ES2373406T3 - Vectores basados en el virus de la anemia infecciosa equina (vaie). - Google Patents

Abstract

Genoma de vector de VAIE que puede estar empaquetado y que puede expresar genes heterólogos, caracterizado porque comprende un gen gag truncado pero que conserva una señal de empaquetamiento de gag, en el que: (i) el truncamiento de gag elimina más de un nucleótido en el sentido de 3' del nucleótido 350 de la secuencia codificante de gag; y (ii) la señal de empaquetamiento comprende los nucleótidos 1-109 de la secuencia codificante de gag.

Description

Vectores basados en el virus de la anemia infecciosa equina (VAIE).

La presente invención se refiere a un genoma de vector de VAIE. En particular, pero no exclusivamente, se refiere a genomas de vector de VAIE que pueden estar empaquetados y por tanto que pueden transferir material genético a células que no se dividen o se dividen lentamente.

Ha habido un considerable interés, durante algún tiempo, en el desarrollo de sistemas de vectores retrovirales basados en lentivirus, un pequeño subgrupo de los retrovirus. Este interés surge en primer lugar a partir de la idea de utilizar vectores basados en VIH para dirigir genes terapéuticos anti-VIH a células susceptibles al VIH susceptible células y en segundo lugar a partir de la predicción de que, dado que los lentivirus pueden infectar células que no se dividen (Lewis & Emerman 1993 J. Virol. 68, 510), los sistemas de vector basados en estos virus podrían transducir células que no se dividen (por ejemplo Vile & Russel 1995 Brit. Med. Bull. 51, 12). Se han producido sistemas de vector basado en VIH (Buchschacher & Panganiban 1992 J.Virol. 66, 2731) y se han utilizado para transducir células CD4+ y, tal como se anticipaba, células que no se dividen (Naldini et al, 1996 Science 272, 263). Además, los vectores lentivirales permiten la expresión a largo plazo muy estable del gen de interés. Ésta ha mostrado ser de por lo menos tres meses para células neuronales de rata transducidas. Los vectores basados en VLM sólo podían expresar el gen de interés durante seis meses.

Los vectores basados en VIH producidos hasta la fecha dan como resultado un provirus integrado en la célula transducida que presenta LTR de VIH en sus extremos. Esto limita la utilización de estos vectores ya que las LTR han de utilizarse como señales de expresión para cualquier gen insertado a menos que se utilice un promotor interno. La utilización de promotores internos presenta importantes desventajas. El resultado impredecible de colocar promotores adicionales dentro de la unidad de transcripción de LTR retroviral está bien documentado (Bowtell et al, 1988 J.Virol. 62, 2464; Correll et al, 1994 Blood 84, 1812; Emerman y Temin 1984 Cell 39, 459; Ghattas et al, 1991 Mol.Cell.Biol. 11, 5848; Hantzopoulos et al, 1989 PNAS 86, 3519; Hatzoglou et al, 1991 J. Biol. Chem 266, 8416; Hatzoglou et al, 1988 J.Biol.Chem 263, 17798; Li et al, 1992 Hum. Gen. Ther. 3, 381; McLachlin et al, 1993 Virol. 195, 1; Overell et al, 1988 Mol. Cell Biol. 8, 1803; Scharfman et al, 1991 PNAS 88, 4626; Vile et al, 1994 Gen Ther 1, 307; Xu et al, 1989 Virol. 171,331; Yee et al, 1987 PNAS 84, 5197). Los factores implicados parecen incluir la posición y orientación relativa de los dos promotores, la naturaleza de los promotores y los genes expresados y cualquier procedimiento de selección que pueda adoptarse. La presencia de promotores internos puede afectar tanto a los títulos de transducción que pueden obtenerse a partir de una línea celular de empaquetamiento y la estabilidad del vector integrado.

Las LTR de VIH y otros lentivirus presentan requisitos específicos de virus para la expresión génica. Por ejemplo, la LTR de VIH no es activa en ausencia de la proteína Tat viral (Cullen 1995 AIDS 9, S19). Es deseable, por tanto, modificar las LTR de tal manera que cambien los requisitos para la expresión génica. En particular, pueden requerirse señales de expresión génica específicas de tejido para algunas aplicaciones de terapia génica.

Los vectores de VIH vectores presentan varias desventajas importantes que pueden limitar su aplicación terapéutica para determinadas enfermedades. El VIH-1 presenta la desventaja de ser un patógeno humano que lleva proteínas y secuencias potencialmente oncogénicas. Existe el riesgo de que la introducción de partículas de vector producidas en el empaquetamiento de células que expresan gag-pol de VIH introduzca estas proteínas en el paciente conduciendo a seroconversion. Por estos motivos, existe una necesidad de desarrollar vectores basados en lentivirus que no introduzcan proteínas de VIH en los pacientes.

Se ha descubierto que es posible proporcionar un vector lentiviral mejorado que supera las limitaciones de vectores basados en VIH. Es importante en el desarrollo de cualquier sistema de vector retroviral para eliminar secuencias del genoma retroviral que pueden inhibir la capacidad del vector para transferir genes heterólogos o que pueden transferir secuencias codificantes de proteínas desfavorables para la célula diana. Los retrovirus están limitados en la longitud de secuencias de ARN que pueden empaquetarse eficazmente y de modo que la existencia de largas regiones del genoma retroviral limita gravemente la capacidad de codificación del vector para ARN codificante heterólogo.

También se ha descubierto que es posible proporcionar un vector lentiviral basado en un lentivirus que no es de primate que presenta una alta capacidad de codificación para secuencias codificantes heterólogas y que presenta una capacidad reducida para transferir componentes retrovirales a la célula diana.

Se ha descubierto sorprendentemente que la cantidad de secuencia genómica de vector requerida de un lentivirus que no es de primate para producir un vector de clonación eficaz es sustancialmente menor de lo que se ha descrito para un vector basado en VIH.

Los requisitos de secuencia para empaquetar genomas de vector de VIH son complejos. La señal de empaquetamiento de VIH engloba el sitio donador de corte y empalme y contiene una parte de la región no traducida en 5’ del gen gag que presenta una supuesta estructura secundaria que contiene 4 horquillas cortas. Es conocido

asimismo que secuencias adicionales en cualquier lugar en el genoma son importantes para la encapsidación eficaz del VIH. Por ejemplo las primeras 350 pb de la secuencia codificante de la proteína gag pueden contribuir al empaquetamiento eficaz y también están implicadas regiones mal definidas de env. Para la construcción de vectores de VIH que pueden expresar genes heterólogos, se ha utilizado una señal de empaquetamiento que se extiende hasta por 350 pb de la región codificante de la proteína gag.

Se ha descubierto sorprendentemente que la estructura de la señal de empaquetamiento en lentivirus que no es de primate es completamente diferente de la de VIH. En lugar de una corta secuencia de 4 horquillas seguida por una región mal definida de secuencias de gag y env, se ha descubierto que una región más corta del gen gag basta para un empaquetamiento eficaz. De hecho la deleción de mayores regiones del gen gag en vectores de VAIE es ventajosa y conduce a que se produzca un vector de mayor título viral. Esta información puede utilizarse para proporcionar vectores mejorados construidos a partir de secuencias de lentivirus que no son de primate que presentan un alto título y características ventajosas en comparación con los vectores de VIH.

Según un aspecto de la presente invención, está previsto un genoma de vector de VAIE que puede estar empaquetado y que puede expresar genes heterólogos, caracterizado porque comprende un gen gag truncado pero que conserva una señal de empaquetamiento de gag, en el que:

(i)

el truncamiento de gag elimina más de un nucleótido en el sentido de 3’ del nucleótido 350 de la secuencia codificante de gag; y

(ii)

la señal de empaquetamiento comprende los nucleótidos 1-109 de la secuencia codificante de gag.

Por tanto, está previsto un genoma de vector de VAIE que contiene un gen gag delecionado de un VAIE en el que la deleción en gag elimina uno o más nucleótidos en el sentido de 3’ del nucleótido 350 de la secuencia codificante de gag. Preferentemente la deleción se extiende desde el nucleótido 350 hasta por lo menos el extremo C-terminal de la región codificante de gagpol. Más preferentemente la deleción adicionalmente elimina el nucleótido 300 de la región codificante de gag y lo más preferentemente la deleción conserva sólo los primeros 150 nucleótidos de la región codificante de gag. Sin embargo también pueden utilizarse deleciones de gag incluso mayores, por ejemplo la región codificante de gag contiene los primeros 109 nucleótidos de la región codificante de gag. También puede ser posible que la región codificante de gag contenga sólo los primeros 2 nucleótidos de la región codificante de gag.

Están incluidas características adicionales del genoma de VAIE en el genoma de vector que son necesarias para la transducción de la célula diana; replicación; transcripción inversa e integración. Éstas son, por lo menos, una parte de una LTR que contiene la secuencia de la región R y la región U5, secuencias de la LTR en 3’ que contienen un tramo de polipurina (PPT) y una LTR en 3’ del lentivirus que no es de primate o una LTR híbrida que contiene secuencias del lentivirus que no es de primate y otros elementos. Opcionalmente, el genoma de VAIE puede contener genes auxiliares derivados de un retrovirus, tales como, pero sin limitarse a, un gen rev, un gen tat, un gen vif, un gen nef, un gen vpr o un gen S2. Pueden añadirse componentes adicionales tales como intrones, sitios donadores de corte y empalme, un elemento de respuesta a rev (RRE), sitios de clonación y genes marcadores seleccionables.

Además, se ha demostrado sorprendentemente que puede construirse un sistema de vector mínimo de lentivirus que no es de primate que no requiere ni S2, Tat, env ni dUTPasa ni para la producción del vector ni para la transducción de células que se dividen y que no se dividen.

Por tanto según otro aspecto el genoma de VAIE del que se deriva el vector carece de uno o más genes auxiliares.

La deleción de genes auxiliares es sumamente ventajosa. En primer lugar, permite que se produzcan vectores sin los genes asociados normalmente con enfermedad en infecciones lentivirales (por ejemplo, por VIH). En particular, tat y env se asocian con enfermedad. En segundo lugar, la deleción de genes auxiliares permite que el vector empaquete más ADN heterólogo. En tercer lugar, pueden omitirse genes cuya función se desconoce, tales como dUTPasa y S2, reduciendo por tanto el riesgo de producir efectos no deseados.

Además, se ha mostrado que la secuencia líder del genoma de lentivirus que no es de primate es esencial para una alta expresión de proteína de gag y gagpol.

Por tanto en un aspecto adicional el genoma de VAIE del que se deriva el vector carece del gen tat pero incluye la secuencia líder entre el extremo de la LTR en 5’ y el ATG de gag.

Estos datos definen adicionalmente un conjunto esencial mínimo de componentes funcionales para un vector lentiviral óptimo. Se proporciona un vector con máxima capacidad genética y alto título, pero sin genes auxiliares que

o bien son de función desconocida (S2, UTPasa), y por tanto pueden presentar riesgo, o son análogos de proteínas de VIH que pueden estar asociadas con el SIDA (tat, env).

Se apreciará que la presente invención proporciona un vector retroviral derivado de un genoma de VAIE (1) que comprende un gen gag delecionado en el que la deleción en gag elimina uno o más nucleótidos en el sentido de 3’ del nucleótido 350 de la secuencia codificante de gag; (2) en el que están ausentes uno o más genes auxiliares del genoma de VAIE; (3) en el que el genoma de VAIE carece del gen tat pero incluye la secuencia líder entre el extremo de la LTR en 5’ y el ATG de gag; y combinaciones de (1), (2) y (3). En una forma de realización preferida el vector retroviral comprende todas las características (1) y (2) y (3).

Un vector “que no es de primate”, tal como se utiliza en la presente memoria, se refiere a un vector derivado de un virus que no infecta principalmente primates, especialmente seres humanos. Por tanto, los vectores de virus que no son de primate incluyen vectores que infectan mamíferos que no son primates, tales como perros, ovejas y caballos, reptiles, aves e insectos.

Un vector lentiviral o de lentivirus, tal como se utiliza en la presente memoria, es un vector que comprende por lo menos una parte componente derivada de un lentivirus. Preferentemente, esa parte componente está implicada en los mecanismos biológicos mediante los cuales el vector infecta células, expresa genes o se replica.

El lentivirus que no es de primate puede ser cualquier miembro de la familia de Lentiviridae que no infecta de manera natural un primate y puede incluir un virus de inmunodeficiencia felina (VIF), un virus de inmunodeficiencia bovina (VIB), un virus de artritis-encefalitis caprina (VAEC), un virus Maedi-visna (VMV) o un virus de la anemia infecciosa equina (VAIE). Según la invención el lentivirus es un VAIE. El virus de la anemia infecciosa equina infecta todos los équidos dando como resultado trombocitopenia y viremia plasmática (Clabough, et al. 1991. J Virol. 65:6242-51). Se cree que la replicación del virus está controlada por el proceso de maduración de monocitos en macrófagos.

VAIE presenta la estructura genómica más sencilla del lentivirus. Además de los genes gag, pol y env VAIE codifica para otros tres genes: tat, rev y S2. Tat actúa como activador transcripcional de la LTR viral (Derse y Newbold1993 Virology. 194:530-6; Maury, et al 1994 Virology. 200:632-42.) y Rev regula y coordina la expresión de genes virales a través de elementos de respuesta a rev (RRE) (Martarano et al 1994 J Virol. 68:3102-11.). Se cree que los mecanismos de acción de estas dos proteínas son muy similares a los mecanismos análogos en los virus de primate (Martano et al ibíd.). La función de S2 se desconoce. Además, se ha identificado que una proteína de VAIE, Ttm, está codificada por el primer exón de tat con corte y empalme a la secuencia codificante de env al comienzo de la proteína transmembrana.

Además de proteasa, transcriptasa inversa e integrasa, los lentivirus que no son de primate contienen un cuarto producto génico de pol que codifica para una dUTPasa. Esto puede desempeñar un papel en la capacidad de estos lentivirus para infectar determinados tipos de células que no se dividen.

El ARN viral en el primer aspecto de la invención se transcribe a partir de un promotor, que puede ser de origen viral

o no viral, pero que puede dirigir la expresión en una célula eucariota tal como una célula de mamífero. Opcionalmente se añade un potenciador, o bien en el sentido de 5’ del promotor o bien en el sentido de 3’. El transcrito de ARN termina en un sitio de poliadenilación puede ser el proporcionado en la LTR en 3’ lentiviral o una señal de poliadenilación diferente.

Por tanto la presente invención proporciona una unidad de transcripción de ADN que comprende un promotor y opcionalmente un potenciador que puede dirigir la expresión de un genoma de vector retroviral.

Las unidades de transcripción tal como se describe en la presente memoria comprenden regiones de ácido nucleico que contienen secuencias que pueden transcribirse. Por tanto, las secuencias que codifican para ARNm, ARNt y ARNr están incluidas dentro de esta definición. Las secuencias pueden estar en orientación homosentido o antisentido con respecto al promotor. Pueden utilizarse constructos antisentido para inhibir la expresión de un gen en una célula según técnicas bien conocidas. Los ácidos nucleicos pueden ser, por ejemplo, ácido ribonucleico (ARN) o ácido desoxirribonucleico (ADN) o análogos de los mismos. Las secuencias que codifican para ARNm incluirán opcionalmente algunas o todas de las secuencias flanqueantes en 5’ y/o 3’ transcritas pero no traducidas de manera natural, o si no, asociadas con la secuencia codificante traducida. Pueden incluir opcionalmente además las secuencias de control transcripcional asociadas, normalmente asociadas con las secuencias transcritas, por ejemplo señales de terminación de la transcripción, sitios de poliadenilación y elementos potenciadores en el sentido de 3’. Los ácidos nucleicos pueden comprender ADNc o ADN genómico (que puede contener intrones).

El término “promotor” se utiliza en el sentido normal de la técnica, por ejemplo un sitio de unión a ARN polimerasa en la teoría de expresión génica de Jacob-Monod.

El término “potenciador” incluye una secuencia de ADN que se une a otros componentes de proteína del complejo de iniciación de la transcripción y por tanto facilita la iniciación de la transcripción dirigida por su promotor asociado.

El promotor y el potenciador de las unidades de transcripción que codifican para el primero componente de vector viral son preferentemente muy activos, o pueden inducirse fuertemente, en la célula productora en condiciones para

la producción del vector retroviral de la presente invención y/o en células diana primarias en condiciones para la producción del vector viral secundario. El promotor y el potenciador de las unidades de transcripción que codifican para el segundo componente de vector viral son preferentemente fuertemente activos, o pueden inducirse fuertemente, en las células diana. El promotor y/o el potenciador pueden ser eficaces de manera constitutiva, o pueden estar limitados temporalmente o por tejido en su actividad. Los ejemplos de promotores/potenciadores limitados por tejido adecuados son los que son sumamente activos en células tumorales tales como un promotor/potenciador de un gen MUC1, un gen CEA o un gen 5T4 antigen. Los ejemplos de promotores/potenciadores limitados temporalmente son los que responden a isquemia y/o hipoxia, tales como elementos de respuesta a hipoxia o el promotor/potenciador de un gen grp78 o uno grp94. Una combinación de promotor-potenciador preferida es una combinación de potenciador/promotor temprano inmediato principal (MIE, major immediate early) de citomegalovirus humano (CMVH).

Las LTR pueden alterarse en, por ejemplo, U3 (tal como para obtener fuerte expresión constitutiva, expresión inducible o expresión específica de tejido); R (tal como eliminar horquillas TAR); o U5 (tal como utilizar señales de poliadenilación no basadas en U5 potenciadas, por ejemplo del gen de la hormona de crecimiento bovina).

En una configuración se invierte el casete de promotor interno y se coloca una señal de poliadenilación en el sentido de 3’ del casete.

En otra forma de realización la señal de poliadenilación que se utiliza contiene por lo menos un intrón.

El vector de la presente invención puede utilizar estrategias de autoinactivación. Se han construido vectores retrovirales de autoinactivación retroviral mediante la deleción de los potenciadores transcripcionales o los potenciadores y promotores en la región U3 de la LTR en 3’. Tras una tanda de replicación de vector, se copian estos cambios tanto a las LTR en 5’ como en 3’ produciendo un provirus inactivo. Sin embargo, cualquier promotor interno con respecto a las LTR en tales vectores será todavía activo. Esta estrategia se ha utilizado para eliminar los efectos de los potenciadores y promotores en las LTR virales en la transcripción a partir de genes situados de manera interna. Tales efectos incluyen un aumento de la transcripción o la supresión de la transcripción. Este estrategia también puede utilizarse para eliminar la transcripción en el sentido de 3’ a partir de la LTR en 3’ para dar ADN genómico. Esto es de preocupación particular en la terapia génica humana en la que es de importancia crítica impedir cualquier activación de un oncogén endógeno.

Se ha construido otro tipo de vector de autoinactivación que presenta repeticiones directas que flanquean la señal de empaquetamiento de tal manera que la señal de empaquetamiento se deleciona frecuentemente durante la transcripción inversa, produciendo virus defectuosos para el empaquetamiento. Con repeticiones directas suficientemente largas, la mayoría de los provirus resultantes pierden sus secuencias de empaquetamiento. La tasa de deleción podría aumentar hasta el 100% diseñando el vector de modo que la deleción de la señal de empaquetamiento reconstituyó el marcador neo sin seleccionar las células infectadas con vector en G418. Esta estrategia puede ser particularmente útil para aplicaciones de terapia génica en las que es indeseable cualquier propagación del vector tras la transferencia génica.

En una forma de realización preferida adicional del primer aspecto de la invención, se introducen uno o más nucleótidos de interés (NDI) en el vector en el sitio de clonación. Tales genes terapéuticos pueden expresarse a partir de un promotor situado en la LTR retroviral o puede expresarse a partir de un promotor interno introducido en el sitio de clonación.

Las secuencias codificantes de NDI adecuadas incluyen de manera no limitativa las que son de aplicación terapéutica y/o de diagnóstico tales como: secuencias que codifican para citocinas, quimiocinas, hormonas, anticuerpos, moléculas similares a inmunoglobulina diseñadas mediante ingeniería genética, un anticuerpo de cadena sencilla, proteínas de fusión, enzimas, moléculas coestimuladoras inmunitarias, moléculas inmunomoduladoras, ARN antisentido, un mutante negativo transdominante de una proteína diana, una toxina, una toxina condicional, un antígeno, una proteína supresora tumoral y factores de crecimiento, proteínas de membrana, proteínas y péptidos vasoactivos, proteínas antivirales y ribozimas, y derivados de los mismos (tales como con un grupo indicador asociado). Cuando están incluidas, tales secuencias codificantes normalmente pueden unirse funcionalmente a un promotor adecuado, que puede ser un promotor que dirige la expresión de una(s) ribozima(s), o un promotor o promotores diferentes.

La secuencia codificante de NDI puede codificar para una proteína de fusión o un segmento de una secuencia codificante.

El vector retroviral de la presente invención puede utilizarse para suministrar un NDI tal como una enzima activadora de profármacos a un sitio tumoral para el tratamiento de un cáncer. En cada caso, se utiliza un profármaco adecuado en el tratamiento del individuo (tal como un paciente) en combinación con la enzima activadora de profármaco apropiada. Se administra un profármaco apropiado junto con el vector. Los ejemplos de profármacos incluyen: fosfato de etopósido (con fosfatasa alcalina, Senter et al 1988 Proc Natl Acad Sci 85: 4842-4846); 5fluorocitosina (con citosina desaminasa, Mullen et al 1994 Cancer Res 54: 1503-1506); doxorubicina-N-p

hidroxifenoxiacetamida (con penicilina-V-amidasa, Kerr et al 1990 Cancer Immunol Immunother 31: 202-206); glutamato de para-N-bis(2-cloroetil)aminobenzoílo (con carboxipeptidasa G2); carbamatos de mostaza de nitrógeno con cefalosporina (con β-lactamasa); SR4233 (con P450 reductasa); ganciclovir (con tidimina cinasa de VSH, Borrelli et al 1988 Proc Natl Acad Sci 85: 7572-7576); profármacos de mostaza con nitrorreductasa (Friedlos et al 1997 J Med Chem 40: 1270-1275) y ciclofosfamida (con P450 Chen et al 1996 Cancer Res 56: 1331-1340).

El vector de la presente invención puede suministrarse a un sitio diana mediante un vector viral o no viral.

Tal como se conoce bien en la técnica, un vector es una herramienta que permite o facilita la transferencia de una entidad de un entorno a otro. A título de ejemplo, algunos vectores utilizados en técnicas de ADN recombinante permite que se transfieran entidades, tales como un segmento de ADN (tal como un segmento de ADN heterólogo, tal como un segmento de ADNc heterólogo), a una célula diana. Opcionalmente, una vez dentro de la célula diana, el vector puede servir para mantener a continuación el ADN heterólogo dentro de la célula o puede actuar como una unidad de replicación de ADN. Los ejemplos de vectores utilizados en técnicas de ADN recombinante incluyen plásmidos, cromosomas, cromosomas artificiales o virus.

Los sistemas de suministro no virales comprenden de manera no limitativa procedimientos de transfección de ADN. En este caso, la transfección incluye un procedimiento que utiliza un vector no viral para suministrar un gen a una célula de mamífero diana.

Los métodos de transfección típicos incluyen electroporación, biolística de ADN, transfección mediada por lípidos, transfección mediada por ADN compactado, liposomas, inmunoliposomas, lipofectina, anfífilos faciales catiónicos (los CFA) mediados por agentes catiónicos (Nature Biotechnology 1996 14; 556) y combinaciones de los mismos.

Los sistemas de suministro viral incluyen pero no se limitan a vector de adenovirus, un vector viral adenoasociado (AAV), un vector viral de herpes, vector retroviral, vector lentiviral, vector baculoviral. Otros ejemplos de vectores incluyen sistemas de suministro ex vivo, que incluyen pero no se limitan a procedimientos de transfección de ADN tales como electroporación, biolística de ADN, transfección mediada por lípidos, transfección mediada por ADN compactado.

El término “partícula de vector retroviral” se refiere al vector retroviral empaquetado, que preferentemente puede unirse a y entrar en células diana. Los componentes de la partícula, tal como ya se ha epxuesto para el vector, puede modificarse con respecto al retrovirus del tipo natural. Por ejemplo, las proteínas Env en la cubierta proteica de la partícula pueden modificarse genéticamente para alterar su especificidad de selección como diana o lograr alguna otra función deseada.

Preferentemente, el vector viral transduce preferentemente un determinado tipo celular o tipos celulares.

Más preferentemente, el vector viral es un vector dirigido, es decir que presenta un tropismo tisular que se altera en comparación con el virus nativo, de modo que el vector se dirige a células particulares. Para vectores retrovirales, esto puede lograrse modificando la proteína Env. Es necesario que la proteína Env del vector secundario retroviral sea una envuelta no tóxica o una envuelta que pueda producirse en cantidades no tóxicas dentro de la célula diana primaria, tal como por ejemplo una envuelta anfotrópica de VLMM o una envuelta anfotrópica modificada. La característica de seguridad en tal caso es preferentemente la deleción de regiones o la homología de secuencia entre componentes retrovirales.

Preferentemente, la envuelta es una que permite la transducción de células humanas. Los ejemplos de genes env adecuados comprenden de manera no limitativa, VEV-G, un env anfotrópico de VLM tal como el env 4070A, el env del virus de la leucemia felina RD114 o hemaglutinina (HA) de un virus Influenza. La proteína Env puede ser una que puede unirse a un receptor en un número limitado de tipos celulares humanos y puede ser una envuelta modificada mediante ingeniería genética que contiene restos de selección como diana. Las secuencias codificantes de env y gag-pol se transcriben a partir de un promotor y opcionalmente un potenciador activo en la línea celular de empaquetamiento elegida y la unidad de transcripción está terminada por una señal de poliadenilación. Por ejemplo, si la célula de empaquetamiento es una célula humana, una combinación de promotor-potenciador adecuada es la procedentes del gen temprano inmediato principal de citomegalovirus humano (hCMV-MIE) y puede utilizarse una señal de poliadenilación del virus SV40. Otros promotores y señales de poliadenilación adecuados se conocen en la técnica.

La célula de empaquetamiento puede ser una célula de empaquetamiento in vivo en el organismo de un individuo que va a tratarse o puede ser una célula cultivada in vitro tal como una línea celular de cultivo tisular. Las líneas celulares adecuadas incluyen células de mamífero tales como líneas celulares derivadas de fibroblastos murinos o líneas celulares humanas. Preferentemente la línea celular de empaquetamiento es una línea celular humana, tal como por ejemplo: línea celular 293, HEK293, 293-T, TE671, HT1080.

Alternativamente, la célula de empaquetamiento puede ser una célula derivada del individuo que va a tratarse tal como un monocito, macrófago, células madre, célula sanguínea o fibroblastos. La célula puede aislarse de un

individuo y los componentes de vector y de empaquetamiento administrados ex vivo seguidos por una nueva administración de las células de empaquetamiento autólogas. Alternativamente, los componentes de vector y de empaquetamiento pueden administrarse a la célula de empaquetamiento in vivo. Los procedimientos para introducir componentes de vector y de empaquetamiento retrovirales en células de un individuo se conocen en la técnica. Por ejemplo, un enfoque consiste en introducir las diferentes secuencias de ADN que se requieren para producir una partícula retroviral de vector, por ejemplo, la secuencia codificante de env, la secuencia codificante de gag-pol y el genoma retroviral defectuoso en la célula simultáneamente mediante transfección triple transitoria (Landau & Littman 1992 J. Virol. 66, 5110; Soneoka et al 1995 Nucleic Acids Res 23:628-633).

En una forma de realización, las configuraciones del vector de la presente invención utilizan como su sistema de producción, tres unidades de transcripción que expresan un genoma, los componentes de gag-pol y una envuelta. El casete de expresión de envuelta puede incluir una de varias envueltas tales como VEV-G o diversas envueltas de retrovirus murinas tales como 4070A.

De manera convencional, estos tres casetes se expresarían a partir de tres plásmidos transfectados transitoriamente en una línea celular apropiada tal como 293T o a partir de copias integradas en una línea celular productora estable. Un enfoque alternativo es utilizar otro virus como sistema de expresión para los tres casetes, por ejemplo baculovirus o adenovirus. Ambos son sistemas de expresión nuclear. Hasta la fecha, no se ha descrito la utilización de un poxvirus para expresar todos de los componentes de un sistema de vector retroviral o lentiviral. En particular, dada la utilización de codones inusual de los lentivirus y su requerimiento para sistemas de manipulación de ARN tales como el sistema rev/RRE no se ha esclarecido si es viable la incorporación de los tres casetes y su expresión posterior en un vector que se expresa en el citoplasma en lugar del núcleo. Persistía la posibilidad de que se requirieran factores nucleares y rutas de manipulación de ARN nuclear clave para la expresión de los componentes de vector y su función en el vehículo de inserción génica. En este caso se describen un sistema de este tipo y se muestra que los componentes lentivirales pueden prepararse en el citoplasma y que se ensamblan en sistemas de inserción génica funcionales. La ventaja de este sistema es la facilidad con la que el poxvirus puede manipularse, los altos niveles de expresión y la capacidad para conservar intrones en los genomas de vector.

Según otro aspecto, por tanto, se proporciona un sistema de vector viral híbrido para la inserción génica in vivo, comprendiendo el sistema un vector viral primario que puede obtenerse a partir de o está basado en un poxvirus y un segundo vector viral que puede obtenerse a partir de o está basado en un vector retroviral, preferentemente un vector lentiviral, incluso más preferentemente un vector lentiviral que no es de primate.

El vector secundario puede producirse a partir de la expresión de genes esenciales para la producción del vector retroviral codificado en el ADN del vector primario. Los genes de este tipo pueden incluir un gag-pol de un retrovirus, un gen env de un virus de envuelta y un vector retroviral defectuoso que contiene uno o más NDI de diagnóstico o terapéutico(s). El vector retroviral defectuoso contiene en términos generales secuencias para permitir la transcripción inversa, por lo menos parte de una repetición terminal larga (LTR) en 5’, por lo menos parte de una LTR en 3’ y una señal de empaquetamiento.

Si se desea hacer que la replicación del vector secundario sea defectuosa, ese vector secundario puede estar codificado por una pluralidad de unidades de transcripción, que pueden estar ubicadas en un único vector o en dos o más vectores adenovirales u otros vectores primarios.

En algunas situaciones experimentales o terapéuticas, puede ser deseable obviar la necesidad de producir VAIE derivado de MVA in vitro. Los híbridos MVA-VAIE se suministran directamente en el paciente/animal, por ejemplo, se inyecta MVA-VAIE por vía intravenosa en la vena de la cola de un ratón y este virus recombinante infecta una variedad de tejidos murinos, por ejemplo, pulmón, bazo, etc. Las células infectadas expresan la transducción de VAIE competente que contiene un gen terapéutico para terapia génica, por ejemplo. Las partículas de vector de VAIE brotan a partir de estas células y transducen células vecinas. La célula transducida contiene entonces una copia integrada del genoma de vector de VAIE y expresa el producto génico terapéutico u otro producto génico de interés. Si la expresión del producto génico terapéutico es potencialmente tóxica para el huésped, puede regularse mediante un promotor específico, por ejemplo el elemento de respuesta hipóxica (HRE), que restringirá la expresión a las células en un entorno hipóxico. Para la terapia génica de células epiteliales de pulmón/tráquea, por ejemplo, para tratar fibrosis quística, MVA-VAIE puede administrarse como un aerosol suministrado por vía intranasal. Alternativamente, los macrófagos pueden transducirse in vitro y luego volver a introducirse para crear fábricas de macrófagos para vectores basados en VAIE. Además, debido a que MVA es incompetente en la replicación, los híbridos MVA-VAIE podrían también utilizarse para tratar huéspedes inmunosuprimidos.

El virus Vaccinia, el miembro prototípico del género orthopox dentro de la familia Poxviridae, fue el primer virus usado para la expresión de proteínas exógenas recombinantes (Mackett et al 1982, Paoletti & Panicalli 1982). El virus Vaccinia presenta un genoma de ADN grande de más de 180 kb y los informes indican que puede albergar más de 25 kb de ADN foráneo (Merchlinsky & Moss 1992). Otras varias cepas del poxvirus se han adaptado como vectores de expresión recombinante (para una revisión, véase, Carroll y Moss 1997) por ejemplo poxvirus aviar (Taylor & Paoletti 1988), poxvirus del canario (Taylor et al 1991), poxvirus porcino (van der Leek et al 1994) y poxvirus de los insectos (Li et al 1997). Adicionalmente, debido a problemas de seguridad, se han desarrollado

varias cepas muy atenuadas de virus Vaccinia que están comprometidas en células humanas y de otros mamíferos, por ejemplo, virus Vaccinia Ankara (MVA) modificado (Mayr 1978, Sutter 1992), NYVAC (Paoletti et al 1994), virus Vaccinia deficiente de una enzima de replicación de ADN (Holzer et al 1997). Pueden utilizares en su totalidad en la presente invención.

Se obtuvo el MVA de una cepa de vacuna de la viruela de Vaccinia competente en la replicación, Ankara. Tras >500 pases en células de fibroblastos de embrión de pollo, el aislado del virus mostró que estaba altamente atenuado en varios modelos con animales incluyendo ratones que eran inmunodeficientes (Mayr et al 1978). El aislado atenuado, MVA, se utilizó para vacunar a más de 120.000 personas, muchas de las cuales estaban inmunocomprometidas (Mahnel 1994) sin efectos adversos. Los estudios ilustran que MVA puede infectar una amplia gama de células de mamífero pero sólo se ha observado infección productiva en la célula de riñón de hámster BHK-21 (Carroll 1997). En todas las demás líneas celulares de mamífero sometidas a prueba, se observan expresión temprana, replicación de ADN y expresión tardía que conducen a la producción de partículas de virus inmaduras no infecciosas (Carroll 1997, Meyer 1991). Los estudios de replicación de virus muestran que una minoría de células de mamífero puede soportar la producción de muy bajo nivel de virus infeccioso, es decir, células BS-C-1 en las que se produce 1 partícula de MVA infecciosa por célula (Carroll y Moss 1997). La expresión génica tardía habitualmente da lugar a >10 veces más proteína que aquellos genes bajo promotores tempranos (Chakrabarti et al 1997, Wyatt et al 1996). En todas las demás cepas de poxvirus atenuado, se observa rara vez la expresión génica tardía en células de mamífero.

La producción de sistemas de vector de retrovirus, por ejemplo, sistemas VLM-VIH y de vector de lentivirus requiere la construcción de líneas productoras que expresan el genoma del virus y proteínas estructurales esenciales para producir un virus competente en la transducción. Generalmente, éste es un procedimiento relativamente ineficaz que se complica adicionalmente cuando el virus se pseudotipa con proteínas de la envuelta tóxicas tales como VEV-G. La expresión de un genoma funcional y las proteínas estructurales requeridas de un poxvirus recombinante puede obviar muchas de las tecnologías de producción de vector de lentivirus y retrovirus ineficaces actuales. Adicionalmente, pueden inyectarse, los poxvirus recombinantes de este tipo directamente a los pacientes para dar lugar a la producción in vivo de retrovirus o lentivirus.

El MVA es un poxvirus particularmente adecuado para la construcción de un híbrido de pox-retrovirus o poxlentivirus debido a su fenotipo no replicativo y su capacidad para realizar tanto una expresión temprana como tardía fuerte para la producción de preparaciones de vector de alto título.

Con el fin de producir un genoma de vector de lentivirus o retrovirus funcional es esencial que el extremo 5’ del genoma de ARN deba ser exacto (Cannon et al. 1996). Esto es un reto en un sistema de producción basado en Vaccinia ya que muchos de los promotores de Vaccinia comprenden en el sentido de 3’ determinantes de la eficacia de transcripción (Davison 1989b, Moss 1996). Sin embargo, se muestra que existen varias maneras de solucionar este problema:

a.

Utilización de un promotor T7 y secuencia de terminación T7.

b.

Utilización de promotores tempranos (en los que las secuencias en el sentido de 3’ del sitio de iniciación del ARN no están altamente conservados), (Davison 1989a).

c.

Utilización de promotores tardíos o intermedios de Vaccinia que requieren secuencias adicionales en el sentido de 3’ del sitio de iniciación junto con estrategias para generar un extremo 5’ auténtico o que coloque las secuencias en el sentido de 3’ adicionales en ambas regiones R. Existe un requisito para secuencias específicas de 4 nucleótidos en el sentido de 3’ de la iniciación de la transcripción en el promotor tardío (Davison 1989b, Moss 1996). En el primer caso, se coloca una ribozima en el sentido de 3’ del promotor y en el sentido de 5’ de la región R. La ribozima se diseña para escindir el ARN en cis para generar el extremo 5’ correcto. En el segundo caso, el enfoque es modificar las regiones R para incorporar las secuencias adicionales. Esto debe realizarse tanto en las regiones R de LRT en 5’ como en 3’.

La ventaja de tener un sistema dependiente de T7 es que requeriría la infección de la célula mediante dos virus Vaccinia recombinantes para producir partículas virales de VAIE de transducción. Por ejemplo, un MVA podría llevar el genoma de vector, bajo el control del promotor T7 y las secuencias de gag/pol y env bajo el control de los promotores de Vaccinia. Los otros MVA llevarían el gen de polimerasa de T7 bajo el control de un promotor de Vaccinia (Wyatt et al 1995).

La partícula de vector retroviral según la invención también podrá transducir células que se dividen lentamente, y que ningún lentivirus tales como VLM podría transducir eficazmente. Las células que se dividen lentamente se dividen una vez cada aproximadamente tres o cuatro días incluyendo determinadas células tumorales. Aunque los tumores contienen células que se dividen rápidamente, algunas células tumorales especialmente las del centro del tumor, se dividen de manera poco frecuente. Alternativamente, la célula diana puede ser una célula de crecimiento detenido que puede estar experimentando división celular tal como una célula en una parte central de una masa tumoral o una célula madre tal como una célula madre hematopoyética o una célula positiva para CD34. Como alternativa adicional, la célula diana puede ser un precursor de una célula diferenciada tal como un precursor de

monocitos, una célula positiva para CD33, o un precursor mieloide. Como alternativa adicional, la célula diana puede ser una célula diferenciada tal como una neurona, astrocito, célula glial, célula microglial, macrófago, monocito, célula epitelial, célula endotelial o hepatocito. Las células diana pueden transducirse o bien in vitro tras aislamiento de un individuo humano o bien pueden transducirse directamente in vivo.

El suministro de uno o más genes terapéuticos mediante un sistema de vector según la presente invención puede utilizarse solo o en combinación con otros tratamientos o componentes de tratamiento.

Por ejemplo, el vector retroviral de la presente invención puede utilizarse para suministrar uno o más NDI útil(es) en el tratamiento de los trastornos enumerados en el documento WO-A-98/05635. Para facilidad de referencia, parte de esta lista se proporciona a continuación: cáncer, enfermedad inflamatoria o inflamación, trastornos dermatológicos, fiebre, efectos cardiovasculares, hemorragia, coagulación y respuesta de fase aguda, caquexia, anorexia, infección aguda, infección por VIH, estados de choque, reacciones de injerto contra huésped, enfermedad autoinmunitaria, lesión por reperfusión, meningitis, migraña y antitrombosis dependiente de aspirina; crecimiento, invasión y diseminación tumorales, angiogénesis, metástasis, tumores malignos, ascitis y derrame pleural maligno; isquemia cerebral, enfermedad cardiaca isquémica, osteoartritis, artritis reumatoide, osteoporosis, asma, esclerosis múltiple, neurodegeneración, enfermedad de Alzheimer, aterosclerosis, accidente cerebrovascular, vasculitis, enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa; periodontitis, gingivitis; psoriasis, dermatitis atópica, úlceras crónicas, epidermólisis ampollosa; úlcera corneal, retinopatía y cicatrización de heridas quirúrgicas; rinitis, conjuntivitis alérgica, eccema, anafilaxia; reestenosis, insuficiencia cardiaca congestiva, endometriosis, aterosclerosis o endosclerosis.

Además, o en la alternativa, el vector retroviral de la presente invención puede utilizarse para suministrar uno o más NDI útil(es) en el tratamiento de los trastornos presentados en el documento WO-A-98/07859. Para facilidad de referencia, parte de esta lista se proporciona a continuación: a ctividad de diferenciación/proliferación de células y citocinas; actividad inmunosupresora o inmunoestimulante (por ejemplo, para tratar la deficiencia inmunitaria, incluyendo infección por virus de la inmunodeficiencia humana; regulación del crecimiento de linfocitos; tratamiento de cáncer y muchas enfermedades autoinmunitarias, y para prevenir el rechazo de trasplantes o inducir inmunidad a tumores); regulación de la hematopoyesis, por ejemplo tratamiento de enfermedades mieloides o linfoides; fomento del crecimiento de hueso, cartílago, tendón, ligamento y tejido nervioso, por ejemplo para la cicatrización de heridas, el tratamiento de quemaduras, úlceras y enfermedad periodontal y neurodegeneración; inhibición o activación de hormona estimulante del folículo (modulación de la fecundidad); actividad de quimiotáctica/quimiocinética (por ejemplo, para movilizar tipos celulares específicos a sitios de lesión o infección); actividad hemostática y trombolítica (por ejemplo, para tratar hemofilia y accidente cerebrovascular); actividad antiinflamatoria (para tratar, por ejemplo, choque séptico o enfermedad de Crohn); como antimicrobianos; moduladores de, por ejemplo, el metabolismo o comportamiento; como analgésicos; tratamiento de trastornos de deficiencia específicos; en el tratamiento de, por ejemplo, psoriasis, en medicina humana o veterinaria.

Además, o alternativamente, el vector retroviral de la presente invención puede utilizarse para suministrar uno o más NDI útil(es) en el tratamiento de los trastornos enumerados en el documento WO-A-98/09985. Para facilidad de referencia, parte de esta lista se proporciona a continuación: actividad inhibidora de células T y/o inhibidora de macrófagos y por tanto, actividad antiinflamatoria; actividad antiinmunitaria, es decir efectos inhibidores frente a una respuesta inmunitaria celular y/o humoral, incluyendo una respuesta no asociada con inflamación; inhibir la capacidad de los macrófagos y las células T para adherirse a componentes de la matriz celular y fibronectina, así como expresión del receptor fas regulada por incremento en células T; inhibir la reacción inmunitaria e inflamación no deseadas incluyendo artritis, incluyendo artritis reumatoide, inflamación asociada con la hipersensibilidad, reacciones alérgicas, asma, lupus eritematoso sistémico, enfermedades del colágeno y otras enfermedades autoinmunitarias, inflamación asociada con aterosclerosis, arteriosclerosis, enfermedad cardiaca aterosclerótica, lesión por reperfusión, paro cardiaco, infarto de miocardio, trastornos inflamatorios vasculares, síndrome de dificultad respiratoria u otras enfermedades cardiopulmonares, inflamación asociada con ulcera péptica, colitis ulcerosa y otras enfermedades del tracto gastrointestinal, fibrosis hepática, cirrosis del hígado u otras enfermedades hepáticas, tiroiditis u otras enfermedades glandulares, glomerulonefritis u otras enfermedades renales y urológicas, otitis u otras enfermedades otorrinolaringológicas, dermatitis u otras enfermedades dérmicas, enfermedades periodontales u otras enfermedades dentales, orquitis o epididimo-orquitis, esterilidad, traumatismo testicular u otras enfermedades testiculares relacionadas inmunitarias, disfunción placentaria, insuficiencia placentaria, aborto habitual, eclampsia, preeclampsia y otras enfermedades ginecológicas relacionadas inflamatorias y/o inmunitarias, uveítis posterior, uveítis intermedia, uveítis anterior, conjuntivitis, coriorretinitis, uveorretinitis, neuritis óptica, inflamación intraocular, por ejemplo, retinitis o edema macular cistoideo, oftalmia simpática, escleritis, retinitis pigmentosa, componentes inflamatorias o inmunitarias de enfermedad degenerativa del fondo de ojo, componentes inflamatorias de traumatismo ocular, inflamación ocular provocada por infección, vitreorretinopatías proliferativas, neuropatía óptica isquémica aguda, cicatrización excesiva, por ejemplo tras operación de filtración para glaucoma, reacción de inflamación y/o inmunitaria frente a implantes oculares y otros enfermedades oftálmicas relacionadas inflamatorias e inmunitarias, inflamación asociada con enfermedades o estados o trastornos autoinmunitarios en los que, tanto en el sistema nervioso central (SNC) o en cualquier otro órgano, la supresión de inflamación y/o inmunitaria sería beneficiosa, enfermedad de Parkinson, complicación y/o efectos secundarios debidos al tratamiento de la enfermedad de Parkinson, complejo de demencia relacionada con el SIDA, encefalopatía relacionada con VIH, enfermedad de Devic, corea de Sydenham, enfermedad de Alzheimer y otras enfermedades degenerativas, estados

o trastornos del SNC, componentes inflamatorias de los accidentes cerebrovasculares, síndrome pospoliomielítico, componentes inflamatorioas o inmunitarias de trastornos psiquiátricos, mielitis, encefalitis, panencefalitis esclerosante subaguda, encefalomielitis, neuropatía aguda, neuropatía subaguda, neuropatía crónica, síndrome de Guillaim-Barre, corea de Sydenham, miastenia grave, pseudotumor cerebral, síndrome de Down, enfermedad de Huntington, esclerosis lateral amiotrófica, componentes inflamatorias de compresión del SNC o traumatismo del SNC o infecciones del SNC, componentes inflamatorias de atrofias y distrofias musculares, y enfermedades relacionadas inflamatorias e inmunitarias, estados o trastornos de los sistemas nervioso central y periférico, inflamación postraumática, choque séptico, enfermedades infecciosas, complicaciones inflamatorias o efectos secundarios de cirugía, trasplante de médula ósea u otras complicaciones y/o efectos secundarios de trasplantes, complicaciones inmunitarias y/o inflamatorias y efectos secundarios de la terapia génica, por ejemplo debidos a la infección por un portador viral, o inflamación asociada con SIDA, para suprimir o inhibir una respuesta inmunitaria celular y/o humoral, para tratar o aliviar enfermedades proliferativas de monocitos o leucocitos, por ejemplo leucemia, reduciendo la cantidad de monocitos o linfocitos, para la prevención y/o el tratamiento del rechazo de injertos en casos de trasplante de células, tejido y órganos naturales o artificiales, tales como córnea, médula ósea, órganos, lentes, marcapasos, tejido de piel natural o artificial.

La presente invención también proporciona una composición farmacéutica para tratar a un individuo mediante terapia génica, comprendiendo la composición una cantidad terapéuticamente eficaz del vector retroviral de la presente invención que comprende uno o más NDI de diagnóstico y/o terapéutico(s) suministrable(s) o una partícula viral producida mediante u obtenida a partir del mismo. La composición farmacéutica puede ser para utilización por seres humanos o animales. Normalmente, un médico determinará la dosificación real que será la más adecuada para un sujeto individual y oscilará con la edad, el peso y la respuesta del individuo particular.

La composición puede comprender opcionalmente un portador, excipiente, diluyente o adyuvante farmacéuticamente aceptable. La elección del portador, excipiente o diluyente farmacéutico pueden seleccionarse con respecto a la vía de administración pretendida y la práctica farmacéutica convencional. Las composiciones farmacéuticas pueden comprender como, o además de, el portador, excipiente o diluyente cualquier aglutinante(s), lubricante(s), agente(s) de suspensión, agente(s) de recubrimiento, agentes(s) de solubilización y otros agentes portadores adecuados que pueden ayudar o aumentar la entrada viral en el sitio diana (tal como, por ejemplo, un sistema de suministro de lípidos).

Cuando sea apropiado, las composiciones farmacéuticas pueden administrarse mediante uno cualquiera o más de: inhalación, en forma de un supositorio o pesario, de manera tópica en forma de una loción, disolución, crema, pomada o polvo para espolvorear, mediante la utilización de un parche cutáneo, por vía oral en forma de comprimidos que contienen excipientes tales como almidón o lactosa, o en cápsulas u óvulos o bien solos o bien en mezcla con excipientes, o en forma de elixires, disoluciones o suspensiones que contienen agentes colorantes o aromatizantes, o pueden inyectarse por vía parenteral, por ejemplo por vía intracavernosa, por vía intravenosa, por vía intramuscular o por vía subcutánea. Para la administración parenteral, las composiciones pueden ser utilizarse de la mejor manera en forma de una disolución acuosa estéril que puede contener otras sustancias, por ejemplo suficientes sales o monosacáridos para hacer que la disolución sea isotónica con la sangre. Para administración sublingual o bucal, las composiciones pueden administrarse en forma de comprimidos o pastillas para chupar que pueden formularse de manera convencional.

El suministro de uno o más genes terapéuticos mediante un sistema de vector según la invención puede utilizarse solo o en combinación con otros tratamientos o componentes de tratamiento. Las enfermedades que pueden tratarse comprenden de manera no limitativa: cáncer, enfermedades neurológicas, enfermedades hereditarias, enfermedad cardiaca, accidente cerebrovascular, artritis, infecciones virales y enfermedades del sistema inmunitario. Los genes terapéuticos adecuados incluyen los que codifican para proteínas supresoras tumorales, enzimas, enzimas activadoras de profármacos, moléculas inmunomoduladoras, anticuerpos, moléculas similares a inmunoglobulina diseñadas mediante ingeniería, proteínas de fusión, hormonas, proteínas de membrana, proteínas

o péptidos vasoactivos, citocinas, quimiocinas, proteínas antivirales, ARN antisentido y ribozimas.

En una forma de realización preferida de un método de tratamiento según la invención, se suministra un gen que codifica para una enzima activadora de profármacos a un tumor utilizando el sistema de vector de la invención y el individuo se trata posteriormente con un profármaco apropiado. Los ejemplos de profármacos incluyen fosfato de etopósido (usado con fosfatasa alcalina Senter et al., 1988 Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 4842-4846); 5-fluorocitosina (con citosina desaminasa Mullen et al. 1994 Cancer Res. 54: 1503-1506); doxorubicina-N-p-hidroxifenoxiacetamida (con penicilina-V-amidasa (Kerr et al. 1990 Cancer Immunol. Immunother. 31: 202-206); glutamato de para-N-bis(2cloroetil)aminobenzoílo (con carboxipeptidasa G2); carbamatos de mostaza de nitrógeno con cefalosporina (con blactamasa); SR4233 (con P450 reductasa); ganciclovir (con timidina cinasa de VHS, Borrelli et al. 1988 Proc . Natl. Acad. Sci. 85: 7572-7576) profármacos de mostaza con nitrorreductasa (Friedlos et al. 1997J Med Chem 40: 12701275) y ciclofosfamida o ifosfamida (con un citocromo P450 Chen et al. 1996 Cancer Res 56: 1331-1340).

Según la invención, pueden utilizarse técnicas de biología molecular convencionales evidentes para el experto en la materia. Tales técnicas se describen completamente en la literatura. Véanse por ejemplo; Sambrook et al (1989) Molecular Cloning; a laboratory manual; Hames y Glover (1985 - 1997) DNA Cloning: a practical approach,

Volúmenes I-IV (segunda edición); se facilitan procedimientos para la modificación mediante ingeniería genética de

genes de inmunoglobulinas en McCafferty et al (1996) “Antibody Engineering: A Practical Approach”. La invención se describirá adicionalmente a continuación a título de ejemplo haciendo referencia a las figuras siguientes, en las que:

La figura 1 muestra la estructura de las unidades de transcripción de los plásmidos pESP, pONY3 y

pONY2.1nlsLacZ. La figura 2 muestra un análisis de PCR de vector de VAIE integrado. Se realizó la PCR con o bien ADN genómico de células transducidas por el vector de VAIE (carriles 1 y 5) o células transducidas de manera simulada (carriles 2 y 6). Se utilizaron pONY2.1n1sLacZ (carriles 3 y 7) y pONY3 (carriles 4 y 8) como controles. A. Detección por PCR de las LTR de VAIE. B. Detección por PCR de pol.

La figura 3 muestra la estructura de las unidades de transcripción de vector en plásmidos de deleción usados para

identificar los requerimientos de empaquetamiento para un vector de VAIE. La figura 4 muestra una predicción de la estructura secundaria para el ARN derivado de la unidad de transcripción de gag presente en pONY2.13LacZ.

La figura 5 es una representación de vectores derivados del genoma de VAIE.

La figura 6 es una representación de constructos de gagpol derivados de VAIE.

La figura 7 es una representación de un vector de VAIE que comprende una deleción de S2

La figura 8 es una representación de constructos de gagpol de VAIE que tienen delecionados los genes S2 y

dUTPasa. La figura 9 es una representación de un vector mínimo de VAIE. La figura 10 ilustra un gel que muestra un análisis de constructos de gagpol de VAIE según la invención. La figura 11 muestra los ejemplos de los vectores pONY4. La figura 12 muestra dos vectores SIN. La figura 13 es una representación de un vector con una señal de poli A dividida. La figura 14 es una representación de un vector con una señal de poli A dividida. La figura 15 es una representación de un vector con una señal de poli A dividida. La figura 16 muestra una construcción de pONY4-GFP con una señal de poli A dividida. La figurar 17 muestra una construcción de un vector de VLM/VAIE. La figura 18 muestra cebadores para la construcción de vectores de VLM/VAIE. La figura 19 muestra la secuencia completa de pONY-mouse. Las figuras 20 y 21 proporcionan el cebado de PCR. La figura 22 muestra pEMVA4 (tras PCR con los cebadores EMVA 1-8). La figura 23 muestra pEMVA4. La figura 24 muestra pEMVA5. Las figuras 25 y 26 muestran un ejemplo de estrategia de cabeza de martillo para la formación del extremo 5’. La figura 27 muestra pEMVA6. La figura 28 muestra pEMVA7 y pSyn pONY4.1. La figura 29 muestra EMVA 10/11.

La figura 30 muestra pEMVA9.

La figura 31 muestra pEMVA10.

La figura 32 muestra pLWHORSE3.1.

La figura 33 muestra pMCRev.

La figura 34 muestra pYFVSVG.

La figura 35 muestra pYFAmpho.

La figura 36 muestra constructos de MVA recombinantes.

La figura 37 muestra la secuencia completa de pSC65.

La figura 38 muestra la secuencia completa de ofpLW22

En más detalle, la figura 1. Los plásmidos usados en este estudio. La organización genómica de VAIE está indicada incluyendo sitios de donador de corte y empalme (d1, d2 y d3) y de aceptor de corte y empalme (a1, a2 y a3). También se muestran las posiciones de las LTR virales y gag, pol, env, tat, rev, S2. El plásmido pESP es un genoma de vector de VAIE que contiene el promotor de SV40 y el gen de resistencia a puromicina. El plásmido pONY3 es un plásmido de expresión de gagpol de VAIE. pONY2.1nlslacZ es un genoma de vector de VAIE que contiene un potenciador/promotor de HCMV IE y un gen de β-galactosidasa (nlslacZ).

La figura 2 muestra un análisis por PCR de vector de VAIE integrado. Se realizó la PCR con o bien el ADN genómico de células transducidas por el vector de VAIE (carriles 1 y 5) o bien células transducidas de manera simulada (carriles 2 y 6). Se utilizaron pONY2.1nlsLacZ (carriles 3 y 7) y pONY3 (carriles 4 y 8) como controles. A. Detección por PCR de las LTR de VAIE. B. Detección por PCR de pol.

Tabla 2. Transducción de células que se dividen y que no se dividen. Se trataron células 293T con afidicolina (columnas en blanco) o sin ella (columnas sombreadas) según el procedimiento de Lewis et al. (Lewis, P. F., y M. Emerman. 1994. J Virol. 68:510-6.) y luego se transdujeron con o bien el vector PONY2.1nlsLacZ de VAIE o bien el vector HIT111 de VLM (Soneoka et al 1995 Nucl. Acids Res. 23:628-633). Se tiñeron 48 horas más tarde, las células con X-gal. Se promediaron los títulos de dos experimentos independientes y se calcularon como unidades formadoras de colonias de lac Z por ml. No se produjo una variación mayor del 10% entre los experimentos.

La figura 10 muestra el análisis de la expresión de constructos de gagpol. Se separaron 30 μg de proteína celular total mediante electroforesis PAGE/SDS, se transfirieron a nitrocelulosa y se estudiaron con sonda con anticuerpos anti-VAIE. El anticuerpo secundario era anti-caballo HRP (Sigma). Se promediaron los títulos de tres experimentos independientes y se calcularon como unidades formadoras de lacZ por ml. No se produjo una variación mayor del 10% entre los experimentos. pONY2.1nlslacZ y los plásmidos de expresión de la envuelta se cotransfectaron con el gagpol de VAIE.

Ejemplo 1 - Construcción de vectores de VAIE que contienen genes gag delecionados.

Para construir un sistema de vector de VAIE incompetente en la replicación se usó, como punto de partida, un clon proviral infeccioso pSPEIAV19 (número de registro: U01866), descrito por Payne et al. (1994, J Gen Virol. 75: 4259). Se construyó un vector basado en VAIE inicial simplemente delecionando parte de env eliminando un fragmento de Hind III/Hind III correspondiente a las coordenadas 5835/6571 según el sistema de numeración de Payne et al. (ibíd.). Este fragmento se sustituyó por el gen de resistencia a puromicina bajo el control del promotor temprano de SV40 de pTIN500 (Cannon et al 1996 J. Virol. 70:8234-8240) para crear pESP (figura 1). Se produjeron disoluciones madre virales mediante transfección con fosfato de calcio de células 293T (Soneoka et al 1995 Nucl. Acids Res. 23:628-633) con pESP y pRV67 (Kim et al 1998 J. Virol. 72(1): 811-6) un plásmido en el que se expresa la glicoproteína del virus de la estomatitis vesicular (VEV-G) a partir del potenciador/promotor HCMV-IE. Alternativamente pueden utilizarse otros plásmidos de expresión de VEV-G, por ejemplo, Yee, et al 1994 PNAS 91:9564-9568. Se utilizó el sobrenadante resultante para transducir células de riñón humano (293T) y de osteosarcoma canino (D17) como se expone a continuación. Se recogió líquido de cultivo tisular 48 horas tras la transfección y se filtró a través de filtros de 0,45 !m. Se prepararon diluciones de diez veces con medio de cultivo que contenía Polybrene a 8 cg/ml y luego se pusieron alícuotas de 500 c1 sobre células D17 sembradas a 1,6 x 105/pocillo en placas de 12 pocillos el día anterior. Dos horas más tarde, se añadió 1 ml de medios de cultivo. Dos días más tarde, se añadió puromicina hasta una concentración final de 4 ug/ml y se continuó con la incubación durante 7 días más. Como control positivo, se utilizó un vector basado en el virus de leucemia murina (VLM) (pTIN500) que contenía el gen de resistencia a puromicina bajo el control del promotor temprano de SV40 junto con pHIT60 (gagpol de VLM) y pRV67 (Cannon et al 1996 J. Virol. 70:8234-8240). No se detectaron colonias con

resistencia en ningún tipo celular tras 7 días de selección de puromicina con el vector de VAIE. El vector de VLM produjo 5,0 x 104 u.f.c./ml en las células 293T y 1,0 x 104 u.f.c./ml en las células D17.

La explicación probable de este resultado es que la LTR de VAIE no es funcional en células humanas en ausencia de tat y así se producen insuficientes cantidades de los componentes críticos tales como gag-pol y tat.

Se construyó, por tanto, un sistema de vector adicional que comprendía tres unidades de transcripción para producir lo siguiente: 1) ARN de genoma de vector; 2) env y 3) gag-pol. Para garantizar que se produce lo suficiente de cada componente, se transcriben las unidades de transcripción de env y gag-pol a partir de un promotor-potenciador activo en la línea celular de empaquetamiento humana elegida. De esta manera, se produce lo suficiente de gag-pol y, lo más probablemente de tat, para garantizar una producción eficaz de partículas de vector competentes en la transducción.

El genoma de vector se construyó presentando el gen indicador dentro de la región de pol del genoma tal como sigue. El plásmido designado como pONY1 se construyó mediante la inserción de la LTR de VAIE, amplificada mediante PCR a partir de pSPVAIE 19, en pBluescript II KS+ (Stratagene). La LTR en 5’ del clon de VAIE pSPEIAV19 se amplificó por PCR utilizando pfu polimerasa con los siguientes cebadores:

5’GCATGGACCTGTGGGGTTTTTATGAGG

3’GCATGAGCTCTGTAGGATCTCGAACAGAC

El amplicón se realizó de extremos romos mediante el relleno con la proyección en 5’ y se insertó en pBluescript II KS+ cortado con Bss HII que se había hecho de extremos romos mediante la eliminación de la proyección en 3’ utilizando ADN polimerasa de T4. Este constructo se denominó pONY1 y la orientación era de 5’ a 3’ en relación con β-galactosidasa de pBluescript II KS+. La secuenciación de pONY1 no reveló mutaciones.

Se cortó pSPEIAV19DH genoma de vector con Mlu I (216/8124) y se insertó en pONY1 Mlu I cortado (216) para producir pONY2. Se llevó a cabo una digestión con Bss HII (619/792) de pBluescript II KS+ para obtener el sitio de clonación múltiple. Éste se realizó de extremos romos mediante relleno con la proyección en 5’ y se ligó a pONY2 cortado con Bgl II y Nco I (1901/4949) y se realizó de extremos romos mediante relleno con la proyección en 5’. La orientación era de 3’ a 5’ en relación con la secuencia de VAIE. Esta se denominó pONY2.1. Se creó pSPCMV mediante la inserción de pLNCX (número de registro: M28246) (Pst I/Hind III) en pSP72 (Promega). Se insertó el gen de la β-galactosidasa de pTIN414 (Cannon PM et al J. Virol. 70, 8234-8240) en pSP72 (Xho I/Sph I) para producir pSPlacZ. Se sustituyó el extremo 5’ con respecto al gen de la β-galactosidasa por la señal de localización nuclear del antígeno T de SV40 T de pAD.RSVbgal (J. Clin. Invet. 90:626-630, 1992). pAD.RSVbgal se cortó con Xho I/ Cla I y se insertó en pSPlacZ de Xho I/Cla I para producir pSPnlslacZ. La β-galactosidasa de localización nuclear y de localización no nuclear de CMV de pSPlacZ y pSPnlslacZ se cortó con Pst I y se insertó en el sitio Pst I de pONY2.1 en la orientación de 5’ a 3’ de VAIE. Éstos se denominaron pONY2.1nlslacZ y pONY2.1lacZ.

Se produjo a continuación un plásmido de expresión de gagpol de VAIE (pONY3) mediante la inserción del fragmento de Mlu I/Mlu I de pONY2ΔH en el plásmido de expresión de mamífero pCl-neo (Promega) de tal manera que el gen gag-pol se expresa a partir del promotor-potenciador hCMV-MIE. En particular, se cortó pSPEIAV19DH de gagpol con Mlu I (216/8124) y se insertó en pCI-Neo (Promega) cortado con Mlu I (216) para producir pONY3. El plásmido pONY3 no debe producir un genoma funcional porque carece de las secuencias LTR apropiadas. Se produjo el virus mediante cotransfección transitoria de tres plásmidos de células 293T con pRV67, pONY3 y pONY2.10nlsLacZ tal como se describe para los vectores basados en VLM (Soneoka et al 1995 Nucl. Acids Res. 23:628-633) y luego se utilizó para transducir células 293T y células D17 tal como sigue. 48 horas tras la transfección se recogió líquido de cultivo tisular y se filtró a través de filtros de 0,45 cm. Se prepararon diluciones de diez veces con medio de cultivo que contenía Polybrene a 8 cg/ml y se pusieron a continuación alícuotas de 500 ul sobre células D17 sembradas a 1,6 x 105/pocillo en placas de 12 pocillos el día anterior. Dos horas más tarde, se añadió 1 ml de medios de cultivo y la incubación continuó durante 48 horas antes de la evaluación de la expresión génica de LacZ utilizando el procedimiento de tinción con X-gal. para β-galactosidasa de E. coli (macGregor et al 1991 Methods in Molecular Biology Vol 7 ed EJ Murray págs. 217-235). En ambos casos, el virus transdujo las células a frecuencias de aproximadamente 105 unidades formadoras de celulas transductoras de LacZ (u.f.l.)/ml que eran aproximadamente 10 veces menores que con el vector basado en VLM producido a partir de pHIT111. Estos datos mostraron que se había producido un sistema de vector basado en VAIE y también sugirieron que la colocación del fragmento de Hind III/Hind III en env con ADN foráneo puede perturbar la función del genoma.

A continuación se caracterizó la capacidad de partículas del vector de VAIE para pseudotiparse con proteínas de la envuelta de otros virus. Se cotransfectaron pONY2.10nlsLacZ y pONY3 con plásmidos de expresión de la envuelta produciendo envueltas de VLM anfotrópicas (pHIT456) y de VLM ecotrópicas (pHIT123) (Soneoka et al 1995 Nucl. Acids Res. 23:628-633) así como VEV-G (pRV67) (tabla 1). Se cotransfectaron pHIT111 (genoma de vector de VLM) y pHIT60 (plásmido de expresión de gagpol de VLM) con los plásmidos de la envuelta como controles positivos (tabla 1). Se utilizaron los sobrenadantes virales para transducir una variedad de líneas celulares incluyendo de riñón

humano (293T), embrión murino (NIH3T3) y osteosarcoma canino (D17). Tal como se esperaba, el tropismo celular del virus estaba determinado en gran medida por la envuelta. El VAIE pudo pseudotiparse con envuelta anfotrópica, pero variaron las eficacias de transducción. El virus pseudotipado anfotrópico proporcionó títulos de aproximadamente 102 en células D17, 103 en células NIH3T3 y 104 en células 293T. El motivo de estas diferencias no se buscó. VAIE también pudo pseudotiparse con la envuelta ecotrópica de VLM y estos virus transdujeron células NIH3T3 a títulos de 104 u.f.l./ml. VAIE, pseudotipado con envuelta de VEV-G, transdujo todas las líneas celulares sometidas a prueba. El título varió entre las diferentes envueltas y tipos celulares pero las eficacias globales fueron relativamente altas para las células no murinas, pero todavía menores que con un sistema de vector murino. Tomados en conjunto, estos datos muestran que el sistema de vector de VAIE no depende de la envuelta de VAIE y puede pseudotiparse eficazmente con tres envueltas confiriéndose una amplia gama de huéspedes. Esto hace que este sistema sea generalmente útil como los sistemas basados en VLM actuales.

También puede pseudotiparse vectores de VAIE de la misma manera que utiliza la envuelta de RD114, por ejemplo utilizando pRDF (Cosset et al 1995 J. Virol. 69: 7430-7436).

Para caracterizar los acontecimientos de transducción se llevaron a cabo adicionalmente análisis por PCR de células 293T transducidas por el vector de VAIE pseudotipado con VEV-G. En particular se cuestionó si el genoma de vector, en oposición a uno recombinante con el plásmido de expresión de gagpol, pONY3, había sido el vehículo de transducción para el gen de la β-galactosidasa. La amplificación por PCR utilizando cebadores específicos para la LTR de VAIE proporcionaron el producto de PCR esperado de 310 pb cuando se utilizó ADN genómico aislado de células transducidas (figura 2A, carril 1). No se detectó producto de PCR cuando se utilizó como molde ADN de células 293T transducido de manera simulada (figura 2A, carril 2). Se utilizó pONY2.10nlsLacZ como control positivo (figura 2A, carril 3). No se detectó producto de PCR cuando se utilizó como molde pONY3 (figura 2A, carril 4). La ausencia de un producto de PCR, cuando se utilizaron cebadores específicos de pol, (figura 2B) confirmó que no se habían integrado secuencias de gagpol de pONY3 en los cromosomas del huésped. Tomados en conjunto estos datos muestran que el auténtico genoma de vector había transducido las células.

Para determinar si el vector de VAIE conservaba la capacidad para transducir células que no se dividen, se detuvieron células 293T en la fase G1/S mediante tratamiento con afidicolina según procedimientos publicados (Lewis y Emerman 1994) y luego se transdujeron con vectores basados en VAIE y basados en VLM pseudotipados con VEV-G. La eficacia de transducción del vector de VLM fue menor en cuatro órdenes de magnitud en células tratadas con afidicolina en comparación con células no tratadas. El bloqueo incompleto de la transducción celular por VLM se debió probablemente a una pequeña población de células que se dividen. En cambio, no se observó una diferencia significativa en el caso del vector basado en VAIE. Esto demuestra que el vector de VAIE, como los vectores de VIH, puede transducir eficazmente células que no se dividen.

El genoma de vector pONY2.101acZ contiene 1377 nt de gag. Se utilizó la predicción de la estructura secundaria del ARN (“http: //www.ibc.wustl.edu/-zuker/rna/”) para identificar posibles estructuras de horquilla dentro de la secuencia líder y el extremo 5’ de gag. Basándose en estas predicciones se realizaron cuatro deleciones dentro de la región de gag de pONY2.101acZ (figura 1). Se realizaron las deleciones mediante mutagénesis por PCR utilizando técnicas convencionales.

pONY2.1lacZ contiene 1377 nt de gag (delecionado desde la posición de nt 1901)

pONY2.11lacZ contiene 354 nt de gag (delecionado desde la posición de nt 878)

pONY2.12lacZ contiene 184 nt de gag (delecionado desde la posición de nt 708)

pONY2.13lacZ contiene 109 nt de gag (delecionado desde la posición de nt 633)

pONY2.14lacZ contiene 2 nt de gag (delecionado desde la posición de nt 526)

Se utilizaron estos vectores en una cotransfección de tres plásmidos tal como se describe para los vectores basados en VLM (Soneoka et al 1995 Nucl. Acids Res. 23:628-633) y se tituló el virus generado en células 293T y D17.

Se descubrió que los primeros 109 nt de la secuencia codificante de gag eran necesarios para un empaquetamiento máximo además de la región no traducida; pONY2.131acZ (tabla 2). Se encontraron títulos similares en las células D17. La estructura secundaria predicha del ARN derivado de la secuencia de gag en pONY2.131acZ se muestra en la figura 4.

Basándose en la predicción de la estructura secundaria en la figura 4, se realizaron cuatro deleciones adicionales dentro de la zona en el sentido de 5’ y en el sentido de 3’ del codón donador principal de corte y empalme en pONY2.131acZ.

pONY2.211acZ contiene deleción entre las posiciones de nt 409 a 421 pONY2.221acZ contiene deleción entre las posiciones de nt 424 a 463

pONY2.231acZ contiene deleción entre las posiciones de nt 470 a 524

5 pONY2.241acZ contiene deleción entre las posiciones de nt 529 a 582

pONY2.251acZ contiene deleción entre las posiciones de nt 584 a 645

pONY2.261acZ contiene una deleción entre las posiciones de nt 409 a 421 y entre las posiciones de nt 470 a 542.

10 Se utilizaron estos vectores en una cotransfección de tres plásmidos tal como se describió anteriormente y se tituló el virus generado en las células D17. Se descubrió que las deleciones dentro de esta región afectaban gravemente al título del virus (tabla 3). Los constructos pONY2.23 y 2.26 proporcionaron el título menor. Estos dos contenían la deleción entre las posiciones de nt 470 a 524. La deleción menos grave fue entre las posiciones de nt 409 a 421.

15 Basándose en esta información la región alrededor del donador principal de corte y empalme es útil para un empaquetamiento óptimo.

Pueden utilizarse predicciones de estructura secundaria y análisis de deleción similares para identificar la señal de empaquetamiento en otros lentivirus que no son de primate. 20 TABLA 1. Eficacia de transducción de vectores virales.

Título (u.f.l./ml)a

Vector Envuelta D17

NIH3T3

293T pONY2.1nlslacZ Simulada

< 1

< 1

< 1 pONY2.1nlslacZ pHIT456 (MLVamp)

1,0 x 102

8,4x102

2,0 x 104 pONY2.1nlslacZ pHIT123 (MLVeco)

< 1

1,5 x 104

< 1 pONY2.1nlslacZ pRV67 (VEVG)

1,0 X 105 3,6 X 103

2,0 X 105 pHIT111 Simulada

< 1 < 1

< 1 pHIT111 pHIT456 (MLVamp)

1,3 x 105 2,6 x 106

2,0 x 107 pHIT111 pHIT123 (MLVeco)

< 1 2,8 x 106

< 1 pHIT111 pRV67 (VEVG)

3,0 X 106

2,0 X 105

5,0 X 106 aCada tipo celular se transdujo y se tiñó para determinar la actividad de �galactosidasa 48 horas tras la transducción de las células diana. Se promediaron los títulos de tres experimentos independientes y se calcularon como unidades formadoras de Z por ml. No se produjo una variación mayor del 10% entre los experimentos. pONY2.1nlsLacZ y los plásmidos de expresión de la envuelta se cotransfectaron con el plásmido de expresión de gagpol de VAIE (pONY3). pHIT111 y los plásmidos de expresión de la envuelta se cotransfectaron con el plásmido de expresión de gagpol de VLM (pHIT60).

Tabla 2

Genoma de vector

Título (u.f.l/ml)

PONY2.10

3,30E+04

PONY2.11

1,60+05

PONY2.12

1,40+05

PONY2.13

1,70E+05

PONY2.14

5,40E+02

Simulado

1,0E+01

Tabla 3 15

Genoma de vector

Título (u.f.l./ml)

2.21

1,20E+04

2.22

3,80E+03

2.23

1,20E+02

2.24

5,20E+02

2.25

5,60E+02

2.26

1,00E+02

2.13

4,00E+04

Ejemplo 2 - Construcción de pEGASUS-1

Se produjo un vector basado en VAIE (pEGASUS-1) que contenía sólo 759 nt de secuencias de VAIE (nt 268 - nt 675 y nt 7942 - nt 8292) tal como sigue.

Se obtuvieron secuencias que comprenden el tramo de polipurina (PPT) de VAIE y la LTR en 3’ mediante amplificación por PCR a partir de pONY2.10LacZ utilizando los cebadores PPTVAIE+ (Y8198): GACTACGACTAGTGTATGTTTAGAAAAACAAGG, y 3’NEGSpeI (Y8199): CTAGGCTACTAGTACTGTAGGATCTCGAACAG. Se purificó el producto, se digirió con SpeI (ACTAGT) y se ligó en pBS II KS+ que se había preparado mediante digestión con SpeI y tratamiento con fosfatasa alcalina. Se seleccionaron con XL-lBlue las colonias obtenidas tras transformación en E. coli, para determinar la presencia de la LTR en 3’ en la orientación en la que la región U5 de la LTR en 3’ estaba próxima al sitio NotI del ligador pBS II KS+. Se determinó la secuencia del inserto clonado y mostró que sólo contenía un cambio con respecto al clon de VAIE pSPEIAV19 (AC: U01866). Ésta era una inserción de ’C’ inserción entre las bases 3 y 4 de la región R. Se encontró el mismo cambio en el molde utilizado en la reacción de PCR. El clon se denominó pBS.LTR en 3’.

A continuación se introdujo el casete del gen indicador, promotor de CMV/LacZ, en el sitio PstI de pBS.LTR en 3’. Se obtuvo el casete CMV/LacZ como un fragmento de PstI de pONY2.10LacZ (véase anteriormente). La reacción de ligamiento para unir los fragmentos anteriores se transformó en E. coli, XL-1Blue. Se evaluaron varios clones en los que el inserto de CMV/LacZ estaba orientado de modo que el gen LacZ estaba próximo a la LTR en 3’ para determinar la actividad del casete CMV/LacZ mediante transfección en la línea celular 293T utilizando procedimientos convencionales. Se seleccionó un clon que proporcionó células azules 48 horas tras la transfección tras el revelado con X-gal para su utilización adicional y se denominó pBS CMVLacZ.3’LTR.

La región en región del vector de VAIE se construyó en el vector de expresión pCIEneo que es un derivado de pCIneo (Promega) modificado mediante la inclusión de aproximadamente 400 pares de bases derivados del extremo 5’ del promotor completo de CMV tal como se definió anteriormente. Este fragmento de 400 pares de bases se obtuvo mediante amplificación por PCR utilizando los cebadores VSAT1 (GGGCTATATGAGATCTTGAATAATAAAATGTGT) y VSAT2 (TATTAATAACTAGT) y pHIT60 como molde. Se digirió el producto con BgIII y SpeI y se ligó en pCIneo que se había digerido de manera similar.

Se amplificó un fragmento del genoma de VAIE que discurría desde la región R hasta el nt 150 de la región codificante de gag (nt 268 a 675) con los cebadores CMV5’EIAV2 (Z0591)(GCTACGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGGGCACTCAGATTCTG: y 3’PSI.NEG (GCTGAGCTCTAGAGTCCTTTTCTTTTACAAAGTTGG) utilizando como ADN molde. La región en 5’ del cebador CMV5’EIAV2 contiene las secuencias inmediatamente en el sentido de 5’ del sitio de inicio de la transcripción del promotor de CMV y puede cortarse con SacI. 3’PSI.NEG se une en 3’ con respecto a las secuencias de empaquetamiento de VAIE tal como se define mediante análisis de deleción (anteriormente) y contiene un sitio XbaI. Se cortó el producto de PCR con SacI y XbaI y se ligó en pCIEneo que se había preparado para ligamiento mediante digestión con las mismas enzimas. Esta manipulación coloca el inicio de la región R de VAIE en el punto de inicio de la transcripción del promotor de CMV y, por tanto, los transcritos producidos comienzan en la posición de inicio genuina utilizada por VAIE y se extienden hasta el lado en 3’ de la señal de empaquetamiento. Se secuenciaron los clones que parecieron ser correctos tal como se evaluó mediante análisis de restricción. Se seleccionó un clon denominado pCIEneo.5’VAIE para el trabajo adicional.

En la siguiente etapa, se introdujo el casete CMVLacZ y LTR en 3’ en pBS.CMVLacZ.3’LTR en pCIEneo. 5’VAIE. Se digirió pBS.CMVLacZ.3’LTR con ApaI, se eliminaron las proyecciones en 3’ con ADN polimerasa de T4, luego se digirieron con NotI. Se purificó el fragmento que contenía CMVLacZ.3’LTR mediante técnicas de biología molecular convencionales. Se preparó el vector para ligamiento con este fragmento a partir de pCIEneo.5’VAIE mediante digestión con SalI, seguido por relleno de las proyecciones en 5’ utilizando ADN polimerasa de T4. Luego se digirió el ADN con NotI y se purificó antes de su utilización en reacciones de ligamiento. Tras la transformación en E. coli, XL-1Blue se seleccionaron colonias por la presencia del inserto mediante análisis de restricción para identificar el clon requerido, designado como pEGASUS-1. Se comparó la función del vector de VAIE pEGASUS-1 v con pONY2.10LacZ utilizando el sistema de cotransfección de tres plásmidos tal como se describe en el ejemplo 1. Se obtuvieron títulos comparables a partir de ambos vectores, lo que indica que pEGASUS-1 contiene todas las secuencias requeridas para el empaquetamiento con buena eficacia.

Ejemplo 3- Introducción de RRE en vectores de VAIE

Puede realizarse mejoras adicionales al vector de VAIE pEGASUS-1 mediante la introducción de elementos adicionales para mejorar el título. Un sitio conveniente para la introducción de tales elementos es el sitio SalI que se encuentra entre XbaI en 3’ de la señal de empaquetamiento y en sentido de 5’ del casete CMV/LacZ de pEGASUS

1. Por ejemplo pueden insertarse RRE de VIH o VAIE en este sitio.

Se obtuvo RRE de VIH-1 a partir del clon molecular de VIH-1, pWI3 (Kimpton y Emerman 1992 (J. Virol. 66: 22322239) mediante amplificación por PCR utilizando los cebadores RRE(+)

GTCGCTGAGGTCGACAAGGCAAAGAGAAGAG y RRE(-) GACCGGTACCGTCGACAAGGCACAGCAGTGG. Se digirieron el fragmento de ADN y pEGASUS-1 con SalI y tras ligamiento, se transformaron en E. coli, XL-1 Blue. Se seleccionaron las colonias por la presencia del RRE de VIH y se utilizaron dos clones, con el RRE de VIH en la orientación o bien positiva o bien negativa, para el trabajo adicional. Estos vectores, pEGASUS-2.HIV RRE(+) o pEGASUS-2.HIV RRE(-) pueden someterse a prueba en células 293T llevando a cabo una cotransfección de cuatro plásmidos en la que el plásmido pCIneoHIVrev, que expresa la proteína rev de VIH-1 se cotransfecta con los plásmidos de vector, pONY3 y pRV67.

Se obtuvo el RRE de VAIE tal como se definió anteriormente (Martarano et al 1994) mediante amplificación por PCR tal como sigue. Utilizando pONY2.10LacZ como molde, se realizaron 2 amplificaciones para obtener las dos partes del RRE de VAIE. Se obtuvo el elemento en 5’ utilizando los cebadores ERRE1 (TTCTGTCGACGAATCCCAGGGGGAATCTCAAC) y ERRE2 (GTCACCTTCCAGAGGGCCCTGGCTAAGCATAACAG) y el elemento en 3’ con ERRE3 (CTGTTATGCTTAGCCAGGGCCCTCTGGAAGGTGAC) y ERRE4 (AATTGCTGACCCCCAAAATAGCCATAAG). Estos productos se hibridarán entre sí, por lo que pueden utilizarse en una segunda reacción de PCR para obtener un ADN que ‘codifica para’ el RRE de VAIE. Se establece la amplificación por PCR con los cebadores ERRE1 y ERRE4 para los primeros 10 ciclos y luego estos cebadores se añaden a la reacción y se llevan a cabo 10 ciclos de amplificación adicionales. Se digirieron el producto de PCR resultante y pEGASUS-1 con SalI, se ligaron y se transformaron en E. coli XL-1Blue. Se seleccionaron los clones en los que el RRE de VAIE estaba en cualquiera de las orientaciones positiva o negativa para el trabajo adicional. Se evaluó la actividad de estos vectores en cotransfecciones de 4 vías y pEGASUS-1, se digirieron con SalI, se ligaron y se transformaron en E. coli XL-1Blue. Se seleccionaron lo clones en los que el RRE de VAIE estaba en cualquiera de las orientaciones positiva o negativa para el trabajo adicional. Se evaluó la actividad de estos vectores en cotransfecciones de tres plásmidos, (suministrándose rev de VAIE por pONY3) o en experimentos de cotransfección de 4 plásmidos tal como se describió anteriormente, pero utilizando pCIneo.VAIE Rev para suministrar rev de VAIE adicional.

Para la construcción de pCIneo EIAV REV, se derivaron las secuencias codificantes de REV de VAIE mediante amplificación por PCR. Se obtuvieron las secuencias de REV de VAIE utilizando un procedimiento de amplificación por PCR de “solapamiento” de dos etapas tal como se describió anteriormente para el RRE de VAIE. El molde para

las

dos reacciones era pONY3 y los cebadores para el fragmento en 5’ eran EIAV REV5’0

(CCATGCACGTCTGCAGCCAGCATGGCAGAATCGAAG)

y EAIV REV IN

(CCTGAGGATCTATTTTCCACCAGTCATTTC)

y para el producto en 3’ EIAV REV IP

(GTGGAAAATAGATCCTCAGGGCCCTCTGG)

y EIAV.REV3’0

(GCAGTGCCGGATCCTCATAAATGTTTCCTCCTTCG). Se llevó a cabo la segunda amplificación por PCR con los cebadores EIAV REV5’O y EIAV REV3’O que se añadieron tras 10 ciclos. Se ligó el producto resultante con el vector de clonación del fragmento de PCR ‘TA’ pCR2.1 (Invitrogen) se evaluó la orientación del inserto de REV de VAIE mediante análisis con enzimas de restricción y se confirmó la presencia de la secuencia de REV de VAIE correcta. El constructo se denominó pTopoRevpos. Se cortó el inserto de REV de VAIE de pTopoRevpos mediante digestión con SpeI y NotI y se ligó en pCIneo que se había digerido con NheI y NotI.

Ejemplo 4 - Transducción de macrófagos humanos

Se obtuvieron monocitos humanos primarios a partir de sangre enriquecida en leucocitos (del National Blood Transfusion Service, Southmead Rd Bristol, RU) como se expone a continuación. Se enriquecieron células mononucleares de sangre periférica (CMSP) mediante centrifugación sobre un gradiente discontinuo de Ficoll (Pharmacia) según las instrucciones del fabricante. Se obtuvieron macrófagos a partir de esta población celular mediante adherencia al plástico del cultivo tisular durante 7 días en medio RPMI 1640 (modificación holandesa; Sigma) que contenía el 2% de suero AB humano inactivado por calor (Sigma) o el 10% de FCS (Sigma). Se eliminaron las células no adherentes mediante lavado externo de las placas con medio.

Se obtuvo el virus para los experimentos de transducción mediante cotransfección de tres plásmidos en células 293T. El vector para los experimentos era un derivado de pONY2.13 en el que el casete indicador de CMV/LacZ se había sustituido por CMV/proteína fluorescente verde (GFP).

Se produjo el vector pONY2.13GFP tal como sigue. Se cortó la secuencia que codifica para la GFP desplazada al rojo y las señales de traducción eucariotas de pEGFP-N1 (Clontech “http://www.clontech.com/”) con BglII y XbaI y se ligó en el vector de clonación general pSP72 (Promega) que se había preparado mediante digestión con las mismas enzimas. Luego se cortaron las secuencias codificantes de GFP utilizando XhoI y se ligaron en pONY2.13 que se había cortado con XhoI (liberando de ese modo la región codificante de LacZ). Tras la transformación en E. coli, XL1Blue se determinaron los clones en los que la orientación del inserto de GFP con respecto al promotor de CMV era tal que se esperaría la expresión, se confirmaron el análisis de restricción y la expresión de GFP mediante transfección de ADN en células 293T.

Se recuperó el vector mediante cotransfección de tres plásmidos en células 293T y se recogió a las 42-48 horas tras la transfección: se filtró el líquido de cultivo tisular en 0,45(m y luego se sedimentó el virus mediante centrifugación a

50.000 g (20 Krpm), durante 90 minutos a 4(C en un rotor SW40Ti. Se resuspendió el virus en 50-100 (1 de medios

completos durante 2 horas y luego se utilizó en experimentos de transducción. Se llevaron a cabo transducciones con el vector pONY2.13GFP tal como sigue. Se lavaron macrófagos, sembrados a 5 x 105 por pocillo de placas de 48 pocillos una vez con medio y luego se volvieron a poner 300(1 de medio sobre las células. Se añadió el virus al medio y se pipeteó suavemente hasta 2-3 veces para garantizar el mezclado. Se evaluó la eficacia de transducción a los 3-5 días tras la transducción. Se determinó el número de macrófagos traducidos utilizando un microscopio de fluorescencia. Puede monitorizarse la expresión de GFP durante periodos prolongados, por ejemplo, de hasta varias semanas. Alternativamente, pueden llevarse a cabo las transducciones con vectores que llevan el marcador LacZ. En tales experimentos, se evalúa la frecuencia de transducción detectando la presencia de β-galactosidasa utilizando procedimientos inmunológicos.

Ejemplo 5 - Introducción de vectores de VAIE in vivo en cerebro de rata

Se anestesiaron ratas Wistar adultas con una disolución que contenía 1 parte de Nembutal (0,1ml /35 g de peso corporal) 1 parte de Novetal (0,1 ml/35 g de peso corporal) y 2 partes de dH2O, y se pusieron en un aparato estereotáxico. Se realizó una incisión en la línea media a lo largo de la longitud rostral a caudal del cuero cabelludo y se retiró hacia atrás la piel para exponer el cráneo. Utilizando coordenadas esterotáxicas (medidas desde el bregma) de 3,00 mm posteriores y 3,00 laterales, se perforó un orificio de 1 mm de diámetro en el cráneo. Luego se realizaron inyecciones intracorticales unilaterales de vectores de VAIE utilizando una jeringa Hamilton 10 !l o un capilar de vidrio fino de 1,0 !l hasta diversas profundidades desde la superficie del cerebro. Se dejó la jeringa en su sitio durante 5 min. más para impedir el reflujo. Los animales control recibieron una única inyección intracortical de 10 !l de solución salina con la jeringa Hamilton o 1,0 !l con el capilar de vidrio fino. Luego se suturaron los animales y se dejó que se recuperasen. Cuarenta y ocho horas después, estos animales se anestesiaron profundamente tal como se describió anteriormente y se les perfundió a través del corazón 200 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS). Luego se diseccionaron los cerebros, se congelaron en isopentano enfriado con hielo seco (-30ºC) y se cortaron de manera coronal a 10 !m con un criostato. Se recogieron cada 5ª sección a través del sitio de la inyección y a 2 mm rostral y caudal sobre portaobjetos Super-Frost, se fijaron y o bien se tiñeron con Xgal o se inmunotiñeron o bien se tiñeron con violeta de cresilo.

Ejemplo 6 - Transducción de células bronquiales diferenciadas en cultivo

Pueden diferenciarse células epiteliales para formar monocapas similares al epitelio que presentan (> 1000 Ocm3) resistencia eléctrica y una morfología cuboide. Existen varias manera para hacer esto, por ejemplo, Fuller et al 1984. Esto crea células polarizadas. Esta polaridad es funcional e imita a las células epiteliales in vivo. Por tanto pueden utilizarse vectores de VAIE para transducir estas células a través de o bien la superficie basolateral o bien la superficie apical utilizando vectores y preparaciones tal como se describen en el ejemplos 1-3.

Ejemplo 7 – Un sistema de VAIE mínimo

Para eliminar el riesgo de que los genes auxiliares o secuencias codificantes presenten efectos perjudiciales en las aplicaciones terapéuticas, se construyen sistemas de sistemas de vector que carecen de tat, S2 y la dUTPasa

Construcción de mutantes de S2

A) Genoma de vector

pONY2.13lacZ contiene 109 nt de gag (delecionado desde las posiciones de nucleótido 633 a 4949) (pONY2.13lacZ se describió anteriormente). Este vector se utiliza para producir un genoma de vector de VAIE del que se elimina la expresión de S2 mediante deleción desde las posiciones de nucleótido 5345 a 5397. Esto elimina el codón de iniciación ATG de S2 y el codón de iniciación de env. Para producir la deleción dentro de S2, se lleva a cabo PCR con SY2/SY5 y SY3/SY4 utilizando pONY2.13 ADN como molde. Se combinan los dos productos de PCR y se lleva a cabo PCR con los cebadores SY5 y SY3. Se liga el producto de 1,1 kb en pGEMT-easy (Promega) para producir pGEMS2 y se secuencia para confirmar la deleción. Se produce pONY2.13lacZDS2 cortándolo de la región de S2 de 1,1 kb de pGEMS2 con Cel II y ligándolo en pONY2.131acZ.

B) Constructo de gagpol

Se deleciona la misma región de S2 en pONY3 para impedir la recombinación entre pONY3DS2 y pONY2.13DS2 que reconstituye el gen S2. Se produce pONY3DS2 mediante amplificación por PCR con SYI/SY2 y SY3/SY4 utilizando pONY3 ADN como molde. Se combinan los dos productos de PCR y se lleva a cabo PCR con los cebadores SY1 y SY3. se liga el producto de 0,7 kb en pGEMT-easy (Promega) para producir pGEMS22 y se secuencia para confirmar la deleción. Se corta la región codificante de S2 de 0,7 kb de pGEMS22 con Not I y se inserta en pBluescript KS+ (Stratagene) para producir pBPCRS2. Se inserta el fragmento de Eco RV y Nco I de pONY3 (2,2 kb) en pBPCRS2 cortado con Eco RV y Nco I para producir pBpONYS2. Éste se corta luego con Eco RV y Cel II (fragmento de 2,9 kb) y se inserta en pONY3 cortado con Eco RV y Cel II para producir de ese modo pONY3DS2.

Construcción de mutante de dUTPasa

Se produce pONY3DdUTPase mediante mutagénesis dirigida al sitio del nucleótido 4176 de un residuo T a uno A (Payne et al., Virology, 210:302-313). Esto muta el ácido aspártico en un ácido glutámico. Esto se realiza mediante amplificación por PCR utilizando los cebadores de PCR dUTPaseF y dUTPaseR. El ADN molde es pONY3. El producto de PCR se inserta en pGEMT-easy y se secuencia para confirmar la mutación. Se denomina pGDdUTPase. pONY3 se corta con Not I y Eco RV (4,6 kb) y se inserta en pBluescript KS+ (Stratagene) para producir pBEV. pGDdUTase se corta con Pac I y Pst I y se inserta la banda de 0,4 kb se inserta en pBEV cortado con Pac I y Pst I. Se denomina pONY3pBDUTPase. Éste se inserta luego en pONY3 mediante Not I y Eco RV (4,6 kb) para producir pONY3DdUTPase.

Construcción del doble mutante de S2 y dUTPasa

Para producir el doble mutante de pONY3, se utiliza el constructo pBpONYS2. pGDdUTPase se corta con Pac I y Pst I y el fragmento insertado en pBpONYS2 se corta con Pac I y Pst I para producir el constructo pS2DdUTPase. Éste se corta luego con Eco RV y Cel II y se inserta en pONY3 cortado con Eco RV y Cel II para producir pONY3DS2DdUTPase.

Análisis de los mutantes de S2 y dUTPasa

Se utilizan los vectores pONY2.131acZDS2, pONY3DdUTPase y pONY3DS2DdUTPase en varias combinaciones en cotransfecciones de tres plásmidos para generar el virus tal como se describe para los vectores basados en VLM (Soneoka et al 1995 Nucl. Acids Res. 23:628-633) y se titula el virus generado en las células 293T y D17, en estados de división o de no división. Se detienen las células en la fase G1/S mediante tratamiento con afidicolina (9) y luego se transducen con vectores basados en VAIE y basados en VLM pseudotipados con VEV-G (tabla 4). La eficacia de transducción del vector de VLM es menor en cuatro órdenes de magnitud en células tratadas con afidicolina en comparación con células no tratadas. El bloqueo incompleto de la transducción celular por VLM se debe probablemente a una pequeña población de células que se dividen. En cambio, no se observó una diferencia significativa en el caso de vectores basados en VAIE. Esto demuestra que el sistema basado en VAIE no requiere ni S2 ni dUTPasa ni para la producción ni la transducción. Payne et al., (Payne et al., Virology, 210:302-313) y otros han mostrado que se requiere dUTPasa de VAIE para la infección de macrófagos de caballo. Esto puede representar una restricción en la infección de macrófagos por VAIE.

Se someten a prueba las propiedades de los mutantes de S2 y dUTPasa mediante transducción de células neuronales hipocámpicas embrionarias de 14 días cultivadas en medios mínimos durante 7 días. No se encuentra una diferencia significativa entre los diversos vectores de VAIE. Sin embargo se observa una eficacia de transducción muy reducida para el vector de VLM. Esto indica que no se requiere S2 ni dUTPasa para la transducción de células que no se dividen fisiológicamente.

En resumen, se concluye que no se requieren tat, S2 ni dUTPasa en ninguna parte del sistema de vector para la producción o transducción del vector.

Ejemplo 8 - Adición de Rev/RRE

Se ha descrito anteriormente la construcción de pEGASUS-1. Este vector contiene 759 pb de la secuencia de VAIE. La introducción del RRE de VAIE (0,7 kb) en pEGASUS-1 para producir pEGASUS/RRE dio como resultado un aumento de cuatro veces en el título cuando se proporciona Rev en trans (tabla 2). Este vector contiene entonces 1,47 kb de VAIE.

Ejemplo 9 - Construcción de plásmidos de expresión de gagpol mejorados

En pONY3 existe una región no traducida en 5’ extendida antes del inicio de la secuencia codificante de gagpol. Es probable que esta secuencia inusualmente larga comprometa la expresión del casete gagpol. Para mejorar la expresión de gagpol, se modifica pONY3 para eliminar la LTR en 5’ restante. Esto se realiza cortando pONY3 con Nar I y Eco RV. Se inserta el fragmento de 2,4 kb en pBluescript KS+ (Stratagene) en sitios Cla I y Eco RV para producir el constructo pBSpONY3.0. pBSpONY3.0 se corta con Xho I y Eco RV. Se inserta el fragmento de 2,4 kb en pONY3 en Xho I y Eco RV para producir pONY3.1.

Esta manipulación elimina la LTR en 5’ hasta el sitio Nar I dentro de la región de unión a cebadores (nt 386). Este constructo proporciona un aumento de dos veces en el título y un aumento de la expresión de la proteína (figura 10).

El pONY3.1 como pONY3 codifica para gag, gagpol, Tat, S2 y Rev. Puesto que los experimentos de mutación de S2 mostraron que no se requiere S2 ni en el sistema de producción ni en el genoma de vector de VAIE es posible diseñar un constructo de expresión de gagpol sin S2. Se producen dos de tales constructos, pHORSE y pHORSE3.1.

Se produce pHORSE mediante amplificación por PCR con EGAGP5’OUTER/EGAGPINNER3 y EGAGP3’OUTER/ EGAGPINNER5 utilizando pONY3 como ADN molde. Se purifican los dos productos de PCR, se combinan y vuelven a amplificarse utilizando cebadores EGAGP5’OUTER /EGAGP3’OUTER. Este producto se inserta en los sitios Xho I y Sal I de pSP72 para producir pSP72EIAVgagpolO’lap. pONY 3 se corta con Pvu II y Nco I y se inserta el fragmento de 4,3 kb en pSP72EIAVgagpolO’lap cortado con Pvu II y Nco I para producir pSPEGP. Éste se corta con Xho I y Sal I (4,7 kb) y se inserta en pCI-Neo en los sitios Xho I y Sal I. Este constructo se denomina pCIEGP. Se corta el RRE de pEGASUS con Sal I (0,7 kb) y se inserta en el constructo pCIEGP en el sitio Sal I para producir pHORSE.

Cuando se somete a ensayo este constructo para determinar la expresión de la proteína en presencia o ausencia de pCI-Rev (un constructo que expresa el marco de lectura abierto de Rev de VAIE, véase anteriormente) se encuentra que depende de Rev tal como se esperaba. Sin embargo, la expresión de la proteína es mucho menor que a partir de pONY3.1. Además cuando se utiliza en la producción del virus se encuentra que el título es 100 veces menor que a partir de pONY3.1.

Inesperadamente, cuando se inserta la secuencia líder (que comprende secuencias del extremo de U5 de la LTR en 5’ con respecto al inicio de ATG de gag nt 383 - 524) de pONY3.1 en pHORSE, para producir pHORSE3.1, la expresión de la proteína y la producción de virus mejoraron. Se produce pHORSE3.1 sustituyendo el Xho I/Xba I de 1,5 kb de pHORSE por el Xho I/Xba I de 0,6 kb de pONY3.1. Los títulos obtenidos con pHORSE3.1 son similares a los de pONY3.1. El motivo para el título ligeramente menor de pHORSE3.1 en comparación con pONY3.1 puede deberse al requisito para una cotransfección de cuatro plásmidos con pHORSE3.1 (debido a la dependencia de Rev de este sistema). Puede concluirse por tanto que un sistema de vector de VAIE mínimo debe presentar esta secuencia líder para una máxima expresión de gagpol.

Cuando se utilizan pHORSE3.1, pRV67, pCIRev y pEGASUS/RRE en una cotransfección de cuatro plásmidos (tabla 6) se produce virus con un alto título (2.0 x 104 u.f.l./ml). Este sistema carece del segundo exón de Tat que es responsable de la transactivación de Tat (Southgate et al., J. Virology, 1995, 69:2605-2610). Esto demuestra que no se requiere Tat para el sistema de vector basado en VAIE.

Modificando mediante ingeniería genética la estructura principal de pHORSE3.1 para expresar Rev (sustituyendo el marco de lectura abierto de Neo por el de Rev de VAIE) se eliminó el requisito de una cotransfección de cuatro plásmidos. Esto se realizó cortando pCI-Neo con Stu I y Bst XI y rellenando en las proyecciones en 5’ con ADN polimerasa de T4. Esto produjo un fragmento de vector de 4,6 kb en el que se insertó el marco de lectura abierto de Rev de pTopoRevpos (cortado con Sac I y Xba I proporcionando una banda de 0,6 kb en la que se rellenaron las proyecciones en 5’ utilizando ADN polimerasa de T4). Éste se denominó pCREV. Se cortó el marco de lectura abierto de gagpol de VAIE que incluye el RRE y la secuencia líder de pHORSE3.1 con Xho I y Not I (5,5 kb) y se insertó en pCREV en los sitios Xho I y Not I para producir pEGPR3.1.

La optimización de codones del gagpol de VAIE debe eliminar la dependencia de la expresión de la proteína gagpol en el sistema RRE/Rev. La necesidad de pEGASUS-1 para Rev/RRE también puede eliminarse utilizando un sistema de exportación de ARN heterólogo tal como el elemento de transporte constitutivo (CTE, constitutive transport element) del virus del mono Mason-Pfizer (VMMP) (Bray et al., PNAS, 1994, 91:1256-1260, Kim et al., 1998)

Tabla 4

Vector gagpol Título en las células D17 Razón

(u.f.l./ml) (Sin división/en división)

En división Sin división

S2+ S2+, dUTPasa+ 2,2 x105 1,1 x 105 0,5

S2-S2+, dUTPasa+ 1,5x 105 1,3 x 105 0,9

S2-S2-, dUTPasa+ 1,0 x 105 1,2 x 105 1,2

S2-S2-, dUTPasa- 1,5 x 105 1,6 x 105 1,1

S2+ S2-, dUTPasa+ 2,2 x 105 2,3 x 105 1,0

S2+ S2-, dUTPasa- 1,5 x 105 1,4 x 105 1,0

S2+ S2+, dUTPasa- 1,5 x 105 1,4 x 105 1,0

Vector de VLM 1,2 x 107 6,7 x 103 0,0006

Simulado < 1 < 1 1

Tabla 5

Comparación de pONY2.10LacZ y pEGASUS +/- RRE de VAIE.

Genoma de vector

Gagpol Título (u.f.l./ml)

pONY2.10LacZ pEGASUS pEGASUS/RRE

pONY3.0 pONY3.0 pONY3.0 7 x 104 2,2 x 104 8,6 x 104

Los títulos con Rev son mayores para pEGASUS-1 aunque no presenta RRE. Posiblemente, el efecto de REV es mediante expresión potenciada de gagpol.

Tabla 6.

Genoma de vector

Gagpol Título (u.f.l./ml)

pONY2.11lacZ

pONY3.1 1,7 x 105

pONY2.11lacZ

pHORSE3.1 9,0 x 104

pEGASUS/RRE pEGASUS/RRE

pONY3.1 pHORSE3.1 8,0 x 104 2,0x 104

Se llevaron a cabo transfecciones en células 293T con pCI-Rev y pRV67. El virus se tituló en las células D17 10 Cebadores

SY5: ACCC CGTACG TCT TCC CGA GCG (Sun I subrayado) 15 dUTPaseF: GTTATTAATTAATGGAGGAATAATTGAAGAAGGATATAC (Pac I subrayado)

(La base en negrita es el cambio de una sola base de T a A que inactivaba la dUTPasa).

dUTPaseR: TCTTCTGCAGGTCCTGATCCTTGCTTAGTGC (Pst I subrayado)

5 S2StopR: GACCATGTTACCCCTTTACCATTAACTCCCTAATATCAAAC (Las bases en negrita son los cambios de base de TATGG a TTAGG que eliminan el codón de iniciación de S2).

S2StopF: GTAAAGGGGTAACATGGTCAGCATCGCATTCTACGGGGGAATCC (La base en negrita es el cambio de base de TATGG a TACGG que elimina el codón de iniciación de S2).

10 EGAGP5’OUTER: CCATGCACGTCTCGAGCCAGCATGGGAGACCCTTTGAC (Xho I subrayado) EGAGP3’OUTER: CGAGCTAGAGGTCGACTCAATTTGGTTTATTAGTAAC (Sal I subrayado)

EGAGPINNER3: GCAATGGAATGACATCCCTCAGCTGCCAGTCC (Pvu II subrayado) 15 EGAGPINNER5: GGGATGTCATTCCATTGCCACCATGGGAAGTATTTATCACTA (Nco I subrayado)

Ejemplo 10 - serie de vectores pONY4

20 Para eliminar la utilización de Tat para la transcripción del genoma de VAIE y aumentar la cantidad de transcrito de longitud completa se sustituyó U3 de VAIE (LTR en 5’) por el potenciador/promotor de HCMV como en el caso de los vectores pEGASUS (ejemplo 2).

Construcción de plásmidos.

25 pONY2.111acZ contiene una deleción en gag de tal manera que sólo permanecen 373 pb del ORF de gag. Se preparó pONY4 sustituyendo la LTR en 5’ con la LTR de CMV de pEGASUS-1. pEGASUS-1 se cortó con Bgl II/Xho I liberando un fragmento de 3,2 kb (que contenía la LTR de CMV) que se insertó en pSP72 cortado con Bgl II/Xho I. Este constructo se denominó pSPPEG213. Éste se cortó con Hpa I/Nar I y se insertó el fragmento de 1,3 kb (que

30 englobaba la LTR de CMV) en pONY2.111acZ cortado con Nae I/Nar I. pONY4.1 contiene una deleción (2,1 kb) en el sentido de 3’ del gen lacZ (entre los sitios Sfu I y Sal I) de tal manera que tat, S2, env, rev y RRE, o bien faltan o bien están gravemente truncados (figura 11 c). Se produjo pONY4.1 cortándolo con Sfu I/Sal I, se realizó de extremos romos mediante polimerasa Klenow y volvió a ligarse. Se produjo pONY4G sustituyendo el gen lacZ de pONY4 (Sac II/Kpn I y luego haciéndolo de extremos romos con polimerasa Klenow) por el de GFP de pEGFP-N1

35 (Clontech) (Bam HI/Xba I y luego haciéndolo de extremos romos) como un fragmento romo.

Producción y ensayo de vectores.

Se generaron disoluciones madre de vector mediante transfección con fosfato de calcio de células de riñón humano

40 293T sembradas en placas de 10 cm con 16 cg de plásmido de vector, 16 cg de plásmido de gag-pol y 8 ug de plásmido de la envuelta. Se filtraron 36-48 h tras la transfección, los sobrenadantes (0,45 cm) se tomaron alícuotas y se almacenaron a -70ºC. Se produjeron preparaciones de vector concentradas mediante ultracentrifugación a

20.000 rpm (rotor SW40Ti) durante 90 min., a 4ºC. Se resuspendió el virus en PBS durante 3-4 h se tomaron alícuotas y se almacenaron a -70ºC. se llevó a cabo la transducción en presencia de Polybrene (8 cg/ml). Se

45 observó sistemáticamente que pONY2.111acZ proporcionaba títulos aproximadamente de 2 a 4 veces mayores que el pONY2.10lacZ menos delecionado. Cuando se sustituyó U3 en la LTR en 5’ por el potenciador /promotor de CMV como en pONY4 entonces los títulos aumentan hasta de 5 a 10 veces adicionalmente.

Ejemplo 11 – Vectores de ‘autoinactivación’ de VAIE (vectores SIN)

50 La expresión del transgén a partir de los vectores de VAIE en tipos celulares particulares puede verse influida por elementos en las LTR. Para eliminar tales elementos SIN (Self Inactivating, de autoinactivación) pueden construirse vectores, sin embargo, la configuración precisa del vector puede verse influida por el requisito para mantener determinadas secuencias necesarias para la producción eficaz del vector (Mol Cell Biol 1996 Sep;16(9):4942-51. La

55 estructura de ARN es un determinante del reconocimiento de sitios de poli(A) mediante factor de especificidad de poliadenilación y escisión. Graveley BR, Fleming ES, Gilmartin GM) (J Virol 1996 Mar;70(3):1612-7. Un mecanismo común para la potenciación del procesamiento en 3’ de ARNm por secuencias de U3 en dos lentivirus relacionados de forma lejana. Graveley BR, Gilmartin GM). Además los vectores SIN proporcionan una manera de eliminar la producción de transcritos de longitud completa en células transducidas.

60 Se produjeron dos vectores SIN: uno que contenía las secuencias supuestamente importantes (para poliadenilación), ubicadas entre los sitios Mlu I y Mun I y uno en el que se delecionaron estas secuencias. El límite en 5’ de las deleciones era a 112 bases desde el extremo 5’ de la región U3 de la LTR en 3’ La estructura de dos vectores SIN se muestra en la figura 12.

Se indican las deleciones presentes en los vectores pONY4G.SIN-MLU y pONY4G.SIN-MUN en líneas discontinuas. Se muestran en cursiva los cebadores.

Se obtuvieron secuencias de ADN entre los nucleótidos 7300 y 8079 (numerados según el clon de VAIE pSPEAIV19, n.º de registro U01866) utilizando amplificación mediante la reacción en cadena de la polimerasa utilizando pONY4G como molde. El cebador de sentido positivo era ERRE3 y los cebadores negativos para la amplificación eran SIN-MLU (C7143: GTCGAGCACGCGTTTGCCTAGCAACATGAGCTAG (sitio MluI en negrita) o SIN-MUN (C7142: GTCGAGCCAATTGTTGCCTAGCAACATGAGCTAG (sitio MunI en negrita) en los que las secuencias subrayadas son complementarias a los nucleótidos 8058 a 8079 (de pSPVAIE 19). Los productos de PCR se digirieron con NspV y o bien MluI o bien MunI respectivamente. Estos se ligaron luego en pONY4G preparado para ligamiento mediante digestión con NspV (SfuI) y o bien MluI (digestión parcial) o bien MunI respectivamente.

Ejemplo 12 - Vectores de VAIE con casetes de indicador-promotor interno de configuración inversa.

En vectores de VAIE tales como pONY4Z o pONY4G el casete de indicador-CMV interno está orientado de modo que la transcripción a partir de la LTR en 5’ y el promotor interno son codireccionales y la señal de poliadenilación en la LTR en 3’ se utiliza para transcritos a partir de ambos promotores. Se logra una configuración alternativa invirtiendo el casete de indicador-promotor interno, sin embargo debe situarse una señal de poliadenilación en el sentido de 3’ del casete.

Un ejemplo de este vector de ‘orientación inversa’ se produjo tal como sigue. pONY4Z se digirió con PstI y los extremos terminales en proyección se cortaron de nuevo con ADN polimerasa de T4. Esto se utilizó luego como el fragmento de ‘vector’ en un ligamiento con el fragmento de MIuI a AseI de pEGFP-C1 que contenía secuencias que incluían el casete de señal de poli A de ARNm de CMV-GFP-SV40 temprano. Antes del ligamiento, este fragmento se hizo de extremos romos con ADN polimerasa de T4. El vector que codifica para el plásmido se denominó pONY4Greverse.

Se recuperaron partículas de vector de pONY4Greverse mediante cotransfección con pONY3.1 y pRV67, que expresan gag/pol de VAIE y proteína VEV-G respectivamente. El título en células caninas D17 a partir de pONY4Greverse era 13 veces menor que a partir del vector pONY4G recuperadas en paralelo.

El menor título de pONY4Greverse se debía probablemente a la interferencia entre los promotores de CMV que dirigen la transcripción del genoma y la GFP la una hacia la otra, sin embargo, el truncamiento del ARN genómico por la señal de poliadenilación derivada de SV40 presente en el casete CMV-GFP-poliA insertado podría haber sido un factor. Se produjo un vector mejorado sustituyendo la señal de poliadenilación de pONY4Greverse por la señal de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina (BGHpA). Para producir esta mejora, se digirió pONY4Greverse con BstAPI y se hicieron los extremos romos con ADN polimerasa de T4, luego se cortó con PstI. Este fragmento de ‘vector’ se ligó luego a un fragmento de ADN que representaba el BGHpA que se preparó a partir de pcDNA3.1+ (Invitrogen) mediante digestión con SphI, y luego se hicieron los extremos romos con ADN polimerasa de T4, luego se digirió con PstI.

Ejemplo 13 - Construcción y utilización de señales de poli. A que contienen intrones

En los vectores pONY descritos en la presente memoria la señal de poliadenilación utilizada es la procedente de VAIE. Ésta se encuentra en la LTR en 3’ en el límite de R y U5. Esta señal puede no ser óptima porque no procede de una secuencia consenso (véase Whitelaw y Proudfoot 1986 EMBO 5; 2915-2922 y Levitt et al 1989 Gen. y Dev. 3; 1019-1025 para la descripción de señal de poliadenilación consenso).

Un procedimiento de mejora de la poliadenilación viral es sustituir la LTR en la señal de poli A en 3’ por la de una señal de poliadenilación consenso/fuerte. Mediante un procedimiento de este tipo la señal sería ahora óptima en la célula productora. Sin embargo tras la transducción, se pierde esta señal porque durante la replicación, la LTR en 5’ es la fuente de la señal de poli A (véase Retrovirus 1998 CSH press (Ed. J.Coffin) para una revisión del ciclo vital retroviral). Una manera novedosa de superar el problema (de no haber una señal de poliadenilación fuerte tras la transducción) es incluir la señal de poli A de una manera que se expondrá ahora: el procedimiento consiste en utilizar una ‘señal de poli A dividida’ mediante lo cual un intrón divide el motivo aataaa del de la caja g/u esencial. Se ha utilizado previamente una señal de este tipo por Liu et al (1993 N.A.R 21;5256-5263) para demostrar tanto que grandes huecos entre aataaa y la caja g/u desactivarán la señal de poli A como que el proceso de poliadenilación precede el corte y empalme. Colocando una señal de poli A dividida dentro del vector retroviral tal señal no será funcional hasta la transducción de las células diana. Esto se debe a que la poliadenilación precede al corte y empalme y como tal la señal de poli A dividida en el sentido de 5’ no se utilizará durante la expresión del vector dentro de la célula productora. Se expone en la figura 13 una representación esquemática de cómo funcionaría un vector retroviral de este tipo, que contiene una señal de poli A dividida, tanto en células productoras como en células transducidas. En primer lugar, esta figura demuestra que aunque existe una señal de poliadenilación consenso en el sentido de 5’, los transcritos de vector iniciales se poliadenilan todavía en la LTR en 3’ habitual utilizando o bien una señal viral o bien otra de poli A según se desee. Esto se debe a que aunque la señal de poli A en el sentido de 5’ es

funcional en el genoma de vector final, esta señal no se lee por la maquinaria de poliadenilación porque se crea sólo durante la eliminación de intrones y por tanto no está presente en el transcrito de ARN primario. En segundo lugar, esta figura demuestra que tras la transducción los transcritos de vector resultantes se poliadenilan ahora en la primera señal; siendo ésta ahora una señal de poliadenilación fuerte normal sin intrones para distanciar la aataaa y caja g/u esenciales.

Existen varias ventajas para la inclusión de tal señal de poli A dividida dentro de un vector retroviral; éstas incluyen las siguientes:

(1)

La utilización de señal de poliadenilación de base no viral fuerte dentro de la célula transducida potenciará la expresión génica dentro de tales células.

(2)

La utilización de tales señales de poli A en el sentido de 5’ de las señales basadas en LTR naturales (véase la figura 13) generará, tras la transducción, transcritos de ARN más cortos que contienen menor secuencia viral en su extremo 3’ y como tal no podrán experimentar una posterior transcripción inversa retroviral. De hecho se expresa el gen deseado a partir de un promotor interno tal como el de CMV, en vez de una LTR; el transcrito resultante expresado en la célula transducida podría diseñarse para no contener secuencia viral en absoluto (véase la figura 3 A).

(3)

La inclusión de una señal de este tipo en el sentido de 5’ de la LTR en 3’ significará que la expresión del ARN en el sentido de 3’ con respecto a la señal de poli A dividida se limitará sólo a la célula productora porque tal ARN no se transcribirá en la célula transducida. Esto restringirá, por tanto, determinada expresión de secuencia (por ejemplo IRESneo; véase la figura 14 B) para células productoras.

(4)

La presencia de un intrón dentro de la célula productora ayudará en la exportación nuclear de ARN de vector desde el núcleo.

(5)

Debido a que tras la transducción existe ahora una señal de poli A funcional interna, la señal de poli A viral en la LTR en 5’ (la copiada a la posición en 3’ durante la transcripción inversa) puede eliminarse/delecionarse si se desea. Esto puede utilizarse para impedir el proceso de poliadenilación próxima al promotor de la LTR en 5’ en la célula productora (véase Scott y Imperiale 1997 (Mol. Cell. Biol. 17;2127-35) y por tanto fomenta la producción del transcrito de longitud completa del virus.

Ejemplo.

Para demostrar la utilización de una señal de este tipo en un retrovirus; el casete de “señal de poli A dividida” se construye tal como se describe en la figura 15; derivándose la secuencia intrónica de pCI (Promega). Una vez producido este casete se clona en el vector pONY 4 GFP utilizando el sitio único compatible con Pstl sse8387 de pONY4-GFP (véase la figura 16). Tras la transducción el vector resultante se poliadenilará ahora antes de la LTR en 3’ y en consecuencia no se transcribirá ARN viral en 3’ con respecto a lacZ (véase la figura 16).

Ejemplo 14 - Construcción de vectores de VLM/VAIE

Al sustituir las secuencias de LTR de VAIE por los equivalentes de VLM, los vectores pONY ya no presentarán elementos tar funcionales dentro de las regiones de repetición (R) y como consecuencia el promotor U3 funcionará sin el requisito de Tat en la célula transducida.

Se expone en la figura 17, cómo se produce un vector de este tipo mediante PCR de solapamiento con los cebadores descritos en la figura 18. Se utilizan los cebadores Me1 y Me2 para amplificar un producto de PCR a partir del vector de VLM pHIT111 (Soneoka et al 1995 NAR 23; 628-633) mientras que se utilizan Me3 y Me4 para amplificar un producto de pONY4 lacZ. Luego se combinan los dos productos resultantes en una reacción de PCR sin cebadores para solaparlos (la homología entre los dos productos aparece sombreada en la figura 17). El producto de longitud completa final se corta con BglII y Xbal y se usa para sustituir el fragmento de BglII-Xbal de pONY4 lacZ (que contenía CMV/R/U5) para producir pONY4-5’VLM. El vector resultante presenta ahora la secuencia CMV/R/U5 de VLM unida a la secuencia U5 de VAIE (secuencia requerida para el reconocimiento del genoma por integrasa antes de la integración). La etapa siguiente implica una amplificación por PCR con los cebadores Me5 y Me6 de pONY4 LacZ molde y amplificación por PCR con Me7 y Me8 de pLXSN molde (Miller y Rosman 1989 Biotechniques 7:980-990). Estos dos productos de PCR se solapan luego mediante PCR sin cebadores (la homología entre los cebadores se muestra como un recuadro sombreado) y el fragmento resultante se corta con NspV y Mun1 y se inserta en los sitios NspV/Mun1 de pONY4-5’VLM; por tanto la sustitución de la LTR en 3’ de VAIE por una LTR en 3’ de VLM se fusionó al sitio de unión de integrasa de 3’UTR/ppt/U3 de pONY 4 lacZ. El plásmido resultante, denominado pONY-MOUSE (véase la figura 19 para la secuencia de ADN completa), proporciona títulos a 104-5 por ml cuando se combina con pONY3.1 y pRV67 en el sistema HIT.

Ejemplo 15 - Promotor temprano que dirige el genoma de vector lentiviral

En este ejemplo se expresa un genoma de VAIE a partir de un promotor temprano de Vaccinia P7.5E (Davison 1989a). El promotor se ha modificado por ingeniería para producir un genoma de VAIE con el extremo de ARN en 5’ correcto. Además la secuencia de terminación temprana de Vaccinia se ha insertado en el sentido de 3’ del genoma de VAIE. Esto se inserta en el plásmido de transferencia pSC65, que puede recombinarse de manera homóloga en la región TK del genoma de MVA. Pueden seleccionarse virus recombinantes por su falta de sensibilidad a BudR (Earl et al. 1998).

La figura 11 es una representación esquemática del genoma de vectores de VAIE pONY4.0 y pONY4.1 que se han descrito en el ejemplo 10 y el vector de transferencia de Vaccinia pSC65 (Chakrabarti et al 1997). La secuencia de P7.5E es AAAAGTAGAAAATATATTCTAATTTATT. La secuencia de terminación temprana para los promotores tempranos es TTTTTNT (N= cualquier nucleótido) (Fields).

Las manipulaciones de ADN son tal como sigue y las figuras 20 y 21 proporcionan la secuencia de los cebadores de PCR. La PCR con los cebadores EMVA1/2 producen la LTR en 5’ con la región U3 sustituida por el promotor P7.5E. Éste se inserta en el plásmido pSP72 (Promega) utilizando los sitios Hind III/Pst I para producir pEMVA1. U3 de VAIE contiene una secuencia que coincide con los criterios para la terminación temprana de Vaccinia (TTTTTAT). Utilizando los cebadores EMVA3/4 y EMVA5/6 y PCR de solapamiento, se muta esta región a TTTCCAT para impedir la terminación temprana. Este producto de PCR se inserta en pEMVA1 utilizando los sitios Bgl II/Pst I para generar pEMVA2. Se inserta una secuencia de terminación (TTTTTTTTT) en el sentido de 3’ de la región R de LTR en 3’ utilizando los cebadores EMVA7/8. Este producto de PCR se inserta en pEMVA2 utilizando los sitios Mun I/Bgl II produciendo pEMVA3. En este plásmido el resto del genoma de vector de VAIE (pONY4) se inserta mediante los sitios Nar I/Nsp V produciendo pEMVA4 (figura 22). Éste se corta luego con Pac I/Bgl lI y se inserta en pSC65 cortado con Pac I/Bam HI para producir pEPONY4 (Bgl II y Bam HI son compatibles) (figura 23). Esto elimina los dos promotores de Vaccinia y el casete de codificación de lacZ de pSC65.

Para producir la versión de genoma mínimo de VAIE de este constructo que es análogo a pONY4.1, pEMVA4 se corta con Sa1 I/Nsp V se hace de extremos romos y vuelve a ligarse para producir pEMVA5 (figura 24). Esto elimina gran parte de la secuencia entre el extremo del gen lac Z y la región de envuelta de extremo, de este modo este vector es negativo para Tat, Rev, S2 y Env. Esto se describe en el ejemplo 10. Esto se corta luego con Pac IlBgl lI y se inserta en pSC65 cortado con Pac IlBam HI para producir pEPONY4.1 (Bgl II y Bam HI son compatibles) (figura 24). Esto elimina los dos promotores de Vaccinia y el casete de codificación de lacZ de pSC65.

Tanto pEPONY4.0 como pEPONY4.1 son adecuados para insertar los casetes de expresión del genoma en la región TK del genoma de MVA (Carroll MW y Moss B Virology 1997 Nov 24;238(2):198-211) utilizando una línea celular BHK negativa para TK (ECACC 85011423) y procedimientos convencionales para la construcción de poxvirus recombinantes (Earl et al 1998a &amp; 1998b)

Ejemplo 16 – Promotor temprano/tardío sintético que dirige el genoma de vector lentiviral

El promotor temprano/tardío sintético de Vaccinia presenta un requisito para secuencias en el sentido de 3’ del sitio de iniciación de ARN (Davison 1989b). Para que se utilice este promotor para generar un genoma retroviral ha de modificarse cualquiera de las regiones R o se utiliza una ribozima para producir el extremo 5’ correcto. La modificación de las regiones R es problemática ya que el sitio de iniciación no se ha identificado de forma concluyente y varía con la secuencia

(Davison 1989b). A continuación se describe la generación de un plásmido de transferencia que expresa el genoma de VAIE a partir del promotor temprano/tardío sintético (Psyn). En el sentido de 3’ de este promotor se inserta una ribozima que garantiza la creación del extremo 5’ correcto del ARN. Este constructo también contiene la secuencia de terminación temprana.

Las manipulaciones de ADN son tal como sigue: PCR con los cebadores EMVA9/1 produce la LTR en 5’ con la región U3 sustituida por el promotor Psyn y una ribozima de cabeza de martillo (figuras 25 y 26). Ésta se inserta en el plásmido pEMVA4 (ejemplo 15) utilizando los sitios Pac I/Nar I para producir pEMVA6 (figura 27). Éste se corta luego con Pac I/Bgl lI y se inserta en pSC65 cortado con Pac IlBam HI para producir pSynPONY4 (Bgl II y Bam HI son compatibles) (figura 27). Esto elimina los dos promotores de Vaccinia y el casete de codificación de lacZ de pSC65.

Para producir la versión de genoma mínimo de VAIE de este constructo que es análogo a pONY4.1, pEMVA6 se corta con Sal I/Nsp V se hizo de extremos romos y volvio a ligarse para producir pEMVA7 (figura 28). Éste se corta luego con Pac I/Bgl lI y se inserta en pSC65 (un vector de transferencia de Vaccinia) cortado con Pac IlBam HI para producir pSynPONY4.1 (Bgl II y Bam HI son compatibles) (figura 28). Esto elimina los dos promotores de Vaccinia y el casete de codificación de lacZ de pSC65.

Tanto pSynPONY4.0 como pSynPONY4.1 son adecuados para insertar los casetes de expresión del genoma en la región TK del genoma de MVA (Carroll MW y Moss B Virology 1997 Nov 24;238(2):198-211) utilizando procedimientos convencionales para la construcción de poxvirus recombinantes (Earl et al 1998a &amp; 1998b)

Ejemplo 17 - Promotor T7 que dirige el genoma de vector lentiviral

Puede utilizarse el promotor de T7 promotor para generar un genoma retroviral que puede producir el extremo 5’ correcto. Se describe a continuación la generación de un plásmido de transferencia que expresa el genoma de VAIE a partir del promotor de T7 (T7). En el sentido de 3’ de este promotor se inserta una secuencia de terminación de T7. Ésta se inserta en el plásmido de transferencia pSC65, que puede recombinarse de manera homóloga en la región TK del genoma de MVA. El promotor de T7 requiere la polimerasa de T7. Están disponibles virus MVA que expresan polimerasa de T7 a partir de promotores de Vaccinia (Wyatt et al 1995).

El promotor de T7 presenta la secuencia (-)TAATACGACTCACTATAGG(+2) comenzando la transcripción tras A preferentemente con una serie de G. La secuencia de terminación de T7 es CTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTG. Las secuencias de terminación y del promotor de T7 son las que se describen en el plásmido pCITE-4a(+) (Novagen).

Las manipulaciones de ADN son tal como sigue. PCR con los cebadores EMVA10/11 (figura 29) produce la LTR en 5’ con la región U3 sustituida por el promotor de T7. Ésta se inserta en el plásmido pEMVA4 utilizando los sitios Pac I/Nar I para producir pEMVA8 (figura 30). PCR con los cebadores EMVA11/7 produce parte de la LTR en 3’ con una secuencia de terminación de T7. Ésta se inserta en pEMVA8 utilizando los sitios Mun I/Bgl II para producir pEMVA9. Éste se corta luego con Pac I/Bgl lI y se inserta en pSC65 (un vector de transferencia de Vaccinia) cortado con Pac IlBam HI para producir pT7PONY4 (Bgl II y Bam HI son compatible) (figura 30). Esto elimina los dos promotores de Vaccinia y el casete de codificación de lacZ de pSC65.

Para producir la versión de genoma mínimo de VAIE de este constructo (pONY4.1) pEMVA9 se corta con Sal I/Nsp V se hace de extremos romos y vuelve a ligarse para producir pEMVA10 (figura 31). Éste se corta luego con Pac I/Bgl lI y se inserta en pSC65 (un vector de transferencia de Vaccinia) cortado con Pac I/Bam HI para producir pT7PONY4.1 (Bgl II y Bam HI son compatibles) (figura 31). Esto elimina los dos promotores de Vaccinia y el casete de codificación de lacZ de pSC65.

Tanto pT7PONY4.0 como pT7PONY4.1 son adecuados para insertar los casetes de expresión del genoma en la región TK del genoma de MVA (Carroll MW y Moss B Virology 1997) utilizando procedimientos convencionales para la construcción de poxvirus recombinantes (Earl et al 1998a &amp; 1998b).

Ejemplo 18 - Construcción de un casete gag/pol de VAIE para la expresión en Vaccinia.

Normalmente gag/pol de VAIE requiere Rev/RRE para la expresión ya que Rev activa que el transcrito sin corte y empalme se exporte al exterior del núcleo. Como los poxvirus son citoplasmáticos, la exportación de ARN viral de VAIE no debe ser un problema. Pero si Rev presenta otras funciones tales como estabilidad de ARN o actúa como potenciador de la traducción, puede expresarse de manera similar a gag/pol de VAIE (Martarano 1994). Alternativamente, la secuencia de gag/pol de VAIE puede optimizarse en sus codones para superar el requisito de Rev /RRE para la exportación y potenciar la estabilidad del ARN. Se describe a continuación la creación de un vector que expresa gag/pol de VAIE a partir de un promotor temprano/tardío sintético (Psyn). Éste se inserta en el plásmido de transferencia pLW-22 (Wyatt y Moss Apéndice 1, Earl et al 1998a &amp; b), que puede recombinarse de manera homóloga en la región Del II del genoma de MVA. Pueden seleccionarse virus recombinantes por su expresión de lac Z.

Puede obtenerse gag/pol de VAIE que incluye la secuencia líder, el marco de lectura abierto de gag/pol y el RRE a partir del corte de pHORSE3.1 (ejemplo 9) con Xho I/Not I para dar una banda de 5,5 kb (figura 32). Ésta se inserta luego en el vector de transferencia de Vaccinia pLW-22 cortado con Sal I/Not I (Sal I y Xho I son compatibles) para producir pLWHORSE3.1 (figura 32).

Ejemplo 19 - Construcción de un casete rev de VAIE para la expresión en Vaccinia

En el caso de que se requiera Rev para la producción del vector viral de VAIE a partir de un poxvirus, puede expresarse a partir de un promotor temprano/tardío sintético. Este constructo se inserta en el plásmido de transferencia pMC03, que puede recombinarse de manera homóloga en la región Del III del genoma de MVA. Pueden seleccionarse virus recombinantes por su expresión de GUS (Carroll et al. 1995).

Las manipulaciones de ADN son tal como sigue. Se describe el plásmido pCIRev en el ejemplo 9. Es un plásmido de expresión de Rev de VAIE. Éste se corta con Afl II/Not I (0,6 kb), se hace de extremos romos mediante ADN polimerasa de T4 y se inserta en pMC03 (Carroll et al. 1995) cortado con Pme I para producir pMCRev (figura 33).

Ejemplo 20 - Construcción de casetes de envuelta heterólogos para la expresión en Vaccinia

Puede pseudotiparse VAIE con varias envueltas tales como VEV-G y envuelta de VLM anfotrópica. Se describe a continuación la creación de un vector de transferencia de MVA que expresa la envuelta anfotrópica o envuelta de VEV-G para el promotor temprano/tardío P7.5. El vector de transferencia es pYF6 que puede recombinarse de manera homóloga en la región HA de MVA. Pueden seleccionarse virus recombinantes mediante inmunotinción en vivo directa para la expresión de env.

Para producir un vector de transferencia que contiene un casete de VEV-G, se corta el plásmido de expresión de VEV-G pRV67 (Kim et al. 1998) con Sma I/Eco RV (1,7 kb) y se inserta el fragmento resultante en pYF6 cortado con Sma I para producir pYFVSVG (figura 34). De forma similar, para producir un constructo de envuelta anfotrópica análogo pHIT456 (Soneoka 1995) se corta con Xba I y se hace la banda de 2,2 kb de extremos romos mediante ADN polimerasa de T4 y se inserta en pYF6 cortado con Sma I produciendo pYFAmpho (figura 35).

Tanto pYFAmpho como pYFVSVG son adecuados para insertar los casetes de expresión del genoma en la región HA del genoma de MVA utilizando procedimientos convencionales para la construcción de poxvirus recombinantes (Earl et al 1998a &amp; b, Flexner et al 1987)

Ejemplo 21 - Construcción y amplificación de recombinantes de MVA-lentivirus

Se construyen los virus Vaccinia recombinantes que contienen múltiples insertos que codifican para los componentes de los vectores de VAIE (figura 25) mediante recombinación secuencial con los plásmidos de transferencia relevantes. Se utiliza la construcción de v.MEeGOr (figura 36) como ejemplo:

1.

Se transfecta un plásmido que lleva gag-pol (pLWHORSE3.1) en células BHK-21 o CEF, que se han infectado previamente con MVA (tal como se describe en Carroll y Moss 1997, Earl et al 1998a &amp; b).

2.

Tras dos días de infección se somete a ensayo el virus MVA recombinante en BHK-21/CEF y se superponen células con medio de agar que contiene el sustrato para el marcador coloreado β-galactosidasa (Chakrabarti et al 1985) que se expresa a partir de pLW22.

3.

Se recogen placas de lisis azules y se purifican en placas de lisis hasta que se obtiene una población de virus recombinante homogénea.

4.

Se utiliza a continuación el virus recombinante para recombinar con plásmidos de transferencia que contienen los otros genes recombinantes: pMCRev en el que se basa la selección en la expresión de GUS (Carroll &amp; Moss 1995), el genoma (pEPONY4.0) en el que se basa la selección en un fenotipo negativo para TK utilizando BudR (Carroll &amp; Moss 1997, Earl et al 1998a &amp; b) y VEVG (pYFVSVG) en el que se identifican recombinantes mediante inmunotinción directa de VEV G (Earl et al 1998a &amp; b).

Pueden amplificarse virus recombinantes en células BHK-21 o CEF tal como se describe a continuación:

Propagación de virus Vaccinia

El MVA de cepa altamente atenuada se deriva de la cepa competente en la replicación Ankara y ha aguantado más de 570 pases en células de fibroblastos embrionarios de pollo primarias. Inicialmente se pensaba que la replicación de MVA se restringía a células CEF ya que sólo se notificó una replicación mínima en células de mamífero. Sin embargo, el análisis adicional ha mostrado que las células de riñón de hámster recién nacido (BHK-21) pueden soportar la producción de alto título de MVA. MVA por tanto también puede hacerse crecer en celulas BHK-21 o CEF primarias (Carroll &amp; Moss (1997) Virology 238:198-211).

Para preparar células CEF, se sacan embriones de pollo de 10 días y se extirpan las extremidades y la cabeza antes de cortarse y tripsinarse en una disolución de tripsina al 0,25% e incubación a 37ºC. Se filtra la suspensión celular a través de una malla filtrante gruesa y se lavan las células y se concentran mediante centrifugación a 2000 rpm en un aparato Sorvall RC-3B a 1500 rpm durante 5 min. Se suspenden las células en MEM que contiene FCS al 10%, se toman alícuotas en matraces de 175 cm y se incuban a 37ºC en un incubador de CO2. Cuando las monocapas son confluentes al 95% se tripsinizan y se usan para sembrar matraces adicionales o placas de seis pocillos. Alternativamente, se transfieren cultivos primarios a un incubador a 31ºC para su utilización posterior (Sutter y Moss (1992) Proc Natl Acad Sci U S A 89:10847-10851).

Preparación de disoluciones madre de virus en bruto, semipurificadas y purificadas

Se prepara disoluciones madre de virus en bruto para el análisis inicial de virus recombinantes o como disoluciones madre virales utilizadas para posteriores preparaciones de virus de alto título. Las preparaciones de virus Vaccinia pueden semipurificarse mediante la eliminación por centrifugación de las membranas celulares y los núcleos o mediante etapas adicionales que implican centrifugación con sacarosa para impedir la contaminación por productos de proteínas recombinantes expresados previamente y orgánulos celulares. Los procedimientos usados son una modificación de los descritos por Earl et al., 1998a &amp; b; Earl y Moss, ibíd., págs. 16.17.1-16.17.16; Earl y Moss, ibíd., págs. 16.18.1-16.18.10; y Bronte et al., (1997) Proc Natl Acad Sci U S A 94(7):3183-3188.

Virus en bruto

5 El MVA se hace crecer o bien en CEF o bien en BHK-21 (obtenido de la ATCC) y WR se hace crecer en HeLa o BSC-1 (ATCC) en matraces de cultivo tisular de 175 cm2. Brevemente, se infectan monocapas confluentes con una moi de aproximadamente 1 ufp con MVA o WR. Se suspende el virus en 10 ml de MEM que contiene el FCS al 2% y se añade a matraces de 175 cm2 que contienen monocapas celulares confluentes. Tras la inoculación durante 1 hora a

10 37ºC se añaden 20 ml más de MEM que contiene FCS al 2%. Tras 48-72 horas, se raspan las células infectadas en el medio y se sedimentan a 1500 g durante 5 min. Para preparaciones de virus en bruto, se resuspenden las células en 2 ml de MEM (al 2%) por matraz de 175cm2. Se descongelan las células tres veces, se sonican y se toman alícuotas en tubos de congelación de 1 ml. Se descongela una alícuota representativa y se titula para determinar la concentración del virus. Se almacenan las disoluciones madre de virus a menos de -20ºC.

15 Preparaciones semipuras

Se recogen las células infectadas tal como se describió previamente (Earl et al a &amp; b; Earl y Moss; 1991). Tras centrifugación, se resuspenden las células en PBS (2 ml/matraz de 175 cm2) y se homogeneizan mediante 30-40

20 golpes en un homogeneizador Dounce de vidrio de ajuste apretado, en hielo. Se comprueba la rotura celular al microscopio. Se eliminan los núcleos, orgánulos celulares y membranas mediante una centrifugación a 300 g durante 5 min. (4ºC), se guarda el sobrenadante. Se resuspende el sedimento celular en 1 ml/matraz de 175 cm2 y se repite la centrifugación. Se combinan los sobrenadantes, se toman alícuotas y se guardan.

25 Preparación purificada

Se recogen las células infectadas tal como se describió anteriormente (Earl et al. a &amp; b; Earl y Moss; 1991) y se resuspenden en Tris.Cl 10 mM, pH 9.0 (2 ml/matraz), manteniendo las muestras en hielo desde este punto del procedimiento. Se homogeneiza tal como se describió anteriormente utilizando Tris 10 mM. Se sonica el lisado (en

30 hielo) utilizando una copa de sonicación XL 2015 (Misonics, EE.UU.) a máxima potencia (500 W) durante 1 min. Se pone la muestra en hielo durante 1 min. y se repite la sonicación hasta 3 veces. Se sonica un máximo de 5 ml cada vez, y se repone el hielo durante la sonicación. Se dispone en capas suavemente el lisado sobre un colchón de 17 ml de sacarosa al 36% (en Tris.Cl 10 mM, pH 9.0) en un tubo de centrífuga SW-27. Se centrifugan los lisados durante 80 min. en un rotor SW-27 a 13.500 rpm (32.900 x g), 4ºC. Se desecha el sobrenadante y se resuspende el

35 sedimento viral en PBS estéril y se sonica en un sonicador de copa durante 1 min. (en hielo). Se toman alícuotas del virus concentrado y se guarda a menos de -20ºC.

Ejemplo 22 - Producción de partículas de vector de VAIE de híbridos de MVA-VAIE

40 Tal como se describió anteriormente se producen preparaciones a gran escala de MVA-VAIE recombinante. Estas preparaciones se utilizan para infectar células de mamífero que no son permisivas para MVA, de tal manera que el sobrenadante resultante sólo contendrá VAIE y MVA no infeccioso (Meyer et al 1991, Carroll y Moss 1997). Una línea celular adecuada es MRC5 (ATCC). Se infectan células a una MOI de 3. Se permite que se produzcan las infecciones durante aproximadamente 48 horas antes de recogerse los sobrenadantes y las partículas de vector de

45 VAIE o bien se utilizan directamente o bien se concentran/purifican mediante procedimientos de ultracentrifugación o flujo transversal. Para producir preparaciones a gran escala, se hacen crecer en suspensión o sobre microsoportes o en frascos rotativos. Se utilizan vectores de VAIE que llevan el gen de interés preparados de estas maneras para transducir células diana in vivo o in vitro.

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Claims (14)

1. REIVINDICACIONES

   1. Genoma de vector de VAIE que puede estar empaquetado y que puede expresar genes heterólogos,

   caracterizado porque comprende un gen gag truncado pero que conserva una señal de empaquetamiento de gag, 5 en el que:

   (i) el truncamiento de gag elimina más de un nucleótido en el sentido de 3’ del nucleótido 350 de la secuencia codificante de gag; y

   10 (ii) la señal de empaquetamiento comprende los nucleótidos 1-109 de la secuencia codificante de gag.
2. 2. Genoma de vector de VAIE según la reivindicación 1, en el que la señal de empaquetamiento comprende los nucleótidos 1-150 de la secuencia codificante de gag.

   15 3. Genoma de vector de VAIE según la reivindicación 1, en el que la señal de empaquetamiento comprende los nucleótidos 1-299 de la secuencia codificante de gag.
3. 4. Genoma de vector de VAIE según la reivindicación 1, en el que la señal de empaquetamiento comprende los

   nucleótidos 1-349 de la secuencia codificante de gag. 20
4. 5. Genoma de vector de VAIE según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el truncamiento deleciona todos los nucleótidos desde el nucleótido 350 de la región codificante de gag hasta por lo menos el extremo C-terminal de la región codificante de gag-pol.

   25 6. Genoma de vector según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el genoma de VAIE carece del gen tat pero incluye las secuencias líder entre el extremo de la LTR en 5’ y el ATG de gag.
5. 7. Sistema de producción de VAIE que comprende una célula de empaquetamiento que comprende el genoma de

   vector de VAIE según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, un gen gag-pol de VAIE y un gen de envuelta. 30

6. 8.

   Sistema de producción según la reivindicación 7, en el que están ausentes uno o más genes auxiliares.

7. 9.

   Sistema de producción según la reivindicación 7, en el que están ausentes uno o más genes seleccionados de entre dUTPasa, S2, env y tat.

   35 10.Sistema de producción según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, en el que está ausente RRE/Rev del sistema.
8. 11.Sistema de producción según la reivindicación 10, en el que RRE/Rev se sustituye por un sistema de exportación 40 de ARN heterólogo.
9. 12.Sistema de producción según la reivindicación 10, en el que el gen gag-pol está optimizado para los codones.
10. 13.Partícula de VAIE producida por el sistema de producción según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 12.

    45 14.Sistema de vector viral que comprende un vector poxviral y un genoma de vector viral de VAIE según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.
11. 15.Partícula viral que puede obtenerse a partir del sistema de vector viral según la reivindicación 14.

    50 16.Célula transfectada o transducida con un genoma de vector de VAIE según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o una partícula según la reivindicación 13 ó 15.
12. 17.Genoma de vector de VAIE según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, partícula según la reivindicación 13 ó 55 15, o célula según la reivindicación 16, para su utilización en medicina.
13. 18.Utilización de un genoma de vector de VAIE según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, partícula según la reivindicación 13 ó 15, o célula según la reivindicación 16 para la preparación de una composición farmacéutica para suministrar un nucleótido de interés a un sitio diana que lo necesita.

    60 19.Utilización según la reivindicación 18, en el que el nucleótido de interés codifica, o incluye, una proteína supresora tumoral, una enzima tal como una enzima activadora de profármacos, una molécula inmunomoduladora, un anticuerpo, una molécula similar a inmunoglobulina diseñada mediante ingeniería genética, una proteína de fusión, una hormona, una proteína de membrana, una proteína o péptido vasoactivo, una citocina, una quimiocina,

    65 una proteína antiviral, un ARN antisentido o una ribozima.
14. 20.Procedimiento para producir la célula según la reivindicación 15, que comprende transfectar o transducir una célula con un genoma de vector de VAIE según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o una partícula según la reivindicación 13 ó 15.