ES2244052T3 - Procedimiento de inhibicion de la descomposicion de peptidos natriureticos y procedimiento mejorado de dosificado de peptidos natriureticos con la ayuda de los indicados peptidos. - Google Patents

Abstract

Un método para inhibir la degradación de péptidos natriuréticos de mamíferos en una muestra de ensayo, que comprende la utilización, en el manejo de la muestra, de un recipiente donde la cara que va a ponerse en contacto con la muestra de ensayo está hecha, o recubierta, con un material que inhibe la activación de una substancia que degrada los péptidos por lo que la citada muestra no contiene aprotinina.

Description

Procedimiento de inhibición de la descomposición de péptidos natriuréticos y procedimiento mejorado de dosificado de péptidos natriuréticos con la ayuda de los indicados péptidos.

Esta invención se refiere a métodos para inhibir la degradación de péptidos natriuréticos por utilización de un recipiente que consiste en un material que inhibe la activación de la substancia que degrada los péptidos, y se refiere también a métodos de medición, ensayo, recogida y almacenado de los péptidos utilizando el recipiente, con lo que los métodos no incluyen el empleo de aprotinina.

La familia de péptidos natriuréticos consiste en al menos tres tipos de péptidos natriuréticos, péptido natriurético atrial (ANP), péptido natriurético del cerebro (BNP) y péptido natriurético tipo C (CNP), El CNP es un péptido regulador de la proliferación vascular secretado principalmente por células endoteliales. Los ANP y BNP son hormonas cardíacas sintetizadas principalmente en el corazón y secretadas desde él. Estos péptidos se sintetizan como pro-hormonas y se escinden al ser péptidos maduros, \alpha-ANP, \alpha-BNP, \alpha-CNP, respectivamente. Los \alpha-ANP, \alpha-BNP, \alpha-CNP humanos consisten en 28, 32 y 22 radicales de aminoácidos, respectivamente.

Algunas enfermedades causan la secreción de estos péptidos natriuréticos en la corriente sanguínea, Dado que la síntesis y secreción de ANP y BNP son promovidas principalmente por una carga contra atrios y ventrículos del corazón, respectivamente, sus secreciones reflejan cambios de las funciones del corazón. Cada péptido se utiliza como un indicador diagnóstico de enfermedades del corazón, especialmente fallos cardiacos. La medición tanto de \alpha-ANP como de \alpha-BNP por inmunoensayo ha sido aplicada ya en el campo clínico.

Dado que \alpha-ANP y \alpha-BNP se degradan fácilmente por proteasas en sangre después de su recogida, son extremadamente inestables en las muestras de sangre. Por esta razón, los resultados de la medición han quedado en gran medida afectados por los métodos de recogida, métodos de almacenado de las muestras de ensayo y el período desde la recogida a la medición. Para medir la concentración de los péptidos con exactitud, ha sido esencial la adición de agentes inhibidores de la degradación, por ejemplo aprotinina y otros, o mantener las muestras a baja temperatura. Pero estas manipulaciones son complicadas, requieren demasiado esfuerzo, y no constituyen métodos completos de pretratamiento de muestras.

Clerico A. y col. [Clinical Chemistry 42:10 (1996), 1627-1633) describe la evaluación de las características analíticas y utilidad clínica de un estuche de equipo (kit) IRMA, comercial, para medir concentraciones de péptido natriurético atrial en plasma utilizando muestras de sangre recogidas de sujetos sanos y pacientes con fallo cardiaco en tubos de polipropileno que contienen aprotinina y EDTA.

Se especula que después de su recogida de la sangre, los péptidos natriuréticos se degradan por substancias tales como proteasas de la sangre. Hasta la fecha, se habían añadido algunos inhibidores de proteasa a las muestras para la inhibición de la degradación de péptidos natriuréticos. Pero esto podría no inhibir por completo la degradación. Los autores de la presente invención han supuesto que factores de
coagulación activados por fase sólida cargada negativamente tal como superficie de vidrio aceleran la degradación de péptidos natriuréticos, cuando las muestras se recogen en un recipiente de vidrio. Los autores de la presente invención han recogido muestras empleando un recipiente de vidrio donde la cara que va a estar en contacto con las muestras estaba recubierta con silicona y han obtenido como resultado la inhibición de la degradación de los péptidos natriuréticos.

Los autores de la presente invención han encontrado que la degradación de péptidos natriuréticos por substancias tales como proteasas puede ser suprimida significativamente utilizando un recipiente recubierto con silicona en la medición de péptido natriurético.

Los autores de la presente invención han encontrado que la degradación de péptidos natriuréticos se puede suprimir por utilización de un recipiente hecho de plástico tal como tereftalato de polietileno (PET), poliestireno, polipropileno, polietileno y resina acrílica.

Estos resultados sugieren que la degradación de péptidos natriuréticos en muestras de ensayo se puede suprimir utilizando un recipiente donde la cara que va a estar en contacto con las muestras está hecha de un material que inhibe la activación de la substancia que degrada los péptidos al manejar las muestras que contienen péptidos natriuréticos de mamíferos. Por lo tanto, es de esperar que la manipulación antes tan complicada de muestras se pueda eliminar por empleo de un recipiente donde la cara que se va a poner en contacto con las muestras de ensayo sea de un material distinto a vidrio, en la medición de los péptidos natriuréticos. Es de esperar además que estos métodos convenientes de recogida de muestras para preparación de muestras de ensayo den resultados más exactos para diagnóstico de enfermedades del corazón que los métodos convencionales ya utilizados en el campo clínico.

Esta invención se basa en el resultado de la medición de péptidos natriuréticos por los métodos así establecidos para inhibición de degradación de péptidos natriuréticos de mamíferos por utilización de un recipiente que no activa substancias que degradan los péptidos al manejar las muestras que contienen los péptidos.

Esta invención se refiere a un método para inhibir la degradación de péptidos natriuréticos de mamíferos por utilización de un recipiente donde la cara que va a estar en contacto con las muestras de ensayo está hecha de un material, preferiblemente silicona o plástico, que inhibe la activación de las substancias que degradan los péptidos con lo que estas muestras no contienen aprotinina.

Los péptidos natriuréticos de mamíferos comprenden al menos ANP y BNP y precursores y derivados de cada tipo de estos péptidos porque en el cuerpo están no solo los tipos naturales sino también precursores tales como \gamma-ANP y \gamma-BNP (BBRC, 214(3), (1995)) y sus derivados- Por mamíferos se entiende toda clase de mamífero que tenga péptidos natriuréticos, tales como son los seres humanos, perros, cerdos, ratas y ratones.

"Manejo de la muestra" significa cualquier tipo de manipulación que se haga con la muestra. tal como recogida, almacenamiento, análisis, medición, etc. de las muestras

"Materiales que inhiben la activación de una substancia que degrada péptidos" significa materiales que pueden inhibir la activación de substancias que degradan los péptidos, tales como proteasas etc. y pueden al menos formar la cara que va a estar en contacto con la muestra contenida en un recipiente de recogida de muestras. Entre los ejemplos del material se incluyen silicona y plástico, preferiblemente polietileno, tereftalato de polietileno, poliestireno, polipropileno, poliamida, resina acrílica, etc. Como silicona comercialmente disponible está, por ejemplo, SILICONIZE L-25 (Ficon Co.). Para una persona experta en la técnica, es posible recubrir con silicona los recipientes comúnmente utilizados hechos de vidrio y polietileno, por utilización de ese reactivo.

"Recipiente" significa cualquier clase de recipiente para recoger muestras, almacenarlas, medirlas, etc., por ejemplo, un recipiente hecho, o recubierto, de un material que inhibe la degradación, preferiblemente de silicona o plástico.

Se puede utilizar cualquier clase de muestras biológicas para medición la muestra de ensayo y siendo las preferidas la sangre completa o el plasma sanguíneo.

Esta invención se refiere a la medición de péptido natriurético en las muestras que no contienen aprotinina.

Aunque se haya añadido aprotinina a las muestras para inhibir la degradación de péptidos natriuréticos por proteasas que son ya activas en la sangre o que se han activado después de la recogida de la sangre, no pueden ser inactivadas por completo las contenidas en las muestras biológicas.

Esta invención se refiere a un método de medición de péptidos natriuréticos de mamíferos que comprende el método de inhibición de la degradación de péptidos.

La medición de péptidos natriuréticos se puede llevar a cabo por medición de la actividad biológica, cromatografía de líquidos, inmunoensayo, etc. Se puede llevar a cabo un inmunoensayo, que puede ser un inmunoensayo competitivo o inmunoensayo o un inmunoensayo sandwich, por cualquier especialista en la técnica. Se puede utilizar también para la medición un estuche (kit) de ensayo "SHIONORIA ANP" para ensayo de \alpha-ANP (Shionogi & Co., Ltd.) o un estuche para ensayo de \alpha-BNP "SHIONORIA BNP" (Shionogi & Co., Ltd.).

La Figura 1 muestra la relación entre los períodos de almacenado en tubos de vidrio o tubos recubiertos de silicona a 25ºC y las actividades residuales de BNP como substancia medida por varias clases de métodos de medición de BNP.

La Figura 2 muestra la relación entre los períodos de almacenado en tubos de tereftalato de polietileno recubiertos de silicona o no recubiertos o tubos de vidrio a 25ºC y las actividades residuales de substancias tipo BNP.

La Figura 3 muestra las actividades residuales de BNP como substancias almacenadas en tubo de vidrio recubierto de silicona o no recubierto y varias clases de tubos de plástico, tales como poliestireno, polipropileno, polietileno reforzado y resina acrílica, durante 24 horas a 25ºC.

La invención se explica más detalladamente con los siguientes ejemplos que no son limitativos de esta invención.

Ejemplo 1 Medición de BNP utilizando tubos de vidrio

(1) Preparación de tubos de vidrio recubiertos de silicona: Se lavaron tubos de vidrio comerciales (Tarumo, Tokyo, Japón) con agua purificada una vez y con solución de silicona al 3% (v/v) (SILICONIZE L-25: Ficon Co.,) tres veces. Se volvieron a lavar una vez con agua purificada y se secaron durante 90 minutos a 300ºC.

(2) Preparación de muestras de ensayo para medición: Se recogió sangre venosa de un sujeto normal en un tubo colector de sangre que contenía EDTA (1,5 mg/ml de EDTA-2Na). Se añadió \alpha-BNP humano (Peptide Institute, Osaka, Japón) a la sangre recogida para conseguir una concentración final de 200 pg/ml, para preparar una muestra de ensayo.

(3) Medición de BNP por el método IRMA: Se tomó con la pipeta la muestra y se pasó a los tubos recubiertos de silicona y a los tubos no recubiertos, respectivamente. Se dejaron reposar durante 0, 2, 6 y 24 horas a temperatura ambiente (25ºC). Se separaron las células de la sangre de estas muestras de ensayo por centrifugación (Kokusan: H-107GA), x2000 g. durante 5 minutos a 4ºC. Estas muestras se almacenaron a -80ºC. Se midieron inmunoreactividades de BNP por SHIONORIA BNP (Shionogi).

Dicho de manera breve, se tomaron con la pipeta 100 \mul de plasma o solución patrón (soluciones de \alpha-BNP: 0, 4, 10, 150, 600, y 2000 pg/ml) e y se pasaron a tubos Shionogi (hechos de poliestireno: Shionogi), respectivamente. A los tubos se añadieron 200 \mul de solución de anticuerpo anti-BNP marcado con yodo y perla de poliestireno con anticuerpo anti-BNP inmovilizado. La mezcla se agitó y se dejó reposar durante 18 horas a 4ºC. Después de lavar dos veces con 2 ml de solución de lavado, se midieron las radioactividades por un contador \gamma ARC-600 (Aloka). El resultado se muestra en la Figura 1.

En el caso de utilizar tubos no recubiertos (Figura 1, \ding{110}), la relación de actividad residual de BNP era de aproximadamente 20% al cabo de 24 horas de reposo. Por otra parte, la relación de actividad residual de BPN era de aproximadamente 80% incluso después de 24 horas de reposo y quedaba suprimida la actividad de substancias que degradan los péptidos por utilizar tubos de vidrio recubiertos de silicona (Figura 1, \boxempty).

La Figura 1 muestra que la actividad de substancias que degradan los péptidos natriuréticos se puede suprimir recubriendo con silicona la cara que se pone en contacto con la muestra de ensayo en un recipiente colector de muestras.

Ejemplo 2 Medición de BNP empleando tubos de tereftalato de polietileno (PET)

(1) Preparación de tubos de PET recubiertos de silicona: Se lavaron tubos comerciales de PET (Terumo, Tokyo, Japón) con agua purificada una vez, y con solución de silicona al 3% (v/v) (SILICONIZE L-25: Ficon Co.,) tres veces. Se lavaron de nuevo una vez con agua purificada y se secaron.

(2) Preparación de una muestra de ensayo para medición: Se recogieron 50 ml de sangre venosa de un sujeto normal en tubos de recogida de sangre que contenían EDTA (1,5 mg/ml EDTA-2Na). Se añadió \alpha-BNP (Peptide Institute) a la sangre recogida para conseguir una concentración final de 200 pg/ml, para preparar una muestra de ensayo.

(3) Medición de BNP por el método IRMA: Se tomó la muestra con la pipeta y se pasó a tubos de PET recubiertos de silicona, a tubos de vidrio recubiertos con silicona, a tubos de PET no recubiertos y a tubos de vidrio no recubiertos, respectivamente. Se dejaron reposar 0, 2, 6, 24 y 72 horas a temperatura ambiente (25ºC). Se separaron las células de la sangre de estas muestras por centrifugación (Kokusan: H-107GA), x 2000 g, durante 5 minutos a 4ºC. Estas muestras de ensayo se almacenaron a -80ºC. Se midieron inmunoreactividades de BNP en estos plasmas sanguíneos por SHIONORIA BNP (Shjonogi). La medición se llevó a cabo por el mismo método que el descrito en el Ejemplo 1.

El resultado se muestra en la Figura 2. La relación de actividad residual de BNP era de aproximadamente el 80% al cabo de 24 horas de reposo debido a la supresión de la actividad de substancias que degradan los péptidos por utilización de los tubos de PET recubiertos de silicona (Figura 2, \circ) y los tubos de PET no recubiertos (Figura 2, \bullet). El resultado era el mismo que el de usar los tubos de vidrio recubiertos de silicona (Figura 2, \boxempty). Por otra parte, la relación de la actividad residual de BNP era 0% después de 24 horas de reposo por utilización de tubos de vidrio cubiertos de silicona (Figura 2, \ding{110} ).

Ejemplo 3 Medición de BNP utilizando tubos de plástico

Como recipientes de almacenado de muestras de ensayo se utilizaron tubos de vidrio, tubos de vidrio recubiertos de silicona, y tubos de plástico. Se emplearon cinco clases de tubos de plástico, es decir, tubos de poliestireno, tubos de polipropileno A, tubos de polipropileno B, tubos de polietileno reforzado, y tubos de resina acrílica.

(1) Medición de BNP por el método IRMA

Se tomó la muestra con la pipeta y se pasó a cada uno de los tubos de plástico antes descritos, recubiertos o no de silicona. Se dejó reposar durante 0 y 24 horas a temperatura ambiente (25ºC). Se separaron las células de la sangre de estas muestras de ensayo por centrifugación (Kokusan: H-107GA), x2000 g, durante 5 minutos a 4ºC. Las muestras de plasma obtenidas se almacenaron a -80ºC. Se midieron las inmunoreactividades en estas muestras de plasma por SHIONORIA BNP (Shionogi). La medición se llevó a cabo por el mismo método que el del Ejemplo
1.

Las relaciones de actividades residuales de BNP eran del 50% o más debido a la supresión de la actividad de substancias que degradan péptidos por empleo de cualquier tipo de tubo de plástico utilizado, es decir, tubo de poliestireno, tubo de polipropileno A, tubo de polipropileno B, tubo de polietileno reforzado, y tubo de resina acrílica (Figura 3, barra 3, 4, 5, 6 y 7). El resultado era el mismo que cuando se empleaba tubo de vidrio recubierto de silicona (Figura 3, barra 2). Por otra parte, la relación de actividad residual de BNP era del 0% empleando tubo de vidrio no recubierto (Figura 3, barra 1).

La actividad residual de BNP decrecía notablemente en tubos de vidrio debido a que el BNP era degradado por substancias que degradan los péptidos tales como proteasas, mientras que la reducción de la actividad residual de BNP quedaba suprimida en tubos de vidrio recubiertos de silicona. Además, en los tubos de plástico hechos de tereftalato de polietileno, poliestireno, polipropileno, polioetileno o recubiertos con resina acrílica con o sin silicona, la degradación de BNP quedaba suprimida debido a la inhibición de la activación de substancias que degradan péptidos.

El método de esta invención para inhibir la degradación de péptidos por utilización de un recipiente donde la cara que se va a poner en contacto con una muestra de ensayo es de un material que inhibe la activación de las substancias de degradación, proporciona datos clínicos estables y fiables, en que los métodos de recogida, métodos de almacenamiento y el período transcurrido hasta la medición no tiene ningún efecto.

Además, contribuirá a un diagnóstico exacto de enfermedades del corazón al proporcionar datos clínicos estables y fiables, de forma económica y conveniente ya que las muestras de sangre se pueden utilizar para mediciones sin manipulación complicada alguna.

Claims (5)

1. Un método para inhibir la degradación de péptidos natriuréticos de mamíferos en una muestra de ensayo, que comprende la utilización, en el manejo de la muestra, de un recipiente donde la cara que va a ponerse en contacto con la muestra de ensayo está hecha, o recubierta, con un material que inhibe la activación de una substancia que degrada los péptidos por lo que la citada muestra no contiene aprotinina.

2. El método según la reivindicación 1, donde el citado material es silicona o plástico.

3. El método según la reivindicación 1 o la 2, donde el citado mamífero es un ser humano, un perro, un cerdo, una rata o un ratón.

4. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 3, donde el citado péptido natriurético es BNP.

5. Un método para medición de péptidos natriuréticos de mamíferos, que comprende el método reivindicado en la reivindicación 1.