ES2244010T3

ES2244010T3 - Metodos y composiciones para el tratamiento del dolor.

Info

Publication number: ES2244010T3
Application number: ES97949809T
Authority: ES
Inventors: Andrew A. Young
Original assignee: Amylin Pharmaceuticals LLC
Current assignee: Amylin Pharmaceuticals LLC
Priority date: 1996-12-16
Filing date: 1997-12-12
Publication date: 2005-12-01
Anticipated expiration: 2017-12-12
Also published as: CA2274967C; AU727688B2; ZA9711255B; EP0964695A1; DE69733575T2; DE69733575D1; CA2274967A1; EP0964695B1; AU7735698A; EP0964695A4; ATE297753T1; WO1998026796A1; US5677279A

Abstract

SE PRESENTAN PROCEDIMIENTOS PARA EL TRATAMIENTO DEL DOLOR QUE COMPRENDEN LA ADMINISTRACION DE UNA CANTIDAD TERAPEUTICAMENTE EFECTIVA DE UNA AMILINA O DE UN AGONISTA DE LA AMILINA SOLA O EN CONJUNCION CON UN ANALGESICO NARCOTICO, POR EJEMPLO MORFINA O PENTAZOCINA.

Description

Métodos y composiciones para el tratamiento del dolor.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a la fabricación de medicamentos para el tratamiento del dolor. Más particularmente, la invención está relacionada con el empleo de la amilina o de un análogo agonista de la amilina en la fabricación de medicamentos para el tratamiento del dolor, tanto solos como en combinación con un analgésico opiáceo u otro agente para aliviar el dolor.

Antecedentes La amilina

La estructura y la biología de la amilina han sido estudiadas previamente. Véase, por ejemplo, Rink et al., Trends in Pharmaceutical Sciences 14: 113 - 118 (1993) ; Gaeta y Rink, Med. Chem. Res., 3: 483 - 490 (1994); y, Pittner et al., J. Cell. Biochem., 55S: 19 - 28 (1994). La amilina es una hormona proteica de 37 aminoácidos. Se aisló, purificó y caracterizó químicamente como el componente mayoritario de los depósitos amiloides de los islotes de pancreasas en humanos diabéticos tipo II fallecidos (Cooper et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84: 8628 - 8632 (1987)). La molécula de amilina presenta dos importantes modificaciones post-traduccionales: el extremo C-terminal es amidado, y las cisteínas de las posiciones 2 y 7 se encuentran enlazadas entre sí para formar un bucle N-terminal. La secuencia del marco de lectura abierto del gen de la amilina humana muestra la presencia de la señal de escisión proteolítica de los aminoácidos dibásicos Lys - Arg, previo al codón N-terminal para la Lys, y la Gly previa a la señal proteolítica de Lys - Arg en la posición C-terminal, una secuencia típica de amidación por parte de una enzima de amidación proteica, PAM (Cooper et al., Biochem. Biophys. Acta, 1014: 247 - 258 (1989)). La amilina es el tema de la patente U. S. nº 5.367.052, publicada el 22 de noviembre de 1995.

En la diabetes de tipo I; se ha demostrado que la amilina era deficiente y se ha propuesto la sustitución combinada con insulina como tratamiento preferible al tratamiento con insulina sola en todas las formas de diabetes. El empleo de la amilina y de otros agonistas de la amilina para el tratamiento de la diabetes mellitus es el tema de la patente U. S. nº 5.175.145, publicada el 29 de diciembre de 1992. Las composiciones farmacéuticas que contiene amilina y amilina más insulina se describen en la patente U. S. nº 5.124.314, publicada el 23 de junio de 1992.

Se ha observado que una acción en exceso de la amilina imita las características clave en la diabetes de tipo II y se ha propuesto el bloqueo de la amilina como una nueva estrategia terapéutica. En la patente U. S. nº 5.266.561, publicada el 30 de noviembre de 1993, se ha dado a conocer que la amilina produce la reducción la incorporación tanto basal como estimulada por la insulina de la glucosa marcada en el glucógeno en el músculo. También se dio a conocer que este último efecto estaba compartido con el péptido relacionado con el gen de la calcitonina (CGRP) (véase también Leighton y Cooper, Nature, 335: 632 - 635 (1988). La amilina y el CGRP resultaron aproximadamente equipotentes, presentando una actividad marcada a unos valores comprendidos entre 1 y 10 nM. También se ha publicado que la amilina reduce la absorción de la glucosa estimulada por la insulina en el músculo esquelético y reduce el contenido en glucógeno (Young et al., Amer. J. Physiol., 259: 45746-1 (1990)). Se da a conocer el tratamiento de la diabetes de tipo II y la resistencia a la insulina con antagonistas de la amilina.

La estructura químicamente de la amilina es idéntica a la de los CGRP en aproximadamente un 50%, y también a proteínas de 37 aminoácidos que son neurotransmisores generalizados que desempeñan diversas acciones biológicas potentes, entre ellas la vasodilatación. La amilina y el CGRP comparten el puente disulfuro ^{2}Cys - ^{7}Cys y la amida C-terminal, siendo ambos esenciales para el desarrollo de una actividad biológica completa (Cooper et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 857763 - 7766 (1988)). También se ha publicado que la amilina puede ser un miembro de una familia de péptidos relacionados que comprende el CGRP, la insulina, los factores de crecimiento insulinoides y las relaxinas y que comparten una herencia genética común (Cooper et al., Prog. Growth Factor Research, 1: 99 - 105 (1989)).

La amilina se sintetiza básicamente en las células beta pancreáticas y se secreta como respuesta a los estímulos de nutrientes tales como la glucosa y la arginina. Los estudios realizados con estirpes de células beta tumorales clonadas (Moore et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 179(1) (1991)), islotes aislados (Kanatsuka et al., FEBS Letts., 259(1), 199 - 201 (1989)) y pancreasas de rata perfundidas (Ogawa et al., J. Clin. Invest., 85: 973-976 (1990) han demostrado que impulsos cortos, de 10 a 20 minutos, de secretagogos de nutrientes tales como la glucosa y la arginina, estimulan la liberación de la amilina así como de la insulina. La relación molar amilina : insulina de las proteínas secretadas varía entre las preparaciones desde aproximadamente 0,01 hasta 0,4, pero parece que no varía mucho en cualquier otra preparación. Sin embargo, durante la estimulación prolongada por un nivel de glucosa elevado, la relación amilina : insulina puede aumentar progresivamente (Gedulin et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 180(1): 788 – 789 (1991)). De este modo, la amilina y la insulina no se secretan siempre en una proporción constante.

Se ha descubierto y publicado que determinadas acciones de la amilina son parecidas a las acciones no metabólicas del CGRP y de la calcitonina; sin embargo, las acciones metabólicas de la amilina descubiertas durante las investigaciones de esta proteína recién identificada ponen de manifiesto su papel biológico primario. Al menos algunas de dichas acciones metabólicas son imitadas por el CGRP (véase, por ejemplo, Leighton et al., Nature, 335: 632 - 635 (1988); Molina et al., Diabetes, 39: 260 - 265 (1990)).

La primera acción descubierta de la amilina fue la reducción de la incorporación de la glucosa estimulada por la insulina en el glucógeno en el músculo esquelético de rata (Leighton et al., Nature, 335: 632 - 635 (1988)); el músculo se hizo "resistente a la insulina". Los estudios posteriores con el músculo sóleo de rata ex vivo e in vivo han indicado que la amilina reduce la actividad de la glucógeno sintasa, provoca la conversión de la glucógeno fosforilasa a partir de la forma inactiva b a la forma activa a, provoca la pérdida neta de glucógeno (en presencia o ausencia de insulina), aumenta los niveles de glucosa-6-fosfato, y puede aumentar la producción de lactato (véase, por ejemplo, Deems et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 181(1): 116 - 120 (1991); Young et al., FEBS Letts,. 281 (1, 2): 149 - 151 (1991)). La amilina no afecta el transporte de la glucosa por sí misma (por ejemplo, Pittner et al., FEBS Letts., 365(1): 98 - 100 (1995)). Los estudios sobre las relaciones de dosis y respuesta de la amilina y la insulina demuestran que la amilina actúa como antagonista de la insulina de tipo no competitivo o funcional en el músculo esquelético (Young et al., Am. J. Physiol., 263(2): E274 - E281 (1992)). No hay indicios de que la amilina interfiera con la unión de la insulina con sus receptores, o la posterior activación receptor de la insulina tirosina cinasa (Follett et al., Clinical Research, 39(1): 39A (1991)); Koopmans et al., Diabetologia, 34: 218 - 224 (1991)).

Se cree que la amilina actúa mediante receptores presentes en las membranas plasmáticas. Los estudios sobre la amilina y el CGRP, y el efecto de antagonistas selectivos, sugieren que la amilina actúa vía su propio receptor (Beamon et al., Br. J. Phamacol., 115 (5): 713 - 715 (1995); Wang et al., FEBS Letts., 219: 195 - 198 (1991 b)), en contra de las conclusiones de otros investigadores según las cuales la amilina podría actuar primariamente en los receptores del CGRP (por ejemplo, Chantry et al., Biochem. J., 277: 139 - 143 (1991)); Galeazza et al., Peptides, 12: 585 - 591 (1991)); Zhu et al. , Biochem. Biophys. Res. Commun., 177(2): 771 - 776 (1991)). Los receptores de la amilina y su utilización en métodos de detección sistemática y análisis de los compuestos agonistas y antagonistas de la amilina se describen en la patente U. S. 5.264.372 publicada el 23 de noviembre de 1993.

Mientras que la amilina presenta unos marcados efectos en el metabolismo calórico hepático in vivo, no hay un acuerdo general en cuales son las acciones de la amilina que se ven en hepatocitos aislados o en hígado perfundido Los datos disponibles no respaldan la idea de que la amilina provoque la glucogenólisis hepática, es decir, no actúa como el glucagón (por ejemplo, Stephens et al., Diabetes, 40: 395 - 400 (1991); Gomez-Foix et al., Biochem J., 276: 607 - 610 (1991)). Se ha sugerido que la amilina podría actuar en el hígado provocando la conversión del lactato en glucógeno y aumentar la cantidad de glucosa disponible para ser liberada por el glucagón (véase Roden et al., Diabetologia, 35: 116 - 120 (1992)). De este modo, la amilina podría actuar como una pareja anabólica de la insulina en el hígado, en contraste con su acción catabólica en el músculo.

En los adipocitos, ocurre la acción contraria a la que tiene lugar en el músculo y la amilina no presenta acción detectable alguna en la absorción de la glucosa estimulada por la insulina, la incorporación en los triglicéridos, la producción de CO_{2} (Cooper et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 85: 7763 - 7766 (1988)), lipólisis estimulada por la adrenalina, o inhibición de la hidrólisis por la insulina (Lupien y Young, "Diabetes Nutrition and Metabolism - Clinical and Experimental ("Diabetes, nutrición y metabolismo - clínica y experimental"," Vol. 6(1), página 1318 (febrero de 1993)). De este modo la amilina ejerce unos efectos específicos en función de cuál sea el tejido, con una acción directa en el músculo esquelético, efectos notablemente indirectos (mediante el suministro del sustrato) y quizá directos en el hígado, mientras que los adipocitos se manifiestan como "ciegos" ante la presencia o ausencia de la amilina.

También se ha publicado que la amilina puede ejercer unos efectos notables en la secreción de la insulina. En islotes aislados (Ohsawa et al., Biochem. Biophys, Res. Commun., 160(2): 961 - 967 (1989)), en el páncreas perfundido (Silvestre et al., Reg. Pept., 31: 23 - 31 (1991)), y en la rata sana (Young et al., Mol. Cell. Endocrinol., 84: R1 - R5. (1992)), algunos experimentos indican que la amilina inhibe la secreción de la insulina. Otros investigadores, sin embargo, han sido incapaces de detectar efectos de la amilina en células \beta aisladas, en los islotes aislados, en el animal entero (véase Broderick et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 177: 932 - 938 (1991) y referencias en el mismo).

La amilina o los agonistas de la amilina potencialmente inhiben el vaciado gástrico en las ratas (Young et al., Diabetologia 38(6): 642 - 648 (1995)), perros (Brown et al., Diabetes 43 (supl. 1): 172A (1994)) y humanos (Macdonald et al., Diabetologia 38 (supl. 1): A32 (sumario 118) (1995)). Se ha publicado que el vaciado gástrico se ve acelerado en las ratas BB diabéticas de tipo I deficientes en amilina (Young et al., Diabetologia, supra; Nowak et al., J. Lab. Clin. Med., 123(1):110 - 6 (1994)) y en ratas tratadas con el antagonista selectivo de la amilina, AC187 (Gedulin et al., Diabetologia, 38 (supl. 1): A244 (1995)). El efecto de la amilina en el vaciado gástrico es fisiológico (funcional a las concentraciones en las que circula normalmente).

Las acciones no metabólicas de la amilina comprenden el efecto vasodilatador en el que puede participar interactuando con los receptores vasculares del CGRP. Ensayos in vivo publicados sugieren que la amilina es al menos aproximadamente entre 100 y 1000 veces menos potente que el CGRP como vasodilatador (Brain et al., Eur. J. Pharmacol., 183: 2221 (1990); Wang et al., FEBS Letts., 291: 195 - 198 (1991)). Se ha publicado el efecto de la amilina en las acciones hemodinámicas regionales, que comprenden el flujo sanguíneo renal, en ratas conscientes (Gardiner et al., Diabetes, 40: 948 - 951 (1991)). Los autores señalaron que la venoclisis de la amilina de rata se encontraba asociada con una mayor vasodilatación renal y con una menor vasoconstricción mesentérica que la que se observa con la venoclisis del \alpha-CGRP humano. Llegaron a la conclusión de que, al provocar la hiperemia renal hasta un mayor nivel que el alcanzado con el \alpha-CGRP, la amilina de la rata puede provocar una estimulación menos notable en el sistema renino-angiotensínico, y de este modo, menor vasoconstricción secundaria en la que interviene la angiotensina II. También se señaló, sin embargo, que durante la co-venoclisis de \alpha-^{8-37}CGRP humano y amilina de rata, se pusieron de manifiesto vasoconstricciones renales y mesentéricas, supuestamente debidas a los efectos vasoconstrictores sin oposición de la angiotensina II, y que este descubrimiento es similar al observado durante la co-venoclisis de A-CGRP humano y de \alpha-^{8-37}CGRP humano (íd. en 951).

Se ha publicado que al realizar la perfusión en el encéfalo, o al administrarla periféricamente, la amilina suprimía la ingesta alimenticia, por ejemplo, Chance et al., Brain Res., 539: 352 - 354 (1991)), una acción compartida con el CGRP y la calcitonina. Se desconocen las concentraciones efectivas en las células que interviene en esta acción. También se ha publicado que la amilina puede tener efectos en los osteoclastos tanto aislados en los que provocan la inactividad celular, como in vivo de los que se ha publicado que la amilina disminuye el calcio en plasma hasta un 20% en ratas, en conejos y en pacientes humanos con la enfermedad de Paget (véase, por ejemplo, Zaidi et al., Trends in. Endocrinal. and Metab., 4: 255 - 259 (1993)). A partir de los datos disponibles, la amilina parece ser entre 10 y 30 veces menos potente que la calcitonina humana para dichas acciones. De un modo interesante, se publicó que la amilina parecía incrementar la producción de AMPc en los osteoclastos y en cambio no aumentaba el Ca^{2+} del citosol, mientras que la calcitonina provoca ambos efectos (Alam et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 179(1): 134 - 139 (1991). Se sugirió, aunque no se demostró, que la calcitonina podría actuar vía dos tipos de receptores y que la amilina podría interactuar con uno de ellos.

También se ha descubierto que, sorprendentemente en vista de su vasodilatación renal y otras propiedades previamente descritas, la amilina aumenta notablemente la actividad de la renina en plasma en ratas sanas cuando se les administra por vía subcutánea de un modo que evite cualquier perturbación de la tensión arterial. Éste último aspecto resulta importante ya que una tensión arterial disminuida constituye un fuerte estímulo para la liberación de la renina. Los antagonistas de la amilina, tales como los antagonistas del receptor de la amilina, comprendiendo aquellos que son selectivos para los receptores de la amilina en comparación con los receptores del CGRP y/o de la calcitonina, pueden utilizarse para bloquear el aumento de la actividad de la renina en plasma provocada por la amilina. El empleo de antagonistas de la amilina para tratar los trastornos relacionados con la renina se describe en la patente U. S. nº 5.376.638 publicada el 27 de diciembre de 1994.

En humanos normales, se han publicado unos niveles de amilina en ayunas que varían entre 1 y 10 pM y unos niveles pospandriales o post-glucosa entre 5 y 20 pM (por ejemplo, (Hartter et al., Diabetologia, 34: 52 - 54 (1991); Sanke et al., Diabetologia, 34: 129 - 132 (1991); Koda et al., The Lancet, 339: 1179 - 1180 (1992)). En pacientes obesos, resistentes a la insulina, los niveles pospandriales de amilina pueden llegar a valores superiores, alcanzando hasta aproximadamente 50 pM. Para poder comparar, los valores en ayunas y pospandriales de la insulina se encuentran entre 20 y 50 pM, y entre 100 y 300 pM respectivamente en personas sanas, con niveles quizás 3 o 4 veces superiores en las personas resistentes a la insulina. En la diabetes de tipo I, en la que se destruyen las células \beta, los niveles de amilina se encuentran en los mismos niveles o por debajo de los de detección y no aumentan como respuesta a la glucosa (Koda et al., The Lancet, 339: 1179 - 1180 (1992)). Se ha publicado que en ratones y ratas normales, los niveles basales de amilina se encuentran entre 30 y 100 pM, mientras que se han determinado valores de hasta 600 pM en determinadas cepas de roedores diabéticos resistentes a la insulina (por ejemplo, Huang et al., Hypertension, 19: I-101-I-109 (1991); Gill et al., Life Sciences, 48: 703 - 710 (1991)).

Dolor

Según la Asociación Internacional para el Estudio del Dolor (International Association for the study of Pain) el dolor se define como "una experiencia sensorial y emocional desagradable asociada a lesiones tisulares reales o potenciales, o descrita en los términos de dichas lesiones". Merskey, Pain 6: 249 (1979). Muchos trastornos y procedimientos médicos se caracterizan por la sensación de dolor que experimenta el paciente de distintas maneras. Por ejemplo, durante y después de las intervenciones quirúrgicas, la manifestación del dolor es elevada. Lo mismo se puede decir en relación con muchos trastornos que implican traumatismos, tales como las quemaduras. El dolor también se encuentra presente en la mayoría de inflamaciones y asociado a trastornos relacionados con los tumores o con el tratamiento de los mismos. Se han utilizado distintas terapias para conseguir un efecto analgésico. Fármacos tales como los analgésicos opiáceos, por ejemplo, la morfina, se utilizan para disminuir el dolor intenso, como por ejemplo el asociado a intervenciones quirúrgicas. Otros productos farmacéuticos empleados para reducir el dolor son los sedantes, que comprenden los barbitúricos y las benzodiacepinas. Muchos de dichos fármacos presentan efectos secundarios tales como una acción depresora de la respiración y la circulación. Bastantes de dichos fármacos también pueden producir efectos hipnóticos. Los fármacos no esteroides también se utilizan en el tratamiento del dolor y de las inflamaciones, y actúan evitando la síntesis de prostaglandinas.

Los dolores crónicos o incurables, tales como puede ocurrir en enfermedades tales los como trastornos óseos degenerativos y el cáncer, significan una situación debilitante que se trata con diversos analgésicos, por ejemplo, los compuestos analgésicos opiáceos tales como la morfina. El dolor crónico también puede durar más tiempo que la aparición de cualquier causa física conocida o sospechada. Puede producirse mucho tiempo después de una lesión o enfermedad conocida o puede producirse sin ningún tipo de causa física conocida. También puede ir acompañada de patologías tisulares conocidas, tales como la inflamación crónica que se produce en determinados tipos de artritis.

En general, las vías encefálicas que gobiernan la percepción del dolor se comprenden de un modo incompleto. Se ha publicado con un cierto detalle sobre las conexiones sinápticas sensoriales aferentes que se dirigen a la médula espinal, llamadas "vías nociceptivas". En la primera etapa de estas vías, las fibras A y C que se extienden desde Las zonas periféricas hasta la médula espinal transportan las señales nociceptivas. Las uniones polisinápticas del asta posterior de la médula espinal se ven implicadas en la trasmisión y modulación de las sensaciones de dolor a diversas regiones del encéfalo, entre ellas la región gris periacueductal. McGeer et al., Molecular Neurobiology of the Mammalian Brain ("Neurobiología molecular del encéfalo de los mamíferos"), Plenum Press, New York, 1987. La analgesia, o la ausencia o reducción del dolor como respuesta a un estímulo que normalmente sería dolorosa, puede efectuarse directamente disminuyendo la transmisión a lo largo de dichas vías nociceptivas. Se cree que los opiáceos analgésicos actúan imitando los efectos de las neuronas que contienen péptidos de endorfina o de encefalina, que terminan en la zona presináptica de las fibras terminales C o A y que, cuando se excitan, inhiben la liberación de la sustancia P: Las vías que descienden desde el encéfalo también son inhibidoras de la excitación de las fibras C y A.

Los analgésicos opiáceos, es decir, las sustancias opioides como la morfina, al mismo tiempo que resultan efectivos en la producción de la analgesia, pueden provocar tolerancia en el paciente, de manera que se requiere incrementar la dosificación para conseguir un efecto satisfactorio. A dosis elevadas, dichos compuestos producen efectos secundarios, entre ellos la depresión respiratoria, que puede poner en peligro la vida, y náuseas y vómitos, que son desagradables y que pueden poner en peligro la vida del paciente si éste se encuentra sedado. Dichos compuestos también pueden producir una dependencia física en el paciente. La dependencia está relacionada con la dosis de analgésico opiáceo que se toma y con el período de tiempo durante el cual se toma. Por lo tanto, los compuestos que sirven tanto como sustitutivos del tratamiento con el analgésico opiáceo, así como los compuestos complementarios a dicho tratamiento, son
útiles en el tratamiento del dolor, particularmente el dolor de tipo crónico, y serán de un valor significativo para ello.

Azarov et al, (Pharmacology, Biochemistry and Behaviour, V. 52, p. 595 - 599, 1995) publicaron los efectos del péptido relacionado con el gen de la calcitonina en los efectos agudos y crónicos de la morfina. Encontraron que el CGRP suprimí el desarrollo de la tolerancia rápida a la morfina pero no realizaba acción alguna en el desarrollo de la tolerancia crónica a la morfina.

WO 96/32958 da a conocer métodos para el tratamiento del dolor incurable mediante la administración de calcitonina.

Ménard et al (J. Neuroscience, 1996, Vol. 16, p. 2342 - 2350) publicaron que el antagonista de la recepción del CGRP prevenía el desarrollo de la tolerancia a la analgesia con morfina espinal.

Resumen de la invención

Hemos descubierto ahora, que resulta sorprendente en vista de las publicaciones en el sentido contrario por parte de otros autores (véase por ejemplo Boual et al supra), que la amilina y los agonistas de la amilina por ejemplo, el análogo agonista de la amilina ^{25,28,29}Pro-h-amilina (conocida como "pramlintida" y al que previamente nos hemos referido como "AC-0137"), pueden utilizarse para la analgesia en mamíferos.

La presente invención se basa en métodos nuevos para el tratamiento del dolor que comprenden la administración de la amilina o de un agonista de la amilina, por ejemplo, el análogo agonista de la amilina ^{25,28,29}Pro-h-amilina siendo el agonista distinto de la calcitonina. Por "calcitonina" se entiende la hormona peptídica humana calcitonina y las variaciones de la misma de distintas especies, tales como la calcitonina de rata, la calcitonina de salmón y la calcitonina de anguila (comprendiendo la calcitonina de anguila aminosubérica).

En un aspecto, la invención está orientada al empleo de la amilina o de un análogo de la amilina que actúa como agonista de la amilina en la fabricación de un medicamento para utilizarlo en un método de tratamiento del dolor en los mamíferos. Específicamente puede utilizarse una cantidad analgésica efectiva, que es la cantidad efectiva para reducir o eliminar el dolor como respuesta a un estímulo que normalmente sería doloroso y que de este modo comprende un efecto analgésico completo (ausencia de dolor) así como al que a veces se refiere como efecto "hipoalgésico" o reducción del dolor.

El término "amilina" se entiende comprendiendo los compuestos tales como los definidos en la patente U. S. nº 5.234.906 publicada el 10 de agosto de 1993, para "composiciones hiperglucémicas". Por ejemplo, comprende la hormona peptídica humana conocida como amilina y secretada por las células \beta del páncreas, y las variaciones de la misma en distintas especies.

El término "agonista de la amilina" también resulta conocido en la especialidad, y se refiere a un compuesto que imita los efectos de la amilina. Un agonista de la amilina puede ser un compuesto peptídico o no peptídico, y comprende los análogos agonistas de la amilina.

El término "análogo agonista de la amilina" se entiende como referido a los derivados de la familia de una amilina que actúan como agonistas de la amilina, normalmente, se cree actualmente, gracias al enlace o de otro modo la interacción directa o indirectamente con un receptor de la amilina u otro receptor o receptores con los que la propia amilina puede interactuar para provocar una respuesta biológica. Los análogos agonistas de la amilina útiles comprenden aquellos identificados en la Solicitud Internacional, WPI Acc. nº 93-182488/22, titulada "New Amylin Agonist Peptides Used for Treatment and Prevention of Hypoglycemia and Diabetes Mellitus ("Nuevos péptidos agonistas de la amilina utilizados en el tratamiento y prevención de la hipoglucemia y la diabetes mellitus")".

El agonista de la amilina utilizado en la invención es un análogo agonista de la amilina, preferentemente, la ^{25,28,29}Pro-h-amilina. En otras formas de realización preferidas, también se administra un analgésico opiáceo. Por "analgésicos opiáceos" se entienden los derivados sintéticos y semisintéticos de los alcaloides opiáceos naturales. Entre los ejemplos de dichos componente encontramos la morfina, la pentazocina, la hidromorfona, la oximorfona, el levorfanol, la metadona, la petidina, la anileridina, la alfaprodina, el fentanol, la codeína, la oxicodona y la hidrocodona. Los analgésicos opiáceos preferidos comprenden la morfina y la pentazocina.

En otro aspecto, la invención está orientada al empleo de la amilina o de un análogo de la amilina que actúa como agonista de la amilina en la fabricación de un medicamento para aumentar la actividad analgésica de un analgésico opiáceo (tal como la morfina o la pentazocina) en el que la amilina o el análogo de la amilina se administra en combinación con el analgésico opiáceo. Esta sinergia permite el empleo de dosificaciones menores de uno de los fármacos o de ambos con una reducción concomitante en el riego de posibles efectos secundarios. En una forma de realización preferida, el análogo agonista de la amilina es la ^{25,28,29}Pro-h-amilina.

En un aspecto relacionado, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende (1) la amilina o un agonista de la amilina, preferentemente, el análogo agonista de la amilina, la ^{25,28,29}Pro-h-amilina, o una sal de la misma farmacéuticamente aceptable y (2) un analgésico opiáceo, preferentemente morfina o pentazocina o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable.

Dichas composiciones pueden además comprender un transportador farmacéuticamente aceptable.

Dichas composiciones pueden comprender sales farmacéuticamente aceptables de la amilina o un agonista de la amilina, y/o sales farmacéuticamente aceptables de un analgésico opiáceo o de cualquier otro agente de alivio del dolor. Dichas composiciones pueden además comprender un transportador farmacéuticamente aceptable.

El uso de la amilina o de un agonista de la amilina, con actividad vasodilatadora, tanto sola como en combinación con un analgésico opiáceo o otro agente de alivio del dolor, resultará especialmente útil en el tratamiento de las cefaleas vasculares, tales como la migraña.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 presenta los resultados de un estudio de desarrollo cronológico del efecto de la administración de la amilina sobre el número de veces que se produce un retorcimiento causado por el dolor durante 10 minutos, 5 minutos después de la administración de ácido acético cuando se inyectaron por vía intraperitoneal (ip) 0,1 mg/kg de amilina (círculos oscuros) o de disolución salina (círculos en blanco) 5, 15, 30 y 60 minutos antes de la inyección de ácido acético en ratones. Las barras de error indican la media \pm el error típico.

La Figura 2 presenta los resultados de un estudio de desarrollo cronológico del efecto de la administración de la amilina sobre el número de veces que se produce un retorcimiento causado por el dolor durante 10 minutos, 5 minutos después de la administración de ácido acético cuando se inyectaron por vía subcutánea (sc) 0,1 mg/kg de amilina (círculos oscuros) o de disolución salina (círculos en blanco) 5, 15, 30 y 60 minutos antes de la inyección de ácido acético en ratones. Las barras de error indican la media \pm el error típico.

La Figura 3 presenta los resultados de un estudio de dosis y respuesta sobre el efecto de la administración de varias dosificaciones (0,001 mg/kg, 0,003 mg/kg, 0,01 mg/kg, 0,1 mg/kg, 1,0 mg/kg y 10,0 mg/kg) de amilina sobre el número de veces que se produce un retorcimiento causado por el dolor durante 10 minutos, 5 minutos después de la administración de ácido acético cuando se inyectaron por vía intraperitoneal (ip) 30 minutos antes de la inyección de ácido acético en ratones. Las barras de error indican la media \pm el error típico.

La Figura 4 presenta los resultados de un estudio de dosis y respuesta sobre el efecto de la administración de varias dosificaciones (0,001 mg/kg, 0,003 mg/kg, 0,01 mg/kg, 0,1 mg/kg, 1,0 mg/kg y 10,0 mg/kg) de amilina sobre el número de veces que se produce un retorcimiento causado por el dolor durante 10 minutos, 5 minutos después de la administración de ácido acético cuando se inyectaron por vía subcutánea (sc) 30 minutos antes de la inyección de ácido acético en ratones. Las barras de error indican la media \pm el error típico.

La Figura 5 presenta los resultados de un estudio de dosis y respuesta sobre el efecto de la administración de varias dosificaciones (0,001 mg/kg, 0,1 mg/kg, 0,3 mg/kg, 1,0 mg/kg y 3,0 mg/kg) de amilina sobre el número de veces que se produce un retorcimiento causado por el dolor durante 10 minutos, 5 minutos después de la administración de ácido acético cuando se inyectaron por vía subcutánea (sc) 30 minutos antes de la inyección de ácido acético en ratones. Las barras de error indican la media \pm el error típico.

La Figura 6 presenta el porcentaje de inhibición (media \pm el error típico) del número de veces que se produce un retorcimiento causado por el dolor durante 10 minutos, 5 minutos después de la administración de ácido acético cuando se inyectaron por vía subcutánea (sc) con 0,003 mg/kg de amilina (círculos oscuros) o de disolución salina (círculos en blanco) en animales tratados con diversas dosificaciones de morfina (0,01 mg/kg, 0,1 mg/kg ó 3,0 mg/kg).

La Figura 7 presenta el porcentaje de inhibición (media \pm el error típico) del número de veces que se produce un retorcimiento causado por el dolor durante 10 minutos, 5 minutos después de la administración de ácido acético cuando se inyectaron por vía subcutánea (sc) con 0,01 mg/kg de amilina (círculos oscuros) o de disolución salina (círculos en blanco) en animales tratados con diversas dosificaciones de morfina (0,01 mg/kg, 0,1 mg/kg ó 3,0 mg/kg).

La Figura 8 es un isobolograma caracterizando el 45% de inhibición de la respuesta en los retorcimientos (número de veces que se produce un retorcimiento causado por el dolor durante 10 minutos, 5 minutos después de la administración de ácido acético cuando se ha inyectado 30 minutos antes de la inyección de ácido acético en ratones). Los datos que se presentan en este diagrama se han tomado de la Figuras 2, 5, 6 y 7.

La Figura 9 presenta los resultados de un estudio de dosis y respuesta sobre el efecto de la administración de varias dosificaciones (0,1 mg/kg, 0,3 mg/kg, 1,0 mg/kg y 3,0 mg/kg) de naloxona, que actúa de antagonista de la morfina, con morfina (1 mg/kg) sobre el número de veces que se produce un retorcimiento causado por el dolor durante 10 minutos, 5 minutos después de la administración de ácido acético cuando se inyectaron 30 minutos antes de la inyección de ácido acético en ratones. Las barras de error indican la media \pm el error típico.

La Figura 10 presenta los resultados de un estudio del efecto de la administración de morfina (1,0 mg/kg) con o sin naloxona (1 mg/kg) o amilina (0,01 mg/kg ó 0,1 mg/kg) con o sin naloxona (1 mg/kg) sobre el número de veces que se produce un retorcimiento causado por el dolor durante 10 minutos, 5 minutos después de la administración de ácido acético cuando se inyectaron 30 minutos antes de la inyección de ácido acético en ratones, indicando el efecto de la naloxona en la analgesia provocada por la morfina y la amilina. Las barras de error indican la media \pm el error típico.

Descripción detallada de la invención

El índice de retorcimientos como respuesta a las inyecciones intraperitoneales de ácido acético diluido en ratones es un sistema indirecto de estudio de la analgesia en animales utilizado frecuentemente. Tal como se describe en el Ejemplo 1, la amilina de rata, cuando se inyectó en ratones 30 minutos antes de la inyección de ácido acético (por vía intraperitoneal y por vía subcutánea), redujo significativamente el número de retorcimientos en los períodos de 10 minutos que empezaron 5 minutos después de la inyección de ácido acético en comparación con el control (P < 0,001 para las inyecciones ip; P < 0,01 para las inyecciones sc). Tal como se indica en las Figuras 1 y 2, el máximo efecto analgésico de la amilina se producía cuando se administraba 30 minutos antes de la inyección de ácido acético. Sobre la base de dichos estudios, se seleccionaron los 30 minutos como período de tiempo para utilizar en los estudios de dosis y respuesta.

El Ejemplo 2 presenta el efecto analgésico de diversas dosificaciones de amilina. Los resultados presentados en las Figuras 3 y 4 indican que la menor dosis efectiva de amilina en dichos experimentos fue de 0,01 mg/kg (P < 0,05 sc; P < 0,01 ip). A una dosis de 0,1 mg/kg la amilina también resultó efectiva al producir la analgesia (P < 0,01 sc; P < 0,05 ip). A dosis superiores (1 mg/kg y 10 mg/kg), la amilina no mostró actividad analgésica significativa en este modelo (P < 0,05). Estos ejemplos demuestran la eficacia de la amilina, así como de los agonistas de la amilina entre ellos los análogos agonistas de la amilina, al prevenir el comportamiento nociceptivo (retorcimientos) en los ratones a los que se ha inyectado ácido acético. Dichos resultados también indican que la eficacia analgésica de la amilina o de los agonistas de la amilina pueden depender de la dosificación.

El ejemplo 3 describe un experimento en el que diversas dosis de morfina se analizaron para evaluar su actividad analgésica, utilizando los mismos procedimientos de ensayo sobre los retorcimientos causados por el dolor en ratones de los Ejemplos 1 y 2. Tal como se presenta en la Figura 5, las dosificaciones de 0,3 mg/Kg, 1,0 mg/kg y 3,0 mg/kg resultaron efectivas para provocas la analgesia bajo dichas condiciones experimentales.

El Ejemplo 4 describe los experimentos en que se examinó la actividad de diversas dosificaciones de amilina y de morfina, utilizando los mismos procedimientos de ensayo sobre los retorcimientos causados por el dolor en ratones de los Ejemplos previos. En un estudio, una dosificación de amilina de rata de la que se había demostrado su ineficacia (0,003 mg/kg) para provocar la analgesia en las condiciones experimentales del Ejemplo 2 se combinó con tres dosis de morfina: 0,01 mg/Kg, 0,1 mg/kg y 3,0 mg/kg. En otro estudio, una dosificación de amilina de rata de la que se había demostrado su eficacia (0,01 mg/kg) para provocar la analgesia en las condiciones experimentales del Ejemplo 2 se combinó con las mismas tres dosis de morfina. Se demostró que la combinación de la amilina y la morfina aumentaba la eficacia para provocar la analgesia en comparación con la morfina sola en combinaciones de (1) 0,003 mg/kg de amilina y 0,1 mg/kg de morfina (P < 0,05); (2) 0,01 mg/kg de amilina y 0,01 mg/kg de morfina (P < 0,05); y (3) 0,01 mg/kg de amilina y 0,1 mg/kg de morfina (P < 0,05). Adicionalmente, se demostró que una combinación de una dosificación no analgésica de amilina (0,003 mg/kg) y una dosificación no analgésica de morfina (0,1 mg/kg) provocaban un efecto analgésico. Los datos se presentan en las Figuras 6 y 7.

El Ejemplo 5 describe el análisis de los resultados de los estudios sobre los retorcimientos causados por el dolor de los Ejemplos 2 a 4 para caracterizar más la interacción entre la amilina y la morfina. Los resultados se presentaron en isobologramas de acuerdo con el método de Berebaum, J. Theor. Biol. 144: 413 (1985). El isobolograma es un método cuantitativo para determinar las interacciones entre dosificaciones equiefectivas de fármacos para indicar sinergia, efecto aditivo o antagonismo. Tal como se presenta en la Figura 8, la interacción de la amilina y la morfina en la producción de retorcimientos causados por el dolor provocados por el ácido acético en ratones es sinérgico. Es decir, el nivel de actividad que resulta de la actuación conjunta de la amilina y la morfina es superior a la suma de las actividades de los componentes individuales

El Ejemplo 6 describe los experimentos en los que se examinó el efecto del antagonista de la morfina, la naloxona, para estudiar su capacidad para contrarrestar la analgesia provocada por la morfina y la analgesia provocada por la amilina en el ensayo sobre los retorcimientos causados por el dolor descrito anteriormente. Tal como se ilustra en la Figura 9 y 10, mientras que 1,0 mg/kg de naloxona resulta efectivo para contrarrestar el efecto analgésico de 1,0 mg/kg de morfina, resulta ineficaz para contrarrestar el efecto de la amilina (0,01 mg/kg y 1,0 mg/kg) en la analgesia, indicando que la morfina y la amilina actúan mediante mecanismos distintos para provocar la analgesia.

Tal como se describe en el Ejemplo 7, se analizaron analgésicos opiáceos adicionales siguiendo los métodos de los Ejemplos 1 a 6.

Los análogos agonistas de la amilina útiles en la presente invención comprenden los análogos agonistas de la amilina dados a conocer en WPI Acc. nº 93-182488/22, "New Amylin Agonist Peptides Used for Treatment and Prevention of Hypoglycemia and Diabetes Mellitus ("Nuevos péptidos agonistas de la amilina utilizados en el tratamiento y prevención de la hipoglucemia y la diabetes mellitus")". Los análogos agonistas de la amilina preferidos comprenden la ^{25,28,29}Pro-h-amilina, la ^{18}Arg^{25,28,29}Pro-h-amilina y la ^{18}Arg^{25,28}Pro-h-amilina.

La actividad como agonistas de la amilina puede confirmarse y cuantificarse realizando diversos análisis de detección sistemática, entre ellos el análisis de enlace con el receptor del nucleus accumbens descrito posteriormente en el Ejemplo 11, y a continuación el ensayo con el músculo sóleo descrito posteriormente en el Ejemplo 12, un ensayo de vaciado gástrico descrito posteriormente en los Ejemplos 13 ó 14 o mediante la capacidad de provocar hipocalcemia o de reducir la hiperglucemia en mamíferos, tal como se describe en el presente documento.

El análisis de enlace con el receptor, un análisis de competición que determina la capacidad de los componentes para unirse específicamente a los receptores de membrana de la amilina, se describe en la patente U. S. nº 5.264.372, publicada el 23 de noviembre de 1993. El análisis de enlace con el receptor también se describe posteriormente en el Ejemplo 11. Una fuente preferida de preparaciones de membrana utilizada en el análisis es el prosencéfalo basal que comprende las membranas del nucleus accumbens y de las regiones circundantes. Los compuestos que se analizan compiten para enlazarse a dichas preparaciones receptoras con ^{125}I-amilina de rata Bolton Hunter. Las curvas de competición, en las que la cantidad enlazada (B) se presenta en el diagrama como función del logaritmo de la concentración de ligando y se analizan con un ordenador, empleando un análisis de regresión no lineal para una ecuación logística de 4 parámetros (programa: GraphPAD Inplot Software, San Diego, California) o el programa ALLFIT de DeLean et al. (ALLFIT, Versión 2.7 (NIH, Bethesda, MD 20892)). Munson y Rodbard, Anal. Biochem. 107: 220 - 239 (1980).

Los análisis de la actividad biológica de los agonistas de la amilina en el músculo sóleo pueden realizarse utilizando los métodos descritos previamente (Leighton, B. y Cooper, Nature, 335: 632 - 635 (1988); Cooper, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. EE. UU. 85: 7763 - 7766 (1988)), en los que la actividad del agonista de la amilina puede valorarse mediante la determinación de la inhibición de la síntesis de glucógeno estimulada por la insulina. El ensayo con el músculo sóleo también se describe posteriormente en el Ejemplo 12.

Los métodos de determinación del vaciado gástrico se dan a conocer en, por ejemplo, Young et al., Diabetologia 38(6): 642 - 648 (1995). Utilizando el método del rojo fenol, que se describe posteriormente en el Ejemplo 13, las ratas conscientes reciben Por sonda nasogástrica un gel incoloro que contiene hipromelosa y un indicador de rojo fenol. Veinte minutos después de suministrar el producto por la sonda nasogástrica, se anestesian los animales utilizando halotano, se pone al descubierto el estómago y se realiza el pinzamiento en los esfínteres pilórico y esofágico inferior, se extrae y se abre en una disolución alcalina. Se puede deducir el contenido del estómago a partir de la intensidad del rojo fenol en la disolución alcalina, medido por absorbancia a una longitud de onda de 560 nm. Utilizando el método de la glucosa tritiada, que se describe posteriormente en el Ejemplo 14, se administra glucosa tritiada a las ratas conscientes mediante una sonda nasogástrica. Se sujetaron con cuidado las ratas por la cola, cuyo extremo se había anestesiado con lidocaína. El tritio del plasma separado de la sangre de la cola se recogió en distintos momentos y se detectó con un contador beta. Los compuestos del ensayo se administran normalmente un minuto antes de la administración por la sonda nasogástrica.

Los efectos de las amilinas o de los agonistas de la amilina en el dolor pueden identificarse, analizarse, o detectarse utilizando los métodos descritos posteriormente en los Ejemplos 1 a 5, o mediante otras técnicas conocidas o métodos equivalentes para determinar el efecto analgésico. Véase, por ejemplo, Tjolsen et al., Handbook of Lab Animal Science ("Manual de ciencias de laboratorio con animales"), Vol. II, capítulo 12, Animal Models in pain Research (Svendsen, Ed. , CRC Press, 1994). Preferentemente los compuestos agonistas de la amilina presenta una actividad en el ensayo de enlace del orden de un valor inferior a de 1 a 5 nM, preferentemente menor a 1 nM y más preferentemente inferior a 50 pm. En el ensayo del músculo sóleo, los compuestos agonistas de la amilina presentaron unos valores de CE_{50} inferiores a aproximadamente entre 1 y 10 micromolar. En los ensayos de vaciado gástrico, los compuesto agonistas preferidos presentaron unos valores de DE_{50} inferiores a 100 \mug/rata.

La amilina y los péptidos agonistas de la amilina pueden prepararse utilizando las técnicas estándar de síntesis peptídica en fase sólida y preferentemente un sintetizador peptídico automático o semiautomático. Normalmente, empleando dichas técnicas, un aminoácido protegido por \alpha-N-carbamoil y un aminoácido unido a una cadena peptídica en crecimiento en una resina se enlazan a temperatura ambiente en un disolvente inerte tal como la dimetilformamida, la N-metilpirrolidinona o cloruro de metileno en presencia de agentes de adherencia tales como la diciclohexilcarbodiimida y el hidroxibenzotriazol en presencia de una base tal como la diisopropiletilamina. Se elimina el grupo protector \alpha-N-carbamoil de la resina - péptido resultante empleando un reactivo tal como el ácido trifluoacético o la piperidina, y la reacción de adherencia se repite con el siguiente aminoácido protegido en N- para ser añadido a la cadena peptídica. Los grupos N-protectores adecuados son bien conocidos en la especialidad, siendo los preferidos en la presente el t-butiloxicarbonilo (tBoc) y el fluorenilmetoxicarbonilo (Fmoc).

Los disolventes, los derivados de los aminoácidos y la resina de 4-metilbenzhidrilamina utilizados en el sintetizador pueden adquirirse en Applied Biosystems Inc. (Foster City, CA). Los siguientes aminoácidos protegidos de cadena lateral pueden adquirirse en Applied Biosystems, Inc. : Boc-Arg (Mts), Fmoc-Arg (Pmc), Boc-Thr (Bzl), Fmoc-Thr (t-Bu), Boc-Ser (Bzl), Fmoc-Ser (t-Bu), Boc-Tyr (BrZ), Fmoc-Tyr (t-Bu) , Boc-Lys (Cl-Z), Fmoc-Lys (Boc), Boc-Glu (Bzl), Fmoc-Glu (t-Bu), Fmoc-His (Trt), Fmc-Asn(Trt), y Fmoc-Gln (Trt). El Boc-His(BOM) puede adquirirse en Applied Biosystems, Inc. o en Bachem Inc. (Torrance, CA). El anisol, el sulfuro de metilo, el fenol, el etanoditiol y el tioanisol pueden adquirirse en Aldrich Chemical Company (Milwaukee, WI). Air Products and Chemicals (Allentown, PA) suministran HF. El éter etílico, el ácido acético y el metanol pueden adquirirse en Fisher Scientific (Pittsburgh, PA).

La síntesis peptídica en fase sólida puede llevarse a cabo con un sintetizador peptídico automático (modelo 430A, Applied Biosystems Inc., Foster City, CA) utilizando el sistema NMP/HOBt (Opción 1) y la química de Tboc o Fmoc (véase, Applied Biosystems User's Manual for the ABI 430A Peptide Synthesizer ("Manual del usuario del sintetizador peptídica ABI 430A de Applied Biosystems"), versión 1.3B 1 de julio de 1988, sección 6, p. 49 - 70, Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) con tapón. Las resinas de péptido y Boc pueden disociarse con HF (-5ºC a 0ºC, 1 hora). El péptido se puede extraer de la resina con la alternancia de agua y ácido acético, y liofilizando los filtrados. Las resinas de péptido y Fmoc pueden disociarse de acuerdo con los métodos estándar (Introduction to Cleavage Techniques ("Introducción a las técnicas de disociación"), Applied Biosystems, Inc., 1990, p. 6 - 12). Los péptidos también pueden ensamblarse empleando un sintetizador de Advanced Chem Tech (modelo MPS 350, Louisville, Kentucky).

Los péptidos pueden purificarse mediante la RP-HPLC (preparativa y analítica) empleando un sistema Waters Delta Prep 3000. Una columna preparativa C4, C8 o C18 (10 \mu, 2,2 x 25 cm; Vydac, Hesperia, CA) puede utilizarse para aislar los péptidos, y su pureza puede determinarse empleando una columna analítica C4, C8 o C18 (5 \mu, 0,46 x 25 cm; Vydac). Los disolventes (A = 0,1% TFA/agua y B = 0,1% TFA/CH_{3}CN) pueden llevarse directamente a la columna analítica con un índice de flujo de 1,0 ml/min y a la columna preparativa a 15 ml/min. Los análisis de los aminoácidos pueden realizarse en un sistema Waters Pico Tag y procesarlos empleando el programa Maxima. Los péptidos se pueden hidrolizar por hidrólisis ácida en fase de vapor (115ºC, 20 - 24 h). Los hidrolizados pueden obtenerse y analizarse mediante métodos estándar (Cohen, et al., The Pico Tag Method: A Manual of Advanced Techniques for Amino Acid Analysis ("El método Pico Tag: un manual de técnicas avanzadas para el análisis de aminoácidos"), p. 11 - 52, Millipore Corporation, Milford, MA (1989)). El análisis por bombardeo con átomos rápidos puede ser realizado por M-Scan, Incorporated (West Chester, PA). La calibración de masa puede realizarse empleando yoduro de cesio o yoduro de cesio / glicerina. El análisis de ionización y desorción del plasma empleando la detección del tiempo de vuelo puede llevarse a cabo en un espectómetro de masas Applied Biosystems Bio-Ion 20.

Los compuestos peptídicos útiles en la invención pueden prepararse utilizando técnicas de ADN recombinante, empleando métodos hoy en día conocidos en la especialidad. Véase, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual ("Clonación molecular: un manual de laboratorio"), 2ª Ed., Cold Spring Harbor (1989). Los compuestos no peptídicos útiles en la presente invención pueden prepararse empleando métodos conocidos en la especialidad.

Los compuestos a los que se ha hecho referencia anteriormente puede formar sales con distintos ácidos y bases de tipo inorgánico y orgánico. Dichas sales comprenden las sales preparadas con ácidos orgánicos e inorgánicos, por ejemplo el HCl, el HBr, el H_{2}SO_{4}, el H_{3}PO_{4}, el ácido trifluoacético, el ácido acético, el ácido metanosulfónico, el ácido toluenosulfónico, el ácido maleico, el ácido fumárico y el ácido canforsulfónico. Las sales preparadas con bases comprenden las sales de amonio, las sales de metales alcalinos, por ejemplo, las sales de sodio y potasio, y las sales de metales alcalinotérreos, por ejemplo, las sales de calcio y magnesio. Las sales preferidas son las sales de acetato, de hidrocloruro y de trifluoacetato. Las sales pueden formarse por medios convencionales, como haciendo reaccionar las formas libres de ácido o base del producto con uno o más equivalentes de la base o ácido apropiados en un disolvente o medio en el que la sal sea insoluble, o en un disolvente tal como el agua que a continuación se elimina al vacío o mediante liofilización o mediante un intercambio de iones de una sal existente por otro ión de una resina adecuada de intercambio de iones.

Las composiciones útiles en la invención se pueden proporcionar oportunamente en la forma de formulaciones aptas para la administración parenteral (comprendiendo la intravenosa, la intramuscular y la subcutánea) o nasal u oral. En algunos casos, resultara conveniente proporcionar un agonista de la amilina y otro agente analgésico, por ejemplo, un opiáceo, tal como la morfina, en una única composición o disolución para su administración conjunta. En otros casos, resultará más ventajoso administrar otro agente analgésico de forma separada de dicha amilina o agonista de la amilina. Un formato de administración adecuado se puede determinar del mejor modo individualmente por el médico de cabecera de cada paciente. Los transportadores farmacéuticamente aceptables aptos y su formulación se describen en los tratados de formulación estándar, por ejemplo, Remington's Pharmaceutical Sciences ("Ciencias farmacéuticas de Remington") de E.W. Martin. Véase también Wang, Y. J. y Hanson, M. A. "Parenteral Formulations of Proteins and Peptides: Stability and Stabilizers, ("Formulaciones parenterales de proteínas y péptidos: estabilidad y estabilizadores")", Journal of Parenteral Science and Technology, Informe técnico nº. 10, Supl. 42: 2S (1988).

Los compuestos proporcionados como composiciones parenterales para su inyección o venoclisis pueden, por ejemplo, estar suspendidos en un aceite inerte, un aceite vegetal adecuado como el de sésamo, de cacahuete, de oliva o cualquier otro transportador aceptable. Preferentemente, se suspenden en un transportador acuoso, por ejemplo una disolución amortiguadora isotónica a un pH de aproximadamente entre 5,6 y 7,4. Dichas composiciones pueden esterilizarse mediante técnicas de esterilización convencionales, o pueden esterilizarse por filtración. Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables requeridas para aproximarse a las condiciones fisiológicas, tales como agentes amortiguadores del pH. Las disoluciones amortiguadoras del pH útiles comprenden por ejemplo, las disoluciones amortiguadoras de acetato de sodio / ácido acético. Una forma de preparación de depósito o de "almacén" de liberación lenta puede utilizarse de manera que se distribuyan en el flujo sanguíneo las cantidades de la preparación que son terapéuticamente eficaces después de muchas horas o días de inyección o administración transdérmica.

La isotonicidad deseada se puede alcanzar utilizando cloruro de sodio u otros agentes farmacéuticamente aceptables como la glucosa, el ácido bórico, el tartrato de sodio, el propilenglicol, los polioles (tales como el manitol y el sorbitol), u otros solutos inorgánicos u orgánicos. El cloruro de sodio es particularmente preferido para las soluciones amortiguadoras que contienen iones de sodio.

Si así se desea, las disoluciones de las composiciones anteriormente mencionadas pueden espesarse con un agente espesante tal como la hipromelosa. Pueden preparase en forma emulsionada, tanto agua en aceite como aceite en agua. Cualquiera de una amplia gama de agentes emulsionantes farmacéuticamente aceptables pueden utilizarse entre ellos, por ejemplo, la goma arábiga, un agente tensoactivo no iónico (tal como el Tween) o un agente tensoactivo iónico (tal como sulfatos o sulfonatos alcalinos de poliéter alcohol, por ejemplo, Triton).

Las composiciones útiles en la invención se preparan mezclando los ingredientes siguiendo los procedimientos normalmente aceptados. Por ejemplo, los componentes seleccionados pueden simplemente mezclarse en una licuadora o cualquier otro dispositivo estándar para producir una mezcla concentrada que a continuación puede ajustarse hasta la concentración y viscosidad finales mediante la adición de agua o de un agente espesante y posiblemente una disolución amortiguadora para controlar el pH o un soluto adicional para controlar la tonicidad.

Para poder ser utilizadas por el médico, las composiciones se proveerán en forma de única dosis conteniendo una cantidad de amilina o de un agonista de la amilina, por ejemplo, un compuesto análogo agonista de la amilina con o sin otro agente analgésico que será efectivo en una o múltiples dosis para controlar el dolor al nivel seleccionado. Las cantidades terapéuticamente efectivas de amilina o de agonista de la amilina, tal como un análogo agonista de la amilina, para utilizar en el control del dolor son aquellas que producen una disminución del dolor. Tal como reconocerán los expertos en la materia, una cantidad efectiva del agente terapéutico variará en función de múltiples factores, entre ellos la edad y el peso del paciente, la condición física del paciente, la acción que se desea conseguir y otros factores.

Las dosificaciones analgésicas de los compuestos, únicas, divididas o continuas, por ejemplo, comprendiendo la ^{25,28,29}Pro-h-amilina, la ^{18}Arg^{25,28,29}Pro-h-amilina y la ^{18}Arg^{25,28}Pro-h-amilina., se encontrarán normalmente entre 0,01 ó 0,03 mg/día y 5 mg/día, preferentemente entre 0,01 ó 0,5 mg/día y 2 mg/día, más preferentemente entre 0,01 ó 0,1 mg/día y 1 mg/día, para un paciente de 70 kg, administradas mediante una dosis única dividida o continua. La dosis exacta a administrar la determina el médico que atiende al paciente y depende de múltiples factores, entre ellos, los mencionados anteriormente. La administración ha de iniciarse cuando se produzcan los primeros signos de dolor. La administración puede realizarse mediante una inyección o infusión, preferentemente intravenosa, subcutánea o intramuscular. Los compuestos orales activos pueden tomarse por vía oral, aunque las dosis han de aumentarse entre 5 y 10 veces.

Generalmente, en el tratamiento o la prevención del dolor, los compuestos de la presente administración pueden administrarse a paciente que necesiten dicho tratamiento en unas dosificaciones similares a las dadas anteriormente, sin embargo, los compuestos pueden administrarse con mayor frecuencia, por ejemplo, una, dos o tres veces al día o de manera continua.

Ejemplo 1 Curso cronológico de la acción de la amilinas

Los machos de ratones suizos Webster (NIH/Sw) obtenidos en Harlan (Madison, Wisconsin) con un peso de 20 - 35 g se alojaron agrupados con acceso libre a los alimentos y agua y se mantuvieron un entorno estable (ciclo luz : oscuridad 12 : 12; 23 \pm 1ºC). Se acostumbró a todos los animales a la sala donde se realizaban los ensayos durante al menos un día antes de cualquier experimento, y se analizaron una vez entre las 07:\cdot0 y las 14:00.

La amilina de rata se sintetizó mediante métodos estándar de síntesis peptídica en fase sólida. La morfina se obtuvo en los Steris Laboratories (Phoenix, Arizona). Todos los fármacos se disolvieron en una disolución fisiológica salina, y se administraron en un volumen de dosis de 10 ml/kg de peso corporal.

El procedimiento de análisis de los retorcimientos de los ratones utilizado fue una modificación del procedimiento dado a conocer en Hendershot y Forsaith, J. Pharmacol. Expt. Therap., 125: 237 - 240 (1959). Se dejó que cada ratón se habituara a la caja de observación durante al menos 15 minutos antes de la prueba. SE administró a cada ratón una inyección intraperitoneal de una disolución de ácido acético al 2% para provocar una reacción en forma de retorcimientos, caracterizada por una onda de contracción en la musculatura abdominal y a continuación la extensión de las extremidades posteriores. Se contó el número de retorcimientos por animal durante un intervalo de 10 minutos empezando 5 minutos después de la inyección con ácido acético.

Se administraron por vía subcutánea (sc) o intraperitoneal (ip) 0,1 mg/kg de amilina de rata 5, 15, 30 y 60 minutos antes de la inyección con ácido acético a los ratones. Las inyecciones con la disolución salina se utilizaron como control negativo.

Los resultados se presentan en las Figuras 1 y 2. La amilina, cuando se inyecta 30 minutos antes de la inyección con ácido acético (tanto ip como sc), reduce significativamente el número de retorcimientos en el período de 10 minutos 5 minutos después de la inyección con ácido acético en comparación con los animales tratados con la disolución salina (P < 0,001 para la inyección ip; P < 0,01 para la inyección sc). El máximo efecto de la amilina tuvo lugar cuando se administró 30 minutos antes de la inyección con ácido acético. Se seleccionó el período de 30 minutos para utilizarlo en los estudios de dosis y respuesta descritos posteriormente en el Ejemplo 2.

Ejemplo 2 Dosis y respuesta de la acción de la amilina

En los siguientes estudios de dosis y respuesta se utilizaron los mismos procedimientos experimentales empleados en los experimentos descritos en el Ejemplo 1. 30 Minutos antes de la inyección con ácido acético se administraron inyecciones subcutáneas y intraperitoneales de amilina de rata (0,001, 0,003, 0,01, 0,1, 1,0 y 10,0 mg/kg). Se utilizó la disolución salina como control negativo. La morfina (1,0 mg/kg) se utilizó como control positivo. Los resultados se presentan en las Figuras 3 y 4. La menor dosificación analgésica efectiva de la amilina en dichos experimentos fue de 0,01 mg/kg (P < 0,05 sc; P < 0,01 ip). Una dosis de 0,1 mg/kg resultó también efectiva (P < 0,05 sc; P < 0,01 ip). En el presente modelo, con mayores dosis administradas (1 mg/kg y 10 mg/kg), la amilina no presentó una actividad analgésica significativa (P > 0,05).

Ejemplo 3 Dosis y respuesta de la acción de la morfina

En los siguientes estudios de dosis y respuesta se utilizaron los mismos procedimientos experimentales empleados en los experimentos descritos en el Ejemplo 1. 30 Minutos antes de la inyección con ácido acético se administraron inyecciones intraperitoneales de morfina (0,001, 0,01, 0,1, 0,3, 1,0 y 3,0 mg/kg). Se utilizó la disolución salina como control negativo. La morfina (1,0 mg/kg) se utilizó como control positivo. Los resultados se presentan en las Figura 5. La menor dosificación analgésica efectiva de la amilina en dichos experimentos fue de 0,3 mg/kg (P < 0,05). Las dosis de 1,0 mg/kg y de 3,0 mg/kg resultaron también efectivas (P < 0,05, P < 0,001 respectivamente).

Ejemplo 4 Acciones analgésicas de la amilina y la morfina

La capacidad de la amilina para aumentar el efecto analgésico de la morfina se demuestra en estos experimentos, empleando los mismos procedimientos experimentales descritos en el Ejemplo 1. En un experimento, una dosis de amilina de rata que se había comprobado que era ineficaz (0,03 mg/kg) para producir la analgesia en las condiciones experimentales del Ejemplo 2 se combinó con 3 dosificaciones de morfina: 0,01 mg/kg, 0,1 mg/kg y 3,0 mg/kg (Figura 6). En otro experimento, una dosis de amilina de rata que se había comprobado que era ineficaz (0,01 mg/kg) para producir la analgesia en las condiciones experimentales del Ejemplo 2 se combinó con las mismas 3 dosificaciones de morfina (Figura 7).

La administración conjunta de la amilina y la morfina presentó una eficacia aumentada para reducir la analgesia en comparación con la morfina sola en unas combinaciones de: (1) 0,003 mg/kg de amilina y 0,1 mg/kg de morfina, P < 0,05 (Figura 6 ); (2) 0,01 mg/kg de amilina y 0,01 mg/kg de morfina, P < 0,05 (Figura, 7); y (3) 0,01 mg/kg de amilina y 0,1 mg/kg de morfina, P < 0.05 (Figure 7). Adicionalmente, se demostró que una combinación de una dosis no analgésica de amilina (0,003 mg/kg) y una dosis no analgésica de morfina (0,1 mg/kg) producía un efecto analgésico.

Ejemplo 5 Análisis mediante isobolograma de la interacción entre la amilina y la morfina

Para caracterizar más la interacción entre la amilina y la morfina, los resultados de los estudios sobre los retorcimientos se representaron gráficamente en isobolograma de acuerdo con el método de Bexebaum, "The expected effect of a combination of agents: the general solution ("El efecto esperado de una combinación de agentes: la solución general")", J. Theor. Biol. 114: 413 (1985). El isobolograma consiste en un método cuantitativo para determinar las interacciones entre las dosis de fármacos que son equiefectivas en relación con un criterio de valoración farmacológico común para indicar sinergia, un efecto aditivo o antagonismo. En este caso, la prueba de los retorcimientos se utilizó para realizar el cálculo del nivel común de la combinación analgésica entre dosis y proporción. El porcentaje de inhibición para cada componente y la combinación de la amilina y la morfina se dedujeron a partir de las curvas sigmoidales de dosis y respuesta de los datos representados en las figuras 2,5,6 y 7. En un isobolograma, las áreas de dosis adicional, sinergia y antagonismo se definen claramente en referencia a una línea recta teórica (adición) que conecta los tres puntos de cada eje. De acuerdo con la teoría del isobolograma, los puntos que se sitúan por debajo de la línea de adición representan una actividad analgésica mejorada y los puntos situados por encima de dicha línea representan una actividad analgésica disminuida.

La interacción sinérgica entre la amilina y la morfina en los retorcimientos provocados por el ácido acético en los ratones se demuestra mediante los datos de la Figura 8, en los que el efecto analgésico de la amilina sola se presenta en las ordenadas y el de la morfina sola se presenta en las abscisas. La interacción sinérgica de la amilina y la morfina al 45% de inhibición de los retorcimientos presentada en la Figura 8 indica la existencia de una inesperada actividad analgésica mejorada por parte de las combinaciones entre la amilina y la morfina. Es decir, la actividad resultante de la amilina y la morfina juntas resulta superior a la actividad esperada de la suma de las actividades de los componentes individuales.

Ejemplo 6 Efecto de la naloxona en la analgesia provocada por la morfina y en la analgesia provocada por la amilina

Siguiendo los procedimientos del estudio sobre los retorcimientos en los ratones de los Ejemplos previos, se analizó el efecto del antagonista de la morfina, la naloxona, en la analgesia provocada por la morfina y en la analgesia provocada por la amilina. En un estudio, se analizó el efecto de diversas dosificaciones (0,1 mg/kg, 0,3 mg/kg, 1,0 mg/kg y 3,0 mg/kg) de naloxona, administradas conjuntamente con 1,0 mg/kg de morfina. Tal como se muestra en la Figura 9, las dosis de 1,0 mg/kg y 3,0 mg/kg resultaron eficaces al contrarrestar la analgesia provocada por la morfina (como se pone de manifiesto por el número de retorcimientos por minuto).

En otro estudio, se analizó el efecto de 1,0 mg/kg de naloxona (que se había probado su eficacia al contrarrestar la analgesia provocada por la morfina en el estudio anterior) para comprobar su capacidad de contrarrestar la analgesia provocada por la amilina. Tal como se muestra en la Figura 10, la respuesta de la morfina (1,0 mg/kg) y la naloxona (1,0 mg/kg) conjuntamente no resultó significativamente diferente de la respuesta del control con la disolución salina, indicando que la naloxona era eficaz al contrarrestar la analgesia provocada por la morfina. También tal como se muestra en la Figura 10, los resultados para 0,1 mg/kg ó 1,0 mg/kg de amilina con o sin 1,0 mg/kg de naloxona son significativamente distintos del control salino, indicando que la naloxona no resultó eficaz al contrarrestar la analgesia provocada por la amilina. Dichos resultados indican que la morfina y la amilina actúan mediante mecanismos distintos para provocar la analgesia.

Ejemplo 7 Análisis de los analgésicos opiáceos adicionales

Siguiendo los procedimientos de los Ejemplos previos, el estudio de las características de dosificación de los analgésicos opiáceos adicionales útiles para aliviar el dolor cuando se administran con amilina o con agonistas de la amilina se realiza sustituyendo una cantidad equi-analgésica de cada uno de: hidromorfona, oximorfona, levorfanol, metadona, petidina, alfaprodina, fentanol, codeína, oxicodona o hidrocodona por la morfina de dichos
Ejemplos.

Ejemplo 8 Preparación de la ^{25,28,29}Pro-h-amilina

La síntesis en fase sólida de ^{25,28,29}Pro-h-amilina empleando una resina de anclaje - unión de metilbenzhidrilamina y una cadena de protección lateral de N^{a}-Boc/bencilo se llevó a cabo mediante métodos estándar de síntesis peptídica. La resina de ^{2,7}-(disulfuro)amilina-MBHA se obtuvo tratando las cisteínas protegidas con Acm con trifluoacetato de talio (III) en ácido trifluoacético. Después de que se consiguió la ciclización se procedió a la escisión de la resina y los grupos de protección de la cadena lateral con HF líquido en presencia de dimetilsulfuro y anisol. Se purificó la ^{25,28,29}Pro-h-amilina mediante HPLC preparativa de fase inversa. Se encontró que el péptido era homogéneo mediante HPLC analítica y electroforesis capilar y se confirmó la estructura mediante un análisis de los aminoácidos y un análisis secuencial. El producto dio la masa iónica deseada. Espect. de masas FAB : (M + H)* =
3,949.

Ejemplo 9 Preparación de la ^{18}Arg^{25,28,29}Pro-h-amilina

La síntesis en fase sólida de ^{18}Arg^{25,28,29}Pro-h-amilina empleando una resina de anclaje - unión de metilbenzhidrilamina y una cadena de protección lateral de N-Boc/bencilo se llevó a cabo mediante métodos estándar de síntesis peptídica. La resina de ^{2,7}-(disulfuro)amilina-MBHA se obtuvo tratando las cisteínas protegidas con Acm con trifluoacetato de talio (III) en ácido trifluoacético. Después de que se consiguió la ciclización se procedió a la escisión de la resina y los grupos de protección de la cadena lateral con HF líquido en presencia de dimetilsulfuro y anisol. Se purificó la ^{18}Arg^{25,28,29}Pro-h-amilina mediante HPLC preparativa de fase inversa. Se encontró que el péptido era homogéneo mediante HPLC analítica y electroforesis capilar y se confirmó la estructura mediante un análisis de los aminoácidos y un análisis secuencial. El producto dio la masa iónica deseada. Espect. de masas FAB : (M + H)* = 3,971.

Ejemplo 10 Preparación de la ^{18}Arg^{25,28}Pro-h-amilina

La síntesis en fase sólida de ^{18}Arg^{25,28}Pro-h-amilina empleando una resina de anclaje - unión de metilbenzhidrilamina y una cadena de protección lateral de N-Boc/bencilo se llevó a cabo mediante métodos estándar de síntesis peptídica. La resina de ^{2,7}-(disulfuro)amilina-MBHA se obtuvo tratando las cisteínas protegidas con Acm con trifluoacetato de talio (III) en ácido trifluoacético. Después de que se consiguió la ciclización se procedió a la escisión de la resina y los grupos de protección de la cadena lateral con HF líquido en presencia de dimetilsulfuro y anisol. Se purificó la ^{18}Arg^{25,28}Pro-h-amilina mediante HPLC preparativa de fase inversa. Se encontró que el péptido era homogéneo mediante HPLC analítica y electroforesis capilar y se confirmó la estructura mediante un análisis de los aminoácidos y un análisis secuencial. El producto dio la masa iónica deseada. Espect. de masas FAB : (M + H)* = 3,959.

Ejemplo 11 Análisis del enlace del receptor

La valoración del enlace de los componentes a los receptores de la amilina se llevó a cabo de la siguiente manera. La ^{125}I-amilina de rata (Bolton Hunter marcada en la lisina N-terminal) se adquirió en Amersham Corporation (Arlington Heights, IL). Las actividades específicas durante el tiempo de empleo variaron entre 1950 y 200 Ci/mmol. Los péptidos sin marcar se adquirieron en BACHEN Inc. (Torrance, CA) y en los Peninsula Laboratories (Belrnont, CA).

Los machos de rata Sprague Dawley (de 200 - 250 gramos) se sacrificaron por decapitación. Se extrajeron los encéfalos y se pusieron en una disolución salina amortiguadora de fosfato (PBS) fría. A partir de la superficie ventral, se realizaron cortes rostrales hacia el hipotálamo, limitado lateralmente por los pedúnculos olfativos y se extendieron internamente en un ángulo de 45º desde dichos pedúnculos. Dicho tejido del prosencéfalo basal, que contiene el nucleus accumbens y las regiones circundantes, se pesó y se homogeneizó en una disolución amortiguadora congelada de 20 mM de HEPES (20 mM de ácido HEPES, el pH ajustado a 7,4 con NaOH a 23ºC). Las membranas se lavaron tres veces en la disolución amortiguadora pura durante 15 minutos a 48.000 g. El sedimento membranoso final se resuspen-
dió en la disolución amortiguadora de 20 mM de HEPES que contenía 0,2 mM de fenilmetilsulfonilfluoruro (PMSF).

Para determinar el enlace de la ^{125}I-amilina, las membranas desde 4 mg de peso húmedo original de tejido se incubaron con la ^{125}I-amilina a 12 - 16 pM en la disolución amortiguadora de 20 mM de HEPES que contenía 0,5 mg/ml de bacitracina, 0,5 mg/ml de seroalbúmina bovina, y 0,2 mM de PMSF. Las disoluciones se incubaron durante 60 minutos a 23ºC. Se finalizaron las incubaciones mediante la filtración a través de unos filtros de fibra de vidrio GF/B (Whatman Inc., Clifton, NJ) que se habían empapado previamente durante 4 horas en polietilenimina al 0,3% a fin de reducir el nivel de enlaces no específicos de los péptidos radiomarcados. Los filtros se lavaron inmediatamente antes de la filtración con 5 ml de PBS frío, e inmediatamente después de la filtración con 15 ml de PBS frío. Se extrajeron los filtros y se realizó la valoración de la radiactividad en un contador gamma a una eficiencia de cálculo del 77%. Las curvas de competición se generaron determinando el enlace en presencia del compuesto de prueba sin marcar a unas concentraciones entre 10^{-12} y 10^{-6} M y se realizó un análisis de regresión no lineal empleando una ecuación logística de 4 parámetros (programa: GraphPAD Inplot Software, San Diego).

En el presente ensayo, la amilina humana purificada se enlaza con su receptor a una CI_{50} valorada de aproximadamente 50 pM. Los resultados para los compuestos del ensayo se presentan en la Tabla I, mostrando que cada uno de los compuestos presenta una actividad significativa de enlace con el receptor.

Ejemplo 12 Ensayo con el músculo sóleo

La determinación de la actividad de los compuestos como agonistas de la amilina se realizó empleando el ensayo con el músculo sóleo del siguiente modo. Se utilizaron machos de rata Sprague Dawley de 200 gramos de masa a fin de mantener la masa en el músculo sóleo escindido inferior a los 40 mg. Se dejó en ayunas a los animales durante las 4 horas previas a su sacrificio por decapitación. Se quitó la piel a partir de la extremidad inferior que a continuación se sujetó en un tablero de corcho. Se cortó el tendón de Aquiles justo por encima del hueso calcáneo y se podía ver el músculo gastrocnemio en la parte posterior de la tibia. El músculo sóleo, un músculo pequeño y plano de 15 - 20 mm de largo y de 0,5 mm de espesor que se encuentra en la superficie ósea del músculo gastrocnemio, se extirpó limpiamente y se le quitó el perimisio utilizando unas tijeras finas y unas pinzas. A continuación se escindió el músculo sóleo en partes iguales utilizando una cuchilla pasada de modo anteroposterior por la parte ventral del músculo para obtener un total de 4 fragmentos musculares de cada animal. Después de diseccionar el músculo del animal, se mantuvo durante un breve período en una disolución fisiológica salina. No resultó necesario mantener el músculo en tensión ya que ello no tiene efectos demostrables en la incorporación de la radioglucosa en el glucógeno.

Se añadieron los músculos en matraces de Erlenmeyer de 50 ml que contenían 10 ml de una disolución amortiguadora de bicarbonato Krebs-Ringer pregaseada conteniendo (cada litro) 118,5 mmol (6,93 g) de NaCl, 5,94 (443 mg) mmol de KCl, 2,54 mmol (282 mg) de CaCl_{2}, 1,19 mmol (143 mg) de MgSO_{4}, 1,19 mmol (162 mg) de KH_{2}PO_{4}, 25 mmol (2,1 g) de NaHCO_{3}, 5,5 mmol (1 g) de glucosa e insulina humana recombinante (Humulin-R, Eli Lilly, IN) y el componente del ensayo, tal como se detalla a continuación. Se comprobó que el pH a 37ºC se encontrase entre 7,1 y 7,4. Los músculos se asignaron a distintos matraces de manera que los 4 fragmentos musculares de cada animal se distribuyeron equitativamente entre las distintas condiciones de ensayo. Se gasearon los medios de incubación haciendo pasar una corriente suave de carbógeno (95% de O_{2}, 5% de CO_{2}) sobre su superficie mientras se agitaban continuamente a 37ºC en un baño María que se hacía oscilar. Después de un período de media hora de "preincubación", se añadieron a cada matraz 0,5 \muCi de U-^{14}C-glucosa y se incubaron durante otros 60 minutos. A continuación se extrajo rápidamente cada fragmento muscular, se secó y se congeló en N_{2} líquido, se pesó y se guardó para la posterior determinación del ^{14}C-glucógeno.

Se realizó la determinación del ^{14}C-glucógeno en un frasco de centelleo de 7 ml. Cada muestra muscular congelada se colocó en un frasco y se digirió en 1 ml de hidróxido de potasio al 60% a 70ºC durante 45 minutos mientras se sometía a agitación continua. El glucógeno disuelto se precipitó en el frasco añadiendo 3 ml de etanol absoluto y se enfrió manteniéndolo a -20ºC durante la noche. Se aspiró suavemente el sobrenadante, se lavó el glucógeno con etanol, se aspiró y se secó el precipitado al vacío. Se hizo evaporar todo el etanol para evitar la extinción de la señal durante el recuento del centelleo. Se redisolvió el glucógeno restante en 1 ml de agua y 4 ml de fluido de centelleo y se realizó el recuento para el ^{14}C.

El valor de la incorporación de la glucosa en el glucógeno (expresada en \mumol/g/h) se obtuvo a partir de la actividad específica de la ^{14}C-glucosa en 5,5 mM de glucosa del medio de incubación, y del recuento total de ^{14}C que permanecía en el glucógeno extraído de cada músculo. Las curvas de dosis y respuesta se ajustaron a un modelo logístico de 4 parámetros empleando una rutina iterativa siguiendo el método de los mínimos cuadrados (ALLFIT, v 2.7, NIH, MD) para deducir las CE_{50}. Dado que la CE_{50} sigue una distribución logarítmica normal, se expresa como \pm el error típico del logaritmo. Se realizaron las comparaciones de datos aparejados empleando las rutinas basadas en la prueba t de SYSTAT (Wilkinson, "SYSTAT: the system for statistics ("SYSTAT: el sistema para la estadística")", SYSTAT Inc., Evanston IL (1989)).

Las curvas de dosis y respuesta se generaron con los músculos añadidos a los medios que contenían 7,1 nM (1000 \muU/ml) de insulina y cada compuesto de prueba se añadió en unas concentraciones finales (nominales) de 0, 1, 3, 10, 30, 100, 300 y 1000 nM. Cada ensayo también contenía controles positivos internos que consistían en un baño simple de amilina de rata archivada, liofilizada y guardada a -70ºC.

La amilina humana es un péptido hiperglucémico conocido y las determinaciones de la CE_{50} de las preparaciones de amilina en el ensayo del músculo sóleo varían normalmente entre aproximadamente 1 - 10 nM, a pesar de que algunas preparaciones comerciales que presentan una pureza inferior al 90% tienen unas CE_{50} superiores debido a la presencia de contaminantes que provocan que las determinaciones de la actividad sean inferiores. Los resultados de los compuestos de la prueba se presentan en la Tabla I.

TABLA I

	Ensayo del enlace con	Ensayo del músculo
	el receptor CI_{50} (nM)	sóleo CE_{50} (nM)
1) ^{28}Pro-h-amilina	15,0	2,64
2) ^{25}Pro^{26}Val^{28,29}Pro-h-amilina	18,0	4,68
3) ^{2,7}Ciclo-[^{2}Asp,^{7}Lys]-h-amilina	310,0	6,62
4) ^{2-37}h-amilina	236,0	1,63
5) ^{1}Ala-h-amilina	148,0	12,78
6) ^{1}Ser-h-amilina	33,0	8,70
7) ^{19}Pro-h-amilina	64,0	3,75
8) ^{25,28}Pro-h-amilina	26,0	13,20
9) des-^{1}Lys^{25,28}Pro-h-amilina	85,0	7,70
10) ^{18}Arg^{25,28}Pro-h-amilina	32,0	2,83

TABLA I (continuación)

	Ensayo del enlace con	Ensayo del músculo
	el receptor CI_{50} (nM)	sóleo CE_{50} (nM)
11) des-^{1}Lys^{18}Arg^{25,28}Pro-h-amilina	82,0	3,77
12) ^{18}Arg^{25,28,29}Pro-h-amilina	21,0	1,25
13) des-^{1}Lys^{18}Arg^{25,28,29}Pro-h-amilina	21,0	1,86
14) ^{25,28,29}Pro-h-amilina	10,0	3,71
15) des-^{1}Lys^{25,28,29}Pro-h-amilina	14,0	4,15

Ejemplo 13 Ensayo del vaciado gástrico con el rojo fenol

El vaciado gástrico se determinó utilizando una modificación (Plourde et al., Life Sci. 53: 857 - 862 (1993)) del método original de Scarpignato et al. (Arch. Int. Pharmacodyn. Ther. 246: 286 - 295 (1980). Durante un breve período, las ratas conscientes recibieron por sonda nasogástrica 1,5 ml de un gel incoloro que contenía hipromelosa al 1,5% (M-0262, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) y el indicador rojo fenol al 0,05%. Veinte minutos después del suministro por la vía nasogástrica, se anestesiaron las ratas utilizando halotano al 5%, se puso al descubierto el estómago y se realizó el pinzamiento de los esfínteres pilórico y esofágico inferior utilizando pinzas hemostáticas, se extrajo y se abrió en una disolución alcalina preparada para un volumen fijo. Se pudo deducir el contenido del estómago a partir de la intensidad del rojo fenol en la disolución alcalina, medido por absorbancia a una longitud de onda de 560 nm. En la mayoría de los experimentos el estómago estaba limpio. En otros experimentos, los contenidos gástricos particulados se centrifugaron para limpiar la disolución para las determinaciones de la absorbancia. Allí donde los contenidos gástricos diluidos permanecieron túrbidos, la absorbancia espectroscópica debida al rojo fenol se dedujo a partir de la diferencia entre la presente en la disolución alcalina y la del diluente acetificado. En unos experimentos separados realizados en 7 ratas, tanto el estómago como el intestino delgado se extirparon y se vaciaron en una disolución alcalina. La cantidad de rojo fenol que pudo recuperarse del tracto gastrointestinal superior en 29 minutos de administración nasogástrica fue del 89 \pm 4%; el tinte que se unió irreversiblemente en la superficie de la luz del intestino puede haberste tenido en cuenta en el cálculo. Para compensar esta pequeña pérdida, el porcentaje de los contenidos restantes del estómago después de 20 minutos se expresó como una fracción de los contenidos gástricos extraídos de las ratas de control sacrificadas inmediatamente después de la administración nasogástrica en el mismo experimento. Porcentaje de los contenidos restantes del vaciado gástrico = (absorbancia en el minuto 20) / (absorbancia en el minuto 0). Las curvas de dosis y respuesta para el vaciado gástrico se ajustaron a un modelo logístico de 4 parámetros empleando una rutina iterativa siguiendo el método de los mínimos cuadrados (ALLFIT, v 2.7, NIH, MD) para deducir las DE_{50}. Dado que la DE_{50} sigue una distribución logarítmica normal, se expresa como \pm el error típico del logaritmo. Se realizaron las comparaciones de datos aparejados empleando el análisis unidireccional de la varianza y la prueba de comparaciones múltiples de Student-Newman-Keuls (Instat v 2.0, GraphPad Software, San Diego, CA) utilizando un nivel de significación de P < 0,05.

En los estudios de dosis y respuesta, la amilina de rata (Bachem, Torrance, CA) se disolvió en una disolución salina 0,15 M, se administró inyección subcutánea rápida de 0,1 ml a dosis de 0, 0,01, 0,1, 1, 10 ó 100 \mug 5 minutos antes de la administración nasogástrica en ratas Sprague Dawley (no diabéticas) que habían ayunado durante 20 horas y en ratas BB diabéticas que habían ayunado durante 6 horas. Cuando las inyecciones subcutáneas de amilina se administraron 5 minutos antes de la administración nasogástrica con el indicador rojo fenol, se produjo una supresión en función de la dosis del vaciado gástrico (no se presentan los datos). La supresión del vaciado gástrico fue completa en las ratas HSD normales a las que se administro 1 \mug de amilina, y en las ratas diabéticas a las que se administraron 10 \mug (P = 0,22, 0,14). La DE_{50} para la inhibición del vaciado gástrico en ratas normales fue de 0,43 \mug (0,60 nmol/kg) \pm 0,19 unidades logarítmicas, y fue de 2,2 \mug (2,3 nmol/kg) \pm 0,18 unidades logarítmicas en ratas diabéticas.

Ejemplo 14 Ensayo del vaciado gástrico con la glucosa tritiada

Se sujetaron las ratas Harlan Sprague Dawley, conscientes y sin ayunar, por la cola, cuyo extremo se había anestesiado con lidocaína al 2%. El tritio del plasma separado de la sangre de la cola se recogió 0, 15, 30, 60, 90 y 120 minutos después de la administración nasogástrica y se detectó con un contador beta. Se inyectaron las ratas por vía subcutánea con una disolución salina de 0,1 ml que contenía 0, 0,1, 0,3, 1, 10 ó 100 \mug de amilina de rata 1 minuto antes de la administración nasogástrica (n = 8, 7, 5, 5, 5, respectivamente). Después de la administración nasogástrica de la disolución salina las ratas preinyectadas con la glucosa tritiada, el tritio en el plasma aumentó rápidamente ( t 1/2 de aproximadamente 8 minutos) hasta una asíntota que disminuyó lentamente. La inyección con amilina ralentizó en función de la dosis y/o retardó la absorción del marcador. La actividad del tritio en el plasma se integró después de 30 minutos para obtener las áreas por debajo de la curva trazada como función de la dosis de amilina. La DE_{50} que se calculó con el ajuste logístico fue de 0,35 \mug de amilina.

Claims

1. El uso de la amilina o de un análogo de la amilina que actúa como agonista de la amilina en la fabricación de un medicamento para utilizarlo en un método de tratamiento del dolor en mamíferos.

2. El uso según la reivindicación 1 en el que dicha amilina o análogo de la amilina se basa en la amilina humana.

3. El uso según la reivindicación 2 en el que dicho análogo de la amilina es la ^{25,28,29}Pro-h-amilina.

4. El uso según las reivindicaciones 1, 2 ó 3 en el que dicha amilina o análogo de la amilina se administra en combinación con un analgésico opiáceo.

5. El uso según la reivindicación 4 en el que dicho analgésico opiáceo se selecciona de entre la morfina, la pentazocina, la hidromorfona, la oximorfona, el levorfanol, la metadona, la petidina, la anileridina, la alfaprodina, el fentanol, la codeína, la oxicodona y la hidrocodona.

6. El uso según la reivindicación 5 en el que dicho analgésico opiáceo es la morfina.

7. El uso según la reivindicación 5 en el que dicho analgésico opiáceo es la pentazocina.

8. El uso de la amilina o un análogo de la amilina que actúa como agonista de la amilina en la fabricación de un medicamento para aumentar la actividad analgésica de un analgésico opiáceo en el que la amilina o el análogo de la amilina se administra en combinación con el analgésico opiáceo.

9. El uso según la reivindicación 8 en el que dicha amilina o análogo de la amilina se basa en la amilina humana.

10. El uso según la reivindicación 9 en el que dicho análogo de la amilina es la ^{25,28,29}Pro-h-amilina.

11. El uso según las reivindicaciones 8, 9 ó 10 en el que dicho analgésico opiáceo se selecciona de entre la morfina, la pentazocina, la hidromorfona, la oximorfona, el levorfanol, la metadona, la petidina, la anileridina, la alfaprodina, el fentanol, la codeína, la oxicodona y la hidrocodona.

12. El uso según la reivindicación 11 en el que dicho analgésico opiáceo es la morfina.

13. El uso según la reivindicación 11 en el que dicho analgésico opiáceo es la pentazocina.

14. Una composición farmacéutica que comprende: (1) la amilina o un análogo agonista que actúa como agonista de la amilina o una sal de la misma farmacéuticamente aceptable; y (2) un analgésico opiáceo o una sal del mismo farmacéuticamente aceptable.

15. Una composición según la reivindicación 14 que además comprende un transportador farmacéuticamente aceptable.

16. Una composición según las reivindicaciones 14 o 15 en la que dicha amilina o análogo de la amilina se basa en la amilina humana.

17. Una composición según la reivindicación 16 en el que dicho análogo de la amilina es la ^{25,28,29}Pro-h-amilina.

18. Una composición según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 17 en la que dicho analgésico opiáceo se selecciona de entre la morfina, la pentazocina, la hidromorfona, la oximorfona, el levorfanol, la metadona, la petidina, la anileridina, la alfaprodina, el fentanol, la codeína, la oxicodona y la hidrocodona.

19. Una composición según la reivindicación 18 en el que dicho analgésico opiáceo es la morfina.

20. Una composición según la reivindicación 18 en el que dicho analgésico opiáceo es la pentazocina.