ES2281704T3 - Procedimientos y compuestos para inhibir el crecimiento de celulas neoplasicas. - Google Patents
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Abstract
Uso de un agente para la preparación de un medicamento para el tratamiento de un tumor en un mamífero, en el que el agente es un polipéptido que tiene por lo menos un 80% de identidad de la secuencia de aminoácidos respecto de la longitud total de: (i) la secuencia de aminoácidos de residuos 1 o X a 338 que aparecen en la figura 2 (SEC ID N.º: 2), en la que X es cualquier residuo aminoácido del 17 al 26, o (ii) un fragmento de la secuencia de aminoácidos que aparece en la figura 6, en el que el polipéptido tiene por lo menos una longitud de 10 aminoácidos y tiene actividad antiproliferativa in vitro contra las células del tumor.
Description
Procedimientos y compuestos para inhibir el
crecimiento de células neoplásicas.
La presente invención se refiere a
procedimientos y compuestos para inhibir el crecimiento de células
neoplásicas. En particular, la presente invención se refiere a
compuestos antitumorales y a procedimientos para el tratamiento de
tumores. La invención se refiere además a procedimientos de cribado
para identificar compuestos inhibidores del crecimiento, por ejemplo
compuestos antitumorales.
Los tumores malignos (cánceres) constituyen la
segunda causa principal de mortalidad en Estados Unidos, después de
las cardiopatías (Boring y otros, CA Cancel J. Clin.,
43; 7 (1993)).
El cáncer se caracteriza por el aumento del
número de células anómalas, o neoplásicas, procedentes de un tejido
normal que proliferan para formar una masa tumoral, la invasión de
los tejidos contiguos por estas células tumorales neoplásicas y la
generación de células malignas que a la larga se difunden a través
del sistema circulatorio o el sistema linfático a los nódulos
linfáticos regionales y a sitios alejados (metástasis). En una
situación cancerosa, una célula prolifera en condiciones en las que
las células normales no crecerían. El cáncer se manifiesta en una
amplia variedad de formas, que se caracterizan por un grado distinto
de capacidad invasora y agresividad.
A pesar de los recientes avances en el
tratamiento del cáncer, es muy necesario hallar nuevos agentes
terapéuticos capaces de inhibir el crecimiento de células
neoplásicas. Por consiguiente, es el objetivo de la presente
invención identificar compuestos capaces de inhibir el crecimiento
de células neoplásicas, tales como las células cancerosas.
Los documentos WO 00/37284, WO 00/68380 y WO
00/69884, que se publicaron después de la fecha de presentación,
notifican la identificación de secuencias similares a las del
PRO320, del que se hace referencia en la presente.
La invención se refiere a medios para el
tratamiento de tumores, incluidos cánceres, tales como el de mama,
próstata, colon, pulmón, ovario, riñón y los cánceres del sistema
nervioso central (SNC), leucemia, melanoma, etc., en mamíferos,
preferiblemente humanos.
La presente invención se refiere a medios para
el tratamiento de un tumor en un mamífero que comprenden una
cantidad terapéuticamente eficaz de un polipéptido PRO320 o un
agonista del mismo, tal como se determina en las reivindicaciones.
El tumor es preferiblemente un cáncer.
En otro aspecto, la invención se refiere a un
procedimiento in vitro para inhibir el crecimiento de una
célula tumoral que comprende exponer la célula a una cantidad eficaz
de un polipéptido PRO320 o un agonista del mismo, tal como se
determina en las reivindicaciones. En una realización particular, el
agonista es un anticuerpo agonista anti-PRO320.
En una realización, la invención utiliza un
anticuerpo agonista anti-PRO320.
La figura 1 muestra la secuencia de nucleótidos
(SEC ID N.º: 1) de un ADNc que contiene una secuencia de nucleótidos
que codifica un PRO320 de secuencia natural, en el que la secuencia
de nucleótidos (SEC ID N.º: 1) es un clon designado en la presente
como ADN32284-1307. También se ofrecen en negrita y
subrayado las posiciones de los respectivos codones de inicio y de
terminación.
La figura 2 muestra la secuencia de aminoácidos
(SEC ID N.º: 2) de un polipéptido PR0320 de secuencia natural
procedente de la secuencia codificante de la SEC ID N.º: 1 mostrada
en la figura 1.
Cuando en la presente se utiliza la expresión
polipéptido o proteína "PRO320" se incluyen polipéptidos PRO320
de secuencia natural y variantes del PRO320 (que además se
determinan en la presente). El polipéptido PRO320 puede ser aislado
a partir de una variedad de fuentes, tales como tipos de tejidos
humanos o a partir de otra fuente, o preparado mediante
procedimientos de recombinación y/o de síntesis.
Un "PRO320 de secuencia natural" comprende
un polipéptido que tiene la misma secuencia de aminoácidos que el
polipéptido PRO320 procedente de la naturaleza. Tal polipéptido
PRO320 de secuencia natural puede ser aislado de la naturaleza o
puede ser producido por medios de recombinación y/o síntesis.
La expresión "PRO320 de secuencia natural"
incluye específicamente formas truncadas o secretadas de aparición
natural (por ejemplo, una secuencia de dominio extracelular), formas
variantes de aparición natural (por ejemplo, formas empalmadas
alternativamente) y variantes alélicas de aparición natural del
polipéptido PRO320.
En una realización de la invención, el
polipéptido PRO320 de secuencia natural es un polipéptido PRO320 de
secuencia natural maduro o en toda su longitud tal como se muestra
en la figura 2 (SEC ID N.º: 2). Asimismo, aunque el polipéptido
PRO320 al que se hace referencia en la figura 2 (SEC ID N.º: 2)
empieza con el residuo de metionina designado en ésta como posición
1 del aminoácido, es concebible y posible utilizar otro residuo de
metionina localizado bien por encima o bien por debajo de la
posición 1 del aminoácido de la figura 2 (SEC ID N.º: 2) como
residuo de aminoácidos iniciador del polipéptido PRO320.
El "dominio extracelular" o "ECD" de
un polipéptido al que se hace referencia en la presente se refiere a
una forma del polipéptido que carece esencialmente de los dominios
transmembrana y citoplásmico. Generalmente, un ECD de un polipéptido
tendrá menos de aproximadamente un 1% de tales dominios
transmembrana y/o citoplásmico y, preferiblemente, tendrá menos de
aproximadamente un 0,5% de tales dominios. Se comprenderá que
cualquier dominio, o dominios, transmembrana identificado para los
polipéptidos de la presente invención es identificado conforme a los
criterios utilizados de manera sistemática en la técnica para
identificar aquel tipo de dominio hidrófobo. Los límites exactos de
un dominio transmembrana pueden variar pero lo más probable es que
no lo hagan en más de unos 5 aminoácidos en cada extremo del
dominio, tal como se identificó inicialmente y como se muestra en
las figuras anexas. Como tal, en una realización de la presente
invención, el dominio extracelular de un polipéptido de la presente
invención comprende de 1 a X aminoácidos de la secuencia de
aminoácidos madura, en la que X es cualquier aminoácido de los 5
aminoácidos de cada lado del límite dominio extracelular/dominio
trans-
membrana.
membrana.
La localización aproximada de los "péptidos
señal" de los diversos polipéptidos PRO a los que se hace
referencia en la presente se muestran en las figuras anexas. No
obstante, se observa que el límite del extremo terminal C de un
péptido señal puede variar, pero lo más probable es que no lo haga
en más de unos 5 aminoácidos a cada lado del límite del extremo
terminal C del péptido señal, tal como se ha identificado
inicialmente en la presente, en el que el límite del extremo
terminal C del péptido señal puede ser identificado conforme a los
criterios utilizados de manera sistemática en la técnica para
identificar aquel tipo de elemento de la secuencia de aminoácidos
(por ejemplo, Nielsen y otros, Prot. Eng., 10:
1-6 (1997) y von Heinje y otros, Nucl. Acids.
Res., 14: 4.683-4.690 (1986)). Además,
también se ha observado que, en algunos casos, la escisión de una
secuencia señal procedente de un polipéptido secretado no es
completamente uniforme, por lo que se produce más de una especie
secretada. Estos polipéptidos maduros, en los que el péptido señal
es escindido en no más de aproximadamente 5 aminoácidos en cada lado
del límite del extremo terminal C del péptido señal, tal como se ha
identificado en la presente, y los polinucleótidos que los
codifican, son contemplados por la presente invención.
El "polipéptido de la variante PRO320" hace
referencia a un polipéptido PR0320 activo (distinto de un
polipéptido PRO320 de secuencia natural) tal como se define
posteriormente, que tiene por lo menos aproximadamente una identidad
de la secuencia de aminoácidos del 80% con la secuencia de
aminoácidos de: (a) de 1 o de aproximadamente 22 a 338 residuos del
polipéptido PRO320 representado en la figura 2 (SEC ID N.º: 2), (b)
de X a 338 residuos del polipéptido PRO320 representado en la figura
2 (SEC ID N.º: 2), en la que X es cualquier residuo de aminoácidos
del 17 al 26 de la figura 2 (SEC ID N.º: 2), o (c) otro fragmento
procedente específicamente de la secuencia de aminoácidos
representada en la figura 2 (SEC ID N.º: 2).
Tales variantes PRO320 incluyen, por ejemplo,
polipéptidos PRO320 en los que uno o más residuos de aminoácidos son
añadidos, o eliminados, en los extremos terminales N o C, así como
dentro de uno o más dominios internos de la secuencia natural.
Generalmente, una variante PRO320 tendrá por lo
menos aproximadamente una identidad de la secuencia de aminoácidos
del 80%, más preferiblemente una identidad de la secuencia de
aminoácidos de por lo menos un 81%, más preferiblemente una
identidad de la secuencia de aminoácidos de por lo menos un 82%, más
preferiblemente una identidad de la secuencia de aminoácidos de por
lo menos un 83%, más preferiblemente una identidad de la secuencia
de aminoácidos de por lo menos un 84%, más preferiblemente una
identidad de la secuencia de aminoácidos de por lo menos un 85%, más
preferiblemente una identidad de la secuencia de aminoácidos de por
lo menos un 86%, más preferiblemente una identidad de la secuencia
de aminoácidos de por lo menos un 87%, más preferiblemente una
identidad de la secuencia de aminoácidos de por lo menos un 88%, más
preferiblemente una identidad de la secuencia de aminoácidos de por
lo menos un 89%, más preferiblemente una identidad de la secuencia
de aminoácidos de por lo menos un 90%, más preferiblemente una
identidad de la secuencia de aminoácidos de por lo menos un 91%, más
preferiblemente una identidad de la secuencia de aminoácidos de por
lo menos un 92%, más preferiblemente una identidad de la secuencia
de aminoácidos de por lo menos un 93%, más preferiblemente una
identidad de la secuencia de aminoácidos de por lo menos un 94%, más
preferiblemente una identidad de la secuencia de aminoácidos de por
lo menos un 95%, más preferiblemente una identidad de la secuencia
de aminoácidos de por lo menos un 96%, más preferiblemente una
identidad de la secuencia de aminoácidos de por lo menos un 97%, más
preferiblemente una identidad de la secuencia de aminoácidos de por
lo menos un 98% y aún más preferiblemente una identidad de la
secuencia de aminoácidos de por lo menos un 99% con: (a) de 1 o de
aproximadamente 22 a 338 residuos del polipéptido PRO320
representado en la figura 2 (SEC ID N.º: 2), (b) de X a 338 residuos
del polipéptido PRO320 representado en la figura 2 (SEC ID N.º: 2),
en la que X es cualquier residuo de aminoácidos del 17 al 26 de la
figura 2 (SEC ID N.º: 2), o (c) otro fragmento procedente
específicamente de la secuencia de aminoácidos representada en la
figura 2 (SEC ID N.º: 2).
Los polipéptidos de la variante PRO320 no
incluyen la secuencia natural del polipéptido PRO320. Generalmente,
los polipéptidos de la variante PRO320 son de por lo menos una
longitud de 10 aminoácidos, a menudo de por lo menos unos 20
aminoácidos de longitud, más a menudo de por lo menos unos 30
aminoácidos de longitud, más a menudo de por lo menos unos 40
aminoácidos de longitud, más a menudo de por lo menos unos 50
aminoácidos de longitud, más a menudo de por lo menos unos 60
aminoácidos de longitud, más a menudo de por lo menos unos 70
aminoácidos de longitud, más a menudo de por lo menos unos 80
aminoácidos de longitud, más a menudo de por lo menos unos 90
aminoácidos de longitud, más a menudo de por lo menos unos 100
aminoácidos de longitud, más a menudo de por lo menos unos 150
aminoácidos de longitud, más a menudo de por lo menos unos 200
aminoácidos de longitud, más a menudo de por lo menos unos 250
aminoácidos de longitud, más a menudo de por lo menos unos 300
aminoácidos de longitud, o más.
Tal como se muestra posteriormente, la tabla 1
proporciona el código fuente completo para el programa informático
de comparación de secuencias ALIGN-2. Este código
fuente puede recopilarse de manera sistemática para utilizarlo en un
sistema operativo UNIX que proporcione el programa informático de
comparación de secuencias ALIGN-2.
Además, las tablas 2A-2D
muestran ejemplos hipotéticos para utilizar el procedimiento
descrito posteriormente para determinar la identidad de la secuencia
de aminoácidos en % (tablas 2A-2B) y la identidad de
la secuencia de ácidos nucleicos en % (tablas 2C-2D)
utilizando el programa informático de comparación de secuencias
ALIGN-2, en el que "PRO" representa la
secuencia de aminoácidos de un polipéptido PRO320 hipotético de
interés; "proteína de comparación" representa la secuencia de
aminoácidos de un polipéptido con la que se compara el polipéptido
"PRO" de interés; "PRO-ADN" representa un
PRO320 hipotético que codifica una secuencia de ácidos nucleicos de
interés; "ADN de comparación" representa la secuencia de
nucleótidos de una molécula de ácidos nucleicos con la que se
compara la molécula de ácidos nucleicos
"PRO-ADN" de interés; "X", "Y" y
"Z" representan cada una distintos residuos de aminoácidos
hipotéticos; y "N", "L" y "V" representan cada una
distintos nucleótidos hipotéticos.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
El "porcentaje (%) de identidad de la
secuencia de aminoácidos" en cuanto a las secuencias del
polipéptido PRO320 identificadas en la presente se define como el
porcentaje de residuos de aminoácidos de una secuencia de elección
que son idénticos a los residuos de aminoácidos de una secuencia
PRO320, después de alinear la secuencias e introducir espacios, si
es necesario, para conseguir el porcentaje máximo de identidad de
las secuencias, y sin contemplar ninguna sustitución conservadora
como parte de la identidad de la secuencia. La alineación a fin de
determinar el porcentaje de identidad de la secuencia de aminoácidos
puede conseguirse de varias maneras que forman parte del estado de
la técnica, por ejemplo, utilizando un programa informático
disponible tal como BLAST, BLAST-2, ALIGN,
ALIGN-2 o Megalign (DNASTAR). Los expertos en la
materia pueden determinar los parámetros apropiados para determinar
la alineación, incluido cualquier algoritmo necesario para conseguir
la alineación máxima a lo largo de toda la longitud de las
secuencias que se comparan. Para los propósitos de la presente, no
obstante, los valores en % de la identidad de la secuencia de
aminoácidos se obtienen tal como se explica posteriormente
utilizando el programa informático de comparación de secuencias
ALIGN-2, en el que el código fuente completo para el
programa ALIGN-2 se proporciona en la tabla 1. El
programa informático de comparación de secuencias
ALIGN-2 es propiedad de Genentech, Inc., y el código
fuente representado en la tabla 1 ha sido presentado junto con la
documentación del usuario en la U.S. Copyright Office, Washington
D.C., 20559, donde se ha registrado como U.S. Copyright Registration
No. TXU510087. El programa ALIGN-2 se halla
disponible en Genentech, Inc., South San Francisco, California, o
puede compilarse a partir del código fuente proporcionado en la
tabla 1. El programa ALIGN-2 debería compilarse para
su uso en un sistema operativo UNIX, preferiblemente un sistema
digital UNIX V4.0D. Todos los parámetros de comparación de
secuencias son establecidos por el programa ALIGN-2
y no varían.
Para los propósitos de la presente, el % de
identidad de la secuencia de aminoácidos de una secuencia
determinada de aminoácidos A con, o frente a, una secuencia de
aminoácidos determinada B (que puede expresarse alternativamente
como una secuencia de aminoácidos A determinada que tiene o
comprende cierto % de identidad de la secuencia de aminoácidos con,
o frente a, una secuencia de aminoácidos determinada B) se calcula
tal como sigue:
100 veces la fracción
X/Y
donde X es el número de residuos de
aminoácidos considerados emparejamientos idénticos por el programa
de alineación de secuencias ALIGN-2 en aquella
alineación de A y B del programa, y donde Y es el número total de
residuos de aminoácidos en B. Podrá apreciarse que dónde la longitud
de la secuencia de aminoácidos A no es igual a la longitud de la
secuencia de aminoácidos B, el % de identidad entre las secuencias
de aminoácidos de A y B no será igual al % de identidad entre las
secuencias de aminoácidos de B y A. Como ejemplos de cálculos del %
de identidad de la secuencia de aminoácidos, las tablas
2A-2B muestran cómo calcular el % de identidad de la
secuencia de aminoácidos entre la secuencia de aminoácidos designada
"proteína de comparación" y la secuencia de aminoácidos
designada
"PRO".
A no ser que se afirme específicamente de otro
modo, todos los valores de % de identidad de la secuencia de
aminoácidos utilizados en la presente han sido obtenidos tal como se
ha descrito anteriormente utilizando el programa informático de
comparación de secuencias ALIGN-2. No obstante, el %
de identidad de la secuencia de aminoácidos también puede
determinarse utilizando el programa de comparación de secuencias
NCBI-BLAST2 (Altschul y otros, Nucleic Acids
Res., 25: 3.389-3.402 (1997)). El
programa de comparación de secuencias NCBI-BLAST2
también puede descargarse en http: //www.ncbi. nlm.nih.gov. El
NCSI-BLAST2 utiliza diversos parámetros de
búsqueda, todos los cuales parámetros de búsqueda han sido
establecidos como valores por defecto entre los que se incluyen, por
ejemplo, unmask = yes, strand = all, expected occurrences = 10,
minimum low complexity lenght = 15/5,
multi-passe-value = 0.01, constant
for multi-pass = 25, dropoff for final gapped
alignment = 25 y scoring matrix = BLOSUM62.
En situaciones en las que se emplea el
NCBI-BLAST2 para comparar secuencias de aminoácidos,
el % de identidad de la secuencia de aminoácidos de una secuencia de
aminoácidos determinada A con, o frente a, una secuencia de
aminoácidos B determinada (que puede expresarse alternativamente
como una secuencia de aminoácidos A determinada que tiene o
comprende cierto % de identidad de la secuencia de aminoácidos con,
o frente a, una secuencia determinada de aminoácidos B) se calcula
tal como sigue:
100 veces la fracción
X/Y
donde X el número de residuos de
aminoácidos considerados con emparejamiento idéntico por el programa
de alineación de secuencias NCBI-BLAST2 en aquella
alineación de A y B del programa, y donde Y es el número total de
residuos de aminoácidos en B. Podrá apreciarse que dónde la longitud
de la secuencia de aminoácidos A no es igual a la longitud de la
secuencia de aminoácidos B, el % de identidad entre las secuencias
de aminoácidos de A y B no será igual al % de identidad entre las
secuencias de aminoácidos de B y
A.
Además, el % de identidad de la secuencia de
aminoácidos también puede determinarse utilizando el programa
informático WU-BLAST-2 (Altschul y
otros, Methods in Enzymology, 266:
460-480 (1996)). La mayor parte de los parámetros de
búsqueda del WU-BLAST-2 han sido
establecidos como valores por defecto. Los que no han sido
establecidos como valores por defecto, es decir, como parámetros
ajustables, han sido establecidos con los siguientes valores:
overlap span = 1, overlap fraction = 0.125, word
threshold (T) = 11 y scoring matrix = BLOSUM62. Para los propósitos
de la presente, un valor de % de identidad de la secuencia de
aminoácidos se determina dividiendo: (a) el número de residuos de
aminoácidos con emparejamiento idéntico entre la secuencia de
aminoácidos del polipéptido PRO de interés procedente del
polipéptido PRO natural y la secuencia de aminoácidos de interés de
comparación (es decir, la secuencia frente a la cual se ha comparado
el polipéptido PRO de interés, que puede ser una variante del
polipéptido PRO), tal como se ha determinado en
WU-BLAST-2, por (b) el número total
de residuos de aminoácidos del polipéptido PRO de interés. Por
ejemplo, en la afirmación: "un polipéptido que comprende una
secuencia de aminoácidos A que tiene por lo menos un 80% de
identidad de la secuencia de aminoácidos con la secuencia de
aminoácidos B", la secuencia de aminoácidos A es la secuencia de
aminoácidos de comparación de interés y la secuencia de aminoácidos
B es la secuencia de aminoácidos del polipéptido PRO de interés.
"Aislado", cuando se utiliza para describir
los diversos polipéptidos a los que se hace referencia en la
presente, significa que el polipéptido ha sido identificado y
separado y/o recuperado de un componente de su entorno natural.
Preferiblemente, el polipéptido aislado carece de asociación con
todos los componentes con los cuales está naturalmente asociado. Los
componentes contaminantes de su entorno natural son materiales que
habitualmente interferirían en el diagnóstico o en los usos
terapéuticos del polipéptido, y pueden incluir enzimas, hormonas, y
otros solutos proteináceos o no proteináceos. En realizaciones
preferidas, el polipéptido será purificado: (I) hasta un grado
suficiente para obtener por lo menos 15 residuos de una secuencia de
aminoácidos interna o del extremo terminal N mediante la utilización
de un secuenciador de taza giratoria, o (2) hasta la homogeneidad
mediante SDS-PAGE en condiciones no reductoras o
reductoras utilizando azul de Coomassie o, preferiblemente, tinción
de plata. El polipéptido aislado incluye un polipéptido in
situ dentro de células recombinantes, ya que como mínimo faltará
un componente del entorno natural de PRO320. Generalmente, no
obstante, la preparación del polipéptido aislado requerirá como
mínimo una etapa de purificación.
El término "anticuerpo" se utiliza en su
sentido más amplio y abarca específicamente, por ejemplo,
anticuerpos monoclonales anti-PRO320 únicos
(incluidos anticuerpos agonistas), compuestos de anticuerpos
anti-PRO320 con especificidad poliepitópica, de
cadena única, anticuerpos anti-PRO320, y fragmentos
de anticuerpos anti-PRO320 (véase posteriormente).
El término "anticuerpo monoclonal" tal como se utiliza en la
presente se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una
población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, todos
los anticuerpos de la población son idénticos excepto por posibles
mutaciones de aparición natural que puedan presentarse en cantidades
menores.
El término "epítopo tagged", cuando
se utiliza en la presente, se refiere a un polipéptido quimérico que
comprende un polipéptido PRO320 fusionado a un "polipéptido
tag". El polipéptido tag tiene suficientes residuos
para proporcionar un epítopo contra el cual puede crearse un
anticuerpo, aunque es lo bastante corto de modo que no interfiere en
la actividad del polipéptido al cual se halla fusionado.
Preferiblemente el polipéptido tag también es totalmente
único, de tal modo que el anticuerpo no presenta reacción cruzada
sustancial con otros epítopos. Los polipéptidos tag adecuados
generalmente tienen por lo menos seis residuos de aminoácidos y
normalmente entre unos 8 y 50 residuos de aminoácidos
(preferiblemente, entre unos 10 y 20 residuos de aminoácidos).
Tal como se utiliza en la presente, el término
"inmunoadhesina" designa moléculas parecidas a anticuerpos que
combinan la especificidad de unión de una proteína heteróloga (una
"adhesina") con las funciones efectoras de los dominios
constantes de la inmunoglobulina. Estructuralmente, las
inmunoadhesinas comprenden una fusión entre una secuencia de
aminoácidos con la especificidad de unión deseada, que es distinta
de la del sitio de identificación y unión del antígeno de un
anticuerpo (es decir, es "heteróloga"), y una secuencia de
dominios constantes de la inmunoglobulina. La parte adhesina de una
molécula de inmunoadhesina habitualmente es una secuencia de
aminoácidos contigua que comprende por lo menos el sitio de unión de
un receptor o un ligando. En la inmunoadhesina, la secuencia de
dominios constantes de la inmunoglobulina puede obtenerse a partir
de cualquier inmunoglobulina, tal como los subtipos de
IgG-14, IgG-2,
IgG-3, o IgG-4, IgA (incluidas la
IgA-1 y la IgA-2), IgE, IgD o
IgM.
Para los propósitos de la presente,
"activa" o "actividad" se refiere a una forma o formas de
PRO320 que conservan actividad biológica y/o inmunológica del PRO320
natural o de aparición natural, en la que actividad "biológica"
se refiere a una función biológica (bien inhibidora o estimuladora)
causada por un PRO320 natural o de aparición natural diferente de la
capacidad de inducir la producción de un anticuerpo contra un
epítopo antigénico poseído por un PRO320 natural o de aparición
natural y actividad "inmunológica" se refiere a la capacidad de
inducir la producción de un anticuerpo contra un epítopo antigénico
poseído por un PRO320 natural o de aparición natural.
"Actividad biológica" en el contexto de un
anticuerpo o de otro agonista que pueda ser identificado mediante
los análisis de cribado descritos en la presente (por ejemplo, un
péptido orgánico o inorgánico de molécula pequeña, etc.) se utiliza
para referirse a la capacidad de tales moléculas para inducir uno o
más de los efectos enumerados en la presente junto con la definición
de una "cantidad terapéuticamente eficaz". En una realización
específica, "actividad biológica" es la capacidad de inhibir el
crecimiento o la proliferación de células neoplásicas. Una actividad
biológica preferida es la inhibición, que incluye el enlentecimiento
o detención completa, del crecimiento de una célula tumoral diana
(por ejemplo, cáncer). Otra actividad biológica preferida es la
actividad citotóxica causante de la muerte de la célula tumoral
diana (por ejemplo, cáncer). Y aún otra actividad biológica
preferida es la inducción de apoptosis de una célula tumoral diana
(por ejemplo, cáncer).
La expresión "actividad inmunológica"
significa reactividad cruzada inmunológica con por lo menos un
epítopo de un polipéptido PRO320.
Tal como se utiliza en la presente,
"reactividad cruzada inmunológica" significa que el polipéptido
de elección es capaz de inhibir competitivamente la actividad
biológica cualitativa de un polipéptido PRO320 que tiene esta
actividad con antisueros policlonales cultivados contra el conocido
polipéptido PRO320 activo. Tales antisueros se preparan de manera
convencional inyectando por vía subcutánea a cabras o conejos, por
ejemplo, el conocido análogo activo en adyuvante completo de Freund,
seguido de una inyección intraperitoneal o subcutánea de refuerzo en
incompleto de Freund. La reactividad cruzada inmunológica es
preferiblemente "específica", lo que significa que la afinidad
de unión de la molécula con reactividad cruzada inmunológica
identificada (por ejemplo, anticuerpo) con el polipéptido PRO320
correspondiente es considerablemente más alta (preferiblemente por
lo menos dos veces, más preferiblemente por lo menos cuatro veces,
incluso más preferiblemente por lo menos unas seis veces, más
preferiblemente por lo menos unas ocho veces más alta) que la
afinidad de unión de aquella molécula con cualquier otro polipéptido
natural conocido.
Tal como se utiliza en la presente, "tumor"
se refiere a todo crecimiento o proliferación de células
neoplásicas, independientemente de que sean malignas o benignas, y a
todas las células y tejidos precancerosos y cancerosos.
Los términos "cáncer" y "canceroso" se
refieren a, o describen, la enfermedad fisiológica en mamíferos que
habitualmente se caracteriza por un crecimiento celular no regulado.
Entre los ejemplos de cáncer se incluyen, pero no exclusivamente, el
carcinoma, el linfoma, el blastoma, el sarcoma, y la leucemia.
Ejemplos más particulares de tales cánceres son el cáncer de mama,
el cáncer de próstata, el cáncer de colon, el cáncer de células
escamosas, el carcinoma microcítico de pulmón, el carcinoma no
microcítico de pulmón, el cáncer de ovarios, el cáncer de cuello
uterino, el cáncer gastrointestinal, el cáncer pancreático, el
glioblastoma, el cáncer hepático, el cáncer de vejiga urinaria, el
hepatoma, el cáncer colorrectal, el carcinoma endometrial, el
carcinoma de las glándulas salivales, el cáncer de riñón, el cáncer
vulvar, el cáncer tiroideo, el carcinoma hepático y diversos tipos
de cáncer de cabeza y cuello.
El "tratamiento" es una intervención que se
lleva a cabo con la intención de prevenir la aparición de un
trastorno o alterar su patología. Por consiguiente, el
"tratamiento" se refiere tanto al tratamiento terapéutico como
a medidas profilácticas o preventivas. Entre los que requieren
tratamiento se incluyen aquellos que ya sufren el trastorno, así
como aquellos en quienes el trastorno tiene que prevenirse. En el
tratamiento de un tumor (por ejemplo, cáncer), un agente terapéutico
puede disminuir directamente la patología de células tumorales, o
hacer que las células tumorales sean más susceptibles al tratamiento
con otros agentes terapéuticos, por ejemplo, radiación y/o
quimioterapia.
La "patología" de un cáncer incluye todos
los fenómenos que afectan al bienestar del paciente. Esto incluye,
sin limitación alguna, el crecimiento celular anómalo o
descontrolado, la metástasis, la interferencia con el funcionamiento
normal de células vecinas, la liberación de citocinas o de otros
productos de secreción a concentraciones anómalas, la supresión o
agravamiento de la respuesta inflamatoria o inmunológica, etc.
Una "cantidad eficaz" del polipéptido
descrito en la presente o de un agonista del mismo, en cuanto a la
inhibición del crecimiento de células neoplásicas, es una cantidad
capaz de inhibir, en mayor o menor grado, el crecimiento de células
diana. El término incluye una cantidad capaz de inducir un efecto
inhibidor, citostático y/o citotóxico sobre el crecimiento y/o
apoptosis de las células diana. Puede determinarse empíricamente y
de manera sistemática una "cantidad eficaz" de un polipéptido
PRO320 o un agonista del mismo con la finalidad de inhibir el
crecimiento de células neoplásicas.
Una "cantidad terapéuticamente eficaz", en
cuanto al tratamiento de un tumor, se refiere a una cantidad capaz
de inducir uno o más de los siguientes efectos: (1) inhibición, en
menor o mayor grado, del crecimiento del tumor, que incluye,
enlentecimiento y detención completa del crecimiento; (2) reducción
del número de células tumorales; (3) reducción del tamaño del tumor;
(4) inhibición (es decir, reducción, enlentecimiento o detención
completa) de la infiltración de células tumorales a los órganos
periféricos; (5) inhibición (es decir, reducción, enlentecimiento o
detención completa) de metástasis; (6) estimulación de la respuesta
inmunitaria antitumoral, que puede, pero no necesariamente, dar
lugar a la regresión o rechazo del tumor; y/o (7) alivio, en mayor o
menor grado, de uno o más de los síntomas asociados con el
trastorno. Puede determinarse empíricamente y de manera sistemática
una "cantidad terapéuticamente eficaz" de un polipéptido PRO320
o de un agonista del mismo con la finalidad de inhibir el
crecimiento de células neoplásicas.
Una "cantidad inhibidora del crecimiento"
de un polipéptido PRO320 o de un agonista del mismo es una cantidad
capaz de inhibir el crecimiento de una célula, en especial un tumor,
por ejemplo, células cancerosas, bien in vitro o bien in
vivo. Puede determinarse empíricamente y de manera sistemática
una "cantidad inhibidora del crecimiento" de un polipéptido
PRO320 o de un agonista del mismo con la finalidad de inhibir el
crecimiento de células neoplásicas.
Una "cantidad citotóxica" de un polipéptido
PRO320 o de un agonista del mismo es una cantidad capaz de causar la
destrucción de una célula, en especial un tumor, por ejemplo,
células cancerosas, bien in vitro o in vivo. Puede
determinarse empíricamente y de manera sistemática una "cantidad
citotóxica" de un polipéptido PRO320 o de un agonista del mismo
con la finalidad de inhibir el crecimiento de células
neoplásicas.
El término "agente citotóxico" tal como se
utiliza en la presente se refiere a una sustancia que inhibe o
previene la función de las células y/o causa destrucción de células.
El término pretende incluir isótopos radioactivos (por ejemplo,
^{131}I, ^{125}I, ^{90}Y y ^{126}Re), agentes
quimioterapéuticos, y toxinas tales como toxinas enzimáticamente
activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, o
fragmentos de los mismos.
Un "agente quimioterapéutico" es un
compuesto químico de utilidad en el tratamiento de un tumor, por
ejemplo, cáncer. Entre los ejemplos de agentes quimioterapéuticos se
incluyen la adriamicina, la doxorrubicina, la epirrubicina, el
5-fluorouracilo, el arabinósido de citosina
("Ara-C"), la ciclofosfamida, el tiotepa, el
busulfán, la citoxina, los taxoides, por ejemplo, el paclitaxel
(Taxol, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton,
NJ), y el doxetaxel (Taxotere, Rhône-Poulenc Rorer,
Antony, Rnace), el toxotere, el metotrexato, el cisplatino, el
melfalán, la vinblastina, la bleomicina, el etopósido, la
ifosfamida, la mitomicina C, mitoxantrona, la vincristina, la
vinorrelbina, el carboplatino, el tenipósido, la daunomicina, la
carminomicina, la aminopterina, la dactinomicina, las mitomicinas,
las esperamicinas (véase, patente de EE.UU. US 4.675.187), el
melfalán y otras mostazas nitrogenadas relacionadas. Los agentes
hormonales que actúan para regular o inhibir la acción hormonal
sobre tumores, tales como el tamoxifeno y la onapristona.
Cuando se utiliza en la presente, un "agente
inhibidor del crecimiento" se refiere a un compuesto que inhibe
el crecimiento celular, especialmente de un tumor, por ejemplo, de
células cancerosas, bien in vitro o in vivo. De este
modo, el agente inhibidor del crecimiento reduce considerablemente
el porcentaje de células diana en la fase S. Ejemplos de agentes
inhibidores del crecimiento incluyen agentes que bloquean la
progresión del ciclo celular (en un momento distinto de la fase S),
tales como los agentes que inducen la detención de G1 y la detención
de la fase M. Entre los bloqueantes clásicos de la fase M se
incluyen vincas (vincristina y vinblastina), taxol e inhibidores de
la topo II, tales como doxorrubicina, epirrubicina, daunorrubicina,
etopósido y bleomicina. Estos agentes que detienen G1 también causan
la detención de la fase S, por ejemplo, agentes alquilantes del ADN
tales como tamoxifeno, prednisona, dacarbazina, meclorretamina,
cisplatino, metotrexato, 5-fluorouracilo y
ara-C. Puede hallarse más información en The
Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn e Israel, eds., capítulo
I, titulado "Cell cycle regulation, oncogens, and antineoplastic
drugs" de Murakami y otros, (WB Saunders: Filadelfia, 1995),
especialmente la pág. 13.
El término "citocina" es un término
genérico para proteínas liberadas por una población de células que
actúan sobre otra célula como mediadores intercelulares. Ejemplos de
tales citocinas son las linfocinas, las monocinas y las hormonas
polipeptídicas tradicionales. Entre las citocinas se incluyen
hormonas del crecimiento tales como la hormona de crecimiento
humano, el N-metionil de la hormona de crecimiento
humana y la hormona de crecimiento bovino; la hormona paratiroidea;
la tiroxina; la insulina; la proinsulina; la relaxina; la
prorrelaxina; hormonas glucoproteínicas, tales como la hormona
estimuladora del folículo (FSH), la hormona estimuladora del
tiroides (TSH), y la hormona luteinizante (LH); el factor de
crecimiento hepático, el factor de crecimiento de fibroblastos: la
prolactina; el lactógeno placentario; los factores de necrosis
tumoral \alpha y \beta; la sustancia inhibidora mulleriana; el
péptido asociado a la gonadotropina murina; la inhibina: la
activina; el factor de crecimiento endotelial vascular; la
integrina; la trombopoyetina (TPO); factores de crecimiento de los
nervios, tales como NGF-\beta; factor de
crecimiento plaquetario; factores transformadores del crecimiento
(TGF), tales como TGF-\alpha y
TGF-\beta; factores de crecimiento insulínico I y
II; eritropoyetina (EPO); factores osteoinductores; interferones
tales como el interferón \alpha, \beta y \gamma; factores
estimulantes de colonias (CSF), tales como CSF de macrófagos
(M-CSF); CSF de macrófagos granulocíticos
(GM-CSF); y CSF de granulocitos
(G-CSF); interleucinas (IL), tales como
IL-1, IL-1a, IL-2,
IL-3, IL-4, IL-5,
IL-6, IL-7, IL-8,
IL-9, IL-11, IL-12;
un factor de necrosis tumoral tal como el
TNF-\alpha o el TNF-\beta; y
otros factores polipeptídicos que incluyen LIF y ligando kit (KL).
Tal como se utiliza en la presente, el término citocina incluye
proteínas de fuentes naturales o de cultivo de células recombinantes
y equivalentes biológicamente activos de las citocinas de secuencia
natural.
Tal como se utiliza en esta solicitud de
patente, el término "profármaco" se refiere a una forma
precursora o derivada de una sustancia farmacéuticamente activa que,
comparada con el fármaco original, es menos citotóxica para las
células tumorales y es capaz de ser activada enzimáticamente o
convertida en la forma original más activa. Véase, por ejemplo,
Wilman, "Prodrugs in Cancer Chemotherapy", Biochemical
Society Transactions, 14, págs. 375-382, 615th
Meeting Belfast (1986) y Stella y otros, "Prodrugs: A Chemical
Approach to Targeted Drug Delivery", Directed Drug
Delivery, Borchardt y otros, (eds.), págs.
247-267. Humana Press (1985). Los profármacos de
esta invención incluyen, pero no exclusivamente, profármacos que
contienen fosfatos, profármacos que contienen tiofosfatos,
profármacos glucosilados o profármacos que contienen fenilacetamida
que opcionalmente puede ser sustituida, profármacos de
5-fluorocitosina y otros profármacos de
5-fluorouridina, que pueden derivar en una forma de
profármaco para su uso en la presente invención, incluyen, pero no
exclusivamente, aquellos agentes quimioterapéuticos descritos
anteriormente.
El término "agonista" incluye
específicamente anticuerpos agonistas o fragmentos de anticuerpos,
fragmentos o variantes de la secuencia de aminoácidos de
polipéptidos PRO320 naturales, péptidos, moléculas orgánicas
pequeñas, etc.
Los procedimientos para la identificación de
agonistas de un polipéptido PRO320 pueden comprender establecer
contacto entre una célula tumoral y una posible molécula agonista, y
determinar la inhibición del crecimiento de células tumorales.
La administración "crónica" se refiere a la
administración continuada del agente o agentes en oposición a una
dosis única, de tal modo que se mantenga el efecto terapéutico
inicial (actividad) durante un período de tiempo prolongado. La
administración "intermitente" es un tratamiento que no se
realiza sucesivamente sin interrupción, sino que es más bien de
naturaleza cíclica.
Para los propósitos de un tratamiento,
"mamífero" se refiere a cualquier animal clasificado como un
mamífero, incluidos los humanos, los animales domésticos y de
granja, así como los del zoológico, los utilizados en deportes, o
las mascotas, tales como perros, gatos, ganado bovino, caballos,
ovejas, cerdos, cabras, conejos, etc. Preferiblemente, el mamífero
es humano.
La administración "en combinación con" uno
o más agentes terapéuticos incluye la administración simultánea
(concurrente) y sucesiva en cualquier orden.
Tal como se utiliza en la presente,
"portadores" incluye portadores farmacéuticamente aceptables,
excipientes o estabilizantes, que son no tóxicos para la célula o el
mamífero expuesto a los mismos a las dosis y concentraciones
empleadas. A menudo, el portador fisiológicamente aceptable es una
disolución acuosa de pH tamponado. Entre los ejemplos de portadores
fisiológicamente aceptables se incluyen tampones tales como fosfato,
citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes como el ácido
ascórbico; polipéptidos de bajo peso molecular (menos de unos 10
residuos); proteínas, tales como albúmina sérica, gelatina, o
inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tales como
polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina,
asparagina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros
hidratos de carbono como glucosa, manosa, o dextrinas; agentes
quelantes tales como EDTA; alcoholes azucarados tales como manitol o
sorbitol; contraiones formadores de sales tales como sodio; y/o
surfactante no iónicos tales como TWEEN™, polietilenglicol (PEG) y
PLURONICS™.
Los "anticuerpos naturales" y las
"inmunoglobulinas naturales" son normalmente glucoproteínas
heterotetraméricas de aproximadamente 150.000 daltons, compuestas
por dos cadenas ligeras (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H)
idénticas. Cada cadena ligera está unida a una cadena pesada
mediante un enlace disulfuro covalente, aunque el número de enlaces
disulfuro varía entre las cadenas pesadas de distintos isotipos de
inmunoglobulina. Cada una de las cadenas pesada y ligera también
presenta puentes disulfuro intracatenarios espaciados regularmente.
Cada cadena pesada presenta en un extremo un dominio variable (VH)
seguido de numerosos dominios constantes. Cada cadena ligera
presenta un dominio variable en un extremo (VL) y un dominio
constante en su otro extremo; el dominio constante de la cadena
ligera está alineado con el primer dominio constante de la cadena
pesada, y el dominio variable de la cadena ligera está alineado con
el dominio variable de la cadena pesada. Se cree que hay residuos de
aminoácidos concretos que forman una interfaz entre los dominios
variables de las cadenas ligera y pesada.
El término "variable" se refiere al hecho
de que ciertas partes de los dominios variables difieren mucho en la
secuencia entre los distintos anticuerpos y se utilizan en la unión
y especificidad de cada anticuerpo particular en para su antígeno
particular. No obstante, la variabilidad no se distribuye
uniformemente por todos los dominios variables de los anticuerpos.
Se concentra en tres segmentos llamados regiones determinantes de
complementariedad (CDR), o regiones hipervariables, tanto en los
dominios variables de la cadena ligera como en los de la cadena
pesada. Las partes más altamente conservadas de los dominios
variables se denominan regiones de entramado (framework, FR).
Los dominios variables de las cadenas pesada y ligera naturales
comprenden cada uno cuatro regiones FR, que adoptan ampliamente una
configuración de hoja \beta, conectadas por tres CDR, que forman
bucles que conectan la estructura de hoja \beta y, en algunos
casos, forman parte de la misma. Las CDR de cada cadena se mantienen
juntas muy próximas a las regiones FR y, con las CDR de la otra
cadena, contribuyen a la formación del sitio de unión al antígeno de
los anticuerpos (véase, Kabat y otros, NIH Publ, No.
91-3242, Vol. 1, págs. 647-669
(1991)). Los dominios constantes no intervienen directamente en la
unión de un anticuerpo a un antígeno, pero muestran varias funciones
efectoras, tales como la participación del anticuerpo en la
toxicidad celular dependiente del anticuerpo.
Cuando se utiliza en la presente, el término
"región hipervariable" se refiere a los residuos de aminoácidos
de un anticuerpo que es responsable de la unión al antígeno. La
región hipervariable comprende residuos de aminoácidos de una
"región determinante de complementariedad" o "CDR" (es
decir, residuos 24-34 (L1), 50-56
(L2) y 89-97 (L3) en el dominio variable de la
cadena ligera y 31-35 (H1), 50-65
(H2) y 95-102 (H3) en el dominio variable de la
cadena pesada; Kabat y otros, Sequences of Proteins of
Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National
Institute of Health, Bethesda, MD. [1991]) y/o aquellos residuos de
un "bucle hipervariable" (es decir, residuos
26-32 (L1), 50-52 (L2) y
91-96 (L3) en el dominio variable de la cadena
ligera y 26-32 (H1), 53-55 (H2) y
96-101 (H3) en el dominio variable de la cadena
pesada; Clothia y Lesk, J. Mol. Biol., 196: 901-917
[1987]). Los residuos de entramado ("framework" o
"FR") son aquellos residuos de dominios variables distintos de
los residuos de la región hipervariable tal como se ha definido en
la presente.
"Fragmentos de anticuerpos" comprende una
parte de un anticuerpo intacto, preferiblemente la región variable o
de unión al antígeno del anticuerpo intacto. Ejemplos de fragmentos
de anticuerpos son Fab, Fab', F(ab')_{2}, y fragmentos Fv;
"diabodies"; anticuerpos lineales (Zapata y otros, Protein
Eng., 8 (10): 1.057-1.062 [1995]);
moléculas de anticuerpos de cadena única; y anticuerpos
multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos.
La digestión papaínica de anticuerpos produce
dos fragmentos idénticos de unión al antígeno, llamados fragmentos
"Fab", cada uno con un único sitio de unión al antígeno, y un
fragmento residual "Fc", designación que refleja la capacidad
de cristalizar fácilmente. El tratamiento con pepsina produce un
fragmento F(ab')_{2} que tiene dos sitios de unión al
antígeno y sigue siendo capaz de formar enlaces transversales con el
antígeno.
"Fv" es el fragmento de anticuerpo mínimo
que contiene un sitio completo de identificación y unión al
antígeno. Esta región consiste en un dímero de un dominio variable
de una cadena pesada y una cadena ligera en estrecha asociación, no
covalente. Es en esta configuración que las tres CDR de cada dominio
variable interactúan entre sí para determinar un sitio de unión al
antígeno en la superficie del dímero
V_{H}-V_{L}. En conjunto, las seis CDR confieren
al anticuerpo especificidad de unión al antígeno. No obstante,
incluso un único dominio variable (o la mitad de un Fv que comprende
sólo tres CDR específicas para un antígeno) tiene la capacidad de
identificar el antígeno y unirse al mismo, aunque con una afinidad
menor que en el sitio de unión completo.
El fragmento Fab también contiene el dominio
constante de la cadena ligera y el primer dominio constante (CH1) de
la cadena pesada. Los fragmentos Fab difieren de los fragmentos Fab'
por la adición de unos pocos residuos en el extremo carboxílico del
dominio CH1 de la cadena pesada que incluye uno o más cisteínas
procedentes de la región bisagra del anticuerpo.
Fab'-SH es la designación en la presente para un
Fab' en el que el residuo de cisteína (s) de los dominios constantes
llevan un grupo tiol libre. Los fragmentos de anticuerpo
F(ab')_{2} originalmente fueron producidos como pares de
fragmentos Fab' unidos por cisteínas bisagra. También se conocen
otros acoplamientos químicos de fragmentos de anticuerpos.
Las "cadenas ligeras" de anticuerpos
(inmunoglobulinas) procedentes de cualquier especie de vertebrado
pueden asignarse a uno de dos tipos claramente diferenciados,
llamados kappa y lambda, en función de las secuencias de aminoácidos
de sus dominios constantes.
Dependiendo de la secuencia de aminoácidos del
dominio constante de sus cadenas pesadas, las inmunoglobulinas
pueden asignarse a clases distintas. Existen cinco clases
principales de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varias
de éstas pueden subdividirse en subclases (isotipos), por ejemplo,
IgG1. IBG2, IgG3, IgG4, IgA e IgA2.
Tal como se utiliza en la presente, el término
"anticuerpo monoclonal" se refiere a un anticuerpo obtenido a
partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea, es
decir, todos los anticuerpos de la población son idénticos excepto
por la presencia, en cantidades menores, de posibles mutaciones de
aparición natural. Los anticuerpos monoclonales son muy específicos,
siendo dirigidos contra un único sitio antigénico. Además, a
diferencia de las preparaciones convencionales de anticuerpos
(policlonales) que habitualmente incluyen anticuerpos distintos
dirigidos contra determinantes distintos (epítopos), cada anticuerpo
monoclonal es dirigido contra un único determinante del antígeno.
Además de su especificidad, una de las ventajas de los anticuerpos
monoclonales es que son sintetizados mediante cultivo del hibridoma,
que no está contaminado por otras inmunoglobulinas. El modificador
"monoclonal" indica el carácter del anticuerpo que se ha
obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea,
y su construcción no requiere producción del anticuerpo por medio de
algún procedimiento en particular. Por ejemplo, los anticuerpos
monoclonales que hay que utilizar según la presente invención pueden
sintetizarse mediante el primer procedimiento de hibridoma descrito
por Kohler y otros, Nature, 256: 495 [1975], o pueden
sintetizarse mediante procedimientos de ADN recombinante (véase, por
ejemplo, patente de EE.UU. US 4.816.567). Los "anticuerpos
monoclonales" también pueden aislarse a partir de genotecas de
anticuerpos bacteriófagos utilizando, por ejemplo, las técnicas
descritas en Clackson y otros, Nature, 352:
624-628 [1991] y Marks y otros, J. Mol.
Biol., 222: 581-597 (1991).
Los anticuerpos monoclonales de la presente
invención incluyen específicamente anticuerpos "quiméricos"
(inmunoglobulinas) en los que una parte de la cadena pesada y/o
ligera es idéntica u homóloga a secuencias correspondientes en los
anticuerpos procedentes de una especie en particular o
pertenecientes a una clase o subclase particular de anticuerpo,
mientras el resto de la cadena o cadenas es idéntico u homólogo a
secuencias correspondientes en los anticuerpos procedentes de otra
especie o pertenecientes a otra clase o subclase de anticuerpos, así
como fragmentos de tales anticuerpos, con tal que muestren la
actividad biológica deseada (Patente de EE.UU. US 4.816.567;
Morrison y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 81:
6.851-6.855 [1984]).
Las formas "humanizadas" de anticuerpos no
humanos (por ejemplo, murinos) son inmunoglobulinas quiméricas,
cadenas de immunoglobulinas o fragmentos de las mismas (tales como
Fv, Fab, Fab', F(ab')_{2} u otras subsecuencias de
anticuerpos que se unen a antígenos) que contienen una secuencia
mínima procedente de una inmunoglobulina no humana. En su mayor
parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas
(anticuerpo receptor) en las que los residuos procedentes de CDR del
receptor son sustituidos por residuos procedentes de CDR de una
especie no humana (anticuerpo donante) tales como un ratón, una rata
o un conejo que tiene la especificidad, la afinidad y la capacidad
deseadas. En algunos casos, los residuos FR de Fv de la
inmunoglobulina humana son sustituidos por los residuos no humanos
correspondientes. Además, los anticuerpos humanizados pueden
comprender residuos que no se hallen ni en el anticuerpo receptor ni
en las secuencias CDR o de entramado importadas. Estas
modificaciones también se hacen para mejorar y maximizar la
actividad de los anticuerpos. En general, el anticuerpo humanizado
comprenderá sustancialmente la totalidad de por lo menos uno, y
habitualmente dos, de los dominios variables, en el que todas o
sustancialmente todas las regiones CDR corresponden a las de una
inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las
regiones FR son las de una secuencia de una inmunoglobulina humana.
De manera óptima, el anticuerpo humanizado también comprenderá por
lo menos una parte de una región constante de inmunoglobulina (Fc),
habitualmente la de una inmunoglobulina humana. Para más detalles,
ice, Jones y otros, Nature, 321:
322-323 (1986); Reichmann y otros, Nature,
332: 323-329 [1988]; y Presta, Curr. Op.
Struct. Biol. 2: 593-596 (1992). El
anticuerpo humanizado incluye un anticuerpo PRIMATIZED™ en el que la
región de unión al antígeno del anticuerpo procede de un anticuerpo
producido por inmunización de monos macacos con el antígeno de
interés.
Los fragmentos de anticuerpos "Fv de cadena
única" o "Fv_{s}" comprenden los dominios de anticuerpo
V_{H} y V_{L}, en los que estos dominios se encuentran en una
cadena polipeptídica única. Preferiblemente, el polipéptido Fv
comprende además un conector polipeptídico entre los dominios
V_{H} y V_{L} que permite al Fv_{s} formar la estructura
deseada para la unión al antígeno. Para un análisis de Fv_{s},
véase Pluckthun en: The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol.
113, Rosenburg y Moore eds., Springer-Verlag, Nueva
York, págs. 269-315 (1994).
El término "dianticuerpos" se refiere a
fragmentos pequeños de anticuerpos con dos sitios de unión al
antígeno, cuyos fragmentos comprenden un dominio variable en la
cadena pesada (V_{H}) conectado a un dominio variable en la cadena
ligera (V_{L}) en la misma cadena polipeptídica
(V_{H}-V_{L}). Utilizando un conector que es
demasiado corto para permitir el acoplamiento entre los dos dominios
en la misma cadena, los dominios tienen que acoplarse con los
dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de unión
al antígeno. Los dianticuerpos se describen con mayor detalle en,
por ejemplo, EP 404.097; el documento WO 93/11161, y Hollinger y
otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:
644-6448 (1993).
Un anticuerpo "aislado" es el que ha sido
identificado y separado y/o recuperado de un componente de su
entorno natural. Los componentes contaminantes de su entorno natural
son materiales que podrían interferir en el diagnóstico o en los
usos terapéuticos del anticuerpo, y entre ellos pueden incluirse
enzimas, hormonas y otros solutos proteináceos o no proteináceos. En
realizaciones preferidas, el anticuerpo se purificará: (I) hasta más
del 95% en peso del anticuerpo tal como se determinó mediante el
procedimiento de Lowry, y más preferiblemente más del 99% en peso,
(2) hasta un grado suficiente para obtener por lo menos 15 residuos
de una secuencia de aminoácidos interna o N-terminal
mediante un secuenciador de taza giratoria, o (3) hasta la
homogeneidad mediante SDS-PAGE en condiciones
reductoras o no reductoras utilizando azul de Coomassie o,
preferiblemente, tinción de plata. El anticuerpo aislado incluye el
anticuerpo in situ dentro de células recombinantes ya que
faltará por lo menos un componente del entorno natural del
anticuerpo. Generalmente, no obstante, la preparación del anticuerpo
aislado requerirá por lo menos una etapa de purificación.
Tal como se utiliza en la presente, la palabra
"marcador" se refiere a un compuesto detectable que se conjuga
directa o indirectamente con el anticuerpo para generar un
anticuerpo "marcado". El marcador puede ser detectable por sí
mismo (por ejemplo, marcadores de radioisótopos o marcadores
fluorescentes) o, en el caso de un marcador enzimático, puede
catalizar la alteración química de un compuesto sustrato que es
detectable. El marcador también puede ser una entidad no detectable
tal como una toxina.
Por "fase sólida" se entiende una matriz no
acuosa a la que puede adherirse el anticuerpo de la presente
invención. Entre los ejemplos de fases sólidas incluidos en la
presente se incluyen aquellas formadas en parte o por completo por
vidrio (por ejemplo, vidrio de poro controlado), por polisacáridos
(por ejemplo, agarosa), poliacrilamidas, poliestireno, alcohol
polivinílico y siliconas. En algunas realizaciones, dependiendo del
contexto, la fase sólida puede comprender el pocillo de una placa de
análisis; en otras se trata de una columna de purificación (por
ejemplo, una columna de cromatografía de afinidad). Este término
también incluye una fase sólida discontinua de partículas aisladas,
tales como las que se describen en la patente de EE.UU. US
4.275.149.
Un "liposoma" es una pequeña vesícula
compuesta por varios tipos de lípidos, fosfolípidos y/o surfactantes
de utilidad en la administración de un fármaco (tal como un
polipéptido PRO320 o un anticuerpo del mismo) a un mamífero. Los
componentes del liposoma suelen disponerse en una bicapa, parecida a
la disposición lipídica de las membranas biológicas.
Una "molécula pequeña" se define en la
presente como la que tiene un peso molecular por debajo de
aproximadamente 500 daltons.
La presente invención proporciona secuencias de
nucleótidos identificadas y aisladas recientemente que codifican
polipéptidos a los que en la presente solicitud se ha hecho
referencia como PRO320. En particular, se ha identificado y aislado
el polipéptido PRO320 que codifica los ADNc, tal como se describe
con mayor detalle en los siguientes ejemplos.
Tal como se ha descrito en los siguientes
ejemplos, el polipéptido PRO320 que codifica clones de ADNc ha sido
presentado junto con la ATCC. Las actuales secuencias de nucleótidos
de los clones pueden ser determinadas fácilmente por el experto en
la materia secuenciando los clones presentados mediante
procedimientos sistemáticos en el estado de la técnica. Las
secuencias de aminoácidos predichas pueden determinarse a partir de
las secuencias de nucleótidos utilizando las técnicas habituales. En
el caso del polipéptido PRO320 y el ácido nucleico codificante
descrito en la presente, los solicitantes han identificado lo que se
cree que representa el mejor marco de lectura identificable con
información de la secuencia disponible por ahora.
Además del polipéptido PRO320 de secuencia
natural completa descrito en la presente, se contempla la
preparación de variantes PRO320. Las variantes PRO320 pueden
prepararse introduciendo modificaciones apropiadas en nucleótidos
del ADN PRO320, y/o mediante la síntesis del polipéptido PRO320
deseado. Los expertos en la materia podrán apreciar que las
modificaciones en los aminoácidos pueden alterar los procesos
postraduccionales del polipéptido PRO320, tales como modificar el
número o la posición de los sitios de glucosilación o alterar las
características de anclaje de la membrana.
Pueden realizarse variaciones en toda la
longitud del PRO320 de secuencia natural o en varios dominios del
PRO320 descrito en la presente, por ejemplo, utilizando cualquiera
de las técnicas e instrucciones de mutaciones conservadoras y no
conservadoras establecidas anteriormente, por ejemplo, en la patente
de EE.UU. US 5.364.934. Las variaciones pueden ser una sustitución,
deleción o inserción de uno o más codones que codifican el PRO320
que dé lugar a una modificación en la secuencia de aminoácidos del
PRO320 comparado con el PRO320 de secuencia natural. La variación
puede llevarse a cabo mediante la sustitución de por lo menos un
aminoácido por cualquier otro aminoácido en uno o más de los
dominios del PRO320. Puede determinarse qué residuo de aminoácidos
puede insertarse, sustituirse o eliminarse sin influir de manera
adversa en la actividad deseada comparando la secuencia del PRO0320
con la de las moléculas proteínicas homólogas conocidas y
minimizando el número de modificaciones en la secuencia de
aminoácidos realizado en regiones de homología elevada. Las
sustituciones de aminoácidos pueden ser el resultado de sustituir un
aminoácido por otro aminoácido que tiene propiedades estructurales
y/o químicas similares, tales como la sustitución de una leucina por
una serina, es decir, sustituciones de aminoácidos conservadoras.
Las inserciones o deleciones pueden llevarse a cabo en el intervalo
de aproximadamente 1 a 5 aminoácidos. La variación permitida puede
determinarse realizando sistemáticamente inserciones, deleciones o
sustituciones de aminoácidos en la secuencia y comprobando las
variantes resultantes en función de la actividad manifestada por la
secuencia natural madura o en toda su longitud.
En la presente se proporcionan fragmentos del
polipéptido PRO320. Tales fragmentos pueden estar truncados en el
extremo terminal N o el extremo terminal C, o pueden carecer de
residuos internos, por ejemplo, cuando se comparan con una proteína
natural en toda su longitud. Algunos fragmentos carecen de residuos
de aminoácidos que no son esenciales para la actividad biológica
deseada del polipéptido PRO320.
Los fragmentos PRO320 pueden prepararse mediante
cualquiera de numerosas técnicas convencionales. Los fragmentos de
péptidos deseados pueden sintetizarse químicamente. Una técnica
alternativa implica la generación de fragmentos PRO320 mediante
digestión enzimática, por ejemplo, tratando la proteína con una
enzima conocida para escindir proteínas en sitios determinados por
residuos de aminoácidos particulares, o mediante digestión del ADN
con enzimas de restricción apropiadas y aislando el fragmento
deseado. Aún otra técnica apropiada implica aislar y amplificar un
fragmento de ADN que codifica un fragmento polipeptídico deseado,
mediante reacción en cadena de la polimerasa (RCP). Los
oligonucleótidos que determinan los extremos del fragmento de ADN
son utilizados en los cebadores 5' y 3' en la RCP. Preferiblemente,
los fragmentos del polipéptido PRO320 comparten por lo menos una
actividad biológica y/o inmunológica con el polipéptido PRO320
natural representado en la figura 2 (SEC ID N.º: 2).
En realizaciones particulares, se muestran
sustituciones conservadoras de interés en la tabla 3 bajo el
encabezamiento de sustituciones preferidas. Si tales sustituciones
producen un cambio en la actividad biológica, a continuación se
introducen cambios más sustanciales, denominados sustituciones
ejemplarizadoras en la tabla 3, o tal como también se ha descrito
posteriormente en referencia a clases de aminoácidos, y se criban
los productos.
Se realizan modificaciones sustanciales en la
función o la identidad inmunológica del polipéptido PRO320
seleccionando sustituciones que difieren notablemente en su efecto
sobre el mantenimiento de: (a) la estructura del esqueleto del
polipéptido en el área de la sustitución, por ejemplo, como
conformación en hoja o hélice, (b) la carga o hidrofobicidad de la
molécula en el sitio diana, o (c) el abultamiento de la cadena
lateral. Los residuos de aparición natural son divididos en grupos
en función de las propiedades de la cadena lateral habitual:
(1) hidrófobos: norleucina, met, ala, val, leu,
ile;
(2) hidrófilos neutros: cys, ser, thr;
(3) ácidos: asp, glu;
(4) básicos: asn, gln, his, lys, arg;
(5) residuos que influyen en la orientación de
la cadena: gly, pro; y
(6) aromáticos: trp, tyr, phe.
Las sustituciones no conservadoras implicarán el
intercambio de un elemento de una de estas clases por otra clase.
Tales residuos sustituidos también pueden introducirse en los sitios
de sustitución conservadora o, más preferiblemente, en los sitios
(no conservados) restantes.
Las variaciones pueden realizarse utilizando
procedimientos conocidos en el estado de la técnica, tales como
mutagénesis (dirigida) mediada por oligonucleótidos, barrido de
alanina y mutagénesis mediante RCP [Carter y otros, Nucl. Acids
Res. 13: 4.331 (1986); Zoller y otros, Nucl. Acids
Res., 10: 6.487 (1987)], mutagénesis por inserción de un casete
[Wells y otros, Gene, 34: 315 (1995)], mutagénesis de
selección por restricción [Wells y otros, Philos. Trans. R. Soc.
London Sera, 317: 415 (1986)] o pueden llevarse a cabo
otras técnicas conocidas sobre el ADN clonado para producir el ADN
de la variante del PRO320.
El análisis de aminoácidos mediante barrido
también puede utilizarse para identificar uno o más aminoácidos a lo
largo de una secuencia contigua. Entre los aminoácidos de barrido
preferidos son aminoácidos neutros relativamente pequeños. Entre
dichos aminoácidos se incluyen alanina, glicina, serina y cisteína.
La alanina es habitualmente un aminoácido de barrido preferido entre
este grupo porque elimina la cadena lateral más allá del carbono
beta y es menos probable alterar la conformación de la cadena
principal de la variante [Cunningham y Wells, Science,
244: 1.081-1.085 (1989)]. La alanina es
también habitualmente preferida porque es el aminoácido más
frecuente. Además, con frecuencia se encuentra tanto en posición
oculta como expuesta [Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman
& Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol., 150: 1
(1976)]. Si la sustitución de alanina no produce cantidades
suficientes de variante, puede utilizarse un aminoácido
isostérico.
Las modificaciones covalentes del PRO320 se
incluyen dentro del alcance de esta invención. Un tipo de
modificación covalente incluye la reacción de residuos de
aminoácidos dirigidos de un polipéptido PRO320 con un agente de
derivación orgánica que es capaz de reaccionar con cadenas laterales
seleccionadas o con los residuos de los extremos terminales N o C
del PRO320. La derivatización con agentes bifuncionales es útil, por
ejemplo, para la formación de enlaces transversales.
PRO320 en una matriz de apoyo o superficie
insoluble al agua de uso en el procedimiento para purificar
anticuerpos anti-PRO320, y viceversa. Entre los
agentes habitualmente utilizados para la formación de enlaces
transversales se incluyen, por ejemplo:
1,1-bis(diazoacetil)-2-feniletano,
glutaraldehído, ésteres N-hidroxisuccinimida, por
ejemplo, ésteres con ácido 4-ácido salicílico, imidoésteres
homobifuncionales, incluidos ésteres disuccinimidil tales como
3,3'-ditiobis (succinimidilpropionato), maleimidas
bifuncionales tales como
bis-Nmaleimido-1,8-octano
y agentes tales como
metil-3-[(p-acidofenil) dithio]
propioimidato.
Otras modificaciones incluyen desamidación de
residuos de glutaminil y asparaginil con los residuos
correspondientes de glutamil y aspartil, respectivamente,
hidroxilación de prolina y lisina, fosforilación de grupos hidroxilo
de residuos seril o treonil, metilación de los grupos
\alpha-amino de cadenas laterales de lisina,
arginina e histidina [T.E. Creighton, Proteins: Structure and
Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco,
págs. 79-86 (1983)], acetilación de la amina del
extremo terminal N y amidación de cualquier grupo carboxílico del
extremo terminal C.
Otro tipo de modificación covalente del
polipéptido PRO320 incluida dentro del alcance de esta invención
comprende la alteración del patrón de glucosilación natural del
polipéptido. Para los propósitos de la presente, por "alteración
del patrón de glucosilación natural" se entiende eliminar uno o
más partes de carbohidratos halladas en el PRO320 de secuencia
natural (bien por eliminación del sitio de glucosilación subyacente,
o mediante eliminación de la glucosilación por medios químicos y/o
enzimáticos), y/o añadiendo uno o más sitios de glucosilación que no
existen en el PRO320 de secuencia natural. Además, la expresión
incluye cambios cualitativos en la glucosilación de las proteínas
naturales, que implican un cambio en la naturaleza y las
proporciones de las diversas partes de carbohidratos presentes.
La adición de sitios de glucosilación en el
polipéptido PRO320 puede llevarse a cabo mediante la alteración de
la secuencia de aminoácidos. La alteración puede realizarse, por
ejemplo, mediante la adición de, o la sustitución por, uno o más
residuos de serina o treonina en el PRO320 de secuencia natural
(para los sitios de glucosilación unidos a O). La secuencia de
aminoácidos del PRO320 puede alterarse opcionalmente a través de
cambios en el ADN, en particular mutando el ADN que codifica el
polipéptido PRO320 en bases preseleccionadas tales que se generan
codones que se transformarán en los aminoácidos deseados.
Otras formas de aumentar el número de partes de
carbohidratos en el polipéptido PRO320 son mediante acoplamiento
químico o enzimático de glucósidos al polipéptido. Tales
procedimientos son descritos en el estado de la técnica, por
ejemplo, en el documento WO 87/05330 publicado el 11 de septiembre
de 1987, y en Aplin y Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem. págs.
259-306 (1981).
La eliminación de las partes de carbohidratos
presentes en el polipéptido PRO320 puede llevarse a cabo química o
enzimáticamente o mediante sustitución mutacional de codones que
codifican residuos de aminoácidos que sirven de dianas en la
glucosilación. Las técnicas de desglucosilación química son
conocidas en el estado de la técnica y han sido descritas, por
ejemplo, por Hakimuddin y otros, Arch. Biochem. Biophys.,
259: 52 (1987) y por Edge y otros, Anal. Biochem.,
118: 131 (1981). La escisión enzimática de partes de carbohidratos
en polipéptidos puede conseguirse mediante la utilización de una
variedad de endo y exoglucosidasas tal como se ha descrito en
Thotakura y otros, Meth. Enzymol., 138: 350
(1987).
Otro tipo de modificación covalente del PRO320
comprende unir el polipéptido PRO320 con uno de una variedad de
polímeros no proteináceos, por ejemplo, polietilenglicol (PEG),
polipropilenglicol o polioxialquilenos, de la manera establecida
anteriormente en las patentes de EE.UU. US 4.640.835; 4.496.689;
4.301.144; 4.610.411; 4.791.192 o 4.179.337.
El polipéptido PRO320 de la presente invención
también puede modificarse de tal modo que forme una molécula
quimérica que comprenda el PRO320 fusionado con otro polipéptido
heterólogo o con una secuencia de aminoácidos.
En una realización, tal molécula quimérica
comprende una fusión del polipéptido PRO320 con un polipéptido
tag que proporciona un epítopo al cual puede unirse
selectivamente un anticuerpo anti-tag. El epítopo
tag generalmente se sitúa en los extremos amino o carboxílico
del polipéptido PRO320. La presencia de tales formas etiquetadas
(tagged) del polipéptido PRO320 puede detectarse utilizando
un anticuerpo contra el polipéptido tag. Asimismo, la
provisión del epítopo tag permite purificar fácilmente el
polipéptido PRO320 mediante purificación por afinidad utilizando un
anticuerpo anti-tag u otro tipo de matriz de
afinidad que se una al epítopo tag. Varios polipéptidos
tag y sus anticuerpos respectivos son bien conocidos en el
estado de la técnica. Entre los ejemplos se incluyen los tags
poli-histidina (poli-his) o
poli-histidina-glicina
(poli-his-gly); el polipéptido
tag de la gripe HA y su anticuerpo 12CA5 [Field y otros,
Mol. Cell. Biol., 8; 2.159-2.165
(1988)]; el tag c-myc y sus anticuerpos 8F9,
3C7, 6E10, G4, B7 y 9E10 [Evan y otros, Molecular and Cellular
Biology, 5: 3.610-3.616 (1985)]; y el
tag de la glucoproteína D (gD) del virus del herpes simple y
su anticuerpo [Paborsky y otros, Protein Engineering,
3(6): 547-553 (1990)]. Otros polipéptidos
tag son el péptido Flag [Hopp y otros, BioTechnology,
6: 1.204-1.210 (1988)]; el péptido epítopo
KT3 (Martin y otros, Science, 255:
192-194 (1992)]; un péptido epítopo de la
tubulina-\alpha [Skinner y otros, J. Biol.
Chem. 266: 15.163-15.166 (1991)]; y el
tag del péptido proteínico del gen 10 del T7
[Lutz-Freyermuth y otros, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 87: 6.393-6.397 (1990)].
En una realización alternativa, la molécula
quimérica puede comprender una fusión del polipéptido PRO320 con una
inmunoglobulina o una región particular de una inmunoglobulina. Para
una forma bivalente de la molécula quimérica (a la que también se
hace referencia como "inmunoadhesina"), dicha fusión podría ser
la región Fc de una molécula IgG. Las fusiones Ig incluyen
preferiblemente la sustitución de una forma soluble (dominio
transmembrana eliminado o inactivado) de un polipéptido PRO320 en
lugar de por lo menos una región variable dentro de una molécula de
Ig. En una realización particularmente preferida, la fusión de las
inmunoglobulinas incluye la bisagra, CH2 y CH3, o la bisagra, las
regiones CH1, CH2 y CH3 de una molécula de IgG1. Para la producción
de fusiones de inmunoglobulinas véase también la patente de EE.UU.
US 5.428.130 publicada el 27 de junio de 1995.
La descripción que aparece a continuación se
refiere principalmente a la producción del PRO320 mediante el
cultivo de células transformadas o transfectadas con un vector que
contiene ácido nucleico del PRO320. Obviamente, también se contempla
el uso de procedimientos alternativos, bien conocidos en el estado
de la técnica, en la preparación del PRO320.
Por ejemplo la secuencia del polipéptido PRO320,
o partes del mismo, puede producirse mediante síntesis directa
utilizando técnicas de fase sólida [véase, por ejemplo, Stewart y
otros, Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H.
Freeman Co., San Francisco, CA (1969); Merrifield, J. Am. Chem.
Soc., 85: 2.149-2.154 (1963)]. Puede
realizarse síntesis de proteínas in vitro utilizando técnicas
manuales o mediante automatización. Puede realizarse síntesis
automatizada, por ejemplo, utilizando un sintetizador de péptidos
(Applied Biosystems Peptide Synthesizer; Foster City, CA) y
siguiendo las instrucciones del fabricante. Varias partes del
polipéptido PRO320 pueden sintetizarse químicamente por separado y
combinarse después mediante procedimientos químicos o enzimáticos
para producir el polipéptido PRO320 en toda su longitud.
El ADN que codifica el PRO320 puede obtenerse a
partir de una genoteca de ADNc preparada a partir de un tejido que
se cree que contiene el ARNm del PRO320 y para expresarlo a un nivel
detectable. Por consiguiente, puede obtenerse ADN del PRO320 humano
a partir de una genoteca de ADNc preparada a partir de tejido
humano, tal como se ha descrito en los ejemplos. El gen que codifica
el PRO320 también puede obtenerse a partir de una genoteca genómica
o mediante procedimientos sintéticos conocidos (por ejemplo,
síntesis automatizada de ácidos nucleicos).
El cribado de genotecas puede realizarse con
sondas (tales como anticuerpos del PRO320 o como oligonucleótidos de
por lo menos unas 20-80 bases) diseñadas para la
identidad del gen de interés o la proteína codificada por éste. El
cribado de ADNc o de una genoteca genómica con la sonda seleccionada
puede realizarse utilizando intervenciones estándar, tales como las
descritas en Sambrook y otros, Molecular Cloning : A Laboratory
Manual (Nueva York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989).
Un medio alternativo para aislar el gen que codifica el PRO320 es
utilizar la metodología de la RCP [Sambrook y otros, supra;
Dieffenbach y otros, PCR Primer: A Laboratory Manual (Cold
Spring Harbor Laboratory Press, 1995)].
Los ejemplos que se ofrecen a continuación
describen técnicas para cribar una genoteca de ADNc. Las secuencias
de oligonucleótidos seleccionadas como sondas deberían ser
suficientemente largas y nada ambiguas de tal modo que se reduzca al
mínimo la aparición de falsos positivos. El oligonucleótido es
marcado preferiblemente de manera que pueda ser detectado en la
hibridación del ADN en la genoteca donde será cribado. Los
procedimientos de marcado son bien conocidos en la técnica, e
incluyen el uso de radiomarcadores como biotinilización de ATP
marcado con ^{32}P o marcado de enzimas. Las condiciones de
hibridación, entre las que se incluyen restricción moderada y
restricción elevada, se proporcionan en Sambrook y otros,
supra.
Las secuencias identificadas en tales
procedimientos de cribado de genotecas pueden compararse y alinearse
con otras secuencias conocidas presentadas y disponibles en bases de
datos públicas tales como GenBank o en otras bases de datos de
secuencias privadas. La identidad de secuencia (a nivel de
aminoácidos o de nucleótidos) dentro de regiones determinadas de la
molécula o a lo largo de toda la longitud de la secuencia pueden
determinarse utilizando procedimientos conocidos en el estado de la
técnica y tal como se ha descrito en la presente.
El ácido nucleico con una secuencia que codifica
proteínas puede obtenerse mediante cribado de ADNc seleccionado o de
genotecas genómicas utilizando la secuencia de aminoácidos deducida
a la que se hace referencia en la presente por primera vez, y, si es
necesario, utilizando procedimientos de ampliación de los cebadores
convencionales tal como se ha descrito en Sambrook y otros,
supra, para detectar precursores y procesar intermediarios de
ARNm que puede que no hayan sido sometidos a transcripción inversa
de ADNc.
Las células huésped son transfectadas o
transformadas con vectores de expresión o clonación descritos en la
presente para la producción del PRO320 y cultivados en medios
nutritivos convencionales modificados de manera apropiada para
inducir promotores, seleccionar transformadores, o amplificar los
genes que codifican las secuencias deseadas. Las condiciones del
cultivo, tales como el medio, la temperatura, el pH y similares,
pueden ser seleccionadas por cualquier experto en la materia. En
general, los principios, protocolos y técnicas prácticas para
maximizar la productividad de los cultivos celulares pueden hallarse
en: Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M.
Butler, ed. (IRL Press, 1991) y Sambrook y otros, supra.
Los procedimientos de transinfección de células
eucariotas y transformación de células procariotas son conocidos por
el experto en la materia, por ejemplo, CaCl_{2}, CaPO_{4},
mediado por liposomas y electroporación. Dependiendo de la célula
huésped utilizada, la transformación se lleva a cabo utilizando
técnicas estándar apropiadas para tales células. El tratamiento con
calcio que recurre al cloruro de calcio, tal como se ha descrito en
Sambrook y otros, supra, o a la electroporación generalmente
se utiliza para procariotas. La infección con Agrobacterium
tumefaciens se utiliza para la transformación de algunas células
vegetales, tal como se ha descrito en Shaw y otros, Gene,
23: 315 (1983) y en el documento WO 89/05859 publicado el 29
de junio de 1989. En el caso de las células de mamíferos que carecen
de tales paredes celulares, puede utilizarse el procedimiento de
precipitación de fosfato de calcio de Graham y van der Eb,
Virology, 52: 456-457 (1978). Los
aspectos generales de las transfecciones del sistema de células
huésped de mamíferos se han descrito en la patente de EE.UU. US
4.399.216. Las transformaciones en levadura habitualmente se llevan
a cabo de acuerdo con el procedimiento de Van Solingen y otros,
J. Bact., 130: 946 (1977) y Hsiao y otros, Proc.
Natl. Acad. Sci. (EE.UU.), 76: 3.829 (1979). No obstante,
también pueden utilizarse otros procedimientos para introducir ADN a
las células, tales como la microinyección nuclear, la
electroporación, la fusión de protoplastos bacterianos con células
intactas, o policationes, por ejemplo, polibreno, poliornitina. Para
diversas técnicas sobre la transformación de células de mamíferos,
véase, Keown y otros, Methods in Enzymology, 185:
527-537 (1990) y Mansour y otros, Nature,
336: 348-352 (1988).
Las células huésped adecuadas para la clonación
o expresión de ADN en los vectores de la presente invención incluyen
procariotas, levaduras, o células eucariotas superiores. Los
procariotas adecuados incluyen, pero no exclusivamente, eubacterias,
tales como organismos gramnegativos o grampositivos, por ejemplo,
enterobacterias tales como E. coli. Hay disponibles diversas
cepas de E. coli, tales como la cepa MM294 de E. coli
K12 (ATCC 31.446); E. coli X1776 (ATCC 31.537); la cepa W3110
de E. coli (ATCC 27.325) y K5 772 (ATCC 53.635). Otras
células huésped procariotas adecuadas incluyen enterobacterias tales
como Escherichia, por ejemplo, E. coli, Enterobacter,
Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, por ejemplo,
Salmonella typhimurium, Serratia, por ejemplo, Serratia
marcescans, y Shigella, así como bacilos tales como B.
subtilis y B. licheniformis (por ejemplo, B.
licheniformis 41 P descrito en DD 266.710 publicada el 12 de
abril de 1989). Pseudomonas, tales como P. aeruginosa,
y Streptomyces. Estos ejemplos son ilustrativos pero no
excluyentes. La cepa W3110 es un huésped o un huésped progenitor
particularmente preferido porque es una cepa huésped frecuente para
fermentaciones de productos de ADN recombinante. Preferiblemente la
célula huésped secreta cantidades mínimas de enzimas proteolíticas.
Por ejemplo, la cepa W3110 puede ser modificada para efectuar una
mutación genética en los genes que codifican proteínas endógenas del
huésped, con ejemplos de tales huéspedes entre los que se incluyen
la cepa IA2 de E. coli W3110, que presenta el genotipo
completo tonA; la cepa 9E4 de E. coli W3110, que presenta el
genotipo completo tonA ptr3; la cepa 27C7 de E. coli W3110
(ATCC 55,244), que presenta el genotipo completo tonA ptr3 phoA E15
(argF-l ac)1 69 degP ompT kon'; la cepa 37D6
de E. coli W3110, que presenta el genotipo completo tonA
ptr3 phoA E15 (argF-l ac)1 69 degP ompT rbs7
ilvG kon'; la cepa 40B4 de E. coli W3110, que es una cepa
37D6 con una mutación de deleción degP no resistente a la
kanamicina; y una cepa de E. coli que presenta una proteasa
periplasmática mutante a la que se hace referencia en la patente de
EE.UU. US 4.946.783 publicada el 7 de agosto de 1990.
Alternativamente, son adecuados procedimientos de clonación in
vitro, por ejemplo, RCP u otras reacciones de la polimerasa de
ácidos nucleicos.
Además de procariotas, microbios eucariotas
tales como los hongos filamentosos o la levadura son huéspedes
apropiados para la clonación o expresión de huéspedes para vectores
que codifican el PRO320. Saccharomyces cerevisiae es un
microorganismo huésped eucariota inferior utilizado con frecuencia.
Entre otros se incluyen Schizasaccharomyces pombe (Beach y
Nurse, Nature, 290: 140 [1981]; EP 139.383 publicada
el 2 de mayo de 1985); huéspedes de Kluyveromyces (patente de
EE.UU. US 4.943.529; Fleer y otros, Bio/Technology, 9:
968-975 (1991)) tales como, por ejemplo, K.
lactis (MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt y
otros, J. Bacteriol., 737 [1983]), K. fragilis
(ATCC 12.424). K. bulgaricus (ATCC 16.045), K.
wickeramii (ATCC 24.178), K. waltii (ATCC 56.500), K.
drosophilarum (ATCC 36.906; Van den Berg y otros,
Bio/Technology, 8: 135 (1990)), K.
thermotolerans, y K. marxiamus: yarrowia (EP 402.226);
Pichia pastoris (EP 183.070; Sreekrishna y otros, J. Basic
Microbiol., 28: 265-278 [1988]);
Candida; Trichoderma reesia (EP 244.234): Neurospora
crassa (Case y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
76: 5.259-5.263 [1979]);
Schwanniomyces tales como Schwanniomyces occidentalis
(EP 394.538 publicada el 31 de octubre de 1990); y hongos
filamentosos tales como, por ejemplo, Neurospora, Penicillium,
Tolypocladium (documento WO 91/00357 publicado el 10 de enero de
1991), y huéspedes de Aspergillus tales como A.
nidulans (Ballance y otros, Biochem. Biophys. Res.
Commun., 112: 284-289 [1983]; Tilburn y
otros, Gene, 26: 205-221 [1983];
Yelton y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:
1470-1474 (1984)) y A. niger (Kelly y Hynes,
EMBO J., 4: 475-479 [1985]). Las
levaduras metilotróficas son adecuadas en la presente e incluyen,
pero no exclusivamente, levaduras capaces de crecer sobre metanol
seleccionadas a partir de los géneros Hansenula, Candida,
Kloeckera, Pichia, Saccharomyces, Torulopsis y
Rhodotorula. Una lista de especies específicas que son
ejemplarizadoras de esta clase de levaduras puede hallarse en: C.
Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269
(1982).
Las células huésped adecuadas para la expresión
de PRO320 glucosilado proceden de organismos pluricelulares. Entre
los ejemplos de células de invertebrados se incluyen células de
insectos tales como S2 de Drosophila y Sf9 de
Spodoptera, así como células vegetales. Entre los ejemplos
útiles de líneas celulares huésped de mamíferos se incluyen células
ováricas (CHO) de hámster chino y células COS. Ejemplos más
específicos incluyen una línea CVI renal de mono transformada
mediante SV40 (COS-7. ATCC CRL 1651); una línea
renal embrionaria humana (células 293 o células 293 subclonadas para
crecimiento en cultivo en suspensión, Graham y otros, J. Gen.
Virol., 36: 59 (1977)); células ováricas de hámster
chino/-DHFR (CHO, Urlaub y Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 77: 4216 (1980)); células de sertoli murinas (TM4,
Mather, Biol. Reprod., 23: 243-251
(1990)); células pulmonares humanas (W138, ATCC CCL 75): células
hepáticas humanas (Hep G2, HB 8065); y tumor mamario murino
(MMT060562, ATCC CCL51). Se considera que la selección de la célula
huésped adecuada forma parte de las habilidades en el estado de la
técnica.
El ácido nucleico (por ejemplo, ADNc o ADN
genómico) que codifica el PRO320 puede ser insertado en un vector
replicable para la clonación (amplificación del ADN) o para la
expresión. Varios vectores se hallan disponibles. El vector puede
ser, por ejemplo, un plásmido, un cósmido, una partícula vírica, o
un fago. La secuencia apropiada de ácidos nucleicos puede ser
insertada en el vector mediante una variedad de intervenciones. En
general, el ADN se inserta en un sitio, o sitios, apropiado de la
endonucleasa de restricción utilizando técnicas conocidas en el
estado de la técnica. Los componentes del vector generalmente
incluyen, pero no exclusivamente, una o más de una secuencia señal,
un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un elemento
potenciador, un promotor y una secuencia de terminación de la
transcripción. La construcción de vectores adecuados que contengan
uno o más de estos componentes utiliza técnicas estándar de ligación
que son conocidas para el experto en la materia.
El PRO320 puede producirse de manera
recombinante no sólo directamente, sino también como polipéptido de
fusión con un polipéptido heterólogo, que puede ser una secuencia
señal u otro polipéptido que presente un sitio de escisión
específico en el extremo terminal N de la proteína o polipéptido
maduros. En general, la secuencia señal puede ser un componente del
vector, o puede formar parte del ADN que codifica el PRO320 que se
inserta en el vector. La secuencia señal puede ser una secuencia
señal procariota seleccionada, por ejemplo, del grupo de la
fosfatasa alcalina, la penicilinasa, Ipp, o líderes de la
enterotoxina II estable al calor. Para la secreción de levaduras la
secuencia señal puede ser, por ejemplo, el líder de la invertasa de
levadura, líder factor alfa (incluidos los líderes del factor
\alpha de Saccharomyces y Kluyveromyces, el último
descrito en la patente de EE.UU. US 5.010.182), o líder fosfatasa
ácida, líder glucoamilasa de C. albicans (EP 362.179
publicada el 4 de abril de 1990), o la señal descrita en el
documento WO 90/13646 publicado el 15 de noviembre de 1990. En la
expresión de células de mamíferos, las secuencias señal de mamíferos
pueden utilizarse para dirigir la secreción de las proteínas, tales
como secuencias señal procedentes de polipéptidos secretados de la
misma especie o de especies afines, así como líderes de secreción
vírica.
Tanto los vectores de expresión como los de
clonación contienen una secuencia de ácidos nucleicos que permite al
vector replicarse en una o más células huésped seleccionadas. Dichas
secuencias son bien conocidas para una variedad de bacterias,
levaduras y virus. El origen de replicación del plásmido pBR322 es
adecuado para la mayor parte de bacterias gramnegativas, el origen
del plásmido 2P es adecuado para la levadura, y son varios los
orígenes víricos (SV40, polioma, adenovirus, VSV o BPV) de utilidad
en la clonación de vectores en células de mamíferos.
Los vectores de expresión y clonación
habitualmente contienen un gen de selección, también denominado
marcador seleccionable. Los genes de selección habituales codifican
proteínas que: (a) confieren resistencia a antibióticos u otras
toxinas, por ejemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato, o
tetraciclina; (b) complementan deficiencias auxotróficas, o (c)
proporcionan nutrientes importantes que no se hallan disponibles en
los medios complejos, por ejemplo, el gen que codifica la
D-alanina racemasa para bacilos.
Un ejemplo de marcadores seleccionables
adecuados para células de mamíferos son aquellos que permiten la
identificación de células competentes para utilizar el ácido
nucleico que codifica el PRO320, tal como DHFR o timidina quinasa.
Una célula huésped apropiada cuando se emplea DHFR de tipo salvaje
es la línea celular CHO deficiente en actividad DHFR, preparada y
difundida tal como describieron Urlaub y otros, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 77: 4.216 (1980). Un gen de selección adecuada
para utilizar en la levadura es el gen trp1 presente en el plásmido
de levadura YRp7 [Stinchcomb y otros, Nature, 282: 39
(1979); Kingsman y otros, Gene, 7: 141 (1979);
Tschemper y otros, Gene, 10: 157 (1980)). El gen trp1
proporciona un marcador de selección para una cepa mutante de
levadura que no puede crecer sobre triptófano, por ejemplo, ATCC No.
44076 o PEP4-1 [Jones, Genetics, 85:
12 (1977)].
Los vectores de expresión y clonación
normalmente contienen un promotor unido operativamente a la
secuencia de ácidos nucleicos que codifica el PRO320 para dirigir la
síntesis de ARNm. Los promotores identificados por una variedad de
posibles células huésped son bien conocidos. Los promotores
adecuados para el uso de huéspedes procariotas incluyen los sistemas
de promotores de la \beta-lactamasa y la lactosa
[Chang y otros, Nature, 275: 615 (1978); Goeddel y
otros, Nature, 281: 544 (1979)], la fosfatasa
alcalina, un sistema de promotores del triptófano (trp) [Goeddel,
Nucleic Acids Res., 8: 4.057 (1980); EP 36.776], y
promotores híbridos tales como el promotor tac [deBoer y otros,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80: 21-25
(1983)]. Los promotores que se utilizan en los sistemas bacterianos
también contendrán una secuencia Shine-Dalgamo
(S.D.) unida operativamente al ADN que codifica el PRO320.
Entre los ejemplos de secuencias de promotores
adecuadas para utilizar con huéspedes levadura se incluyen los
promotores de 3-fosfoglicerato quinasa [Hitzeman y
otros, J. Biol. Chem., 255: 2.073 (1980)] u otras
enzimas glucolíticas [Hess y otros, J. Adv. Enzyme Reg.,
7: 149 (1968); Holland, Biochemistry, 17: 4.900
(1978)], tales como enolasa,
gliceraldehído-3-fosfato
deshidrogenasa, hexoquinasa, piruvato descarboxilasa,
fosfofructoquinasa,
glucosa-6-fosfato isomerasa,
3-fosfoglicerato mutasa, piruvato quinasa,
triosafosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa y glucoquinasa.
Otros promotores de levadura, que son promotores
inducibles que tienen la ventaja adicional de la transcripción
controlada mediante condiciones de crecimiento, son las regiones
promotoras para la alcohol deshidrogenasa 2, el isocitocromo C, la
fosfatasa ácida, las enzimas degradadoras asociadas al metabolismo
del nitrógeno, metalotioneína,
gliceraldehído-3-fosfato
deshidrogenasa y enzimas responsables de la utilización de maltosa y
galactosa. Los vectores y promotores adecuados para utilizar en la
expresión de levaduras se describen en EP 73.657.
La transcripción del PRO320 a partir de vectores
en células huésped de mamíferos es controlada, por ejemplo, por
promotores obtenidos a partir de los genomas de virus tales como el
virus del polioma, el virus de la viruela aviar (patente del Reino
Unido UK 2.211.504, publicada el 5 de julio de 1989), adenovirus
(tales como adenovirus 2), virus del papiloma bovino, virus del
sarcoma aviar, citomegalovirus, un retrovirus, virus de la hepatitis
B y virus 40 de los simios (SV40), a partir de promotores de
mamíferos heterólogos, por ejemplo, el promotor de la actina o un
promotor de inmunoglobulina, y a partir de promotores del choque de
calor, siempre que dichos promotores sean compatibles con los
sistemas de la célula huésped.
La transcripción de un ADN que codifica el
PRO320 mediante eucariotas superiores puede aumentarse insertando
una secuencia potenciadora en el vector. Los potenciadores son
elementos de ADN de acción cis, normalmente de unos 10 a 300 pb, que
actúan sobre un promotor para aumentar su transcripción. Actualmente
se conocen varias secuencias potenciadoras procedentes de genes de
mamíferos (globina, elastasa, albúmina,
\alpha-fetoproteína e insulina). Habitualmente, no
obstante, se utilizará un potenciador procedente de un virus celular
eucariota. Entre los ejemplos se incluyen el potenciador SV40 en la
última parte del extremo del origen de replicación
(100-270 pb), el potenciador del promotor precoz de
citomegalovirus, el potenciador de polioma en la última parte del
extremo del origen de replicación, y los potenciadores de
adenovirus. El potenciador puede empalmarse en el vector en la
posición 5' o 3' de la secuencia que codifica el ' - - PRO320, pero
preferiblemente se localiza en la posición 5' del promotor.
Los vectores de expresión utilizados en células
huésped eucariotas (levaduras, hongos, insectos, vegetales,
animales, humanos, o células nucleadas procedentes de otros
organismos pluricelulares) también contendrán secuencias necesarias
para la finalización de la transcripción y para la estabilización
del ARNm. Tales secuencias se hallan normalmente disponibles a
partir de regiones no traducidas 5', y ocasionalmente 3', de ADN o
ADNc eucariotas o víricos. Estas regiones contienen segmentos de
nucleótidos transcritos como fragmentos poliadenilados en la parte
no traducida del ARNm que codifica el PRO320.
Aún otros procedimientos, vectores y células
huésped adecuados para la adaptación de la síntesis del PRO320 en
cultivo recombinante de células de vertebrados se describen en:
Gething y otros, Nature, 293: 620-625
(1981); Mantei y otros, Nature, 281:
40-46 (1979); EP 117.060 y EP 117.058.
\newpage
La amplificación y/o expresión de genes puede
determinarse en una muestra directamente, por ejemplo, mediante
transferencia convencional de Southern y de Northern para
cuantificar la transcripción de ARNm [Thomas, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 77: 5.201-5.205 (1980)],
transferencia puntual (análisis de ADN), o mediante hibridación
in situ, utilizando una sonda marcada de manera apropiada, en
función de las secuencias proporcionadas en la presente.
Alternativamente, pueden emplearse anticuerpos capaces de
identificar duplicidades específicas, incluidas duplicidades de ADN,
duplicidades de ARN y duplicidades híbridas de
ADN-ARN o duplicidades de
ADN-proteína. Los anticuerpos pueden a su vez estar
marcados y el análisis puede realizarse en los sitios donde la
duplicidad se une a la superficie, de modo que sobre la formación de
duplicidad en la superficie puede detectarse la presencia de
anticuerpo unido a la duplicidad.
Alternativamente, la expresión de genes puede
determinarse mediante procedimientos inmunológicos, tales como
tinción inmunohistoquímica de células o partes de tejidos y análisis
de cultivo celular o líquidos corporales, para cuantificar
directamente la expresión de producto génico. Los anticuerpos de
utilidad para la tinción inmunohistoquímica y/o el análisis de
líquidos de la muestra pueden ser bien monoclonales o policlonales,
y pueden prepararse en cualquier mamífero. De manera conveniente,
los anticuerpos pueden prepararse contra un polipéptido PRO320 de
secuencia natural o contra un péptido sintético en función de las
secuencias de ADN proporcionadas en la presente o contra una
secuencia exógena fusionada con un ADN de PRO320 y codificante de un
epítopo de anticuerpo específico.
Las formas del PRO320 pueden recuperarse de un
medio de cultivo o de lisados de células huésped. Si están unidas a
la membrana, pueden ser liberadas de la membrana utilizando una
disolución detergente adecuada (por ejemplo,
Triton-X 100) o mediante escisión enzimática. Las
células utilizadas en la expresión del PRO320 pueden alterarse por
varios medios físicos o químicos, tales como ciclos de
congelación-licuación, sonicación, alteración
mecánica, o agentes que lisan células.
Puede ser deseable purificar el PRO320 de
proteínas celulares o polipéptidos recombinantes. Las siguientes
intervenciones son ejemplarizadoras de intervenciones de
purificación adecuadas: mediante fraccionamiento en una columna de
intercambio iónico; precipitación de etanol; HPLC de fase inversa;
cromatografía sobre sílice o sobre una resina de intercambio
catiónico, tal como DEAE; cromatofocalización;
SDS-PAGE; precipitación de sulfato de amoníaco;
filtración en gel utilizando, por ejemplo, Sephadex
G-75; columnas Sepharose de proteína A para eliminar
contaminantes tales como IgG; y columnas de quelación de metales
para unir formas etiquetadas (tagged) de epítopos del PRO320.
Pueden utilizarse diversos procedimientos de purificación de
proteínas y tales procedimientos son conocidos en el estado de la
técnica y se han descrito por ejemplo en: Deutscher, Methods in
Enzymology, 182 (1990); Scopes, Protein Purification:
Principles and Practice. Springer-Verlag, Nueva
York (1982). La etapa o etapas de purificación seleccionadas
dependerán, por ejemplo, de la naturaleza del proceso de producción
utilizado y de los PRO179, PRO320 particulares producidos.
Algunos de los posibles fármacos que pueden
utilizarse en los compuestos y procedimientos de la presente
invención son anticuerpos y fragmentos de anticuerpos que emulan la
actividad biológica de un polipéptido PRO320.
Los procedimientos para la preparación de
anticuerpos policlonales son conocidos por el experto en la materia.
Los anticuerpos policlonales pueden ser cultivados en un mamífero,
por ejemplo, mediante una o más inyecciones de un agente inmunizante
y, si se desea, un adyuvante. Habitualmente, el agente inmunizante
y/o adyuvante será inyectado en el mamífero mediante múltiples
inyecciones subcutáneas o intraperitoneales. El agente inmunizante
puede incluir el polipéptido PRO320 o una proteína de fusión del
mismo. Puede ser útil conjugar el agente inmunizante con una
proteína que se sabe que es inmunogénica en el mamífero que es
inmunizado. Entre los ejemplos de tales proteínas inmunogénicas se
incluyen pero no exclusivamente la hemocianina de lapa, la albúmina
sérica, la tiroglobulina bovina y el inhibidor de la tripsina de
soja. Entre los ejemplos de adyuvantes que pueden utilizarse se
incluyen adyuvante completo de Freund y adyuvante
MPL-TDM (monofosforil lípido A, dicorinomicolato de
trealosa sintético). El protocolo de inmunización puede ser
seleccionado por cualquier experto en la materia.
Los anticuerpos pueden, alternativamente, ser
anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos monoclonales pueden
prepararse utilizando procedimientos de hibridoma, tales como los
descritos por Kohler y Milstein, Nature, 256: 495
(1975). En un procedimiento de hibridoma, un ratón, un hámster, u
otro animal huésped apropiado, es habitualmente inmunizado con un
agente inmunizante para obtener linfocitos que produzcan o sean
capaces de producir anticuerpos que se unirán específicamente al
agente inmunizante. Alternativamente, los linfocitos pueden ser
inmunizados in vitro.
El agente inmunizante habitualmente incluirá el
polipéptido PRO320 de una proteína de fusión del mismo.
Generalmente, se utilizan linfocitos de sangre periférica
("PBL") si desean obtenerse células de origen humano, o se
utilizan células del bazo o células de los nódulos linfáticos si no
se desean fuentes mamíferas humanas. A continuación se fusionan los
linfocitos con una línea celular inmortalizada utilizando un agente
de fusión adecuado, tal como polietilenglicol, para formar una
célula de hibridoma [Goding, Monoclonal Antibodies: Principles
and Practice, Academic Press, (1986) págs.
59-103]. Las líneas celulares inmortalizadas
normalmente son transformadas en células de mamíferos, en particular
en células de mieloma originarias de roedor, bovino y humano.
Normalmente, se utilizan líneas celulares de mieloma de rata o de
ratón. Las células de hibridoma pueden cultivarse en un medio de
cultivo adecuado que preferiblemente contenga una o más sustancias
que inhiban el crecimiento o la supervivencia de las células
inmortalizadas no fusionadas. Por ejemplo, si las células
progenitoras carecen de la enzima hipoxantina guanina fosforribosil
transferasa (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo para los hibridomas
habitualmente incluirá hipoxantina, aminopterina y timidina
("medio HAT"), sustancias que evitan el crecimiento de células
deficientes para HGPRT.
Las líneas celulares inmortalizadas preferidas
son las que se fusionan de manera eficaz, sostienen una expresión
elevada estable del anticuerpo por parte de las células que producen
el anticuerpo seleccionado y son sensibles a un medio tal como el
medio HAT. Las líneas celulares inmortalizadas más preferidas son
líneas de mieloma murinas, que pueden obtenerse, por ejemplo, en el
Salk institute Cell Distribution Center, San Diego, California y la
American Type Culture Collection, Manassas, Virginia. Las líneas
celulares de mieloma humano y heteromieloma
murino-humano también han sido descritas para la
producción de anticuerpos monoclonales humanos [Kozbor, J.
Immunol., 133: 3.001 (1984); Brodeur y otros,
Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,
Marcel Dekker, Inc., Nueva York, (1987) págs.
51-63].
El medio de cultivo en el que se cultivan las
células de hibridoma puede ser analizado en busca de la presencia de
anticuerpos monoclonales dirigidos contra PRO320. Preferiblemente,
la especificidad de unión de los anticuerpos monoclonales producidos
por las células de hibridoma es determinada por inmunoprecipitación
o mediante un análisis de unión in vitro, tal como
radioinmunoanálisis (RIA) o enzimoinmunoanálisis de adsorción
(ELISA). Tales técnicas y análisis son conocidos en el estado de la
técnica. La afinidad de unión del anticuerpo monoclonal puede, por
ejemplo, ser determinada mediante el análisis Scatchard de Munson y
Pollard, Anal. Biochem., 107: 220 (1980).
Una vez identificadas las células de hibridoma
deseadas, pueden subclonarse los clones mediante procedimientos de
dilución limitantes y cultivarse mediante procedimientos estándar
[Coding, supra]. Los medios de cultivo adecuados para este
propósito incluyen, por ejemplo, Dulbecco's Modified Eagle's Medium
y medio RPMI-1640. Alternativamente, las células de
hibridoma pueden cultivarse in vivo como ascitis en un
mamífero.
Los anticuerpos monoclonales secretados por los
subclones pueden ser aislados o purificados del medio de cultivo o
líquido de ascitis mediante procedimientos convencionales de
purificación de inmunoglobulinas tales como, por ejemplo, columna
Sepharose de proteína A, cromatografía en hidroxiapatita,
electroforesis en gel, diálisis, o cromatografía de afinidad.
Los anticuerpos monoclonales también pueden
sintetizarse mediante procedimientos de ADN recombinante, tales como
los que se describen en la patente de EE.UU. US 4.816.567. El ADN
que codifica los anticuerpos monoclonales de la invención puede
aislarse fácilmente y secuenciarse utilizando procedimientos
convencionales (por ejemplo, utilizando sondas de oligonucleótidos
que son capaces de unirse específicamente a genes que codifican las
cadenas pesada y ligera de anticuerpos murinos). Las células de
hibridoma de la invención actúan como fuente preferida de tal ADN.
Una vez rotado, puede colocarse el ADN en vectores de expresión, que
a continuación son transfectados a células huésped tales como
células COS de simio, células ováricas de hámster chino (CHO), o
células de mieloma que de otro modo no producen proteína
inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuerpos
monoclonales en células huésped recombinantes. El ADN también puede
ser modificado, por ejemplo, sustituyendo con la secuencia
codificante de los dominios constantes de las cadenas pesada y
ligera humanas las secuencias murinas homólogas [patente de EE.UU.
US 4.816.567; Morrison y otros, supra] o mediante la unión
covalente de toda la secuencia codificante de la inmunoglobulina o
de parte de la secuencia codificante de un polipéptido distinto de
la inmunoglobulina. Dicho polipéptido distinto de la inmunoglobulina
puede ser sustituido en los dominios constantes de un anticuerpo de
la invención, o puede ser sustituido en los dominios variables de un
sitio de unión al antígeno de un anticuerpo de la invención para
crear un anticuerpo bivalente quimérico.
Los anticuerpos pueden ser anticuerpos
monovalentes. Los procedimientos para la preparación de anticuerpos
monovalentes son bien conocidos en el estado de la técnica. Por
ejemplo, un procedimiento implica la expresión recombinante de la
cadena ligera y la cadena pesada modificada de la inmunoglobulina.
La cadena pesada generalmente está truncada en cualquier punto de la
región Fc para evitar la formación de enlaces transversales en la
cadena pesada. Alternativamente, los residuos relevantes de cisteína
son sustituidos por otros residuos de aminoácidos o son eliminados
para evitar la formación de enlaces transversales.
Los procedimientos in vitro también son
adecuados para la preparación de anticuerpos monovalentes. La
digestión de anticuerpos para producir fragmentos de los mismos, en
particular, fragmentos Fab, puede llevarse a cabo utilizando
técnicas sistemáticas conocidas en el estado de la técnica.
\newpage
Los anticuerpos de la invención pueden
comprender además anticuerpos humanizados o anticuerpos humanos. Las
formas humanizadas de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos)
son inmunoglobulinas quiméricas, cadenas de inmunoglobulinas o
fragmentos de las mismas (tales como Fv, Fab, Fab',
F(ab')_{2} u otras subsecuencias de anticuerpos de unión a
antígenos) que contienen una secuencia mínima procedente de una
inmunoglobulina no humana. Los anticuerpos humanizados incluyen
inmunoglobulinas humanas (anticuerpo del receptor) en las que los
residuos de una región determinante de complementariedad (CDR) del
receptor son sustituidos por residuos procedentes de una CDR de una
especie no humana (anticuerpo de donante), tal como un ratón, una
rata o un conejo con la especificidad, afinidad y capacidad
deseadas. En algunos casos, los residuos de entramado Fv de la
inmunoglobulina humana son sustituidos por residuos no humanos
correspondientes. Los anticuerpos humanizados también pueden
comprender residuos que no se hallen ni en el anticuerpo del
receptor ni en la CDR importada o las secuencias de entramado. En
general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos
de por lo menos uno, y habitualmente dos, de los dominios variables,
en el que todas o sustancialmente todas las regiones CDR
corresponden a las de una inmunoglobulina no humana y todas o
sustancialmente todas las regiones FR son las de una secuencia
consenso de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado también
comprenderá de manera óptima por lo menos una parte de una región
constante de inmunoglobulina (Fc), habitualmente la de una
inmunoglobulina humana [Jones y otros, Nature, 321:
522-525 (1986); Riechmann y otros, Nature,
332: 323-329 (1988); y Presta, Curr. Op.
Struct. Biol., 2: 593-596 (1992)].
Los procedimientos para la obtención de
anticuerpos humanizados no humanos son bien conocidos en el estado
de la técnica. Generalmente, un anticuerpo humanizado tiene uno o
más residuos de aminoácidos procedentes de una fuente que no es
humana. A menudo se hace referencia a estos residuos de aminoácidos
no humanos como residuos de "importación", que habitualmente se
obtienen a partir de un dominio variable de "importación". La
humanización puede realizarse básicamente siguiendo el procedimiento
de Winter y sus colaboradores [Jones y otros, Nature,
321: 522-525 (1986); Riechmann y otros,
Nature, 332: 323-327 (1988); Verhocyen
y otros, Science, 239: 1.534-1.536
(1988)], mediante la sustitución de CDR o secuencias CDR de roedor
por las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. Por
consiguiente, tales anticuerpos "humanizados" son anticuerpos
quiméricos (patente de EE.UU. US 4.816.567), en los que
sustancialmente menos de un dominio variable humano intacto ha sido
sustituido por la secuencia correspondiente de una especie no
humana. A la práctica, los anticuerpos humanizados son habitualmente
anticuerpos humanos en los que algunos residuos CDR y posiblemente
algunos residuos FR son sustituidos por residuos procedentes de
sitios análogos en anticuerpos de roedores.
Los anticuerpos humanos también pueden
producirse utilizando varias técnicas conocidas en el estado de la
técnica, incluidas las genotecas de bacteriófagos [Hoogenboom y
Winter, J. Mol. Biol., 227: 381 (1991); Marks y otros,
J. Mol. Biol., 222: 581 (1991)]. Las técnicas de Cole
y otros, y Boerner y otros, también se hallan disponibles para la
preparación de anticuerpos monoclonales humanos (Cole y otros,
Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss. pág.
77 (1985) y Boerner y otros, J. Immunol.,
147(1): 86-95 (1991)]. De un modo
parecido, los anticuerpos humanos pueden sintetizarse mediante la
introducción de loci de inmunoglobulinas humanas a animales
transgénicos, por ejemplo, ratones en los que se han inactivado
parcial o completamente los genes de la inmunoglobulina endógena.
Tras la exposición, se observa producción de anticuerpos humanos, lo
que recuerda exactamente en todos los aspectos la producción
observada en humanos, incluida la redisposición de los genes, el
ensamblaje y el repertorio de anticuerpos. Este procedimiento se
describe, por ejemplo, en las patentes de EE.UU. US 5.545.807; US
5.545.806; US 5.569.825; US 5.625.126; US 5.633.425; US 5.661.016 y
en las siguientes publicaciones científicas: Marks y otros,
Bio/Technology, 10: 779-783 (1992);
Lonberg y otros, Nature, 368: 856-859
(1994); Morrison, Nature, 368: 912-13
(1994); Fishwild y otros, Nature Biotechnology, 14:
845-51 (1996); Neuberger, Nature
Biothechnology, 14: 826 (1996); Lonberg y Huszar,
Intern. Rev. Immunol., 13: 65-93
(1995).
Los anticuerpos biespecíficos son monoclonales,
preferiblemente humanos o humanizados, anticuerpos que presentan
especificidades de unión para por lo menos dos antígenos distintos.
En el caso presente, una de las especificidades de unión es para el
PRO320, la otra es para cualquier otro antígeno, y preferiblemente
para una proteína o un receptor o una subunidad de receptor de la
superficie de la célula.
Los procedimientos para sintetizar anticuerpos
biespecíficos son conocidos en el estado de la técnica.
Tradicionalmente, la producción recombinante de anticuerpos
biespecíficos se basa en la coexpresión de dos pares de cadena
pesada/cadena ligera de la inmunoglobulina, en los que las dos
cadenas pesadas tienen especificidades diferentes [Milstein y
Cuello, Nature, 305: 537-539 (1983)].
Dado el surtido aleatorio de cadenas pesadas y ligeras de la
inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla
potencial a menudo de distintas moléculas de anticuerpos, de las que
sólo una tiene la estructura biespecífica correcta. La purificación
de la molécula correcta normalmente se lleva a cabo mediante fases
de cromatografía de afinidad. Procedimientos similares se describen
en el documento WO 93/08829, publicado el 13 de mayo de 1993, y en
Traunecker y otros, EMBO J., 10:
3.655-3.659 (1991).
Los dominios variables de anticuerpos que
presentan las especificidades de unión deseadas (sitios de unión
anticuerpo-antígeno) pueden fusionarse con
secuencias de dominios constantes de inmunoglobulina. La fusión
tiene lugar preferiblemente con un dominio constante de la cadena
pesada de una inmunoglobulina, que comprende por lo menos parte de
las regiones bisagra, CH2 y CH3. Es preferible que la primera región
constante de la cadena pesada (CHI) contenga el sitio necesario para
la unión de la cadena ligera presente en por lo menos una de las
fusiones. Los ADN que codifican las fusiones de la cadena pesada de
la inmunoglobulina y, si se desea, la cadena ligera de la
inmunoglobulina, son insertados en vectores de expresión separados y
son cotransfectados a un organismo huésped adecuado. Para más
detalles sobre la generación de anticuerpos biespecíficos véase, por
ejemplo, Suresh y otros, Methods in Enzymology, 121:
210 (1986).
De acuerdo con otro procedimiento descrito en el
documento WO 96/27011, la interfaz entre un par de moléculas de
anticuerpos puede ser manipulada para maximizar el porcentaje de
heterodímeros que ha sido recuperado de un cultivo celular
recombinante. La interfaz preferida comprende por lo menos una parte
de la región CH3 de un dominio constante de anticuerpo. En este
procedimiento, una o más cadenas laterales pequeñas de aminoácidos
de la interfaz de la primera molécula de anticuerpo son sustituidas
por cadenas laterales más grandes (por ejemplo, tirosina o
triptófano). Se crean "cavidades" compensatorias de tamaño
idéntico o similar al de la cadena, o cadenas, lateral grande sobre
la interfaz de la segunda molécula de anticuerpo sustituyendo las
cadenas laterales grandes de aminoácidos por otras más pequeñas (por
ejemplo, alanina o treonina). Esto proporciona un mecanismo para
aumentar la producción del heterodímero por encima de la de otros
productos finales no deseados, tales como homodímeros.
Los anticuerpos biespecíficos pueden prepararse
como anticuerpos en toda su longitud o como fragmentos de anticuerpo
(por ejemplo, anticuerpos biespecíficos F(ab')_{2}). Las
técnicas para la generación de anticuerpos biespecíficos a partir de
fragmentos de anticuerpos han sido descritas en la literatura sobre
el tema. Por ejemplo, pueden prepararse anticuerpos biespecíficos
utilizando enlaces químicos. Brennan y otros, Science,
229: 81 (1985), describen un procedimiento en el que se
escinden proteolíticamente anticuerpos intactos para generar
fragmentos F(ab')_{2}. Estos fragmentos son reducidos en
presencia de arsenito sódico, un ligando ditiol, para estabilizar
los ditioles vecinos y evitar la formación de disulfuros
intermoleculares. Los fragmentos Fab' generados son convertidos a
continuación en derivados de tionitrobenzoato (TNB). Uno de los
derivados TNB-Fab' es reconvertido a continuación a
tiol Fab' mediante reducción con mercaptoetilamina y mezclado con
una cantidad equimolar del otro derivado TNB-Fab'
para formar el anticuerpo biespecífico. Los anticuerpos
biespecíficos producidos pueden utilizarse como agentes para la
inmovilización selectiva de enzimas.
Los fragmentos Fab' pueden recuperarse
directamente de E. coli y acoplarse químicamente para formar
anticuerpos biespecíficos. Shalaby y otros, J. Exp. Med.,
175: 217-225 (1992) describen la producción
de una molécula de anticuerpo biespecífico F(ab')
completamente humanizada. Cada fragmento Fab' fue secretado
independientemente a partir de E. coli y sujeto a
acoplamiento químico dirigido in vitro para formar el
anticuerpo biespecífico. El anticuerpo biespecífico formado de este
modo era capaz de unirse a células que sobreexpresaban el receptor
ErbB2 y a células T humanas normales, así como de desencadenar la
actividad lítica de linfocitos citotóxicos humanos contra tumores
diana de mama humanos.
También se han descrito varias técnicas para
sintetizar y aislar fragmentos de anticuerpos biespecíficos
directamente a partir del cultivo celular recombinante. Por ejemplo,
se han producido anticuerpos biespecíficos utilizando cremalleras de
leucina. Kostelny y otros, J. Immunol., 148 (5):
1.547-1.553 (1992). Los péptidos de la cremallera de
leucina procedentes de las proteínas Fos y Jun estaban unidos a las
partes Fab' de los dos anticuerpos distintos mediante fusión génica.
Los homodímeros del anticuerpo fueron reducidos en la región bisagra
para formar monómeros y a continuación reoxidados para formar los
heterodímeros del anticuerpo. Este procedimiento también puede
utilizarse para la producción de homodímeros de anticuerpo. La
tecnología relativa a "dianticuerpos" descrita por Hollinger y
otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:
6.444-6.448 (1993) ha proporcionado un mecanismo
alternativo para sintetizar fragmentos de anticuerpos biespecíficos.
Los fragmentos comprenden un dominio variable (V_{H}) en la cadena
pesada conectado a un dominio variable (V_{L}) en la cadena ligera
por medio de un conector que es demasiado corto para permitir el
acoplamiento entre los dos dominios de la misma cadena. Por
consiguiente, los dominios V_{H} y V_{L} de un fragmento están
obligados a acoplarse con los dominios V_{L} y V_{H}
complementarios de otro fragmento, por lo que se forman dos sitios
de unión al antígeno. También se ha descrito otra estrategia para
sintetizar fragmentos de anticuerpos biespecíficos mediante el uso
de dímeros Fv de cadena única (sFv). Véase, Gruber y otros, J.
Immunol., 152: 5.368 (1994).
Se contemplan anticuerpos con más de dos
valencias. Por ejemplo, pueden prepararse anticuerpos
triespecíficos. Tun y otros, J. Immunol., 147: 60
(1991).
Los anticuerpos biespecíficos ejemplarizadores
pueden unirse a dos epítopos diferentes en un polipéptido PRO320
dado de la presente. Alternativamente, puede combinarse un brazo de
polipéptido anti-PRO320 con un brazo que se une a
una molécula desencadenante en un leucocito tal como una molécula
receptora de células T (por ejemplo, CD2, CD3, CD28, o B7), o
receptores Fc de la IgG (FcgR), tales como FcgRI (CD64), FcgRII
(CD32) y FcgRIII (CDJ6) para centrar los mecanismos de defensa
celular de la célula que expresa el polipéptido PRO320 en
particular. Los anticuerpos biespecíficos también pueden utilizarse
para localizar agentes citotóxicos para células que expresan un
polipéptido PRO320 particular. Estos anticuerpos poseen un brazo de
unión al PRO320 y un brazo que se une a un agente citotóxico o a un
quelante de radionúclidos, tal como EOTUBE, DPTA, DOTA, o TETA. Otro
anticuerpo biespecífico de interés se une al polipéptido PRO320 y
además se une al factor tisular (TF).
Los anticuerpos heteroconjugados también se
hallan dentro del alcance de la presente invención. Los anticuerpos
heteroconjugados están compuestos por dos anticuerpos unidos
covalentemente. Tales anticuerpos han sido propuestos, por ejemplo,
para dirigir células del sistema inmunitario contra células no
deseadas [patente de EE.UU. US 4.676.980] y para el tratamiento de
la infección por el VIH [documentos WO 91/00360; WO 92/200373; EP
03089]. Se contempla la posibilidad de preparar anticuerpos in
vitro utilizando procedimientos conocidos en química de síntesis
de proteínas, incluidas aquellas en las que intervienen agentes de
entrecruzamiento. Por ejemplo, pueden construirse inmunotoxinas
utilizando una reacción de intercambio de disulfuros o formando un
enlace tioéter. Entre los ejemplos de reactivos adecuados para este
fin se incluyen el iminotiolato y el
metil-4-mercaptobutirimidato y los
que se describen, por ejemplo, en la patente de EE.UU. US
4.676.980.
Puede ser deseable modificar el anticuerpo de la
invención en cuanto a su función efectora, para aumentar, por
ejemplo, la eficacia del anticuerpo en el tratamiento del cáncer.
Por ejemplo, pueden introducirse uno o más residuos de cisteína en
la región Fc, lo que permite la formación de enlaces disulfuro
intercatenarios en esta región. El anticuerpo homodimérico generado
de este modo puede tener mejor capacidad de interiorización y/o
mayor capacidad de eliminación de células mediada por el complemento
y citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC). Véase,
Caron y otros, J. Exp. Med., 176:
1.191-1.195 (1992) y Shopes, J. Immunol.,
148: 2.918-2.922 (1992). Los anticuerpos
homodiméricos con actividad antitumoral potenciada también pueden
prepararse utilizando entrecruzadores heterobifuncionales tal como
se ha descrito en Wolff y otros, Cancer Research, 53:
2.560-2.565 (1993). Alternativamente, puede
manipularse un anticuerpo que presenta regiones Fc dobles y por lo
tanto puede tener potenciada la lisis del complemento y las
capacidades ADCC. Véase, Stevenson y otros,
Anti-Cancer Drug Design. 3:
219-230 (1989).
La invención también está relacionada con
inmunoconjugados que comprenden un conjugado de anticuerpo con un
agente citotóxico, tal como un agente quimioterapéutico, una toxina
(por ejemplo, una toxina enzimáticamente activa de origen
bacteriano, fúngico, vegetal, o animal, o fragmentos de la misma), o
un isótopo radioactivo (es decir, un radioconjugado).
Los agentes quimioterapéuticos útiles en la
generación de tales inmunoconjugados han sido descritos
anteriormente. Entre las toxinas, y los fragmentos de las mismas,
enzimáticamente activas que pueden utilizarse se incluyen: la cadena
A de la difteria, los fragmentos activos no unidos de la toxina de
la difteria, la cadena A de la exotoxina (de Pseudomonas
aeruginosa), la cadena A de la ricina, la cadena A de la abrina,
la cadena A de la modecina y atpha-sancin. Las
proteínas de Aleurites fordii, las proteínas de diantina, las
proteínas de Phytolaco americana (PAPI, PAPII y PAPS), el
inhibidor de Momordica charantia, la curcina, la crotina, el
inhibidor de Saponaria officinalis, gelonina, mitogilina,
restrictocina, fenomicina, enomicina y los tricotecenos. Para la
producción de anticuerpos radioconjugados hay disponible una
variedad de radionúclidos. Entre los ejemplos se incluyen
^{112}Bi, ^{131}I, ^{131}In, ^{90}Y y ^{130}Re.
Los conjugados del anticuerpo y el agente
citotóxico se sintetizan utilizando una variedad de agentes
bifuncionales que se acoplan a proteínas tales como
N-succinimidil-3-(1-piridilditiol)
propionato (SPDP), iminotiolano (11), derivados bifuncionales de
imidoésteres (tales como dimetiladipimidato HCL), ésteres activos
(tales como disuccinimidil suberato), aldehídos (tales como
glutaraldehído), compuestos bis-azido (tales como
bis(p-acidobenzoil) hexanediamina), derivados
bis-diazonio (tales como
bis-(p-diazoniumbenzoil)-etilenediamina),
diisocianatos (tales como 2,6-diisocianato de
tolueno) y compuestos de fluoruro bis-activos (tales
como
1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno).
Por ejemplo, una inmunotoxina de la ricina puede prepararse tal como
se ha descrito en Vitetta y otros, Science, 238: 1.098
(1987). El ácido
1-isotiocianatobenzil-3-metildietileno
triaminapentaacético (MX-DTPA) marcado en el carbono
14 es un agente quelante ejemplarizador de la conjugación de
radionucleótidos con el anticuerpo. Véase, documento WO
94/11026.
En otra realización, el anticuerpo puede
conjugarse con un "receptor" (tal como estreptavidina) para su
utilización en el premarcaje del tumor en la que el conjugado
anticuerpo-receptor es administrado al paciente,
seguido de la eliminación de la circulación del conjugado no unido
utilizando un agente limpiador y administrando a continuación un
"ligando" (por ejemplo, avidina) que se conjuga con un agente
citotóxico (por ejemplo, un radionucleótido).
Los anticuerpos descritos en la presente también
pueden formularse como inmunoliposomas. Los liposomas que contienen
el anticuerpo se preparan mediante procedimientos conocidos en el
estado de la técnica, tales como los descritos en Epstein y otros,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 3.688 (1985); Hwang y
otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 4.030 (1980); y
las patentes de EE.UU. US 4.485.045 y US 4.544.545. Los liposomas
con mayor tiempo de circulación se describen en la patente de EE.UU.
US 5.013.556.
Pueden generarse liposomas de particular
utilidad mediante el procedimiento de evaporación de la fase inversa
con un compuesto lípido que comprenda fosfatidilcolina, colesterol y
fosfatidiletanolamina derivada de PEG (PEG-PE). Los
liposomas se sacan a través de filtros con un tamaño de poro
determinado para obtener liposomas con el diámetro deseado. Los
fragmentos Fab' del anticuerpo de la presente invención pueden
conjugarse a los liposomas tal como se ha descrito en Martin y
otros, J. Biol. Chem., 257: 286-288
(1982) mediante reacción de intercambio disulfuro. El liposoma
puede contener opcionalmente un agente quimioterapéutico (tal como
doxorrubicina). Véase, Gabizon y otros, J. National Cancer
Inst., 81(19): 1.484 (1989).
Las proteínas descritas en la presente solicitud
de patente han sido analizadas en una tabla de 60 líneas celulares
tumorales actualmente utilizada en el cribado, orientado a las
enfermedades, de fármacos in vitro del National Cancer
Institute (NCI). El objetivo de este cribado es identificar
moléculas que tienen actividad citotóxica y/o citostática contra
diferentes tipos de tumores. El NCI criba más de 10.000 moléculas
nuevas cada año (Monks y otros, J. Natl. Cancer Inst.,
83: 757-766 (1991); Boyd, Cancer; Princ.
Pract. Oncol. Update, 3(10): 1-12
([1989]). Las líneas celulares tumorales utilizadas en este estudio
han sido descritas en Monks y otros, supra. Las líneas
celulares cuyo crecimiento ha sido considerablemente inhibido por
las proteínas de la presente solicitud de patente se especifican en
los ejemplos.
Los resultados han mostrado que las proteínas
probadas muestran actividad citostática y, en algunos casos y según
las concentraciones, actividad citotóxica en una variedad de líneas
celulares cancerosas y, por lo tanto, son candidatos al tratamiento
de un tumor.
También pueden utilizarse otros análisis a
partir de células y modelos animales para tumores (por ejemplo,
cánceres) para verificar los resultados del estudio oncológico del
NCI y para comprender, además, la relación entre la proteína
identificada en la presente y el desarrollo y patogenia del
crecimiento celular neoplásico. Por ejemplo, en los análisis a
partir de células de la presente pueden utilizarse cultivos
primarios obtenidos a partir de tumores en animales transgénicos
(tal como se describe posteriormente), aunque se prefieren líneas
celulares estables. Las técnicas para obtener líneas celulares
constantes a partir de animales transgénicos son bien conocidas en
el estado de la técnica (véase, por ejemplo, Small y otros, Mol.
Cell. Biol., 5: 642-648 [1985]).
Puede utilizarse una variedad de modelos
animales bien conocidos para comprender además la función de las
moléculas identificadas en la presente en el desarrollo y patogenia
de tumores, y para probar la eficacia de los posibles agentes
terapéuticos, incluidos los anticuerpos, y otros agonistas de los
polipéptidos naturales, incluidos agonistas de moléculas pequeñas.
La naturaleza in vivo de tales modelos los hace
particularmente útiles para la predicción de respuestas en pacientes
humanos. Los modelos animales de tumores y de cánceres (por ejemplo,
cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer de próstata, cáncer de
pulmón, etc.) incluyen tanto animales (transgénicos) no
recombinantes como recombinantes. Los modelos animales no
recombinantes incluyen, por ejemplo, roedores, por ejemplo, modelos
murinos. Dichos modelos pueden generarse introduciendo células
tumorales a ratones singeneicos utilizando técnicas estándar, por
ejemplo, inyección subcutánea, inyección en la vena de la cola,
implante de bazo, implante intraperitoneal, implante debajo de la
cápsula renal, o implante de ortopina, por ejemplo, células de
cáncer de colon implantadas en tejido colónico (véase, por ejemplo,
PCT n.º de publicación WO 97/33551, publicado el 18 de septiembre de
1997).
Probablemente la especie animal utilizada más a
menudo en los estudios oncológicos son los ratones inmunodeficientes
y, en particular, los ratones desnudos. La observación de que el
ratón desnudo con hipoaplasia podría utilizarse satisfactoriamente
como huésped en los xenotrasplantes de tumores humanos ha llevado a
su amplia utilización con este fin. El gen autosómico recesivo
nu ha sido introducido en un gran número de cepas congénitas
distintas de ratón desnudo, incluidas, por ejemplo, ASW, A/He, AKR,
BALB/c, B10.LP, C17, C3H, C57BL, C57, CBA, DBA, DDD, I/st, NC, NFR,
NFS, NFS/N, NZB, NZC, NZW, P, RIII y SJL. Además, se ha criado una
amplia variedad de otros animales con alteraciones inmunológicas
hereditarias distintas a la del ratón desnudo y se han utilizado
como receptores de xenotrasplantes tumorales. Para más detalles
véase, por ejemplo, The Nude Mouse in Oncology Research, E.
Boven y B. Winograd, eds., CRC Press, Inc.. 1991.
Las células introducidas en tales animales
pueden obtenerse a partir de líneas celulares tumorales/cancerígenas
conocidas, tales como, cualquiera de las líneas celulares tumorales
enumeradas anteriormente, y, por ejemplo, la línea celular
B104-1-1 (línea celular estable
NIH-3T3 transfectada con el nuevo protooncogén);
células NIH-3T3 transfectadas con ras;
Caco-2 (ATCC HTB-37); una línea
celular de adenocarcinoma de colon humano de grado II moderadamente
bien diferenciado, HT-29 (ATCC
HTB-38), o a partir de tumores y de cánceres. Las
muestras de células tumorales o cancerígenas pueden obtenerse a
partir de pacientes que se someten a cirugía, utilizando condiciones
estándar, que implican la congelación y almacenamiento en nitrógeno
líquido (Karmali y otros, Br. J. Cancer, 48:
689-696 [1983]).
Las células tumorales pueden introducirse en
animales, tales como el ratón desnudo, mediante una variedad de
procedimientos. El espacio subcutáneo en los ratones es muy adecuado
para el trasplante de un tumor. Los tumores pueden trasplantarse
subcutáneamente como bloques sólidos, como biopsias por punción
utilizando una aguja trocar, o como suspensiones celulares. Para el
bloque sólido o el trasplante con aguja trocar, se introducen los
fragmentos de tejido tumoral de tamaño adecuado en el espacio
subcutáneo. Las suspensiones celulares son recién preparadas a
partir de tumores primarios o de líneas celulares tumorales
estables, y se inyectan por vía subcutánea. Las células tumorales
también pueden inyectarse como trasplantes subdérmicos. En este
sitio, el inóculo se deposita entre la parte inferior del tejido
conectivo dérmico y el tejido subcutáneo. Boven y Winograd (1991),
supra. Pueden generarse modelos animales de cáncer de mama,
por ejemplo, mediante trasplante de células de neuroblastoma de rata
(a partir de las cuales fue aislado inicialmente el nuevo oncogén),
o células NIH-3T3 nuevamente transformadas en
ratones desnudos, esencialmente tal como describieron Drebin y
otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83:
9.129-9.133 (1986).
Asimismo, pueden generarse modelos animales de
cáncer de colon mediante la introducción de células de cáncer de
colon en animales, por ejemplo, ratones desnudos, lo que origina la
aparición de tumores en estos animales. Se ha descrito un modelo de
trasplante ortotópico de cáncer de colon humano en ratones desnudos,
por ejemplo, en Wang y otros, Cancer Research, 54:
4.726-4.728 (1994) y Too y otros, Cancer
Research, 55: 681-684 (1995). Este modelo
se basa en el así denominado "METAMOUSE" vendido por
AntiCancer, Inc. (San Diego, California).
Los tumores que aparecen en animales pueden ser
eliminados y cultivados in vitro. Las células de cultivos
in vitro pueden a continuación introducirse en animales.
Dichos tumores pueden servir como dianas para otras pruebas o
cribado de fármacos. Alternativamente, los tumores resultantes de
esta introducción pueden ser aislados y puede analizarse el ARN de
las células previamente y las células aisladas después de una o más
rondas de introducción para la expresión diferencial de genes de
interés. Tales técnicas de introducción pueden llevarse a cabo con
cualquier línea celular tumoral o cancerígena conocida.
Por ejemplo, Meth A, CMS4, CMSS. CMS21. y
WEHI-164 son fibrosarcomas de ratones hembra BALB/c
inducidos químicamente (DeLeo y otros, J. Exp. Med.,
146: 720 [1977]), que proporcionan un sistema modelo muy
controlable para estudiar las actividades antitumorales de varios
agentes (Palladino y otros, J. Immunol., 138:
4.023-4.032 [1987]). En resumen, las células
tumorales se propagan in vitro en cultivo celular. Antes de
inyectarlas a los animales, las líneas celulares se limpian y se
suspenden en un tampón, a una densidad celular de aproximadamente
10x10^{6} a 10x10^{7} células/ml. A continuación los animales
son infectados por vía subcutánea con de 10 a 100 \mul de la
suspensión celular, lo que permite la aparición de un tumor en un
período de una a tres semanas.
Además, el carcinoma de pulmón de Lewis (3LL) de
los ratones, que es uno de los tumores experimentales estudiados más
exhaustivamente, puede utilizarse como modelo tumoral experimental.
La eficacia de este modelo tumoral se ha correlacionado con efectos
beneficiosos en el tratamiento de pacientes humanos con un
diagnóstico de carcinoma microcítico de pulmón (SCCL). Este tumor
puede introducirse en ratones normales mediante inyección de
fragmentos tumorales procedentes de un ratón afectado o de células
mantenidas en cultivo (Zupi y otros, Br. J. Cancer,
41, supl. 4: 309 [1980]), y las pruebas indican que los
tumores pueden iniciarse a partir de la inyección incluso de una
única célula y que una proporción muy elevada de células tumorales
infectadas sobrevive. Para más información sobre este modelo tumoral
véase, Zacharski, Haemostasis, 16:
300-320 [1986]).
Una manera de evaluar la eficacia de un
compuesto de prueba en un modelo animal con un tumor implantado es
medir el tamaño del tumor antes y después del tratamiento.
Tradicionalmente, el tamaño de los tumores trasplantados se ha
medido con un calibrador en dos o tres dimensiones. La medida
limitada a dos dimensiones no refleja con precisión el tamaño del
tumor, por lo tanto, normalmente se convierte en el volumen
correspondiente utilizando una fórmula matemática. No obstante, la
medición del tamaño del tumor es poco precisa. Los efectos
terapéuticos de un posible fármaco se describen mejor como retraso
del crecimiento y retraso específico del crecimiento inducidos por
el tratamiento. Otra variable importante en la descripción del
crecimiento de un tumor es el tiempo de duplicación del volumen del
tumor. Hay disponibles programas informáticos para el cálculo y la
descripción del crecimiento del tumor, tales como el programa de
Rygaard y Spang-Thomsen, Proc. 6th Int. Workshop
on Immune-Deficient Animals, Wu y Sheng eds.,
Basilea, 1989, 301. No obstante, se observa que la necrosis y la
respuesta inflamatoria posterior al tratamiento en realidad puede
dar lugar a un aumento del tamaño del tumor, por lo menos
inicialmente. Por lo tanto, es necesario controlar cuidadosamente
los cambios, combinando un procedimiento morfométrico y el análisis
citométrico de flujo.
Los modelos animales (transgénicos)
recombinantes pueden manipularse introduciendo la parte codificante
de los genes identificados en la presente en el genoma de animales
de interés, utilizando técnicas estándar para la producción de
animales transgénicos. Entre los animales que pueden actuar como
diana para la manipulación transgénica se incluyen, sin limitación
alguna, ratones, ratas, conejos, cobayas, ovejas, cabras, cerdos y
primates no humanos, por ejemplo, babuinos, chimpancés y simios. Las
técnicas conocidas en el estado de la técnica para introducir un
transgén a tales animales incluyen la microinyección pronucleica
(Hoppe y Wanger, patente de EE.UU. US 4.873.191); transferencia de
genes, mediada por retrovirus, a líneas germinales (por ejemplo,
Van der Putten y otros, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
82: 6.148-615 [1985]); marcaje génico en
células madre embrionarias (Thompson y otros, Cell,
56: 313-321 [1989]); electroporación de
embriones (Lo, Mol. Cell. Biol., 3:
1.803-1.814 [1983]); transferencia de genes mediada
por esperma (Lavitrano y otros, Cell, 57:
717-73 [1989]). Para una revisión, véase, por
ejemplo, patente de EE.UU. US 4.736.866.
Para los propósitos de la presente invención,
entre los animales transgénicos se incluyen los que sólo llevan el
transgén en parte de sus células ("animales mosaico"). El
transgén puede integrarse bien como un transgén único, o en
concatámeros, por ejemplo, tándems de
cabeza-a-cabeza o de
cabeza-a-cola. También es posible
introducir selectivamente un transgén en un tipo de célula
particular siguiendo, por ejemplo, la técnica de Lasko y otros,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:
6.232-6.236 (1992).
La expresión del transgén en animales
transgénicos puede controlarse mediante técnicas estándar. Por
ejemplo, puede utilizarse el análisis de transferencia de Southern o
la amplificación de la RCP para verificar la integración del
transgén. A continuación puede analizarse el nivel de expresión del
ARNm utilizando técnicas tales como hibridación in situ,
análisis de transferencia de Northern, RCP o inmunocitoquímica.
Además los animales son examinados en busca de signos de desarrollo
de tumor o de cáncer.
La eficacia de anticuerpos que se unen
específicamente a los polipéptidos identificados en la presente y de
otros posibles fármacos también puede probarse en el tratamiento de
tumores animales espontáneos. Un objetivo adecuado para tales
estudios es el carcinoma de células escamosas (SCC) orales felino.
El SCC oral felino es un tumor maligno muy invasivo que constituye
el tumor maligno oral más frecuente de los gatos, dando cuenta de
más del 60% de los tumores orales observados en esta especie.
Raramente hace metástasis a sitios alejados, aunque esta baja
incidencia de metástasis puede ser simplemente un reflejo de la
corta supervivencia de los gatos con este tumor. Normalmente estos
tumores no pueden tratarse mediante cirugía, principalmente a causa
de la anatomía de la cavidad oral de los felinos. Por ahora, no
existe ningún tratamiento eficaz para este tumor. Antes de empezar
el estudio, se somete a cada uno de los gatos a una exploración
clínica completa, a una biopsia y a una tomografía computarizada
(TC). Los gatos con un diagnóstico de tumor de células escamosas
oral sublingual son excluidos del estudio. La lengua puede
paralizarse como resultado de tal tumor, e incluso si el tratamiento
elimina el tumor, es posible que los animales no sean capaces de
alimentarse. Cada gato es tratado repetidamente, durante un período
prolongado de tiempo. Durante el período de tratamiento, y en cada
uno de los chequeos posteriores, será necesario tomar diariamente
fotografías de los tumores. Después del tratamiento, se somete a
cada gato a otra TC. Después, las TC y los radiogramas torácicos son
evaluados cada 8 semanas. Los datos son evaluados en busca de
diferencias en la supervivencia, respuesta y toxicidad en
comparación con los grupos control. La respuesta positiva puede
requerir pruebas de regresión del tumor, preferiblemente con mejoría
de la calidad de vida y/o aumento del tiempo de vida.
Además, también pueden probarse otros tumores
animales espontáneos, tales como fibrosarcoma, adenocarcinoma,
linfoma, condroma, leiomiosarcoma de los perros, gatos y babuinos.
De éstos, el adenocarcinoma mamario de perros y gatos es un modelo
preferido ya que su apariencia y comportamiento son muy similares a
los de los humanos. No obstante, el uso de este modelo está limitado
por la ocurrencia poco frecuente de este tipo de tumor en
animales.
Los análisis de cribado de posibles fármacos han
sido diseñados para identificar compuestos que se unen
competitivamente, o forman complejos, con el receptor o receptores
de los polipéptidos identificados en la presente, o cualquier otra
señal a través de tal receptor o receptores. Dichos análisis de
cribado incluirán análisis que permitan un cribado muy productivo de
las genotecas químicas, lo que los convierte en particularmente
adecuados para identificar posibles fármacos de moléculas pequeñas.
Entre las moléculas pequeñas contempladas se incluyen compuestos
orgánicos o inorgánicos sintéticos, incluidos péptidos,
preferiblemente péptidos solubles, fusiones de
(poli)péptido-inmunoglobulina, y, en
particular, anticuerpos entre los que se incluyen, sin limitación
alguna, anticuerpos monoclonales y policlonales y fragmentos de
anticuerpos, anticuerpos de cadena única, anticuerpos
antiidiotípicos, y versiones quiméricas o humanizadas de tales
anticuerpos o fragmentos, así como anticuerpos humanos y fragmentos
de anticuerpos. Los análisis pueden llevarse a cabo en una variedad
de formatos, tales como análisis de unión
proteína-proteína, análisis bioquímicos de cribado,
inmunoanálisis y análisis a partir de células, que son bien
caracterizadas en el estado de la técnica.
En los análisis de unión, la interacción es la
unión y el complejo formado puede ser aislado o detectado en la
mezcla de reacción. En una realización particular, un receptor de un
polipéptido codificado por el gen identificado en la presente o el
posible fármaco es inmovilizado en una fase sólida, por ejemplo, en
una placa de microtitulación, mediante enlaces covalentes o no
covalentes. Un enlace no covalente generalmente se obtiene
recubriendo la superficie sólida con una disolución del polipéptido
y secando. Alternativamente, puede utilizarse un anticuerpo
inmovilizado, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal, específico para
el polipéptido que será inmovilizado para anclarlo a la superficie
sólida. El análisis se lleva a cabo añadiendo el componente no
inmovilizado, que puede estar marcado con un marcador detectable, al
componente inmovilizado, por ejemplo, la superficie recubierta que
contiene el componente anclado. Cuando la reacción ha terminado, se
eliminan los componentes que no han reaccionado, por ejemplo,
mediante lavado, y se detectan los complejos anclados en la
superficie sólida. Cuando el componente no inmovilizado
originalmente lleva un marcador detectable, la detección del
marcador inmovilizado en la superficie indica que se ha producido la
formación de complejos. Cuando el componente originalmente no
inmovilizado no lleva un marcador, puede detectarse la formación de
complejos, por ejemplo, utilizando un anticuerpo marcado que se una
específicamente al complejo inmovilizado.
Si el posible compuesto interacciona con un
receptor en particular pero no se une al mismo, puede analizarse su
interacción con aquel polipéptido mediante procedimientos bien
conocidos para detectar interacciones
proteína-proteína. Dichos análisis incluyen
procedimientos tradicionales, tales como, entrecruzamiento,
coinmunoprecipitación y copurificación a través de gradientes o de
columnas cromatográficas. Además, las interacciones
proteína-proteína pueden controlarse utilizando un
sistema genético a partir de levaduras descrito por Fields y sus
colaboradores [Fields y Song, Nature (Londres), 340:
245-246 (1989); Chien y otros, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 88: 9.578-9.582 (1991)] tal
como describieron Chevray y Nathans [Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 89: 5.789-5.793 (1991)]. Varios
activadores transcripcionales, tales como la levadura GAL4,
consisten en dos dominios modulares separados físicamente, uno que
actúa como el dominio de unión al ADN, mientras el otro funciona
como dominio de activación de la transcripción. El sistema de
expresión de levaduras descrito en las publicaciones anteriores (al
que generalmente se hace referencia como el "sistema de dos
híbridos") saca provecho de esta propiedad, y utiliza dos
proteínas híbridas, una en la que la proteína diana se fusiona con
el dominio de unión al ADN de GAL4, y otra, en la cual las posibles
proteínas de activación se fusionan con el dominio de activación. La
expresión de un gen indicador GAL1-lacZ bajo el
control de un promotor activado por GAL4 depende de la
reconstitución de la actividad de GAL4 mediante interacción
proteína-proteína. Las colonias que contienen
polipéptidos de interacción son detectadas con un sustrato
cromogénico para \beta-galactosidasa. Un equipo
completo (MATCHMAKER™) para la identificación de interacciones
proteína-proteína entre dos proteínas específicas
utilizando la técnica de dos híbridos se halla comercialmente
disponible en Clontech. Este sistema también puede extenderse al
mapeo de dominios proteínicos involucrados en interacciones
proteínicas específicas, así como para identificar residuos de
aminoácido que son cruciales para estas interacciones.
Los polipéptidos de la presente invención,
proteínas que se unen específicamente a los anticuerpos agonistas
identificados en la presente, así como otras moléculas identificadas
mediante análisis de cribado descritos en la presente, pueden ser
administrados para el tratamiento de tumores, incluidos cánceres, en
forma de compuestos farmacéuticos.
Cuando se utilizan fragmentos de anticuerpos, se
prefiere el fragmento inhibidor más pequeño que se une
específicamente al dominio de unión de la proteína diana. Por
ejemplo, a partir de secuencias de región variable de un anticuerpo,
pueden diseñarse moléculas peptídicas que conserven la capacidad de
unirse a la secuencia proteínica diana. Tales péptidos sintetizarse
químicamente y/o producirse mediante tecnología de ADN recombinante
(véase, por ejemplo, Marasco y otros, Proc. Natl. Acad. Sci,
USA, 90: 7.889-7.893 [1993]).
La formulación de la presente también puede
contener más de un compuesto activo, si hace falta, para el caso
particular tratado, preferiblemente aquellos con actividades
complementarias que no tengan entre sí efectos adversos.
Alternativamente, o además, el compuesto puede comprender un agente
que potencie su función, tal como, por ejemplo, un agente
citotóxico, citocina, un agente quimioterapéutico, o un agente
inhibidor del crecimiento. Tales moléculas existen adecuadamente
combinadas en cantidades que son eficaces para los fines
pretendidos.
Las formulaciones terapéuticas de los
polipéptidos identificados en la presente, o agonistas de los
mismos, se preparan para su almacenaje mezclando el ingrediente
activo que presenta el grado deseado de pureza con portadores,
excipientes o estabilizantes farmacéuticamente aceptables optativos
(Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol. A.
ed. [1980]), en forma de formulaciones liofilizadas o disoluciones
acuosas. Los portadores, excipientes o estabilizantes aceptables son
no tóxicos para los receptores a las dosis y concentraciones
utilizadas, y entre ellos se incluyen tampones tales como: fosfato,
citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes como el ácido
ascórbico y la metionina; conservantes (tales como cloruro de
amoníaco octadecildimetilbencil; cloruro de hexametonio; cloruro de
benzalconio, cloruro de bencetonio; fenol, butil o bencil alcohol;
alquil parabenos tales como metil o propil parabeno; catecol;
resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y
m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular
(menos de unos 10 residuos); proteínas, tales como albúmina sérica,
gelatina, o inmunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tales como
polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina,
asparagina, histidina, arginina, o lisina; monosacáridos,
disacáridos y otros carbohidratos como glucosa, manosa, o dextrinas;
agentes quelantes tales como EDTA; azúcares tales como sacarosa,
manitol, trealosa o sorbitol; contraiones que forman sales tales
como sodio; complejos metálicos (por ejemplo, complejos
proteína-Zn); y/o surfactantes no iónicos tales como
TWEEN™, PLURONICS™ o polietilenglicol (PEG).
La formulación de la presente también puede
contener más de un compuesto activo si hace falta, para el caso
particular tratado, preferiblemente aquellos con actividades
complementarias que no tengan entre sí efectos adversos.
Alternativamente, o además, el compuesto puede comprender un agente
citotóxico, citocina, o un agente inhibidor del crecimiento. Tales
moléculas existen adecuadamente combinadas en cantidades que son
eficaces para los fines pretendidos.
Los ingredientes activos también pueden hallarse
dentro de microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas
de coacervación o mediante polimerización interfacial, por ejemplo,
microcápsulas de hidroximetilcelulosa o gelatina y microcápsulas
poli-(metilmetacilato), respectivamente, en sistemas de
administración del fármaco coloidales (por ejemplo, liposomas,
microesferas de albúmina, microemulsiones, nanopartículas y
nanocápsulas) o en macroemulsiones. Tales técnicas se describen en
Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A.
ed. (1980).
Las formulaciones utilizadas para la
administración in vivo deben ser estériles. Esto se consigue
fácilmente mediante filtración a través de membranas de filtración
estéril, antes o después de la liofilización y reconstitución.
Los compuestos terapéuticos de la presente
generalmente se colocan en un recipiente que tenga un puerto de
acceso estéril, por ejemplo, una bolsa o un vial de solución
intravenosa que tenga un tapón perforable mediante una aguja de
inyección hipodérmica.
Pueden prepararse preparados de liberación
prolongada. Son ejemplos adecuados de preparados de liberación
prolongada las matrices semipermeables de polímeros hidrófobos
sólidos que contienen el anticuerpo, las cuales matrices se
presentan como artículos con forma, por ejemplo, películas o
microcápsulas. Entre los ejemplos de matrices de liberación
prolongada se incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo,
poli(2-hidroxietil-metacrilato),
o poli(vinilalcohol)), poliláctidos (patente de EE.UU. US
3.773.919), copolímeros de ácido L-glutámico y
\gamma etil-L-glutamato,
etileno-vinil acetato no degradable, copolímeros de
ácido láctico-ácido glucólico degradables tales como el LUPRON
DEPOT™ (microesferas inyectables compuestas por el copolímero ácido
láctico-ácido glucólico y acetato de leuprólido), y ácido
poli-D-(-)-3-hidroxibutírico.
Mientras polímeros tales como el etileno-vinil
acetato y el ácido láctico-ácido glucólico permiten la liberación de
moléculas durante más de 100 días, algunos hidrogeles liberan
proteínas durante períodos de tiempo más cortos. Cuando los
anticuerpos encapsulados permanecen en el cuerpo durante un tiempo
prolongado, pueden desnaturalizarse o formar agregados como
resultado de la exposición a humedad a 37ºC, lo que da lugar a
pérdida de la actividad biológica y posibles cambios en la
inmunogenicidad. Dependiendo del mecanismo implicado, pueden
planificarse estrategias razonables para la estabilización. Por
ejemplo, si se descubre que el mecanismo de agregación es la
formación de un enlace intermolecular S-S a través
del intercambio tio-disulfuro, puede conseguirse la
estabilización modificando los residuos sulfhidrilo, liofilizando a
partir de disoluciones ácidas, controlando el contenido de humedad,
utilizando aditivos apropiados y fabricando compuestos de matriz
polimérica específicos.
Está previsto que los polipéptidos de la
presente invención y sus agonistas, incluidos anticuerpos, péptidos
y agonistas de moléculas pequeñas, puedan ser utilizados para tratar
varios tumores, por ejemplo, cánceres. Entre los ejemplos de
enfermedades o trastornos que hay que tratar se incluyen tumores
benignos o malignos (por ejemplo, carcinomas renales, de hígado, de
riñón, de vejiga urinaria, de mama, gástricos, ováricos,
colorrectales, de próstata, pancreáticos, pulmonares, vulvales,
tiroideos, hepáticos; sarcomas; glioblastomas, y varios tumores de
cabeza y cuello); leucemias y neoplasias linfocíticas; otros
trastornos tales como trastorno neuronal, glial, astrocitol,
hipotalámico y otros trastornos glandulares, macrofágicos,
epiteliales, estromales y blastocélicos; y trastornos inflamatorios,
angiogénicos e inmunológicos. Los agentes antitumorales de la
presente invención (incluidos los polipéptidos descritos en la
presente y agonistas que emulan su actividad, por ejemplo,
anticuerpos, péptidos y moléculas orgánicas pequeñas) son
administrados a un mamífero, preferiblemente un humano, según
procedimientos conocidos, tales como administración intravenosa como
bolo o mediante infusión continua durante un período de tiempo, o
por vía intramuscular, intraperitoneal, intracerebroespinal,
intraocular, intraarterial, intralesivo, subcutánea, intraarticular,
intrasinovial, intratecal, oral, tópica, o por inhalación.
Pueden combinarse otros regímenes terapéuticos
con la administración de los agentes anticancerígenos de la actual
invención. Por ejemplo, el paciente que hay que tratar con tales
agentes anticancerígenos también puede recibir radioterapia.
Alternativamente, o además, puede administrarse un agente
quimioterapéutico al paciente. Las pautas de preparación y
administración de tales agentes quimioterapéuticos puede utilizarse
según las instrucciones de los fabricantes o tal como haya
determinado empíricamente el médico experto en la materia. Las
pautas de preparación y administración de tal quimioterapia también
se describen en Chemotherapy Service, ed., M.C. Perry,
Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1992). El agente
quimioterapéutico puede preceder, o seguir, la administración del
agente antitumoral de la presente invención, o puede administrarse
simultáneamente con éste. Los agentes anticancerígenos de la
presente invención pueden combinarse con un compuesto
antiestrogénico tal como tamoxifeno o con una antiprogesterona tal
como onapristona (véase, EP 616812) a dosis conocidas para tales
moléculas.
También puede ser deseable administrar
anticuerpos contra los antígenos asociados al tumor, tales como
anticuerpos que se unen a ErbB2, EGFR, ErbB3, ErbB4, o factor
endotelial vascular (VEGF). Alternativamente, o además, pueden
coadministrarse al paciente dos o más anticuerpos que se unan a los
mismos antígenos o a dos o más antígenos distintos asociados al
cáncer. A veces, puede ser beneficioso administrar también al
paciente una o más citocinas. En una realización preferida, los
agentes anticancerígenos de la presente se administran conjuntamente
con un agente inhibidor del crecimiento. Por ejemplo, puede
administrarse en primer lugar el agente inhibidor del crecimiento,
seguido de la administración de un agente anticancerígeno de la
presente invención. No obstante, también se contempla la posibilidad
de una administración simultánea o la administración del agente
anticancerígeno de la presente invención en primer lugar. Las dosis
adecuadas de agente inhibidor del crecimiento son las que se
utilizan actualmente y pueden reducirse dada la acción combinada
(sinergia) del agente inhibidor del crecimiento y el anticuerpo de
la presente.
Para la prevención o tratamiento de una
enfermedad, la dosis apropiada de un agente antitumoral de la
presente dependerá del tipo de enfermedad que deba tratarse, tal
como se ha determinado anteriormente, de la gravedad y el curso de
la enfermedad, de si el agente se administra con fines preventivos o
terapéuticos, del tratamiento anterior, de los antecedentes clínicos
del paciente y la respuesta al agente, y el criterio del médico que
lo atienda. El agente es adecuadamente administrado al paciente de
una vez o a lo largo de una serie de tratamientos. Los experimentos
con animales proporcionan una orientación fiable para la
determinación de dosis eficaces para el tratamiento en humanos. El
escalonado de dosis eficaces entre especies puede llevarse a cabo
siguiendo los principios establecidos por Mordenti. J. y Chappell.
W. "The use of interspecies scaling in toxicokinetics" en
Toxicokinetics and New Drug Development, Yacobi y otros,
eds., Pergamon Press, Nueva York 1989, págs.
42-96.
Por ejemplo, dependiendo del tipo y gravedad de
la enfermedad, puede administrarse al paciente una posible dosis
inicial de aproximadamente 1 \mug/kg a 15 mg/kg (por ejemplo,
0,1-20 mg/kg) de un agente antitumoral, tanto, por
ejemplo, mediante una o más administraciones independientes, o
mediante infusión continua. Una dosis diaria habitual podría oscilar
entre aproximadamente 1 \mug/kg a 100 mg/kg o más, dependiendo de
los factores mencionados anteriormente. Para administraciones
repetidas a lo largo de varios días o durante más tiempo,
dependiendo de la enfermedad, el tratamiento se mantiene hasta que
tiene lugar la eliminación deseada de los síntomas de la enfermedad.
No obstante, pueden ser útiles otros regímenes de dosis. La
evolución de este tratamiento se controla fácilmente mediante
técnicas y análisis convencionales. Se proporciona orientación sobre
dosis particulares y los procedimientos de administración en la
literatura sobre el tema; véase, por ejemplo, patentes de EE.UU. US
4.657.760; US 5.206.344; o US 5.225.212. Se anticipa que las
distintas formulaciones serán eficaces para compuestos terapéuticos
distintos y trastornos distintos, que la administración dirigida a
un órgano o tejido, por ejemplo, puede requerir un modo de
administración distinto del de otro órgano o tejido.
En otra realización de la invención, se
proporciona un artículo de fabricación que contiene materiales
útiles para el diagnóstico o tratamiento de los trastornos descritos
anteriormente. El artículo de fabricación comprende un recipiente y
una etiqueta. Entre los recipientes adecuados se incluyen, por
ejemplo, botellas, viales, jeringas y tubos de ensayo. Los
recipientes pueden estar hechos de una variedad de materiales tales
como vidrio o plástico. El recipiente contiene un compuesto que es
eficaz para el diagnóstico o tratamiento de la enfermedad y puede
tener un puerto de acceso estéril (por ejemplo, el recipiente puede
ser una bolsa o un vial de solución intravenosa que tiene un tapón
perforable mediante una aguja de inyección hipodérmica). El agente
activo del compuesto es un agente antitumoral de la presente
invención. La etiqueta del recipiente, o asociada con el mismo,
indica que el compuesto se utiliza para el diagnóstico o tratamiento
de la enfermedad de elección. El artículo de fabricación puede
comprender además un segundo recipiente que comprende un tampón
farmacéuticamente aceptable, tal como solución salina tamponada con
fosfato, solución de Ringer y solución de dextrosa. Además puede
incluir otros materiales deseables desde el punto de vista comercial
y del usuario, incluidos otros tampones, diluyentes, filtros,
agujas, jeringas y prospectos de envase con instrucciones de
uso.
Los siguientes ejemplos sólo tienen fines
ilustrativos, y no pretenden limitar de ninguna manera el alcance de
la presente invención.
Todas las referencias de patentes y literatura
sobre el tema mencionadas en la presente memoria se incorporan a
ésta como referencia en su totalidad.
Los reactivos comercialmente disponibles a los
que se hace referencia en los ejemplos se utilizaron según las
instrucciones del fabricante a no ser que se indicara de otro modo.
La fuente de las células identificadas en los siguientes ejemplos, y
a lo largo de toda la memoria, por medio de números de accesión ATCC
es la American Type Culture Collection, Manassas, VA.
Se utilizaron las secuencias de dominio
extracelular (ECD) (incluida la secuencia señal de secreción, si hay
alguna) de aproximadamente 950 proteínas secretadas conocidas
procedentes de la base de datos pública Swiss-Prot
para buscar bases de datos EST. Las bases de datos EST incluían
bases de datos públicas (por ejemplo, Dayhoff. GenBank) y bases de
datos privadas (por ejemplo, LIFESEQ®. Incyte pharmaceuticals, Palo
Alto, CA). La búsqueda se llevó a cabo utilizando el programa
informático BLAST o BLAST-2 (Altschul y otros,
Methods in Enzymology, 266: 460-480
(1996)) comparando las secuencias proteínicas ECD con una traducción
de marco 6 de las secuencias EST. Estas comparaciones con una
puntuación BLAST de 70 (o en algunos casos 90) o mayor que no
codificaban proteínas conocidas fueron agrupadas y ensambladas en
secuencias de ADN consenso con el programa "phrap" (Phil Green,
University of Washington, Seattle, Washington).
Utilizando este cribado de homología de dominio
extracelular, las secuencias ADN consenso se ensamblaron con las
otras secuencias EST identificadas utilizando phrap. Además, a
menudo (pero no siempre), se ampliaron las secuencias ADN consenso
obtenidas utilizando ciclos repetidos de BLAST o
BLAST-2 y phrap para ampliar al máximo la secuencia
consenso utilizando las fuentes de secuencias EST comentadas
anteriormente.
A partir de las secuencias consenso obtenidas
tal como se ha descrito anteriormente, se sintetizaron
oligonucleótidos y se utilizaron para identificar mediante RCP una
genoteca de ADNc que contenía la secuencia de interés y para
utilizarlos como sondas para aislar un clon de la secuencia
codificante en toda su longitud de un polipéptido PRO. Los cebadores
de la RCP directa y la RCP inversa generalmente tienen entre 20 y 30
nucleótidos y a menudo son diseñados para proporcionar un producto
RCP con una longitud aproximada de 100-1.000 pb. Las
secuencias de la sonda tienen habitualmente una longitud de
40-55 pb. En algunos casos, se sintetizan
oligonucleótidos adicionales cuando la secuencia consenso es mayor
de aproximadamente 1-1,5 pkb. Para cribar diversas
genotecas en busca de un clon en toda su longitud, se analizó el ADN
de las genotecas mediante amplificación de la RCP, como hicieron
Ausubel y otros, Current Protocols in Molecular Biology, con
el par del cebador RCP. A continuación se utilizó una genoteca
positiva para aislar clones que codifican el gen de interés
utilizando los oligonucleótidos de la sonda y uno de los pares del
cebador.
Las genotecas de ADNc utilizadas para aislar los
clones de ADNc se construyeron mediante procedimientos estándar
utilizando reactivos comercialmente disponibles tales como los de
Invitrogen, San Diego, CA. El ADNc se preparó con
oligo-dT que contenía un sitio NotI, se unió
directamente a adaptadores hemiquinasa SalI, se escindió con NotI,
se le dio el tamaño apropiado mediante electroforesis en gel y se
clonó en una orientación determinada en un vector de clonación
adecuado (tal como pRKB o pRKD; pRK5B es un precursor de pRK5D que
no contiene el sitio SfiI; véase, Holmes y otros, Science,
253: 1.278-1.280 (1991)) en los sitios XhoI y
NotI originales.
Se ensambló una secuencia de ADN consenso con
otras secuencias EST utilizando phrap tal como se ha descrito
anteriormente en el ejemplo 1. Esta secuencia consenso ha sido
diseñada en la presente como ADN 28739. A partir de la secuencia
consenso del ADN 28739, se sintetizaron oligonucleótidos: I) para
identificar mediante RCP una genoteca de ADNc que contenía la
secuencia de interés, y 2) para utilizarlos como sondas para aislar
un clon en toda su longitud de la secuencia codificante del
PR0320.
Se sintetizaron un par de cebadores de la RCP
(directo e inverso):
cebador directo de la RCP:
| 5'-CCTCAGTGGCCACATGCTCATG-3' | (SEC ID N.º: 3) |
\vskip1.000000\baselineskip
Cebador inverso de la RCP:
| 5'-GGCTGCACGTATGGCTATCCATAG-3' | (SEC ID N.º: 4) |
\vskip1.000000\baselineskip
Adicionalmente, se construyó una sonda de
hibridación de nucleótidos sintética a partir de la secuencia
consenso de ADN 28739 que tenía la siguiente secuencia de
nucleótidos:
sonda de hibridación:
| 5'-GATAAACTGTCAGTACAGCTGTGAAGACACAGAAGAAGGGCCACAGTGCC-3' | (SEC ID N.º: 5) |
\vskip1.000000\baselineskip
Para cribar varias genotecas en busca de una
fuente de un clon en toda su longitud, se cribó el ADN de las
genotecas mediante amplificación de la RCP con el par de cebadores
de la RCP identificados anteriormente. A continuación se utilizó una
genoteca positiva para aislar clones que codifican el gen PRO320
utilizando los oligonucleótidos de la sonda y uno de los cebadores
de la RCP. El ARN para la construcción de las genotecas de ADNc se
aisló a partir de tejido pulmonar fetal humano (LIB025).
La secuenciación de ADN de los clones aislados
tal como se ha descrito anteriormente proporcionó la secuencia de
ADN en toda su longitud para el ADN 32284-1307
[figura 1 SEC ID N.º: 1]; y la secuencia proteínica derivada para el
PRO320.
La secuencia codificante completa del ADN
32284-1307 se incluye en la figura 1 (SEC ID N.º:
1). El clon de ADN 32284-1307 contiene un único
marco abierto de lectura con un sitio aparente de iniciación de la
traducción en las posiciones 135-137 del nucleótido,
y un codón de terminación aparente en las posiciones
1.149-1.151 del nucleótido. El precursor del
polipéptido predicho tiene una longitud de 338 aminoácidos. El
análisis de la secuencia del PRO320 en toda su longitud representada
en la figura 2 (SEC ID N.º: 2) evidencia la presencia de una
variedad de dominios importantes del polipéptido, en el que las
localizaciones dadas para estos dominios importantes del polipéptido
son aproximadas tal como se ha descrito anteriormente. El análisis
del polipéptido PRO320 en toda su longitud representado en la figura
2 evidencia la presencia de lo siguiente: un péptido señal de
aproximadamente 1 aminoácido a aproximadamente 21 aminoácidos; un
sitio de amidación de aproximadamente 330 aminoácidos a
aproximadamente 334 aminoácidos; sitios de hidroxilación del ácido
aspártico y la asparagina de aproximadamente 109 aminoácidos a
aproximadamente 121 aminoácidos, de aproximadamente 191 aminoácidos
a aproximadamente 203 aminoácidos, y de aproximadamente 236
aminoácidos a aproximadamente 248 aminoácidos; un patrón
característico de cisteínas con dominios del tipo EGF de
aproximadamente 80 aminoácidos a aproximadamente 91 aminoácidos;
dominios del tipo EGF de unión al calcio de aproximadamente 103
aminoácidos a aproximadamente 125 aminoácidos, de aproximadamente
230 aminoácidos a aproximadamente 252 aminoácidos y de
aproximadamente 185 aminoácidos a aproximadamente 207 aminoácidos.
El clon de ADN 32284-1307 fue presentado junto con
el ATCC el 11 de marzo de 1998 y se le asignó el n.º de depósito
ATCC 209670. La proteína PR0320 en toda su longitud representada en
la figura 2 tiene un peso molecular estimado de aproximadamente
37.143 daltons y un pI de aproximadamente 8,92.
\newpage
El procedimiento siguiente describe la
utilización de una secuencia de nucleótidos codificante del PRO320
como sonda de hibridación.
El ADN que comprende la secuencia codificante
del PRO320 en toda su longitud o maduro (tal como se representa en
la figura 1, SEC ID N.º: 1) o un fragmento de la misma es utilizado
como sonda para cribar los ADN homólogos (tales como las variantes
codificantes del PRO320 de aparición natural) en genotecas de ADNc
de tejido humano o en genotecas genómicas de tejido humano.
La hibridación y lavado de los filtros que
contienen cualquiera de los ADN de las genotecas se lleva a cabo en
las siguientes condiciones de restricción elevada. La hibridación de
una sonda radiomarcada obtenida a partir del gen que codifica un
polipéptido PRO320 en los filtros se lleva a cabo en una disolución
de formamida al 50%, SSC 5x, SDS al 0,1%, pirofosfato de sodio al
0,1%, fosfato de sodio 50 mM, pH 6:8, solución de Denhardt 2x y
sulfato de dextrano al 10% a 42ºC durante 20 horas. El lavado de los
filtros se lleva a cabo en una disolución acuosa de SSC 0,1x y SDS
al 0,1% a 42ºC.
A continuación, pueden identificarse los ADN que
tienen la identidad de secuencia deseada con la secuencia natural en
toda su longitud del ADN codificante utilizando técnicas estándar
conocidas en el estado de la técnica.
Este ejemplo ilustra la preparación de una forma
del PRO320 sin glucosilar mediante expresión recombinante en E.
coli.
La secuencia de ADN que codifica el PRO320 se
amplifica inicialmente utilizando cebadores de la RCP seleccionados.
Los cebadores deberían contener sitios en la enzima de restricción
que correspondan a los sitios de la enzima de restricción en el
vector de expresión seleccionado. Pueden utilizarse una variedad de
vectores de expresión. Un ejemplo de vector adecuado es el pBR322
(derivado de E. coli; véase Bolivar y otros, Gene,
2: 95 (1977)) que contiene genes para la resistencia a la
ampicilina y la tetraciclina. El vector es digerido con enzimas de
restricción y desfosforilado. A continuación se unen las secuencias
amplificadas de la RCP al vector. El vector incluirá preferiblemente
secuencias que codifican un gen de resistencia a antibióticos, un
promotor trp, un líder poli-his (incluidos los
primeros seis codones STII, secuencia poli-his y
sitio de escisión enterocinasa), la región codificante del PRO320,
el terminador transcripcional lambda y un gen argU.
La mezcla de ligación se utiliza a continuación
para transformar una cepa de E. coli seleccionada utilizando
los procedimientos descritos en Sambrook y otros, supra. Los
transformadores son identificados por su capacidad de crecer sobre
placas LB y a continuación se seleccionan las colonias resistentes a
antibióticos. El ADN de plásmidos puede aislarse y confirmarse
mediante análisis de restricción y secuenciación de ADN.
Los clones pueden cultivarse durante toda la
noche en un medio de cultivo líquido tal como un caldo LB
complementado con antibióticos. El cultivo de toda la noche puede
utilizarse posteriormente para inocular un cultivo a mayor escala. A
continuación se cultivan las células a una densidad óptica deseada,
durante la cual se activa el promotor de expresión.
Después de cultivar las células durante varias
horas más, pueden recogerse las células mediante centrifugación. El
sedimento celular obtenido mediante la centrifugación puede
solubilizarse utilizando varios agentes conocidos en el estado de la
técnica, y a continuación puede purificarse la proteína PRO320
solubilizada utilizando una columna quelante de metales en
condiciones que permiten la unión estrecha de la proteína.
El PRO320 puede ser expresado en E coli
en una forma etiquetada (tagged) poli-his,
utilizando el siguiente procedimiento. El ADN que codifica el PRO320
es inicialmente amplificado utilizando cebadores de la RCP
seleccionados. Los cebadores contendrán sitios en la enzima de
restricción que corresponden a los sitios en la enzima de
restricción del vector de expresión seleccionado, y otras secuencias
útiles que proporcionan un inicio fiable y eficaz de la traducción,
una purificación rápida en la columna quelante de metales y la
eliminación proteolítica con enterocinasa. Las secuencias
poli-his etiquetadas (tagged) amplificadas
mediante RCP son ligadas a continuación a un vector de expresión,
que se utiliza para transformar un huésped E. coli basado en
una cepa 52 (W3110 fuhA(tonA) lon galE rpoHts(htpRts)
clpP(laclq). Los transformadores se cultivan en primer lugar
en LB que contiene 50 mg/ml de carbenicilina a 30ºC con agitación
hasta que se obtiene un OD600 de 3-5. A continuación
los cultivos son diluidos 50-100 veces en medio CRAP
(preparado mezclando 3,57 g (NH_{4})_{2}SO_{4}, 0,71 g
de citrato de sodio\cdot2H_{2}O, 1,07 g KCl, 5,36 g de extracto
de levaduras Difco, 5,36 g de Sheffield hycase SF en 500 ml de agua,
así como MPOS 110 mM, pH 7,3, glucosa al 0,55% (p/v) y MgSO_{4} 7
mM) y cultivados durante aproximadamente 20-30 horas
a 30ºC con agitación. Las muestras son extraídas para verificar la
expresión mediante análisis SDS-PAGE, y el grueso
del cultivo es centrifugado para sedimentar las células. Los
sedimentos celulares son congelados hasta su purificación y
replegamiento.
La pasta de E. coli de fermentaciones de
0,5 a 1 l (6-10 g sedimentos) es resuspendida en 10
volúmenes de tampón (p/v) en guanidina 7 M, Tris 20 mM, pH 8. Se
añade sulfito de sodio y tetraionato de sodio sólidos para obtener
las concentraciones finales de 0,1 M y 0,02 M, respectivamente, y se
mantiene la disolución en agitación durante toda la noche a 4ºC.
Este paso da como resultado una proteína desnaturalizada con todos
los residuos cisteína bloqueados por sulfitolización. La disolución
es centrifugada a 40.000 rpm en una ultracentrífuga Beckman durante
30 min. El sobrenadante es diluido con 3-5 volúmenes
de tampón de una columna quelante de metales (guanidina 6 M, Tris 20
mM, pH 7,4) y filtrado a través de filtros de 0,22 micrones para
clarificar. El extracto clarificado es cargado en una columna
quelante de metales Ni^{2+}-NTA Qiagen de 5 ml
equilibrada en el tampón de la columna quelante de metales. La
columna se lava con un tampón adicional que contiene imidazol 50 mM
(Calbiochem, grado Utrol), pH 7,4. La proteína es eluida con un
tampón que contiene imidazol 250 mM. Las fracciones que contienen la
proteína deseada son agrupadas y almacenadas a 4ºC. La concentración
de proteínas se calcula mediante su absorbancia a 280 nm utilizando
el coeficiente de extinción calculado a partir de su secuencia de
aminoácidos.
Las proteínas son replegadas diluyendo la
muestra lentamente en un tampón de repliegue recién preparado que
consta de: tris 20 mM, pH 8,6, NaCl 0,3 M, urea 2,5 M, cisteína S
mM, glicina 20 mM y EDTA 1 mM. Los volúmenes de repliegue se eligen
de modo que la concentración de proteínas final sea entre 50 y 100
microgramos/ml. La disolución de repliegue se agita suavemente a 4ºC
durante 12-36 horas. La reacción de repliegue
termina con la adición de TFA hasta una concentración final de 0,4%
(pH de aproximadamente 3). Antes de otra purificación de la
proteína, se filtra la disolución a través de un filtro de 0,22
micrones y se añade acetonitrilo hasta la concentración final de
2-10%. La proteína replegada es sometida a
cromatografía en una columna de fase inversa Pores RI/H utilizando
un tampón móvil de TFA al 0,1% con elución con un gradiente de
acetonitrilo de 10 al 80%. Las muestras de fracciones con
absorbancia A_{180} son analizadas en geles de poliacrilamida SDS
y las fracciones que contienen proteína replegada homogénea son
agrupadas. Generalmente, las especies replegadas apropiadamente de
la mayor parte de proteínas son eluidas a concentraciones más bajas
de acetonitrilo ya que esas especies son las más compactas con su
parte interna hidrófoba que evita la interacción con la resina de
fase inversa. Las especies agregadas suelen eluirse a
concentraciones más altas de acetonitrilo. Además, para separar las
formas mal plegadas de proteínas de la forma deseada, la etapa de
fase inversa también elimina endotoxina de las muestras.
Las fracciones que contienen el polipéptido
PRO320 plegado deseado son agrupadas y se elimina el acetonitrilo
utilizando una corriente suave de nitrógeno dirigida a la
disolución. Las proteínas son formuladas en Hepes 20 mM, pH 6,8 con
cloruro de sodio 0,14 M y manitol al 4% mediante diálisis o mediante
filtración con gel utilizando resinas Superfine G25 (Pharmacia)
equilibradas en el tampón de la formulación y filtradas de manera
estéril.
En el documento WO 00/37 638, los polipéptidos
fueron expresados satisfactoriamente en E. coli en una forma
etiquetada (tagged) poli-his mediante el
procedimiento anterior.
Este ejemplo ilustra la preparación de una forma
potencialmente glucosilada del PRO320 mediante expresión
recombinante en células de mamíferos.
El vector, pRK5 (véase EP 307.247, publicada el
15 de marzo de 1989), se utiliza como el vector de expresión.
Opcionalmente, el ADN del PRO320 se liga a pRK5 con enzimas de
restricción seleccionadas para permitir la inserción del ADN del
PRO320 utilizando procedimientos de ligación tales como los
descritos en Sambrook y otros, supra. El vector resultante se
denomina pRK5-PRO320.
En una realización, las células huésped
seleccionadas pueden ser células 293. Las células 293 humanas (ATCC
CCL 1573) son cultivadas hasta confluir en placas de cultivo tisular
en un medio tal como DMEM complementado con suero fetal de ternera y
opcionalmente nutrientes y/o antibióticos. Se mezclan
aproximadamente 10 \mug de ADN de pRK5-PRO320 con
aproximadamente 1 \mug de ADN que codifica el gen del ARN de VA
ARN [Thimmappaya y otros, Cell, 31: 543 (1982)] y se
disuelven en 500 \mul de Tris-HCl 1 mM, EDTA 0,1
mM, CaCl_{2} 0,227 M. A esta mezcla se añaden, por goteo, 500
\mul de HEPES 50 mM (pH 7,35), NaCl 280 mM, NaPO_{4} 1,5 mM, y
ello permite la formación de un precipitado a los 10 minutos a 25ºC.
El precipitado es suspendido y añadido a las células 293 y se deja
reposar durante unas cuatro horas a 37ºC. Se extrae el medio de
cultivo y se añaden 2 ml de glicerol al 20% en PBS durante 30
segundos. A continuación se lavan las células 293 con un medio libre
de suero, se añade un medio fresco y se incuban las células durante
aproximadamente 5 días.
Al cabo de aproximadamente 24 horas de las
transfecciones, se elimina el medio de cultivo y se sustituye por
medio de cultivo (solo) o medio de cultivo que contenga 200
\muCi/ml de ^{35}S-cisteína y 200 \muCi/ml de
^{35}S-metionina. Tras 12 horas de incubación, se
extrae el medio condicionado, se concentra en un filtro de
centrifugación y se carga en un gel SDS al 15%. El gel procesado
puede desecarse y dejar que forme una película durante un período de
tiempo seleccionado para descubrir la presencia del polipéptido
PRO320. Los cultivos que contienen células transfectadas pueden
someterse a otra incubación (en un medio libre de suero) y el medio
es analizado en bioanálisis seleccionados.
En una técnica alternativa, puede introducirse
transitoriamente el PRO320 en células 293 utilizando el
procedimiento con sulfato de dextrano descrito por Somparyrac y
otros, Proc. Natl. Acad. Sci., 12: 7.575 (1981), las
células 293 son cultivadas hasta una densidad máxima en un matraz de
centrifugación y se añaden 700 \mug de ADN
pRK5-PRO320. En primer lugar se concentran las
células del matraz de centrifugación mediante centrifugación y se
lavan con PBS. El precipitado ADN-dextrano es
incubado en el sedimento celular durante cuatro horas. Las células
son tratadas con glicerol al 20% durante 90 segundos, lavadas con
medio de cultivo tisular y reintroducidas en el matraz de
centrifugación que contiene medio de cultivo tisular, 5 \mug/ml de
insulina bovina y 0,1 \mug/ml de transferrina bovina. Al cabo de
unos cuatro días, el medio condicionado es centrifugado y filtrado
para eliminar células y residuos. La muestra que contiene el PRO320
expresado puede concentrarse y purificarse a continuación mediante
cualquier procedimiento seleccionado, tal como diálisis y/o
cromatografía de columna.
En otra realización, puede ser expresado en
células CHO. El pRK5-PRO320 puede ser transfectado
en células CHO utilizando reactivos conocidos tales como CaPO o
DEAE-dextrano. Tal como se ha descrito
anteriormente, los cultivos celulares pueden ser incubados y el
medio sustituido por medio de cultivo (solo) o por un medio que
contenga un marcador radioactivo tal como
"S-metionina". Después de determinar la
presencia de un polipéptido PRO320, el medio de cultivo puede ser
sustituido por un medio libre de suero. Preferiblemente, los
cultivos son incubados durante unos 6 días y a continuación se
recoge el medio condicionado. A continuación, puede concentrarse y
purificarse el medio que contiene el polipéptido PRO320 expresado
mediante cualquier procedimiento seleccionado.
El PRO320 de epítopo etiquetado (tagged)
también puede expresarse en células CHO huésped. El PRO320 puede
subclonarse a partir del vector pRK5. El inserto del subclon puede
someterse a RCP para fusionarse en marco con un epítopo tag
seleccionado tal como un tag poli-his en un
vector de expresión de baculovirus. A continuación puede subclonarse
el inserto del PRO320 etiquetado (tagged)
poli-his en un vector dirigido SV40 que contenga un
marcador de selección tal como DHFR para la selección de clones
estables. Por último, las células CHO pueden ser transfectadas (tal
como se ha descrito anteriormente) con un vector dirigido SV40. El
marcado puede llevarse a cabo, tal como se ha descrito
anteriormente, para verificar la expresión. A continuación puede
concentrarse y purificarse el medio de cultivo que contiene el
PRO320 etiquetado (tagged) poli-his expresado
mediante cualquier procedimiento seleccionado, tal como mediante
cromatografía de afinidad de quelatos Ni^{2+}.
El PRO320 también puede expresarse en células
CHO y/o COS mediante un procedimiento de expresión transitoria o en
células CHO mediante otro procedimiento de expresión estable.
La expresión estable en células CHO se lleva a
cabo utilizando el siguiente procedimiento. Las proteínas son
expresadas como una construcción IgG (inmunoadhesina), en el que las
secuencias codificantes de las formas solubles (por ejemplo,
dominios extracelulares) de las proteínas respectivas son fusionadas
a una secuencia de regiones constantes IgGI que contiene la región
bisagra, los dominios CH2 y CH2 y/o como una forma etiquetada
(tagged) poli-his.
Tras la amplificación mediante RCP, los ADN
respectivos son subclonados en un vector de expresión CHO utilizando
técnicas estándar tal como se ha descrito en Ausubel y otros,
Current Protocols of Molecular Biology, Unit 3.16, John Wiley
y Sons (1997). Los vectores de expresión CHO se construyen para
disponer de los sitios de restricción 5' y 3' compatibles del ADN de
interés para permitir el lanzamiento conveniente de los ADNc. El
vector utilizado en la expresión en células CHO es tal como se ha
descrito en Lucas y otros, Nucl. Acids Res., 24: 9
(1.774-1.779 (1996) y utiliza el
promotor/potenciador inmediato de SV40 para conducir la expresión
del ADNc de interés y de la dihidrofolato reductasa (DHFR). La
expresión de la DHFR permite la selección para el mantenimiento
estable del plásmido tras la transfección.
Se introducen doce microgramos del ADN plásmido
deseado en aproximadamente 10 millones de células CHO utilizando los
reactivos de transfección comercialmente disponibles Superfect®
(Quiagen), Dosper® o Fugene® (Boehringer Mannheim). Las células se
cultivan tal como se describe en Lucas y otros, supra. Se
congelan aproximadamente 3x10^{-7} células en un recipiente de
vidrio para el posterior cultivo y producción tal como se describe a
continuación.
Los recipientes de vidrio que contienen el ADN
plásmido son licuados colocándolas en un baño de agua y se mezclan
en vórtex. El contenido se pipetea a un tubo de centrifugación que
contiene 10 ml de medio y se centrifuga a 1.000 rpm durante 5
minutos. El sobrenadante es aspirado y las células son resuspendidas
en 10 ml de medio selectivo (0,2 \mum de PS20 filtrado con 0,2
\mum de suero bovino fetal diafiltrado al 5%). A continuación se
distribuyen las células en un centrifugador de 100 ml que contiene
90 ml de medios selectivos. Al cabo de 1-2 días, las
células son transferidas a un centrifugador de 250 ml que contiene
150 ml de medio de cultivo selectivo y se incuban a 37ºC. Al cabo de
otros 2-3 días, se siembran los centrifugadores de
250 ml, 500 ml y 2.000 ml con 3x10^{3} células/ml. Los medios
celulares son sustituidos por medios recién preparados mediante
centrifugación y resuspensión en un medio de producción. Aunque
puede utilizarse cualquier medio CHO adecuado, en realidad puede
utilizarse un medio de producción descrito en la patente de EE.UU.
US 5.122.469, publicada el 16 de junio de 1992. En un centrifugador
de producción de 3 l se siembran 1,2x10^{6} células/ml. El día 0,
se determinan el número de células y el pH. El día 1, se muestrea el
centrifugador y se inicia la agitación con aire filtrado. El día 2,
se muestrea el centrifugador, se modifica la temperatura hasta 33ºC
y se toman 30 ml de glucosa 500 g/l y 0,6 ml de antiespumante al 10%
(por ejemplo, emulsión de polidimetilsiloxano al 35%; Dow Coming 365
Medical Grade Emulsion). Durante la producción, se ajusta el pH
cuando sea necesario para mantenerlo alrededor de 7,2. Al cabo de 10
días, o hasta que la viabilidad disminuya por debajo del 70%, se
recoge el cultivo celular mediante centrifugación y filtrando a
través de un filtro de 0,22 \mum. El filtrado se almacena a 4ºC o
se carga de inmediato en columnas para su purificación.
\newpage
En el caso de las construcciones etiquetadas
(tagged) poli-his, las proteínas son
purificadas utilizando una columna Ni^{2+}-NTA
(Qiagen). Antes de la purificación, se añade imidazol al medio
condicionado hasta una concentración de 5 mM. El medio condicionado
es bombeado en una columna Ni^{2+}-NTA de 6 ml
equilibrada en Hepes 20 mM, pH 7,4, un tampón que contiene NaCl 0,3
M e imidazol 5 mM a una velocidad de flujo de 4-5
ml/min a 4ºC. Después de la carga, se lava la columna con un tampón
de equilibrio adicional y se eluye la proteína con un tampón de
equilibrio que contiene imidazol 0,25 M. La proteína altamente
purificada es posteriormente desalada en un tampón de almacenado que
contiene Hepes 10 mM, NaCl 0,14 M y manitol al 4%, pH 6,8, con una
columna G25 Superfine (Pharmacia) de 25 ml y se almacena a
-80ºC.
Las construcciones de inmunoadhesina (que
contienen Fc) son purificadas de los medios condicionados tal como
sigue. El medio condicionado es bombeado a una columna de proteína A
de 5 ml (Pharmacia) que ha sido equilibrada en un tampón fosfato de
Na 20 mM, pH 6,8. Después de la carga, se lava la columna a fondo
con un tampón de equilibrio antes de la elución con ácido cítrico
100 mM, pH 3,5. La proteína eluida es inmediatamente neutralizada
mediante extracción de fracciones de 1 ml en tubos que contienen 275
\mul de tampón Tris 1 M, pH 9. Posteriormente se desala la
proteína altamente purificada en un tampón de almacenaje tal como se
ha descrito anteriormente para las proteínas etiquetadas
(tagged) poli-his. La homogeneidad se evalúa
mediante geles de poliacrilamida SDS y mediante secuenciación de
aminoácidos N-terminales mediante degradación de
Edman.
El PRO320 se expresa de manera estable en
células CHO mediante el procedimiento descrito anteriormente.
Además, los polipéptidos fueron expresados en células CHO mediante
el procedimiento de expresión transitoria del documento WO
00/37638.
El siguiente procedimiento describe la expresión
recombinante del PRO320 en levadura.
En primer lugar, se construyen los vectores de
expresión de levaduras para la producción intracelular o secreción
del PRO320 a partir del promotor ADH2/GAPDH. El ADN que codifica el
PRO320 y el promotor es insertado en sitios adecuados de la enzima
de restricción en el plásmido seleccionado para dirigir la expresión
intracelular directa del PRO320. Para la secreción, puede clonarse
el ADN que codifica el PRO320 en el plásmido seleccionado, junto con
el ADN que codifica el promotor ADH2/GAPDH, un péptido señal del
PRO320 natural u otro péptido señal de mamífero, o, por ejemplo, un
factor alfa de levaduras o una secuencia líder/señal secretora de
invertasa, y secuencias conectoras (si hacen falta) para la
expresión del PRO320.
A continuación pueden transformarse células de
levaduras, tales como la cepa AB110 de levadura, con plásmidos de
expresión descritos anteriormente y cultivados en medios de
fermentación seleccionados. Los sobrenadantes de levaduras
transformadas pueden ser analizados mediante precipitación con ácido
tricloroacético al 10% y separados mediante
SDS-PAGE, seguido de tinción de la descendencia con
tinción de azul de Coomassie.
El PRO320 recombinante puede aislarse y
purificarse eliminando posteriormente las células de levaduras del
medio de fermentación mediante centrifugación y a continuación
concentrando el medio utilizando filtros de cartucho seleccionados.
El concentrado que contiene el PRO320 también puede purificarse
utilizando resinas de cromatografía de columna seleccionadas.
El siguiente procedimiento describe la expresión
recombinante en células de insecto infectadas por baculovirus.
La secuencia que codifica el PRO320 es fusionada
en la dirección 5' de un epítopo tag contenido dentro de un
vector de expresión de baculovirus. Tales epítopos tag
incluyen tags poli-his y tags de
inmunoglobulinas (como las regiones Fc de la IgG). Pueden utilizarse
una variedad de plásmidos, incluidos los plásmidos derivados de
plásmidos comercialmente disponibles tales como pVL1393 (Novagen).
En resumen, la secuencia que codifica el PRO320 o la parte deseada
de la secuencia codificante del PRO320 (tal como la secuencia que
codifica el dominio extracelular de una proteína transmembrana o la
secuencia que codifica la proteína madura si la proteína es
extracelular) es amplificada mediante RCP con cebadores
complementarios hasta las regiones 5' y 3'. El cebador 5' puede
incorporar sitios de la enzima de restricción flanqueantes
(seleccionados). A continuación el producto es digerido con aquellas
enzimas de restricción seleccionadas y subclonado en el vector de
expresión.
El baculovirus recombinante se genera mediante
cotransfección del plásmido anterior y el ADN del virus BaculoGold™
(Pharmingen) en células de Spodoptera frugiperda ("Sf9")
(ATCCCRL 1711) utilizando lipofectina (comercialmente disponible en
GIBCO-BRL). Después de 4-5 días de
incubación a 28ºC, se recogen los virus liberados y se utilizan en
otras amplificaciones. La infección vírica y la expresión de
proteínas se llevan a cabo tal como describieron O'Reilley y otros,
Baculovirus expression vectors: A Laboratory Manual, Oxford:
Oxford University Press (1994).
A continuación puede purificarse el PRO320
etiquetado (tagged) poli-his expresado, por
ejemplo, mediante cromatografía de afinidad quelante Ni^{2+ } tal
como sigue. Los extractos se preparan a partir de células Sf9
recombinantes infectadas por virus tal como describieron Rupert y
otros, Nature, 362: 175-179 (1993). En
resumen, se lavan las células Sf9, se resuspenden en un tampón de
sonicación (25 ml Hepes, pH 7,9; MgCl_{2} 12,5 mM; EDTA 0,1 mM;
glicerol al 10%; NP-40 al 0,1%; KCl 0,4 M) y se
someten dos veces a exposición de ultrasonidos durante 20 segundos
en hielo. Se elimina mediante centrifugación el extracto sometido a
sonicación, el sobrenadante se diluye 50 veces en un tampón de carga
(fosfato 50 mM, NaCl 300 mM, glicerol al 10%, pH 7,8) y se filtra a
través de un filtro de 0,45 mm. Se prepara una columna de agarosa
Ni^{2+}-NTA (comercialmente disponible en Qiagen)
con un volumen de lecho de 5 ml, se lava con 25 ml de agua y se
equilibra con 25 ml de tampón de carga. El extracto celular filtrado
se carga en la columna a 0,5 ml por minuto. La columna se lava hasta
que se recupera el estado inicial A_{280} con un tampón de carga,
en cuyo momento se inicia la recogida de fracciones. A continuación,
se lava la columna con un tampón de lavado secundario (fosfato 50
mM: NaCl 300 mM, glicerol al 10%, pH 6,0), que eluye la proteína
unida de un modo inespecífico. Después de alcanzar de nuevo el
estado inicial A_{280}, la columna se pone a punto con un
gradiente de imidazol de 0 a 500 mM en el tampón de lavado
secundario. Se recogen fracciones de un ml y se analizan mediante
SDS-PAGE y tinción de plata o mediante
inmunotransferencia con
Ni^{2+}-NTA-conjugado con
fosfatasa alcalina (Qiagen). Las fracciones que contienen el PRO320
etiquetado (tagged) His_{10} eluidas son agrupadas y
dializadas frente el tampón de carga.
Alternativamente, puede realizarse la
purificación del PRO320 etiquetado (tagged) (o tagged
Fc) de la IgG utilizando técnicas de cromatografía conocidas, entre
las que se incluyen, por ejemplo, la cromatografía en columna de
proteínas A o proteínas G.
Después de la amplificación mediante RCP, las
secuencias codificantes respectivas son subclonadas en un vector de
expresión de baculovirus (pb.PH.lgG para fusiones de IgG y
pb.PH.His.c para proteínas etiquetadas tagged
poli-his), y el vector y el ADN de baculovirus
Baculogold® (Pharmingen) son cotransfectados en células de
Spodoptera frugiperda ("Sf9") 105 (ATCC CRL 1711),
utilizando lipofectina (Gibco BRL). pb.PH.IgG y pb.PH.His son
modificaciones del vector de expresión de baculovirus comercialmente
disponible pVL1393 (Pharmingen), con regiones policonectoras
modificadas para incluir las secuencias tag his o Fc. Las
células son cultivadas en medio TNM-FH de Hink
complementado con FBS al 10% (Hyclone). Las células son incubadas
durante 5 días a 28ºC. Se recoge el sobrenadante y posteriormente se
utiliza para la primera amplificación vírica mediante infección de
células Sf9 en medio TNM-FH de Hink complementado
con FBS al 10% a una multiplicidad de infección (MOI) aproximada de
10. Las células son incubadas durante 3 días a 28ºC. Se recoge el
sobrenadante y se determina la expresión de las construcciones en el
vector de expresión de baculovirus mediante unión por lotes de 1 ml
de sobrenadante con 25 ml de perlas Ni^{2+}-NTA
(QIAGEN) para proteínas etiquetads (tagged) de histidina o
con perlas CL-4B en una columna Sepharose de
proteínas A (Pharmacia) para proteínas etiquetadas (tagged)
de IgG seguido de análisis SDS-PAGE comparando con
una concentración conocida de proteina estándar mediante tinción con
azul de Coomassie.
El primer sobrenadante de la amplificación
vírica se utiliza para infectar un cultivo celular con agitación
centrífuga (500 ml) de células Sf9 cultivadas en medio
ESF-921 (Expression Systems LLC) a una MOI
aproximada de 0,1. Las células son incubadas durante 3 días a 28ºC.
Se recoge el sobrenadante y se filtra. Se repiten la unión por lotes
y el análisis SDS-PAGE tantas veces como sea
necesario hasta que se confirma la expresión del cultivo celular con
agitación centrífuga.
El medio condicionado de las células
transfectadas (0,5 a 3 l) es recogido mediante centrifugación para
eliminar las células y se filtra a través de filtros de 0,22
micrones. Para las construcciones etiquetadas (tagged)
poli-his, se purifica la construcción proteínica
utilizando una columna Ni^{2+}-NTA (Qiagen). Antes
de la purificación, se añade imidazol al medio condicionado hasta
una concentración de 5 mM. El medio condicionado es bombeado a una
columna Ni^{2+}-NTA de 6 ml equilibrada en Hepes
20 mM, pH 7,4, un tampón que contiene NaCl 0,3 M e imidazol 5 mM a
una velocidad de flujo de 4-5 ml/min a 4ºC. Después
de la carga, se lava la columna con un tampón de equilibrio
adicional y se eluye la proteína con el tampón de equilibrio que
contiene imidazol 0,25 M. La proteína altamente purificada es
posteriormente desalada en un tampón de almacenaje que contiene
Hepes 10 mM, NaCl 0,14 M y manitol al 4%, pH 6,8, con una columna
G25 Superfine de 25 ml (Pharmacia) y almacenada a -80ºC.
Las construcciones de inmunoadhesina (que
contienen Fc) de proteínas son purificadas de los medios
condicionados tal como sigue. El medio condicionado es bombeado en
una columna de proteínas A de 5 ml (Pharmacia) que ha sido
equilibrada en un tampón fosfato que contiene Na 20 mM y de pH 6,8.
Después de la carga, se lava extensamente la columna con un tampón
de equilibrio antes de llevar a cabo la elución con ácido cítrico
100 mM, a pH 3,5. La proteína eluida es neutralizada de inmediato
mediante recogida de fracciones de 1 ml en tubos que contienen 275
ml de tampón Tris 1 M, a pH 9. La proteína altamente purificada es
posteriormente desalada en un tampón de almacenaje tal como se ha
descrito anteriormente para las proteínas etiquetadas
(tagged) poli-his. La homogeneidad de las
proteínas se verifica mediante electroforesis en gel de
poliacrilamida SDS (PEG) y secuenciación de aminoácidos del extremo
terminal mediante degradación de Edman.
En el documento WO 00/37638, los polipéptidos
fueron expresados en células de insecto Sf9 infectadas por
baculovirus.
Alternativamente, puede utilizarse un
procedimiento con baculovirus modificado incorporando
high-5 células. En este procedimiento, el ADN que
codifica la secuencia deseada es amplificado con sistemas adecuados,
tales como Pfu (Stratagene), o fusionada en dirección 5' de un
epítopo tag contenido en un vector de expresión de
baculovirus. Dichos tags de epítopo incluyen tags
poli-his y tags de inmunoglobulina (como las
regiones Fc de la IgG). Pueden utilizarse una variedad de plásmidos,
incluidos plásmidos obtenidos a partir de plásmidos comercialmente
disponibles tales como plE1-1 (Novagen). Los
vectores plE1-1 y plE1-2 se han
diseñado para la expresión constitutiva de proteínas recombinantes a
partir del promotor ie1 de baculovirus en células de insecto
transformadas de manera estable (I). Los plásmidos difieren
únicamente en la orientación de los múltiples sitios de clonación y
contienen todas las secuencias promotoras que se sabe que son
importantes para la expresión génica mediada por IE1 en células de
insecto no infectadas, así como el elemento potenciador de hr5,
pIE1-1 y pIE1-2 incluyen el sitio de
inicio de la traducción y pueden utilizarse para producir proteínas
de fusión. En resumen, la secuencia deseada o la parte deseada de la
secuencia (tal como la secuencia que codifica el dominio
extracelular de una proteína transmembrana) es amplificada mediante
RCP con cebadores complementarios a las regiones 5' y 3'. El cebador
5' puede incorporar sitios de la enzima de restricción flanqueantes
(seleccionados). A continuación el producto es digerido con aquellas
enzimas de restricción seleccionadas y subclonado en el vector de
expresión. Por ejemplo, los derivados de pIE1-1
pueden incluir la región Fc de la IgG humana (pb.PH.IgG) o un
tag de 8 histidinas (pb.PH.His) en dirección 3' de la
secuencia deseada. Preferiblemente, la construcción del vector es
secuenciada para confirmación.
Las células High-5 se cultivan
hasta una confluencia del 50% en las siguientes condiciones: 27ºC,
ausencia de CO_{2}, NO pen/strep. Para cada placa de 150 mm, se
mezclan 30 \mug del vector basado en pIE que contiene la secuencia
con 1 ml de medio Ex-Cell (medio: Ex.Cell 401 +
1/100 l-Glu JRH Biosciences n.º
14401-78P (nota: este medio es sensible a la luz)),
y en un tubo separado se mezclan 100 \mul de CellFectin
(CellFECTIN (G ibcoBRL n.º 10362-010) (mezclado en
vórtex)) con 1 ml de medio Ex-Cell. Las dos
disoluciones se combinan y se dejan incubar a temperatura ambiente
durante 15 minutos. Se añaden 8 ml de medio Ex-Cell
a los 2 ml de la mezcla de ADN/CellFECTIN y ésta se extiende sobre
células high-5 que han sido lavadas una vez con
medio Ex-Cell. A continuación se incuba la placa en
la oscuridad durante 1 hora a temperatura ambiente. A continuación,
se aspira la mezcla de ADN/CellFECTIN y se lavan las células una vez
con Ex-Cell para eliminar el exceso de CellFECTIN,
se añaden 30 ml de medio Ex-Cell recién preparado y
se incuban las células durante 3 días a 28ºC. Se recoge el
sobrenadante y se determina la expresión de la secuencia en el
vector de expresión de baculovirus mediante unión por lotes de 1 ml
de sobrenadante con 25 ml de perlas Ni^{2+}-NTA
(QIAGEN) para proteínas etiquetadas (tagged) de histidina o
con perlas CL-4B Sepharose de proteína A (Pharmacia)
para proteínas etiquetadas (tagged) de IgG seguido de
análisis SDS-PAGE comparando con una concentración
conocida de referencia de proteína mediante tinción con azul de
Coomassie.
El medio condicionado de las células
transfectadas (0,5 a 3 l) es recogido mediante centrifugación para
eliminar las células y se filtra a través de filtros de 0,22
micrones. Para las construcciones etiquetadas (tagged)
poli-his, se purifica la proteína que comprende la
secuencia utilizando una columna Ni^{2+}-NTA
(Qiagen). Antes de la purificación, se añade imidazol al medio
condicionado hasta una concentración 5 mM. El medio condicionado es
bombeado a una columna Ni^{2+}-NTA de 6 ml
equilibrada en Hepes 20 mM, pH 7,4, un tampón que contiene NaCl 0,3
M e imidazol 5 mM a una velocidad de flujo de 4-5
ml/min a 48ºC. Después de la carga, se lava la columna con un tampón
de equilibrio adicional y se eluye la proteína con el tampón de
equilibrio que contiene imidazol 0,25 M. La proteína altamente
purificada es posteriormente desalada en un tampón de almacenaje que
contiene Hepes 10 mM, NaCl 0,14 M y manitol al 4%, pH 6,8, con una
columna G25 Superfine de 25 ml (Pharmacia) y almacenada a -80ºC.
Las construcciones de inmunoadhesina (que
contienen Fc) son purificadas de los medios condicionados tal como
sigue. El medio condicionado es bombeado a una columna de proteínas
A de 5 ml (Pharmacia) que ha sido equilibrada en un tampón fosfato
que contiene Na 20 mM y con un pH de 6,8. Después de la carga, se
lava extensamente la columna con un tampón de equilibrio antes de
llevar a cabo la elución con ácido cítrico 100 mM, a pH 3,5. La
proteína eluida es neutralizada de inmediato mediante recogida de
fracciones de 1 ml en tubos que contienen 275 ml de tampón Tris 1 M,
a pH 9. La proteína altamente purificada es posteriormente desalada
en un tampón de almacenaje tal como se ha descrito anteriormente
para las proteínas etiquetadas (tagged)
poli-his. La homogeneidad de la secuencia es
evaluada mediante geles de poliacrilamida SDS y por secuenciación de
aminoácidos del extremo terminal N mediante degradación de Edman y
otros procedimientos analíticos en función de lo que se desee o haga
falta.
En el documento WO 00/37638, los polipéptidos
fueron expresados en células de insecto Sf9 infectadas por
baculovirus.
Este ejemplo ilustra la preparación de
anticuerpos monoclonales que pueden unirse específicamente al
PRO320.
Las técnicas para producir los anticuerpos
monoclonales son conocidas en el estado de la técnica y se
describen, por ejemplo, en Goding, supra. Entre los
inmunógenos que pueden utilizarse se incluyen el PRO320 purificado,
proteínas de fusión que contienen PRO320 y células que expresan el
PRO320 recombinante en la superficie de la célula. La selección del
inmunógeno puede ser llevada a cabo por cualquier experto en la
materia.
Ratones, tales como los Balb/c, son inmunizados
con el inmunógeno PRO320 emulsionado en adyuvante completo de Freund
e inyectados por vía subcutánea o intraperitoneal en una cantidad de
1-100 microgramos. Alternativamente, el inmunógeno
es emulsionado en adyuvante MPL-TDM (Ribi
Immunochemical Research. Hamilton. MT) e inyectado en las patas
traseras del animal. A continuación, los ratones inmunizados reciben
una inyección de refuerzo 10-12 días más tarde con
inmunógeno adicional emulsionado en el adyuvante seleccionado.
Después de esto, durante varias semanas, los ratones también pueden
recibir inyecciones de refuerzo con inyecciones de inmunización
adicionales. Periódicamente pueden obtenerse muestras séricas de los
ratones mediante sangrado retroorbital para someterlas a análisis
ELISA para detectar anticuerpos anti-PRO320.
Después de detectar una titulación adecuada de
anticuerpos, los animales "positivos" para anticuerpos pueden
recibir una última inyección intravenosa de PRO320. Al cabo de tres
o cuatro días, los ratones son sacrificados y se extraen las células
del bazo. A continuación se fusionan las células del bazo
(utilizando polietilenglicol al 35%) con una línea celular de
mieloma murino seleccionada, tal como P3X63AgU. 1, disponible en la
ATCC, N.º CRL 1597. Las fusiones generan células de hibridoma que a
continuación pueden sembrarse en placas de cultivo celular de 96
pocillos que contienen medio HAT (hipoxantina, aminopterina y
timidina) para inhibir la proliferación de células no fusionadas,
híbridos de mieloma e híbridos de células del bazo.
Las células de hibridoma serán cribadas mediante
ELISA en busca de reactividad contra el PRO320. La determinación de
células de hibridoma "positivas" que secretan los anticuerpos
monoclonales deseados anti-PRO320 forma parte de las
habilidades de la técnica.
Las células de hibridoma positivas pueden ser
inyectadas por vía intraperitoneal en ratones Balb/c singeneicos
para producir ascitis que contiene los anticuerpos monoclonales
anti-PRO320. Alternativamente, las células de
hibridoma pueden ser cultivadas en matraces de cultivo tisular o
"roller bonles". La purificación de los anticuerpos
monoclonales producidos en la ascitis puede conseguirse mediante
precipitación de sulfato de amoníaco, seguida de cromatografía de
exclusión en gel. Alternativamente, puede utilizarse la
cromatografía de afinidad basada en la unión del anticuerpo a la
proteína A o a la proteína G.
Los polipéptidos PRO320 naturales o
recombinantes pueden purificarse mediante una variedad de técnicas
estándar en el ámbito de la purificación de proteínas. Por ejemplo,
el polipéptido pro-PRO320, el polipéptido PRO320
maduro o el polipéptido pre-PRO320 es purificado
mediante cromatografía de inmunoafinidad utilizando anticuerpos
específicos para el polipéptido PRO320 de interés. En general, una
columna de inmunoafinidad se prepara mediante unión covalente del
anticuerpo del polipéptido anti-PRO320 con una
resina cromatográfica activada.
Las inmunoglobulinas policlonales se preparan a
partir de suero inmune bien mediante precipitación con sulfato de
amoníaco o mediante purificación sobre una proteína A inmovilizada
(Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, N.J.). Asimismo, los
anticuerpos monoclonales se preparan a partir de líquido de ascitis
de ratón mediante precipitación con sulfato de amoníaco o mediante
cromatografía sobre proteína A inmovilizada. La inmunoglobulina
parcialmente purificada se une covalentemente a una resina
cromatográfica tal como SEPHAROSE™ activada con CnBr (Pharmacia LKB
Biotechnology). El anticuerpo se une a la resina, se bloquea la
resina y se lava la resina obtenida de acuerdo con las
instrucciones del fabricante.
Dicha columna de inmunoafinidad se utiliza en la
purificación del polipéptido PRO320 mediante la preparación de una
fracción de células que contiene el polipéptido PRO320 en una forma
soluble. Este preparado se obtiene mediante solubilización de la
célula entera o de una fracción subcelular obtenida mediante
centrifugación diferencial por medio de la adición de detergente o
mediante otros procedimientos bien conocidos en el estado de la
técnica. Alternativamente, puede secretarse en cantidades útiles el
polipéptido PRO320 soluble que contiene una secuencia señal en el
medio donde se cultivan las células.
Se hace pasar un preparado que contiene el
polipéptido PRO320 soluble por la columna de inmunoafinidad y se
lava la columna en condiciones que permitan la absorbancia
preferente del polipéptido PRO320 (por ejemplo, tampones de elevada
fuerza iónica en presencia de detergente). A continuación, se eluye
la columna en condiciones que interrumpen la unión
anticuerpo/polipéptido PRO320 (por ejemplo, un tampón de pH bajo tal
como aproximadamente pH 2-3, o una concentración
elevada de un caotrópico tal como urea o ión tiocianato) y se recoge
el polipéptido PRO320.
Esta invención es particularmente útil para el
cribado de compuestos mediante polipéptidos PRO320 o un fragmento de
unión del mismo en cualquiera de una variedad de técnicas de cribado
de fármacos. El polipéptido PRO320 o fragmento utilizado en tal
prueba puede estar libre en la solución, estar fijado a un soporte
sólido, hallarse en la superficie de una célula, o localizarse
intracelularmente. Un procedimiento de cribado de fármacos utiliza
células huésped eucariotas o procariotas que son transformadas de
manera estable con ácidos nucleicos recombinantes que expresan el
polipéptido PRO320 o fragmento. Los fármacos son cribados contra
tales células transformadas en análisis de unión competitiva. Dichas
células, bien en forma viable o fijada, pueden utilizarse para
análisis de unión estándar. Puede mesurarse, por ejemplo, la
formación de complejos entre un polipéptido PRO320 o un fragmento
del mismo y el agente que se está probando. Alternativamente, puede
examinarse la disminución en la formación de complejos entre el
polipéptido PRO320 y su célula diana o los receptores diana causada
por el agente que se está probando.
De hecho, la presente invención proporciona
procedimientos de cribado para fármacos u otros agentes que pueden
afectar a una enfermedad o trastorno asociado a un polipéptido
PRO320. Estos procedimientos comprenden poner en contacto tal agente
con un polipéptido PRO320 o un fragmento del mismo y analizar: (i)
en busca de la presencia de un complejo entre el agente y el
polipéptido PRO320 o un fragmento del mismo, o (ii) en busca de la
presencia de un complejo entre el polipéptido PRO320 o fragmento del
mismo y la célula, mediante procedimientos bien conocidos en el
estado de la técnica. En dichos análisis de unión competitiva,
habitualmente el polipéptido PRO320, o fragmento del mismo, está
marcado. Tras la incubación adecuada, se separa el polipéptido
PRO320 libre, o fragmento del mismo, de aquel presente en forma
unida, y la cantidad de marcador libre o que no ha formado complejos
es una medida de la capacidad del agente particular para unirse al
polipéptido PRO320 o para interferir con el complejo polipéptido
PRO320/célula.
Otra técnica para cribar fármacos proporciona un
cribado muy productivo para compuestos que presentan una afinidad de
unión adecuada a un polipéptido y se describe con detenimiento en el
documento WO 84/03564, publicado el 13 de septiembre de 1984. Para
decirlo de una forma resumida, se sintetizan grandes cantidades de
distintos compuestos de prueba de péptidos pequeños sobre un
sustrato sólido, tal como agujas de plástico o alguna otra
superficie. En cuanto al polipéptido PRO320, se hacen reaccionar los
compuestos de prueba de péptidos con el polipéptido PRO320 y se
lavan. El polipéptido PRO320 unido es detectado mediante
procedimientos bien conocidos en el estado de la técnica. El
polipéptido PRO320 purificado también puede cubrir directamente
placas de cultivo para utilizarlo en las técnicas de cribado de
fármacos mencionadas anteriormente. Además, pueden utilizarse
anticuerpos no neutralizantes para atrapar el péptido e
inmovilizarlo en un soporte sólido.
Esta invención también contempla el uso de
análisis de cribado de fármacos competitivos en los que los
anticuerpos neutralizantes capaces de unirse al polipéptido PRO320
compiten específicamente con un compuesto de prueba para unirse al
polipéptido PRO320 o a fragmentos del mismo. De esta manera, pueden
utilizarse los anticuerpos para detectar la presencia de cualquier
péptido que comparta uno o más determinantes antigénicos con un
polipéptido PRO320.
El objetivo de un diseño razonable de fármacos
es producir análogos estructurales de un polipéptido biológicamente
activo de interés (es decir, un polipéptido PRO320) o de moléculas
de bajo peso molecular con las que éstos interactúan, por ejemplo,
agonistas, antagonistas, o inhibidores. Puede utilizarse cualquiera
de estos ejemplos para crear fármacos que son formas más activas o
estables del polipéptido PRO320 o que potencian la función del
polipéptido PRO320 in vivo, o interfieren en la misma (c.f.,
Hodgson, Bio/Technology, 9: 19-21
(1991)).
En un procedimiento, la estructura
tridimensional del PRO320, o de un complejo inhibidor del
polipéptido PRO320, se determina mediante cristalografía de rayos x,
mediante modelado informatizado o, más habitualmente, mediante una
combinación de ambos procedimientos. Deben determinarse tanto la
forma como las cargas del polipéptido PRO320 para explicar la
estructura y determinar el sitio o sitios activos de la molécula.
Con menor frecuencia, puede obtenerse información útil sobre la
estructura del polipéptido PRO320 mediante modelado basado en la
estructura de proteínas homólogas. En ambos casos, la información
estructural relevante se utiliza para diseñar moléculas análogas
parecidas al polipéptido PRO320 o para identificar inhibidores
eficaces. Entre los ejemplos útiles de diseño razonable de fármacos
se incluyen moléculas que tienen una mejor actividad o estabilidad,
tal como demostraron Braxton y Wells, Biochemistry,
31: 7.796-7.801 (1992), o que actúan como
inhibidores, agonistas, o antagonistas de péptidos naturales tal
como demostraron Athauda y otros, J. Biochem., 113:
742-746 (1993).
También puede aislarse un anticuerpo específico
de una diana, seleccionado mediante análisis funcional, tal como se
ha descrito anteriormente, y a continuación resolver su estructura
cristalina. Este procedimiento, en principio, proporciona un
"pharmacore" sobre el cual puede basarse el posterior diseño de
fármacos. Es posible prescindir por completo de la cristalografía de
proteínas mediante la generación de anticuerpos antiidiotípicos
contra un anticuerpo funcional, farmacológicamente activo. Como una
imagen especular de una imagen especular, se esperaría que el sitio
de unión de los anticuerpos antiidiotípicos fuera un análogo del
receptor original. Entonces podría utilizarse el anticuerpo
antiidiotípico para identificar y aislar péptidos de bancos de
péptidos producidos química o biológicamente. Los péptidos aislados
actuarían entonces como el "pharmacore".
En virtud de la presente invención, pueden
ponerse a disposición cantidades suficientes del polipéptido PRO320
para realizar tales estudios analíticos como cristalografía de rayos
X. Además, el conocimiento de la secuencia de aminoácidos del
polipéptido PRO320 proporcionado en la presente orientará a quienes
utilizan técnicas de modelado mediante ordenador en lugar, o además,
de la cristalografía de rayos X.
La actividad antiproliferativa de los
polipéptidos PRO320 se determinó en el análisis experimental de
identificación de fármacos anticancerosos in vitro orientado
a la enfermedad del National Cancer Institute (NCI), utilizando un
análisis de unión basado en tinción de sulforhodamina B (SRB),
esencialmente tal como describieron Skehan y otros, J. Natl.
Cancer Inst., 82: 1.107-1.112 (1990). Las
60 líneas celulares de tumores utilizadas en este estudio ("el
panel NCI"), así como las condiciones para su mantenimiento y
cultivo in vitro han sido descritas por Monks y otros, J.
Natl. Cancer Inst., 83: 757-766 (1991).
El objetivo de este análisis es evaluar inicialmente la actividad
citotóxica y/o citostática de los compuestos de prueba contra
distintos tipos de tumores (Monks y otros, supra: Boyd,
Cancer: Princ. Pract. Oncol. Update, 3(10):
1-12 [1989]).
Se recogieron con tripsina/EDTA (Gibco) células
de aproximadamente 60 líneas celulares de tumores humanos, se
lavaron una vez, se resuspendieron en IMEM y se determinó su
viabilidad. Las suspensiones celulares se añadieron mediante pipeta
(volumen de 100 \mul) a distintas placas de microtitulación de 96
pocillos. La densidad celular a los 6 días de incubación fue menor
que a los 2 días de incubación para evitar el sobrecrecimiento. Los
cultivos se dejaron durante un período de preincubación de 24 horas
a 37ºC para su estabilización. Las diluciones dos veces superiores a
la concentración de prueba pretendida se añadieron en el tiempo cero
en partes iguales de 100 \mul a los pocillos de la placa de
microtitulación (dilución 1:2). Estos compuestos fueron evaluados en
cinco diluciones semilogarítimicas (de 1.000 a 100.000 veces). Los
períodos de incubación fueron de dos días y de seis días en una
atmósfera de CO_{2} al 5% y una humedad del 100%.
Tras la incubación, se eliminó el medio y se
fijaron las células en 0,1 ml de ácido tricloroacético al 10% a
40ºC. Las placas se lavaron cinco veces con agua desionizada, se
secaron, se tiñeron durante 30 minutos con 0,1 ml de tinción de
sulforhodamina B al 0,4% (Sigma) disuelta en ácido acético al 1%, se
lavaron cuatro veces con ácido acético al 1% para eliminar el
colorante no unido, se secaron y a los cinco minutos se extrajo el
colorante con 0,1 ml de Tris base [tris (hidroximetilo) aminometano]
10 mM, pH 10,5. La absorbancia (OD) de la sulforhodamina B a 492 nm
se midió utilizando un lector de interfaz informática de placas de
microtitulación de 96 pocillos.
Se considera que una muestra de prueba es
positiva si muestra por lo menos un efecto inhibidor del crecimiento
del 40% a una o más concentraciones. Los resultados se representan
en la siguiente tabla 4 donde las abreviaciones del tipo de célula
tumoral son las siguientes:
NSCL = carcinoma de pulmón no microcítico; SNC =
sistema nervioso central
\vskip1.000000\baselineskip
Los siguientes materiales han sido depositados
junto con la American Type Culture Collection, 10801 Universit
Blvd., Manassas, VA 20110-2209, USA (ATCC):
| Material | N.º dep. ATCC | Fecha de presentación |
| ADN32284-1307 | 209670 | 11 de marzo de 1998 |
Este depósito se llevó a cabo bajo las
provisiones del Tratado de Budapest sobre el Reconocimiento
Internacional del Depósito de Microorganismos a los fines del
Procedimiento en Materia de Patentes y sus regulaciones (Tratado de
Budapest). Esto garantiza el mantenimiento de un cultivo viable del
depósito durante 30 años a partir de la fecha de depósito. Los
depósitos serán puestos a disposición por la ATCC bajo los términos
del Tratado de Budapest, y estarán sujetos a un acuerdo entre
Genentech, Inc.. y ATCC, que garantizan la disponibilidad pública
permanente e ilimitada de la descendencia del cultivo del depósito
desde la publicación de la patente de EE.UU. pertinente o desde la
presentación pública de cualquier solicitud de patente de EE.UU. o
del extranjero, la que llegue primero, y garantiza la disponibilidad
de la descendencia a uno determinado por el Comisionado de Patentes
y Marcas Registradas de EE.UU. a ser autorizado a eso de acuerdo con
35 U.S.C. \NAK 122 y las reglas del Comisionado conforme a eso
(incluida 37 CFR \NAK 1.14 con particular referencia a 886 OG
638).
El cesionario de la presente solicitud de
patente ha acordado que si un cultivo de materiales en depósito
muriera o se perdiera o destruyera habiendo sido cultivado en
condiciones adecuadas, los materiales serán remplazados de inmediato
tras notificación por otros de iguales. La disponibilidad del
material depositado no tiene que entenderse como una autorización
para poner en práctica la invención en contravención de los derechos
otorgados bajo la autoridad de cualquier gobierno de acuerdo con sus
leyes en materia de patentes.
La anterior memoria escrita se considera
suficiente para permitir a un experto en la materia poner en
práctica la invención. El alcance de la presente invención no se ve
limitado por la construcción presentada, ya que la realización
presentada se considera una simple ilustración de algunos aspectos
de la invención y otras construcciones que son funcionalmente
equivalentes se hallan dentro del alcance de esta invención tal como
se define en las reivindicaciones. La presentación de material de la
presente no es una aceptación de que la descripción escrita
contenida en la presente sea inadecuada para permitir la práctica de
cualquier aspecto de la invención, incluida la mejor manera de la
misma, ni pretende su construcción limitar el alcance de las
reivindicaciones a las ilustraciones específicas que representa. En
realidad, son varias las modificaciones que además de las
representadas y descritas en la presente serán claras para los
expertos en la materia a partir de la descripción precedente y que
se hallan dentro del alcance de las reivindicaciones anexas.
<110> Genentech, Inc.
\vskip0.400000\baselineskip
<120> PROCEDIMIENTOS y COMPUESTOS PARA LA
INHIBICIÓN DEL CRECIMIENTO DE CÉLULAS NEOPLÁSICAS
\vskip0.400000\baselineskip
<130> P2834RIPCT
\vskip0.400000\baselineskip
<140> EP04007617.6
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
1999-12-02
\vskip0.400000\baselineskip
<150> EP99960644.5
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1999-12-02
\vskip0.400000\baselineskip
<150> PCT/US99/28565
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1999-12-02
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/113.296
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1998-12-22
\vskip0.400000\baselineskip
<150> PCT/US99/05028
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1999-03-08
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/130.232
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1999-04-21
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/131.445
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1999-04-28
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/134.287
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1999-05-14
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/144.758
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1999-07-20
\vskip0.400000\baselineskip
<150> US 60/145.698
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1999-07-26
\vskip0.400000\baselineskip
<150> PCT/US99/21090
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1999-09-15
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Claims (15)
1. Uso de un agente para la preparación de un
medicamento para el tratamiento de un tumor en un mamífero, en el
que el agente es un polipéptido que tiene por lo menos un 80% de
identidad de la secuencia de aminoácidos respecto de la longitud
total de:
(i) la secuencia de aminoácidos de residuos 1 o
X a 338 que aparecen en la figura 2 (SEC ID N.º: 2), en la que X es
cualquier residuo aminoácido del 17 al 26, o
(ii) un fragmento de la secuencia de aminoácidos
que aparece en la figura 6, en el que el polipéptido tiene por lo
menos una longitud de 10 aminoácidos y tiene actividad
antiproliferativa in vitro contra las células del tumor.
2. Uso según la reivindicación 1, en la que el
tumor es un cáncer.
3. Uso según la reivindicación 2, en el que el
cáncer se selecciona del grupo que consiste en cáncer de mama,
cáncer de ovarios, cáncer renal, cáncer colorrectal, cáncer uterino,
cáncer de próstata, cáncer de pulmón, cáncer de vejiga urinaria,
cáncer del sistema nervioso central, melanoma y leucemia.
4. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
anteriores, en el que el grado de identidad es de por lo menos un
90%.
5. Uso según la reivindicación 4, en el que el
grado de identidad es de por lo menos un 95%.
6. Uso según la reivindicación 5, en el que el
polipéptido tiene la secuencia de aminoácidos de los residuos 1 o X
a 338 que se muestra en la figura 2 (SEC ID N.º: 2), en el que X es
cualquier residuo aminoácido de 17 a 26.
7. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
anteriores, en el que X es 22.
8. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
1-5 y 7, en el que el polipéptido tiene una longitud
de por lo menos 50 aminoácidos.
9. Uso según la reivindicación 8, en el que el
polipéptido tiene una longitud de por lo menos 100 aminoácidos.
10. Uso según la reivindicación 8, en el que el
polipéptido tiene una longitud de por lo menos 150 aminoácidos.
11. Uso según la reivindicación 8, en el que el
polipéptido tiene una longitud de por lo menos 200 aminoácidos.
12. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
anteriores, en el que el medicamento comprende además otro agente
inhibidor del crecimiento, un agente citotóxico o un agente
quimioterapéutico.
13. Uso según cualquiera de las reivindicaciones
anteriores, en el que el mamífero es un ser humano.
14. Procedimiento in vitro para inhibir
el crecimiento de una célula tumoral, el procedimiento comprende
exponer dicha célula tumoral a una cantidad eficaz de un agente tal
como se ha definido en cualquier otra de las reivindicaciones 1 a
11.
15. Procedimiento de la reivindicación 14, en el
que el tumor es tal como se define en la reivindicación 2 o en la
reivindicación 3.
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