RS67258B1 - Upotreba dugodelujućih glp-1 peptida - Google Patents

Description

KRATAK PRIKAZ PRONALASKA

Pronalazak se odnosi na agonist GLP-1 semaglutid u farmaceutskoj kompoziciji za upotrebu u prevenciji ili lečenju dijabetesa tipa 2, pri čemu se navedeni agonist GLP-1 primenjuje jednom nedeljno u količini od 1,0 mg, i pri čemu se navedeni agonist GLP-1 primenjuje parenteralno.

KRATAK OPIS CRTEŽA

Slika 1 prikazuje promenu HbA1c nakon potkožne primene placeba, semaglutida ili liraglutida kod ljudi. *p<0,05 u odnosu na placebo; **p<0,001 u odnosu na placebo (na osnovu prilagođenih srednjih vrednosti). Početne vrednosti su samo u informativne svrhe: podaci su prilagođeni modelu za početni HbA1c. Podaci su prilagođeni modelu LS srednjih vrednosti, FAS LOCF. Procene su dobijene iz ANOVA modela sa tretmanom, zemljom i prethodnim tretmanom kao fiksnim efektima i početnim HbA1c kao kovarijablom.

Slika 2 prikazuje srednju promenu HbA1c od početne vrednosti u odnosu na vreme; podaci su srednja vrednost (1,96SE), FAS LOCF. Tretmani su placebo (A); semaglutid 0,1 mg (B, isprekidana linija), 0,2 mg (C), 0,4 mg (D), 0,8 mg (E), 0,8 mg T (F, isprekidana linija), 1,6 mg T (G); liraglutid 1,2 mg (H), 1,8 mg (I).

Slika 3 prikazuje subjekte koji su dostigli AACE ili ADA kriterijume za glikemijsku kontrolu. Broj pacijenata koji ispunjavaju kriterijume po tretmanu je naznačen u svakoj traci. Tretmani su placebo (A); semaglutid 0,1 mg (B), 0,2 mg (C), 0,4 mg (D), 0,8 mg (E), 0,8 mg T (F), 1,6 mg T (G); liraglutid 1,2 mg (H), 1,8 mg (I). *p<0,05 u odnosu na placebo; **p<0,001 u odnosu na placebo; ***p<0,0001 u odnosu na placebo (na osnovu prilagođenih srednjih vrednosti). Podaci su FAS LOCF. Procene su dobijene iz modela logističke regresije, gde su zemlja i prethodni tretman fiksni efekti, a početni HbA1c kovarijabla. ADA, Američko udruženje za dijabetes; AACE, Američko udruženje kliničkih endokrinologa.

Slika 4 prikazuje promenu srednje telesne težine u odnosu na vreme; podaci su srednja vrednost (1,96SE), FAS LOCF. Tretmani su placebo (A); semaglutid 0,1 mg (B, isprekidana linija), 0,2 mg (C), 0,4 mg (D), 0,8 mg (E), 0,8 mg T (F, isprekidana linija), 1,6 mg T (G); liraglutid 1,2 mg (H), 1,8 mg (I).

Slika 5 prikazuje promenu telesne težine u odnosu na početnu vrednost u 12. nedelji. **p<0,001 u odnosu na placebo; ***p<0,0001 u odnosu na placebo (na osnovu prilagođenih srednjih vrednosti). †: Osnovne vrednosti su samo u informativne svrhe: podaci su prilagođeni modelu za početnu težinu. Podaci su prilagođeni modelu LS srednjih vrednosti, FAS LOCF. Procene su dobijene iz ANOVA modela sa tretmanom, zemljom i prethodnim tretmanom kao fiksnim efektima i početnom težinom kao kovarijablom.

SE: Standardna greška. FAS: Kompletan set analiza. LOCF: Poslednje zapažanje je preneto dalje.

OPIS

Bilo koje reference u opisu na postupke lečenja odnose se na jedinjenja, farmaceutske kompozicije i lekove ovog pronalaska za upotrebu u postupku lečenja ljudskog (ili životinjskog) tela terapijom.

Predmetni pronalazak se odnosi na poboljšanu upotrebu GLP-1 agonista u terapiji. U jednoj realizaciji pronalazak se odnosi na određene režime doziranja GLP-1 agonista koji pružaju poboljšani efekat kod bolesti ili stanja, kao što su prevencija i/ili lečenje dijabetesa tipa 2 i gojaznosti. U jednoj realiizaciji postupci ovog pronalaska iznenađujuće pružaju poboljšano smanjenje HbA1c i smanjenje telesne težine. U jednoj realizaciji agonist GLP-1 se primenjuje u količini koja obezbeđuje poboljšano a) smanjenje HbA1c ili b) smanjenje telesne težine u poređenju sa primenom 1,8 mg liraglutida ili manje, kao što je 0,8 mg liraglutida ili manje, dnevno.

U jednoj realizaciji pronalazak se odnosi na postupak za smanjenje HbA1c ili za prevenciju ili lečenje dijabetesa tipa 2, hiperglikemije, poremećene tolerancije na glukozu ili dijabetesa nezavisnog od insulina, pri čemu navedeni postupak obuhvata primenu GLP-1 agonista subjektu kome je to potrebno u količini od najmanje 0,7 mg nedeljno. U jednoj realizaciji postupak je za smanjenje HbA1c. U jednoj realizaciji postupak je za prevenciju ili lečenje dijabetesa tipa 2. U jednoj realizaciji postupak je za prevenciju ili lečenje hiperglikemije. Ovde je opisan postupak za prevenciju ili lečenje poremećene tolerancije glukoze. Ovde je opisan postupak za prevenciju ili lečenje dijabetesa nezavisnog od insulina. Ovde je opisan postupak koji obuhvata odlaganje ili sprečavanje progresije dijabetičke bolesti. U jednoj realizaciji postiže se nivo HbA1c ispod 7%. U jednoj realizaciji nivo HbA1c se određuje prema metodi definisanoj u Ispitivanju kontrole i komplikacija dijabetesa (DCCT). U jednoj realizaciji nivo HbA1c se određuje prema metodi koju je definisala Međunarodna federacija kliničke hemije (IFCC).

U jednoj realizaciji agonist GLP-1 se daje u količini od 1,0 mg nedeljno.

Agonist GLP-1 je semaglutid.

Agonist GLP-1 se daje parenteralnom primenom, na primer supkutanim

ubrizgavanjem.

Ovde je opisan agonist GLP-1 za upotrebu u smanjenju HbA1c ili za upotrebu u prevenciji ili lečenju dijabetesa tipa 2, hiperglikemije, poremećene tolerancije na glukozu ili dijabetesa nezavisnog od insulina, koji obuhvata primenu agonista GLP-1 u količini od najmanje 0,7 mg nedeljno. U jednoj realizaciji GLP-1 agonist i/ili primena je ovde definisana.

U jednoj realizaciji pronalazak se odnosi na kompoziciju koja sadrži agonist GLP-1 i jedan ili više farmaceutski prihvatljivih ekscipijenata za upotrebu u smanjenju HbA1c ili za prevenciju ili lečenje dijabetesa tipa 2, hiperglikemije, poremećene tolerancije na glukozu ili dijabetesa nezavisnog od insulina, pri čemu se navedeni agonist GLP-1 primenjuje u količini od najmanje 0,7 mg nedeljno. U jednoj realizaciji GLP-1 agonist i/ili primena je ovde definisana.

U jednoj realizaciji GLP-1 agonist se daje sa drugim terapeutskim sredstvom.

Primena sa drugim terapijskim sredstvom može se sprovesti kao primena GLP-1 agonista i drugog terapijskog sredstva u istom terapijskom prozoru (npr. u periodu od dve nedelje, u periodu od jedne nedelje ili u periodu od 96, 72 ili 48 sati, itd.). Lečenje agonistom GLP-1 prema ovom pronalasku može se kombinovati sa jednim ili više dodatnih terapijskih sredstava, npr. izabranih iz antidijabetičkih sredstava, sredstava protiv gojaznosti, sredstava za regulisanje apetita, antihipertenzivnih sredstava, sredstava za lečenje i/ili prevenciju komplikacija koje nastaju usled ili su povezane sa dijabetesom i sredstava za lečenje i/ili prevenciju komplikacija i poremećaja koji nastaju usled ili su povezani sa gojaznošću; primeri ovih terapijskih sredstava su: sulfonilureje, tiazolidindioni, bigvanidi, meglitinidi, inhibitori glukozidaze, antagonisti glukagona i inhibitori DPP-IV (dipeptidil peptidaza-IV).

U jednoj realizaciji „efikasna količina“ GLP-1 agonista, kako se ovde koristi, označava količinu dovoljnu da izleči, ublaži ili delimično zaustavi kliničke manifestacije date bolesti ili stanja i njenih komplikacija. Količina koja je dovoljna da se ovo postigne definiše se kao „efektivna količina“. Efikasne količine za svaku svrhu zavisiće od težine bolesti ili povrede, kao i od težine i opšteg stanja subjekta. Razume se da se određivanje odgovarajuće doze može postići rutinskim eksperimentisanjem, konstruisanjem matrice vrednosti i testiranjem različitih tačaka u matrici, što je sve u okviru uobičajenih veština obučenog lekara ili veterinara.

U jednoj realizaciji izraz „tretiranje” i „lečenje” kako se ovde koriste označavaju upravljanje i negu pacijenta u svrhu borbe protiv stanja, kao što je bolest ili poremećaj. U jednoj realizaciji, termin „lečenje“ ili „lečenje“ treba da obuhvati ceo spektar tretmana za dato stanje od kojeg pacijent pati, kao što je primena aktivnog jedinjenja radi ublažavanja simptoma ili komplikacija; radi odlaganja progresije bolesti, poremećaja ili stanja; radi ublažavanja ili olakšavanja simptoma i komplikacija; i/ili, radi lečenja ili eliminisanja bolesti, poremećaja ili stanja, kao i radi sprečavanja stanja. U jednoj realizaciji, prevencija se podrazumeva kao lečenje i briga o pacijentu u svrhu borbe protiv bolesti, stanja ili poremećaja i uključuje primenu aktivnih jedinjenja kako bi se sprečila pojava simptoma ili komplikacija.

U jednoj realizaciji termin „hidrofilni razmak“, kako se ovde koristi, označava razmak koji razdvaja peptid i ostatak koji vezuje albumin hemijskim delom koji sadrži najmanje 5 atoma koji nisu vodonik, gde je 30-50% njih ili N ili O.

U jednoj realizaciji izraz „analog“ kako se ovde koristi koji upućuje na polipeptid označava modifikovani peptid pri čemu je jedan ili više aminokiselinskih ostataka peptida supstituisan drugim aminokiselinskim ostacima i/ili pri čemu je jedan ili više aminokiselinskih ostataka obrisan iz peptida i ili pri čemu je jedan ili više aminokiselinskih ostataka dodat peptidu. Takvo dodavanje ili brisanje aminokiselinskih ostataka može se desiti na N-terminalu peptida i/ili na C-terminalu peptida. Za opisivanje analoga koristi se jednostavan sistem: Na primer, Arg<34>GLP-1 (7-37) Lys označava GLP-1 analog gde je prirodni lizin na poziciji 34 supstituisan argininom i ostatak lizina je dodat na C-terminal (pozicija 38).

U jednoj realizaciji termin „GLP-1 peptid“, kako se ovde koristi, označava GLP-1 (7-37), GLP-1 analog, GLP-1 derivat ili derivat GLP-1 analoga.

U jednoj realizaciji, termin „zaštićen DPP-IV“, kako se ovde koristi u odnosu na polipeptid, označava polipeptid koji je hemijski modifikovan kako bi se navedeno jedinjenje učinilo otpornim na plazma peptidazu dipeptidil aminopeptidazu-4 (DPP-IV). Poznato je da je enzim DPP-IV u plazmi uključen u razgradnju nekoliko peptidnih hormona, npr. GLP-1, Exendin-4 itd. Stoga se ulažu značajni napori da se razviju agonisti GLP-1 koji su manje podložni hidrolizi posredovanoj DPP-IV kako bi se smanjila brzina razgradnje koju izaziva DPP-IV.

Ovaj pronalazak se takođe odnosi na GLP-1 agonist iz pronalaska, za upotrebu kao lek. Ovde opisani GLP-1 agonist može se koristiti za sledeće medicinske tretmane:

(i) prevenciju i/ili lečenje svih oblika dijabetesa, kao što su hiperglikemija, dijabetes tipa 2, poremećena tolerancija na glukozu, dijabetes tipa 1, insulin nezavisni dijabetes, MODY (dijabetes sa ranom postavkom kod mladih), gestacijski dijabetes i/ili za smanjenje HbA1c;

(ii) odlaganje ili sprečavanje progresije dijabetske bolesti, kao što je progresija dijabetesa tipa 2, odlaganje progresije poremećene tolerancije na glukozu (IGT) na dijabetes tipa 2 koji zahteva insulin, i/ili odlaganje progresije dijabetesa tipa 2 koji ne zahteva insulin na dijabetes tipa 2 koji zahteva insulin;

(iii) prevenciju i/ili lečenje poremećaja u ishrani, kao što je gojaznost, npr.

smanjenjem unosa hrane, smanjenjem telesne težine, suzbijanjem apetita, izazivanjem sitosti; lečenje ili sprečavanje poremećaja prejedanja, bulimije i/ili gojaznosti izazvane primenom antipsihotika ili steroida; smanjenje pokretljivosti želuca; i/ili odlaganje pražnjenja želuca.

U drugoj posebnoj realizaciji, indikacija je (i). U sledećoj posebnoj realizaciji, indikacija je (ii). U još jednoj posebnoj realizaciji indikacija je (iii). U jednoj ealizaciji indikacija je dijabetes tipa 2 i/ili gojaznost.

U jednoj realizaciji postupak obuhvata prevenciju, lečenje, smanjenje i/ili indukciju u jednoj ili više bolesti ili stanja definisanih ovde. U jednoj realizaciji indikacija je (i) i (iii). U jednoj realizaciji indikacija je (ii) i (iii).

U jednoj realizaciji pronalazak se odnosi na davanje efikasne količine GLP-1 agonista.

U jednoj realizaciji, kako se ovde koristi, specifične vrednosti date u odnosu na brojeve ili intervale mogu se shvatiti kao specifična vrednost ili kao oko specifične vrednosti.

FUNKCIONALNA SVOJSTVA

U prvom funkcionalnom aspektu, GLP-1 agonisti pronalaska imaju dobru potenciju. Takođe, ili alternativno, u drugom funkcionalnom aspektu, GLP-1 agonisti pronalaska imaju produženi farmakokinetički profil. Takođe, ili alternativno, u trećem funkcionalnom aspektu, GLP-1 agonisti pronalaska su stabilni na razgradnju gastrointestinalnim enzimima.

Biološka aktivnost (potencija)

Prema prvom funkcionalnom aspektu, GLP-1 agonisti pronalaska su biološki aktivni ili potentni. U posebnoj realizaciji „potencija“ i/ili „aktivnost“ se odnosi na in vitro potenciju, tj. performanse u funkcionalnom testu GLP-1 receptora, posebno na sposobnost stimulisanja formiranja cAMP u ćelijskoj liniji koja ekspresuje klonirani ljudski GLP-1 receptor.

Stimulacija formiranja cAMP-a u medijumu koji sadrži ljudski GLP-1 receptor može se poželjno odrediti korišćenjem stabilne transfektovane ćelijske linije kao što je BHK467-12A (tk-ts13), i/ili korišćenjem za određivanje cAMP-a funkcionalnog testa receptora, npr. zasnovanog na konkurenciji između endogeno formiranog cAMP-a i egzogeno dodatog biotinom obeleženog cAMP-a, u kom testu se cAMP poželjnije hvata korišćenjem specifičnog antitela, i/ili gde je još poželjniji test AlphaScreen cAMP test, kao što je onaj opisan u testu (I).

U jednoj realizaciji izraz polumaksimalna efektivna koncentracija (EC50) se generalno odnosi na koncentraciju koja indukuje odgovor na pola puta između početne i maksimalne, pozivajući se na krivu odgovora na dozu. EC50se koristi kao mera potentnosti jedinjenja i predstavlja koncentraciju u kojoj se primećuje 50% njegovog maksimalnog efekta.

In vitro potencija GLP-1 agonista ovog pronalaska može se odrediti kao što je gore opisano, a može se odrediti i EC50dotičnog GLP-1 agonista. Što je niži EC50, to je bolja potencija.

U posebnoj realizaciji medijum ima sledeći sastav (konačne koncentracije u analizi): 50 mM TRIS-HCl; 5 mM HEPES; 10 mM MgCl2, 6H2O; 150 mM NaCl; 0,01% Tween; 0,1% BSA; 0,5 mM IBMX; 1 mM ATP; 1 µM GTP; pH 7,4.

U daljoj posebnoj realizaciji, GLP-1 agonist pronalaska ima in vitro potenciju koja odgovara EC50na ili ispod 3000 pM, kao što je ispod 2000 pM, ispod 1000 pM ili ispod 500 pM, ili kao što je ispod 200 pM ili ispod 100 pM.

U drugoj posebnoj realizaciji, GLP-1 agonisti pronalaska su snažni in vivo, što se može utvrditi kao što je poznato u struci na bilo kom pogodnom životinjskom modelu, kao i u kliničkim ispitivanjima.

Dijabetički db/db miš je jedan primer odgovarajućeg životinjskog modela, a efekat snižavanja glukoze u krvi može se utvrditi kod takvih miševa in vivo, npr. kao što je opisano u testu (III), ili kao što je opisano u primeru 43 iz WO09/030738.

Takođe, ili alternativno, efekat na unos hrane in vivo može se utvrditi u farmakodinamičkim studijama na svinjama, npr. kao što je opisano u testu (IV).

Protrakcija - poluživot in vivo kod minijaturnih svinja

Prema drugom funkcionalnom aspektu, GLP-1 agonisti pronalaska su produženi. U posebnom otelotvorenju, protrakcija se može odrediti kao poluživot (T1⁄2)in vivo kod minijaturnih svinja nakon intravenske primene. U dodatnim realizacijama, poluživot je najmanje 24 sata, kao što je najmanje 48 sati, najmanje 60 sati, najmanje 72 sata, ili kao što je najmanje 84 sata, najmanje 96 sati ili najmanje 108 sati.

Pogodan test za određivanje poluživota in vivo kod minijaturnih svinja nakon intravenske primene je opisan u testu (II).

Razgradnja gastrointestinalnim enzimima

Prema trećem funkcionalnom aspektu, GLP-1 agonisti pronalaska su stabilni, ili stabilizovani, u odnosu na razgradnju jednim ili više gastrointestinalnih enzima.

Gastrointestinalni enzimi uključuju, bez ograničenja, egzo i endo peptidaze, kao što su pepsin, tripsin, himotripsin, elastaze i karboksipeptidaze. Stabilnost se može testirati u odnosu na ove gastrointestinalne enzime u obliku prečišćenih enzima ili u obliku ekstrakata iz gastrointestinalnog sistema.

U posebnoj realizaciji, agonist GLP-1 pronalaska ima in vitro poluživot (T1⁄2), u ekstraktu tankih creva pacova, podeljen odgovarajućim poluživotom (T1⁄2) GLP-1(7-37), od najmanje 1, kao što je iznad 1,0, najmanje 1,2, najmanje 2,0, ili kao što je najmanje 3,0, ili najmanje 4,0. Drugim rečima, odnos (SI) može biti definisan za svaki GLP-1 agonist, naime kao in vitro poluživot (T1⁄2) dotičnog GLP-1 agonista, u ekstraktu tankog creva pacova, podeljen odgovarajućim poluživotom (T1⁄2) GLP-1(7-37).

Pogodan test za određivanje poluživota in vitro u ekstraktu tankih creva pacova opisan je u testu (V).

GLP-1 AGONISTI

U jednoj realizaciji GLP-1 agonisti pronalaska imaju GLP-1 aktivnost. U jednoj realizaciji „agonist GLP-1“ se podrazumeva kao bilo koje jedinjenje, uključujući peptide i nepeptidna jedinjenja, koja u potpunosti ili delimično aktiviraju ljudski GLP-1 receptor. U jednoj realizaciji „GLP-1 agonist“ je bilo koji peptidni ili nepeptidni mali molekul koji se vezuje za GLP-1 receptor, poželjno sa konstantom afiniteta (KD) ili potencijom (EC50) ispod 1 mM, npr. ispod 100 nM mereno metodama poznatim u struci (videti npr. WO 98/08871). U jednoj realizaciji metode za identifikaciju GLP-1 agonista su opisane u WO 93/19175 (Novo Nordisk A/S), a primeri odgovarajućih GLP-1 agonista koji se mogu koristiti u skladu sa ovim pronalaskom uključuju one navedene u WO 2005/027978 (Novo Nordisk A/S), čija su učenja ovde uključena putem reference. „GLP-1 aktivnost“ se odnosi na sposobnost da veže GLP-1 receptor i inicira putanju prenosa signala koja rezultira insulinotropnim dejstvom ili drugim fiziološkim efektima kao što je poznato u tehnici. Na primer, GLP-1 agonisti pronalaska mogu se testirati na GLP-1 aktivnost korišćenjem testa opisanog u testu (I) ovde.

U još jednoj realizaciji GLP-1 agonist je stabilan GLP-1 agonist. Kako se ovde koristi, „stabilni GLP-1 agonist“ označava GLP-1 agonist koji pokazuje in vivo poluživot eliminacije u plazmi od najmanje 24 sata kod čoveka, opcionalno određeno postupkom opisanim u nastavku. Primeri stabilnih GLP-1 agonista mogu se naći u WO2006/097537.

U jednoj realizaciji postupak za određivanje poluživota eliminacije jedinjenja iz plazme kod čoveka može se sprovesti na sledeći način: Jedinjenje se rastvara u izotoničnom puferu, pH 7,4, PBS ili bilo kom drugom pogodnom puferu. Doza se ubrizgava periferno, poželjno u abdomen ili gornji deo butine. Uzorci krvi za određivanje aktivnog jedinjenja uzimaju se u čestim intervalima i tokom dovoljnog trajanja da pokriju terminalni deo eliminacije (npr. pre doze, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 12, 24 (2. dan), 36 (2. dan), 48 (3. dan), 60 (3. dan), 72 (4. dan) i 84 (4. dan) sata nakon doze). Određivanje koncentracije aktivnog jedinjenja vrši se kao što je opisano u Wilken et al., Diabetologia 43 (51), 2000. Izvedeni farmakokinetički parametri izračunati su iz podataka o koncentraciji u vremenu za svakog pojedinačnog subjekta korišćenjem nekomplektnih metoda, koristeći komercijalno dostupan softver WinNonlin verzija 2.1 (Pharsight, Cary, NC, SAD). Konstanta brzine terminalne eliminacije procenjuje se log-linearnom regresijom na terminalnom log-linearnom delu krive koncentracija-vreme i koristi se za izračunavanje poluživota eliminacije.

U jednoj realizaciji, agonist GLP-1 je formulisan tako da ima poluživot kod čoveka od najmanje 48 sati. Ovo se može postići formulacijama sa produženim oslobađanjem poznatim u struci.

U jednoj realizaciji agonist GLP-1 je GLP-1 peptid. GLP-1 peptid je semaglutid. WO 06/097537 otkriva semaglutid (Primer 4), monoacilovani GLP-1 agonist za primenu jednom nedeljno.

U jednoj realizaciji ovaj pronalazak obuhvata farmaceutski prihvatljive soli GLP-1 agonista. Takve soli uključuju farmaceutski prihvatljive soli dobijene adicijom kiselina, farmaceutski prihvatljive metalne soli, amonijumove soli i alkilovane amonijumove soli.

Takođe, kao farmaceutski prihvatljive soli dobijene adicijom kiselina, namenjeni su i hidrati koje su predmetni GLP-1 agonisti u stanju da formiraju.

U jednoj realizaciji lekovi ili farmaceutske kompozicije koje sadrže GLP-1 agonist semaglutid mogu se primenjivati parenteralno pacijentu kome je to potrebno. U jednoj realizaciji parenteralna primena se može izvesti supkutanom, intramuskularnom ili intravenskom injekcijom pomoću šprica, opcionalno šprica olovke.

Alternativno, parenteralna primena se može izvršiti pomoću infuzione pumpice. Dalja opcija je kompozicija koja može biti prah ili tečnost za primenu GLP-1 agonista u obliku nazalnog ili plućnog spreja. Kao još jedna opcija, agonist GLP-1 može se primenjivati i transdermalno, npr. iz flastera, opciono jontoforetskog flastera, ili transmukozno, npr. bukalno. Gore navedeni mogući načini primene GLP-1 agonista ne smatraju se ograničavajućim obimom pronalaska.

U jednoj realizaciji agonist GLP-1 se primenjuje zajedno sa dodatnim terapeutski aktivnim sredstvom koje se koristi u tretmanima definisanim ovde.

U jednoj realizaciji GLP-1 peptid sadrži [Aib8,Arg34]GLP-1-(7-37).

Ljudski glukagon-sličan peptid-1 je GLP-1(7-37) i ima sekvencu HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFI AWLVKGRG (SEQ ID NO: 1). GLP-1(7-37) se takođe može označiti kao „nativni“ GLP-1. U listi sekvenci, prvom amino-kiselinskom ostatku SEQ ID NO: 1 (histidin) je dodeljen br.1. Međutim, u onome što sledi - prema ustaljenoj praksi u tehnici - ovaj histidinski ostatak se označava kao br.7, a naredni amino-kiselinski ostaci su numerisani u skladu sa tim, i završavaju se sa glicinom br.37. Stoga, generalno, svaka referenca ovde na broj amino-kiselinskog ostatka ili broj pozicije GLP-1(7-37) sekvence odnosi se na sekvencu koja počinje sa His na poziciji 7 i završava se sa Gly na poziciji 37. Neograničavajući primer odgovarajuće analogne nomenklature je [Aib<8>,Arg<34>,Lys<37>]GLP-1(7-37), koji označava GLP-1(7-37) analog, u kome je alanin na poziciji 8 supstituisan sa αaminoizobuternom kiselinom (Aib), lizin na poziciji 34 je supstituisan sa argininom, a glicin na poziciji 37 je supstituisan sa lizinom.

Koncentracija u plazmi agonista GLP-1 iz pronalaska može se odrediti korišćenjem bilo koje pogodne metode. Na primer, može se koristiti LC-MS (tečna hromatografska masena spektroskopija) ili imunotestovi kao što su RIA (radio-imunološki test), ELISA (enzimski imunosorbentni test) i LOCI (imuno-određivanje svetlosti indukovane singletnim kiseonikom). Opšti protokoli za odgovarajuće RIA i ELISA testove nalaze se u npr. WO 09/030738 na str.116-118. Poželjan test je LOCI (Luminescentni imunotest kanalisanja kiseonika), generalno kao što je opisano za određivanje insulina od strane Poulsena i Jensena u časopisu Journal of Biomolecular Screening 2007, vol.12, str.240-247 - ukratko, uzorci krvi mogu se sakupljati u željenim intervalima, plazma se odvojiti, odmah zamrznuti i čuvati na -20°C dok se ne analizira koncentracija u plazmi odgovarajućeg GLP-1 agonista; donorske perle su obložene streptavidinom, dok su akceptorske perle konjugovane sa monoklonskim antitelom koje prepoznaje srednji/C-terminalni epitop peptida; drugo monoklonsko antitelo, specifično za N-terminus, je biotinilisano; tri reaktanta se kombinuju sa analitom i formiraju dvostrani imunokompleks; osvetljavanje kompleksa oslobađa singletne atome kiseonika iz donorskih perli, koji se kanališu u akceptorske perle i pokreću hemiluminescenciju koja se može meriti u Envision čitaču ploča; količina svetlosti je proporcionalna koncentraciji jedinjenja.

U jednoj realizaciji termin „Aib“, kako se ovde koristi, odnosi se na aaminoizobuternu kiselinu.

FARMACEUTSKE KOMPOZICIJE

Primenjena doza može da sadrži od 5 mg - 100 mg GLP-1 agonista, ili od 5-50 mg, ili od 5-20 mg, ili od 5-10 mg GLP-1 agonista.

Farmaceutske kompozicije koje sadrže GLP-1 agonist pronalaska ili njegovu farmaceutski prihvatljivu so, amid ili estar, i farmaceutski prihvatljiv ekscipijens mogu se pripremiti kao što je poznato u struci.

U jednoj realizaciji izraz „ekscipijens” se široko odnosi na bilo koju komponentu osim aktivnog(ih) terapijskog sastojka(sastojaka). Pomoćna supstanca može biti inertna supstanca, neaktivna supstanca i/ili medicinski neaktivna supstanca. Formulacija farmaceutski aktivnih sastojaka sa različitim ekscipijensima poznata je u tehnici, videti npr. Remington: The Science and Practice of Pharmacy (e.g.19<th>edition (1995), i sva kasnija izdanja). Neograničavajući primeri pomoćnih materija su: rastvarači, razblaživači, puferi, konzervansi, sredstva za regulisanje toničnosti (npr. izotonična sredstva), helatna sredstva, stabilizatori (npr. inhibitori oksidacije, inhibitori agregacije, surfaktanti i/ili inhibitori proteaze).

Primeri formulacija uključuju tečne formulacije, tj. vodene formulacije koje sadrže vodu. Tečna formulacija može biti rastvor ili suspenzija. Vodena kompozicija obično sadrži najmanje 50 % w/w vode, ili najmanje 60%, 70%, 80%, ili čak najmanje 90% w/w vode.

Alternativno, farmaceutska kompozicija može biti čvrsta formulacija, npr. sastav sušen liofilizacijom ili raspršivanjem, koji se može koristiti kakav jeste, ili u koji lekar ili pacijent dodaju rastvarače i/ili razblaživače pre upotrebe.

pH vrednost u vodenoj formulaciji može biti bilo koja vrednost između pH 3 i pH 10, na primer od oko 7,0 do oko 9,5; ili od oko 3,0 do oko 7,0.

Kompozicija dalje može biti kombinovana u nosaču leka ili sistemu za isporuku leka, npr. u cilju poboljšanja stabilnosti, bioraspoloživosti i/ili rastvorljivosti. U posebnoj realizaciji, kompozicija može biti vezana za takav sistem putem kovalentnih, hidrofobnih i/ili elektrostatičkih interakcija. Svrha takvog kombinovanja može biti, npr., smanjenje neželjenih efekata, postizanje hronoterapije i/ili povećanje saradnje pacijenata.

Kompozicija se takođe može koristiti u formulaciji sistema za kontrolisano, produženo, produženo, usporeno i/ili sporo oslobađanje lekova.

Kompozicija se daje parenteralno. Parenteralna primena se može izvesti supkutanom, intramuskularnom, intraperitonealnom ili intravenskom injekcijom pomoću šprica, opcionalno šprica u obliku olovke ili pomoću infuzione pumpe.

PROIZVODNI POSTUPCI

U jednoj realizaciji, GLP-1 peptidi mogu da se proizvedu odgovarajućom derivatizacijom odgovarajuće peptidne kičme koja je proizvedena tehnologijom rekombinantne DNK ili sintezom peptida (npr. sinteza čvrste faze tipa Merifild) kao što je poznato u tehnici sinteze peptida i hemiji peptida.

U jednoj realizaciji, proizvodnja peptida poput GLP-1(7-37) i GLP-1 analoga je dobro poznata u tehnici. GLP-1 deo GLP-1 peptida iz pronalaska (ili njegovih fragmenata) može se, na primer, proizvesti klasičnom sintezom peptida, na primer, sintezom peptida u čvrstoj fazi korišćenjem t-Boc ili Fmoc hemije ili drugih dobro utvrđenih tehnika, vidi, npr., Greene i Wuts, „Protective Groups in Organic Synthesis”, John Wiley & Sons, 1999, Florencio Zaragoza Dörwald, „Organic Synthesis on solid Phase”, Wiley-VCH Verlag GmbH, 2000, i „Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis”, priređen od W.C. Chan i P.D. White, Oxford University Press, 2000.

U jednoj realizaciji, GLP-1 agonisti se mogu proizvesti rekombinantnim metodama, tj. kultivisanjem ćelije domaćina koja sadrži DNK sekvencu koja kodira GLP-1 agonist i sposobnu da eksprimuje peptid u pogodnom hranljivom medijumu pod uslovima koji dozvoljavaju ekspresiju peptida. Neograničavajući primeri ćelija domaćina pogodnih za ekspresiju ovih peptida su: Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, kao i BHK ili CHO ćelijske linije sisara.

U jednoj realizaciji GLP-1 agonisti iz pronalaska koji uključuju neprirodne aminokiseline i/ili kovalentno vezan N-terminalni mono- ili dipeptidni mimetik mogu npr. biti proizvedeni kako je opisano u eksperimentalnom delu. Ili vidi npr. Hodgson et al: „The synthesis of peptides and proteins containing non-natural amino acids”, Chemical Society Reviews, vol.33, no.7 (2004), p.422-430; i WO 2009/083549 A1 pod nazivom „Semirecombinant preparation of GLP-1 analogues”.

PRIMERI

Skraćenice

Sledeće skraćenice se koriste u nastavku, po abecednom redu:

ADA: Američko udruženje za dijabetes

Primer 1: Glp-1 peptid semaglutid obezbeđuje smanjenje HbA1c i telesne težine Semaglutid je jedinstveni acilovani GLP-1 peptid sa poluživotom od 160 sati. Cilj je bio da se ispita zavisnost HbA1c od doze semaglutida primenjenih jednom nedeljno (pet nivoa doziranja) kod osoba sa dijabetesom tipa 2. Takođe su ispitivani bezbednost, podnošljivost i farmakodinamika semaglutida u odnosu na placebo i otvorenu terapiju liraglutidom jednom dnevno.

Materijali i postupci

Liraglutid se može dobiti kao što je opisano u Primeru 37 iz WO98/08871.

Semaglutid se može pripremiti kao što je opisano u Primeru 4 iz WO2006/097537. Sastav primenjenih GLP-1 agonista može biti formulisan kao izotonični vodeni rastvori sa fosfatnim puferom, kao što je natrijum-dihidrogen-fosfatni pufer, koji ima pH u opsegu 7,0-9,0, kao što je pH 7,4 ili pH 8,15, na primer, koji dodatno sadrži ekscipijente propilen glikol i fenol.

Kompozcija GLP-1 agonista koji se primenjuju može biti onakav kakav je opisan u WO2003/002136 ili WO2005/049061. Kompozcija placeba može biti identična kompoziciji GLP-1 agonista, ali ne može da sadrži GLP-1 agonist.

U 12-nedeljnom, nasumičnom, dvostruko slepom, placebo kontrolisanom ispitivanju, 411 ljudi (n=43–50 po grupi) sa dijabetesom tipa 2 je bilo izloženo leku. Učesnici (muškarci/žene 65/35%; početni HbA1c (srednja vrednost ± standardna devijacija) 8,1 ± 0,8%; početna telesna težina 87,5 ± 13,8 kg; trajanje dijabetesa 2,6 ± 3,1 godine; samo metformin/samo dijeta i vežbanje 80/20%) primali su potkožnu injekciju jedne od pet doza semaglutida (0,1–1,6 mg) jednom nedeljno, otvoreni liraglutid (1,2 mg, 1,8 mg) jednom dnevno ili placebo jednom nedeljno. Dve doze semaglutida su titrirane (T) u nedeljnim koracima od 0,4 mg. Primarni krajnji cilj bila je promena HbA1c u odnosu na početnu vrednost. Sekundarni krajnji ciljevi efikasnosti uključivali su procenat ispitanika koji su dostigli ciljni nivo HbA1c za ADA (<7%) i promenu telesne težine. Promena i procenat u odnosu na cilj analizirani su pomoću ANOVA i logističke regresije, respektivno. Poređenja između semaglutida i liraglutida nisu korigovana za multiplicitet. Početne karakteristike subjekata date su u Tabeli 1.

Tabela 1. Početne karakteristike subjekata

Podaci su srednja vrednost (SD) osim ako nije drugačije naznačeno. *: Broj ispitanika izloženih stvarnom tretmanu. D&E: Dijeta i vežbanje FPG: Glukoza u plazmi na gladno. BMI: Indeks telesne mase.

Rezultati

U kompletnom analiziranom skupu, semaglutid (≥0,2 mg) je zavisno od doze smanjio HbA1c u odnosu na početnu vrednost (Sl.1) i povećao verovatnoću postizanja HbA1c <7% (p<0,05 u odnosu na placebo za doze ≥0,2 mg). Rezultati u pogledu promene HbA1c prikazani su na slici 1. Promena HbA1c na slici 1 je u odnosu na početnu vrednost u 12. nedelji. Slika 2 prikazuje promenu HbA1c tokom vremena sa različitim tretmanima.

Lečenje semaglutidom ≥0,8 mg numerički je dovelo više pacijenata do cilja nego liraglutid 1,8 mg (0,8 mg T 69%, 0,8 mg 73%, 1,6 mg T 81% u odnosu na liraglutid 1,8 mg 57%). Rezultati (videti npr. sl.1) pokazuju da je lečenje semaglutidom 0,8 mg, 0,8 mg T ili 1,6 mg T poboljšalo smanjenje HbA1c u poređenju sa lečenjem liraglutidom 1,2 mg ili 1,8 mg; štaviše, lečenje semaglutidom 1,6 mg T bilo je statistički superiornije u odnosu na lečenje liraglutidom 1,2 mg ili 1,8 mg u pogledu smanjenja HbA1c (na osnovu neprilagođenih srednjih vrednosti). Slika 3 prikazuje procenat i broj ispitanika koji su dostigli AACE ili ADA kriterijume za kontrolu glikemije sa različitim tretmanima. Rezultati (videti sl.3) pokazuju da je tretman semaglutidom 0,8 mg, 0,8 mg T ili 1,6 mg T poboljšao procenat i broj ispitanika koji su dostigli AACE ili ADA kriterijume za glikemijsku kontrolu u poređenju sa tretmanom liraglutidom 1,2 mg ili 1,8 mg.

Telesna težina je zavisno od doze smanjena u odnosu na početnu vrednost do 4,8 kg u odnosu na placebo 1,2 kg (p<0,01 za doze ≥0,8 mg). Sl.4 i 5 prikazuju prosečnu promenu telesne težine u odnosu na vreme i promenu telesne težine od početne vrednosti u 12. nedelji, respektivno, sa različitim tretmanima. Rezultati (videti npr. sl.5) pokazuju da je tretman semaglutidom 0,8 mg, 0,8 mg T ili 1,6 mg T povećao smanjenje telesne težine u poređenju sa tretmanom liraglutidom 1,2 mg ili 1,8 mg. Štaviše, rezultati (videti npr. sl.5) pokazuju da je tretman semaglutidom 0,8 mg T ili 1,6 mg T bio statistički superiorniji u odnosu na tretman liraglutidom 1,8 mg u pogledu smanjenja telesne težine; i da je tretman semaglutidom 0,8 mg, 0,8 mg T ili 1,6 mg T bio statistički superiorniji u odnosu na liraglutid 1,2 mg u pogledu smanjenja telesne težine (na osnovu neprilagođenih srednjih vrednosti).

Nije bilo izveštaja o pankreatitisu ili promenama kalcitonina u krvi povezanim sa lečenjem. Udeo ispitanika sa mučninom i povraćanjem povećavao se sa dozom, ali su generalno bili blagi ili umereni i poboljšavali su se titracijom. Povlačenja iz terapije zbog gastrointestinalnih neželjenih događaja bila su 4,7%-27,7% za semaglutid i 2,2%-10% za liraglutid. Malo ispitanika je prijavilo blagu hipoglikemiju (semaglutid n=5, liraglutid n=3); nije bilo veće hipoglikemije. Reakcije na mestu injekcije prijavilo je 7 ispitanika: semaglutid n=2; liraglutid n=5. Jedan ispitanik (semaglutid 1,6 mg T) razvio je nizak titar neneutralizujućih antitela protiv semaglutida (bez unakrsne reakcije sa prirodnim GLP-1).

Zaključak

Tokom 12 nedelja, semaglutid je zavisno od doze smanjio HbA1c i telesnu težinu. Efekat semaglutida 0,4 mg na kontrolu glikemije i telesnu težinu bio je uporediv sa efektom liraglutida 1,2 mg, dok je semaglutid ≥0,8 mg izgleda doveo više ispitanika do cilja i obezbedio bolji gubitak težine nego liraglutid 1,8 mg. Nisu utvrđene nikakve zabrinutosti u vezi sa bezbednošću semaglutida. Povećanje doze nije bio glavni fokus ovog ispitivanja i biće optimizovano u budućim kliničkim ispitivanjima.

Farmakološki Postupci

Test (I): In Vitro Jačina

Svrha ovog primera je da se testira aktivnost, ili potencija, GLP-1 agonista in vitro. Potencija GLP-1 agonista može se odrediti kao što je opisano u nastavku, tj. kao stimulacija formiranja cikličnog AMP (cAMP) u medijumu koji sadrži membrane koje ekspresuju ljudski GLP-1 receptor.

Princip

Prečišćene plazma membrane iz stabilne transfektovane ćelijske linije, BHK467-12A (tk-ts13), koje eksprimiraju humani GLP-1 receptor, stimulišu se dotičnim GLP-1 agonistom, a potencija proizvodnje cAMP-a se meri korišćenjem AlphaScreen™ cAMP Assay Kit-a od Perkin Elmer Life Sciences. Osnovni princip AlphaScreen testa je konkurencija između endogenog cAMP-a i egzogeno dodatog biotin-cAMP-a. Hvatanje cAMP-a se postiže upotrebom specifičnog antitela konjugovanog sa akceptorskim kuglicama.

Kultura ćelija i priprema membrana

Za skrining se biraju stabilna transfektovana ćelijska linija i klon sa visokom ekspresijom. Ćelije se gaje na 5% CO2u DMEM, 5% FCS, 1% Pen/Strep (penicilin/streptomicin) i 0,5 mg/ml selekcionog markera G418.

Ćelije sa približno 80% konfluencije se ispere 2 puta sa PBS i sakupe pomoću Versene-a (vodeni rastvor tetranatrijumove soli etilendiamintetrasirćetne kiseline), centrifugiraju 5 minuta na 1000 o/min i supernatant se ukloni. Dodatni koraci se izvode na ledu. Ćelijski talog se homogenizuje pomoću Ultraturaksa tokom 20-30 sekundi u 10 ml pufera 1 (20 mM Na-HEPES, 10 mM EDTA, pH=7,4), centrifugira 15 minuta na 20.000 o/min, a talog se resuspenduje u 10 ml pufera 2 (20 mM Na-HEPES, 0,1 mM EDTA, pH=7,4).

Suspenzija se homogenizuje 20-30 sekundi i centrifugira 15 minuta na 20.000 o/min.

Suspenzija u puferu 2, homogenizacija i centrifugiranje se ponavljaju jednom i membrane se resuspenduju u puferu 2. Koncentracija proteina je određena i membrane su čuvane na -80°C do upotrebe.

Test se izvodi na pločama sa 96 bunarića, 1⁄2 površine i ravnim dnom (npr. Costar kat. br.: 3693). Konačna zapremina po bunariću je 50 µl.

Rastvori i reagensi

Primeri rastvora i reagensa dati su u nastavku.

Komplet za analizu AlphaScreen cAMP od Perkin Elmer Life Sciences (kat. br.: 6760625M); sadrži kuglice akceptora anti-cAMP (10 U/µl), kuglice donora streptavidina (10 U/µl) i biotinilovani cAMP (133 U/µl).

AlphaScreen pufer, pH=7,4: 50 mM TRIS-HCl (Sigma, kat. br.: T3253); 5 mM HEPES (Sigma, kat. br.: H3375); 10 mM MgCl2, 6H2O (Merck, kat. br.: 5833); 150 mM NaCl (Sigma, kat. br.: S9625); 0,01% Tween (Merck, kat. br.: 822184). Sledeće je dodato u AlphaScreen pufer pre upotrebe (navedene su konačne koncentracije): BSA (Sigma, kat. br. A7906): 0,1%; IBMX (Sigma, kat. br. I5879): 0,5 mM; ATP (Sigma, kat. br. A7699): 1 mM; GTP (Sigma, kat. br. G8877): 1 µM.

cAMP standard (faktor razblaživanja u testu = 5): cAMP rastvor: 5 µL 5 mM cAMP-osnovnog rastvora 495 µL AlphaScreen pufera.

Pripremaju se odgovarajuće serije razblaženja u AlphaScreen puferu cAMP standarda, kao i GLP-1 agonista koji se testira, npr. sledećih osam koncentracija GLP-1 agonista: 10<-7>, 10<-8>, 10<-9>, 10<-10>, 10<-11>, 10<-12>, 10<-13>i 10<-14>M, i serija od, npr., 10<-6>do 3x10<-11>cAMP-a.

Membranske/akceptorske perle

Koristite hGLP-1/BHK 467-12A membrane; 6 µg/bunarić, što odgovara 0,6 mg/ml (količina membrana koje se koriste po bunariću može da varira)

„Bez membrana“: Akceptorske kuglice (15µg/ml konačno) u AlphaScreen puferu „Membrane od 6 µg/bunarić“: membrane akceptorske kuglice (konačno 15 µg/ml) u AlphaScreen puferu

Dodati 10 µl „Bez membrana“ u cAMP standard (po bunariću u duplikatima) i pozitivne i negativne kontrole.

Dodati 10 µl „membrana od 6 µg/bunarić“ GLP-1 i GLP-1 agonistima (po bunariću u duplikatima/triplikatima)

Poz. Kontrola: 10 µl „bez membrana“ 10 µl AlphaScreen pufera

Neg. Kontrola: 10 µl „bez membrana“ 10 µl cAMP osnovnog rastvora (50µM) Pošto su perle osetljive na direktno svetlo, svako rukovanje se vrši u mraku (što je moguće tamnije) ili na zelenom svetlu. Sva razblaženja se prave na ledu.

Procedura

1. Napravite AlphaScreen bafer.

2. Rastvoriti i razblažiti GLP-1 agoniste/cAMP standard u AlphaScreen puferu.

3. Napravite rastvor donorskih perli i inkubirajte 30 minuta na sobnoj temperaturi. 4. Dodati cAMP/GLP-1 agoniste na ploču: 10 µl po bunariću.

5. Pripremite rastvor membrane/akceptorskih perli i dodajte ga na ploče: 10 µl po bunariću.

6. Dodati donorske perle: 30 µl po bunariću.

7. Umotajte ploču u aluminijumsku foliju i inkubirajte na mućkalici 3 sata (veoma sporo) na sobnoj temperaturi.

8. Brojanje na AlphaScreen-u – svaka ploča se prethodno inkubira u AlphaScreen-u 3 minuta pre brojanja.

Vrednosti EC50[pM] mogu se izračunati korišćenjem softvera Graph-Pad Prism (verzija 5). Po želji, varijacija u odnosu na GLP-1 može se izračunati kao EC50(GLP-1) / EC50(analog) – 3693,2.

Test (II): Poluživot kod patuljastih svinja

Cilj ove studije je da se utvrdi produženje dejstva in vivo GLP-1 agonista nakon intravenske primene kod patuljastih svinja, tj. produženje njihovog vremena delovanja. Ovo se radi u farmakokinetskoj (FK) studiji, gde se određuje terminalni poluživot dotičnog GLP-1 agonista. Pod terminalnim poluživotom se generalno podrazumeva vremenski period potreban da se prepolovi određena koncentracija u plazmi, mereno nakon početne faze distribucije.

U studijama su korišćeni mužjaci getingenskih patuljastih svinja od uzgajivača Ellegaard Göttingen Minipigs (Dalmose, Danska), starosti približno 7-14 meseci i težine od približno 16-35 kg. Patuljaste svinje se drže pojedinačno i hrane ograničeno jednom ili dva puta dnevno SDS dijetom za patuljaste svinje (Special Diets Services, Eseks, UK). Nakon najmanje 2 nedelje aklimatizacije, svakoj životinji se implantiraju dva trajna centralna venska katetera u venu kaudalis ili kranijalis. Životinjama se daje jedna nedelja oporavka nakon operacije, a zatim se koriste za ponovljene farmakokinetske studije sa odgovarajućim periodom ispiranja između doza.

Životinje se drže gladne približno 18 sati pre doziranja i najmanje 4 sata nakon doziranja, ali imaju neograničen pristup vodi tokom celog perioda.

GLP-1 agonist se rastvara u 50 mM natrijum fosfatu, 145 mM natrijum hloridu, 0,05% Tween 80, pH 7,4 do koncentracije obično od 20-60 nmol/ml. Intravenske injekcije (zapremina koja obično odgovara 1-2 nmol/kg, na primer 0,033 ml/kg) jedinjenja se daju kroz jedan kateter, a krv se uzorkuje u unapred određenim vremenskim tačkama do 13 dana nakon doziranja (poželjno kroz drugi kateter). Uzorci krvi (na primer 0,8 ml) su sakupljeni u EDTA puferu (8 mM) i zatim centrifugirani na 4°C i 1942G tokom 10 minuta. Plazma se pipetira u Micronic epruvete na suvom ledu i čuva na -20°C dok se ne analizira koncentracija odgovarajućeg GLP-1 jedinjenja u plazmi korišćenjem ELISA ili sličnog testa zasnovanog na antitelima ili LC-MS. Pojedinačni profili koncentracije u plazmi u odnosu na vreme analiziraju se nekompartmentalnim modelom u WinNonlin v.5.0 (Pharsight Inc., Mountain View, CA, SAD), a zatim se određuje rezultujući terminalni poluživot (harmonična srednja vrednost).

Test (III): Uticaj na glukozu u krvi i telesnu težinu

Cilj studije je da se potvrdi efekat GLP-1 agonista na glukozu u krvi (GK) i telesnu težinu (TT) kod dijabetičara. GLP-1 agonisti mogu biti testirani u studiji doza-odgovor na modelu gojaznih, dijabetičkih miševa (db/db miševi) kao što je opisano u nastavku.

Pedeset db/db miševa (Taconic, Danska), hranjenih od rođenja dijetom NIH31 (NIH 31M Rodent Diet, komercijalno dostupna od Taconic Farms, Inc., SAD, videti www.taconic.com), uključeni su u studiju u uzrastu od 7-9 nedelja. Miševima je dat slobodan pristup standardnoj hrani (npr. Altromin 1324, Brogaarden, Gentofte, Danska) i vodi iz slavine i držani su na 24°C. Nakon 1-2 nedelje aklimatizacije, bazalna glukoza u krvi se procenjuje dva puta tokom dva uzastopna dana (tj. u 9 ujutru).8 miševa sa najnižim vrednostima glukoze u krvi mogu biti isključeni iz eksperimenata. Na osnovu srednjih vrednosti glukoze u krvi, preostala 42 miša mogu biti odabrana za dalje eksperimentisanje i raspoređena u 7 grupa (n=6) sa odgovarajućim nivoima glukoze u krvi. Miševi se mogu koristiti u eksperimentima u trajanju od 5 dana do 4 puta. Nakon poslednjeg eksperimenta, miševi su eutanazirani.

Sedam grupa mogu da prime lečenje kao što sledi:

1: Vehikulum, supkutano

2: GLP-1 agonist, 0,3 nmol/kg, supkutano

3: GLP-1 agonist, 1,0 nmol/kg, supkutano

4: GLP-1 agonist, 3,0 nmol/kg, supkutano

5: GLP-1 agonist, 10 nmol/kg, supkutano

6: GLP-1 agonist, 30 nmol/kg, supkutano

7: GLP-1 agonist, 100 nmol/kg, supkutano

Vehikulum: 50 mM natrijum fosfat, 145 mM natrijum hlorid, 0,05% Tween 80, pH 7,4.

GLP-1 agonist se rastvara u vehikulumu, npr. do koncentracija od 0,05, 0,17, 0,5, 1,7, 5,0 i 17,0 nmol/ml. Životinjama se daje supkutana doza od 6 ml/kg (tj.300 µl po mišu od 50 g).

Na dan doziranja, glukoza u krvi se procenjuje u vremenu -1⁄2 sata (8:30 časova), nakon čega se miševi mere. GLP-1 agonist se dozira približno u 9 sati ujutru (vreme 0). Na dan doziranja, glukoza u krvi se procenjuje, npr. u vremenima od 1, 2, 4 i 8 sati (10:00, 11:00, 13:00 i 17:00 časova).

Narednih dana, nivo glukoze u krvi se procenjuje, npr. u vremenu 24, 48, 72 i 96 sati nakon doziranja (tj. u 9 časova ujutru 2., 3., 4. i 5. dana). Svakog dana, miševi se mere nakon uzorkovanja glukoze u krvi.

Miševi se mere pojedinačno na digitalnoj vagi.

Uzorci za merenje glukoze u krvi dobijaju se iz kapilara na vrhu repa svesnih miševa. Krv, 10 µl, se sakuplja u heparinizovane kapilare i prenosi u 500 µl glukoznog pufera (EKF sistemski rastvor, Ependorf, Nemačka). Koncentracija glukoze se meri metodom glukoza oksidaze (analizator glukoze Biosen 5040, EKF Diagnostic, GmbH, Barleben, Nemačka). Uzorci se čuvaju na sobnoj temperaturi do 1 sata do analize. Ako se analiza mora odložiti, uzorci se čuvaju na 4°C najviše 24 sata.

ED50je doza koja dovodi do polovine maksimalnog efekta u nmol/kg. Ova vrednost se izračunava na osnovu sposobnosti GLP-1 agonista da smanje telesnu težinu, kao i sposobnosti da smanje glukozu u krvi, kao što je objašnjeno u nastavku.

ED50za telesnu težinu se izračunava kao doza koja dovodi do polovine maksimalnog efekta na delta telesnu težinu 24 sata nakon potkožne primene GLP-1 agonista. Na primer, ako je maksimalno smanjenje telesne težine nakon 24 sata 4,0 g, onda bi ED50telesne težine bila ona doza u nmol/kg koja dovodi do smanjenja telesne težine nakon 24 sata od 2,0 g. Ova doza (ED50telesne težine) može se očitati sa krive dozaodgovor.

ED50za glukozu u krvi se izračunava kao doza koja dovodi do polovine maksimalnog efekta na AUC delta BG 8 sati nakon potkožne primene GLP-1 agonista.

Vrednost ED50može se izračunati samo ako postoji odgovarajući sigmoidni odnos doza-odgovor sa jasnom definicijom maksimalnog odgovora. Dakle, ako to ne bi bio slučaj, dotični agonist GLP-1 se ponovo testira u različitom rasponu doza dok se ne dobije sigmoidni odnos doza-odgovor.

Test (IV): Uticaj na unos hrane

Cilj ovog eksperimenta je ispitivanje uticaja GLP-1 agonista na unos hrane kod svinja. Ovo se radi u farmakodinamskoj (FD) studiji kao što je opisano u nastavku, u kojoj se unos hrane meri 1, 2, 3 i 4 dana nakon primene jedne doze GLP-1 agonista, u poređenju sa kontrolnom grupom tretiranom nosačem.

Koriste se ženke svinja rase Landras Jorkšir Durok (LYD), starosti približno 3 meseca, težine približno 30-35 kg (n=3-4 po grupi). Životinje se smeštaju u grupi 1-2 nedelje tokom aklimatizacije na objekte za životinje. Tokom eksperimentalnog perioda životinje se smeštaju u pojedinačne ograđene prostore od ponedeljka ujutru do petka popodne radi merenja individualnog unosa hrane. Životinje se hrane po volji hranom za svinje (Svinefoder, Antonio) sve vreme, kako tokom aklimatizacije, tako i tokom eksperimentalnog perioda. Unos hrane se prati onlajn beleženjem težine hrane svakih 15 minuta. Sistem koji se koristi je Mpigvin (Ellegaard Sistems, Faaborg, Danska).

GLP-1 agonisti se rastvaraju u fosfatnom puferu (50 mM fosfat, 0,05% Tvin 80, pH 8), npr. u koncentracijama od 12, 40, 120, 400 ili 1200 nmol/ml, što odgovara dozama od 0,3, 1, 3, 10 ili 30 nmol/kg. Fosfatni pufer je služio kao nosač. Životinjama se daje jedna potkožna doza GLP-1 agonista ili nosača (zapremina doze 0,025 ml/kg) ujutru prvog dana, a unos hrane se meri tokom 4 dana nakon doziranja. Poslednjeg dana svake studije, 4 dana nakon doziranja, uzorak krvi za merenje plazma izloženosti GLP-1 agonista se uzima iz srca anesteziranih životinja. Životinje se potom eutanaziraju intrakardijalnom prekomernom dozom pentobarbitona. Sadržaj agonista GLP-1 u plazmi je analiziran korišćenjem ELISA ili sličnog testa zasnovanog na antitelu.

Unos hrane se izračunava kao srednja vrednost ± SEM za 24-časovni unos hrane tokom 4 dana. Statistička poređenja 24-časovnog unosa hrane u grupi koja je primala nosač u odnosu na grupu koja je primala GLP-1 agonist tokom 4 dana vrše se korišćenjem ponovljenih merenja jednofaktorske ili dvofaktorske ANOVA, nakon čega sledi Bonferonijev post-test.

Test (V): Stabilnost prema razgradnji crevnim enzimima

Svrha ovog primera je da se testira stabilnost u odnosu na razgradnju crevnim enzimima. GLP-1(7-37) se može koristiti u testu kao uporedno jedinjenje. Najjače proteolitičke aktivnosti u crevima su pankreasnog porekla i uključuju serinske endopeptidaze tripsin, himotripsin i elastazu, kao i nekoliko vrsta karboksipeptidaza. Test sa ekstraktom tankog creva pacova je razvijen i korišćen kao što je opisano u nastavku.

Ekstrakti iz tankog creva pacova

Tanka creva su pripremljena od pacova i isprana sa 8 ml 150 mM NaCl, 20 mM Hepes pH 7,4. Rastvori se centrifugiraju 15 minuta na 4.600 o/min u centrifugi Heraeus Multifuge 3 S-R sa rotorom 75006445. Supernatanti se uklanjaju i filtriraju kroz Millipore Millex GV PVDF membranu od 0,22 µm. Filtrati nekoliko životinja se objedinjuju kako bi se usrednile individualne razlike.

Sadržaj proteina u dobijenim ekstraktima određuje se Bredfordovim testom (videti npr. Analitička biohemija (1976), vol.72, str.248-254, i Analitička biohemija (1996), vol.236, str.302-308)

Test degradacije

2,5 nmol GLP-1 agonista koji se testiraju inkubiraju se sa crevnim ekstraktom u zapremini od 250 µl na 37°C tokom perioda od jednog sata. Uzorci creva se analiziraju u prisustvu 20 mM Hepes-a pri pH 7,4. Koncentracija crevnog ekstrakta se titrira u pilot eksperimentima tako da poluživot (t1⁄2) GLP-1(7-37) bude u rasponu od 10-20 minuta.

Ekstrakt tankog creva se koristi u koncentraciji od 1,4 µg/ml. Sve komponente osim crevnog ekstrakta se mešaju i prethodno zagrevaju deset minuta na 37°C. Odmah nakon dodavanja crevnog ekstrakta, uzima se uzorak od 50 µl i meša se sa istom zapreminom 1% trifluorosirćetne kiseline (TFA). Dalji uzorci se uzimaju shodno tome nakon 15, 30 i 60 minuta.

Analiza uzorka

UPLC analiza: 10 µl uzoraka se analizira UPLC-om koristeći Waters Acquity sistem sa kolonom BEH C181,7 µm 2,1 x 50 mm i gradijentom od 30 do 65% od 0,1% TFA i 0,07% TFA u acetonitrilu tokom 5 minuta pri brzini protoka od 0,6 ml/min. Nakon oduzimanja osnovne linije, određuju se integrali pikova intaktnih jedinjenja u HPLC hromatogramu snimljenom na talasnoj dužini od 214 nm.

MALDI-TOF analiza: 1 µl svakog uzorka se prenosi na Bruker/Eppendorf PAC HCCA 384 MALDI metu. Analiza se vrši pomoću Bruker Autoflex matrično potpomognutog laserskog desorpcionog i jonizacionog masenog spektrometra sa vremenom leta (MALDI-TOF) korišćenjem unapred definisane metode „PAC_measure“ sa proširenim opsegom detekcije od 500 do 5000 Da i unapred definisane metode kalibracije „PAC_calibrate“.

Analiza podataka Integrali pikova HPLC hromatograma su prikazani u zavisnosti od vremena. Poluživot odgovarajućeg jedinjenja izračunava se uklapanjem podataka korišćenjem softvera SigmaPlot 9.0 i jednačine za eksponencijalni raspad sa 2 parametra. Za svaki testirani agonist GLP-1, relativno vreme poluraspada (relativni T1⁄2) se izračunava kao vreme poluraspada (T1⁄2)dotičnog jedinjenja, podeljeno sa vremenom poluraspada (T1⁄2) GLP-1(7-37), određenim na isti način.

Claims (5)

PATENTNI ZAHTEVI

1. Kompozicija koja sadrži agonist GLP-1 i jedan ili više farmaceutski prihvatljivih ekscipijenasa za upotrebu u prevenciji ili lečenju dijabetesa tipa 2, naznačena time što je navedeni agonist GLP-1 semaglutid, i što se navedeni agonist GLP-1 primenjuje jednom nedeljno u količini od 1,0 mg i što se navedeni agonist GLP-1 primenjuje parenteralnom administracijom.

2. GLP-1 agonist za upotrebu prema zahtevu 1, naznačen time što se navedeni GLP-1 agonist primenjuje supkutanom (s.c.) injekcijom.

3. GLP-1 agonist za upotrebu prema bilo kom od prethodnih zahteva, naznačen time što je navedeni GLP-1 agonist u obliku farmaceutski prihvatljive soli.

4. Agonist GLP-1 za upotrebu prema bilo kom od prethodnih zahteva, naznačen time što se navedena kompozcija sastoji od navedenog agonista GLP-1 i jednog ili više farmaceutski prihvatljivih ekscipijenasa.

5. Kompozicija za upotrebu prema bilo kom od prethodnih zahteva, naznačena time što je pH date kompozicije oko 7,0.