ES2245042T3 - Vectores de lentivirus de no primates y sistemas de empaquetamiento. - Google Patents
Vectores de lentivirus de no primates y sistemas de empaquetamiento.Info
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Abstract
Un vector de ácido nucleico que comprende un sitio de encapsidación de VIF y una LTR 5¿ de VIF, en donde la región U3 de la LTR 5¿ está sustituida por una secuencia de control de la expresión que actúa en células humanas; y en donde dicho vector de ácido nucleico es incapaz de producir al menos una proteína vírica necesaria para encapsidar dicho vector en una partícula vírica en el contexto de una célula.
Description
Vectores de lentivirus de no primates y sistemas
de empaquetamiento.
Esta invención se ha realizado con ayuda
gubernamental proporcionada por la Administración de Veteranos y
concedida con el número de concesión Ca 67394 y AI36612 otorgado por
los Institutos Nacionales de Salud. El Gobierno tiene ciertos
derechos sobre esta invención.
La terapia génica proporciona métodos para
combatir enfermedades infecciosas crónicas (p. ej., infección con
VIH), así como enfermedades no infecciosas que incluyen el cáncer y
algunas formas de defectos congénitos, tales como deficiencias
enzimáticas. Se han empleado algunas vías para introducir ácidos
nucleicos en células in vivo, ex vivo e in
vitro. Estas incluyen la entrega de genes mediante liposomas
(Debs y Zhu (1993) documento de patente internacional WO 93/24640 y
el documento de patente de Estados Unidos nº 5.641.662); Mannino y
Gould-Fogerite (1988) BioTechniques
6(7): 682-691; el documento de patente de
EE.UU. de Rose nº 5.279.833; el documento de patente de Brigham
(1991) WO 91/06309; y Felgner y col. (1987) Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 84:7413-7414) y la entrega de genes
mediada por vectores adenovíricos, p. ej., para tratar el cáncer
(véase, p. ej., Chen y col. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA
91: 3054-3057; Tong y col. (1996) Gynecol.
Oncol. 61: 175-179; Clayman y col. (1995)
Cancer Res. 5: 1-6; O'Malley y col. (1995)
Cancer Res. 55: 1080-1085; Hwang y col.
(1995) Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 13:
7-16; Haddada y col. (1995) Curr. Top. Microbiol.
Immunol. 199 (Pt. 3): 297-306; Addison y col.
(1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:
8522-8526; Colak y col. (1995) Brain Res.
691: 76-82; Crystal (1995) Science 270:
404-410; Elshami y col. (1996) Human Gene
Ther. 7: 141-148; Vincent y col. (1996) J.
Neurosurg. 85: 648-654). También se han empleado
vectores retrovíricos con replicación defectuosa que albergan una
secuencia terapéuticas de polinucleótidos como parte del genoma
retrovírico, particularmente en relación con vectores MuLV
sencillos. Véase, p. ej., Miller y col. (1990) Mol. Cell.
Biol. 10:4239 (1990); Kolberg (1992) J. NIH Res. 4:43 y
Cornetta y col. Hum. Gene Ther. 2:215 (1991)).
Uno de los objetos más atractivos para la terapia
génica es la infección con VIH. La expansión pandémica del VIH ha
conducido a un intenso esfuerzo a escala mundial para desentrañar
los mecanismos moleculares y el ciclo vital de estos virus. Ahora
está claro que el ciclo de vida de los VIH proporciona muchas dianas
potenciales para inhibir mediante terapia génica, que incluye la
expresión celular de ácidos nucleicos de gag y env
mutantes transdominantes para interferir con la entrada del virus,
TAR (el sitio de unión de tat, que se requiere típicamente
para la transactivación) es una señal para inhibir la transcripción
y la transactivación y RRE (el sitio de unión de Rev; es decir, el
elemento de respuesta a Rev, (del inglés, Rev Response Element) es
un señuelo y los mutantes Rev transdominantes inhiben el
procesamiento del ARN. Véase, Rosenburg y Fauci (1993) en
Fundamental Immunology, Tercera Edición Paul (compilador)
Raven Press, Ltd., Nueva York y las referencias citadas para un
resumen de la infección con VIH y el ciclo vital del VIH. Los
vectores para la terapia génica que codifican ribozimas, moléculas
antiparalelas, genes señuelos, genes transdominantes y genes
suicidas, que incluyen los retrovirus, son descritos por Yu y col.,
Gene Therapy (1994) 1:13-26. Los agentes
terapéuticos antiparalelos y las ribozimas tienen una importancia
creciente para el tratamiento y la prevención de la infección con
VIH.
A pesar de las diversas vías terapéuticas génicas
que están avanzando ahora para tratar el cáncer, el VIH y similares,
existe una variedad de limitaciones en los sistemas de entrega
empleados generalmente en la terapia génica. Por ejemplo, en
relación con el tratamiento del VIH, los vectores retrovíricos de
múridos empleados ampliamente transducen (transfieren los ácidos
nucleicos) de forma defectuosa los linfocitos humanos de la sangre
periférica y fracasan en la transducción de células que no se
dividen, tales como los monocitos/macrófagos, que son conocidos por
ser depósitos de VIH. Son deseables nuevos vectores seguros para la
entrega de inhibidores víricos, particularmente, a las células
pluripotenciales hematopoyéticas que no se dividen, para el
tratamiento de la infección con
VIH.
VIH.
Los lentivirus de no primates proporcionan un
posible sistema para el desarrollo de nuevos sistemas de vectores;
sin embargo, se conoce relativamente poco sobre estos virus. Aunque
se ha estudiado considerablemente menos su biología que la de los
lentivirus de primates (p. ej., VIH-1,
VIH-2 y VIS), los lentivirus de no primates son de
interés para la biología comparativa de los lentivirus y como
fuentes potenciales de vectores seguros de lentivirus. Los vectores
retrovíricos basados en VIH se han mostrado recientemente
prometedores para la transferencia terapéutica de genes porque
muestran la propiedad específica de los lentiretrovirus de infectar
de forma permanente las células que no se dividen (véase, Naldini y
col., (1996) Science 272, 263-267). Por el
contrario, los vectores retrovíricos obtenidos a partir de simples
retrovirus (p. ej., los Oncovirinae) requieren la rotura de
la envuelta nuclear durante la mitosis, para completar la
transcripción inversa y la integración. Por ello, estos vectores
transducen de forma defectuosa las células que no se dividen, lo que
puede limitar su utilidad para la transferencia de genes a dianas de
células quiescentes o post-mitóticas. Sin embargo,
los vectores de VIH presentan problemas complejos de seguridad
(véase, Emerman (1996) Nature Biotechnology 14, 943).
Los lentivirus de no primates incluyen los
lentivirus de ungulados que incluyen los virus visna/maedi, los
virus de la artritis encefalitis caprina (VEAC), los virus de la
anemia infecciosa equina (VAIE) y los virus de la inmunodeficiencia
bovina (VIB). Estos lentivirus infectan sólo animales ungulados y
generalmente sólo infectan especies particulares de ungulados.
Los lentivirus de no primates también incluyen el
virus de la inmunodeficiencia de felinos (VIF) (véase, Clements
& Zink (1996) Clinical Microbiology Reviews 9,
100-117) que sólo infecta a felinos. Se han
identificado numerosas cepas de VIF.
Los lentivirus de no primates (p. ej., de felinos
y ungulados) pueden proporcionar una alternativa más segura que los
vectores de lentivirus de primates, pero su uso es complicado por
una falta relativa de conocimiento sobre sus propiedades
moleculares, especialmente su adaptabilidad a células animales no
hospedadoras (Emerman, mencionado anteriormente). Todos los
lentivirus muestran tropismos altamente restringidos (véase,
Clements & Zink (1996), véase arriba y Haase (1994) Annuals
of the New York Academy of Sciences 724,
75-86).
El VIF fue descubierto en 1986 como una causa de
la inmunodeficiencia adquirida y de enfermedad neurológica en, y
sólo en, gatos domésticos (Felis catus) Pedersen y col.
(1987) Science 235, 790-793 (1987); Elder
& Phillips (1993) Infectious Agents and Disease 2,
361-374; Pedersen (1993) "The feline
immunodeficiency virus" en The Retroviridae (compilador,
Levy, J.A.) 181-228 (Plenum Press, Nueva York)
Bendinelli y col. (1995) Clinical Microbiology Reviews 8,
87-112; y Sparger (1993) Veterinary Clinics of
North America, Small Animal Practice 23,
173-191). En los gatos grandes, el VIF está
ampliamente extendido geográficamente y parece ser simbiótico: 18 de
37 especies de Felidae no domésticas y de vagabundeo libre se
conocen por estar infectadas en todo el mundo, pero sin tener una
enfermedad manifiesta (Elder & Phillips (1993), véase arriba;
Olmsted y col. (1992) Journal of Virology 66,
6008-6018; Burr y col. (1995) Journal of
Virology 69, 7371-7374; Courchamp & Pontier
(1994) "Feline immunodeficiency virus: an epidemiological
review". Comptes Rendus de L'Academie des Sciences. Serie III.
Sciences de la Vie 317, 1123-1134). El virus es
predominante, infectando 2-20% de las poblaciones de
gato doméstico en Norte América, Europa y Japón; se han observado
tasas más altas en gatos llevados a cuidados veterinarios (Pedersen
(1993), véase arriba y Courchamp, F. & Pontier (1994), véase
arriba). La predominancia mundial del VIF en diversas Felidae
y la observación de que los sueros de Felis catus con fecha
de 1960 que muestran unas tasas altas similares de casos positivos,
sugieren que el VIF no se ha introducido recientemente en los gatos
domésticos (Bendinelli y col. (1995), véase arriba, Olmsted y col.
(1992), véase arriba; Courchamp, F. & Pontier (1994) véase
arriba; Shelton y col. (1990) Journal of Acquired Immune
Deficiency Syndromes 3, 623-630; Bennett &
Smyth (1992) British Veterinary Journal 148,
399-412; Brown y col. (1993) Journal of Zoo and
Wildlife Medicine 24, 357-364; Carpenter &
O'Brien (1995) Current Opinion in Genetics and Development 5,
739-745.
No existe una evidencia de infección con VIF de
animales no felinos. La infección cruzada con cualquier lentivirus
de ungulado o de felino no se ha observado nunca en animales no
ungulados o no felinos, respectivamente. El VIH y el VIF difieren
notablemente en sus modos de transmisión, ya que el VIF se dispersa
principalmente por mordedura (Pederson (1993) véase arriba). A pesar
de la frecuente exposición de los humanos al VIF a través de
mordeduras de gatos domésticos, este modo de inoculación claramente
eficaz, no produce como resultado la seroconversión en humanos o
cualquier otra evidencia detectable de infección o de enfermedad en
los humanos (Pedersen (1993) mencionado anteriormente: Bendinelli y
col. (1995) véase arriba; Sparger (1993), véase arriba; Courchamp,
F. & Pontier (1994), véase arriba; Brown y col.
(1993).
El VIF también está distante genética y
antigénicamente de los lentivirus de primates. Comparaciones de las
secuencias de nucleótidos indican una relación más estrecha con los
lentivirus de ungulados que con el VIH y el VIS (Olmsted y col.
(1989) Proceedings of the National Academy of Sciences of the
United States of America 86, 2448-2452 (Olmsted
y col. (1989) A); Olmsted y col. (1989) Proceedings of the
National Academy of Sciences of the United States of America 86,
8088-8092 (Olmsted y col. (1989) B). Se ha observado
reactividad serológica cruzada de las proteínas del núcleo de VIF
con diversos lentivirus de ungulados, pero no tiene lugar con
VIH-1, VIH-2 o VIS (Elder, J.H.
& Phillips (1993), véase arriba; Bennett, M. & Smyth (1992),
véase arriba; Olmsted y col. (1989) A, véase arriba; Talbott y col.
(1989) Proceedings of the National Academy of Sciences of the
United States of America 86, 5743-5747; Miyazawa
y col. (1994) Archives of Virology 134,
221-234). El virus codifica una dUTPasa; esta quinta
actividad enzimática codificada por pol es una característica
encontrada sólo en lentivirus de no primates (Wagaman y col. (1993)
Virology 196, 451-457). Los datos
filogenéticos y epidemiológicos sugieren un episodio adaptativo
antiguo entre el VIF y los ancestros de los felinos salvajes, así
como una divergencia temprana en la evolución desde los ancestros de
otros lentivirus (Olmsted, R.A. y col. (1992) véase arriba; Brown y
col. (1993), véase arriba; Carpenter & O'Brien (1995); Talbott y
col. (1989), véase arriba).
A nivel celular, también son evidentes
restricciones en las células humanas frente a los estados
productivos e infecciosos de los ciclos vitales de lentivirus de no
primates (Tomonaga y col. (1994) Journal of Veterinary Medical
Science 56, 199-201; Miyazawa y col. (1992)
Journal of General Virology 73, 1543-1546;
Thormar & Sigurdardottir (1962) Acta Pathol Microbiol
Scandinav 55, 180-186; Gilden y col. (1981)
Archives of Virology 67, 181-185; Carey &
Dalziel (1993) British Veterinary Journal 149,
437-454. Las bases de estos bloqueos que pueden
impedir el desarrollo de vectores basados en lentivirus de no
primates, para aplicación humana, no se conocen bien.
Las moléculas CD4 de primates son los únicos
receptores primarios de lentivirus, conocidos (p. ej., para VIH). No
se han determinado previamente receptores primarios ni secundarios,
para ninguno de los lentivirus de no primates. Aunque un anticuerpo
que se une al homólogo en felinos de CD9, inhibe la infección con
VIF en cultivo de tejidos (Willett (1994) Immunology 81,
228-233), una investigación posterior ha establecido
que ni CD9 ni el homólogo en felinos de CD4 son receptores de VIF
(Willett y col. (1997) Journal of General Virology 78,
611-618). Los obstáculos descritos para la expresión
de VIF en células humanas han incluido el funcionamiento débil de
las funciones víricas del núcleo, tales como el eje regulador
Rev/RRE (Tomonaga, K. y col. (1994) véase arriba; Simon y
col. (1995) Journal of Virology 69,
4166-4172) y la débil actividad promotora de la
repetición terminal larga (LTR) (Miyazawa y col. (1992), véase
arriba; Sparger y col. (1992) Virology 187,
165-177. Debido a estos bloqueos, la expresión de
las proteínas estructurales dependientes de Rev de lentivirus de no
primates, se ha estudiado muy limitadamente.
Además de la cuestión del tropismo restringido,
la producción de vectores de lentivirus de no primates en células de
ungulados o de felinos para uso clínico, crearía riesgos de
transmisión de retrovirus endógenos u otros patógenos potenciales.
Este peligro está bien documentado en células de origen animal
diverso (Stoye & Coffin (1995) Nature Medicine 1, 1100;
van der Kuyl y col. (1997) Journal of Virology 71,
3666-3676). Las células de felinos también contienen
múltiples copias de un retrovirus endógeno de tipo C, competente
para la replicación (RD114), que se replica en células humanas, se
mezcla fenotípicamente con otros retrovirus y se relaciona a nivel
de la secuencia de nucleótidos con un retrovirus de primate (virus
endógeno de babuino) (McAllister y col. (1972) Nature New
Biol. 235, 3-6). Además, al contrario de la
mayoría de los otros retrovirus de mamíferos de tipo C, RD114
resiste la inactivación por el complemento del suero humano
(Takeuchi y col. (1994) Journal of Virology 68,
8001-8007). Las células de gato también pueden
contener otros agentes infecciosos desconocidos y potencialmente
patógenos.
Por tanto, existe una necesidad en la técnica de
vectores seguros para lentivirus, p. ej., para la entrega de genes,
el tratamiento del cáncer, los inhibidores víricos y similares para
células que no se dividen, que incluyen células pluripotenciales
hematopoyéticas y células neuronales, y para células humanas que
encapsidan vectores, capaces de encapsidar vectores de lentivirus de
no primates. La presente invención proporciona estas y otras
características.
Esta invención describe sistemas de encapsidación
de retrovirus, vectores, ácidos nucleicos encapsidables y otras
características basadas en el descubrimiento y el diseño de vectores
de lentivirus de no primates que son activos en células humanas. Los
vectores que pueden ser encapsidados por un lentivirus de no
primate, VIF, se transducen a células humanas que no están en
división. Los sistemas de encapsidación producen unos componentes de
encapsidación de vectores en trans en las células humanas,
evitando de este modo la posibilidad de introducción de nuevos
agentes patógenos en la población humana. Estos vectores y los
componentes de encapsidación son útiles para la construcción de
vectores generales para la transferencia génica y para la terapia
génica en humanos.
Una clase de vector retrovírico proporcionada por
la invención tiene un ácido nucleico del vector encapsidado por el
lentivirus de no primate, VIF. Por tanto, el vector tiene un ácido
nucleico encapsidable que es reconocido y encapsidado por las
proteínas víricas de encapsidación codificadas por el retrovirus
seleccionado (es decir, VIF). El ácido nucleico del vector puede
incluir también un ácido nucleico diana heterólogo, tal como un gen
terapéutico. El ácido nucleico del vector no es virulento porque el
ácido nucleico carece o tiene defectuoso uno o varios genes
necesarios para la replicación vírica. Sin embargo, cuando el
componente perdido o defectuoso (p. ej., una proteína retrovírica)
se proporciona en trans (p. ej., en una célula de
encapsidación), el ácido nucleico del vector se encapsida en forma
de partícula vírica. Estos vectores incluyen opcionalmente elementos
de la encapsidación o de la replicación del vector, tales como
proteínas víricas, partículas víricas, actividad de transcriptasa
inversa o similares.
Una clase preferida de dianas para los vectores
de la invención son las células humanas, particularmente las células
que no se dividen tales como las células hematopoyéticas
diferenciadas terminalmente y las neuronas (las células están in
vitro o in vivo). Por ello, se prefieren las
características dirigidas a la transducción y a la infección de
células humanas. Por ejemplo, la incorporación de la glicoproteína
del virus de la estomatitis vesicular (VSV) en la superficie del
vector, se prefiere en algunas realizaciones, ya que ésta facilita
la entrada del vector en una variedad de células humanas. De forma
similar, la incorporación de un promotor (p. ej., el promotor de CMV
o un promotor de ARNt) que dirige la expresión de uno o varios
ácidos nucleicos codificados por el vector en una célula humana, es
deseable para la producción de ácidos nucleicos y, opcionalmente, de
proteínas codificadas por el vector en una célula humana diana.
Los plásmidos de encapsidación que codifican
componentes víricos que encapsidan los ácidos nucleicos del vector
en trans, también se pueden proporcionar. Los plásmidos de
encapsidación incluyen un promotor que es activo en una célula
humana (es decir, una célula humana empleada para la encapsidación
del vector). Este promotor está ligado funcionalmente con un ácido
nucleico que codifica al menos una proteína necesaria para la
encapsidación del ácido nucleico del vector, p. ej., un ácido
nucleico de encapsidación de VIF. El plásmido de encapsidación
carece de un sitio para la encapsidación de VIF.
En una realización preferida, el plásmido de
encapsidación tiene una LTR de VIF que tiene una deleción en el
promotor U3, típicamente con una inserción de un promotor heterólogo
en el sitio de la deleción. Esta disposición da como resultado la
eliminación endógena de la función del promotor de LTR de VIF,
permitiendo la regulación con el promotor heterólogo.
Se apreciará que las células retrovíricas de
encapsidación que encapsidan los ácidos nucleicos encapsidables en
lentivirus de no primates, son proporcionadas por los plásmidos de
encapsidación descritos anteriormente. En particular, las células
que son preferentemente humanas, comprenden plásmidos de
encapsidación que codifican los elementos de encapsidación
necesarios para el virus (p. ej., las proteínas Gag y Env). Estos
elementos de encapsidación se emplean para encapsidar los ácidos
nucleicos del vector encapsidables en trans. Por razones de
seguridad, frecuentemente es preferible para la célula incluir
plásmidos de encapsidación separados, codificando cada uno de ellos
proteínas de encapsidación diferentes. Por ejemplo, una célula de
encapsidación puede incluir dos plásmidos de encapsidación separados
que codifican diferentes proteínas de encapsidación de retrovirus
distintas (p. ej., las proteínas Gag y Env de VIF). La célula puede
comprender adicionalmente un plásmido que codifique un elemento
seudotipificador, tal como la glicoproteína de la envuelta de VSV
para aumentar el campo de cualquier plásmido encapsidado. El
elemento seudotipificador puede estar codificado en el mismo
plásmido como otro elemento retrovírico de no primates o en un
plásmido separado. En cualquier caso, los elementos de encapsidación
deseados están bajo el control de elementos reguladores adecuados
que dirigen la expresión de los componentes en una célula humana. Se
apreciará que los ácidos nucleicos encapsidables (p. ej., que
incluyen un sitio de encapsidación de VIF y un ácido nucleico
heterólogo) se transducen opcionalmente (de forma estable o
transitoria) en las células de la invención.
La Fig. 1 es un esquema que describe las
estructuras artificiales de ácidos nucleicos de la invención, que
incluyen FIV34TF-10, CT5, CTRZLb y CTAGCb.
Los paneles de las Figs. 2A y B, proporcionan los
resultados experimentales de forma gráfica.
Para los fines de la presente invención, se
definen a continuación los siguientes términos.
Un "vector" es una composición que se puede
transducir, transformar o puede infectar una célula, causando por
ello que la célula exprese los ácidos nucleicos codificados por el
vector y, opcionalmente, las proteínas distintas de las naturales de
la célula o de una manera no natural para la célula. Un vector
incluye un ácido nucleico (generalmente ARN o ADN) que va a ser
expresado por la célula (un "ácido nucleico del vector"). Un
vector incluye opcionalmente materiales de ayuda para conseguir la
entrada del ácido nucleico en la célula, tales como una partícula
retrovírica, un liposoma, una proteína de la cubierta o
similares.
Un "ácido nucleico encapsidable en lentivirus
de no primate" es un ácido nucleico que tiene un sitio funcional
de encapsidación en virus, procedente de un lentivirus de ungulado o
de un lentivirus VIF. Los ácidos nucleicos que tienen este sito de
encapsidación que se puede incorporar en una partícula vírica
mediante componentes víricos, aportados en trans, por un
virus correspondiente de tipo silvestre, se encapsidan en el virus
de tipo silvestre (o en los componentes de encapsidación adecuados,
obtenidos a partir de un virus de tipo silvestre).
Un "defecto de encapsidación que bloquea la
auto-encapsidación" de un ácido nucleico de un
vector de lentivirus de no primate, es una incapacidad del ácido
nucleico para producir al menos una proteína vírica necesaria para
la encapsidación del ácido nucleico del vector en una partícula
vírica en el contexto de una célula. Por ejemplo, cuando el vector
del lentivirus no codifica las proteínas Gag o Env, las proteínas se
deben suministrar en trans, antes de que se pueda encapsidar
en la célula el ácido nucleico del vector. La omisión puede ser una
deleción o una mutación de un gen necesario para la encapsidación
vírica de un clon vírico, en la región codificadora o no
codificadora (p. ej., promotor) del gen relevante. El ácido nucleico
del vector se puede rescatar en trans cuando codifica un
sitio de encapsidación vírico que es reconocido por un vector de
lentivirus de no primate, tal como VIF.
Un "plásmido de encapsidación" es un
plásmido que codifica componentes necesarios para la producción de
partículas víricas en una célula transducida con el plásmido de
encapsidación. El plásmido de encapsidación codifica opcionalmente
todos los componentes necesarios para la producción de partículas
víricas o incluye opcionalmente un subgrupo de componentes
necesarios para la encapsidación. Por ejemplo, en una realización
preferida, una célula de encapsidación se transforma con más de un
plásmido de encapsidación, teniendo cada uno de ellos una función
complementaria en la producción de una partícula de VIF. El plásmido
de encapsidación carece de un sitio funcional para la encapsidación,
es decir, un sitio para la encapsidación reconocido por los
componentes del lentivirus de no primate, codificado por el
plásmido, volviendo al plásmido incapaz de encapsidarse a sí
mismo.
Dos (o más) de los plásmidos para la
encapsidación basada en lentivirus de no primate, son
"complementarios" cuando juntos codifican todas las funciones
necesarias para la encapsidación vírica y cuando cada uno de forma
individual no codifica todas las funciones necesarias para la
encapsidación. Por tanto, p. ej., cuando dos plásmidos transducen a
una sola célula y juntos codifican la información para la producción
de las partículas para la encapsidación de VIF, los dos vectores son
"complementarios". El uso de plásmidos complementarios se
prefiere porque aumenta la seguridad de cualquier célula de
encapsidación preparada para la transformación con un plásmido de
encapsidación, reduciendo la posibilidad de que un proceso de
recombinación produzca un virus infeccioso.
Los plásmidos de encapsidación codifican
componentes de una partícula vírica. Las partículas son competentes
para encapsidar el ARN diana que tiene un sitio correspondiente para
la encapsidación. Los "plásmidos muy eficaces para la
encapsidación" encapsidan ARNs dianas que tienen sitios de
encapsidación de modo que las células de encapsidación transducidas
de forma transitoria o estable con el plásmido de encapsidación y
transducidas con el ácido nucleico encapsidable diana, se dirigen a
la diana de ARN del vector encapsidable, con un título de al menos
aproximadamente 10^{5} o 10^{6} hasta aproximadamente 10^{7} o
incluso 10^{8} unidades de transducción por ml o más. El título
preciso que se produce varía dependiendo de la naturaleza del ácido
nucleico encapsidable y de la célula de encapsidación seleccionada.
Una mayor capacidad de infección se obtiene típicamente cuando se
encapsidan vectores con sitos de encapsidación completos.
Un "inhibidor" o un "inhibidor vírico"
es lo más frecuente un ácido nucleico que codifica un agente
antivírico activo o que es el mismo un agente antivírico. Por tanto,
en una clase de realizaciones, el inhibidor es un "inhibidor
directo", es decir, el inhibidor actúa directamente sobre un
componente vírico para inhibir la infección, la replicación, la
integración o el crecimiento del virus en la célula. Por ejemplo, en
una realización particularmente preferida, el inhibidor comprende
una ribozima trans-activa que corta un transcrito de VIH. Con
esta configuración, el inhibidor es típicamente una molécula de ARN
con actividad nucleasa catalítica. En otra clase de realizaciones,
el inhibidor es un "inhibidor indirecto", es decir, el
inhibidor codifica el inhibidor directo. Un inhibidor
"codifica" un inhibidor directo tal como una ribozima activa,
una proteína, un señuelo molecular de ARN o un ARN antiparalelo si
éste contiene el ácido nucleico paralelo o antiparalelo, codificante
o complementario, que se corresponde con el inhibidor directo. Por
convención, los ARNs inhibidores directos, tales como ribozimas se
clasifican típicamente por sus secuencias de ADN correspondientes.
Esto se hace para simplificar la visualización del ARN activo
correspondiente, que es equivalente a la secuencia dada con los
residuos T sustituidos por residuos U.
Una "inhibición vírica" se refiere a la
capacidad de un componente para inhibir la infección, el
crecimiento, la integración o la replicación de un virus en una
célula. La inhibición se mide típicamente vigilando los cambios en
una carga vírica de la célula (es decir, el número de virus y/o de
proteínas víricas o de ácidos nucleicos presentes en la célula, en
el cultivo celular o en el organismo) o vigilando la resistencia a
la infección de una célula, de un cultivo celular o de un
organismo.
Un "promotor" es un conjunto de secuencias
para controlar el ácido nucleico que dirigen la transcripción de un
ácido nucleico. Tal y como se emplea en esta memoria, un promotor
incluye las secuencias de ácido nucleico necesarias cercanas al
sitio de inicio de la transcripción, tales como, en el caso de un
promotor de tipo polimerasa II, un elemento TATA. Un promotor
también incluye opcionalmente elementos potenciadores o represores
que pueden estar localizados hasta a varios miles de pares de bases
del sito de inicio de la transcripción.
Un promotor "constitutivo" es un promotor
que es activo bajo la mayoría de las condiciones del entorno y del
desarrollo. Un promotor "inducible" es un promotor que está
sometido a regulación por elentorno o por el desarrollo.
Los términos y expresiones "aislado" o
"biológicamente puro" se refieren a un material que está
sustancial o esencialmente exento de componentes que le acompañan
normalmente cuando se encuentra en estado natural.
El término "heterólogo", cuando se emplea en
relación con las partes de un ácido nucleico, indica que el ácido
nucleico comprende dos o más subsecuencias que no se encuentran en
la misma relación entre sí en la naturaleza. Por ejemplo, el ácido
nucleico se produce típicamente de forma recombinante, disponiéndose
dos o más secuencias de genes no relacionados, para formar un nuevo
ácido nucleico funcional. Por ejemplo, en una realización, el ácido
nucleico tiene un promotor de un gen dispuesto para dirigir la
expresión de una secuencia codificadora de un gen diferente, tal
como una ribozima antivírica. Por tanto, haciendo referencia a la
secuencia que codifica la ribozima, el promotor es heterólogo.
El término "idéntico" en el contexto de dos
secuencias de ácidos nucleicos o de polipéptidos, se refiere a los
residuos en las dos secuencias que son iguales cuando están
alineados con una correspondencia máxima. Cuando se emplea un
porcentaje de la identidad de la secuencia en relación con proteínas
o péptidos, se reconoce que las posiciones de los residuos que no
son idénticos, difieren frecuentemente en sustituciones
conservadoras de aminoácidos, en donde los residuos de aminoácidos
están sustituidos por otros residuos de aminoácidos con propiedades
químicas similares (p. ej., carga o hidrofobicidad) y por ello no
cambian las propiedades funcionales de la molécula. Cuando las
secuencias difieren en sustituciones conservadoras, el porcentaje de
identidad de la secuencia se tiene que ajustar hacia arriba para
corregir la naturaleza conservadora de la sustitución. Los medios
para realizar este ajuste son bien conocidos por los expertos en la
técnica. Típicamente, esto implica valorar una sustitución
conservadora como un desemparejamiento parcial, más que un
desemparejamiento total, incrementando de este modo el porcentaje de
identidad de la secuencia. Por tanto, por ejemplo, cuando un
aminoácido idéntico se valora con una puntuación 1 y a una
sustitución no conservadora se le da un valor cero, a una
sustitución conservadora se le da una puntuación entre cero y 1. La
puntuación de sustituciones conservadoras se calcula, p. ej., según
el algoritmo de Meyers y Miller, Computer Applic. Biol. Sci., 4:
11-17 (1988) p. ej., como se implementa en el
programa PC/GENE (Intelligenetics, Mountain View, California,
EE.UU.). Una "ventana comparativa", tal y como se emplea en
esta memoria, se refiere a un segmento de al menos aproximadamente
50 posiciones contiguas, generalmente aproximadamente 50 hasta
aproximadamente 200, más generalmente aproximadamente 100 hasta
aproximadamente 150, en donde una secuencia se compara con una
secuencia de referencia con el mismo número de posiciones contiguas,
después de alinear de forma óptima las dos secuencias. Los métodos
para alinear las secuencias a comparar son bien conocidos en la
técnica. La alineación óptima de secuencias a comparar se puede
realizar mediante el algoritmo de homología local de Smith y
Waterman (1981), Adv. Appl. Math. 2: 482; por el algoritmo de
alineación por homología de Needleman y Wunsch (1970) J. Mol.
Biol. 48: 443; por la búsqueda de similitudes por el método de
Pearson y Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444;
mediante implementaciones por ordenador de estos algoritmos (que
incluyen, pero no están limitadas a CLUSTAL en el programa PC/Gene
de Intelligenetics, Mountain View, California, GAP, BESTFIT, FASTA y
TFASTA en el paquete de programas de Wisconsin Genetics, Genetics
Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, Wisconsin, EE.UU.);
el programa CLUSTAL está bien descrito por Higgins y Sharp (1988)
Gene, 73: 237-244 y Higgins y Sharp (1989)
CABIOS 5: 151-153; Corpet y col. (1988)
Nucleic Acids Research 16, 10881-90; Huang y
col., (1992) Computer Applications in the Biosciences 8,
155-65; y Pearson y col. (1994) Methods in
Molecular Biology 24, 307-31. La alineación
también se realiza frecuentemente por inspección y alineación
manual. Las "variaciones modificadas de forma conservadora" de
una secuencia de ácidos nucleicos particular, se refieren a los
ácidos nucleicos que codifican secuencias de aminoácidos idénticas o
esencialmente idénticas o, cuando el ácido nucleico no codifica una
secuencia de aminoácidos, para las secuencias esencialmente
idénticas. Debido a la degeneración del código genético, un gran
número de ácidos nucleicos funcionalmente idénticos codifican
cualquier polipéptido dado. Por ejemplo, los codones CGU, CGC, CGA,
CGG, AGA y AGG todos ellos codifican el aminoácido arginina. Por
tanto, en todas las posiciones en las que se especifica una arginina
por un codón, el codón se puede alterar a cualquiera de los codones
correspondientes descritos, sin alterar el polipéptido codificado.
Tales variaciones de ácidos nucleicos son "variaciones
silenciosas" que son un tipo de las "variaciones modificadas de
forma conservadora". Cada secuencia de ácido nucleico que
codifica en esta memoria un polipéptido, también describe cualquier
posible alteración silenciosa. Un experto en la técnica reconocerá
que cada codón en un ácido nucleico (excepto AUG, que es
generalmente el único codón para metionina) se puede modificar para
conseguir una molécula funcionalmente idéntica, mediante técnicas
convencionales. Por tanto, cada "variación silenciosa" de un
ácido nucleico que codifica un polipéptido está implícita en
cualquier secuencia descrita. Además, un experto en la técnica
reconocerá que las sustituciones, las deleciones o las adiciones
individuales que alteran, añaden o delecionan un aminoácido aislado
o un pequeño porcentaje de aminoácidos (típicamente menos de 5%, más
típicamente menos de 1%) en una secuencia codificada, son
"variaciones modificadas de forma conservadora", en donde las
alteraciones dan como resultado la sustitución de un aminoácido por
un aminoácido químicamente similar. Las tablas de sustituciones
conservadoras que proporcionan aminoácidos funcionalmente similares
son bien conocidas en la técnica. Los seis grupos siguientes
contienen cada uno aminoácidos que son sustituciones conservadoras
de otro: 1) Alanina (A), Serina (S), Treonina (T); 2) Ácido
aspártico (D), Ácido glutámico (E); 3) Asparagina (N), Glutamina
(Q); 4) Arginina (R), Lisina (K); 5) Isoleucina (I), Leucina (L),
Metionina (M), Valina (V); y 6) Fenilalanina (F), Tirosina (Y),
Triptófano (W). Véase también, Creighton (1984) Proteins W.H.
Freeman and Company. Finalmente, la adición de secuencias que no
alteran la actividad de una molécula de ácido nucleico, tal como una
secuencia no funcional, es una modificación conservadora del ácido
nucleico básico.
Las "condiciones rigurosas de lavado de la
hibridación" en el contexto de los experimentos de hibridación de
ácidos nucleicos, tales como hibridaciones de tipo Southern y
Northern, son dependientes de la secuencia y son diferentes según
parámetros diferentes del entorno. Una guía a fondo de la
hibridación de ácidos nucleicos se encuentra en Tijssen (1993)
Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular
Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes
parte I capítulo 2 "revisión de los principios de la hibridación y
la estrategia de ensayos con sondas de ácidos nucleicos",
Elsevier, Nueva York. Generalmente, una hibridación y unas
condiciones de lavado muy rigurosas se seleccionan para que sean
aproximadamente 5ºC menores que el punto de fusión térmico (T_{m})
para la secuencia específica, con una fuerza iónica y un pH
definidos. El T_{m} es la temperatura (con una fuerza iónica y un
pH definidos) a la que el 50% de la secuencia diana se hibrida con
una sonda perfectamente emparejada. Unas condiciones muy rigurosas
se seleccionan para que sea igual al T_{m} para una sonda en
particular.
Un ejemplo de condiciones de hibridación
rigurosas para la hibridación de ácidos nucleicos complementarios
que tienen más de 100 residuos complementarios, sobre un filtro en
una transferencia de tipo Southern o Northern, es 50% de formalina
con 1 mg de heparina a 42ºC, realizándose la hibridación durante una
noche. Un ejemplo de condiciones de lavado rigurosas es un lavado
con 2x SSC a 65ºC durante 15 minutos (véase, Sambrook, véase arriba,
para una descripción del tampón SSC). Frecuentemente, el lavado muy
riguroso está precedido de un lavado menos riguroso para eliminar la
señal de fondo de la sonda. Un ejemplo de lavado menos riguroso es
2x SSC a 40ºC durante 15 minutos. En general, una proporción de la
fuerza de una señal con la cantidad de interferencia no deseada
(ruido) de 2x (o superior) que la observada para una sonda no
relacionada en el ensayo de hibridación particular, indica la
detección de una hibridación específica.
Los ácidos nucleicos que no se hibridan entre sí
bajo condiciones rigurosas son todavía sustancialmente idénticos si
los polipéptidos que codifican son sustancialmente idénticos. Esto
tiene lugar, p. ej., cuando se crea una copia de un ácido nucleico
empleando la mayor degeneración posible del codón, permitida por el
código genético.
Una "proteína Gag de VIF-1"
es una proteína codificada por el gen gag de
VIF-1. Las proteínas Gag se traducen típicamente
como una gran preproteína que se corta para formar las proteínas del
núcleo estructural que encapsidan el ARN genómico de VIF de tipo
silvestre. Una proteína Gag truncada es una proteína producida por
un gen gag que tiene una deleción en relación con la
secuencia de tipo silvestre. De forma similar, una proteína de la
transcriptasa inversa de VIF y una proteína de la envuelta de VIF
están codificadas por los genes pol y env,
respectivamente.
La expresión "ácido nucleico" se refiere a
un polímero de desoxirribonucleótidos o de ribonucleótidos en forma
mono o bicatenaria y, a menos que no se indique de otro modo,
incluye los análogos conocidos de nucleótidos naturales que se
hibridan con los ácidos nucleicos de forma similar a los nucleótidos
presentes en la naturaleza. A no ser que se indique de otro modo,
una secuencia de ácidos nucleicos particular incluye opcionalmente
su secuencia complementaria.
La expresión "ligado funcionalmente" se
refiere a una asociación funcional entre una secuencia que controla
la expresión del ácido nucleico (tal como un promotor o un conjunto
de sitios de unión de un factor de transcripción) y una segunda
secuencia de ácidos nucleicos, en donde la secuencia que controla la
expresión dirige la transcripción del ácido nucleico correspondiente
a la segunda secuencia.
El término "recombinante", cuando se emplea
haciendo referencia a una célula, indica que la célula replica o
expresa un ácido nucleico, o que expresa un péptido o una proteína
codificada por ácido nucleico, cuyo origen es exógeno a la célula.
Las células recombinantes pueden expresar genes que no se encuentran
en la forma natural (no recombinante) de la célula. Las células
recombinantes también pueden expresar genes encontrados en la forma
natural de la célula en donde los genes se reintroducen en la
células por medios artificiales.
Una "casete de expresión recombinante" o
simplemente una "casete de expresión" es una estructura
artificial de ácidos nucleicos, generada por recombinación o
sintéticamente, con elementos de ácido nucleico que permiten la
transcripción de un ácido nucleico particular en una célula. La
casete de expresión recombinante puede ser parte de un plásmido, un
virus o un fragmento de ácido nucleico. Típicamente, la casete de
expresión recombinante incluye un ácido nucleico que se va a
transcribir y un promotor. En algunas realizaciones, la casete de
expresión también incluye, p. ej., un origen de replicación y/o
elementos de integración cromosómica (p. ej., una LTR
retrovírica).
El término "subsecuencia" en el contexto de
una secuencia de ácidos nucleicos en particular, se refiere a una
región del ácido nucleico igual o menor que el ácido nucleico
especificado.
Un virus o un vector "se transduce" a una
célula cuando transfiere el ácido nucleico a la célula. Un virus o
un vector es "infectivo" cuando se transduce a una célula, se
replica y (sin la ayuda de ningún virus o vector complementario)
dispersa los vectores o los virus de la progenie del mismo tipo que
los del virus o del vector transductor original, a otras células en
un organismo o en un cultivo celular, en donde los vectores o los
virus de la progenie tienen la misma capacidad para reproducirse y
diseminarse por el organismo o el cultivo celular. Por tanto, un
ácido nucleico que codifica una partícula de VIF no es infectivo si
el ácido nucleico no se puede encapsidar en la partícula de VIF (p.
ej., si el ácido nucleico carece de un sitio de encapsidación de
VIF), aunque el ácido nucleico se pueda emplear para transfectar y
transformar una célula. De forma similar, un ácido nucleico
encapsidable en VIF, encapsidado por una partícula de VIF, no es
infectivo si no codifica la partícula de VIF que lo encapsida,
aunque se pueda emplear para transformar y transfectar una célula.
Los vectores que no codifican un grupo completo de componentes de
encapsidación vírica (p. ej., las proteínas Gag y Env) son
"deficientes para la encapsidación". Estos vectores son
"trans-rescatables" cuando los vectores son
encapsidados por proteína víricas proporcionadas en trans en
una célula de encapsidación. Si un ácido nucleico encapsidable en
VIF se emplea para transformar una célula infectada con VIF en un
cultivo celular o en un organismo infectado con VIF, el ácido
nucleico encapsidable en VIF se replicará y se diseminará por el
organismo, junto con el virus VIF infectante. Sin embargo, el ácido
nucleico encapsidable en VIF no es "infectivo" por sí mismo,
debido a que las funciones de encapsidación son suministradas por el
virus VIF infectivo mediante complementación en trans.
Un "material sobrenadante" celular es el
medio de cultivo en el que crece una célula. El medio de cultivo
incluye material de la célula que incluye, p. ej., partículas
víricas de VIF que se invaginan desde la membrana celular y entran
en el medio de cultivo.
La transfección del clon CF1 de lentivirus de no
primate en células humanas HeLa, de riñón 293 y
293-T por el método de coprecipitación con fosfato
cálcico, produjo el sorprendente resultado de sincitios con forma de
globo, muy diseminados (células gigantes multinucleadas producidas
por fusión de células que expresan la envuelta con otras células)
que contenían de cincuenta a varios cientos de núcleos y altos
niveles (más de un millón de cpm) de transcriptasa inversa en el
material sobrenadante. De forma inesperada, los cultivos en monocapa
de células humanas 293 y 293-T y HeLa fueron
destruidos de 90-95% con reproducibilidad por los
sincitios, después de una transfección transitoria de CF1 (por
ejemplo, por transfección de 10 \mug de CF1 en un matraz de 75
cm^{2}), aunque se produjeron virus no infecciosos o competentes
para replicación: la transferencia de grandes volúmenes de material
sobrenadante de células 293-T transfectadas con CF1
a células 293 o 293-T de nuevo aporte o a células de
riñón de felino Crandall, daban como resultado la falta de formación
de sincitios o de producción de RT. CF1\Deltaenv, que es
idéntico a CF1 exceptuando una deleción de la envuelta de VIF, no
produce sincitios pero produce altos niveles de transcriptasa
inversa y de funciones víricas necesarias para encapsidar vectores.
Estos resultados sin precedentes llevaron al nuevo enfoque de que
todas las funciones de los vectores de no primates, tales como VIF,
requieren la producción de proteínas, incluyendo el eje de
regulación Rev/RRE, la producción de gag/pol de VIF y los
sincitios mediados por la envuelta, podrían tener lugar en células
humanas si el promotor de VIF se sustituía por un promotor activo en
células humanas.
Por tanto, esta invención proporciona el primer
uso de vectores de lentivirus de no primate, encapsidados en células
de encapsidación humanas, para la transducción de células diana
humanas. Antes de la presente invención no existía ningún modo de
conocer si estos sistemas de encapsidación se podían desarrollar en
células humanas o si los vectores de lentivirus de no primates
encapsidados se podían utilizar para transducir células humanas o si
los componentes reguladores, procesadores y de encapsidación de
tales vectores serían activos en células humanas. No existía
información sobre disposiciones deseables o sobre estructuras
artificiales particulares especialmente útiles en los vectores y en
las células de encapsidación de la invención, p. ej., la disposición
y la estructura artificial de vectores basados en VIF y los sistemas
de encapsidación descritos en esta memoria. Las ventajas de los
vectores incluyen una falta de patogenicidad en humanos para los
virus en los que están basados los vectores y los sistemas de
encapsidación y en la capacidad de los vectores para transducir
células humanas que no se dividen. Tales células que no se dividen
incluyen, pero no están limitadas a, células del sistema nervioso
humano, del ojo, del sistema hematopoyético, del tegumento, del
sistema endocrino, del sistema hepatobiliar, del tracto
gastrointestinal, del tracto genitourinario, del hueso, del músculo,
del sistema cardiovascular y del sistema respiratorio. Todas estas
células se transducen in vitro o in vivo, empleando
los vectores de la invención. Estos vectores también evitan la
exposición de pacientes a células no humanas y evitan la exposición
a genes de lentivirus o a proteínas de lentivirus derivadas de
patógenos conocidos.
Los mecanismos del ciclo vital de VIF en células
humanas se describe en esta memoria. Aquí se describe por primera
vez que las proteínas del virus de la inmunodeficiencia felina (VIF)
codificadas por un plásmido encapsidado, se pueden expresar con
altos niveles en células humanas, en forma defectuosa para la
replicación y se pueden suministrar a vectores que se pueden
encapsidar en VIF en trans, reemplazando la repetición
terminal larga del genoma de VIF por un promotor heterólogo, tal
como el promotor inmediato temprano de citomegalovirus humano
(promotor CMV). En particular, la sustitución con un promotor
heterólogo poll II de los elementos del promotor de la LTR de VIF,
permitía altos niveles de producción de proteína de VIF, en
trans, en células humanas. Además, la sustitución selectiva
del elemento U3 5-prima de VIF mediante fusión
precisa de un promotor heterólogo con la repetición R, daba como
resultado una alta producción en células humanas de VIF de tipo
silvestre que era competente para la replicación sólo en células de
felino. Se construyó un sistema de vector de VIF con tres plásmidos,
defectuoso para la replicación, con env delecionado y con
promotor totalmente heterólogo y se encontró que se transducía de
forma eficaz en células humanas que se dividen y que no se dividen
con partículas de VIF seudotipificadas con glicoproteína G del virus
de la estomatitis vesicular (VSV-G). No había una
ventaja en la transducción a células de felino; las eficacias
relativas de la transducción en células que se dividen de diversos
linajes humanos y felinos eran las mismas que para el vector basado
en el virus de la leucemia de múridos de Moloney
(M-MuLV). Al contrario que el vector común de
M-MuLV, los vectores de VIF se transducían
eficazmente en células humanas que no se dividen, que incluyen
macrófagos humanos diferenciados de forma terminal y neuronas
(neuronas hNT). Los sincitios extensos se forman cuando la expresión
de VIF es posible en células humanas; esta actividad requiere la
expresión de CXCR4/fusina35, el correceptor para el material aislado
de VIH que induce sincitios. La expresión de CXCR4 humana en células
CRFK de felinos, cambia el fenotipo vírico a uno muy inductor de
sincitios y media en la entrada del vector en la envuelta de VIF.
Los estudios muestran que VIF puede utilizar el homólogo humano de
CXCR4 para generar sincitios en células humanas, de roedor y de
felinos y, de forma compatible con una función de correceptor, para
la entrada de virus en células de felino.
El virus de la inmunodeficiencia de felinos que
es competente para la replicación en células de felinos pero no en
células humanas, se produce con bajos niveles en células humanas y
de felino por una fusión precisa de un promotor heterólogo, tal como
el promotor temprano inmediato de citomegalovirus humano (promotor
CMV), y el genoma de VIF, inmediatamente aguas arriba de la
repetición R de VIF, tal y como se ha descrito. En una realización,
la fusión se une precisamente sobre la caja TATA (se emplea la caja
TATA del promotor CMV; las secuencias de VIF comienzan en el sitio
de Sac I justo aguas debajo de la caja TATA). Los detalles de esta
fusión que conserva la caja TATA en las disposiciones espaciales del
sitio de inicio de la transcripción del ARNm, se esquematizan en los
ejemplos.
Los vectores retrovíricos derivados de VIF se
expresan opcionalmente con altos niveles a partir de la misma fusión
del promotor heterólogo-repetición R, en la que el
elemento U3 cinco prima del vector VIF ha sido sustituido
precisamente por un promotor heterólogo. Estos vectores de VIF se
pueden entregar con un alto título de forma defectuosa para la
replicación, a células de mamíferos no felinos que incluyen células
humanas que se dividen y con crecimiento detenido, mediante
envueltas heterólogas que incluyen, pero no están limitadas a, la
seudotipificación mediante la glicoproteína G de la envuelta del
virus de la estomatitis vesicular (VSV-G); esta es
la primera demostración de entrega de genes a células humanas
empleando un lentivirus de no primate.
La coproducción de proteínas de VIF y de vectores
de VIF daba como resultado vectores de lentivirus con alta
titulación, defectuosos para la replicación que se pueden entregar a
células humanas y a células de felinos. Se consiguieron títulos del
vector de VIF que excedían 10^{7} por mol en células humanas y los
títulos superiores se consiguieron con refinamientos de la
producción y la concentración empleando métodos disponibles. Por
ello, la invención tiene una aplicabilidad directa a la terapia
génica humana. Otros promotores activos en las células humanas
también serán útiles en algunas realizaciones.
La invención incorpora diversas ventajas en la
seguridad. Una ventaja importante de la seguridad de esta invención
es la producción del vector defectuoso para la replicación,
exclusivamente en células humanas. El promotor de VIF natural (LTR)
está inactivo o mínimamente activo en las células humanas. De hecho,
el promotor hCMVVIE tal y como se aplica en esta memoria, permite
una mayor expresión que la LTR de VIF en células de felinos y
humanas. Ya que la LTR de VIF se emplea en células productoras de
felinos para dirigir la expresión (de forma análoga al uso del
promotor del virus de la leucemia de múridos de Moloney (MoMLV) en
sistemas basados en MoMLV), dicho uso presenta diferentes problemas
de seguridad que preferentemente se evitan. Las células de felino
pueden contener un retrovirus endógeno de tipo C competente para la
replicación (RD114) que se replica en células humanas. Las células
de felino, a las que se han dirigido menos estudios científicos que
a las células humanas, también pueden contener otros agentes
infecciosos desconocidos que son potencialmente patógenos. RD114 se
aisló originalmente en células de rabdomiosarcoma humanas en las que
se habían hecho pases en gatitos fetales; RD114 competente para la
replicación también se ha aislado de líneas de células de felinos
cultivadas mediante cocultivo con células humanas y otras células de
no felinos. Además, RD114 está estrechamente relacionado al nivel de
secuencia de nucleótidos con un retrovirus de primate (virus
endógeno de babuino o BaEV); este hecho, además de demostrar la
competencia para la replicación en líneas celulares humanas, sugiere
un claro potencial de transmisión entre especies a humanos. El
peligro de transmisión de retrovirus endógenos tales como RD114 u
otros virus a los seres humanos a través de xenotransplantes o de la
exposición a materiales biológicos obtenidos a partir de células o
tejidos animales, ha generado recientemente una gran preocupación.
Las células de cerdo, por ejemplo, han mostrado ahora que pueden
cultivar un retrovirus endógeno que se puede replicar en células
humanas de forma similar a RD114; este descubrimiento se considera
ahora por los expertos como capaz de alcanzar serias dudas sobre la
seguridad de los xenotransplantes de órganos animales en seres
humanos o sobre el uso de materiales biológicos obtenidos de
animales que no son esterilizables para fines terapéuticos. Por
ello, la exposición de los seres humanos a vectores obtenidos a
partir de líneas celulares felinas, que están mucho menos
caracterizadas que las líneas celulares de humanos o de roedores,
podría ser problemática. El diseño de quimeras de los vectores en
esta memoria permite una producción exclusiva en líneas celulares
productoras en humanos que están bien definidas, tales como las
células 293T. La ventaja en seguridad es la falta de exposición en
cualquier etapa de la producción a las células o a los tejidos de
felinos. Por tanto, para aplicaciones que implican la introducción
de células o de vectores en pacientes, es preferible emplear
vectores encapsidados en células de encapsidación humanas.
En todas sus realizaciones, el sistema también
representa un avance significativo en seguridad, sobre los vectores
de lentivirus basados en VIH, tal y como se mencionaba
anteriormente, porque VIF no es transmisible a los seres humanos ni
es patógeno en humanos. Esta invención hace por ello uso del hecho
bien documentado de que no existe ninguna evidencia de patogenia de
VIF en los seres humanos. La aplicación práctica de esta invención
también se beneficia del hecho de que la falta de tropismo o de
patogenicidad en los seres humanos está mejor establecida para VIF
que para cualquier otro lentivirus de no primate (estos incluyen a
Visna/Maedi, VEAC, VAIE y VIB) ya que muchos miles de seres humanos
están expuestos anualmente a los mismos medios por los que se
transmite predominantemente VIF entre los gatos domésticos y
salvajes en la naturaleza, es decir, las mordeduras de gatos.
Todos los lentivirus se transmiten exclusivamente
por intercambio de fluidos corporales. VIH se transmite
predominantemente de forma sexual; existe una ligera evidencia de
que VIF se transmite sexualmente en la naturaleza; por otro lado,
las mordeduras de los gatos, a los cuales también están generalmente
expuestos los humanos, es el mecanismo principal. Las heridas de las
mordeduras son comunes entre los gatos porque estos animales son
territoriales y los machos en particular entablan frecuentes luchas
por el territorio y la dominancia; la infección con VIF es por tanto
más común entre los gatos machos que entre los gatos hembras.
Resumiendo, no existe una evidencia de infección
con VIF de animales no felinos: este tropismo restringido es
característico de todos los lentivirus conocidos. Morder es la forma
natural principal de extender el VIF entre los gatos y, a pesar de
la frecuente exposición de los humanos a VIF por las mordeduras de
los gatos, este medio tan eficaz de inoculación no tiene como
resultado la seroconversión en humanos o cualquier otra evidencia
detectable de infección en humanos. Por ello, entre los lentivirus
de no primates, es importante una evidencia epidemiológica de VIF
frente a la patogenicidad en humanos.
Puesto que con el VIF se trabaja rutinariamente
empleando las medidas de bioseguridad de nivel 2
(BL-2), se puede trabajar rutinariamente con los
vectores con las medidas de BL-2, siendo menores los
riesgos a los que se expone el personal implicado en su desarrollo y
producción, comparado con los vectores de VIH, mejorando de este
modo la comodidad y la conveniencia de la producción.
Además de las ventajas en la seguridad inherentes
al uso de lentivirus de no primates para la transferencia génica
celular y para la terapia génica, un sistema preferido, descrito en
esta memoria procedente de un clon de VIF (34TF10), es defectuoso en
un gen importante de VIF (ORF2) y por ello es un virus atenuado.
34TF10 se replica en líneas celulares adherentes de gatos pero no en
linfocitos; la competencia para la replicación en linfocitos felinos
se ha cartografiado para ORF2. Además, el virus
ORF2-minus es neurotrópico. Si se necesita para la
entrega a ciertos tipos celulares, ORF2 se puede reparar. Además, en
otras realizaciones, otras cepas o clones moleculares de VIF se
emplean de forma similar, ya que la presente invención muestra su
adaptabilidad para la transducción a células humanas.
Aunque en un ejemplo de esta memoria se ha
empleado una estructura artificial quimérica en donde se fusiona el
promotor heterólogo con secuencias de VIF, debido a que la fusión
está localizada en el inicio de la transcripción, sólo se
transcriben las secuencias de VIF (es decir, sólo las secuencias del
promotor de VIF aparecen en el ARNm generado por el sistema; las
secuencias del promotor heterólogo no se transcriben). La
posibilidad de un virus quimérico competente para la replicación
conseguido por una recombinación al nivel del ARN, se reduce de este
modo.
Además, puesto que este lentivirus está
filogenéticamente distante de VIH y ya que se muestra ahora en la
presente invención que es adaptable a la transducción de células
humanas, ahora está claro que otros lentivirus de no primates,
particularmente los lentivirus de ungulados, se pueden utilizar de
forma similar.
Mediante la expresión por ingeniería genética del
plásmido de encapsidación, en donde el plásmido de expresión de la
envuelta y del vector tiene el mismo promotor, se facilita la
expresión sincronizada (es decir, la coordinación temporal) de la
expresión de proteínas.
\newpage
La presente invención proporciona una variedad de
plásmidos de encapsidación y de ácidos nucleicos encapsidables, tal
y como se ha descrito anteriormente. Los plásmidos de encapsidación
incluyen ácidos nucleicos obtenidos a partir de lentivirus de no
primates, particularmente los obtenidos a partir de VIF. Los
vectores de ácido nucleico encapsidable codifican ARNs que
comprenden un sitio de encapsidación de VIF y, opcionalmente,
comprenden otros ácidos nucleicos de lentivirus de no primate o
ácidos nucleicos heterólogos.
Los vectores encapsidables y los plásmidos de
encapsidación de la invención se obtienen a partir de clones de
lentivirus. Muchos de estos clones son conocidos por los expertos en
la técnica y hay publicaciones disponibles. Depositarios bien
establecidos de la información de la secuencia incluyen GenBank,
EMBL, DDBJ y el NCBI. Los clones de VIH que están bien
caracterizados incluyen HIV-1_{NLA3},
HIV-1_{SF2}, HIV-1_{BRU},
HIV-1_{MN}.
Además, los clones víricos se pueden aislar a
partir de los virus de tipo silvestre empleando técnicas conocidas.
Típicamente, un clon de fago lambda que contiene un provirus de
lentivirus de longitud completa, se obtiene a partir del ADN
genómico de una línea celular infectada con una cepa vírica aislada
a partir de las células mononucleares de sangre periférica de un
animal seropositivo. El virus es competente para la replicación
in vitro, produciendo viriones infecciosos en la progenie,
después de la transfección directa en células diana procedentes del
organismo (p. ej., células CD4^{+}). En general, un genoma
completo virulento se puede emplear para preparar un plásmido de
encapsidación. Un "genoma de VIF de longitud completa" en
relación con un vector de encapsidación de VIF, consta de un ácido
nucleico (ARN o ADN) codificado por un virus VIF o un clon vírico
(p. ej., un fago de ADN) que incluye las regiones 5' y 3' de LTR y
los genes entre las regiones LTR que están presentes en un virus
típico correspondiente. Para VIF, estos genes incluyen:
gag-pol, env y orf-2 y además hay
varios cuadros de lectura sin caracterizar, particularmente en
env.
Un plásmido de encapsidación se prepara
delecionando el sitio de encapsidación de un genoma de longitud
completa, volviendo al clon capaz de producir proteínas víricas,
pero siendo incapaz de encapsidar él mismo los ARNs víricos. La
estructura secundaria del ARN del sitio de encapsidación de VIF
incluye probablemente la región entre MSD y gag-pol;
además, otras regiones pueden ser importantes para una encapsidación
correcta. La naturaleza precisa del sitio de encapsidación se puede
determinar realizando un análisis por deleción.
En los plásmidos de encapsidación,
preferentemente, el sitio psi (sitio de encapsidación) está
delecionado, pero es suficiente cualquier mutación o deleción que
delecione o mute el sitio de modo que se inhiba la encapsidación.
Esto produce típicamente como resultado una deleción sustancial en
la región entre el sitio del donante principal de corte y empalme
("MSD") y el comienzo del gen gag y puede incluir
también otras regiones. La deleción de elementos del promotor que
dirigen la expresión vírica de las proteínas víricas codificadas
también es deseable, ya que se incorporan promotores heterólogos. En
particular, los promotores humanos (es decir, promotores activos en
células humanas que son típicamente, pero no necesariamente, de
origen humano, o se obtienen a partir de un patógeno humano, tal
como un virus que es activo en un ser humano).
Los plásmidos de encapsidación resultantes de la
invención se emplean para preparar partículas víricas, transduciendo
el clon con deleción a una célula de encapsidación (típicamente una
célula humana tal como una célula 293 u otra célula bien
caracterizada que no comprenda ningún componente indeseado) y
expresar el plásmido. Debido a que el plásmido carece de un sitio de
encapsidación de lentivirus, no se produce una encapsidación en
partículas víricas.
Para incrementar la seguridad de las células de
encapsidación transducidas, es preferible cortar (p. ej.,
subclonando) el plásmido de encapsidación (o los clones homólogos)
en múltiples plásmidos de encapsidación con funciones
complementarias. Esto disminuye la probabilidad de que un proceso de
recombinación dé como resultado una partícula infecciosa.
Los ácidos nucleicos encapsidables codifican un
ARN que es competente para ser encapsidado en una partícula de VIF.
Tales ácidos nucleicos se pueden construir por recombinación
combinando un sitio de encapsidación de VIF con un ácido nucleico a
elegir. El sitio de la encapsidación (sitio psi) está localizado
adyacente a LTR 5', en primer lugar entre el sitio de MSD y el codón
iniciador de gag (AUG), en la secuencia líder del gen
gag. Por tanto, el sitio mínimo de encapsidación incluye una
mayoría de los ácidos nucleicos entre MSD y el codón iniciador de
gag, del lentivirus pertinente. Preferentemente, un sitio
completo de encapsidación incluye secuencias de LTR 5' y la región
5' del gen gag, para obtener la máxima eficacia en la
encapsidación. Estas secuencias de encapsidación incluyen
típicamente una parte del gen gag, p. ej., que se extiende
aproximadamente 100 bases en la región codificadora de gag o
más, y aproximadamente 100 bases en la LTR 5' de VIF o más.
Adicionalmente, las secuencias del gen env se incluyen
opcionalmente en el sitio de encapsidación, particularmente la
RRE.
Dada la estrategia para preparar los plásmidos de
encapsidación y los ácidos nucleicos del vector diana encapsidable
de la presente invención, una persona experta en la técnica puede
construir una variedad de clones que contienen ácidos nucleicos
equivalentes en su función. Las metodologías de clonación para
alcanzar estos fines y los métodos de secuenciación para verificar
la secuencia de ácidos nucleicos, son bien conocidos en la técnica.
Ejemplos de técnicas adecuadas de clonación y de secuenciación y las
instrucciones suficientes para dirigir a personas expertas, mediante
muchos ejercicios de clonación, se encuentran en Berger y Kimmel,
Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology
volumen 152, Academic Press, Inc. San Diego, CA (Berger); Sambrook y
col. (1989) Molecular Cloning - A Laboratory Manual (2ª ed.)
vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring
Harbor Press, N.Y., (Sambrook); y Current Protocols in Molecular
Biology, F.M. Ausubel y col., compiladores, Current Protocols,
una asociación entre Greene Publishing Associates, Inc. y John Wiley
& Sons, Inc., (suplemento de 1994) (Ausubel). La información
sobre el producto de los fabricantes de los reactivos biológicos y
los equipos experimentales, también proporciona una información útil
sobre métodos biológicos conocidos. Tales fabricantes incluyen la
compañía química SIGMA (Saint Louis, MO), R&D Systems
(Minneapolis, MN), Pharmacia LKB Biotechnology (Piscataway, NJ),
CLONTECH Laboratories, Inc. (Palo Alto, CA), Chem Genes Corp.,
Aldrich Chemical Company (Milwaukee, WI), Glen Research, Inc., GIBCO
BRL Life Technologies, Inc. (Gaithersberg, MD), Fluka
Chemica-Biochemika Analytika (Fluka Chemie AG,
Buchs, Suiza), Invitrogen, San Diego, CA y Applied Biosystems
(Foster City, CA), así como muchas otras fuentes comerciales
conocidas por los expertos.
Las composiciones de ácidos nucleicos de esta
invención, ARN, ADNc, ADN genómico o un híbrido de diversas
combinaciones, se aíslan de fuentes biológicas o se sintetizan in
vitro. Los ácidos nucleicos de la invención están presentes en
células completas transformadas o transfectadas, en lisados
celulares transformados o transfectados o en una forma parcialmente
purificada o sustancialmente pura.
Las técnicas de amplificación in vitro
adecuadas para amplificar secuencias para uso como sondas
moleculares o para generar fragmentos de ácidos nucleicos para una
subclonación posterior, son conocidas. Ejemplos de técnicas que sean
suficientes para dirigir a los expertos en la técnica a través de
las mismas, son métodos de amplificación in vitro que
incluyen la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la reacción
en cadena de la ligasa (LCR), la amplificación con la replicasa
Q\beta y otras técnicas mediadas por la polimerasa de ARN (p. ej.,
NASBA), se encuentran en Berger, Sambrook y Ausubel, así como en
Mullis y col. (1987) documento de patente de EE.UU. nº 4.683.202;
PCR Protocols A Guide to Methods and Applications (Innis y
col. compiladores) Academic Press Inc. San Diego, CA (1990) (Innis);
Arnheim & Levinson (1 de octubre, 1990) C&EN
36-47; The Journal Of NIH Research (1991) 3,
81-94; Kwoh y col. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 86, 1173; Guatelli y col. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 87, 1874; Lomell y col. (1989) J. Clin. Chem 35,
1826; Landegren y col., (1988) Science 241,
1077-1080; Van Brunt (1990) Biotechnology 8,
291-294; Wu y Wallace, (1989) Gene 4, 560;
Barringer y col. (1990) Gene 89, 117; y Sooknanan y Malek
(1995) Biotechnology 13: 563-564. Los métodos
mejorados de clonación in vitro de ácidos nucleicos
amplificados, se describen en Wallace y col. documento de patente de
EE.UU. nº 5.426.039.
Los oligonucleótidos para uso como sondas, p.
ej., en los métodos de amplificación in vitro, para uso como
sondas génicas o como componentes inhibidores (p. ej., ribozimas) se
sintetizan típicamente de forma química según el método de triéster
de fosforamidita en fase sólida, descrito por Beaucage y Caruthers
(1981), Tetrahedron Letts.,
22(20):1859-1862, p. ej., empleando un
sintetizador automático, tal y como describen
Needham-VanDevanter y col. (1984) Nucleic Acids
Res., 12:6159-6168. Los oligonucleótidos también
se pueden obtener comercialmente a partir de una variedad de fuentes
comerciales conocidas por los expertos en la técnica. La
purificación de oligonucleótidos, cuando es necesaria, se realiza
típicamente mediante electroforesis en gel de acrilamida natural o
por HPLC de intercambio aniónico, tal y como describen Pearson y
Regnier (1983) J. Chrom. 255:137-149. La
secuencia de los oligonucleótidos sintéticos se puede verificar
empleando el método de degradación química de Maxam y Gilbert (1980)
en Grossman y Moldave (compiladores) Academic Press, Nueva York,
Methods in Enzymology 65: 499-560.
Un experto en la técnica apreciará que con muchas
variaciones conservadoras de las estructuras artificiales de los
ácidos nucleicos descritos, se consigue una estructura artificial
funcionalmente idéntica. Por ejemplo, debido a la degeneración del
código genético, las "sustituciones silenciosas" (es decir,
sustituciones de una secuencia de ácidos nucleicos que no dan como
resultado la alteración de un polipéptido codificado) son una
característica implícita de cada secuencia de ácidos nucleicos que
codifica un aminoácido. De forma similar, con las "sustituciones
conservadoras de aminoácidos" de uno o de unos pocos aminoácidos,
en una secuencia de aminoácidos de una estructura artificial de
encapsidación o encapsidable, se sustituyen éstos con diferentes
aminoácidos con propiedades muy similares (véase, la sección de
definiciones, arriba), que se identifican fácilmente por ser una
estructura artificial muy similar a la descrita. Tales variaciones
por sustitución conservadora de cada secuencia descrita
explícitamente, son una característica de la presente invención.
Un experto en la técnica conocerá muchos modos
para generar alteraciones en una estructura artificial dada de
ácidos nucleicos. Tales métodos bien conocidos incluyen la
mutagénesis dirigida al sitio, la amplificación con PCR empleando
oligonucleótidos degenerados, la exposición de células que contienen
el ácido nucleico a agentes mutágenos o a radiación, la síntesis
química de un oligonucleótido deseado (p. ej., junto con ligación
y/o clonación para generar ácidos nucleicos largos) y otras técnicas
bien conocidas. Véase, Giliman y Smith (1979) Gene
8:81-97; Roberts y col. (1987) Nature
328:731-734 y Sambrook, Innis, Ausubel, Berger,
Needham VanDevanter y Mullis (todos véase arriba).
Un experto puede seleccionar un ácido nucleico
deseado de la invención basado en las secuencias proporcionadas y
basado en el conocimiento de la técnica en relación con retrovirus
en general. Los efectos específicos de muchas mutaciones en los
genomas de retrovirus son conocidos. Además, el conocimiento general
de la naturaleza de las proteínas y de los ácidos nucleicos permite
a los expertos el poder seleccionar las secuencias adecuadas con una
actividad similar o equivalente a los ácidos nucleicos y a los
polipéptidos descritos en los listados de secuencias de esta
memoria. La sección de definiciones de esta memoria describe a modo
de ejemplo, sustituciones conservadoras de aminoácidos.
Finalmente, la mayoría de las modificaciones de
ácidos nucleicos se evalúan por técnicas de escrutinio rutinarias,
en ensayos adecuados para la característica deseada. Por ejemplo, se
pueden detectar cambios en el carácter inmunológico de polipéptidos
codificados según un ensayo inmunológico adecuado. Las
modificaciones de otras propiedades, tales como la hibridación de
ácidos nucleicos con un ácido nucleico complementario, la
estabilidad redox o térmica de las proteínas codificadas, la
hidrofobicidad, la susceptibilidad a proteolisis o la tendencia a
agregarse, se someten todas a ensayo según técnicas
convencionales.
Las líneas celulares estables de encapsidación se
preparan transduciendo de forma estable o transitoria una célula de
mamífero con un plásmido de encapsidación, lo más preferido
transduciendo una célula humana. La transducción de células de
mamífero (incluyendo los seres humanos) es conocida en la técnica.
Las células hospedadoras son competentes o se vuelven competentes
para la transformación según diversos medios conocidos. Existen
diversos métodos bien conocidos para introducir ADN en células
animales. Estos incluyen: la precipitación con fosfato cálcico, la
fusión de las células receptoras con protoplastos bacterianos que
contienen el ADN, el tratamiento de las células receptoras con
liposomas que contienen el ADN, el DEAE-dextrano, la
endocitosis mediada por receptor, la electroporación y la
micro-inyección del ADN directamente en las
células.
El cultivo de células empleado en la presente
invención, que incluye líneas celulares y células cultivadas
procedentes de tejidos o de muestras de sangre, es bien conocido en
la técnica. Freshney (Culture of Animal Cells, a Manual of Basic
Technique, tercera edición Wiley-Liss, Nueva
York (1994)) y las referencias citadas en esta memoria, proporcionan
una guía general para el cultivo de células. Las células
transformadas se cultivan por medios bien conocidos en la técnica.
Véase, también Kuchler y col. (1977) Biochemical Methods in Cell
Culture and Virology, Kuchler, R.J., Dowden, Hutchinson and
Ross, Inc. Los sistemas de células de mamíferos estarán
frecuentemente en forma de monocapas celulares, aunque también se
utilizan suspensiones de células de mamífero. Ejemplos ilustrativos
de líneas celulares de mamíferos incluyen las células VERO y HeLa,
las células de riñón embrionario 293, las líneas celulares de ovario
de hámster chino (CHO), las líneas celulares W138, BHK,
Cos-7 o MDCK (véase, p. ej., Freshney, véase
arriba). Las células humanas son las más preferidas.
El material sobrenadante de cultivos celulares de
las células de encapsidación de la invención se obtiene utilizando
técnicas convencionales, tales como las mostradas por Freshney,
véase arriba. Véase también, Corbeau y col. (1996) Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 93:14070-14075 y las
referencias en esta memoria. Los componentes del material
sobrenadante celular se pueden purificar adicionalmente empleando
técnicas convencionales. Por ejemplo, las partículas de VIF en el
material sobrenadante se pueden purificar del material sobrenadante,
por métodos empleados típicamente para la purificación de virus,
tales como centrifugación, cromatografía, procedimientos de
purificación por afinidad y similares.
La transformación de las células de mamífero con
ácidos nucleicos pueden incluir, por ejemplo, incubar las células
competentes con un plásmido que contiene ácidos nucleicos que
codifican una partícula de VIF. El plásmido que se emplea para
transformar la célula hospedadora contiene preferentemente
secuencias de ácidos nucleicos para iniciar la transcripción y
secuencias para controlar la traducción de las secuencias
codificadas. Estas secuencias se denominan generalmente secuencias
de control de la expresión. Las secuencias ilustrativas de control
de la expresión de mamíferos se obtienen a partir del promotor de
SV-40 (Science (1983)
222:524-527), el promotor I.E. de CMV (Proc.
Natl. Acad. Sci. USA (1984) 81:659-663), el
promotor de CMV o el promotor de la metalotioneína (Nature
(1982) 296:39-42). Un vector de clonación que
contiene secuencias de control de la expresión, se corta empleando
enzimas de restricción y se ajusta el tamaño a como sea necesario o
deseable y se liga con ADN que codifica las secuencias de VIH de
interés, por medios bien conocidos en la técnica. Se conoce en la
técnica una amplia variedad de promotores específicos de pol II y de
pol III, activos en células humanas, y un experto en la técnica es
capaz de seleccionar y de emplear tales promotores según el nivel de
expresión deseado, el patrón, la célula transformada o
similares.
Las secuencias de poliadenilación o de
terminación de la transcripción procedentes de genes de mamíferos
conocidos, se incorporan típicamente en los vectores de la
invención. Un ejemplo de una secuencia de terminación es la
secuencia de poliadenilación procedente del gen de la hormona de
crecimiento bovina. Las secuencias para precisar el corte y el
empalme del transcrito también se pueden incluir. Un ejemplo de una
secuencia de corte y empalme es el intrón VPI de SV40 (Sprague y
col. (1983) J. Virol. 45: 773-781).
Adicionalmente, las secuencias génicas para controlar la replicación
en una célula hospedadora particular, se incorporan en el vector
como las encontradas en los vectores del tipo virus de papiloma
bovino. Véase, Saveria-Campo (1985), "Bovine
Papilloma virus DNA a Eukaryotic Cloning Vector" en DNA
Cloning Vol. II a Practical Approach Glover (compilador) IRL
Press, Arlington, Virginia págs. 213-238.
Los coplásmidos se pueden utilizar en los métodos
de selección. En estos métodos, un plásmido que contiene un marcador
seleccionable, tal como un gen de resistencia a antibióticos, se
emplea para cotransfectar una célula junto con un plásmido que
codifica ácidos nucleicos para la encapsidación de VIH. Las células
se seleccionan según la resistencia al antibiótico y la presencia
del plásmido de interés se confirma con el análisis de tipo
Southern, el análisis de tipo Northern o con PCR. Los coplásmidos
que codifican proteínas que se van a expresar en la superficie de
una partícula de VIH (p. ej., proteínas que amplían el campo del
hospedador de la cápsida, tales como la envuelta de VSV, un ligando
de receptor celular o un anticuerpo de un receptor celular) se
transducen opcionalmente en la célula de encapsidación. Además del
VSV, las proteínas de la envuelta de otros virus con envuelta
lipídica se incorporan opcionalmente en una partícula de la
invención, aumentando de este modo el campo de transducción de la
partícula.
Los vectores víricos que contienen ácidos
nucleicos que codifican secuencias seleccionadas, también se emplean
para transformar células en el campo de hospedadores del vector.
Véase, p. ej., Methods in Enzymology, vol 185, Academic Press
Inc., San Diego, CA (D.V. Goeddel, compilador) (1990) o M. Krieger,
Gene Transfer and Expression - A Laboratory Manual, Stockton
Press, Nueva York, (1990) y las referencias citadas en el mismo.
Una vez preparadas las líneas celulares estables
transformadas que expresan las partículas de VIF, las líneas
celulares transformadas se transfectan con vectores que codifican
ácidos nucleicos que se van a incorporar en los vectores de VIF.
Típicamente, estos vectores son plásmidos o se codifican en vectores
víricos. Los ácidos nucleicos encapsidados incluyen una subsecuencia
del sitio de encapsidación de VIF, junto con una secuencia de
interés, tal como un inhibidor vírico u otro agente terapéutico
génico (se apreciará que cualquier estado que esté mediado por
células que no se dividen o su progenie, es tratable empleando los
vectores de la invención, incluyendo las infecciones con VIH,
infecciones con HTLV, los linfomas, las leucemias, los tumores
neuronales y similares).
Las células humanas son líneas celulares de
encapsidación preferidas y se pueden volver competentes para la
transformación por técnicas descritas anteriormente. Por ejemplo,
para generar una línea celular de encapsidación de VIF estable, las
células de VIF se transfectan por el método de fosfato cálcico tal y
como se describe en los ejemplos de esta memoria. Un cultivo
subconfluyente, p. ej., en una placa de 6 pocillos (Costar,
Cambridge, MA) se transfecta con plásmido linealizado y precipitado
con fosfato cálcico (10 \mug), p. ej., en medio de Eagle
modificado con Dulbecco, suplementado con 10% de FCS, antibióticos y
glutamina (DMEM-10% de FCS), opcionalmente con un
marcador del coplásmido. Después de 18 horas, se lavan los pocillos
con solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (PBS) pH 7,8,
se incuba durante 2 min a 20ºC con solución de 15% de glicerol en
solución salina tamponada con HEPES (HEPES 50 mM pH 7,1, NaCl 280
mM, Na_{2}HPO_{4} 1,5 mM) se lava dos veces con PBS y se cultiva
en DMEM-10% de FCS. Estas células se someten a
selección de forma adecuada por un gen marcador de la
transducción.
Una amplia variedad de formatos y marcadores
están disponibles y son adecuados para la detección de plásmidos de
encapsidación, ácidos nucleicos encapsidables y partículas de
lentivirus en células de encapsidación, células diana y lisados
celulares. Los anticuerpos para los componentes de lentivirus y los
polipéptidos y los ácidos nucleicos de la invención (vectores,
plásmidos de encapsidación, ácidos nucleicos codificados y
polipéptidos, etc.) se detectan y se cuantifican por cualquiera de
una variedad de medios bien conocidos por los expertos en la
técnica. Estos incluyen los métodos analíticos bioquímicos, tales
como espectrofotometría, radiografía, electroforesis, electroforesis
capilar, cromatografía líquida de alta resolución (HPLC),
cromatografía en capa fina (TLC), cromatografía por hiperdifusión y
similares, y diversos métodos inmunológicos tales como reacciones de
precipitación en gel o fluida, inmunodifusión (sencilla o doble),
inmunoelectroforesis, radioinmunoensayos (RIAs), ensayos
inmunoenzimáticos (ELISAs), ensayos de inmunofluorescencia y
similares. Diversos ensayos de ELISA para la detección de
componentes de lentivirus (p. ej., VIF) están disponibles,
permitiendo a un experto en la técnica detectar partículas de
lentivirus de no primate o de lentivirus de no primate en una
muestra biológica.
La detección de ácidos nucleicos se realiza por
métodos bien conocidos, tales como el análisis de tipo Southern, el
análisis de tipo Northern, electroforesis en gel, PCR,
radiomarcación y recuento de centelleo y cromatografía de afinidad.
Muchos formatos de los ensayos son adecuados, incluyendo los
revisados por Tijssen (1993) Laboratory Techniques in
biochemistry and molecular biology-hybridization
with nucleic acid probes partes I y II, Elsevier, Nueva York y
Choo (compilador) (1994) Methods In Molecular Biology Volume 33-
In Situ Hybridization Protocols Humana Press Inc., New Jersey
(véanse también, otros libros en las series de Methods in Molecular
Biology); véase especialmente, el capítulo 21 de Choo (mencionado
antes) "Detection of Virus Nucleic Acids by Radioactive and
Nonisotropic in Situ Hybridization". También son
apropiadas una variedad de técnicas de detección en fase sólida
automatizadas. Por ejemplo, conjuntos de polímeros inmovilizados a
gran escala (VLSIPS^{TM}) se emplean para detectar ácidos
nucleicos. Véase Tijssen (véase arriba), Fodor y col. (1991)
Science, 251: 767-777 y Sheldon y col. (1993)
Clinical Chemistry 39(4): 718-719.
Finalmente, también se puede utilizar la PCR de forma rutinaria para
detectar ácidos nucleicos en muestras biológicas (véase, Innis,
véase arriba, para una descripción general de la técnicas de
PCR).
En una realización preferida, se emplean
anticuerpos para detectar proteínas expresadas por el vector
encapsidado, el ácido nucleico de encapsidación o para vigilar el
VIH, VLTH circulante (u otro agente patógeno de relevancia), los
niveles en sangre humana, p. ej., para vigilar el efecto in vivo de
un agente terapéutico génico codificado por los ácidos nucleicos
encapsidados en VIF. En otras realizaciones, los anticuerpos se
expresan conjuntamente en las células de encapsidación que se van a
incorporar en partículas víricas. Los métodos para producir
anticuerpos policlonales y monoclonales son conocidos por los
expertos en la técnica y están a disposición muchos anticuerpos.
Véase, p. ej., Coligan (1991) Current Protocols in Immunology
Wiley/Greene, NY; y Harlow y Lane (1989) Antibodies: A Laboratory
Manual Cold Spring Harbor Press, NY; Stites y col.
(compiladores) Basic and Clinical Immunology (4ª ed.) Lange
Medical Publications, Los Altos, CA, y las referencias citadas en
los mismos; Goding (1986) Monoclonal Antibodies: Principles and
Practice (2ª ed.) Academic Press, Nueva York, NY; y Kohler y
Milstein (1975) Nature 256: 495-497. Otras
técnicas adecuadas para la preparación de anticuerpos incluyen la
selección de bancos de anticuerpos recombinantes en fagos o vectores
similares. Véase, Huse y col. (1989) Science 246:
1275-1281; y Ward y col. (1989) Nature 341:
544-546. Los anticuerpos monoclonales y policlonales
específicos y los antisueros se unirán generalmente con una K_{D}
de al menos aproximadamente 0,1 \muM, preferentemente al menos
aproximadamente 0,01 \muM o mejor y lo más típico y preferido,
0,001 \muM o mejor.
Además de su utilidad para preparar líneas
celulares de encapsidación, los plásmidos de encapsidación no
infectivos de la invención se pueden utilizar para detectar virus de
tipo silvestre en muestras biológicas, empleando ensayos de
transferencia de tipo Southern o Northern. Brevemente, un ácido
nucleico codificado por el plásmido de encapsidación se marca,
típicamente empleando un radiomarcador o un marcador bioluminiscente
y se emplea para sondar una transferencia de tipo Northern o
Southern de una muestra que se sospecha que contiene un virus (VIF).
El uso del plásmido de encapsidación como sonda es más seguro que el
uso de un virus infectivo como sonda. El plásmido de encapsidación
es también más susceptible de que detecte un virus de tipo silvestre
que una sonda menor, debido que, al contrario de una sonda pequeña,
la sonda del plásmido de encapsidación tiene opcionalmente
prácticamente el genoma completo en común con un virus de tipo
silvestre (excepto el sitio de encapsidación), siendo improbable que
el virus de tipo silvestre pueda escapar a la detección por una
mutación del sitio de unión a la
sonda.
sonda.
Además, el plásmido de encapsidación se puede
utilizar como testigo positivo en esencialmente todos los métodos de
detección conocidos, para la detección del retrovirus
correspondiente (VIF). En esta realización, un ácido nucleico del
plásmido de encapsidación o el polipéptido codificado, se emplea
como testigo positivo para establecer que un ensayo de detección de
VIF esté funcionando de forma adecuada. Por ejemplo, los
oligonucleótidos se emplean como cebadores en reacciones de la PCR
para detectar ácidos nucleicos de VIF en muestras biológicas, tales
como sangre de felinos, en la práctica veterinaria. El plásmido de
encapsidación, que comprende subsecuencias del ácido nucleico
correspondientes a la región que se va a amplificar, se emplea como
un molde para la amplificación en una reacción separada de una
muestra del ensayo, tal como sangre humana, para determinar que los
reactivos de la PCR y las condiciones de la hibridación son
adecuadas. De forma similar, los polipéptidos codificados por el
plásmido de encapsidación se pueden emplear para comprobar los
reactivos de ELISA en ensayos para la detección de productos de la
expresión de VIF en muestras biológicas.
Los ácidos nucleicos encapsidables también se
pueden utilizar del mismo modo que las sondas moleculares, p. ej.,
cuando codifican componentes de VIH, tales como los sitios de
encapsidación de VIH, LTRs de VIH, proteínas Tat o Rev
transdominantes o similares, para la detección de VIH o como
reactivos para la detección de VIH.
La presente invención proporciona ácidos
nucleicos encapsidables para la transformación de células in
vitro e in vivo. Estos ácidos nucleicos encapsidables se
encapsidan en partículas de lentivirus de no primate, tales como
partículas de VIF, en las líneas celulares de encapsidación de
lentivirus descritas en esta memoria. Preferentemente, cuando la
diana está en el campo del hospedador del virus VSV (p. ej., una
célula pluripotencial hematopoyética) la partícula también incluye
glicoproteínas de VSV. Los ácidos nucleicos se transfieren a las
células mediante interacción de la partícula de VIF que rodea el
ácido nucleico y un receptor celular de VIF o de VSV.
En una clase particularmente preferida de
realizaciones, los ácidos nucleicos encapsidables de la invención se
emplean en procedimientos de transformación celular para terapia
génica. La terapia génica proporciona métodos para combatir
enfermedades infecciosas crónicas, tales como VIH, así como
enfermedades no infecciosas, tales como cáncer y defectos de
nacimiento, tal como deficiencias enzimáticas. Yu y col. (1994)
Gene Therapy 1:13-26 y las referencias del
mismo proporcionan una guía general para las estrategias de terapia
génica para la infección con VIH. Véase también, Sodoski y col.
documento de patente PCT/US91/04335. Una limitación general de los
vectores comunes para la terapia génica, tales como los retrovirus
de múridos, es que sólo infectan células que se dividen activamente
y que generalmente no son específicos. La presente invención
proporciona diversas características generales que permiten a un
experto generar vectores retrovíricos potentes para terapia génica
que se dirigen al blanco de células pluripotenciales de forma
específica in vivo y que transforman muchos tipos de células
in vitro. Las células CD4+, células neuronales y otras
células que no se dividen (frecuentemente positivas para CXCR4) se
transducen con ácidos nucleicos encapsidados en partículas de VIF.
Además, los vectores se seudotipifican opcionalmente para la
transformación de células pluripotenciales.
Las células pluripotenciales hematopoyéticas son
dianas especialmente preferidas para la transformación celular en
general y para la terapia génica (particularmente la terapia génica
anti-VIH) en particular. Los vectores encapsidables
se hacen competentes para transformar células CD34+ seudotipificando
el vector. Esto se realiza transduciendo la línea celular de
encapsidación empleada para encapsidar el vector, con un ácido
nucleico que codifica una proteína Env que suplanta o complementa la
función env retrovírica. La función de la envuelta se puede
proporcionar en trans por cualquiera de las distintas
proteínas heterólogas de la envuelta vírica. Estas incluyen, pero no
están limitadas a, VSV-G, la envuelta anfotrópica
del virus de la leucemia de Moloney (MoMuLV) y la envuelta del virus
de la leucemia de los simios gibones (GALV). La glicoproteína de la
envuelta del virus de la estomatitis vesicular (VSV) que se expresa
en la superficie del vector es un componente de seudotipificación
preferido. VSV infecta células CD34+ que se dividen y que no se
dividen, y los vectores de seudotipificación que expresan proteínas
de la envuelta de VSV son competentes para transducir estas
células.
De forma similar, las proteínas víricas o
celulares en general se pueden co-expresar para
incrementar el campo de hospedadores de un vector basado en VIF.
Típicamente, un ácido nucleico que codifica una proteína
seleccionada se coexpresa en una célula de encapsidación de VIF de
la invención. La proteína codificada por el ácido nucleico se
incorpora en la partícula que encapsida un ácido nucleico
encapsidable en VIF, que se invagina desde la membrana de la célula
de encapsidación. Si la proteína es reconocida por un receptor
celular sobre una célula diana, la partícula se transduce a la
célula mediante endocitosis mediada por el receptor. Las proteínas
preferidas incluyen las proteínas de la envuelta o de la cubierta
vírica, los ligandos del receptor celular, los anticuerpos o los
fragmentos de anticuerpos que se unen a receptores celulares sobre
las células diana, y similares.
Una clase de realizaciones emplea una secuencia
de LTR de VIH como promotor para el vector encapsidable en VIF.
Estas secuencias de LTR se transactivan después de la infección de
una célula que contiene el promotor de LTR del virus VIH infectante.
Los promotores de LTR de VIH, además de unirse a tat y a
rev, son sensibles a las citoquinas celulares (tales como
IL-2 y SP-1) que actúan permitiendo
la transcripción del genoma de VIH después de la infección. Por
tanto, en una realización, un ácido nucleico terapéutico de elección
se sitúa bajo el control de un promotor de LTR, volviendo las
células que generalmente son lo más vulnerable a la infección con
VIH, resistentes a la infección. Además, en una realización, un
sitio de encapsidación de VIH (además del sitio de encapsidación de
lentivirus de VIF o de no primate) se incluye en el vector
encapsidable en VIF. Esto permite que el agente terapéutico
anti-VIH codificado en el vector basado en VIF, se
encapside y se disemine infectando virus VIH, causando un efecto
protector secundario que se va a propagar junto con la infección de
VIH, retardando de este modo la infección. El sitio de encapsidación
de VIH está bien descrito, véase, Poznansky y col. (1991) Journal
of Virology 65(1): 532-536; Aldovini y
Young (1990) Journal of Virology 64(5):
1920-1926 y Clever y col. (1995) Journal of
Virology 69(4):2101-2109. Para una
descripción de los vectores que se pueden encapsidar en VIH para
proporcionar un efecto protector secundario, véase,
Wong-Stall y col. documento de patente de EE.UU. nº
5.650.309.
También son preferidos los promotores
constitutivos para dirigir la expresión de los ácidos nucleicos
terapéuticos, tales como los promotores pol III. El documento de
solicitud de patente PCT/US94/05700 (WO 94/26877) y Chatterjee y
col. (Science (1992), 258:1485-1488, de aquí
en adelante, Chatterjee y col. 1) describen la inhibición
antiparalela de la infectividad de VIH-1 en células
diana empleando vectores víricos con una casete constitutiva de
expresión de pol III que expresa ARN anti-TAR.
Chatterjee y col. (documento de solicitud de patente PCT/US91/03440
(1991), de que aquí en adelante, Chatterjee y col. 2)
describen vectores víricos que incluyen vectores basados en el VAA
que expresan secuencias antiparalelas de TAR. Chatterjee y Wong
(Methods, A companion to Methods in Enzymology (1993), 5:
51-59) describen adicionalmente vectores víricos
para la entrega de ARN antiparalelo. La publicación del documento de
patente PCT WO 94/26877 (PCT/US/05700) describe una variedad de
genes para la terapia anti-VIH y estrategias para la
terapia génica, que incluyen generalmente el uso de genes suicidas,
genes transdominantes, ribozimas, genes antiparalelos y genes
señuelos en vectores de terapia génica. Yu y col. (1994) Gene
Therapy 1: 13-26 y las referencias citadas en
esta memoria proporcionan una guía general para las estrategias de
terapia génica, útiles contra la infección con VIH.
Los métodos ex vivo para inhibir la
replicación vírica en una célula en un organismo (o para introducir
de otro modo un gen terapéutico en la célula) incluyen transducir la
célula ex vivo con un ácido nucleico terapéutico de esta
invención e introducir la célula en el organismo. Las células diana
incluyen células CD4+, tales como células T CD4+ o macrófagos
aislados o cultivados de un paciente, células pluripotenciales o
similares. Véase, p. ej., Freshney y col., véase arriba y las
referencias citadas en esta memoria para una exposición de cómo
aislar y cultivar células de pacientes. Alternativamente, las
células pueden ser las almacenadas en un banco de células (p. ej.,
un banco de sangre). En una clase de realizaciones preferidas, el
ácido nucleico encapsidable codifica un agente terapéutico
antivírico (p. ej., un gen suicida, un gen transdominante, una
ribozima anti-VIH, un gen antiparalelo o un gen
señuelo) que inhibe el crecimiento o la replicación de un virus VIH,
bajo el control de un promotor activado o constitutivo. El vector de
la transformación celular inhibe la replicación vírica en cualquiera
de estas células ya infectadas con el virus VIH, además de conferir
un efecto protector a las células que no están infectadas con VIH.
Además, en realizaciones preferidas, el vector se replica y se
encapsida en cápsidas de VIH, empleando la maquinaria de la
replicación de VIH, provocando de este modo que el gen terapéutico
anti-VIH se propague junto con la replicación de un
virus VIH. Por tanto, en un organismo infectado con VIH se puede
tratar la infección transduciendo una población de sus células con
un vector de la invención e introduciendo las células transducidas
de nuevo en el organismo, tal y como se describe en esta memoria.
Por tanto, la presente invención proporciona un método para proteger
células in vitro, ex vivo o in vivo, incluso
cuando las células ya están infectadas con el virus contra el que se
buscaba protección.
En una realización particularmente preferida, las
células pluripotenciales (que son típicamente no CD4+) se emplean en
procedimientos ex vivo para la transformación celular y la
terapia génica. La ventaja de utilizar células pluripotenciales es
que se pueden diferenciar en otros tipos de células in vitro
o se pueden introducir en un mamífero (tal como el donante de las
células) en donde se implantan en la médula ósea. Los métodos para
diferenciar células CD34+ in vitro en tipos inmunocelulares
clínicamente importantes, empleando citoquinas tales como
GM-CSF,
IFN-\gamma y TNF-\alpha, son conocidos (véase, Inaba y col. (1992) J. Exp. Med. 176, 1693-1702 y Szabolcs y col. (1995) 154:5851-5861). Los métodos para seudotipificar vectores de VIF de modo que se puedan transformar células pluripotenciales se han descrito anteriormente. Se puede utilizar un procedimiento de aislamiento en columna de afinidad para aislar células que se unen a CD34 o a anticuerpos unidos a CD34. Véase, Ho y col. (1995) Stem Cells (supl. 3): 100-105. Véase también, Brenner (1993) Journal of Hematotherapy 2: 7-17. En otra realización, las células pluripotenciales hematopoyéticas se aíslan a partir de sangre del cordón umbilical fetal. Yu y col. (1995) PNAS 92: 699-703 describen un método preferido para transducir células CD34+ de sangre del cordón umbilical humano, empleando vectores retrovíricos. Más que el uso de células pluripotenciales, las células T también se transducen en realizaciones preferidas en procedimientos ex vivo. Se conocen diversas técnicas para aislar células T. En un método, se emplea la centrifugación en gradiente de densidad con Ficoll-Hypaque para separar PBMC de los glóbulos rojos y de los neutrófilos, según procedimientos establecidos. Las células se lavan con AIM-V modificado (que consta de AIM-V (GIBCO) con glutamina 2 mM, 10 \mug/ml de sulfato de gentamicina, 50 \mug/ml de estreptomicina) suplementado con 1% de suero de ternera fetal (FBS). El enriquecimiento de las células T se realiza mediante selección negativa o positiva con anticuerpos monoclonales adecuados, acoplados a columnas o a lechos magnéticos según técnicas convencionales. Una parte alícuota de las células se analiza para estudiar el fenotipo de la superficie celular deseada (p. ej., CD4, CD8, CD3, CD14, etc.).
IFN-\gamma y TNF-\alpha, son conocidos (véase, Inaba y col. (1992) J. Exp. Med. 176, 1693-1702 y Szabolcs y col. (1995) 154:5851-5861). Los métodos para seudotipificar vectores de VIF de modo que se puedan transformar células pluripotenciales se han descrito anteriormente. Se puede utilizar un procedimiento de aislamiento en columna de afinidad para aislar células que se unen a CD34 o a anticuerpos unidos a CD34. Véase, Ho y col. (1995) Stem Cells (supl. 3): 100-105. Véase también, Brenner (1993) Journal of Hematotherapy 2: 7-17. En otra realización, las células pluripotenciales hematopoyéticas se aíslan a partir de sangre del cordón umbilical fetal. Yu y col. (1995) PNAS 92: 699-703 describen un método preferido para transducir células CD34+ de sangre del cordón umbilical humano, empleando vectores retrovíricos. Más que el uso de células pluripotenciales, las células T también se transducen en realizaciones preferidas en procedimientos ex vivo. Se conocen diversas técnicas para aislar células T. En un método, se emplea la centrifugación en gradiente de densidad con Ficoll-Hypaque para separar PBMC de los glóbulos rojos y de los neutrófilos, según procedimientos establecidos. Las células se lavan con AIM-V modificado (que consta de AIM-V (GIBCO) con glutamina 2 mM, 10 \mug/ml de sulfato de gentamicina, 50 \mug/ml de estreptomicina) suplementado con 1% de suero de ternera fetal (FBS). El enriquecimiento de las células T se realiza mediante selección negativa o positiva con anticuerpos monoclonales adecuados, acoplados a columnas o a lechos magnéticos según técnicas convencionales. Una parte alícuota de las células se analiza para estudiar el fenotipo de la superficie celular deseada (p. ej., CD4, CD8, CD3, CD14, etc.).
En general, la expresión de los marcadores de
superficie facilita la identificación y la purificación de células
T. Los métodos para identificar y aislar células T incluyen FACS,
cromatografía en columna, la separación por absorción a lechos
magnéticos, las transferencias de tipo Western, radiografía,
electroforesis, electroforesis capilar, cromatografía líquida de
alta resolución (HPLC), cromatografía en capa fina (TLC),
cromatografía por hiperdifusión y similares, y diversos métodos
inmunológicos tales como reacciones con precipitina sobre fluido o
sobre gel, inmunodifusión (simple o doble), inmunoelectroforesis,
radioinmunoensayos (RIAs), ensayos inmunoenzimáticos (ELISAs),
ensayos inmunofluorescentes y similares. Para una revisión de los
procedimientos inmunológicos de inmunoensayo en general, véase
Stites y Terr (compiladores) 1991 Basic and Clinical
Immunology (7ª ed.) y Paul véase arriba. Para una exposición de
cómo preparar anticuerpos para seleccionar antígenos, véase, p. ej.,
Coligan (1991) Current Protocols in Immunology Wiley/Greene, NY; y
Harlow y Lane (1989) Antibodies: A Laboratory Manual Cold
Spring Harbor Press, NY; Stites y col. (compiladores) Basic and
Clinical Immunology (4ª ed.).
Además de los usos ex vivo descritos
anteriormente, las líneas celulares de encapsidación de la invención
y los ácidos nucleicos encapsidables en VIH de la invención, son
útiles generalmente en métodos de clonación. Los ácidos nucleicos
encapsidables se encapsidan en una partícula de VIF y se emplean
para transformar una célula infectable con VIF (p. ej., una célula
hematopoyética de felino) in vitro o in vivo. Esto
proporciona a un experto una técnica y unos vectores para
transformar células con un ácido nucleico elegido, p. ej., en
ensayos de descubrimiento de fármacos o como una herramienta en el
estudio de la regulación génica, o como un vector de clonación
general.
Las partículas de lentivirus de no primate que
contienen ácidos nucleicos terapéuticos se pueden administrar
directamente al organismo, para la transducción de células in
vivo. La administración se realiza mediante cualquiera de las
vías empleadas normalmente para introducir una molécula en contacto
fundamental con la sangre o células tisulares. Los ácidos nucleicos
encapsidables encapsidados en VIF o en otras partículas de
lentivirus de no primate, se emplean para tratar y prevenir las
enfermedades mediadas por virus, tales como SIDA, en pacientes
animales y humanos. Los ácidos nucleicos encapsidados se administran
de cualquier forma adecuada, preferentemente con vehículos
farmacéuticamente aceptables. Los métodos de administración
adecuados para dichos ácidos nucleicos encapsidados en el contexto
de la presente invención, a un paciente, están disponibles y, aunque
se puede utilizar más de una ruta para administrar una composición
particular, una ruta en particular puede proporcionar frecuentemente
una reacción más inmediata y más eficaz que otra ruta.
Los vehículos farmacéuticamente aceptables se
determinan en parte por la composición particular que se va a
administrar, así como por el método particular empleado para
administrar la composición. Por tanto, existe una gran variedad de
formulaciones adecuadas de composiciones farmacéuticas de la
presente invención.
Los ácidos nucleicos encapsidados, solos o en
combinación con otros componentes adecuados, se pueden preparar
también en formulaciones de aerosoles (es decir, se pueden
"nebulizar") para una administración mediante inhalación. Las
formulaciones de aerosoles se pueden colocar en propulsores
aceptables a presión, tales como diclorodifluorometano, propano,
nitrógeno y similares.
Las formulaciones adecuadas para una
administración por vía parenteral, tales como por ejemplo, por vía
interarticular (en las articulaciones), intravenosa, intramuscular,
intradérmica, intraperitoneal y subcutánea, incluyen soluciones
acuosas y no acuosas, para inyección estéril e isotónica, que pueden
contener antioxidantes, tampones, bacteriostáticos y solutos que
vuelven la formulación isotónica con la sangre del receptor elegido,
y suspensiones acuosas y no acuosas estériles que pueden incluir
agentes de suspensión, solubilizantes, agentes espesantes,
estabilizantes y conservantes. La administración por vía parenteral
y la administración por vía intravenosa son los métodos de
administración preferidos. Las formulaciones del ácido nucleico
encapsidado se pueden presentar en recipientes sellados de una dosis
o de dosis múltiples, tales como ampollas y frascos.
Las células transducidas con el ácido nucleico
encapsidado, tal y como se ha descrito anteriormente, en el contexto
de la terapia ex vivo, también se pueden administrar por vía
intravenosa o parenteralmente tal y como se ha descrito
anteriormente.
La dosis administrada a un paciente, en el
contexto de la presente invención, debe ser suficiente para efectuar
una respuesta terapéutica beneficiosa extra en el paciente o para
inhibir la infección con un agente patógeno. La dosis se determinará
por la eficacia del vector empleado en particular y el estado del
paciente, así como el peso corporal o la superficie del paciente que
se va a tratar. El tamaño de la dosis también se determinará según
la existencia, la naturaleza y el grado de cualquier efecto
secundario adverso que acompañe la administración de un vector en
particular o el tipo de célula transducida en un paciente en
particular.
Para determinar la cantidad eficaz del vector que
se va a administrar en el tratamiento o en la profilaxis de
enfermedades mediadas por virus, tales como el SIDA, el médico
evalúa los niveles circulantes en plasma, las toxicidades del
vector, la progresión de la enfermedad y la producción de
anticuerpos anti-vector. En general, la dosis
equivalente de un ácido nucleico desnudo procedente de un vector es
desde aproximadamente 1 \mug a 100 \mug para un paciente típico
de 70 kg y las dosis de vectores que incluyen una partícula
retrovírica se calculan para conseguir una cantidad equivalente de
ácido nucleico inhibidor. Los vectores de esta invención puede
complementar el tratamiento de estados mediados por virus, según
cualquier terapia convencional conocida, incluyendo agentes
citotóxicos, análogos de nucleótidos y modificadores de la respuesta
biológica.
Para la administración, los inhibidores y las
células transducidas de la presente invención se pueden administrar
con una tasa determinada por la LD-50 del inhibidor,
del vector o del tipo celular transducido, y los efectos secundarios
del inhibidor, del vector o del tipo celular a diferentes
concentraciones, tal y como se aplica a la masa y a la salud general
del paciente. La administración se puede realizar con una sola dosis
o en dosis divididas.
Para introducir las células transducidas, antes
de la infusión, se obtienen muestras de sangre y se conservan para
análisis. Entre 1 x 10^{8} y 1 x 10^{12} células transducidas se
infunden por vía intravenosa a lo largo de 60-200
minutos. Las señales vitales y la saturación de oxígeno por
oximetría de pulso se vigilan de cerca. Las muestras sanguíneas
obtenidas 5 minutos y 1 hora después de la infusión se conservan
para un posterior análisis. La leucoforesis, la transducción y la
reinfusión se repiten cada 2 a 3 meses durante un total de 4 a 6
tratamientos en el periodo de un año. Después del primer
tratamiento, las infusiones se pueden realizar de forma ambulante a
discreción del médico. Si se proporciona la reinfusión de forma
ambulante, el paciente se vigila durante al menos 4 y
preferentemente 8 horas después de la terapia.
Las células transducidas se preparan para
reinfusión según métodos establecidos. Véase, Abrahamsen y col.,
(1991) J. Clin. Apheresis 6: 48-53; Carter y
col. (1988) J. Clin. Apheresis 4: 113-117;
Aebersold y col. (1988), J. Immunol. Methods 112:
1-7; Muul y col. (1987) J. Immunol. Methods
101: 171-181 y Carter y col. (1987)
Transfusion 27: 362-365. Después de un
periodo de aproximadamente 2-4 semanas en cultivo,
se deben tener entre 1x 10^{8} y 1 x 10^{12} células. En
relación con ésto, las características del crecimiento de las
células varía de paciente a paciente y de tipo celular a tipo
celular. Aproximadamente 72 horas antes de la reinfusión de las
células transducidas, se toma una parte alícuota para analizar el
fenotipo y el porcentaje de células que expresan el agente
terapéutico.
Si un paciente al que se está realizando la
infusión de un vector o de células transducidas tiene fiebre,
escalofríos o dolores musculares, recibe la dosis apropiada de
aspirina, ibuprofeno o acetaminofeno. Los pacientes que padecen
reacciones frente a la infusión, tales como fiebre, dolores
musculares y escalofríos se medican previamente 30 minutos antes de
las futuras infusiones con aspirina, acetaminofeno o difenhidramina.
La meperidina se emplea para los escalofríos y los dolores
musculares más graves que no responden rápidamente a los
antipiréticos e antihistamínicos. La infusión celular es lenta o
discontinua, dependiendo de la gravedad de la reacción.
Los inhibidores víricos especializados se
codifican típicamente en los ácidos nucleicos encapsidados de la
invención, en donde el uso pretendido es la inhibición vírica (p.
ej., VIH). Por tanto, las técnicas aplicables a la construcción y al
mantenimiento de ácidos nucleicos, se aplican a los inhibidores de
la presente invención. Los agentes antivíricos que se incorporan
opcionalmente en los inhibidores víricos de la invención, incluyen
genes antiparalelos, ribozimas, genes señuelos y ácidos nucleicos
transdominantes.
Un ácido nucleico antiparalelo es un ácido
nucleico que, después de la expresión, se hibrida con una molécula
de ARN particular, con un promotor transcripcional o con la hebra
paralela de un gen. En la hibridación, el ácido nucleico
antiparalelo interfiere con la transcripción de un ácido nucleico
complementario, con la traducción de un ARNm o con la función de un
ARN catalítico. Las moléculas antiparalelas útiles en esta invención
incluyen las que se hibridan con transcritos de genes víricos. Dos
secuencias diana para las moléculas antiparalelas son el primer y el
segundo exón de los genes del VIH tat y rev.
Chatterjee y Wong, véase arriba y Marcus-Sekura
(Analytical Biochemistry (1988) 172, 289-285)
describen el uso de genes antiparalelos que bloquean o modifican la
expresión génica.
Una ribozima es una molécula de ARN catalítica
que corta otras moléculas de ARN que tienen secuencias de ácidos
nucleicos particulares. Los métodos generales para la construcción
de ribozimas, que incluyen las ribozimas en horquilla, las ribozimas
en cabeza de martillo, las ribozimas de ARNasa P (es decir,
ribozimas obtenidas a partir de la ribozima de ARNasa P presente en
la naturaleza en procariontes y eucariontes) son conocidos en la
técnica. Castanotto y col. (1994) Advances in Pharmacology
25: 289-317 proporcionan una revisión de las
ribozimas en general, incluyendo el grupo de ribozimas I, ribozimas
en cabeza de martillo, ribozimas en horquilla, ARNasa P y ribozimas
en cabeza de hacha. Las ribozimas útiles en esta invención incluyen
las que cortan transcritos víricos, particularmente transcritos de
genes de VIH. Ojwang y col. Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
89:10802-06 (1992); Wong-Staal y
col. (documento de patente PCT/US94/05700); Ojwang y col. (1993)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6340-6344;
Yamada y col. (1994) Human Gene Therapy 1:
39-45; Leavitt y col. (1995) Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 92: 699-703; Leavitt y col. (1994)
Human Gene Therapy 5: 1151-1120; Yamada y
col. (1994) Virology 205:121-126 y Dropulic y
col. (1992) Journal of Virology
66(3):1432-1441 proporcionan ejemplos de
ribozimas en horquilla y cabeza de martillo específicas de
VIH-1.
Resumiendo, dos tipos de ribozimas que son
particularmente útiles en esta invención incluyen la ribozima en
horquilla y la ribozima en cabeza de martillo. La ribozima en cabeza
de martillo (véase, Rossie y col. (1991) Pharmac. Ther.
50:245-254; Forster y Symons (1987) Cell
48:211-220; Haseloff y Gerlach (1988) Nature
328:596-600; Walbot y Bruening (1998) Nature
334:196; Haseloff y Gerlach (1988) Nature 334:585 y Dropulic
y col. y Castanotto y col. y las referencias citadas en esas
memorias, véase arriba) y la ribozima en horquilla (véase, p. ej.,
Hampel y col. (1990) Nucl. Acids. Res.
18:299-304; Hempel y col., (1990) el documento de
publicación de patente europea nº 0360257; el documento de patente
de EE.UU. nº 5.254.678 expedido el 19 de octubre de 1993;
Wong-Staal y col., documento de patente
PCT/US94/05700; Ojwang y col. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 90:6340-6344; Yamada y col. (1994) Human
Gene Therapy 1:39-45; Leavitt y col. (1995)
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:699-703;
Leavitt y col. (1994) Human Gene Therapy
5:1151-1120 y Yamada y col. (1994) Virology
205:121-126) son moléculas catalíticas que tienen
actividad antiparalela y endorribonucleotidasa. La expresión
intracelular de las ribozimas en cabeza de martillo y las ribozimas
en horquilla, dirigidas contra ARN de VIH, ha mostrado que confiere
una resistencia significativa frente a la infección con VIH. Estas
ribozimas se construyen para dirigirse como blanco a una parte del
genoma de VIH o del ácido nucleico codificado por el genoma. Los
sitios de diana preferidos en VIH-1 incluyen la
región U5 y el gen de la polimerasa. Se conocen las ribozimas
anti-VIH transactivas que cortan en GUC y GUA.
Un ácido nucleico señuelo es un ácido nucleico
que tiene una secuencia reconocida por una proteína reguladora que
se une al ácido nucleico (es decir, un factor de transcripción, un
factor celular de tráfico, etc.). Después de la expresión, el factor
de transcripción se une más al ácido nucleico señuelo que a su diana
natural en el genoma. Las secuencias señuelo de ácido nucleico
útiles incluyen cualquier secuencia a la que se une un factor de
transcripción vírico. Por ejemplo, la secuencia TAR, a la que se une
la proteína tat y la secuencia RRE de VIH (en particular la
secuencia SL II), a la que se unen las proteínas rev, son secuencias
adecuadas para emplear como ácidos nucleicos señuelo.
Un ácido nucleico transdominante es un ácido
nucleico que expresa una proteína cuyo fenotipo, cuando se
suministra por transcomplementación, supera el efecto de la forma
natural de la proteína. Por ejemplo, tat y rev se
pueden mutar para mantener su capacidad para unirse a TAR y a RRE,
respectivamente, pero carecen de la propia función reguladora de
estas proteínas. En particular, rev se puede volver
transdominante eliminando el dominio rico en leucinas cercano al
extremo C, que es esencial para la regulación normal propia de la
transcripción. Las proteínas tat transdominantes se pueden generar
por mutaciones en el dominio de localización del ARN de
unión/nuclear. La complementación recíproca de los clones
moleculares defectuosos de VIH está descrita, p. ej., por Lori y
col. (1992) Journal of Virology 66(9)
5553-5560.
Los siguientes ejemplos se proporcionan sólo a
modo de ilustración y no como una limitación. Los expertos
reconocerán fácilmente una variedad de parámetros no decisivos que
se cambian o se modifican para conseguir resultados similares.
La repetición larga terminal (LTR) de VIF está
inactiva o mínimamente activa en las células humanas. No se ha
descrito previamente ningún método anterior para una expresión de
altos niveles del complemento completo de proteínas de un lentivirus
de no primate en trans, en células humanas y de forma
defectuosa para la replicación. Por tanto, para expresar altos
niveles de proteínas de VIF en trans, de forma defectuosa
para la replicación en células humanas y para potenciar la seguridad
sustituyendo una parte decisiva de VIF que sea necesaria para la
replicación, el clon 34TF10 de VIF se cortó con EspI, tratado con la
polimerasa Klenow en presencia de dNTPs 200 \muM, a continuación
se cortó con SacI, se trató con la ADN polimerasa de T4 en presencia
de dNTPs 200 \muM y el fragmento resultante que contenía las
regiones que codifican el virus (pero no las LTRs) se purificó en
gel. Este fragmento se ligó después con extremos romos en el
elemento principal tratado con fosfatasa alcalina intestinal de
ternera, tratado con Klenow y cortado con NotI & XbaI, del
plásmido de expresión de CMV, pRc/CMV. El plásmido resultante (CF1)
se confirmó mediante múltiples digestiones con enzimas de
restricción para diagnóstico. CF1 contiene el promotor de CMV
seguido del genoma de VIF desde la parte distal de líder 5'
post-LTR (93 nucleótidos aguas arriba del donante
principal de corte y empalme) hasta 38 nucleótidos aguas abajo del
último ORF (Rev) de VIF.
El clon 34TF10 de VIF se escogió para este
trabajo porque este clon de VIF ya tiene una mutación que inactiva
el gen de ORF2. Véase, Talbott, R.L. y col. (1989) Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 86, 5743-5747. ORF2 es un
transactivador putativo que se ha observado que es necesario para la
replicación en linfocitos de sangre periférica de felinos. Por
tanto, 34TF10 es un virus atenuado; esta atenuación es beneficiosa
para esta invención porque disminuye adicionalmente el riesgo
patogénico de VIF de tipo silvestre, sin afectar al comportamiento
del vector. Sin embargo, están disponibles otros clones con
propiedades similares o se pueden obtener fácilmente inactivando de
forma similar el virus de tipo silvestre, empleando métodos
recombinantes.
La transfección de CF1 en células humanas HeLa,
293 y 293-T de riñón por el método de
coprecipitación con fosfato de calcio producía el sorprendente
resultado de sincitios inflamados expandidos (células gigantes
multinucleadas producidas por fusión de células que expresan la
envuelta con otras células) que contenían de cincuenta a varios
cientos de núcleos y altos niveles (sobre un millón de cpm) de
transcriptasa inversa en el material sobrenadante. De hecho,
encontramos que los cultivos en monocapa de células 293 y
293-T y de HeLa humanas se destruían en
90-95% con reproducibilidad con los sincitios,
después de la transfección transitoria de CF1 (por ejemplo, mediante
transfección de 10 \mug de CF1 en un frasco de 75 cm^{2}), tal y
como se había diseñado y esperado, se producía un virus no
infeccioso o no competente para la replicación: la transferencia de
grandes volúmenes de material sobrenadante de células
293-T transfectadas con CF1, a células 293 o
293-T de nuevo aporte o a células de riñón de felino
Crandall, daba como resultado la falta de formación de sincitios o
la no producción de RT. CF1\Deltaenv, que es idéntico a CF1
excepto una deleción en la envuelta de VIF (véanse los detalles
arriba), no causa sincitios pero produce altos niveles de
transcriptasa inversa y de las funciones víricas necesarias para
encapsidar los vectores. Este resultado sin precedentes llevaba al
nuevo enfoque de que todas las funciones de VIF necesarias para la
producción de proteínas, incluyendo el eje de regulación Rev/RRE, la
producción de gag/pol de VIF y los sincitios mediados por la
envuelta, pueden tener lugar en células humanas si el promotor de
VIF se sustituye específicamente con un promotor activo en células
humanas.
Los sincitios producidos en células humanas por
CF1 y CT5 (abajo) se inhibían totalmente por la inclusión de una
dilución 1:1000 de plasma procedente de gatos infectados con VIF
(CI50 entre una dilución de 1:10.000 y 1:30.000), pero no se
inhibían en absoluto con cualquier dilución (incluso de 1:10) de
plasma procedente de gatos domésticos no infectados. Esta inhibición
específica con anticuerpos anti-VIF, proporcionaba
una evidencia adicional de que los sincitios eran específicos de la
envuelta de VIF.
La radioinmunoprecipitación de células humanas
(293-T, HeLa) y felinas (CRFK) marcadas con
^{35}S-metionina y con
^{35}S-cisteína, transfectadas con CF1 y con el
virus parental (34TF10), mostraba que las proteínas víricas de VIF
se podían inmunoprecipitar específicamente con sueros VIF+
procedentes de células CRFK transfectadas con otro plásmido. En las
células humanas, 34TF10 producía poca proteína o ninguna, lo que
indica una actividad mínima del promotor de VIF, aunque CF1 producía
grandes cantidades de proteína de VIF. Estas proteínas mostraban ser
específicas de VIF por su ausencia en inmunoprecipitados de las
mismas células transfectadas con un plásmido testigo.
Para permitir el uso heterólogo de la envuelta
(p. ej., VSV-G), se realizó una deleción específica
de la envuelta de VIF (el producto del gen env) en CF1
mediante una ligación en 3 partes: CF1 se restringió con PflmI (que
está presente 4 veces en CF1). Puesto que dos sitios de PflM de
interés en el gen env, eran incompatibles, y debido a que la
formación de extremos romos en estos sitios PflM produciría una
deleción en el marco de lectura de env, la digestión de PflM
se trató con polimerasa de T4 para eliminar la parte sobresaliente
3' PflmI y se ligó con un enlazador sacII con desplazamiento del
marco de lectura, se digirió con SacII y se purificó en gel. A
continuación, se digirieron partes alícuotas de la digestión
enlazada a PflMI/SacII con sacII y separadamente con pvuI o con
Bsu36I. Entonces se realizó un ligación en 3 partes
(PvuI-BsU36I más
BsU36I-PflM(enlazador de SacII) más
(enlazador de SacII)PflMI-PvuI). El plásmido
resultante (CF1\Deltaenv) se confirmó por múltiples
digestiones para diagnóstico por restricción. CF1\Deltaenv
contenía una deleción de 875 nt en env. Producía altos
niveles de transcriptasa inversa en células humanas después de la
transfección, pero no producía sincitios, proporcionando una
evidencia más, además de los experimentos de inhibición plasmática
descritos anteriormente, de que los sincitios observados con CF1
estaban mediados específicamente con la envuelta de VIF.
La función de la envuelta en
CF1\Deltaenv se puede sustituir en trans por
cualquier cantidad de proteínas heterólogas de la envuelta vírica.
Estas incluyen, pero no están limitadas a, VSV-G, la
envuelta anfotrópica del virus de la leucemia de múridos de Moloney
(MoMuLV) y la envuelta del virus de la leucemia de simios gibones
(GALV), que son bien conocidas por los expertos en la técnica por
ser capaces de suplantar de modo eficaz la función de la envuelta en
retrovirus.
En otras realizaciones, las deleciones
adicionales de las secuencias de VIF, se realizan a partir de
CF1\Deltaenv. Por ejemplo, la región entre el donante
principal 5' de corte y empalme y el codón ATG de gag, aunque
sólo tiene veinte nucleótidos en VIF (en comparación con más de 40
en VIH-1 y más de 70 en VIH-2), se
puede delecionar o cambiar la secuencia. Las secuencias adicionales
de env se eliminan y se someten a ensayo los efectos de la
deleción de vif o de otras regiones estudiadas.
En una realización preferida, se decidió
sustituir completamente la función promotora del U3 de VIF en este
sistema (es decir, en las estructuras artificiales de encapsidación
y en el vector) por diversas razones (U3, o región única
3-prima, contiene los elementos de
promotor/potenciador de un retrovirus). En primer lugar, la LTR de
VIF está inactiva o poco activa en las células humanas y se deseaba
conseguir la producción de un vector en células humanas ya que
incrementaría la probabilidad de transducción posterior en células
humanas y debido a que no están bien caracterizados los sistemas de
transfección adecuados que emplean células de felinos. En segundo
lugar, porque son deseables los altos niveles de expresión bien
conocidos, dirigidos por un promotor tal como el promotor inmediato
temprano de hCMV en sistemas definidos (p. ej., el sistema de
células de riñón embrionario humano 293T). En tercer lugar, la
sustitución de U3 en el vector y en la estructura artificial de
encapsidación ayudará adicionalmente a eliminar el riesgo de un VIF
competente para la replicación. En otra modificación, se
delecionaron del vector 80 bases de la región 3' de U3, incluyendo
especialmente la caja TATA. Por tanto, no se puede regenerar un VIF
competente para la replicación debido a esta deleción, y debido a
que el plásmido de encapsidación tiene la deleción del gen
env y del codón de detención que inactiva ORF2. En cuarto
lugar, por estar dirigidos los tres componentes (el plásmido de
encapsidación, el vector y el plásmido de expresión de la envuelta)
por el mismo promotor, se puede mejorar la expresión sincronizada y
la formación eficaz de partículas. En quinto lugar, tal y como se ha
descrito anteriormente, la producción en células humanas es más
segura que la producción en células de felino para uso clínico,
debido a que las células de felino plantean el riesgo de introducir
agentes infecciosos conocidos o desconocidos en los seres
humanos.
El diseño de la estructura artificial incluye la
fusión del promotor de CMV y del genoma de VIF (desde la repetición
5' R) precisamente en la caja TATA. Primero, la PCR (las PCRs
sintéticas se realizaron con exonucleasa + polimerasa Vent) se
realizó con un cebador para PCR paralelo, con cola de SacI, homólogo
a los nucleótidos inmediatamente aguas debajo de la caja TATA de VIF
(5'-atataGAGCTCtgtgaaacttcgaggagtctc-3')
junto con un cebador para PCR antiparalelo
(5'-ccaatctcgcccctgtccattcccc-3')
homólogo a la cadena opuesta del gen gag de VIF. El producto
de la PCR generado tenía 450 pb. Este producto de la PCR se digirió
con XhoI antes de la digestión con sac I (debido a que hay un sitio
sac inmediatamente después del sitio XhoI en la LTR de VIF y sino se
generaría un fragmento SacI-SacI). Después de la
digestión con XhoI y la digestión posterior con SacI, el fragmento
resultante de 310 pb era:
Este fragmento se purificó en gel, lejos del
residuo de 140 pb y se clonó en el elemento principal
SacI-XhoI del plásmido pRc/CMV. Resumiendo, esta
etapa dispone las secuencias LTR de VIF aguas abajo de la caja TATA,
en un registro preciso para la caja TATA del promotor de CMV y para
la caja TATA de VIF sustituida: coloca un sitio SacI 3 nucleótidos
aguas abajo de la caja TATA justo donde hay un sitio SacI 3
nucléotidos aguas debajo de la caja TATA, justo donde se encuentra
un sitio SacI 3 nucleótidos aguas abajo de la caja TATA en el
promotor hCMV y coloca la repetición R de VIF precisamente 9 nt
aguas debajo de la caja TATA, justo como en el genoma de VIF. Por
ello la fusión conserva (y une) la separación entre los nucleótidos
del promotor CMV y de las secuencias transcripcionales de VIF y se
detalla en la secuencia a continuación:
CRF1 completaba la fusión en
5-prima del promotor CMV con la repetición R de VIF,
pero la LTR 3-prima y el resto del genoma de VIF
permanecían situados aguas abajo. Por tanto, se empleaban los
cebadores de PCR con cola de sal I, F3'S
(tatataGTCgactagggactgtttacgaac) y F3'A/Not
(atatatagtcgacGCGGCCGCtgcgaagttctcg) para amplificar la LTR 3' de
VIF: el producto de la PCR digerido con SalI se ligó en el sitio Xho
I compatible de CRF1 tratado con fosfatasa alcalina y la ligación se
inactivó térmicamente y se seleccionó frente al tipo silvestre con
Xho I. El plásmido resultante, denominado CRF(L), tiene ambas
LTRs y un único sitio NotI se sitúa en el extremo 3' de la LTR
3'.
A continuación, la región principal de
codificación del genoma de VIF se insertó mediante ligación del
fragmento de 8.845 nt BbeI-EspI de p34TF10 en el
elemento principal BbeI-EspI fosfatado de
CRF(L). El plásmido resultante se denominó CT5 (por promotor
CMV \rightarrow fusión en la caja TATA \rightarrow
genoma de VIF completo desde la repetición R hasta el extremo
provírico normal en el elemento U5 de la LTR 3'). CT5
codifica un VIF infeccioso de longitud completa que se dirige con el
promotor CMV en la primera ronda (en las rondas posteriores se
dirige con la LTR de VIF puesto que la transcriptasa inversa genera
un U3 de tipo silvestre en el extremo 5' del provirus). La
transfección de CT5 o de 34TF10 de tipo silvestre en células humanas
293-T daba como resultado niveles equivalentes de RT
en el material sobrenadante y en los sincitios expandidos en un
ensayo convencional para la replicación de VIF: formación de
sincitios sobre células de riñón de felino Crandall mantenidas con
suero al 0,5% (células CRFK) seguida de transferencia del material
sobrenadante filtrado a las células 293-T
transfectadas (véase también, Tozzini y col. (1992) Journal of
Virological Methods 37, 241-252). Sin embargo,
de forma idéntica al virus generado con 34TF10, el virus generado
con CT5 es completamente de tipo silvestre en su tropismo: no se
replica en células humanas. Esto se esperaba ya que el U3 tres prima
de CT5 es de tipo silvestre (los retrovirus portan su promotor en el
extremo tres prima del ARNm del virión: la transcripción inversa da
como resultado la colocación de una copia del U3 tres prima en el
extremo 5' del provirus integrado, en donde adquiere la capacidad de
promover rondas posteriores de transcripción en células
susceptibles). Resumiendo, VIF que es competente para la replicación
en células de felino, se produjo por transfección de CT5 en líneas
celulares adherentes, incluyendo las células 293T, probando que la
fase productora del ciclo vital se conseguía eficazmente, pero no la
replicación, en células humanas.
Aunque esté transfectado en células humanas o
felinas, CT5 genera VIF que es competente para la replicación en
células felinas pero no en las humanas: los transcritos víricos se
expresan con un promotor humano, pero no felino, en células
productoras, pero el U3 tres prima felino permanece intacto y la
fuente del promotor de U3 cinco prima en cualquier ronda posterior
de replicación es siempre el U3 tres prima del transcrito de la
célula productora. Este elemento U3 tres prima restante también se
puede delecionar.
Para generar vectores retrovíricos a partir de
modificaciones de CT5, se emplearon dos estrategias. Una realización
toma nota del hecho de que RRE de VIF está localizado tres prima de
las secuencias codificadoras en VIF (en el extremo de la proteína TM
más que en la unión de SU/TM como en otros lentivirus). Por ello, si
una casete génica informadora que tiene su señal p(A) de
poliadenilación, se sitúa con orientación antiparalela en
relación con las secuencias de VIF, la posición de RRE se conserva
potenciando el uso de las señales que actúan en cis y de
encapsidación. En una segunda realización, la RRE se retira de su
posición 3 prima normal y se sitúa mediante técnicas convencionales
de clonación, inmediatamente después de una parte del gen
gag/pol de VIF, permitiendo la protección de Rev del
transcrito del vector que contiene la secuencia gag y la
inserción de una casete génica informadora con orientación paralela,
aguas abajo. Las secuencias del gen gag se incluyen en estos
vectores porque se ha observado que potencian la encapsidación en
otros retrovirus. Sin embargo, en estos vectores, el gen gag
se desplaza en el marco de lectura por el cierre cohesivo de un
sitio Tth III 1, localizado en el nucleótido 298 de gag
(clonado por digestión con Tth III1, relleno mediado con la
polimerasa Klenow, ligación, inactivación de la ligasa y finalmente
selección con Tth III 1 frente al tipo silvestre) para evitar la
recombinación de gag funcional y evitar la generación de una
proteína Gag supresora de forma transdominante. Porciones
adicionales de gag detrás de este cambio del marco de lectura
o incluso que lo precedan, se pueden eliminar de los vectores sin
afectar a la titulación.
Se debe tener en cuenta que la transcripción de
estos vectores tiene lugar desde el promotor de CMV y no el promotor
de VIF. Se pueden emplear opcionalmente otros promotores. Además,
son posibles modificaciones múltiples, delecionando regiones
adicionales del genoma de VIF, p. ej., regiones de gag, tal y
como se detalla adelante.
Tales vectores se han descrito e ilustrado a
continuación:
1. Vector CTAGCgfsB. Las letras subrayadas
en las descripciones de la cápsula, tales como las que aquí se
encuentran entre paréntesis, indican la derivación del nombre del
vector (promotor CMV unido a la caja TATA que dirige
la expresión de una casete génica interna de información
CMV-GFP-p(A) en orientación
inversa y que tiene una mutación en el marco de lectura (del inglés,
frame shift) del gen gag y una inserción
posterior del sitio de unión del antígeno de sv40 T, para causar la
amplificación del plásmido después de la transfección en células que
expresan el antígeno SV40 T). CTAGCgfsB se construyó mediante
ligación en tres partes del fragmento pvuI-ecoR1 de
CT5, el fragmento EcoR1-Spe1 de un plásmido que
contiene el gen de la proteína fluorescente verde (GFP), pZcmvGFPpA,
y el fragmento SpeI-PvuI de CT5. Esta ligación
coloca la casete del promotor CMV-la señal
GFP-p(A) en orientación inversa entre EcoRI y
SpeI en el genoma de VIF. A continuación, el sito Tth III 1 en la
parte de gag/pol que permanece en el vector se corta, se
rellena con la polimerasa Klenow en presencia de dNTPs 200 \muM y
se cierra con la ligasa de ADN T4. Esto inserta con extremos romos
un residuo G extra que cambia el marco de lectura del fragmento
gag en unas pocas bases del sitio Tth III 1. No están
presentes secuencias pol. Por ello, el precursor de gag/pol
se tiene que entregar en trans desde CF1\Deltaenv o
de modificaciones posteriores de CF1\Deltaenv. Además, esta
etapa reduce la posibilidad de que se produzca la recombinación del
tipo silvestre y la posibilidad de que un fragmento de la proteína
Gag interfiera de forma transdominante. Finalmente, la casete
sv40-promotor-neoR de pRc/CMV se
insertó en el plásmido fuera de las secuencias del vector para
beneficiarse de la amplificación del plásmido dirigida por el
antigeno de Sv40 T y para permitir la selección con neoR, si es
necesaria. En una modificación, el codón de iniciación ATG del gen
gag se puede mutar un codón de detención. También la región
entre el sitio BsRG1 y los sitios aguas arriba de PstI, se
delecionan opcionalmente para eliminar más de gag.
2. Vector CTRZLb. (Promotor CMV
unido a la caja TATA que dirige la expresión que comienza con
la repetición R de una casete génica interna de información
de LacZ con orientación paralela y que tiene la LTR 3'
después de lacZ. También tiene una mutación con cambio del marco de
lectura del gen gag en el sitio Tth III 1 y una inserción
posterior del sitio de unión (del inglés, binding) al
antígeno de sv40 T, para causar la amplificación del plásmido
después de la transfección). Para construir este vector, se
delecionó CTAGCgfs entre EcoR1 y BsrG1 cortando con estas enzimas,
se trató con Klenow con dNTPs 200 \muM, se ligó con extremos romos
con ligasa T4 y se seleccionó frente al tipo silvestre con EcoR1. El
sitio BsrG1 se regeneró. El fragmento BsrgI-EcoNi de
pz-lacz se trató con Klenow y se colocaron extremos
romos en el único sitio EcoNI. La estructura era así: promotor CMV -
fusión de la caja TATA con la repetición R de VIF - U5 -
\Deltagag - elemento de respuesta Rev de VIF - promotor cmv
- gen LacZ - LTR. Finalmente la región promotor
sv40-promotor neoR procedente de pRc/CMV se insertó
en el plásmido aguas abajo del vector, para proporcionar un sitio
del unión del antígeno T para beneficiarse de la amplificación del
plásmido dirigida por el antígeno T de Sv40 y para permitir la
selección con neoR, si fuera necesaria. El codón de iniciación ATG
del gen gag se puede mutar en un codón de detención y se
pueden delecionar porciones adicionales de gag.
El material sobrenadante del vector generado por
el método de la cotransfección con fosfato cálcico, se tituló en
células humanas (HeLa, 293) y felinas (CRFK, Fc3Tg). Al comparar con
vectores retrovíricos convencionales basados en
(Mo-MuLV) del virus de la leucemia de múridos de
Moloney, los vectores de VIF eran igual de eficaces para transducir
células humanas y felinas. Se consiguieron títulos de 10^{7} en
las células de humanos y de felinos, después de una sola ronda de
concentración por ultracentrifugación. Títulos superiores se podían
conseguir con un refinamiento de la transfección y una posterior
ultracentrifugación. Además, las células humanas (HeLa) y felinas
(CRFK) se transducen de forma eficaz cuando se detiene el
crecimiento empleando 15 \mug/ml de afidicolina en el medio de
cultivo, añadidos 24 horas antes de la transducción y sustituidos
diariamente mediante tinción con lacZ. Los títulos de lacZ con el
vector de VIF en células detenidas con afidicolina, era
80-90% de los de las células en división, mientras
que se eliminaba la transducción de vectores Mo-MuLV
mediante el tratamiento con afidicolina. Estos resultados indican
que el vector de VIF puede transducir células humanas y que tiene
claramente propiedades biológicas específicas de lentivirus que
faltan en los vectores retrovíricos convencionales (p. ej.,
múridos): la capacidad de transducir células que no se dividen. De
forma importante, no detectamos una preferencia de los vectores de
VIF por las células de felinos: la transducción relativa de diversas
células humanas y felinas era específica de la célula y no
específica del vector. En otras palabras, las células en las que era
eficaz la transducción con el vector de VIF, también se transducían
de forma eficaz con vectores del virus de la leucemia de múridos de
Moloney convencionales, y viceversa.
La invención es aplicable a la terapia génica en
humanos. Tal y como se ha detallado anteriormente, estos vectores
retrovíricos tienen ventajas en seguridad sobre los vectores de
lentivirus basados en el VIH, porque los vectores de VIH se obtienen
a partir de agentes patógenos humanos letales. Puesto que los
vectores de VIF se pueden manipular con las medidas de seguridad de
nivel BL-2, los riesgos a los que se expone el
personal implicado en su producción son menores, comparados con los
vectores de VIH, y se mejora la facilidad y la comodidad de la
producción. Estos vectores tienen ventajas sobre otros métodos para
entregar genes si se desea una transferencia estable de genes a
células que no se dividen o que se dividen poco frecuentemente.
Tales células incluyen, pero no están limitadas a las células del
sistema nervioso humano, del ojo, del sistema hematopoyético, del
tegumento, del sistema endocrino, del sistema hepatobiliar, del
tracto gastrointestinal, del tracto genitourinario, del hueso, del
músculo, del sistema cardiovascular y del sistema respiratorio.
Estos vectores también evitan la exposición de pacientes a células
no humanas y evitan la exposición a genes de lentivirus o a
proteínas de lentivirus obtenidas a partir de agentes patógenos
conocidos.
Los vectores de lentivirus basados en VIH
transducen de forma eficaz las células que no se dividen pero son
problemáticos por obtenerse a partir de agentes patógenos letales
para humanos. Sin embargo, el uso de los lentivirus de no primate
era complicado por una falta relativa de información sobre sus
propiedades moleculares, particularmente su adaptabilidad a las
células humanas. Este ejemplo describe los mecanismos infectivos
productores y post-receptores del ciclo vital de VIF
en células humanas y muestra que las funciones necesarias para la
transducción del vector de lentivirus pueden tener lugar con alta
eficacia. Se realizó la sustitución del promotor de VIF que funciona
débilmente en células de no felinos. Un sistema de vector de VIF con
promotor completamente heterólogo y seudotipificado con env,
mostraba un alto nivel de expresión celular en humanos y el
procesamiento de las proteínas de VIF en trans y producía
vectores retrovíricos de VIF que transducían células humanas que se
dividen, detenidas en el crecimiento y
post-mitóticas (macrófagos y neuronas hNT) con una
titulación alta. El sistema elimina los riesgos en seguridad de las
células productoras de felinos. Se observó una citopaticidad grave
de las proteínas de la envuelta de VIF con promotor heterólogo en
células humanas y los vectores de la invención se utilizaron para
investigar este fenómeno. La expresión del genoma de VIF con el
promotor de citomegalovirus humano inducía sincitios profusos,
específicos de Env en una amplia variedad de células humanas pero no
en células de roedores. Además, esta actividad fusogénica requería
la coexpresión de CXCR4, el co-receptor para las
cepas que inducen sincitios de VIH. Sin embargo, a pesar de su
dependencia de CXCR4, la inducción de sincitios Env VIF en células
no hospedadoras era disociable de la entrada del virus: la expresión
de CXCR4 en células de no felinos permitía la fusión de células
específicas para Env de VIF pero no la transducción del vector
mediado con Env de VIF ni la replicación vírica. Siendo compatible
con el papel de un correceptor, la expresión de CXCR4 humana en
células de felinos, cambiaba el fenotipo vírico de no citopático a
altamente citopático e incrementaba la infectividad vírica y la
transducción con vectores de la envuelta de VIF. El uso de CXCR4 en
lentivirus evolucionalmente distantes, implica un papel fundamental
para este receptor de quimioquinas en la replicación de los
lentivirus y la citopaticidad. Los resultados tienen implicaciones
para la biología comparativa de lentivirus, así como para la terapia
génica en humanos.
Se empleó un clon molecular defectuoso en
ORF-2 (FIV 34TF10)19 de la cepa Petaluma
(Fig. 1). En la parte superior de la Fig. 1, se muestran FIV 34TF10
y el plásmido CF1. Las modificaciones adicionales de CF1 empleadas
en este estudio se muestran y se describen debajo del dibujo de FIV
34TF10. Para generar CF1, se ligaron con extremos romos el fragmento
SacI-Esp1 de 34TF10 entre NotI y XbaI en el
polienlazador del plásmido de expresión con el promotor hCMVIE,
pRc/CMV (Invitrogen). La fusión del promotor hCMVIE con el genoma de
VIF entre la caja TATA (obtenida de CMVIEp) y el inicio de la
repetición R (obtenida de VIF) se realizó y se muestra para el
plásmido CT5 (unión en el sitio Sac1). La fusión generada con PCR
dispone las secuencias de la repetición R de VIF aguas abajo de la
caja TATA de CMV, en el registro preciso para la caja TATA de VIF
sustituida; esta también dirige la expresión de los vectores (abajo)
que carecen todos de las secuencias vif, ORF2, pol y
env. La casete génica del marcador está en la orientación
paralela para lacZ y con orientación antiparalela para GFP, con una
señal adicional de poli(A). Se introdujo un cambio del marco
de lectura en los vectores en el nt 298 del fragmento restante de
gag. Para generar el vector seudotipificado, el plásmido de
expresión de VSV-G, pHCMV-G 42 (no
ilustrado) se cotransfectó en células 293T con CF1\Deltaenv
y se mostraron los vectores. Los detalles adicionales de la
clonación se encuentran en el
\hbox{Ejemplo 1.}
34TF10 infecta productivamente células de riñón
felino Crandall (células CRFK) pero no infecta los linfocitos de
sangre periférica de felinos o los macrófagos primarios de felinos
(Carpenter & O'Brien (1995) Current Opinion in Genetics and
Development 5, 739-745; Waters y col. (1996)
Virology 215, 10-16; Sparger y col. (1994)
Virology 205, 546-553; Bandecchi y col.
(1995) New Microbiologica 18, 241-252;
Tozzini y col. (1992) Journal of Virological Methods 37,
241-252 (1992); Olmsted y col. (1989) Proceedings
of the National Academy of Sciences of the United States of
America 86, 2448-2452). Este tropismo
restringido cartografía la mutación de ORF2, no env:
reparación de ORF2, un transactivador putativo de LTR, que da como
resultado una infección productiva con 34TF10 de todos estos tipos
de células de felino 36. La envuelta de 34TF10 se debe considerar,
por tanto, por analogía débil con VIH, que tiene "tropismo
dual", sin embargo no se ha establecido la clasificación de
adaptación a lab/primario frente a
T-trópico/macrofagotrópico para cepas o clones de
VIF. De hecho, aunque es característica la depleción de CD4 que
conduce al SIDA, VIF también infecta células T CD8+ y células B, así
como células T CD4+ en felinos infectados (Pedersen (1993) véase
arriba). Ni 34TF10 ni ninguna otra cepa o clon de gato doméstico,
son citolíticos en células CRFK; se pueden detectar pequeñas células
gigantes multinucleadas (4-12 núcleos) en un cultivo
infectado al máximo, pero no tiene lugar una muerte celular intensa
(Barr y col. (1995) véase arriba; Tozzini y col. (1992)
Journal of Virological Methods 37, 241-252; Barr
(1997) Virology 228, 84-91). 34TF10 no causa
una viremia o enfermedad significativa en gatos domésticos
infectados experimentalmente; el fenotipo in vivo de los
clones con ORF2 reparado todavía no se conoce (Sparger y col. (1994)
Virology 205, 546-553).
Tal y como se muestra en el diagrama de la Fig.
1, el promotor génico temprano inmediato del citomegalovirus humano
(hCMVIEp) se dispuso (a) para sustituir todas las LTR de FIV con una
unión 97 nt aguas arriba del donante principal de corte y empalme 5'
de VIF (en el plásmido CF1) o (b) para sustituir selectivamente los
elementos del promotor U3 de VIF (en el plásmido CT5 y en los
vectores de VIF) mediante una fusión en la posición \sim 14, entre
la caja TATA y el inicio de la transcripción, es decir, la
repetición R. La disposición sitúa la caja TATA de CMV en el
registro preciso para sustituir a la caja TATA de VIF en relación
con el inicio de la transcripción (posición \sim27). CF1 carece de
ambas LTRs, excepto la porción de 89 nt de la U3 tres prima que
solapa el ORF de rev (VIF no tiene un homólogo de nef de VIH),
delecionando de este modo las secuencias que actúan en cis
necesarias para la replicación y la integración (secuencias del
promotor U3, sitio de unión al cebador de ARNt, repeticiones R,
elementos U5). Véase también, el Ejemplo 1 para detalles de la
clonación de las estructuras artificiales descritas en este ejemplo.
CF1\Deltaenv tiene una deleción adicional de 875 nt en
env que engloba la unión SU-TM y que también
cambia el marco de lectura: este plásmido, que se empleó para
encapsidar vectores seudotipificados es por tanto defectuoso para
ORF-2, env y los elementos retrovíricos
mencionados que actúan en cis. CT5 por el contrario, codifica
34TF10 completamente de tipo silvestre y competente para la
replicación. El sistema elimina de este modo la necesidad de un
promotor de felinos. La función de ORF2 no se ha definido de forma
concluyente, pero la actividad transactivadora de LTR de VIF
descrita para el producto génico 36 sería por ello también
prescindible.
La transfección de CF1 o de CT5 pero no de 34TF10
en células humanas daba como resultado la formación explosiva de
sincitios, en 12-18 horas. Las monocapas de células
HeLa y de células de riñón embrionario humano 293 se destruían en
90-95% con reproducibilidad por lisis sincitial al
cabo de 48-60 horas de la transfección de CF1 o de
CT5 (Fig. 1). Los tres plásmidos producían siempre muchos menos
sincitios (400 veces), más pequeños (4-12 núcleos) y
no había una citolisis discernible en las células CRFK.
Las transfecciones eran con precipitación con
fosfato cálcico, excepto para las células U87MG y U87MG.CXCR4 que se
habían electroporado. En todos los casos, las células transfectadas
en este estudio se compararon mediante un ensayo cuantitativo de
enfoque sincitial, empleando células transfectadas simultáneamente
con el mismo precipitado de fosfato cálcico. Las células se tiñeron
con violeta de cristal o, para los ensayos de infectividad focal,
con tinción con inmunoperoxidasa con sueros de Petaluma de VIF y un
anticuerpo secundario de cabra conjugado con peroxidasa de rábano
picante para IgG41 de felinos. Todas las comparaciones se
controlaban por cotransfección de un GFP con promotor hCMVIE o un
plásmido informador de LacZ como 10% de entrada de ADN; sólo se
describen los experimentos con eficacias de la transfección que
variaban < de 5% entre las líneas celulares comparadas. Cuando la
lisis se ampliaba a 24 horas para CF1, la eficacia comparativa de la
transfección se sometió a ensayo, mediante GFP en pocillos paralelos
en presencia de una dilución 1:300 del plasma de gato doméstico
infectado con VIF, para inhibir la formación de sincitios. Todas las
células eran líneas ATCC multiplicadas en suero bovino al 10% con
antibióticos; las células CRFK se hacían crecer en medio L50 tal y
como se ha descrito. La ATCC de CRFK es ATCC CL94.
Siendo compatible con estudios previos (Barr y
col. (1995) Journal of Virology 69,
7371-7374), la transfección de 34TF10 y CT5 en
células CRFK (ATCC CCL 94) establecía una infección permanente con
altos niveles de RT (> 5 x 10^{5} cpm/ml) por día
7-14, pero con un efecto citopático mínimo
(6-12 +/- 4 sincitios, 4-8 núcleos
cada uno, por pocillo de 9,6 cm^{2} de una placa de seis
pocillos). Sin embargo, tal y como se esperaba, CF1 no producía
virus infeccioso: el paso de material sobrenadante filtrado desde
células humanas o felinas transfectadas con CF1 a 10^{7} células
CRFK o a 10^{7} células humanas (HeLa, 293, H9, Molt4, supT1,
U937) no producía sincitios o la producción de RT; las líneas
celulares adherentes también eran negativas según un ensayo de la
infectividad focal descrito previamente (FIA) (Remington y col.
(1991) Journal of Virology 65, 308-312),
sensible a <5 unidades infecciosas por ml en células CRFK
infectadas con 34TF10 o CT5. Aunque se produjera en células humanas
o CRFK, VIF generado con p34TF10 o con CT5 no se replicaba en
células humanas. Sin embargo, los sincitios producidos por la
transfección de CF1 y CT5 en células humanas y felinas se producían
específicamente por la proteína de la envuelta de VIF, puesto que la
transfección de CF1\Deltaenv no producía nunca sincitios en
ninguna célula, pero se obtenían altos niveles comparativamente de
RT.
La transcriptasa inversa dependiente de Mg2+ se
midió tal y como se ha descrito previamente (Willey y col. (1988)
Journal of Virology 62, 139-147) 52 horas
después de la transfección de los plásmidos indicados en las células
CRFK, HeLa, 293 y 293T. La lisis intensa de los sincitios se observó
en las células transfectadas con CT5, CF1, CF1\Deltapol y
pHCMV-G. Los dos últimos plásmidos se incluyeron
como testigos de la lisis celular para verificar la especificidad
vírica. El material sobrenadante de células H9 infectadas 2 semanas
antes con VIH-1 y VIH-2 con m.o.i de
1,0, también se sometieron a ensayo para comparar. En la Fig. 2,
cada punto es la media de mediciones por triplicado \pm la
S.E.
Se realizó la radioinmunoprecipitación de las
células transfectadas con plasma de gato doméstico infectado con VIF
(cepa Petaluma). Las células 293, HeLa y CRFK se transfectaron con
los plásmidos indicados mediante precipitación con fosfato cálcico,
en frascos de 25 cm^{2}. Al cabo de 27 horas (células 293) o 48
horas (células HeLa o CRFK) de la transfección, las células se
radiomarcaron durante cinco horas con
^{35}S-cisteína y
^{35}S-metionina en medio exento de cisteína y de
metionina, con 7,5% de suero bovino fetal dializado después de una
hora de preincubación en este medio sin isótopos. Los materiales
lisados se lavaron previamente con suero de gato normal y Sepharose
A proteica, se incubaron durante una noche con 10 \mul de plasma
de gato infectado con VIF, se precipitaron con Sepharose A proteica
y se sometieron a electroforesis con marcadores teñidos previamente
en 10 o 12,5% de geles de SDS-poliacrilamida. El
material lisado se obtenía a partir de aproximadamente
15-25% de la cantidad de células en otras pistas,
debido a la pérdida de células por la lisis intensa de sincitios. El
panel B muestra la inhibición de sincitios inducidos con CF1 en
células 293T y HeLa mediante plasma de gatos domésticos infectados
con VIF. Los sincitios se puntuaron a las 48 horas como focos con
\geq8 núcleos mediante tinción con violeta de cristal de las
células fijadas con metanol. Las diluciones de los plasmas VIF +
(cuadrados, círculos) o VIF + (rombos, triángulos) se añadieron a
las células en el momento de la transfección en placas de 12
pocillos y con un nuevo cambio del medio 14 horas después.
Los sincitios en las células humanas
transfectadas con CF1 se suprimían de forma intensa con el plasma de
gato doméstico infectado con la cepa Petamula de VIF, con un 50% de
inhibición en células 293T y HeLa diluidas 1:32.000 veces y diluidas
1:12.700 veces, respectivamente, aunque el plasma de gato doméstico
preinmunizado no tenía efecto sobre la formación de sincitios con
ninguna dilución, incluso de 1:10 (Fig. 2B). Además, la inducción de
sincitios se suprimía con una pequeña deleción de 539 nt (nt
7322-7861), que no cambiaba el marco de lectura,
confinada en la parte SU de env (prescindiendo del dominio TM
y del sitio de corte proteolítico aguas arriba, véase CF1\DeltaSU
en la Fig. 1) sugiriendo que ambos dominios SU y TM de la envuelta
son necesarios para la inducción de sincitios. La eficacia de la
transfección determinada por una cotransfección informadora con GFP
en pocillos paralelos, en presencia de antisuero diluido 1:300 para
los experimentos, era \leq10%, mostrando que la lisis sincitial
estaba mediada por la fusión de células no transfectadas con células
transfectadas.
La expresión en células humanas se examinó
entonces adicionalmente mediante ensayos de la transcriptasa inversa
(RT) y mediante la inmunoprecipitación de células radiomarcadas con
plasma de gatos domésticos infectados con VIF. Las estructuras
artificiales con el promotor hCMVIE expresaban altos niveles de RT
dependiente de Mg 2+ en células humanas (HeLa, 293, 293T) y también
eran superiores a la LTR natural de p34TF10 en células felinas
(CRFK) y humanas (Fig. 2A). Por el contrario, la expresión de RT
dirigida por LTR en células 34TF110 en células humanas era mínima;
la expresión proteica en las estructuras artificiales quiméricas
hCMVIEp también excedía a la expresión de 34TF10 en células de
felino, en aproximadamente seis veces. Un mutante con deleción en
pol (CF1\Deltapol) no producía RT (Fig. 2A) pero producía
sincitios con la misma intensidad que CF1.
La inmunoprecipitación de las células
transfectadas y radiomarcadas humanas y de felinos mostraba un
patrón de expresión de 34TF10 de tipo silvestre para CF1 o CT5 en
células humanas, con cantidades correspondientes a los ensayos de
RT. La expresión de p34TF10 se detectaba sin embargo claramente por
RIPA en células HeLa pero con niveles considerablemente menores que
en las quimeras CMVIEp y no era detectable (incluso después de una
exposición prolongada de la película) en células 293 o 293T. Es
compatible con este resultado, que los sincitios pequeños
(4-6 núcleos, 11-14 sincitios \pm
4, n = 4, por pocillo en placas de seis pocillos) eran detectables
en células HeLa, 48 horas después de la transfección con p34TF10. La
deleción de SU que mantiene el marco de lectura en CF1\DeltaSU,
daba como resultado el precursor pronosticado truncado de la
envuelta, una mancha de poca resolución que corre con el producto
del corte acortado de SU/gp100. En el plasma utilizado no
precipitaba la proteína TM de ninguna célula. Los otros dos mutantes
env anulaban la producción de Env inmunoprecipitable y ningún
mutante de la envuelta formaba sincitios en ninguna célula. Siendo
compatible con los datos de RT, la expresión de CF1 era también
superior a la expresión dirigida por LTR en células CRFK.
En conjunto, estos datos muestran que altos
niveles de expresión del repertorio genómico completo de un
lentivirus de no primate, tiene lugar en células humanas y que la
sustitución del promotor permite la fase productora de la
replicación de VIF (que incluye el eje regulador Rev/RRE, el corte y
empalme, la producción de los precursores de Gag/Pol y Env y el
correcto procesamiento proteolítico de cada uno) que tiene lugar con
una eficacia máxima en las células humanas y con niveles más
elevados que los observados con el promotor natural o el promotor
CMVIE en las células CRFK. La sustitución selectiva de U3 (en CT5 y
para uso en vectores descritos a continuación) y la sustitución
completa de LTR (para la producción de proteínas en trans)
eran ambas eficaces.
Para examinar las fases posteriores a la entrada
del ciclo vital de VIF en las células humanas, se empleó CT5 como el
punto de partida para construir vectores retrovíricos que contienen
casetes génicas de marcador con promotor interno que sustituyen
pol, env y los genes accesorios, así como una parte de
gag. Se introdujo una mutación por cambio del marco de
lectura en todos los vectores en el nt 298 del ORF de gag
restante por cierre de los extremos romos de un sitio Tth III 1,
generando un codón de detención en el nt 319 (Fig. 1). El vector
CTRZLb se cotransfectó con CF1\Deltaenv y el plásmido de
expresión de VSV-G, pHCMV-G, en
células 293T mediante coprecipitación con fosfato cálcico. De
48-96 horas después de la transfección, el material
sobrenadante del vector VIF y de un vector testigo LacZ
Mu-MLV, seudotipificado con VSV-G,
se lavó, se filtró (0,45 \muM), se tituló sobre células HeLa y a
continuación se tituló de nuevo por dilución limitante sobre un
panel de líneas celulares humanas y de felino; los experimentos se
realizaron con células que estaban en crecimiento o detenidas en
G1/S con 20 \mug/ml de afidicolina. Se consiguieron títulos altos
(10^{6}), equivalentes a los de un vector retrovírico de virus de
la leucemia de múridos de Moloney convencional, con una sola ronda
de concentración (Burns y col. (1993) Proceedings of the National
Academy of Sciences of the United States of America 90,
8033-8037) por ultracentrifugación. De forma similar
a los vectores de VIH, el vector de VIF estaba mínimamente afectado
por la detención del ciclo celular, aunque se había eliminado la
transducción del vector Mu-MLF, demostrando de este
modo esta propiedad específica de lentivirus del vector de VIF y la
capacidad de transferencia de esta propiedad a las células de
humanos. Con igual de importancia, cuando se comparaba en células en
crecimiento el vector lacZ del virus de la leucemia de múridos de
Moloney seudotipificado con VSV-G, el vector de VIF
no mostraba una preferencia significativa hacia las células de
felino (comparar porcentajes de titulación, véase la representación
gráfica inserta). Cuando se permitía la proliferación después de la
transducción con CTRZLb, se generaban homogéneamente colonias
grandes (100-400 células), positivas para lacZ, lo
que indicaba un mantenimiento estable del clon del transgen. Aunque
las líneas celulares variaban considerablemente en su capacidad de
transducción, tal y como se esperaba, estas diferencias eran
equivalentes en los vectores de VIF y de Moloney: es decir, eran más
específicas de las células que específicas del vector y reflejan la
susceptibilidad a una transducción mediada con
VSV-G. Por tanto se muestra que el bloqueo clave del
estado infectivo del ciclo vital de VIF en células de no felinos,
está a nivel de la entrada del virión más que posteriormente.
Para determinar adicionalmente la capacidad de
los vectores de VIF para transducir células humanas que no se
dividen, transdujimos células humanas postmitóticas, empleando los
dos modelos más desarrollados de cultivo tisular humano definitivo:
macrófagos humanos primarios y neuronas hNT. Las neuronas hNT se
diferencian de forma irreversible, se polarizan las neuronas humanas
obtenidas a partir de células de teratocarcinoma NT2 mediante un
proceso de seis semanas, empleando ácido retinoico y diversos
inhibidores mitóticos. Las células hNT cambiadas de placa por
tercera vez, empleadas en este experimento, que son
irreversiblemente post-mitóticas, permaneciendo de
este modo un año después del transplante a los cerebros de ratones
inmunosuprimidos, pareciéndose morfológicamente a neuronas
primarias, expresan una variedad de marcadores específicos de
neuronas y crecen en racimos de neuronas que elaboran axones
funcionales y dendritas. Las nNT neuronas transducidas con una
m.o.i. de 1,0, mostraban que la tinción de lacZ era visible en los
cuerpos celulares y en los procesos. Los macrófagos primarios
humanos mostraban un amplio fondo de tinción de lacZ y se
transdujeron por ello con el vector de GFP, CTAGCb, el noveno día
después del aislamiento de la sangre periférica de donantes
normales. Estas células se transdujeron con un alto título con el
vector de VIF pero no con un vector de Mu-MLV con
transducción de GFP.
Los determinantes de la encapsidación de VIF no
han tenido un estudio previo, Las señales de la encapsidación de
lentivirus son más complejas que las de los oncovirinae de
múridos (Lever, (1996) Gene Therapy 3,
470-471). Las LTRs se delecionaron en
CF1\Deltaenv para evitar una encapsidación y se eliminaron
las secuencias necesarias para la transcripción inversa y la
integración; los 20 nucleótidos entre el donante principal de corte
y empalme y el gen gag, una contribución putativa a la
encapsidación de lentivirus, es extraordinariamente corta en VIF (20
nt comparados con los 44 nt en VIH-175 nt en
VIH-2 y 375 nt en Mu-MLV). La
encriptación y la deleción de esta región puede mejorar el
título.
Para someter a ensayo si las secuencias
codificadoras de genes estructurales de VIF se transferían a las
células diana por transducción con el vector encapsidado de CF1, se
transdujeron 10^{6} células de CRFK con una m.o.i. = 10 con el
vector CTRZLb sometido a ADNasa, consiguiendo 99% de transducción.
Un \mug de ADN genómico procedente de estas células, era negativo
en la PCR para las secuencias gag, mientras que la
amplificación simultánea de la misma cantidad de este ADN espigado
con ADN genómico procedente de sólo 10 células de un cultivo de CRFK
infectado crónicamente con 34TF10, era positiva.
Se obtenía una citopaticidad grave cuando era
posible la expresión de la envuelta de VIF en células humanas.
Debido al reciente descubrimiento de CXCR4 como correceptor de cepas
de VIH que inducen sincitios, estas observaciones plantean
cuestiones inmediatas sobre el mecanismo específico. El receptor
primario de VIF sigue siendo desconocido. Puesto que la mayoría de
las líneas celulares humanas, incluyendo las células HeLa y 293,
expresan niveles apreciables de CXCR4, a continuación empleamos las
líneas celulares humanas raras, conocidas por no expresar CXCR4 (las
células U87MG y SK-N-MC) o niveles
extremadamente bajos de CXCR4 (células HOS) Berson y col. (1996)
Journal of Virology 70, 6288-6295; Endres y
col. (1996) Cell 87, 745-756; Harouse &
González-Scarano (1996) Journal of Virology
70, 7290-7294). La transfección de CF1 o CT5 en
células U87MG y SK-N-MC (mediante
electroporación o coprecipitación con fosfato cálcico) nunca daba
como resultado la formación de sincitios (n = 9 para cada línea,
eficacias de la transfección \geq10% con cotransfección
informadora con GFP). Además, aunque las células 208F de rata
transfectadas con CF1 se fusionaban fácilmente con una variedad de
líneas celulares humanas y con células CRFK, la fusión no tenía
lugar con células SK-N-MC o U87MG.
Además, la transfección de otras células de roedores (NIH 3T3, CHO)
no producía sincitios (n = 8, eficacias \geq10% con cotransfección
con GFP).
Por tanto construimos un vector retrovírico a
base de MMLV, pZ.CXCR4, que expresa CXCR4 humano y neoR a partir de
un ARNm bicistrónico y lo empleamos para generar un panel de líneas
celulares seleccionadas con G418, U87MG, HOS,
SK-N-MC, NIH3T3 y CRFK que
expresaban CXCR4 humano. Las líneas testigos seleccionadas con G418
se generaron con el vector retrovírico parental, pJZ30854. La
expresión de CXCR4 estaba documentada en todas las líneas
transducidas con pZ.CXCR4. La transfección de CF1 o CT5 en
U87MG.CXCR4, SK-N-MC.CXCR4,
3T3.CXCR4 pero no la transfección simultánea en las líneas testigos
respectivas (n = 8 para CF1, n = 6 para CT5), producía sincitios
exuberantes. Además, aunque en las células HOS transfectadas con CF1
se podían observar pequeños sincitios de 4-8
células, en las células HOS.CXCR4 transfectadas con CF1 se producían
células gigantes multinucleadas de forma masiva que contenían varios
cientos de núcleos. Para confirmar estos resultados, también
realizamos estudios de mezclas de células felinas/humanas con
células 3201-FIV (células de linfoma de gato felino
infectadas crónicamente con VIF, ATCC CRL 10909). Las células U87MG,
SK-N-MC, HOS, 3T3, sus líneas
duplicadas seleccionadas con el vector pZ.CXCR4 y las células HeLa
se extendieron en placas (3 x 10^{5} células) en placas de seis
pocillos. Al día siguiente se añadieron 10^{5} células
3201-FIV a cada pocillo. Después de 18 h, se
observaron grandes sincitios en forma de balón (que incluían
30-80% de la monocapa) de las células HeLa y cada
línea que expresaba CXCR4; en las células U87MG,
SK-N-MC, HOS o 3T3 no se observó
ningún sincitio en ningún momento.
La transducción de Env de VIF se examinó a
continuación empleando la cotransfección de CF1 y CTRZLb en células
293T. Tal y como se muestra en la Tabla 1, este vector era incapaz
de transducirse en ninguna línea humana, sin tener en cuenta la
expresión de CXCR4; la transducción se podía detectar en células
CRFK pero con un título bajo (< 10 unidades de transducción/ml).
Las células CRFK.CXCR4 por el contrario, se podían transducir al
menos con un título superior en 2 logaritmos (3,6 x 102) que las
CRFK. Además, el ligando para CXCR4 inhibía la transducción del
vector a través de la envuelta de VIF.
Puesto que los datos del vector indicaban que
CXCR4 aumentaba la entrada de virus en células de felinos, así como
una fusogénesis más amplia, a continuación comparamos la
infectividad de VIF competente para la replicación sobre células
CRFK y sobre células CRFK.CXCR4. Cada línea se sembró en placas de
48 pocillos, con 10^{4} células por pocillo y se infectaron el día
siguiente con diluciones en series de cuatro de unas reservas de
virus 34TF10 producido en células CRFK. Para reducir la pérdida por
artefactos del título de la citopaticidad marcada de 34TF10 en
células CRFK.CXCR4, las placas se fijaron y se examinaron 40 horas
después de la infección con un ensayo de la infectividad focal
(empleando una dilución 1:500 de los sueros VIF positivos y un
anticuerpo de IgG anti-felino conjugado
secundariamente con peroxidasa de rábano picante) sensible a 1
célula en 10^{6} células infectadas (véase también, Remington y
col. (1991) Journal of Virology 65, 308-312 y
Chesebro & Wehrly (1988) Journal of Virology 62,
3779-3788). 34TF10 era ocho veces más infeccioso
sobre CRFK.CXCR4 que sobre CRFK ( p = 0,0002). Consideramos ésto un
mínimo estimado de proporción de infectividad, puesto que numerosas
células flotantes redondeadas o poco adheridas, teñidas por el
método IFA, estaban presentes en los pocillos de CRFK.CXCR4
infectados, ya a las 40 horas (pero no en los pocillos testigos no
infectados o los pocillos infectados con CRFK) y no se contaron.
Para confirmar estos resultados, se realizó una titulación con
dilución limitante de 34TF10 sobre las dos líneas celulares,
infectando como se ha descrito anteriormente: las células que se
separaban en intervalos de cuatro-cinco días durante
tres semanas, y los pocillos positivos fueron identificados en el
ensayo de RT.
Reuniendo estos resultados, se observa que la
actividad fusogénica y la entrada vírica de lentivirus de primates
relacionados remotamente y de no primates está mediada por la misma
molécula de la superficie celular. Esta amplia utilización de CXCR4
en un lentivirus de no primate que no utiliza CD4 con receptor
primario, implica un papel fundamental de CXCR4 en la génesis de
sincitios en lentivirus y en la patogénesis del SIDA. Nuestros
experimentos no excluyen que el bajo nivel de infección mediada por
la envuelta de células humanas tenga lugar, quizás sólo debido a
CXCR4, tal y como se ha descrito para algunos materiales aislados de
VIH-1 y VIH-2 (Endres y col. (1996)
Cell 87, 745-756; Harouse &
González-Scarano (1996) Journal of Virology
70, 7290-7294; McKnight y col. (1994)
Virology 201, 8-18; Reeves y col. (1997)
Virology 231, 130-134; Potempa y col. (1997)
Journal of Virology 71, 4419-4424; Harouse y
col. (1995) Journal of Virology 69,
7383-7390; Talbot y col. (1995) Journal of
Virology 69, 3399-3406; Tateno y col. (1989)
Proceedings of the National Academy of Sciences of the United
States of America 86, 4287-4290 (1989), Clapham
y col. (1992) Journal of Virology 66,
3531-3537) sino que indican que, en la mayoría de
estos ejemplos, dicho proceso es ineficaz. De forma similar, también
los conejos se pueden infectar con VIH-1, pero el
proceso es bastante ineficaz (Gardner & Luciw (1989) Faseb
Journal 3, 2593-2606). Nuestros datos son
compatibles con la existencia de un receptor primario de VIF. Además
de los datos de los vectores, por ejemplo, las células HeLa no
mantienen una replicación productiva de VIF sino que eran fácilmente
transducibles con los seudotipos VSV-G, expresaban
CXCR4 abundante, mostraban una citopaticidad específica de Env
intensa, mostraban niveles bajos pero significativos de expresión
dirigida con LTR de VIF, permitían el procesamiento normal de
proteínas víricas y generaban VIF competentes para la replicación a
partir de un plásmido CT5.
Los resultados por ello tienen implicaciones
importantes para la biología de lentivirus y para la terapia génica
en humanos. Al mostrar que un lentivirus de no primate también
utiliza CXCR-4 para la fusión celular y para la
entrada vírica, nuestros datos muestran que este receptor de
quimioquinas tiene un papel fundamental en la replicación del
lentivirus, en la génesis de sincitios y quizás en la patogénesis.
También es probable que la replicación in vivo de VIF tenga
otros requerimientos más sutiles. Los vectores de VIF por tanto,
representan una alternativa inherentemente segura a los vectores de
VIH. El apoyo epidemiológico para esta hipótesis es mayor para VIF
que para cualquiera de los otros lentivirus de no primates, porque
VIF ha mostrado que no tiene capacidad de infección o de causar
enfermedad en humanos después de la inoculación natural en muchos
seres humanos a lo largo de muchos años, mediante la principal vía
infectiva, operativa en los gatos (mordeduras). Adicionalmente,
además de U3, ORF2 y env, son posibles deleciones adicionales
de secuencias de VIF en ambos vectores y en plásmidos de
encapsidación. Los vectores de VIF son más fáciles de producir
logísticamente puesto que el VIF infeccioso se propaga de forma
rutinaria en cultivo de tejidos con nivel de Bioseguridad 2 (los
vectores de esta memoria han sido aprobados para uso con
BL-2 por el Comité de Bioseguridad Institucional de
UC San Diego).
Claims (33)
1. Un vector de ácido nucleico que comprende un
sitio de encapsidación de VIF y una LTR 5' de VIF, en donde la
región U3 de la LTR 5' está sustituida por una secuencia de control
de la expresión que actúa en células humanas; y en donde dicho
vector de ácido nucleico es incapaz de producir al menos una
proteína vírica necesaria para encapsidar dicho vector en una
partícula vírica en el contexto de una célula.
2. El vector de ácido nucleico según la
reivindicación 1, que comprende un ácido nucleico heterólogo ligado
funcionalmente a una secuencia de control de la expresión que actúa
en células humanas.
3. El vector de ácido nucleico según la
reivindicación 2, en donde el ácido nucleico heterólogo codifica una
proteína.
4. El vector de ácido nucleico según la
reivindicación 2, en donde el ácido nucleico heterólogo codifica un
inhibidor vírico.
5. El vector de ácido nucleico según la
reivindicación 4, en donde el inhibidor vírico se selecciona entre
el grupo consistente en ácido nucleico antiparalelo, ribozima, ácido
nucleico señuelo y ácido nucleico transdominante.
6. El vector de ácido nucleico según la
reivindicación 2, en donde el ácido nucleico heterólogo codifica un
componente de VIH.
7. El vector de ácido nucleico según una
cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6, en donde la secuencia de
control de la expresión se selecciona entre el grupo consistente en
la secuencia del promotor de CMV, la secuencia del promotor de VIH,
la secuencia del promotor de LTR de VIH, la secuencia del promotor
de SV-40, la secuencia del promotor de pol II y la
secuencia del promotor de pol III.
8. El vector de ácido nucleico según la
reivindicación 7, en donde la secuencia de control de la expresión
es una secuencia del promotor de CMV.
9. El vector de ácido nucleico según la
reivindicación 1, que comprende la región R y la región U5 de la LTR
5'.
10. El vector de ácido nucleico según la
reivindicación 1, que comprende una LTR 3' de VIF y en donde la
región U3 de la LTR 3' o una parte de la misma está delecionada.
11. Una partícula vírica, que comprende el vector
de ácido nucleico de la reivindicación 1.
12. La partícula vírica según la reivindicación
11, que comprende un polipéptido vírico env seleccionado
entre el grupo consistente en el polipéptido de la envuelta de VIF,
el polipéptido de la envuelta de VIH, el polipéptido de la envuelta
de VSV, el polipéptido de la envuelta de MoMLV y el polipéptido de
la envuelta de VLAG.
13. La partícula vírica según la reivindicación
11, que comprende un polipéptido de la envuelta de VSV.
14. Una célula que comprende el vector de ácido
nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.
15. La célula según la reivindicación 14, que es
humana.
16. La célula según la reivindicación 14 o 15,
que comprende un plásmido de ácido nucleico en el que:
el plásmido de ácido nucleico comprende una
secuencia de nucleótidos que codifica uno o varios polipéptidos
necesarios para encapsidar el vector de ácido nucleico;
la secuencia de nucleótidos está ligada
funcionalmente a una secuencia de control de la expresión que actúa
en células humanas; y
el plásmido de ácido nucleico carece de un sitio
de encapsidación funcional de lentivirus.
17. La célula según la reivindicación 16, en
donde la secuencia de nucleótidos codifica un polipéptido
seleccionado entre el grupo consistente en el polipéptido de la
envuelta vírica, el polipéptido de la cubierta vírica, el ligando
del receptor celular, el anticuerpo o un fragmento de
anticuerpo.
18. La célula según la reivindicación 16, en
donde la secuencia de nucleótidos codifica uno o varios polipéptidos
víricos seleccionados entre env, gag y pol.
19. La célula según la reivindicación 17, en
donde el polipéptido env vírico se selecciona entre el grupo
consistente en el polipéptido de la envuelta de VIF, el polipéptido
de la envuelta de VIH, el polipéptido de la envuelta de VSV, el
polipéptido de la envuelta de MoMLV y el polipéptido de la envuelta
de VLAG.
20. La célula según la reivindicación 19, en
donde la secuencia de nucleótidos codifica un polipéptido de la
envuelta de VSV.
21. La célula según una cualquiera de las
reivindicaciones 16 a 20, en donde la secuencia de control de la
expresión se selecciona entre el grupo consistente en la secuencia
del promotor de CMV, la secuencia del promotor de VIH, la secuencia
del promotor de LTR de VIH, la secuencia del promotor de
SV-40, la secuencia del promotor de pol II y la
secuencia de control de la expresión de pol III.
22. La célula según la reivindicación 21, en
donde la secuencia de control de la expresión es una secuencia del
promotor de CMV.
23. Un método para transfectar una célula con un
vector de ácido nucleico según cualquiera de las reivindicaciones 1
a 10, o para transducir una célula con una partícula vírica que
comprende dicho vector de ácido nucleico, que comprende poner en
contacto la célula in vitro con dicho vector de ácido
nucleico o dicha partícula vírica, en donde:
el vector de ácido nucleico comprende un ácido
nucleico diana heterólogo, ligado funcionalmente a una secuencia de
control de la expresión.
24. El método según la reivindicación 23, en
donde la célula es una célula humana.
25. El método según la reivindicación 23, en
donde la célula es una célula humana que no se divide.
26. El método según la reivindicación 24, en
donde la célula humana que no se divide se selecciona entre el grupo
consistente en células neuronales diferenciadas de forma terminal y
células hematopoyéticas diferenciadas de forma terminal.
27. El método según la reivindicación 24, en
donde la célula humana que no se divide es de un tejido seleccionado
entre el grupo consistente en el sistema nervioso, el ojo, el
sistema hematopoyético, el tegumento, el sistema endocrino, el
sistema hepatobiliar, el tracto gastrointestinal, el tracto
genitourinario, el hueso, el músculo, el sistema cardiovascular y el
sistema respiratorio.
28. Un vector de ácido nucleico según una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 o una partícula vírica que
contiene dicho vector de ácido nucleico, para uso en un método de
transfección de una célula humana con dicho ácido nucleico o de
transducción de una célula humana con dicha partícula vírica, que
comprende poner en contacto dicha célula con dicho ácido nucleico o
partícula vírica in vivo.
29. Un ácido nucleico o una partícula vírica
según la reivindicación 28, en donde dicha célula es como se ha
definido en una cualquiera de las reivindicaciones 24 a 27.
30. Un vector de ácido nucleico según una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, una partícula vírica que
contiene dicho vector de ácido nucleico o una célula tal y como se
han definido en cualquiera de las reivindicaciones 16 a 22, para uso
en un método terapéutico.
31. Una célula según la reivindicación 30, en
donde dicha célula es para uso en un método que comprende la
infusión en un paciente.
32. El método según cualquiera de las
reivindicaciones 23 a 27, que comprende poner en contacto la célula
con un plásmido del vector de ácido nucleico, tal y como se ha
definido en cualquiera de las reivindicaciones 16 a 20.
33. El método según la reivindicación 23, en
donde la partícula vírica es como se ha definido en la
reivindicación 12 o 13.
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| US6015686A (en) | 1993-09-15 | 2000-01-18 | Chiron Viagene, Inc. | Eukaryotic layered vector initiation systems |
| US6451592B1 (en) | 1996-04-05 | 2002-09-17 | Chiron Corporation | Recombinant alphavirus-based vectors with reduced inhibition of cellular macromolecular synthesis |
| GB2356200B (en) * | 1997-12-22 | 2002-05-01 | Oxford Biomedica Ltd | Retroviral vectors |
| ES2373406T3 (es) * | 1997-12-22 | 2012-02-03 | Oxford Biomedica (Uk) Limited | Vectores basados en el virus de la anemia infecciosa equina (vaie). |
| WO1999036511A2 (en) * | 1998-01-16 | 1999-07-22 | Chiron Corporation | Feline immunodeficiency virus gene therapy vectors |
| US8647864B2 (en) | 1999-04-14 | 2014-02-11 | Novartis Ag | Compositions and methods for generating an immune response utilizing alphavirus-based vector systems |
| US6730297B1 (en) | 1999-05-28 | 2004-05-04 | Chiron Corporation | Use of recombinant gene delivery vectors for treating or preventing lysosomal storage disorders |
| ATE395930T1 (de) | 1999-10-22 | 2008-06-15 | Aventis Pasteur | Verfahren zur erregung und/oder verstärkung der immunantwort gegen tumorantigene |
| EP1103615A1 (en) * | 1999-11-25 | 2001-05-30 | Universite De Geneve | Vectors capable of immortalizing non-dividing cells and cells immortalized with said vectors |
| DE60033180T2 (de) * | 1999-12-14 | 2007-10-25 | Novartis Ag | Auf dem rinderimmunschwächevirus (biv) basierte vektoren |
| US6864085B2 (en) | 1999-12-14 | 2005-03-08 | Novartis Ag | Bovine immunodeficiency virus (BIV) based vectors |
| US6656706B2 (en) | 1999-12-23 | 2003-12-02 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Molecular clones with mutated HIV gag/pol, SIV gag and SIV env genes |
| DK1282702T3 (da) * | 2000-05-10 | 2007-04-02 | Sanofi Pasteur Ltd | Immunogene polypeptider, som er kodet af KAGE-minigener, og anvendelser deraf |
| DK1285080T3 (da) | 2000-05-31 | 2008-12-01 | Novartis Vaccines & Diagnostic | Fremgangsmåde til oprensning af alphavirusreplikonpartikler |
| US6712612B1 (en) | 2000-12-12 | 2004-03-30 | Genecure Llc | Safe and stable retroviral helper cell line and related compositions and methods |
| EP1401480B1 (en) * | 2001-02-22 | 2012-11-28 | Novartis AG | Viral vectors encoding endostatin in the treatment of ocular neovascularization |
| ATE303169T1 (de) | 2001-11-19 | 2005-09-15 | Scil Technology Gmbh | Homogen beschichtete vorrichtung mit osteoinduktiven und osteokonduktiven eigenschaften |
| JP2005533485A (ja) * | 2002-02-04 | 2005-11-10 | ノバルティス アクチエンゲゼルシャフト | 組換えウシ免疫不全ウイルスに基づく遺伝子導入システム |
| EP1864691B1 (en) | 2002-04-09 | 2011-07-20 | Sanofi Pasteur Limited | Modified CEA nucleic acid and expression vectors |
| AU2004280608B2 (en) * | 2002-04-09 | 2012-04-05 | Sanofi Pasteur, Inc. | Modified CEA/B7 vector |
| NZ538958A (en) * | 2002-08-28 | 2006-09-29 | Novartis Ag | Treating disorders of the retina by increasing the in vivo concentration of endostatin in ocular tissues |
| AU2003253049A1 (en) | 2002-09-10 | 2004-04-30 | Scil Technology Gmbh | Metal implant coated under reduced oxygen concentration with osteoinductive protein |
| EP2181704B1 (en) | 2002-12-30 | 2015-05-06 | Angiotech International Ag | Drug delivery from rapid gelling polymer composition |
| US7135339B2 (en) * | 2003-11-20 | 2006-11-14 | University Of Iowa Research Foundation | Methods for producing and using in vivo pseudotyped retroviruses using envelope glycoproteins from lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) |
| US7083783B2 (en) * | 2004-02-18 | 2006-08-01 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Method for treating glaucoma |
| US7196062B2 (en) | 2004-02-18 | 2007-03-27 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Method for treating glaucoma |
| US20060199266A1 (en) * | 2004-08-12 | 2006-09-07 | Vectorcore A Co., Ltd. | CAEV-based vector systems |
| AU2006214278C1 (en) | 2005-02-16 | 2012-07-19 | Miltenyi Biotec Technology, Inc. | Lentiviral vectors and their use |
| US20070092883A1 (en) * | 2005-10-26 | 2007-04-26 | De Luwe Hoek Octrooien B.V. | Methylation specific multiplex ligation-dependent probe amplification (MS-MLPA) |
| US11859168B2 (en) | 2007-05-29 | 2024-01-02 | Christopher B. REID | Electroporation, developmentally-activated cells, pluripotent-like cells, cell reprogramming and regenerative medicine |
| SG10201509679XA (en) * | 2007-05-29 | 2015-12-30 | Christopher B Reid | Methods for production and uses of multipotent cell populations |
| EP2215231A4 (en) | 2007-10-15 | 2010-12-01 | Univ Queensland | EXPRESSION SYSTEM FOR MODULATING AN IMMUNE RESPONSE |
| WO2009065080A1 (en) | 2007-11-16 | 2009-05-22 | San Diego State University Research Foundation | Compositions and method for manipulating pim-1 activity in circulatory system cells |
| US9795658B2 (en) | 2010-04-20 | 2017-10-24 | Admedus Vaccines Pty Ltd | Expression system for modulating an immune response |
| CN103328038A (zh) | 2010-12-01 | 2013-09-25 | 史拜诺莫度雷森公司 | 向神经解剖结构直接递送药剂 |
| EP2568289A3 (en) | 2011-09-12 | 2013-04-03 | International AIDS Vaccine Initiative | Immunoselection of recombinant vesicular stomatitis virus expressing hiv-1 proteins by broadly neutralizing antibodies |
| US9402894B2 (en) | 2011-10-27 | 2016-08-02 | International Aids Vaccine Initiative | Viral particles derived from an enveloped virus |
| US9347065B2 (en) | 2012-03-29 | 2016-05-24 | International Aids Vaccine Initiative | Methods to improve vector expression and genetic stability |
| US9730996B2 (en) | 2012-10-24 | 2017-08-15 | Texas Biomedical Research Institute | Involucrin-driven retroviral expression cassettes encoding human immunodeficiency virus envelope glycoproteins |
| WO2015066796A1 (en) * | 2013-11-06 | 2015-05-14 | Nexen Energy Ulc | Processes for producing hydrocarbons from a reservoir |
| EP2871233A1 (de) | 2013-11-12 | 2015-05-13 | Brandenburgische Technische Universität Cottbus-Senftenberg | Verfahren zur Herstellung von biogenen Stoffen |
| WO2017096432A1 (en) | 2015-12-09 | 2017-06-15 | Admedus Vaccines Pty Ltd | Immunomodulating composition for treatment |
| US11285191B2 (en) | 2016-07-26 | 2022-03-29 | The Board Of Supervisors Of Louisiana State University And Agricultural And Mechanical College | Immunostimulatory compositions and uses therefor |
| KR20200036912A (ko) | 2017-07-31 | 2020-04-07 | 리플렉션 바이오테크놀러지스 리미티드 | 안과 질환을 위한 세포 모델 및 치료요법 |
| GB202013940D0 (en) | 2020-09-04 | 2020-10-21 | Synpromics Ltd | Regulatory nucleic acid sequences |
| AU2021358957A1 (en) | 2020-10-07 | 2023-06-08 | AskBio Inc. | Therapeutic adeno-associated virus delivery of fukutin related protein (fkrp) for treating dystroglycanopathy. disorders including limb girdle 21 |
| DE102023102366A1 (de) | 2023-01-31 | 2024-08-01 | BRANDENBURGISCHE TECHNISCHE UNIVERSITÄT COTTBUS-SENFTENBERG, Körperschaft des öffentlichen Rechts | Testsystem aufweisend stabil CYP-transfizierte oder transduzierte Säugetierzellen |
Family Cites Families (30)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4683202A (en) | 1985-03-28 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying nucleic acid sequences |
| US5254678A (en) | 1987-12-15 | 1993-10-19 | Gene Shears Pty. Limited | Ribozymes |
| CA1340323C (en) | 1988-09-20 | 1999-01-19 | Arnold E. Hampel | Rna catalyst for cleaving specific rna sequences |
| ATE157012T1 (de) | 1989-11-03 | 1997-09-15 | Univ Vanderbilt | Verfahren zur in vivo-verabreichung von funktionsfähigen fremden genen |
| US5279833A (en) | 1990-04-04 | 1994-01-18 | Yale University | Liposomal transfection of nucleic acids into animal cells |
| AU2007392A (en) | 1991-05-29 | 1993-01-08 | United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services, The | Eukaryotic expression vectors with regulation of rna processing |
| US5858784A (en) | 1991-12-17 | 1999-01-12 | The Regents Of The University Of California | Expression of cloned genes in the lung by aerosol- and liposome-based delivery |
| EP0646178A1 (en) | 1992-06-04 | 1995-04-05 | The Regents Of The University Of California | expression cassette with regularoty regions functional in the mammmlian host |
| DE69431295T2 (de) | 1993-04-21 | 2003-05-15 | Institut Pasteur, Paris | Biokompatibles implantat zur in vivo expression und sekretion von therapeutischer verbindung |
| CN1127527A (zh) | 1993-05-17 | 1996-07-24 | 加利福尼亚大学董事会 | 人免疫缺陷型病毒感染和艾滋病的核酶基因治疗方法 |
| US5426039A (en) | 1993-09-08 | 1995-06-20 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Direct molecular cloning of primer extended DNA containing an alkane diol |
| WO1995025547A1 (en) | 1994-03-24 | 1995-09-28 | University Of Washington | Devices and methods for implanting transduced cells |
| WO1995025806A2 (en) * | 1994-03-24 | 1995-09-28 | Syngenix Limited | Packaging-deficient lentiviruses |
| WO1995030755A1 (en) | 1994-05-10 | 1995-11-16 | Hisamitsu Pharmaceutical Co., Inc. | Recombinant human immunodeficiency virus vector and process for producing the same |
| WO1995032300A1 (en) | 1994-05-23 | 1995-11-30 | University Of Medicine & Dentistry Of New Jersey | Selective biological destruction of tumor cells |
| US5693508A (en) | 1994-11-08 | 1997-12-02 | Chang; Lung-Ji | Retroviral expression vectors containing MoMLV/CMV-IE/HIV-TAR chimeric long terminal repeats |
| US5681746A (en) * | 1994-12-30 | 1997-10-28 | Chiron Viagene, Inc. | Retroviral delivery of full length factor VIII |
| ATE238427T1 (de) | 1995-03-09 | 2003-05-15 | Austrian Nordic Biotherapeutic | Vektoren, die therapeutische gene fuer antimikrobielle peptide enthalten, zur verwendung in der gentherapie |
| US5650309A (en) | 1995-05-16 | 1997-07-22 | The Regents Of The University Of California | Viral vectors |
| GB9510272D0 (en) | 1995-05-22 | 1995-07-19 | Isis Innovation | Retroviral vectors |
| GB9517263D0 (en) | 1995-08-23 | 1995-10-25 | Cancer Res Campaign Tech | Expression systems |
| US6013516A (en) | 1995-10-06 | 2000-01-11 | The Salk Institute For Biological Studies | Vector and method of use for nucleic acid delivery to non-dividing cells |
| GB9525639D0 (en) * | 1995-12-15 | 1996-02-14 | Isis Innovation | Improved retroviral vectors |
| JP2000506727A (ja) * | 1996-03-05 | 2000-06-06 | ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア | 組換え生ネコ免疫不全ウイルスおよびプロウイルスｄｎａワクチン |
| WO1997042338A1 (en) | 1996-05-06 | 1997-11-13 | Chiron Corporation | Crossless retroviral vectors |
| WO1997048277A1 (en) | 1996-06-20 | 1997-12-24 | The Salk Institute For Biological Studies | Modular assembly retroviral vectors and uses thereof |
| GB9621680D0 (en) | 1996-10-17 | 1996-12-11 | Oxford Biomedica Ltd | Lentiviral vectors |
| JP4390860B2 (ja) * | 1997-05-13 | 2009-12-24 | ユニヴァーシティ・オヴ・ノース・キャロライナ・アト・チャペル・ヒル | レンチウイルスをベースにした遺伝子転移ベクター |
| US5994136A (en) | 1997-12-12 | 1999-11-30 | Cell Genesys, Inc. | Method and means for producing high titer, safe, recombinant lentivirus vectors |
| WO1999036511A2 (en) | 1998-01-16 | 1999-07-22 | Chiron Corporation | Feline immunodeficiency virus gene therapy vectors |
-
1998
- 1998-09-15 CA CA002304983A patent/CA2304983A1/en not_active Abandoned
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