhoalveolarne tečnosti, indukovanog fibrotičnim stanjem, koji sadrži korake davanja subjektu koji ima fibrotično stanje, efektivne količine antagonista interakcije između integrina koji sadrži alfa 4 subjedinicu i veznika za integrin koji sadrži alfa 4 subjedinicu. U određenim oblicima pronalaska, agens vezivanja integrina aifa 4 je kodiran sekvencom nukleinske kiseline koja sadrži nukleinsku kiselinu koja hibridizuje pod nekoliko uslova strogoće do definisanih sekvenci nukleinske kiseline odabranih iz grupe sekvenci iz tabele 6 U.S. patenta 5,840,299 ili komplementa pomenute sekvence nukleinske kiseline. U drugim aspektima metoda, agens vezivanja integrina alfa 4 kodiran je sekvencom nukleinske kiseline koja sadrži nukleinsku kiselinu koja hibridizuje pod različitim uslovima strogoće sa sekvencom nukleinske kiseline koja kodira sekvencu polipeptida odabranog iz grupe koja se sastoji od odrećenih definisanih poiipeptida nađenih u U. S. patentu 5,932,214 ili produkovanih od strane ćelijske linije ATCC CRL 11175.

Sva literatura koja je navedena u odeljcima koji slede, kao i citirana literatura i zaštićeni patenti uključeni u prijavu koja sledi, ovde su inkorporirani referencom.

DETALJNI OPIS PRONALASKA

I. Definicije

Sa ciljem da se jasnije i konciznije ukaže na predmet zaštićenog pronalaska, obezbeđene su sledeće definicije za specifične termine koji su upotrebljeni u pisanom opisu i podnetim zahtevima koji slede.

Pronalazak će sada biti opisan sa pozivom na sledeći detaljan opis čije su sledeće definicije uključene: Superfarnilija vrlo kasnog antigena (VLA) je sačinjena od strukturno i funkcionalno srodnih glikoproteina koji se sastoje od (alfa i beta) heterodimernih molekula transmembranskih receptora nađenih u različitim kombinacijama u gotovo svakom tipu ćelija sisara (radi pregleda vidi: E.C. Butcher, Cell, 67, 1033 (1991); D. Cox i sar., "Farmakologija integrina." Medicinal Research Rev. (1994) i V.W. Engleman i sar., "Integrin) ćelijske athezije kao farmaceutski ciljevi" u Ann. Report in Medicinal Chemistrv. Vol. 31, J.A. Bristol, izd.; Acad Press, NY, 1996, p. 191). Integrini VLA porodice uključuju (danas) VLA-1, -2, -3, -4, -5, -6, -9 i -11 u kojima svaki molekul sadrži pi lanac ne-kovalentno vezan za alfa lanac (cd, a2, a3, a4, a5, a6 i tome slično), respektivno.

Alfa 4 beta 1 (014(31) integrin je receptor površine ćelije za VCAM-1, fibronektin i verovatno druge veznike (ovi poslednji veznici su kolektivno označeni kao "alfa4 veznici"). TerminCC4J31 integrin ("VLA-4" ili "a4b1" ili "aifa4beta1 integrin", korišćen naizmenično) prema tome ovđe označava polipeptide koji su sposobni da se vežu za VCAM-1 i članove izvančeliskih matriks proteina, posebno fibronektin, ili homologe ili njihove fragmente, i ako će biti prihvaćeno od strane istraživača koji imaju uobičajeno iskustvo u praksi da mogu postojati drugi Ugandi za VLA-4 i da se mogu analizirati koristeći konvencionalne metode. Ipak, poznato je da će se alfa4 subjedinica vezati sa drugim beta subjedinicama sem betal tako da možemo definisati termin "alfa (a) 4 integrin" ili "integrin koji sadrži alfa(a) 4 subjedinicu" kao što su oni integrini čija je alfa4 subjedinica vezana sa jednom ili drugom od beta subjedinica. Drugi primer "a!fa4" integrina sem VLA4 je alfa4beta7 (vidi Lobb i Adams, supra). Slično, "alfal integrin" ili "integrin koji sadrži alfal subjedinicu" su oni integrini čija se alfal subjedinica vezuje sa jednom ili drugom od beta subjedinica.

"Antagonist" integrina ukfjučuje bilo koje jedinjenje koje inhibira integrine koji sadrže alfal i/ili alfa4 subjedinicu u odnosu na vezivanje sa veznikom integrina i/ili receptorom. Korisni su anti-integrin antitelo ili homoiog antitela koji sadrži proteine (diskutovani niže) kao i drugi molekuli kao što su rastvorljivi oblici veznih proteina za integrine. Rastvorljivi oblici veznih proteina za integrine koji sadrže aifa4 subjedinicu uključuju rastvorljive VCAM-1, VCAM-1 fuzione proteine ili bifunkcionalne VCAM-1 /lg fuzione proteine. Na primer, rastvorljivi oblik veznika integrina ili njegovog fragmenta može biti dat da se veže za integrin i poželjno bude u konkurenciji sa mestom za vezivanje integrina na ćelijama, vodeći tako efektima sličnim davanju antagonista kao što su anti-integrin (npr., VLA-1, VLA-4) antitela. Posebno, u delokrug pronalaska uključeni su rastvorljivi mutanti integrina koji vezuju veznik ali ne izazivaju davanje signala zavisno od integrina,. Takvi mutanti integrina mogu delovati kao konkurentni inhibitori proteina integrina divljeg tipa i smatraju se "antagonistima". Drugi antagonisti koji se upotrebljavaju u metodima pronalaska su "mali molekuli", kao što je to opisano dole.

U pronalazak su takođe uključeni metodi korišćenja molekula koji antagonizuju delovanje više od jednog integrina koji sadrži alfa 4 subjedinicu, kao što su mali molekuli ili homologi antitela koja antagonizuju i VLA-4 i alfa4beta7 ili druge kombinacije integrina koji sadrže alfa 4 subjedinicu. Takođe su uključeni metodi korišćenja molekula koji antagonizuju delovanje više od jednog integrina koji sadrži alfa 1 subjedinicu. U delokrug pronalaska takođe su ukfjučeni metodi korišćenja kombinacije molekula tako da kombinacija antagonizuje delovanje više od jednog integrina, kao što je metod korišćenja nekoliko malih molekula ili homologa antitela koji u kombinaciji antagonizuju i VLA-4 i alfa4 beta7 ili druge kombinacije integrina koji sadrže alfa4subjedinicu.

Kao što je dlskutovano ovde, određeni antagonisti integrina mogu biti fuzionisani iii konjugovani na drugi način sa, na primer, homologom antitela kao što je imunogiobulin ili njegov fragment i nisu ograničeni na određeni tip ili strukturu integrina ili liganda ili drugog molekula. Prema tome, za ciljeve pronalaska, bilo koji agens koji je sposoban da formira himerični protein (kao što je definisano niže) i koji je sposoban za vezivanje za veznike integrina i koji efektivno blokira ili oblaže integrin koji sadrži alfa4 i/ili alfal subjedinicu smatra se da je ekvivalent antagonista upotrebljenog ovde u primerima.

"Homoiog antitela" uključuje intaktna antitela koja se sastoje od lakih i teških lanaca imunoglobulina vezanih preko disulfidnih veza. Termin "homoiog antitela" ima takođe narneru da obuhvati jedan ili viša polipeptida odabranih iz lakih lanaca imunoglobulina, teških lanaca imunoglobulina i njihovih fragmenata za koje se vezuje antigeni koji su sposobni da se vezuju za jedan ili više antigena (tj., integrin ili veznik integrina). Komponenta polipeptida homologa antitela komponovanog od više od jednog polipeptida može po potrebi biti disulfidna veza ili drugačije unakrsno kvalentno vezivanje. Prema tome, "homologa antitela" uključuju intaktne imunoglobuline tipa IgA, IgG, IgE, IgD, IgM (kao i njihove pod tipove), gde laki lanci imunoglobulina mogu biti tipa kapa ili lambda. "Homologa antitela" takođe uključuju delove intaktnog antitela koji zadržavaju specifičnost vezivanja antigena, na primer Fab fragmenti, Fab' fragmenti, F(ab')2 fragmenti, F(v) fragmenti, teški i laki lanci monomeri ili dlmeri ili njihove mešavine.

"Humanizovani homoiog antitela" je homoiog antitela, produkovan tehnologijom rekombinantne DNK, u kojoj su neke ili sve amino kiseline lakog ili teškog lanca humanog imunoglobulina koje nisu potrebne za vezivanje antigena supstituisane sa odgovarajućim amino kiselinama iz nehumanog sisarskog imunoglobulina lakog ili teškog lanca. "Humani homoiog antitela" je homoiog antitela u kojem sve amino kiseline imunoglobulina lakog ili teškog lanca izvedene iz humanog izvora (bez obzira da li jesu ili nisu potrebne za vezivanje antitela).

Onako kako se koristi ovde "homoiog humanog antitela" je homoiog antitela produkovan tehnologijom rekombinantne DNK, u kojoj su sve amino kiseline lakog ili teškog lanca imunoglobulina izvedene iz humanog izvora.

"Agonist" integrina uključuje jedinjenje koje aktivira ligand integrina.

"Amino kiselina" je monomerna jedinica peptida, polipeptida ili proteina. Postoji dvadeset amino kiselina nađenih u peptidima koji se prirodno javljaju, polipeptidima i proteinima koji su svi L-izomeri, Termin takođe uključuje analoge amino kiselina i D-izomere amino kiselina proteina i njihovih analoga.

"Kovalentno vezan" - znači da naznačene grupe pronalaska (npr., PEG-ilirani alfa 4 i/i!i alfa 1 antagonist integrina, fragment imunoglobulina/alfa 4 ili antagonist 1 integrina) su bile direktna kovalentno vezane jedna za drugu ili su drugačije indirektno kovalentno vezane jedna za drugu preko umešane grupe ili grupa, kao što je spejser grupa ili grupe. Umešana grupa ili grupe nazvane su "spregnuta grupa". Termin "konjugovani" upotrebljava se za razmenu sa "kovalentno udružen". U tom smislu "spejser" se odnosi na grupu koja može biti ubačena između amino kiseline i drugih komponenti antagonista integrina ili fragmenta i ostatka molekula. Spejser može obezbediti razdvajanje između amino kiseline ili druge komponente i ostatka molekula tako da spreči menjanje zbog mešanja sa funkcijom proteina i/ili olakšavanje amino kiselini ili drugoj komponenti da se vezije sa drugom grupom.

"Sekvenca kontrole ekspresije" - sekvenca polinukleotida koja kontroliše i reguliše ekspresiju gena kada je operativno vezana za te gene.

"Ekspresioni vektor" - polinukleotid, kao što je plazmid DNK ili fag (među drugim čestim primerima) koji omogućuje ekspresiju najmanje jednog gena kada je ekspresioni vektor uveden u ćeliju domaćina. Vektor može, ili ne, biti sposoban da se replikuje u ćeliji.

"Efektivna količina" agensa pronalaska je količina koja produkuje rezultate ili ispoljava uticaj na određeno stanje koje se tretira.

"Funkcionalni ekvivalent" ostatka amino kiseline je (i) amino kiselina koja ima slične reaktivne karakteristike kao ostatak amino kiseline koji je zamenjen sa funkcionalnim ekvivalentom; (ii) amino kiselina antagonista pronalaska, amino kiselina koja ima slične karakteristike kao ostatak amino kiseline koji je zamenjen funkcionalnim ekvivalentom; (iii) molekul koji nije amino kiselina koji ima slične karakteristike kao ostatak amino kiseline koji je zamenjen funkcionalnim ekvivalentom.

Prvi polinukleotid koji kodira proteinizovani antagonist pronalaska je "funkcionalni ekvivalent" upoređen sa drugim polinukleotidom koji koji kodira protein antagonist ako zadovoljava najmanje jedan od sledećih uslova: (a) : "funkcionalni ekvivalent" je prvi polinukleotid koji hibridizuje sa drugim polinukleotidom pod standardnim uslovima hibridizacije i/Ili je degenerativan u odnosu na polinukleotidne sekvence. Najpoželjnije, on kodira mutantni protein koji ima aktivnost proteina antagonista integrina; (b) "funkcionalni ekvivalent" je prvi polinukleotid koji kodira ekspresiju za sekvencu amino kiseline kodirane drugim polinukleotidom.

Antagonisti integrina upotrebljeni u pronalasku uključuju, i ako nisu ograničeni na, agense nabrojane ovde kao i druge funkcionalne ekvivalente. Onako kako se koristi ove termin "funkcionalni ekvivalent" prema tome odnosi se na antagonist Integrina ili polinukleotid koji kodira antagonist integrina koji ima isti ili poboljšani koristan efekt na primaoca kao i antagonist integrina iz kojeg je izveden funkcionalni ekvivalent. Kao što će to biti prihvaćeno od strane onog sa prosečnim iskustvom u praksi, funkcionalni ekvivalent protein može biti produkovan rekombinantnim tehnikama, npr., eksprimiranjem "funkcionalno ekvivalentne DNK". Shodno tome, sadašnji pronalazak obuhvata integrin proteine kodirane sa DNK koje se prirodno javljaju, kao i sa DNK koje se ne javljaju u prirodi koje kodiraju isti protein kao što kodiraju DNK koje se prirodno javljaju. Zbog degeneracije kodirajućih nukleotidnih sekvenci da se kodira protein integrin mogu se upotrebiti drugi polinukleotidi. Ove uključuju cele, ili delove gornjih sekvenci koje su izmenjene supstitucijom različitih kodona koji kodiraju ostatke amino kiseline unutar sekvence, prudukujući tako tihu promenu. Takve izmenjene sekvence označene su kao ekvivalenti ovih sekvenci. Na primer, Phe (F) je kodiran sa dva kodona, TTC ili TTT, Tyr (Y) kodiran je sa TAC ili TAT i His (H) je kodiran sa CAC ili CAT. S druge strane, Trp (W) je kodiran jednim kodonom, TGG. Shodno tome, biće prihvaćeno da će za datu sekvencu DNK koja kodira određeni integrin biti mnogo degenerativnih sekvenci DNK koje ga kodiraju. Smatra se da su te degenerativne sekvence DNK u okviru delokruga pronalaska.

Termin "himeričan" kada se odnosi na antagonist pronalaska znači da je antagonist sastavljen od veze (unakrsne hemijske veze ili kovalentne ili drugog tipa) dva ili više proteina koji imaju različite strukture i/ili imaju različite izvore porekla. Tako, hfmerni antagonist alfa 4 integrina može uključivati grupu koja je antagonist alfa 4 integrina ili fragment i drugu grupu koja nije antagonist alfa 4 integrina. Himerični antagonist alfa 1 integrina može uključiti jednu grupu koja je antagonist alfa 1 integrina ili fragment i druga grupu koja nije antagonist alfa 1 integrina.

Vrsta "himeričnog" proteina je "fuzioni" Ili "fuzioni protein" koji se odnosi na ko-linearnu, kovalentnu vezu dva ili više proteina iii njihovih fragmenata preko individualnih peptidnih veza, najpoželjnije preko genetičke ekspresije polinukleotidnog molekula koji kodira ove proteine. Tako, poželjni fuzioni proteini su himerični proteini koji uključuju alfa4 (ili alfal) antagonist integrina ili fragment kovalentno vezan za drugu grupu koja nije alfa 4 (ili alfa 1) antagonist integrina. Poželjni fuzioni proteini pronalaska mogu uključivati delove intaktnog antitela koje zadržava specifičnost vezivanja za antigen, na primer, Fab fragmenti, Fab' fragmenti, F(ab')2 fragmenti, F(v) fragmenti, monomeri ili dimeri teškog lanca, monomeri ili dlmeri lakog lanca, dlmeri koji se sastoje od jednog teškog i jednog lakog lanca i tome slično.

Najpoželjniji fuzioni proteini su himerični i sadrže grupu antagonista integrina fuzionisanu ili vezanu na drugi način sa svim delovima zgloba i konstantni region lakog lanca imunoglobulina, teški lanac ili oba. Prema tome, ovaj pronalazak karakteriše molekul koji ukljčuje: (1) grupu antagonista integrina, (2) drugi peptid, npr., onaj koji povećava rastvorljivost ili životni vekin vivogrupe antagonista integrina, npr., član super familije imunoglobulina ili fragment ili njegov deo, npr., deo ili fragment IgG, npr., deo teškog lanaca humanog lgG1, npr., CH2, CH3 i zglobne regione. Specifično, "antagonist integrina/fuzioni Ig" je protein koji sadrži biološki aktivan molekul pronalska antagonista integrina (npr., rastvorljivi VLA-4 ili VLA-1 veznik, ili njegov biološki aktivan fragment vezan za N-terminus lanca imunoglobulina gde je deo N-terminusa imunoglobulina zamenjen sa antagonistom integrina. Vrsta antagonista integrina/fuzioni Ig je "integrin/fuzioni Fc" koji je protein koji sadrži antagonist integrina pronalaska vezan za najmanje deo konstantnog domena imunoglobulina. Poželjniji fuzioni Fc sadrži antagonist integrina pronalaska vezan za fragment antitela koje sadrži C terminalni domen teškog lanca Imunoglobulina.

Termin "fuzioni protein" takođe znači antagonist integrina hemijski vezan preko mono- ili hetero- funkcionalnog molekula za drugu grupu koja nije antagonist integrina (što rezultira "himeričnim" molekulom) i napravljen jeddnovoiz prečišćenog proteina kao što je opisano dole. Tako, jedan primer himeričnog molekula hemijski vezanog, nasuprot rekombinantno vezanom, koji je fuzioni protein, može sadržati: (1) ciljnu grupu alfa 4 subjedinice integrina, npr., VCAM-1 grupu sposobnu da se vezuje za VLA-4 na površini ćelija koje nose VLA-4; (2) drugi moiekul koji povećava rastvorljivost ili dužinu životain vivociljne grupe, npr., polimer polialkilen glikola kao što je polietilen glikol (PEG). Ciljna grupa alfa 4 može biti bilo koji alfa 4 ligand koji se prirodno javlja ili njegov fragment, npr., VCAM-1 peptid ili slično supstituisana sekvenca amino kiseline.

"Heterologi promotor" - onako kako se koristi ovde je promotor koji nije prirodno vezan sa genom ili prečišćenom nukleinskom kiselinom.

"Homologija" - onako kako se koristi ovde je sinonim sa terminom "identičnost" t odnosi se na sličnost sekvenci između dva polipeptida, molekula, ili između dve nukleinske kiseline. Kada je pozicija u obe upoređene skvence zauzeta sa istom bazom ili monomernom subjedinicom amino kiseline (na primer, ako je pozicija u oba molekula DNK zauzeta sa adeninom, ili je pozicija na svakom od dva polipeptida zauzeta sa lizinom), onda su odgovarajući molekuli homologi na toj poziciji. Procenat homologije između dve sekvence je funkcija broja poklapanja ili homologih pozicija koje dele dve sekvence podeljene sa brojem upoređenih pozicija x 100. Na primer, ako su 6 od 10 pozicija u dve sekvence preklopljene ili su homologe, onda su dve sekvence hornologe 60%. Putem primera, sekvence DNK CTGACT i CAGGTT dele 50% homologije (3 od 6 ukupnih pozicija se preklapaju). Generalno, poređenje je

napravljeno kada su dve sekvence poredane da daju maksimum homologije. Takvo redanje može biti obezbeđeno koristeći, na primer, metod Karlin-a i Altschul-a koji je dole detaljnije opisan.

Homologe sekvence dele identične iii slične ostatke amino kiselina gde su slični ostatci konzervativne substitucije za, ili "dozvoljene tačkaste mutacije", odgovarajućih ostataka amino kiselina u poredanoj referentnoj sekvenci. U tom smislu, "konzervativna supstitucija" ostatka u referentnoj sekvenci su one supstitucije koje su fizički ili funkcionalno slične odgovarajućim referentnim ostatcima, npr., onim koji imaju sličnu veličinu, oblik, naelektrisanje, hemijske karakteristike, uključujući sposobnost da formiraju kovalentne ili vodonične veze ili tome slično. Posebo poželjne konzervativne supstitucije su one koje ispunjavaju definisane kriterijume za "prihvatljive tačkaste mutacije" kod Davhoff i sar., 5; Atlas sekvenci i strukture proteina, 5: supl. 3, poglavlje 22: 354-352, Nat. Biomed. Res.Foundation, VVashington, D.C. (1978).

"Homologija" i "identitet" ovde su zamenjivi i svaki se odnosi na sličnost sekvence između dve polipeptidne sekvence. Homologija i identitet mogu biti određeni poređenjem pozicije na svakoj sekvenci koja može biti poredana sa ciljem poređenja. Kada je pozicija u sekvenci koja se pored! okupirana sa istim ostatkom amino kiseline, tada se peptidi mogu označiti identičnim na toj poziciji; kada je ekvivalentno mesto okupirano istom amino kiselinom (npr., identično) ili sličnom amino kiselinom (npr., sličnoj u sterićnoj ili prirodi naelektrisanja), tada se molekuli mogu označiti kao homologi na toj poziciji. Procenat homologije ili identiteta između sekvenci je funkcija broja poklapanja homologih pozicija koje dele sekvence. "Nesrodna" ili "ne-homologa" sekvenca deli manje od 40 procenta identičnosti, i ako je poželjno manje od 25 procenta identičnosti sa sekvencom predmetnog pronalaska.

"Procenat homologije" sekvenci dve amino kiseline ili sekvenci dve nukleinske kiseline određen je koristeći logaritam poravnavanja Karlin-a i Altschul-a (Proc. Nat. Acad. Sci., USA 87: 2264 (1990) onako kako je modifikovan od strane Karlin-a i Altschul-a (Proc. Nat. Acad. Sci., USA 90: 5873 (1993). Takav, algoritam je inkorporiran u NBLAST ili XBLAST programe Altschul-a i sar., J. Mol. Biol. 215:403 (1990). BLAST pretraživanja su izvedena sa NBLAST programom, rezultat = 100, dužina reći = 12, da se dobiju nukleotidne sekvence homologe nukleinskoj kiselini pronalaska. BLAST pretraživanja su izvedena sa XBLAST programom, rezultat = 50, dužina reči = 3, da se dobiju sekvence amino kiseline homologe referentnom poiipeptidu. Da se dobiju svrstavanja prekida radi poređenja, upotrebljen je BLAST prekida kao što su opisali Altschul i sar., Nucleic Acid res., 25: 3389 (1997). Kada su upotrebljavani BLAST i Gapped BLAST, korišćeni su standardni parametri dotičnih programa (XBLAST i NBLAST). Vidi http://www/ncbi.nlm.nih.gov.

"Izolovani" (korišćeno naizmenično sa "potpuno čist") kada se primeni na nukleinsku kiselinu, tj., polinukieotidne sekvence koje kodiraju antagoniste integrina znači RNK ili DNK polinukleotid, deo genomskog polinukleotida, cDNK ili simetrični polinukleotid koji, na osnovu svog porekla ili manipulisanja: (i) nije vezan sa svim polinukleotidima sa kojima je vezan u prirodi (npr., prisutan je u ćeliji domaćinu kao ekspresioni vektor, ili njgov deo); ili (ii) je vezan za nukleinsku kiselinu ili drugu hemijsku grupu različitu od one za koju je vezan u prirodi; ili (iii) se ne javlja u prirodi. Pod "izolovani" dalje se podrazumeva sekvenca polinukleotida koja je: (i) amplifikovanain vitioputem, na primer, lančane polimerazne reakcije (PCR); (ii) sintetizovana hemijski; (iii) produkovana rekombinantnim kloniranjem; ili (iv) prečišćena, kao putem isecanja i razdvajanja na gelu. Tako je "potpuno čista nukleinska kiselina" nukleinska kiselina koja nije neposredno susedna sa jednom ili obe kodirajuće sekvence sa kojima je normalno susedna u genomima koji se prirodno javljaju u organizmima iz kojih je dobijena nukleinska kiselina.

Potpuno čista DNK takođe uključuje rekombinantnu DNK koja je deo hibridnog gena koji kodira dodatne sekvence integrina.

"Izolovani" (korišćen naizmenično sa "potpuno čist") - kada se primeni na polipeptide znači polipeptid ili njegov deo koji, samim svojim poreklom ili manipulisanjem: (i) je prisutan u ćeliji domaćinu kao ekspresioni produkt dela ekspresionog vektora; ili (ii) je vezan za protein ili drugu hemijsku grupu različitu od one za koju je vezan u prirodi; ili (iii) se ne javlja u prirodi, na primer, protein koji je hemijski manipulisan priključivanjem ili dodavanjem proteinu najmanje jedne hidrofobne grupe tako da je protein u obliku koji se nalazi u prirodi. Pod "izolovan" dalje se podrazumevao protein koji je: (i) hemijski sintetizovan; ili (ii) eksprimiran u ćeliji domaćinu i prečišćen iz vezanih i kontaminirajućih proteina. Termin generalno znači polipeptid koji je bio razdvojen od drugih proteina i nukleinskih kiselina sa kojima se javlja u prirodi. Poželjno, polipeptid je takođe odvojen od supstanci kao što su antitela iii gel matrice (poliakrilamid) koje se koriste da se on prečisti.

"Multivalentni kompleks proteina" - odnosi se na mnoštvo antagonista integrina (tj., jedan ili više). Homoiog ili fragment anti-integrin antitela može biti unakrsno ukršten ili vezan sa drugim homologom ili fragmentom antitela. Svaki protein može biti isti ili različit i svaki homoiog ili fragment antitela može biti isti ili različit.

"Mutant" - bilo koja pramena u genetičkom materijalu organizma, posebno bilo koja pramena (tj., deiecija, suspstrtucija, adicija ili izmena) u polinukleotidnoj sekvenci divljeg tipa ili bilo koja promena u proteinu divljeg tipa. Termin "mutein" koristi se naizmenično sa terminom "mutant".

"Operativno vezan" - polinukleotidna sekvenca (DNK, RNK) je operativno vezana za sekvencu kontrole ekspresije kada sekvenca kontrole ekspresije kontroliše i reguliše transkripciju i translaciju te polinukleotidne sekvence. Termin "operativno vezan" uključuje posedovanje odgovarajućeg startnog signala (npr., ATG) ispred polinukleotidne sekvence koja treba da se eksprimira i održavanje korektnog okvira čitanja da se omogući ekspresija sekvence polinukleotida pod kontrolom sekvence kontrole ekspresije, i produkciju željenog polipeptida kodiranog sekvencom polinukleotida.

"Farmakološki agens", definisan je kao jedno ili više jedinjenja ili molekula ili drugih hemijskih entiteta datih subjektu (u dodatku na antagoniste pronalaska) koji utiću na delovanje antagonista. Termin "farmakološki agens" onako kako se koristi ovde odnosi se na takav agens koji se daje tokom "kombinovane terapije" gde je antagonist pronalaska dat bilo pre ili nakon ili istovremeno sa davanjem jednog ili više farmakoloških agenasa.

"Protein" - bilo koji polimer koji se sastoji u osnovi od bilo koje od 20 amino kiselina. I ako je "polipeptid" obično korišćen za relativno velike polipeptide i "peptid" se često koristi za male polipeptide, upotreba ovih termina u praksi se poklapa i raznovrsna je. Termin "protein" onako kako se koristi ovde odnosi se na peptide, proteine i polipeptide, sem ako nije drugačije zabeleženo.

Termini "peptid(i)", "protein(i)" i "polipeptid(i)" se ovde koriste naizmenično. Termini "polinukleotidna sekvenca" i "nukleotidna sekvenca" se takođe ovde koriste naizmenično.

"Rekombinantni" onako kako se koristi ovde, znači da je protein izveden iz rekombinanta sisarskih ekspresionih sistema. Pošto integrin nije glikoiiziran niti sadrži disulfidne veze, on može biti eksprimiran u većini prokariotskih i eukariotskih ekspresionih sistema.

"Mali molekul" - ima definiciju kao u odeljku A2.

Fraza "površinska amino kiselina" znači bilo koja amino kiselina koja je izložena rastvaraču kada je protein savijen u svom prirodnom obliku.

"Uslovi hibridizacije" generalno podrazumevaju uslove slanoće i temperature potpuno ekvivalentne 0.5 X SSC-u do oko 5 X SSC I 55°C i za hibridizaciju i za ispiranje. Termin "standardni usovi hibridizacije" kako se koristi ovde je prema tome operativna definicija i obuhvata raspon uslova hibridizacije. Ipak, uslovi "visoke strogoće" uključuju hibridizovanje sa puferom na pločastim situ (0.2% polivinilptrolidon, 0.2% fikol 400; 0.2% goveđi serum albumin, 50 mM tris-HCI (pH 7.5); 1 M NaCI; 0.1% natrijum pirofosfat; 1 % SDS); 10% dekstrin sulfatom i 100 u. g/ml denaturisanom, sonifikovanom DNK sperme lososa na 65°C takom 12-20 časova i ispiranje sa 75 mM NaCl/7.5 mM natrijum citrata (0.5 x SSC)/1% SDS na 65°C. Uslovi "niske strogoće" uključuju hibridizovanje sa puferom na pločastom situ, 10% dekstran sulfat i 110 u. g/ml denaturisane, sonifikovane DNK sperme lososa na 55°C tokom 12-20 časova i ispiranje sa 300 mM NaCl/30 mM natrijum citrata (2.0 x SSC)/1% SDS na 55°C. Vidi takođe Tekući protokoli u molekularnoj biologiji, John Wiiey & Sons, Inc. New York, poglavlja 6.3.1 - 6.3.6,

(1989).

'Terapeutsko jedinjenje" onako kako se koristi ovde definisano je kao da sadrži antagonist pronalaska i druge biološki kompatibilne sastojke. Terapeutsko jedinjenje može sadržati eksicipijente kao što su voda, minerali i nosači kao što je protein.

"Subjekt sa fibrotičnim stanjem" odnosi se na, ali nije ograničeno na, subjekte koji pate od fibrozisa unutrašnjeg organa, subjekata koji pate od bolesti kožnog fibrozisa i subjekata koji pate od fibrotičkih stanja oka. Fibrozis unutrašnjih organa (npr., jetra, pluća, bubreg, krvni sudovi srca, gastrointestinalni trakt), javlja se u poremećajima kao što je plućni fibrozis, mielofibrozis, ciroza jetre, mezengijalni proliferativni glomerulonefritis, krescentični glomerulonefritis, dijabetična nefropatija, renalni fibrozis kod pacijenata koji primaju ciklosporin i nefropatije vezane za HIV. Kožni fibrozni poremećaji uključuju, ali nisu ograničeni na, skierodermu, morfeu, keloide, hipertrofične ožiljke, porodična kutana kolagenoma i nevija vezivnog tkiva tipa kolagena. Fibrotična stanja oka uključuju stanja kao što je dijabetična retinopatija, posthirurški ožiljci (na primer, nakon hirurgije filtriranja glaukoma i nako unakrsne hirurgije oka) i proliferativna vitreoretinopatija. Dodatna fibrotična stanja koja mogu biti tretirana sa metodima predmetnog pronalaska uključuju: reumatodni artritis, bolesti vezane sa produženim bolom u zglobovima i propalim zglobovima; progresivni sistemski skierozis, polimiozitis, dermatomiozitis, eozinofilnim fascitis, morfeu, Raynaud-ovim sindrom i nosni polipozis. Sem toga, fibrotička stanja koja mogu biti tretirana metodima predmetnog pronalaska takođe uključuju inhibiranje preterane produkcije ožiljaka kod pacijenata za koje je poznato da obrazuju keloide ili hipertrofirane ožiljke, inhibiranje ili sprečavanje stvaranja ožiljaka ili prekomernu produkciju stvaranja ožiljaka tokom zalečenja različitih tipova rana uključujući hirurške incizije, hirurške trbušne rane i traumatične povrede, sprečavanje ili inhibiranje stvaranja ožiljaka i ponovnog zatvaranja arterija nakon koronarne angioplazije, sprečavanje ili inhibiciju viška ožiljka ili formiranja fibroznog tkiva vezanog sa srčanim fibrozisom nakon preloma i hipersenzitivne vaskulopatije.

"Efektivan količina" je količina dovoljna da deluje na korisne ili željene rezultate. Efektivna količina može biti data u jednom ili više davanja. U terminima tretmana, "efektivna količina" antagonista za upotrebu u predmetnom pronalasku je količina dovoljna da olakša, poboljša, stabilizuje, ukloni, uspori ili odloži napredovanje fibrotičnog stanja u skladu sa prihvatljivim standardima za poremećaje koji treba da se tretiraju. Detekcija i merenje indikatora efikasnosti mogu biti mereni brojnim dostupnim dijagnostičkim oruđima uključujući, na primer,

fizičko ispitivanje uključujući testove krvi, testove plućne funkcije, pregled grudi X-zracima; CT skan; bronhoskopiju; bronhoalveolarno ispiranje; biopsiju pluća i CT skan.

Praktikovanje predmetnog pronalaska će upotrebiti, sem ako je naznačeno drugačije, konvencionalne tehnike biologije ćelije, kulture ćelija, molekularne biologije, mikrobiologije, rekombinantne DNK, hernije proteina, farmakologije i imunologije, koje su u okviru iskustva u praksi. Takve tehnike su opisane u literaturi, Ako nije utvrđeno drugačije, sve reference citirane u detaljnim opisima inkorporirane su ovde referencom.

II. Opis poželjnih oblika

Predmetna prijava je usmerena na otkriće da antagonisti integrina koji sadrže subjedinice alfal i/ili alfa 4 i njihovih fragmenata koji se mogu koristiti za tretman plućnog fibrozisa.

A. Antagonisti integrina

Za svrhe pronalaska antagonist integrina može biti antagonist bilo koje interakcije između integrina i njegovog srodnog veznika ili receptora tako da je normalna funkcija, indukovana sa interakcijama veznik-receptor, narušena (tj., sprečena ili usporena ili modifikovana na drugi način). Jedan poželjni oblik antagonista integrina je antagonist interakcija alfa4 integrina sa njihovim veznicima, kao što su VCAM-1A/LA-4 interakcije. To je agens, npr., polipeptid ili drugi molekul, koji može da inhibira ili blokira VCAM-1 i/iii VLA-4 posredovano vezivanje ili koji može drugačije modulisati funkciju VCAM-1 i/ili VLA-4, npr., inhibiranjem ili blokiranjem VLA-4-veznika posredovanog sa VLA-4 transdukcijom signala ili VCAM-1-veznik posredovan sa VCAM-1 transdukcijom signala i koji je efektivan u tretmanu akutne povrede mozga, poželjno na isti način kao anti-VLA-4 antitela.

Antagonist VCAM-1 A/LA-4 interakcija je agens koji ima jednu ili više od sledećih karakteristika: (1) on obavija ili se vezuje za, VLA-4 na površini ćelija koje nose VLA-4 (npr., endotelijalna ćelija) sa dovoljnom specifičnosti da inhibira VLA-4-veznikA/LA-4 interakciju, npr., VCAM-1 A/LA-4 interakciju; (2) on obavija ili se vezuje za, VLA-4 na površini ćelija koje nose VLA-4 (tj., Hmfocita) sa dovoljno specifičnosti da modifikuje i poželjno da inhibira transdukciju signala posredovanog sa VLA-4, npr., VLA-4A/CAM-1-posredovano signaliziranje; (3) on obavija ili se vezuje za, VLA-4-veznik, (npr., VCAM-1) na endotelijalnim ćelijama sa dovoljnom specifičnošću da inhibira VLA-4/VCAM-1 interakciju; (4) on obavija ili se vezuje za, VLA-4-veznik, (npr., VCAM-1) sa dovoljnom specifičnošću da modifikuje i poželjno da inhibira, transdukciju VLA-4 veznikom posredovano VLA-4 signalisanje, npr., VCAM-1 -posredovano VLA-4 signaiisanje. U poželjnim oblicima antagonist ima jednu ili obe od karakteristika 1 i 2. U drugim poželjnim oblicima antagonist ima jednu ili obe karakteristike 3 i 4. Štaviše, može biti upotrebljeno više od jednog antagonista npr., agens koji se vezuje za VLA-4 može biti kombinovan sa agensom koji se vezuje za VCAM-1.

Drugi oblik antagonista Integrina je antagonist interakcija alfa 1 integrina sa njegovim veznicima, kao što su kolagenA/LA-1 interakcije. To je agens, npr., polipeptid ili drugi molekul, koji može inhibirati ili blokirati kolagen i/ili VLA-1 posredovano vezivanje ili koji može drugačije modulisati kolagen i/iii funkciju VLA-1, npr., inhibiranjem ili blokiranjem VLA-1-veznikom posredovane VLA-1 transdukcije signala ili kolagenom posredovane transdukcije signala kolagena. Antagonist interakcije kolagenA/LA-1 je agens koji ima jednu ili više sledećih karakteristika: (1) on obavija ili se vezuje za, VLA-1 na površini ćelija koje nose VLA-1 (npr., kolagen) sa dovoljnom specifičnosti da inhibira VLA-1-veznik/VLA-1 interakciju, npr., kolagenA/LA-1 interakciju; (2) on obavija ili se vezuje za, VLA-1 na površini ćelija koje nose VLA-1 sa dovoljno specifičnosti da modifikuje i poželjno da inhibira transdukciju signala posredovanog sa VLA-1, npr., VLA-1/kolagen posredovano signaliziranje; (3) on obavija ili se vezuje za, VLA-1-veznik, (npr., kolagen) sa dovoljnom specifičnošću da inhibira VLA-1/kolagen interakciju; (4) on obavija ili se vezuje za, VLA-1-veznik, sa dovoljnom specifičnošću da modifikuje i poželjno da inhibira, transdukciju VLA-1 veznikom posredovano VLA-1 signalfsanje, npr., kolagen-posredovano VLA-1 signalisanje. U poželjnim oblicima antagonist alfa 1 ima jednu ili obe od karakteristika 1 i 2. U drugim poželjnim oblicima antagonist ima jednu ili- obe karakteristike 3 i 4. štaviše, može biti upotrebljeno više od jednog antagonista npr., agens koji se vezuje za VLA-1 može biti kombinovan saagensom koji se vezuje za kolagen.

Kao što je diskutovano ovde antagonisti koji se koriste u metodima pronalaska nisu ograničeni na određeni tip ili strukturu molekula tako da, za svrhu pronalaska i primera radi, bilo koji agens sposoban za vezivanje za alfa4 integrine (npr., VLAS-4) na površini ćelija ili za alfa4 veznik kao što je VCAM-1 na površini ćelija koje nose veznik alfa4) i koji efektivno blokira ili obmotava integrin alfa 4 (npr., VLA-4)iii alfa 4 veznik (npr., VCAM-1), nazvan "agens koji nosi alfa4 integrin" i "agens vezivanja veznika integrina" respektivno), smatra se da je ekvivalent antagonista upotrebljenog ovde u primerima.

Na primer, korisna su antitela ili homolozi antitela (diskutovani niže) kao i rastvorljivi oblici proteina koji se prirodno vezuju za VLA-4 i VCAM-1. Rastvorljivi oblici proteina koji se prirodno vezuju za VLA-4 uključuju rastvorljive VCAM-1 peptide, VCAM-1 fuzioneproteine, bifunkcionalne VCAM-1/Ig fuzione proteine (npr., "himerične" molekule diskutovane gore), fibronektin, fibrinonektin koji ima alternativno spojen vezujući segment koji nije tipa III i fibrinonektin peptide koji sadrže sekvencu amino kiseline EILDV ili sličnu konzervativno supstituisanu sekvencu amino kiseline. Rastvorljivi oblici proteina koji se prirodno vezuju za VLA-1 uključuju rastvorljive VLA-4 fuzione proteine, bifunkcionalne VLA-4/lg fuzione proteine i tome slično. Onako kako se koristi ovde, "rastvorljivi VLA-4 peptid" ili "rastvorljivi VCAM-1 peptid" je VLA-4 ili VCAM-1 polipeptid nesposoban da se usidri na membrani. Takvi nerastvorljivi polipeptiđi uključuju, na primer, VLA-4 i VCAM-1 polipeptide kojima nedostaje dovoljan deo njihovog domena koji obuhvata membranu da se usidri polipeptid ili su modifikovani tako da deo koji obuhvata membranu nije funkcionalan. Ovi agensi vezivanja mogu biti u konkurenciji sa proteinom koji se vezuje za površinu ćelije za VLA-4 iii koji na drugi način narušava funkciju VLA-4. Na primer, rastvorljivi oblik VCAM-1 (vidi npr.,. Osborn i sar., 1969, Cell, 59: 1203-1211) ili njegov fragment mogu biti dati da se vežu za VLA-4 i poželjno budu u kompeticiji sa mestom za vezivanje VLA-4 na ćelijama koje noseVCAM-1, vodeći tako efektima sličnim davanju antagonista kao Što su mali molekuli ili antf-VLA-4 antitela.

1. Homolozi anti-antiintegrin antitela

U drugim poželjnim oblicima, antagonisti koji se koriste u metodu pronalska da bi se vezali za, uključujući blok ili omotač, integrin površine-ćelije alfal i/Hl alfa4 (kao VLA-1, VLA-4 ili alfa4 beta7) i/III površinski ligand za alfal i/ili a!fa4 integrin (kao kolagen ili VCAM-1, respektivno) su anti-VLA-1 ili anti-VLA-4 i/ili anti kolagen i/ili anti-VCAM-1 monoklonalno antitelo ili homologo antitelo, kako je prethodno definisano. Poželjna antitela i homoiogi za tretman, posebno za humano tretiranje, uključuju homologe humanih antitela, homologe humanizovanih antitela, homologe himernog antitela, Fab, Fab', F(ab')2 i F(v) fragmente antitela i monomere ili dimere antitela teških ili lakih lanaca ili njihovu mešavinu. U metodu pronalska monoklonaina antitela protiv VLA-4 su poželjni činilac vezivanja.

2. Mali molekuli antagonisti integrina

Termin "mali molekul" antagonist integrina se odnosi na hemijske agense (tj. organske molekule) sposobne da prekidaju integrin/integrin interakcije liganda, na primer, blokiranje VLA-4/VCAM interakcije vezivanjem VLA4 na površinu ćelija ili vezivanjem VCAM-1 na površinu ćelija. Takvi mali molekuli mogu takođe vezati respektivno VLA-4- i VCAM-1 receptore. VLA-4 i VCAM-1 mali molekul inhibitori mogu sami biti peptidi, semi-peptidna jedinjenja ili ne-peptidna jedinjenja, kao mali organski molekuli koji su antagonisti interakcije VCAM-1 A/LA-4. "Mali molekul" kako je definisan ovde, nije predviđen da obuhvati antitelo ili homoiog antitela. Molekularna težina egzemplarnih malih molekula generalno je manje od 1000.

Na primer, mogu biti upotrebljeni mali molekuli kao Što su oligosaharidi koji oponašaju domen vezivanja veznika VLA-4 i uklapaju se u domen receptora VLA-4. (Vidi.J.J. Devlin i sar., 1990, Science 249:400-406 (1990), J.K. Scott i G.P. Smith, 1990, Science 249:386-390 i U.S. patent 4.833,092 (Gevsen), svi inkorporirani ovde referencom). Suprotno, mogu biti upotrebljeni mali molekuli koji oponašaju domen veznika vezivanja VCAM-1 i uklapaju se u domen receptora VCAM-1.

Primeri drugih malih molekula korisnih u pronalasku mogu se naći u Komoriva i sar., ("Minimalna neophodna sekvenca za glavno mesto adhezije specifično za tip ćelije (CS1) unutar alternativno podeljenog spoja tipa III domena vezujućeg segmenta fibrinonektina je leucin-aspartična kiselina-valin" J. Biol. Chem., 266(23), p. 15075-79 (1991)). Oni su identiflkovali minimum aktivne sekvence amino kiseline neophodne da veže VLA-4 i sintetizovali mnoštvo preklapajućih peptida na osnovu sekvence amino kisline CS-1 regiona (domen vezivanja VLA-4) od posebne vrste fibronektina. Oni su identifikovali peptid od 8 aminokiselina, Glu-lle-Leu-Asp-Val-Pro-Ser-Thr, kao i dva manja preklapajuća pentapeptida, Glu-lle-Leu-Asp-Val- i Leu-Asp-Val-Pro-Ser, koji su imali inhibitornu aktivnost protiv ćelijske adhezije zavisne od fibrinonektina. Za određene veće peptidi koji sadrže LDV sekvencu bilo je pokazano da su aktivniin vivo(T.A. Ferguson i sar., "Dva peptida koji se vezuju za integrin ukidaju Imune odgovore posredovane T-ćelijamain vivo",Proc. Nat!. Acad. Sci. USA, 88, str. 8072-76 (1991); i S. M. Wahl i sar., "Sintetički fibrinonektin peptidi supresuju artritis kod pacova prekidanjem athezije leukocita i okrepljivanjem", J. Clin. Invest., 94, str. 655-62 (1994)). Takođe je opisan ciklični pentapeptid, Arg-Cys-Asp-Tpro-Cys (gde Tpro označava 4-tioprolin), koji može inhibirati adheziju i VLA-4 i VLA-5 za fibrinonektin. (Vidi, npr., D.M. Nowlin i sar. "Novi ciklični pentapetid inhibira Alfa4Beta1 adheziju ćelije posredovanu integrinom", J. Biol. Chem. 268(27), str. 20352-59 (1993); I PCT publikacija PCT/US91/04862). Taj pentapeptid je zasnovan na tripeptidnoj sekvenci Arg-Gly-Asp iz fibrinonektina koji je poznat kao čest motiv u mestu prepoznavanjaza nekoliko ekstraćelijskih matriks proteina. Izneseni su primeri drugih VLA-4 inhibitora, na primer, u Adams i sar. "Inhibitori adhezije ćelija", PCT US97/13013, koji opisuju linearna peptidna jedinjenja koja sadrže beta amino kiseline koje imaju inhibitornu aktivnost u odnosu na adheziju ćelija. Međunarodne patentne prijave WO 94/15958 i WO 92/00995 opisuju ciklični peptid i peptidnomimetična jedinjenja sa inhibitornom aktivnosti u odnosu na adheziju ćelija. Međunarodne patentne prijave WO 93/08823 i WO 92/08464 opisuju jedinjenja koja moduliraju adheziju ćelija i sadrže guanidil-, urea-u, i tioureu. Patent Ujedinjenih država br. 5,260,277 opisuje guanidil jedinjenja koja modulišu adheziju ćelija. Drugi antagonisti VLA-4 opisani su u D. Y. Jackson i sar., "Snažni a4pi peptidi antagonisti kao potencijalni anti-inflamatorni agensi", J. Med. Chem, 40, 3359

(1977); H. Shorff i sar., "Mali peptidi inhibitori a4j37 posredovali su MadCAM-1 adheziju za limfocite", Bio. Med. Chem. Lett., 1 2495 (1996); U.S. patent 5,510,332, PCT publikacije WO 98/53814, WO 97/03094, WO 97/02289, WO 96/40781, WO 96/22966, WO 96/20216, WO 96/01644, WO 96/106108 i WO 95/15973 i drugi.

Takvi mali molekularni agensi mogu biti produkovani sintetisanjem mnoštva peptida (npr., 5 do 20 amino kiselina u dužinu), polu-peptidnih jedinjenja ili ne-peptidnih, organskih jedinjenja i skrininga tih jedinjenja u odnosu na njihovu sposobnost da inhibiraju odgovarajuće VLA-1/kolagen ili VLA-4/VCAM-1 interakcije. Vidi generalno U.S. patent br., 4,833,092, Scott i Smith, 'Traganje za peptidnim veznicima sa epitopnom bibliotekom", Science, 249, str. 386-90 (1990) i Devlin i sar., "Slučajne peptidne biblioteke: izvor posebnih proteinskih vezujućih molekula", Science, 249, str. 40407 (1990).

B. Metodi pravljenja homologa anti- integrin antitela

Tehnologija produkovanja monoklonalnih antitela, uključujući na primer, anti-itegrin monoklonalna antitela, je dobro poznata. Vidi, na primer, Mendrick i sar., 1995, Lab. Invest., 72:367-375 (mAbs za mišja antkx1j3l i anti-a2f3l); Sonneberg i sar., 1987 J. Biol. Chem. 262:10376-50 (mAbs za mišja anti-a64<p>i); Yao i sar. 1996, J. Cell Sci 1996 109:3139-50 (mAbs za mišja antkx74]3l); Hemler i sar, 1984, J Immunol 132:3011-8 (mAbs u odnosu na humani rx1p1); Pischel i sar., 1987 J Immunol 138:226-33 (mAbs u odnosu na humani a2[3l); VVavner i sar., 1988, J. Cell Biol 107:1881-91 (mAbs u odnosu na humani a3(3l); Hemler i sar.1987 J Biol Chem 262:11478-85 (mAbs u odnosu na humani 41p1); VVavner i sar 1988 J Cell Biol 107:1881-91 (mAbs u odnosu na humani a5pi); Sonneberg i sar. 1987, J. Biol. Chem. 262:10376-10383 (mAbs u odnosu na humani oc6|3l); A Wang i sar. 1966 Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 15:664-672 (mAbs u odnosu na humani a9pi); Davies i sar, 1989 J Cell Biol 109:1817-26 (mAbs u odnosu na humani avpi); Sanchez-Madrid i sar. 1982, Proc Natl Acad Sci U S A 79:7489-93 (mAbs u odnosu na humani aL<p>2); Diamond i sar. 1993, J. Cell Biol 120:1031-43 (mAbs u odnosu na humani aM<p>2); Stacker i sar. 1991 J Immunol 146:648-55 (mAbs u odnosu na humani ccXp2); Van der Vieren i sar. 1995 Immunitv 3:683-90 (mAbs u odnosu na humani aDp2); Bennett i sar. 1983 Proc Natl Acad Sci U S A 80:2417-21 (mAbs u odnosu na humani ctllbP3); Hessle i sar. 1984, Differentiation 26:49-54 (mAbs u odnosu na humani a6p4); VVeinacker i sar. 1994 J Biol Chem 269:6940-8 (mAbs u odnosu na humani aVP5); VVeinacker i sar. 1994 J Biol Chem 269:6940-8 (mAbs u odnosu na humani ocVp6); Cerf-Bensussan i sar. 1992 Eur J Immunol 22:273-7 (mAbs u odnosu na humani ccEP7); Nishimura i sar. 1994 J Biol Chem 269:28708-15 (mAbs u odnosu na humani aVips); Bossv i sar. 1990 EMBO J 10:2375-85 (poliklonaini antiserum u odnosu na humani cc8p1); Camper i sar. 1998 J. Biol. Chem. 273:20383-20389 (poliklonaini antiserum u odnosu na humani aiopi).

Poželjni antagonisti integrina razmotreni ovde mogu biti eksprimirani iz intaktne ili okrnjene genomske ili cDNK ili iz sintetičkih DNK u prokariotskim ili eukariotskim ćelijama domaćinima. Dimerični proteini mogu biti izolovani iz medijuma za kulturu i/ili odmotani i dimerizovaniin vitroda formiraju biološki aktivna jedinjenja. Heterodimeri mogu biti formiraniin vitrokombinovanjem odvojenih, nesrodnih polipeptidnih lanaca. Alternativo se heterodimeri mogu formirati u pojedinačnoj ćeliji putem ko-eksprimirajućih nukleinskih kiselina koje kodiraju nesrodne polipeptidne lanace. Vidi, na primer, WO 93/09229, ili U.S. pat. br. 5,411,941, radi nekoliko protokola za produkciju egzemplarnih rekombinantnih heterodimernih proteina. Trenutno poželjne ćelije domaćini uključuju, bez ograničenja, prokariote uključujućiE coli,ili eukariote uključujući kvasac,Saccharomyces,ćelije insekata, ili sisarske ćelije, kao što su CHO, COS ili BSC ćelije. Neko sa prosečnim iskustvom u praksi shvatiće da se mogu korisno upotrebiti druge ćelije domaćini.

Na primer, anti-VLA-4 antitela mogu biti identifikovana imunotaloženjem 125l-obeleženog lizata ćelija iz VLA-4-eksprimirajućih ćelija (Vidi, Sanchez-Madrid i sar. 1986, Eur. J. Immunoi., 16: 1343-1349 i Hemler i sar., 1987, J. Biol. Chem., 262, 11478-11485). Anti-VLA-4 antitela mogu takođe biti identifikovana putem flou-citometrije, npr., merenjem fluorescentnog bojenja Ramos ćelija inkubiranih sa antitelom za koje se veruje da prepoznaje VLA-4 (vidi Elices i sar., 1990 Cell, 60: 577-584). Limfociti koji se koriste u produkciji ćelija hibridoma tipično su izolovani iz imunizovanih sisara čiji se serum već pokazao pozitivnim u odnosu na VLA-4 antitela u skrining ogledima.

Obično je besmrtna ćelijska linija (npr., ćelijska linija mieloma) izvedena iz iste vrste sisara kao limfociti. Poželjne besmrtne ćelijske linije su ćelijske linije mijeloma miša koje su senzitivne na medijum za kulturu koji sadrži hipoksantin, aminopterin i timidin ("HAT medijum"). Obično su ćelije mijeloma miša HAT-senzitivne fuzionisane sa splenocitama miša koristeći polietilen glikol molekulske težine 1500 ("PEG 1500"). Ćelije hibridoma koje su nastale iz fuzije su zatim selekcionisane koristeći HAT medijum koji ubija nefuzionisane i neproduktivno fuzinisane ćelije mijeloma (nefuzionisane splenocite umiru nakon nekoliko dana zato što nisu transformisane). Hibridomi koji produkuju željeno antitelo detektovani su skriningom supernatanta kultura hibridoma. Na primer, hibridomi pripremljeni da produkuju anti-VLA-4 antitela mogu biti pregledani testiranjem supernatanta kultura hibridoma radi skrininga antitela koja imaju sposobnost da se vezuju za rekombinantnu ćelijsku liniju koja eksprimira alfa4-subjedinicu (vidi, Elices i sar. supra).

Da se produkuju homolozi VLA-4 antitela koji su intaktni imunoglobulini, hibridoma ćelije koje su testirane kao pozitivne u takvim skrining ogledima kultivisane su na hranjivom medijumu pod uslovima koji su dovoljnog vremenskog trajanja da omoguće hibridoma ćelijama da izluče monoklonalna antitela u medijum za kulturu. Tehnike kulture ćelija i medijum za kulturu hibridoma ćelija dobro su poznati. Supernatant kondicloniranih hibridoma kultura može se sakupptp i anti-VLA-4 antitela mogu po potrebi dalje biti prečišćena dobro poznatim metodama.

Alternativno, željeno antitelo može biti produkovano injektiranjem hibridoma ćelija u peritonealnu šupljinu neimunizovanog miša. Hibridoma ćelije proliferiraju u peritonealnu šupljinu, izlučuju antitelo koje akumulira ascites tećnost. Antitelo meže biti prikupljeno vađenjem ascites tečnosti iz peritonealne šupljine sa siringom.

Nekoliko mišjih anti-VLA-4 monoklonalnih antitela opisano je ranije. (Vidi, npr., Sanchez-Madrid i sar., 1986, supra; Hemler i sar., 1987, supra; Pauiido i sar., 1991, J. Biol. Chem., 266 (16), 10241-10245; Issekutz i Wykeretowicz, 1991, J. Immunol., 147:109 (TA-2 mab)). Ova anti-VLA-4 monoklonalna antitela i druga VLA-4 antitela (npr., U.S. patent 5,888,507-Biogen, Ine ,i reference citirane ovde) sposobna za prepoznavanje alfa i/ili beta lanca VLA-4 biće korisna u metodima i tretmanima u skladu sa predmetnim pronalaskom. Poželjnija su anti VLA-4 antitela koja će prepoznati epitope VLA-4 alfa4 lanca uključenog u vezivanje veznika VCAM-1 i fibrinonektina (tj., antitela koja se mogu vezati za VLA-4 na mestu uključenom u prepoznavanje veznika i blokiranje vezivanja VCAM-1 i fibrinonektina). Takva antitela definisana su kao B epitop specifična antitela (B1 ili B2)(Pulido i sar., 1991, supra) i takođe su anti-VLA-4 antitela u skladu sa predmetnom pronalaskom.

Homolozi potpuno humanog monoklonalnog antitela protiv VLA-4 su drugi poželjan agens vezivanja koji može blokirati ili obaviti ligande VLA-4 u metodu pronalaska. U svom intaktnom obliku oni mogu biti pripremljeni koristećiInMf/<p->prajmovane humane splenocite, kao što su opisali Boerner i sar., 1991. J. Immunol., 147, 86-95. Alternativno, oni mogu biti pripremljeni repertoarom kloniranja kao što je opisano u Persson i sar., 1991, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 88: 2432-2436 ili Huang i Stollar, 1991, J. Immunol. Methods 141, 227-236. U.S. patent 5,798,230 (25 avgust, 1998), "Procesi pripremanja humanih monoklonalnih antitela i njihova upotreba") koji opisuje pripremanje humanih monoklonalnih antitela iz humanih B ćelija. U skladu sa tim procesom, humane B ćelije koje produkuju antitela su učinjene besmrtnim putem inficiranja sa Epstein-Barr virusom ili njegovim derivatima koji eksprimiraju Epstein-Barr virusni jedarni antigen 2 (EBNA2), EBNA2 funkciju, koja je potrebna za besmrtnost, i koja je postepeno isključena što rezultira povećanom produkcijom antitela.

U još jednom metodu produkovanja potpuno humanih antitela, patent Ujedinjenih država 5,789,650 4 avgust, 1998, "Transgene ne-humane životinje za produkciju heterologih antitela" opisuju se transgene ne-humane životinje sposobne za produkovanje heterologih antitela i transgenih ne-humanih životinja koje imaju inaktivirane endogene gene imunoglobulina. Endogeni geni imunoglobulina su supresovani sa antisens polinukleotidima i/ili sa antiserumom usmerenim protiv endogenih imunoglobulina. Heterologa antitela su kodirana imunoglobinskim genima koji se normalno ne nalaze u genomu vrste ne-humane životinje. Jedan ili više transgena koji sadrže sekvence ne raspoređenih heterologih humanih teških lanaca imunoglobulina uneti su u ne-humanu životinju formirajući tako transgenu životinju sposobnu da funkcionalno rearanžira transgene sekvence Imunoglobulina i produkuje repertoar antitela različitih izotipova koji kodiraju humane gene imunoglobulina. Takva heterologa humana antitela produkovana su u B-ćelijama koje su zatim učinjene besmrtnim, npr., fuzionisanjem sa besmrtnom ćelijskom linijom kao što je mijeloma ili manipulišući takve B-ćelije drugim tehnikama da se ovekoveći ćelijska linija potpuni homoiog humanog antitela, sposobna da produkuje monoklonalne heterologe.

Velike prikazane neimunizovane humane fag biblioteke mogu se takođe upotrebiti da se izoluju antitela visokog afiniteta koja mogu biti razvijena kao humani terapeutici koristeći standardnu fag tehnologiju (Vaughan i sar., 1996).

Još jedan poželjni agens vezivanja koji može blokirati ili obaviti veznike integrina u metodu pronalaska je humanizovani rekombinantni homoiog antitela koji ima specifičnost integrina. Sledeći rane metode za pripremanje pravih "himeričnih antitela" (gde su celi konstantni i celi varijabilni regioni izvedeni iz različitih izvora), opisan je novi pristup u EP 0239400 (VVinter i sar.) gde su antitela izmenjena supstitucijom (unutar datog varijabilnog regiona) njihovih komplementarnih određenih regiona (CDR-ova) za jednu vrstu sa onim iz druge. Ovaj proces može se upotrebiti, na primer, da se zamene CDR-ovi iz domena varijabilnih regiona humanih teških i lakih lanaca Ig sa alternativnim CDR-ovima iz domena varijabilnih regiona miša. Ovi izmenjeni varijabilni Ig regioni mogu naknadno biti kombinovani sa humanim konstantnim regionima Ig kreiranim antitelima koja su potpuno humana po sastavu sem supstituisanih mišjih CDR-ova. Predviđeno je da takva CDR-supstituisana antitela cimaju manju verovatnoću da izmene imuni odgovor kod ljudi u poređenju sa pravim himeričnim antitefima zato što CDR-supstituisana antitela sadrže značajno manje ne-humanih komponenti. Proces za humanizovanje monoklonalnih antitela preko CDR "kalemnjenja" nazvan je "preoblikovanje". (Riechmann i sar., 1988, Nature 332, 323-327; Verhoeven i sar., 1988, Science 239, 1534-1536).

Obično su regioni komplementarnog određivanja (CDR-ovi) mišjeg antitela transplantirani na odgovarajuće regione u humanom antitelu, pošto su CDR-ovi (tri u teškim lancima antitela, tri u lakim lancima) ti regioni mišjeg antitela koji se vezuju za specifični antigen. Transplantacija CDR-ova dostignuta je genetičkim inženjeringom dok su DNK sekvence CDR-ova određene kloniranjem mišjih varijabilnih (V) regiona segmenata gena teških i lakih lanaca, i zatim su preneseni u odgovarajući humani V region putem mutageneze usmerene na mesto. U završnom stupnju procesa, segmenti humanog konstantnog regiona gena željenog izotipa (obično gama i za CH i kapa za CL) su dodani i humanizovani geni teškog i lakog lanaca su ko-eksprimirani u sisarskim ćelijama da produkuju rastvorljivo humanizovano antitelo.

Transfer ovih CDR-ova u humano antitelo daje tom antitelu karakteristike vezivanja antigena originalnog mišjeg antitela. Šest CDR-ova u mišjem antitelu su namešteni strukturno na V regionu "okvira" regiona. Razlog što je kalemljenje CDR-ova uspešno je što okvir regiona između mišjih i humanih antitela može imati veoma slične 3-D strukture sa sličnim tačkama pričvršćivanja za CDR-ove, tako da CDR-ovi mogu biti razmenjeni. Takvi humanizovani homologi antitela mogu biti pripremljeni kao što je pokazano u Jones i sar., 1986, Nature 321, 522-525; Riechmann, 1988, Nature 332, 323-327, Queen i sar., 1989, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86, 10029i Orlandi i sar., 1989, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86, 3833.

Pored toga, smatra se da određene aminokiseline u regionima okvira intereaguju sa CDR-ovima i utiču na ukupan afinitet vezivanja antigena. Direktan transfer CDR-ova iz mišjeg antitela da se produkuju humani okviri V regiona često rezultira delimičnim ili kompletnim gubitkom afiniteta vezivanja. U određenom broju slučajeva, izgleda da je kritično da se u regionu okvira prijemnog antitela naruše ostaci s ciljem da se dobije aktivnost vezivanja

Queen i sar., 1989 (supra) i WO 90/07861 (Protein Design Labs) opisali su pripremanje humanizovanog antitela koje sadrži modifikovane ostatke u regionu okvira primajućeg antitela, putem kombinovanja CDR-ova mišjeg Mab (anti-Tac) sa okvirom humanog imunoglobulina i konstantnim regionima. Oni su pokazali jedno rešenje problema gubitka afiniteta vezivanja koji često nastaje iz direktnog transfera CDR-ova bez bilo kakvog modifikovanja ostataka humanog okvira V regiona; njihovo rešenje uključuje dva ključna koraka. Prvo, humani okviri V regiona odabrani su kompjuterskom analizom radi optimalne homologije proteinske sekvence u odnosu na okvir V regiona originalnog mišjeg antitela, u tom slučaju, anti-Tac Mab. U drugom koraku, tercijarna struktura mišjeg V regiona je modelirana kompjuterom sa ciljem da se vizualizuje okvir amino kiselinskih ostataka za koje je verovatno da reaguju međusobno sa mišjim CDR-ovima i ovi mišji ostaci amino kiseline su zatim nadodati na homologi humani okvir. Vidi takođe U.S. patente 5,693,762; 5,693,761; 5,585,089 i 5,530,101 (Protein Design Labs).

Može se upotrebiti različit pristup (Tempest i sar., 1991, Biotechnologv 9, 266-271) i kao standard upotrebiti okvire regiona V izvedene iz NEVVM i RE) teških i lakih lanaca respektivno za kalemljenje CDR-ova bez radikalnog uvođenja mišjih ostataka. Prednost korišćenja pristupa Tempest-a i sar., da se konstruišu NEVVM i REl na osnovu humanizovanih antitela je u tome što su trodimenzionalne strukture NEVVM i REl varijabilni regioni poznati iz kristalografije x-zracima i prema tome interakcija između CDR-ova i okvira regiona V može biti modelirana.

Bez obzira na pristup koji je upotrebljen, primeri inicijalnog humanizovanog homologa antitela pripremljni do danas pokazali su da to nije pravolinijski proces. Međutim, čak i primanjem k znanju da takve promene okvira mogu biti neophodne, nije moguće predvideti na osnovu prethodne dostupne prakse koji će, ako uopšte neki, ostaci okvira morati biti izmenjeni da se dobiju funkcionalna humanizovana rekombinantna antitela željene specifičnosti. Dosadašnji rezultati ukazuju da promene neophodne da se sačuva specifičnost i/ili afinitet su većim delom jedinstveni za dato antitelo i ne mogu se predvideti na osnovu humanizacije različitih antitela.

Određeni integrin koji sadrži alfa-4 subjedinicu, koristan u predmetnom pronalasku, uključuje himerični i humanizovani rekombinantni homoiog antitela (tj., intaktne imunoglobuline i njihove đelove) sa specifičnostima B epitopa koje su bile pripremljene i koje su opisane u U.S. patentu 5,932,214 (mab HP1/2). Polazni materijal za pripremanje himeričnog (miš varijabilni-humani konstantni) i humanizovanog anti-integrin homologa antitela može biti mišje monoklonalno anti-itegrin antitelo, kao što je prethodno opisano, monoklonalno anti-integrin komercijalno dostupno (npr., HP2/1, Amae International, Inc., VVestbrook, Maine), iii monoklonalno anti-integrin antitelo pripremljeno u skladu sa podučavanjima dalim ovde. Drugi poželjni homologi humanizovanog anti-VLA-4 antitela opisani su u Athena Neurosciences, Ine, u PCT/US 95/01219 (27. jul 1995) i U.S. patent 5,840,299 (inkorporiran ovde referencom).

Ova humanizovana anti-VLA-4 antitela sadrže humanizovane svetle lance i humanizovane teške lance. Humanizovani svetli lanac sadrži tri komplementarna đeterminišuća regiona (CDR1, CDR2 i CDR3) koji imaju sekvence amino kiseline iz odgovarajućih komplementarno determinišućih regiona mišjeg 21-6 lakog lanca imunoglobulina, i skvence okvira varijabilnog regiona iz humanog kapa okvira varijabilnog regiona lakog lanca sem na poslednoj poziciji položaja amino kiseline koja je zauzeta sa amino kiseilnom prisutnom na ekvivalentnoj poziciji miša 21.6 lakog lanca imunoglobulina okvira varijabilnog regiona. Humanizovani teški lanac sadrži tri komplementarna regiona (CDR1, CDR2 i CDR3) koji imaju sekvence iz odgovarajućih komplementarno determinišućih regiona 21-6 teškog lanca imunoglobulina miša iz sekvence okvira humanog varijabilnog regiona teškog lanca sem na poslednjoj poziciji koja je okupirana istom amino kiselinom prisutnom na ekvivalentnoj poziciji mišjeg 21.6 lakog lanca imunoglobulina okvira varijabilnog regiona

Metodi predmetnog pronalaska mogu koristiti antagoniste kodirane sekvencama nukleinske kiseline koji hibridizuju pod uslovima strogoće sa sekvencama nukleinske kiseline koje kodiraju antitela usmerena protiv integrina koji sadrže alfa4 subjedinice. Na primer, antagonist predmetnog pronalaska može biti protein čija nukleinska kiselina hibridizuje pod viskoim uslovima strogosti sa jednom ili više onih sekvenci amino kiseline koje se nalaze u tabeli 6 U.S. patenta 5,840,299 ili komplement jedne takve ili više sekvenci. Antagonisti mogu takođe biti proteini čije nukleinske kiseline hibridizuju pod uslovima visoke strogoće sa nukleinskom kiselinom koja kodira SEQ ID br.:2 ili SEQ ID br.:4 nađen u U.S. patentu 5,932,214. Dalje, antagonisti mogu biti takođe proteini čije nukleinske kiseline hibridizuju pod uslovima visoke strogoće sa nukleinskom kiselinom koja kodira varijabilni domen antitela produkovanog ćelijskom linijom ATCC CRL 11175.

Alternativno, antagonist predmetnog pronalaska može biti protein čija nukleinska kiselina hibridizuje pod uslovima niske strogoće sa jednom ili više sekvenci onih nukleinskih kiselina nađenih u tabeli 6 U.S. patenta 5,840,299 ili komplement jedne takve iii više sekvenci. Antagonist može takođe biti protein čija nukleinska kiselina hibridizuje pod uslovima niske strogoće sa nukleinskom kiselinom koja kodira SEQ ID be.:2 ili SEQ ID br.;4 nađen u U.S. patentu 5,932,214. Dalje, antagonisti mogu biti takođe proteini čije nukleinske kiseline hibridizuju pod uslovima niske strogoće sa nukleinskom kiselinom koja kodira varijabilni domen antitela produkovanog ćelijskom linijom ATCC CRL 11175.

C. Produkcija fragmenata i analoga

Fragment izolovanog alfa4 antagonista integrina (npr., ovde opisani fragmenti homologa antitela) mogu takođe biti efikasno produkovani rekombinantnim metodima, proteolitičkom digestijom ili hemijskom sintezom koristeći metode poznate onima sa iskustvom u praksi. U rekombinantnim metodima, unutrašnji terminalni fragmenti polipeptida mogu biti generisani uklanjanjem jednog ili više nukleotida sa jednog kraja (za terminalni fragment) ili oba kraja (za unutrašnji fragment) sekvence DNK koja kodira Izolovane jež polipeptide. Ekspresija mutagenizovane DNK produkuje polipeptidne fragmente. Digestija sa endonukleazama sa "ovlaš krajevima" može takođe generisati DNK koje kodiraju područje fragmenata. DNK koje kodiraju fragmente proteina mogu takođe biti generisane slučajnim deljenjem, restrikcionom digestijom ili njihovom kombinacijom. Fragmenti proteina mogu biti generisani direktno iz intaktnih proteina. Peptidi mogu biti specifično isečeni proteolitičkim enzimima, uključujući, ali bez ograničenja na plazmin, trombln, tripsin, himotripsin ili pepsin. Svaki od ovih enzima je specifičan za tip peptidne veze koju napada. Tripsin katalizuje hidrolizu peptidne veze u kojoj je karbonil grupa u obliku amino kiseline, obično arginina ili lizina. Pepsin i himotripsin katalizuju hidrolizu peptidnih veza iz aromatičnih amino kiselina, kao što su triptofan, tirozin i fenilalanin. Alternativni setovi isečenih fragmenata proteina su generisani putem sprečavanja kidanja na mestu koje je prijemčivo za proteolitički enzim. Na primer, reakcija e-amino kiselinske grupe lizina sa etiltrifluorotioacetatom, u srednje baznom rastvoru, daje blokirane ostatke amino kiselina Čija susedna peptldna veza nije više prijemčiva za hidrolizu sa tripsinom. Proteini mogu biti modifikovani tako da kreiraju peptidne veze koje su prijemčive za proteolitičke enzime. Na primer, alikilacija ostataka cisteina sa j3-haloetilaminima daje peptidne veze koje su hidrolizovane sa tripsinom (Lindley, (1956) Nature 178, 647). Sem toga mogu biti upotrebljeni hemijski reagensi koji isecaju peptidne lance na specifičnim ostacima. Na primer, cijanogen bromid iseca peptide na metioninskim ostacima (Gross i VVitkip, (1961) J. Am. Chem. Soc. 83, 1510). Tako, tretiranjem proteina sa različitim kombinacijama modifikatora, proteolitičkih enzima i/ili hemijskih agensa, proteini mogu biti podeljeni u fragmente željene dužine bez preklapanja fragmenata ili podeljeni u preklapajuće fragmente željene dužine.

Fragmenti mogu takođe biti sintetizovani hemijski koristeći tehnike poznate u praksi kao što su Merrifield-ova čvrsta faza F moc ili t-Boc hernija. Merrifield, Recent Progress in Hormone Research 23: 451 (1967).

Primeri metoda iz prethodne prakse koji omogućuju produkciju i testiranje fragmenatai analoga diskutovani su niže. Ovi ili analogi metodi mogu biti upotrebljeni da se naprave i skrinuju fragmenti i analozi izolovanih antagonista integrina alfa4 za koje se pokazalo da imaju biološku aktivnost. Egzemplarni metod testiranja da li fragmenti i analozi integrina koji sadrži alfa4 subjedinicu imaju biološku aktivnost nađen je u sekciji IV i primerima.

D. Produkcija izmenjeneDNKi peptidnih sekvenci: metodi slučajnosti

Sekvence amino kiseline varijanti proteina mogu biti pripremljene slučajnom mutagenezom DNK koja kodira protein ili njegov određeni deo. Korisni metodi uključuju PCR mutagenezu i saturacionu mutagenezu. Biblioteka slučajnih varijanti sekvenci amino kiseline može takođe biti generisana sintezom seta degenerativnih oligonukleotidnih sekvenci. U praksi su dobro poznati metodi generisanja varijanti sekvence amino kiseline datog proteina koristeći izmenjene DNK i peptide. Sledeći primeri takvih metoda nemaju nameru da ograniče obim predmetnog pronalaska, već jednostavno služe da ilustruju reprezentativne tehnike. Osobe koje imaju prosečno iskustvo u praksi prepoznaće da su i drugi metodi u tom smislu takođe korisni.

PCR mutageneza: vidi, na primer Leung i sar., (1989) Technique 1, 11-15.

Saturaciona mutageneza: jedan metod je generalno opisan u Mavers i sar., (1989) Science 229, 242.

Degenerativna oligonukleotidna mutageneza: vidi, na primer, Harang, S.A. (1983) Tetrahedron 39, 3; Itakura i sar., (1984) Ann. Rev. Biochem. 53, 323 i Itakura i sar., Rekombinantna DNK, Proc. 3rd Clevland Symposium on Macromolecules, str., 273-289 (A.G. VValton, izd.) Elsevier, Amsterdam, 1981.

E. Produkcija izmenjeneDNKi peptidnih sekvenci: direktni metodi

Ne slučajna ili usmerena mutageneza obezbeđuje specifične sekvence ili mutacije u specifičnim delovima sekvence polinukleotida koja kodira izolovani polipeptid da obezbedi varijante koje uključuju delecije, insercije ili supstitucije ostataka poznate sekvence amino kiseline izolovanog polipeptida. Mutaciona mesta mogu biti modifikovana pojedinačno ili u seriji, na primer putem: (1) supstituisanja prve sa konzerviranim amino kiselinama i zatim sa radikalnijim izborom u zavisnosti od postignutog rezultata; (2) isecanjem ciljnog ostatka; ili (3) ubacivanjem ostataka iste ili različite klase u susedstvo iociranog mesta, ili kombinacijom opcija 1-3.

Jasno, takvi na mesto usmereni metodi su jedan način u kojem N-terminalni cistein (ili funkcionalni ekvivalent) može biti uveden u datu polipeptidnu sekvencu da obezbedi mesto pričvršćivanja za hidrofobnu grupu.

Mutageneza skrininga alanlna: Vidi Cunningham i VVells (1989) Science 244, 1081-1085).

Mutageneza posredovana oiigonukleotidom: Vidi, na primer, Adelman i sar., (1983) DNK 2, 183.

Kasetna mutageneza: Vidi VVeiis i sar., (1985) Gene 34, 315.

Kombinatorna mutageneza: Vidi, na primer, Ladner i sar., WO 88/06630

Strategije pokazivanja faga: Vidi, na primer prikaz Marks i sar., J. Biol. Chemistrv: 267: 16007-16010 (1992).

F. Druge varijante antagonista integrina

Varijante se mogu razlikovati od drugih antagonista integrina opisanih ovde u sekvenci amino kiseline ili u načinima koji ne uključuju sekvence, ili u oba. Najpoželjniji polipeptidi pronalaska imaju preferirane ne-sekventne modifikacije koje uključujuin vivoiliin vitroizvođenje (npr., njihovog N-terminalnog kraja), što je bolje moguće promene u acetilaciji, metilaciji, fosforilaciji, amidaciji, karboksilaciji ili glikosilaciji.

Drugi analozi uključuju protein ili njegove biološki aktivne fragmente čije se sekvence razlikuju od onih koje se nalaze u U.S. patentima 5,840,299 ili U.S. 5,888,507; U.S, 5,932,214 (svi inkorporirani ovde sa referencom) ili PCT US/94/00266 sa jednom ili više supstitucija amino kiselina ili sa jednom ili više ne konzervativnih suspstitucija amino kiselina, ili sa đelecijama ili insercijama koje ne ukidaju biološku aktivnost izolovanog proteina. Konzervativne supstitucije obično uključuju supstituciju jedne amino kiseline drugom sa sličnim karakteristikama kao što je suspstitucija unutar sledećih grupa: valin, alanin i glicin; leucin i izoleucin; aspartična kiselina i glutaminska kiselina; asparagin i glutamin; serin i treonin; lizin i arginln i fenilalanin i tirozin. Ne-poiarne hidrofobne amino kiseline uključuju alanin, leucin, izoleucin, valin, prolin, fenilalanin, triptofan i metionin. Polarne neutralne amino kiseline uključuju glicin, serin, treonin, cistein, tirozin, asparagin i glutamin. Pozitivno naelektrisane (bazične) amino kiseline uključuju arginin, lizin i histidin. Negativno naelektrisane (kisele) amino kiseline uključuju aspartičnu kiselinu i glutaminsku kiselinu. Druge konzervativne supstitucije ■, mogu biti lako poznate onima sa prosečnim iskustvom. Na primer, za amino kiselinu alanin, konzervativna supstitucija može biti obavljena sa bilo kojim od D-alanina, glicina, beta-alanina, L-cisteina i D-cistina. Za lizin zamena može biti bilo koji od D-lizina, arginina, D-arginina, homo-arginina, metionina, D-metionina, ornitina ili D-ornitina

Drugi analozi koji se koriste u pronalasku su oni sa modifikacijama koje povećavaju stabilnost peptida. Takvi analozi mogu sadržati, na primer, jednu ili više ne-peptidnih veza (koje zamenjuju peptidne veze) u peptidnoj sekvenci. Takođe su uključeni: analozi koji uključuju ostatke koji se ne javljaju prirodno kao L-amino kiseline, kao što su D-amino kiseline ili sintetičke amino kiseline koje se ne javljaju prirodno kao što su beta ili gama amino kiseline i ciklični analozi. Inkorporacija D- umesto L-aminokiselina u izolovane jež polipeptide može povećati otpornost na proteaze. Vidi U.S. patent 5,219990supra.

Poželjni homolozi antitela uključuju sekvencu amino kiseline od najmanje 60%, 80%, 90%, 95%, 98% ili 99% homologije sa sekvencom amino kiseline PS/2 antitela (vidi primer) ili uključuje sekvencu amino kiseline od najmanje 60%, 80%, 90%, 95%, 98% ili 99% homologije sa sekvencom amino kiseline opisanom u U.S. patentu 5,840,299 (SEQ ID br.:15-laki lanac varijabilni region iii SEQ ID br.:17-teški lanac varijabilni region) ili U.S. patent 5,932,214 (SEQ ID br.:2 ili 4); i publikovanu patentnu prijavu VVO94/16094 (one sekvence nađene u anti-VLA-4 antitelu deponovane ćelijske linije ATCC CRL 11175).

G. Konjugovani oblici polimera

U širem obimu predmetnog pronalaska, pojedinačni polimer molekul može biti upotrebljen za konjugovanje sa antagonistima integrina alfa 1 ili alfa4, i ako se ima u vidu da takođe može biti pričvršćeno više od jednog molekula polimera. Konjugovana antagonistička jedinjenja pronalaska alfa4 integrina mogu naći upotrebu i uin vivokao i une-/>? vivoprimenama. Sem toga, biće prepoznato da konjugovani polimer može koristiti bilo koje druge grupe, grupe, hemijske gupe ili druge konjugovane vrste kao odgovarajuće za krajnju primenu. Na način kao u primeru, u nekim primenama može biti korisno da se kovalentno vezuje polimer i funkcionalna grupa koja dodeljuje polimeru otpornost na UV degradaciju, ili oksidaciju, ili druge karakteristike. Kao dalji primer, može biti korisno u nekim aplikacijama da se polimer učini funkcionalnim da postane reaktivan i omogući vezivanje za molekul leka, da pojača različite osobine ili karakteristike ukupnog konjugovanog materijala. Shodno tome, polimer može sadržati bilo koju funkcionalnost, ponovljive grupe, veze ili druge konstitutivne strukture koje ne isključuju efikasnost konjugovanih jedinjenja antagonista integrina alfa4 za njegovu nameravanu upotrebu. Drugi objekti i prednosti predmetnog pronalaska biće očigledniji iz obezbeđene prijave i podnetih patentnih zahteva.

Ilustrativni polimeri koji se mogu korisno upotrebiti da se dostignu ove poželjne karakteristike opisni su ovde niže u primernim reakcionim shemama. U kovalentno vezanim antagonist/polimer konjugatima, polimer može biti funkcionalizovan i zatim vezan za slobodnu amino kiseiinu(e) antagonista da formira obavezne veze.

Antagonisti integrina koji sadrže alfa4 ili alfa 1 subjedinicu poželjno su konjugovani preko terminalne rekativne grupe na polimer i ako konjugacije mogu biti razgranate iz ne terminainih reaktivnih grupa. Polimer sa reaktivnom grupom(ama) ovde je označen kao "aktivirani polimer". Reaktivna grupa selektivno reaguje sa slobodnim amino ili drugim reaktivnim grupama na molekulu antagonista. Aktivirani polimer(i) je reagovan tako da se pričvršćivanje može odigrati na bilo kojoj dostupnoj amino grupi antagonista integrina alfa4 kao što su alfa amino grupe ili epsilon-amino grupe lizina. Slobodne karboksilne grupe, prigodno aktivirane karbonil grupe, hidroksii, guanidiloksidisane ugljovodonične grupe i merkapto grupe antagonista integrina alfa4 (ako je dostupan)mogu takođe biti upotrebljene kao mesta pričvršćivanja.

I ako se polimer može pričvrstiti bilo gde na molekulu antagonista integrina, poželjno mesto za pričvršćivanje polimera za antagoniste integrina (posebno one koji su proteini) je N-terminus antagonista integrina. Sekundarno mesto(a) su iii u blizini ili na C-terminusu i preko Šećerne grupe (ako je ima). Tako, pronalazak uzima u obzir: (i) N-terminalno vezane konjugate polimera antagonista alfa 1 i aifa4 integrina; (ii) C-terminalno vezane konjugate polimera antagonista alfa 1 i alfa4 integrina, (iii) šećer-vezane konjugate; (iv) kao i N-, G- i šećer-vezane polimer konjugate alfa 1 i alfa 4 antagoniste integrina.

Generalno se koristi od oko 1.0 do oko 10 mola aktiviranog polimera po molu antagonista, u zavisnosti od koncentracije antagonista. Konačna količina je ravnoteža između maksimizovanja opsega reakcije sa minimizovanjem ne-specifičnih modifikacija produkta i, istovremeno, optimizovanjem ako je moguće, poluživota antagonista Poželjno je zadržano najmanje 50% biološke aktivnosti antagonista, a najpoželjnije je zadržano100%.

Reakcije se mogu odigravati bilo kojim pogodnim metodom poznatim u praksi upotrebljenim za reagovanje biološki aktivnih materijala sa inertnim polimerima. Proces generalno uključuje pripremanje aktiviranog polimera (koji može imati najmanje jednu terminalnu hldroksilnu grupu) i zatim reagovanje antagonista sa aktiviranim polimerom da se produkuje rastvorljivi protein pogodan za formulaciju. Gornje modifikacije reakcije mogu se izvesti putem nekoliko metoda, koji mogu uključivati jedan ili nekoliko koraka.

Kao što je pomenuto gore, određeni oblici pronalaska koriste N-terminalni kraj antagonista integrina kao vezu za polimer. Prigodni konvencionalni metodi dostupni su da se selektivno dobije N-terminalno modifikovani antagonist integrina alfa t ili alfa4. Jedan metod je uprimeren putem metoda reduktivne alkilacije koja iskorišćava različitu reaktivnost različitih tipova primarnih amino grupa (epsilon amino grupe na lizin u odnosu na amino grupe na N-terminalnom metioninu) dostupnom za derivatizaciju na pogodnom antagonistu integrina U odgovarajućim uslovima selekcije može biti postignuta potpuna selektivna derivatizacija prigodnog antagonista integrina na njegovom N-terminusu sa polimerom koji sadrži karbonil grupu. Reakcija se obavlja na pH koji omogućuje da se iskoristi prednost pKa razlika između epsilon-arnino grupa ostataka lizina i one od alfa-amino grupe N-terminalnog ostatka antagonista integrina. Ovaj tip hernije dobro je poznat osobama sa prosečnim iskustvom u praksi.

Strategija za usmeravanje polimera polialkilen glikola kao što je PEG u C-terminus antagonista integrina alfa 1 ili alfa4 (npr., kao protein) bila bi da se hemijski pričvrsti ili genetički konstruiše mesto koje može biti upotrebljeno da se usrneri grupa polimera. Na primer, inkorporacija Cys-a na mesto koje je na ili blizu C-terminusa proteina dopustiće specifične modifikacije koristeći u praksi prepoznatljive malemide, vinilsulfone ili haloacetatom aktivirane derivate polietiien glikola (npr., PEG). Ovi derivati mogu biti upotrebljeni specifično za modifikovanje konstruisanih cisteina zahvaljujući visokoj selektivnosti ovih reagenasa za Cys. Druge strategije, kao što je inkorporacija histidinskog taga koji može biti usmeren (Fancy i sar.,

(1996) Chem. & Biol. 3: 551) ili dodatno mesto glikozilacije na proteinu, predstavljaju druge alternative za modifikovanje C-terminusa antagonista integrina pronalaska

Metodi za usmeravanje šećera kao mesta za hemijsko modifikovanje su takođe dobro poznati u praksi i prema tome verovatno je da se polimer polialkilen glikola može dodati direktno i specifično šećerima (ako ih ima) na antagonist integrina koji je aktiviran putem oksidacije. Na primer, može biti generisan polietilenglikol-hidrazid koji formira relativno stabilne hidrazon veze kondenzovanjem sa aldehidima i ketonima. Ova karakteristika je bila upotrebljena za modifikovanje proteina putem oksidacije veza oligosaharida. Vidi Andresz, H. I sar., (1978), Makromol. Chem. 179:301. Posebno, tretman PEG-karboksimetil hidrazida sa nitratima produkuje PEG-karboksimetil azid koji je elektrofilno aktivna grupa reaktivna u odnosu na amino grupe. Ova reakcija može se takođe upotrebiti da se pripreme proteini modifikovani sa polialkilen glikolom. Vidi U.S. patente 4,101,380 i 4,179,337.

Može se upotrebiti poznata praksa hernije posredovane tiol veznikom da se dodatno olakša unakrsno vezivanje proteina da se formiraju multivaientna jedinjenja antagonista alfa 1 i alfa4 integrina. Posebno se mogu generisati reaktivni aidehidi na ugljovodoničnim grupama sa natrijum periodatom, formirajući cistamin konjugate kroz aldehide i indukujući unakrsno vezivanje preko tiol grupa na cistaminima. Vidi Pepinski, B. i sar., (1991), J. Biol. Chem, 166:18244-18249 i Chen, L.L i sar., (1991) J. Biol. Chem, 266: 18237-18243. Prema tome ovaj tip hernije biće takođe odgovarajući za modifikovanje sa polialkilen glikolpolimerima gde je veznik inkorporiran u šećer i polimer polialkilen glikola je pričvršćen za veznik. Dok će veznici koji sadrže aminotiol ili hidrazin omogućiti dodavanje pojedinačne grupe polimera, struktura veznika može biti varirana tako da su dodani višestruki polimeri i/ili da je prostorna orijentacija polimera promenjena u odnosu na antagonist integrina.

U praktikovanju predmetnog pronalaska, preporučljivo je da ostatci polietiien glikola od C1-C4 alkil polialkilen glikola, poželjno polietiien glikol (PEG), ili ostaci poli(oksi)alkilen glikola od takvih glikola, budu inkorporirani u sistem polimera od interesa. Tako, polimer za koji je protein pričvršćen može biti homopolimer polietiien glikola (PEG) ili je polioksietilirani poliol, obezbeđen u svim slučajevima kada je polimer rastvorljiv u vodi na sobnoj temperaturi. Ne-ograničeni primeri takvih polimera uključuju polialkilen oksid homopolimere kao što su PEG ili polipropilen glikoli, polioksietilirani glikoli, njihovi kopolimeri i njihovi blok kopolimeri, pod uslovom da je rastvorljivost u vodi blok kopolimera održana. Primeri polioksietiliranih poliola uključuju, na primer, polioksietilirani glicerol, polioksietilirani sorbitol, polioksietiliranu glukozu ili tome slično. Glicerolski kostur polioksietiliranog glicerola je isti kostur koji se javlja prirodno kod, na primer, životinja i ljudi u mono-, di- i trigliceridima. Prema tome, ovo grananje ne mora obavezno biti viđeno kao strani agens u telu.

Kao alternativni polialkilen oksidi mogu biti upotrebljeni dekstran, polivinil pirolidoni, pollakrilamidi, polivinil alkoholi, polimeri bazirani na ugljovodoniku i tome slično. Oni sa prosečnim iskustvom u praksi prepoznaće da je gore pomenuta lista samo ilustrativna i da su svi polimemi materijali koji imaju ovde opisne kvalitete uzeti u razmatranje.

Polimer ne mora imati bilo koju određenu molekulsku težinu, ali je poželjno da molekulska težina bude između 300 i 10,000, još poželjnije između 10,000 i 40,000. Posebno, veličine od 20,000 ili više su najbolje u sprečavanju gubitka produkta zahvaljujući filtriranju u bubrezima.

Derivatizacija polietiien glikola ima određen broj korisnih karakteristika u formulisanju antagonista konjugata polimer-integrin u praksi predmetnog pronalaska, što je u vezi sa sledećim karakteristikama derivata polialikien glikola: poboljšanje rastvorljivosti u vodi, dok istovremeno ne izaziva antigenične ili imunogenične odgovore; visok stepen biokompatibilnosti; odsustvo biodegradacijein vivoderivata polialkilen glikola; i lakoća izlučivanja od strane Živih organizama.

Štaviše, u drugom aspektu pronalaska, može se upotrebiti antagonist integrina kovalentno vezan za komponentu polimera u kojoj priroda konjugaclje uključuje kidanje kovalentnih hemijskih veza. To omogućuje kontrolu u terminima trajanja vremena u kojem polimer može biti isečen iz antagonista integrina. Ova kovalentna veza između antagonista integrina i polimera može biti isečena hemijskom ili enzimatskom reakcijom. Produkt antagonista polimer-integrin zadržava prihvatljivu količinu aktivnosti. Konkurentno, delovi polietiien glikola su prisutni u konjugiranom polimeru da podare konjugat antagonista polimer-integrin sa visokom rastvorljivošću u vodi i produženim delovanjem u cirkulaciji krvi. Kao rezultat ovih poboljšanih karakteristika pronalazak uzima u obzir parenteralnu, nazalnu i oralnu isporuku i aktivnih vrsta polimera antagonista alfa4 integrina i uin vivoaplikacija' sledeći hidrofilno isecanje, biodostupnost antagonista integrina samog za sebe.

Trebalo bi da se shvati da su sheme reakcije opisane ovde obezbeđene samo sa ciljem ilustrovanja i nisu ograničavajuće u smislu reakcija i struktura koje mogu biti upotrebljene u modifikovanju antagonista alfal ili alfa4 integrina, npr., da se dostigne rastvorljivost, stabilizacija i afinitet membrane ćelije za parenteralno i oralno davanje. Aktivnost i stabilnost tih konjugata antagonista integrina može biti varirana na nekoliko načina, korišćenjem polimera različitih molekularnih razmera Rastvorljivost konjugata može biti varirana menjanjem proporcije i veličine fragmenata polietiien glikola koji su inkorporirani u polimer jedinjenje.

III. Upotrebe

Količina aktivnog sastojka koja se može kombinovati sa nosačkim materijalima da se produkuje pojedinačni oblik doze variraće u zavisnosti od subjekta koji se tretira i posebnog načina davanja. Trebalo bi da se shvati, međutim, da će posebno doziranje i režim tretmana za bilo koji određeni subjekt zavisiti od mnoštva faktora, uključujući aktivnost specifičnog upotrebljenog jedinjenja, starosti, telesne težine, opšteg zdravlja, pola, ishrane, vremena davanja, stope izlučivanja, kombinacije lekova i procene lekara koji obavlja tretman i težine određene bolesti koja se tretira. Količina aktivnog sastojka može takođe zavisiti od terapeutskog ili profilaktičkog agensa, ako ga ima, sa kojim se sastojak daje zajedno.

Metod za tretman u skladu sa pronalaskom uključuje davanje subjektu efektivne količine antagonista predmetnog pronalaska. Doze u inventivnom metodu su efikasne, ne toksične količine. Osobe iskusne upraksi korišćenja rutinskog kliničkog testiranja sposobne su da odrede optimum doza za određenu bolest koja se tretira.

Farmaceutske preparacije

U metodima pronalaska, antagonisti pronalaska mogu se davati parenteralno. Termin "parenteralni" ovde se koristi tako da uključuje subkutano, intravensko, intramuskularno, intr-artikularno, intra-sinovijalno, intrasternalno, intratrahealno, intratekalno, intrahepatično, intralezijski i intrakranijalno injekciranje ili infuzione tehnike. Željena doza daje se subjektu jednom ili više puta dnevno, intravenski, oralno, rektaino, parenteralno, intranazalno, površinski ili putem inhalacije. Željena doza može takođe biti data putem kontinuirane intravenske infuzije.

Poželno se homolozi antitela daju kao sterilno farmaceutsko jedinjenje koje sadrži farmaceutski prihvatljivi nosač, koji može biti bilo koji od brojnih dobro poznatih nosača, kao što je voda, fiziološki rastvor, rastvor fosfatnog pufera, dekstroza, glicerol, etanol i tome slično, ili njihove kombinacije. Jednjienje predmetnog pronalaska može biti upotrebljeno u obliku farmaceutski prihvatljivih soli izvedenih iz neorganskih ili organskih kiselina i baza. Među takve soli uključene su sledeće: acetati, adipati, alginati, aspartati, benzoati, benzensulfonat, bisulfat, butirat, citrat, kamforat, kamforsulfonat, ciklopentanpropionat, diglukonat, dodecisulfat, etansulfonat, fumarat, glukoheptanoat, glicerofosfat, hemisulfat, heptanoat, heksanpat, hidrohiorid, hidrobromid, hidrojodid, 2-hidroksietansulfonat, laktat, maleat, metansulfonat, 2-naftaiensulfonat, nikotinat, oksalat, pamoat, pektinat, persulfat, 3-fenil-propionat, pikrat, propionat, sukcinat, tatrat, tiocijanat, tiosilat i undekanoat. Bazne soli uključuju amonijum soli, soli alkalnih metala, kao što su natrijum i kalijum soli, soli alkalnih zemljanih metala, kao što su soli kalcijuma i magnezijuma, soli organskih baza, kao što su soli diheksilamina, N-metil-D-glukamin, tris(hidroksimetil)metilamin i soli sa amino kiselinama kao što su arginin, lizin i td. Takođe, baze koje sadrže azotne grupe mogu biti kvaternizovane sa takvim agensima kao Što su niži alkil halidi, kao što su metil, etil, propil i butil hlorid, bromidi i jodidi; dialkil sulfati, kao što su dimetil, dietil, dibutil i diamiisulfati, dugolančani halidi kao što su decil, lauril, miristil i stearil hloridi, bromidi i jodidi, aralkil halidi, kao što su benzil i fenetil bromidi i drugi. Tako su dobijeni produkti rastvoljivi u vodi ili ulju ili raspršivi.

Farmaceutska jedinjenja ovog pronalaska sadrže bilo koje od jedinjenja predmetnog pronalaska ili njegove farmaceutski prihvatljive derivate, zajedno sa bilo kojim farmaceutski prihvatljivim nosačem. Termin "nosač" koji se može upotrebiti uključuje pomoćna sredstva i nosače. Farmaceutski prihvatljivi nosači koji se mogu koristiti u farmaceutskim jedtnjenjima ovog pronalaska uključuju, ali nisu ograničeni na, jono izmenjivače, aluminijum, aluminijum stearat, lecittn, serum proteine, kao što je humani serum albumin, puferske supstance kao što su fosfati, glicin, sorbinska kiselina, kalijum sorbat, deiimične gliceridne mešavine masnih kiselina povrća, vodu, soli ili elektrolite kao što su protamin sulfat, dinatrijum vodonik, vodonik fosfat, kalijum hidragen fosfat, natrijum hlorid, cinkove soli, kolidni silika, magnezijum trisilikat, polivinil pirolidon, supstance bazirane na celulozi, polietiien glikol, natrijum karboksimetilceloloza, poliakriiati, voskovi, polietilen-polioksipropllen-blok-polimeri, polietiien glikol i masnoća.

U skladu sa ovim pronalaskom farmaceutska jedinjenja mogu biti u obliku sterilnih injektibilnih preparacija, na primer sterilne injektibilne vodene masiinaste suspenzije. Ova suspenzija može se formulisati u skladu sa tehnikama poznatim u praksi koristeći prigodne agense za vlaženje i suspendovanje. Sterilne, injektibilne preparacije mogu takođe biti sterilni injektibilni rastvori ili suspenzije u ne-toksićnom parenteralno prihvatljivom razblaživaču ili rastvaraču, na primer, kao rastvor u 1,3-butendiolu. Među prihvatljivim nosačima i rastvaračima koji se mogu upotrebiti su voda, Ringer-ov rastvor i izotonični rastvor natrijum hlorida. Sem toga, kao rastvarać ili medijum za suspendovanje konvencionalno se koriste sterilna, fiksirana ulja. Za tu svrhu, može biti upotrebljeno bilo koje blago fiksno ulje uključujći sintetičke mono- ili di-gliceride. Masne kiseline kao što su oleinska kiselina i njeni glicerinski derivati korisne su u preparaciji injekcija, kao što su i prirodna farmaceutski prihvatljiva ulja, kao što je maslinovo ulje ili dabrovo ulje, posebno u njihovim polioksietiliranim verzijama.

Farmaceutska jedinjenja ovog pronalaska mogu se davati oralno. Ako se daju oralno, mogu se davati u oralno prihvatljivom obliku doze uključujući, ali bez ograničenja na, kapsule,

tablete, vodene suspenzije ili rastvore. U slučaju tableta za oralnu upotrebu, nosači koji se često koriste uključuju laktozu i kukuruzni škrob. Takođe se obično dodaju agensi za mazanje, kao što je magnezijum stearat. Za oralno davanje u obliku kapsula, korisni razblaživači uključuju laktozu i sušeni kukuruzni škrob. Kada su za oralnu upotrebu potrebni vodeni rastvori aktivni sastojak se kombinuje sa agensima za emulzifikovanje i suspendovanje. Ako je potrebno, mogu se takođe dodati određeni zaslađivaći i agensi za ukus i bojenje.

Određena jedinjenja za upotrebu u metodu predmetnog pronalaska su ona gde je formulisan antagonist u vezikulama kao što su jedinjenja koja sadrže lipozome. Lipozomi su vezikule formirane od strane amfipatičnih molekula kao što su polarni lipidi, na primer, fosfatidil holini, etanolamini i serini, sfingomielini, kardiolipini, plazmalogeni, fosfatidne kiseline i cerebiosidi. Lipozomi su formirani kada se pogodnim afipatičnim molekulima dozvoli da se rastvore u vodi iii vodenom rastvoru da se formiraju tečni kristali obično od višeslojne strukture sastavljene od mnogo dvostrukih slojeva razdvojenih jedan od drugog vodenim materijalima (takođe označenim kao sirovi lipozomi). Drugi tip lipozoma za koji je poznato da se sastoji od jednog dvostrukog sloja koji inkapsulira vodeni materijal označen je kao uniiamelarna vezikula, Ako su u vodenu fazu tokom bubrenja lipida uključeni materijali rastvorljivi u vodi oni bivaju zarobljeni u vodenom sloju između lipidnih dvosrukih slojeva.

Posebno pogodan metod pripremanja lipozomno formulisanih oblika predmetnih antagonista je metod opisan u EP-A-253,619, inkorporiran ovde sa referencom. U ovom metodu pojedinačni dvoslojni lipozomi koji sadrže inkapsulirane aktivne sastojke pripremljeni su rastvaranjem lipidne komponente u organskom medijumu, injektiranjem organskog rastvora lipidne komponente pod pritiskom u vodenu komponentu uz istovremeno mešanje organskih i vodenih komponenti sa homogenizatorom visoke brzine ili napravom za mešanje, nakon čega su lipozomi formirani spontano. Pojedinačni dvoslojni lipozomi koji sadrže inkapsulirani aktivni sastojak mogu biti upotrebljeni direktno ili mogu biti upotrebljeni u pogodnom farmaceutski prihvatljivom nosaču za površinsko davanje. Viskoznost lipozoma može biti povećana dodavanjem jednog ili više pogodnih agenasa zgušnjavanja kao što su, na primer, ksantum guma, hidrogsipropil celuloza, hidroksipropil metilceluloza i njihove mešavine. Vodena komponenta može se sastojati od same vode ili može sadržati elektrolite, puferske sisteme i druge sastojke, kao što su, na primer, prezervativi. Prigodni elektroliti koji mogu biti upotrebljeni uključuju soli metala kao Što su alkalni metali i alkalne zemljane metalne soli. Poželjne metalne soli su kalcijum hlorid, natrijum hlorid i kalijum hlorid. Koncentracija elektrolita može varirati od nula do 260 mM, poželjno od 5 mM do 160 mM. Vodena komponenta je stavljena u pogodnu posudu koja se može adaptirati da deluje na homogenizaciju delujući na veliku trubulenciju tokom injektiranja organske komponente. Homogenizacija dve komponente može biti obavljena unutar posude, ili alternativno, vodena i organska komponenta mogu biti injektirane odvojeno u napravu za mešanje koja je locirana izvan posude. U poslednjem slučaju, lipozomi su formirani u napravi za mešanje i zatim preneti u drugu posudu radi prikupljanja.

Organska komponenta sastoji se od prigodnih ne-toksičnih, farmaceutski prihvatljivih rastvarača kao što su, na primer, etanol, glicerol, propilen glikol i polietiien glikol i prigodnog fosfolipida koji j rastvorljiv u rastvaraču. Prigodni fosfolipidi koji se mogu upotrebiti uključuju, na primer, lecitin, fosfatidilholin, fosfatidilserin, fosfatidiletanol-amin, fosfatidilinozitol, lizofosfatidilholin i fosfatidi! glicerol. Mogu biti upotrebljeni drugi lipofilni aditivi s ciljem da selektivno modifikuju karakteristike lipozoma. Primeri takvih drugih aditiva uključuju sterilamine, fosfatidnu kiselinu, tokoferol, hoiesteroi i ekstrakte lanolina.

Sem toga, organskoj komponenti mogu se dodati drugi sastojci koji sprečavaju oksidaciju fosfolipida. Primeri takvih sastojaka uključuju tokoferol, butilirani hidroksianizol, askorbll palmitat i askorbii oleat. Prezervativi kao što je benzoična kiselina, metil paraben i propil paraben mogu takođe biti dodani.

Sem ovih gore-opisanih jedinjenja, mogu se upotrebiti prekrivači, npr., flasteri, zavoji, ovoji, gaze i tome slično, koji sadrže odgovarajuću količinu terapeutika anti-VLA antitela. U nekim slučajevima mogu se upotrebiti flasteri, zavoji, ovoji, gaze i tome slično koji su bili impregnirani sa površinskom formulacijom koja sadrži terapeutsku formulaciju.

Farmaceutska jedinjenja ovog pronalaska mogu takođe biti davana nazalnim aerosolom ili inhalacijom putem upotrebe nebulizera, inhalatorom suvog pudera Ili inhalacijom sa odmerenom dozom. Takva jedinjenja pripremljena su tehnikama dobro poznatim u farmaceutskim formulacijama i mogu biti pripremljena kao rastvori u fiziološkom rastvoru, koristeći benzil alkohol Ili druge prigodne prezervative, apsorpcione promotore da se pojača biodostupnost, fluorougljenike i/ili druge konvencionalne agense rastvaranja ili dispergovanja.

U skladu sa drugim oblikom, preparacije koje sadrže jedinjenje ovog pronalska mogu takođe sadržati dodatni agens odabran iz grupe koja se sastoji od kortikosteroida, antiinflamatorika, imunosupresanata, antimetabolika i imunomodulatora. Specifična jedinjenja unutar svake od ovih klasa može biti odabtrano bilo koje od onih koja su nabrojana pod odgovarajućim zajedničkim naslovom u "Sveobuhvatna medicinska hernija", Pergamon Press, Oxford, England, str. 970-986 (1990), čija su otkrića ovde inkorporirana sa referencom. Takođe su u tu grupu uključena jedinjenja kao što su teofilin, sulfasalazin i aminosalicilati (antiinflamatori); ciklosporin, FK-506 i rapamicin (Imunosupresant); cikiofosfamid i metotreksat (antimetabolici); steroidi (inhalaciont, oralni i površinski) i interferoni (imunomodulatori).

Doziranje i razmera doza jedinjenja pronalska koje efikasno produkuju željene efekte zavisiće od različitih faktora, kao što su priroda antagonista, veličina subjekta, cilj tretmana, priroda patologije koja se tretira, specifičnog upotrebljenog farmaceutskog jedinjenja i praćene lekara koji vrši tretman.

Korisni nivoi doze su između oko 0.001 i oko 100 mg/kg tetesne težine po danu, poželjno između oko 0.1 i oko 50 mg/kg telesne težine po danu aktivnog sastojka jedinjenja. Najpoželjnije, VLA-4 agens vezivanja, ako se daje derivat antitela ili antitelo u raponu od doze između oko 0.1 mg/kg telesne težine/danu i oko 20 m mg/kg telesne težine/danu, poželjno u rasponu između oko 0.1 mg/kg telesne težine/dan i oko 10 m mg/kg telesne težine/danu i u intervalima od svakih 1-14 dana. Za ne-antitelo ili agens koji se vezuje za male molekule, raspon doze treba preferentno da bude između količina moiarnog ekvivalenta do onih doza koje su za antitelo. Poželjno je da se antitelo jedinjenje daje u količini koja je efektivna da obezbedi nivoe antitela u plazmi od najmanje 1 mg/ml. Optimizacija doziranja može biti određena davanjem agensa vezivanja, praćenim procenjivanjem obavijanja integrin pozitivnih ćelija od strane agensa tokom vremena nakon davanja u određenoj doziin vivo.

Prisustvo datog agensa može biti detektovanoin vitro(iliex vivo)na osnovu nemogućnosti ili smanjene mogućnosti ćelija individue da vezuju isti agens koji je sam obeležen (npr., putem fluorohroma). Preferirana doza trebalo bi da produkuje detektabilno obavijanje velike većine integrin-pozitivnih ćelija. Poželjno, obavijanje je dokazano u slučaju homologa antitela za period od 1 -14 dana.

Osobe koje imaju prosečno iskustvo u praksi mogu lako testirati da li je antagonist pronalaska imao nameravani efekt. Od strane iskusnih praktičara biće upotrebljeni standardni testovi za klinički oporavak (npr., ispiranje i FACS skan za vezivanje antitela; poboljšanje u forsiranom vitalnom kapacitetu pluća) da se odredi efikasnost. Na primer, ćelije sadržane u uzorku tkiva pluća jedinke su ispitane na prisustvo agensain vitro(iliex vivo)koristeći drugi reagens da se detektuje dati agens. Na primer, to može biti antitelo obeleženo fluorohromom specifično za dati agens koji je zatim meren standardnom FACS (fluorscentno aktivirani ćelijski sorter) analizom. Alternativno, prisustvo datog agensa se detektujein vitro(iliex vivo)nemogućnošću iii smanjenom mogućnošću ćelija individue da vezuju isti agens koji je sam obeležen (npr., fluorohromom). Preferirana doza trebalo bi da produkuje detektabilno obavijanje velike većine integrin-pozitivnih ćelija. Poželjno, obavijanje je dokazano u slučaju homologa antitela za period od 1 -14 dana.

Primeri koji slede obezbeđeni su da ilustruju predmetni pronalazak i ne treba da budu protumačeni tako da ga ograničavaju.

PRIMER I: ŽIVOTINJSKI MODEL PLUĆNOG FIBROZISA

Mnogi dokazi dokumentovali su učešće inflamatornih ćelija i medijatora u plućnom fibrozisu u široko korišćenim bleomicin (BL)-glodarskim modelima. Ovaj model je privlačan zato što produkuje karakterističnu sliku fibrozisa sa mnogim komponentama humane bolesti, i zato što je BL-indukovani plućni fibrozis dobro prepoznat sporedni efekt u humanoj hemoterapiji. Intratrahealno nakapavanje BL kod glodara često je upotrebljavano za ispitivanje mehanizama fibrinogeneze i za skrining potencijalno željenih antifibrotičnih jedinjenja. I ako je inicijalni uzročnik BL-indukovane plućne toksičnosti pripisan generisanju kiseonika rektivne vrste (ROS) jednom kada se vezuje za gvožđe i DNK, proces koji vodi konačnoj manifestaciji plućne fibroze uključuje oslobađanje različitih inflamatornih medijatora (Giri i Wang, Comments Toxicol., 3: 145-176 (1989)). Patogeneza plućnih povreda BL-indukovanih inicijalno je prijavljivana kao edem, hemoragija i celularni infiltrat predominiran sa neurofilima i makrofagima. Akumulacija u višku inflamatornih leukocita u vaskularnom, intersticijalnom i alveolarnom prostoru pluća može izazvati vaskulame- i parenhimalne ozlede generisanjem ROS i proteolitičkih enzima. Neutrofili sadrže značajne količine mieloperoksidaze (MPO), koja može da oksidiše Cl- u hipohlornu kiselinu (HOCI) u reakciji sa H2Oti poznato je da neutrifilno-izvedena HOCI uzrokuje ćelijsku toksičnost. Makrofage i neutrofil izveden iz ROS-a su u stanju da stimulišu produkciju proinflamatornnih i fibrinogenih citoklnina koji posreduju pojačani fibroproliferativni odgovor (Phan i Kunkel., Exp. Lung. Res.,18: 29-43 (1992)). Sem veiike inflamatorne infiltracije ćelija, fibrotični proces je dalje okarakterisan hiperproliferativnim odgovorom za apsolutni porast u sadržaju kolagena u plućima i abnormalnosti u Infrastrukturnom pojavljivanju i prostornoj distribuciji tipova kolagena.

Primer 2:

Inhibicija fibrozisa sa antagonistom za integrin koji sadrži alfa4 subjedinicu

Materijali i metodi

Upotrebljeni su nespecifično kontrolno antitelo (1E6) i antitelo protiv integrina koji sadrže alfa4 subjedinicu (PS2). 1E6 je mišje anti-humano LFA3 (domen 1) lgG1 moniklonalno antitelo. Vidi Miller, Hochman, Meir, Tizard, Bixler, Rosa i VVallner (1992). J. Exp. Med. 178:211-222. PS/2 je produkovan metodom Miake i sar., J. Exp. Med., 173: 599-607 (1991).

Mužjaci C57BL/6 miševa hronično bez respiratornih bolesti težine 25-30 g su dobijeni od Charles Rlver Laboratory. Bleomicin sulfat (zaštitni znak Blenoxane) je poklonjen od strane Bristol Laboratories, (Svracuse, NY). L-[3,4-3H]prolin za obeležavanje prokolagen supstrata prolil hidroksilaze dobijen je iz NEN Life Science Products (Boston, MA). Z-fix, vodena puferizovani cink formalin, nabavljen je od Anatech, LTD (Battle Creek, Ml). Svi drugi reagensi bili su kvaliteta reagenasa ili više čistoće i dobijeni su iz standardnih komercijalnih izvora.

Tretman životinja

Po četiri miša su smeštena u kavez i održavana u skladu sa NIH-ovim uputstvima za dobro održavanje životinja. Miševi su ostavljeni da se aklimatizuju u objektu nedelju dana pre svih tretmana. Ciklusi 12 č/12 č svetio/mrak su održavani i imali su pristup vodi i Rodent Laboratorv Chowad libidum.Životinje su nasumično podeljene u četiri eksperimentalne grupe: 1) SA + SA; 2) BL + IE6; 3) BL + SA; i 4) BL + PS2. Miševi su intratrahealno IT injekcirani sa jednom dozom fiziološkog rastvora ili BL u 0.08 jedinica/100 mikrolitar/miš pod hilazin i ketamin anestezijom. Nakon IT nakapavanja miševi su primili IP injekciju i IE6, SA ili PSA (100 mikrograma u 0.2 ml/miš) tri puta nedeljno. Dvadeset i jedan dan nakpn BL nakapavanja miševi su žrtvovani pod anestezijom pentobarbitalom radi bronhoalveolarnog ispitivanja tečnosti (BALF), biohemijskih i histopatoloških analiza.

Preparacija BALF i tkiva pluća

Nakon anestezije otvorena je abdominalna šupljina sledećl eksangvinaciju silazne abdominalne aorte. Pluća su pripremljena ispiranjem pomoću kanuliranja traheje sa tupom iglom pričvršćenom na siringu. Ispiranje pruća je obavljeno sa 3 ml hladnog izotoničnog fiziološkog rastvora isporučenog u alikvotima od 1-ml. Alikvot BALF je obezbeđen za brojanje ukupnih ćelija. Preostali BALF je centrifugiran na I500g tokom 20 min na 4 stepena C, nastali supernatant je alikvotovan i zatim čuvan na -70°C.

Kasnije su zamrznuta pluća otopljena i homogenizovana u 0.1 M KCI, 0.02 M Tris-a (pH 7.6) sa Polvtron homogenizatorom (Brinkmann Instruments, Inc., VVestberv, NY). Homogenat je snažno izmešan ponovljenim inverzijama i zapremine konačnog homogenata (4-5 ml) su zabeležene. Homogenat je izdeljen u nekoliko alikvota i čuvan na -70°C za biohemijska merenja.

Određivanje ekvivalenta malondiadehida pluća i sadržaja hidroksiprolina

Plućni ekvivalent mainodialdehida je procenjen iz ukupne količine tiobarbiturnih kiselo-reagujućih produkata u nefrakcionisanom homogenatu metodom Ohkawa i sar., Anal. Biochem., 95:351 (1979). Za plućni hidrokslprolin ogled, 1 ml homogenata je istaložen sa 0.25 ml ledeno hladne 50% (w/v) trihlor sirćetne kiseline, centrifugiran i talog je hidrolizovan u 2 ml 6 N HCl tokom 18 sati na 110 stepeni C. Sadržaj hidroksiprolina izmeren je tehnikama opisanim od strane VVoessner, J.F., Arch. Biochem. Biophvs., 93: 440 (1961).

Određivanje aktivnosti proiil hidroksilaze ( EC 1, 14. 11. 2).

Pripremanje supstrata proiil hidroksilaze (prokolagen) i metod za ogled proiil hidroksilaze opisani su u Giri, S.N. i sar., Exp. Mol. Pathol. 39 317 (1983). Ukratko, sveže izolovane tibije iz deset dana starog embriona pileta obeležene su sa [3H1- prolinom u kulturnom medijumu bez prolina na 37 stepeni celzijusa tokom 6 časova. Nakon uklanjanja neinkorporiranog obeleživača ispiranjem, tkivo je homogenizovano i centrifugirano na 3000 g 20 minuta na 4 stepena C. Nastali supernatant je dijalizovan ekstenzivno da se ukloni neinkorporirani obeleživać. Obeleženi prokolagen supstrat je alikvotovan i čuvan na -70 stepeni C. Inkubaciona mešavina za enzimski ogled u ukupnoj zapremini od 2 ml sastojala se od fero amonijum sulfata (0.1 mmol/l), alfa-ketoglutarne kiseline (0.1 mmol/l), [3H]-prolin prokolagen (200,000 dpm), homogenat pluća (0.2 ml), askorbinska kiselina (0.5 mmol/l) i pufer TRIS-hiorovodonične kiseline (0.1 mol/l, pH 7.8). Rekcija dodavanja 0.2 ml 50% trihlorsirćetne kiseline nakon 30 minuta na 37 stepeni C u Dubnoff-ovom metaboličkom šejkeru. Tokom reakcije, obeležena voda je oslobođena u stohiometrijskoj proporciji u proiil hidroksilaciju i upotrebljena je da se izmeri enzimska aktivnost. Obeležena voda reakcionog sistema je razdvojena destilacijom u vakumu cele reakcione mešavine i izbrojana na radioaktivnost. Aktivnost enzima je izražena kao dpm obeležene vode oslobođene u celim plućima za 30 min.

Određivanje brojeva ćelija u BALF.

Ukupan broj ćelija u BALF određen je kao što je to opisano u Wang, Q. i sar., Lab. Invest., 67: 234-242 (1992). Ukupan broj leukocita u BALF je procenjen Coulter brojačem (model F, Coulter Electronics Inc., Hialeah, FL), prema uputstvu za upotrebu.

Ogled BALF proteina

Sadržaj proteina u supernatantu BALF određen je korisćenjem Bio-Rad ogleda za protein (Bio-Rad Laboratories, Richmon, CA) a goveđi serum albumin je upotrebljen kao standard.

Histopatološka i imunohistohemijska analiza

Na kraju eksperimenta tri do četiri životinje iz grupe svakog tretmana nasumice su odabrane za histopatološke i imunohistohemijske procene. Otvaranje abdominalne šupljine životinje je praćeno eksangvinacijom silazne abdominalne aorte. Odmah nakon toga, tkivo pluća pripremljeno je za histološku analizu kao što je opisano gore u Wang i sar. Nakon kanutacije traheja sa tupom iglom torakalna šupljina je otvorena i uklonji su i srce i plućaen bloc.Pluća su fiksirana sa Z-fix rastvorom preko traheje pri pritisku od 30 cm vode. Desni kranijalni i kaudalni lobusi i levi lobus su kasnije blokirani utisnuti u parafin, isečeni na odsečke od 7-mikrona i obojeni sa hematoksilinom i eozinom. Za imunohemijsko bojenje za alfaSMA, isečci tkiva pluća su deparafinizirani i endogene peroksidaze su blokirane. Isečci koji je trebalo da se oboje su zatim tretirani sa blokirajućim kozjim serumom tokom 30 min, i inkubirani 16 časova sa primarnim monoklonalnim anti-alfaSMA antitelom (Sigma Chemical Co., St Louis, MO).

Statistička analiza podataka

Podaci za životinje izraženi su na osnovu ukupnih pluća i izneseni su kao srednja vrednost ± standardna greška (SD). Podaci su upoređeni unutar četiri grupe koristeći dvostruku analizu varijanse (SIGMASTAT) i Student-Newman-Keuls metod. Vrednost P<0.05 smatrana je značajnom.

REZULTATI

Lipidna peroksidacija u plućima miša.

Sadržaj ekvivalenta malondialdehida u plućima kao indeksa lipidne peroksidacije određen je u različitim grupama miševa. Nakapavanja BL je značajno povećalo sadržaj ekvivalenta malondialdehida u plućima miša i kod BL+IE6 i kod BL+SA grupa u poređenju sa SA+SA i BL+PS2 grupama (podaci nisu prikazani). Tretman sa PS2 je efektivno blokirao peroksidaciju plućnog lipida indukovanu sa BL pošto sadržaj ekvivalenta malondialdehida u BL+PS2 grupi nije različit u odnosu na SA+SA grupu.

Sadržaj hidroksiprolina u plućima miša.

Plućni hidroksiprolin, ključni indeks nivoa kolagena u plućima, određen je za 4 grupe miševa. IT nakapavanje BL značajno je podiglo plućni nivo hidroksiprolina u BL+IE6 i BL+SA grupama do 185% i 205% od SA+SA kontrolne grupe, respektivno. BL-indukovani porast plućnog nivoa hidroksiprolina u BL+PS2 grupi je značajno smanjen za 35% tretmanom sa PS2 u poređenju sa BL+SA grupom. Plućni nivo hidroksiprolina u BL+TR grupi nije bio značajno viši od onog u IT SA kontroli (SA+SA) grupa.

Aktivnost proiil hidroksilaze u plućima miša.

Aktivnosti proiil hidroksilaze u plućima različitih grupa pokazale su da je BL sam značajno povećao aktivnost proiil hidroksilaze u plućima u BL+SA grupi do 207% od SA+SA kontrolne grupe. PS2 je značajno smanjio aktivnost proiil hidroksilaze podignute sa BL tretmanom u BL+SA grupi.

Ukupni brojevi ćelija u plućima miša

Ukupni brojevi ćelija u BALF različitih grupa 21 dana nakon IT nakapavanja fiziološkog rastvora ili BL pokazali su da je BL tretman povećao ukupne brojeve ćelija u BLAF iz BL+IE6 i BL+SA grupa u poređenju sa kontrolnom grupom sa fiziološkim rastvorom (SA+SA) grupa, i ako je samo BL+IE6 grupa imala značajno više nivoe od SA+SA grupe. BALF broj ćelija u BL+PS2* grupi nije bio različit od SA+SA grupe.

Sadržaj proteina u BALF

Sadržaj proteina u supernatantu BALF za 4 eksperimentalne grupe otkrio je da je IT nakapavanje BL značajno povećalo BALF protein svi BL tretiranih grupa u poređenju sa SA+SA grupom. Međutim, tretman sa PS2 u BL+PS2 grupi smanjio je porast u proteinima supernatanta BALF indukovan sa BL, i ako razlika nije bila statistički značajna.

Histopatologija pluća miša

Histopatološko ispitivanje pluća miša otkrilo je normalna plućna parenhimalna tkiva u SA+SA grupi. Međutim, pluća iz BL+IE6 i BL+SA grupa pokazala su neregularne alveolite i multifokalni intersticijalni fibrozis koji je sadržao akumulaciju ekstraceiulamih fibera. Piuća miša u tim grupama imala su zadebljalnu interafveolamu pregradu i inflamatorne ćelije u susednom vazdušnom prostoru. U poređenju sa BL+1E6 i BL+SA grupama, pluća iz BL+PS2 grupe imala su mnogo manje fibrotičnih lezija, i ako su neki lobusi još uvek pokazivali blag stepen intersticijalnog fibrozisa.

Imunohistohemijsko bojenje za alfaSMA u plućima miša.

Da se odredi akumulacija fibroblasta i ćelija nalik na fibroblasete kod miševa nakon tretmana sa BL, ispitali smo ekspresiju XSMA u tkivu pluća koristeći monoklonalno antitelo protiv XSMA. U kontrolnim plućima imunopozitivnost javila se u vaskularnim i bronhijalnim slojevima glatkih mišića. U BL i kontrolnom antitelu iii plućima tretiranim sa fiziološkim rastvorom bilo je ekstenzivno i intenzivno imunobojenje u fibrotičnim područjima, i u intersticijumu i pleuri. Međutim, BL i PS2 tretirana pluća pokazala su mnogo redukovanije imunobojenje od alfaSMA u poređenju sa BL+IE6 i BL+SA grupama.

Diskusija

IPF je bolest invaliditeta i slabo reaguje na današnju terapiju. U predmetnoj studiji, mi obezbeđujemo dokaze da je integrin koji sadrži alfa4 subjedinicu drugi mogući cilj u održavanju IPF. Opšte je prihvaćeno da su leukociti iz pluća uključeni u evoluciju plućne fibroze putem sekrecije ROS, fibrinogene citokineze i faktora rasta. Promet i stanje aktivacije leukocita su modifikovani različitim površinskim proteinima kao što su integrini. Jasno je da su interakcije ćelija-ćelija kao i ćelija-ECM interakcije kritične za patogenezu plućnog fibrozisa. Konstantni nalaz kod pacijenata sa aktivnim plućnim fibrozisom I životinjskim modelima fibrotičnih pućnih bolesti je povećana akumulacija brojeva imunih i inflamatornih ćelija u područjima koja prolaze kroz fibrozis.

VLA-4 je eksprimiran u svim limfocitima u cirkulaciji i vezuje se za adhezione molekule vaskulame ćelije (VCAM-1), član superfamillje Ig gena koji se eksprimira na endotelijalnim ćelijama aktiviranim citokininom i na matriks proteinu fibrinonektina Alfa4beta7 je eksprimiran na podskupu T i B ćelija, prirodnih ćelija ubica i eozinofilima. On se vezuje za mukozalni vaskulami adresin (MAdCAM-1), član Ig i mucinu-nalik familija adhezionih molekula, kao kao I za VCAM-1 i fibrinonektin. Ispitivanjain vitropokazala su da je VLA-4 interakcija sa VCAM-1 uključena u mononuklearne leukocite i adherenciju eozinofila za endotelijum i transendotelijalnu migraciju i smatra se da je alfa4beta7 primarno uključen u povlačenje leukocita u iimfoidna tkiva vezana sa crevom.

U predmetnom ispitivanju, tretman sa PS2 smanjio je povećanja ukupnih leukocita u BALF indukovana sa BL Smanjeni leukociti u plućima BL+PS2 miševa mogu biti odgovorni za smanjenje inflamatorne povrede i fibrozisa u plućima BL-tretiranih životinja. BL-indukovane ozlede pluća značajno su redukovane tretmanom sa PS2 što je indicirano merenjem peroksidacije plućnih lipida. Povećani kolagen u plućima bio je vezan sa povećanim brojevima fibroblasta u intersticijumu i samom alveolarnom prostoru. Mnoge od tih fibroblastima nalik ćelija su miofibroblasti koji Imaju različit fenotip koji uključuje ekspresiju alfaSMA, kontraktilnog proteina koji se često nalazi u glatkim mišićnim ćelijama i smatra se važnim u fibrinogenezi i zarastanju rana. Značajan nalaz predmetnog pronalaska bio je da PS2 tretman slabi proliferaciju miofibroblasta indukovanu sa BL Bez želje da se veže za bilo koju posebnu teoriju, davanje sa antitelom protiv alfa integrina može imati redukovan nivo faktora rasta u plućima oslobođenih infiltriranjem leukocita ili direktno pogoditi ponašanje miofibroblasta. U bilo kom od ovih slučajeva, redukovana proliferacija miofibroblasta može voditi opadanju akumulacije kolagena u plućima kod BL-tretiranih životinja u BL+PS2 grupi.

PRIMER 3:

Inhibicija fibrozisa sa antagonistom integrina koji ima afa 1 subjedinicu.

Tretman životinja

Mužjaci C57/BL6 miševa, težine 28-30 g, gajni su u plastičnim kavezima u grupama po 4 u objektu odobrenom od strane American Association for Accreditation of Laboratorv Animal Care. Životinje su ostavljene da se aklimatizuju jednu nedelju na laboratorijske uslove pre početka eksperimenata. Imali su pristup Rodent Laboratorv Chow 5001 (Purina Mills, Inc., St Louis, MO) i voduad libitumi gajeni su u sobi koja dobija filtriran vazduh i ima 12Č/12Č cikluse svetio mrak. Miševi su podeljeni u sledeće grupe:

Bleomicin sulfat je rastvoren u sterinom izotoničnom fiziološkom rastvoru bez pirogena neposredno pre intratrahealnog (IT) nakapavanja. Mševi u odgovarajućim grupama pod metoksifluranskom anestezijom primili su intratrahealno 100 u.l sterilnog izotonićnog rastvora ili 0.08 jedinica rastvora bleomicina u 100 pJ. Antitela (4mg/kg) data su intraperitonealnom injekcijom miševima u odgovarajućim grupama tri puta nedeljno tokom 21 dana nakon nakapavanja. Nakon toga životinje u svakoj grupi su ubijene prekomernom dozom natrijum pentobarbitala (100-125 mg/kg lp) I njihova pluća su procesovana za bronhoalveolarno ispiranje, biohemijske i histopatološke studije.

Određivanje ukupnog broja ćelija i nivoa proteinaubronhoalveolarnom ispiranju

Nakon kanulacije traheje, pluća su isprana sa 5 ml izotonićnog rastvora što je dalo pet alikvota od 1 ml. Fiziološki rastvor je dat sa slringom kroz kanulu, zid grudi je lagano masiran i tećnost odstranjena. Tećnost je centrifugirana na 1500 g 20 minuta na 4 stepena C i resuspendovana u izotoničnom fiziološkom rastvoru. Sadržaj proteina za supernatant iz primeraka bronhoalveolamog ispiranja je određen metodom Lowry i sar., J. Biol. Chem.1193:265-275 (1951), sa goveđim serum albuminom kao standardom. Ukupan broj ieukocita u ćelijama u suspenziji određen je u Coulter Counter (Coulter Electronics, Hiaieah, FL).

Određivanje hidroksipirolina

Pluća životinja upotrebljinih za biohemijske studije su perfuzovanain situpreko desne komore sa ledeno hladnim izotoničnim fiziološkim rastvorom da se ispere krv iz plućne vaskulature kroz otvor leve aurikule. Plućni lobusi brzo su disekovani, oslobođeni od ne-parenhimalnog tkiva, potopljeni u tečni azot za brzo zamrzavanje i zatim čuvani na -80°C. Zamrznuta pluća su kasnije otopljena i homogenizovana u 0.1 M KCI, 0.02 M tris puferu (pH 7.6) sa Polvtron homogenlzatorom. Sadržaj hidroksiprolina homogenata pluća, kao mera sadržaja kolagena, kvantifikovan je tehnikama Woessner-a, Arch. Biochem. Biophvs. 93: 440-447

(1961).

Histopatološka studija

Nakon ispiranja pluća, otvorena je torakalna duplja i sreće i pluća su ukljonjenien bioc.Pluća su nakapana sa 1% fiksativom glutaraldehid-paraformaldehidom u 0.12 M kakodilat puferu na 400 m Osm na 30 cm HzO pritiska. Pluća su fiksirana putem tog pritiska tokom dva sata i zatim čuvana u fiksativu sa pokrivenim trahejama. Pre utiskivanja, pluća su izolovana od srca i svih ne-plućnih tkiva tupom disekcijom i uklonjena. Blokovi tkiva su isečeni na najmanje dve sagitalne kriške (2-3mm debele) iz desnog kranijalnog, desnog kaudainog i levnog plućnog lobusa svakih pluća. Svaki blok je isečen na površinu od oko 1 cm<2>. Blokovi su dehidrirani u postupnim serijama etanola i potopljeni u parafin. Sekcije (5p debele) su isečene iz parafinskih blokova i obojene sa hematoksilinom i eozinom radi histološke procene.

Analiza podataka)interpretacija

Podaci su analizirani u terminima srednjih vrednosti sa standardnom devijacijom i greškama srednje vrednosti. Studentov t-test, distribucija hi-kvadrata, koeficijent korelacije, analiza varijanse (ANOVA) i test višestrukih poređenja primenjeni su da se procent značajnost razlika između kontrole i tretman grupa koristeći statistički paket za računar (SAS/STAT vodič, 6. izd. Carv, N.C. str. 183-260 (1985)).

Rezultati

U ovoj studiji testirali smo hipotezu da neutralisanje antitela za integrin a1(3l (antia1(3l) redukuje flbrizis plućain vivoindukovan sa bleomicinom (BL). Mužjaci C57/BL6 miševa su injekcirani intratrahealno (IT) sa fiziološkim rastvorom (SA) iii BL na 0.08 U u 0.1 ml praćenim intraperitonealnom (IP) injekcijom antitela (100 pg u 0.2 ml) tri puta nedeljno. Dvadeset jednog dana nakon IT nakapavanja miševi su ubijeni radi bronhoaiveoiarnog ispiranja (BAL), bihemijske i histopatološke analize.

Histopatološko Ispitivanje pluća

Očekivali smo da miševi tretirani sa fiziološkim rastvorom i kontrolnim IgG nemaju vidljive lezije i da pokazuju intraalveoiarne pregrade sa normalnom tankom pojavom. Nasuprot tome, miševi tretirani sa bleomicinom i kontrolnim IgG imaće lezije koje variraju od multifokalnih lokacija u proksimalnoj acini do difuzne distribucije koja povremeno uključuje pleuru. Mi očekujemo da pluća miševa tretiranih sa bleomicinom i anti-alfal integrin antitelima budu više nalik na ona iz grupe B (gore). Očekujemo da životinje grupe D pokazuju samo ograničen broj fibrotičnih lezija sa blagim multifaktorijalnim septalnim zadebljavanjem i malim agregatima mononuktearnih ćelija.

I ako je gore pomenuti pronalazak opisan u nekim detaljima na način ilustrovanja i primera sa ciljem razjašnjavanja i razumevanja, biće očigledno onima sa iskustvom u praksi, da će određene promene i modifikacije biti praktikovane. Prema tome, opisi i primeri koji su ocrtani podnetim zahtevima ne treba da se tumače kao ograničavajući za obim pronalaska,.

Claims

1. Upotreba preparata koji sadrži homoiog antitela koji je antagonist interakciji između integrina koji nosi alfa 4 podjedinicu i liganda za integrin koji nosi alfa 4 podjedinicu za pripremu farmaceutskog preparata za lečenje fibroze kod pacijenta.

2. Upotreba prema zahtevu 1, naznačena time što je fibroza fibroza nekog unutrašnjeg organa.

3. Upotreba prema zahtevu 2, naznačena time što je taj unutrašnji organ jetra, pluća, bubreg, krvni sudovi srca ili gastrointestinalni trakt.

4. Upotreba prema zahtevu 1, naznačena time što pacijent pati od plućne fibroze, mijelofibroze, ciroze jetre, mezangijalnog proliferativnog glomerulonefritisa, progresivnog glomerulonefritisa, dijabetske nefropatije, renalne intersticijalne fibroze, ili nefropatije povezane sa HIV-om.

5. Upotreba prema zahtevu 1, naznačena time što je fibroza dermalna fibroza.

6. Upotreba prema zahtevu 5, naznačena time što pacijent pati od skleroderme, morfee, keloida, hipertrofičnih ožiljaka, familijarnog kutanog kolagenoma ili mladeža vezivnog tkiva tipa kolagena.

7. Upotreba prema zahtevu 1, naznačena time što je fibroza fibroza oka.

8. Upotreba prema zahtevu 7, naznačena time što pacijent pati od dijabetske retinopatije, postoperativnih ožiljaka ili proliferativne vitreoretinopatije.

9. Upotreba prema bilo kom od prethodnih zahteva 1 do 8, naznačena time što preparat sadrži homoiog anti-alfa4 antitela.

10. Upotreba prema bilo kom od prethodnih zahteva, naznačena time što je homoiog antitela homoiog humanizovanog, humanog ili hiraernog antitela.

11. Upotreba prema bilo kom od prethodnih zahteva od 1 do 10, naznačena time što je farmaceutski preparat prilagođen tako da se primenjuje: a) pri dozi od 0,1 mg/kg dnevno do 10 mg/kg dnevno; b) u periodu primene od jednog do četrnaest dana; i c) u količini koja je dovoljna da održava koncentraciju homologa antitela u plazmi od 1 mg/ml ili većoj.

12. Upotreba prema bilo kom od prethodnih zahteva od 1 do 11, naznačena time što je homoiog antitela humanizovano mišje 21-6 antitelo.

13. Upotreba prema bilo kom od prethodnih zahteva od 1 do 12, naznačena time što je pacijent čovek.