ES2245456T3

ES2245456T3 - Redireccion de la inmunidad celular por quimeras de receptores.

Info

Publication number: ES2245456T3
Application number: ES96904498T
Authority: ES
Inventors: Brian Seed; Charles Romeo; Waldemar Kolanus
Original assignee: General Hospital Corp
Current assignee: General Hospital Corp
Priority date: 1995-02-24
Filing date: 1996-01-25
Publication date: 2006-01-01
Anticipated expiration: 2016-01-25
Also published as: NO973864D0; NZ337002A; FI119757B; EP0871495A4; JP4170390B2; PT871495E; KR100490099B1; DK0871495T3; FI973437A0; FI973437L; CZ259997A3; ATE297986T1; WO1996025953A1; AU708339B2; ZA961477B; NO973864L; KR19980702450A; NZ302513A; DE69634855D1; AU4858896A

Abstract

SE DESCRIBE UN PROCEDIMIENTO PARA DIRIGIR UNA RESPUESTA CELULAR EN UN MAMIFERO MEDIANTE LA EXPRESION EN UNA CELULA DEL MAMIFERO DE AL MENOS DOS RECEPTORES QUIMERICOS QUE ACTIVAN EL RECONOCIMIENTO Y LA DESTRUCCION ESPECIFICOS DE UNA AGENTE INFECCIOSO, UNA CELULA INFECTADA CON UN AGENTE INFECCIOSO, UNA CELULA TUMORAL O CANCEROSA, O UNA CELULA DE GENERACION AUTOINMUNE. UNO DE LOS RECEPTORES QUIMERICOS EXPRESADOS INCLUYE UNA PORCION EXTRACELULAR QUE ES CAPAZ DE RECONOCER Y UNIRSE DE FORMA ESPECIFICA A LA CELULA DIANA O AL AGENTE INFECCIOSO DIANA, Y UNA PORCION INTRACELULAR O TRANSMEMBRANA QUE ES CAPAZ DE PRODUCIR UNA SEÑAL EN LA CELULA TERAPEUTICA PARA QUE DESTRUYA UNA CELULA DIANA UNIDA AL RECEPTOR O UN AGENTE INFECCIOSO DIANA UNIDO AL RECEPTOR; Y EL SEGUNDO RECEPTOR QUIMERICO INCLUYE UNA PORCION EXTRACELULAR QUE ES CAPAZ DE RECONOCER Y UNIRSE DE FORMA ESPECIFICA A LA CELULA DIANA O AL AGENTE INFECCIOSO DIANA, Y UNA PORCION INTRACELULAR QUE SE DERIVA DE CD28. TAMBIEN SE DESCRIBEN PARES DE RECEPTORES QUIMERICOS UTILES, CELULAS QUE EXPRESAN LOS RECEPTORES QUIMERICOS, Y ADN QUE CODIFICA LOS RECEPTORES QUIMERICOS.

Description

Redirección de la inmunidad celular por quimeras de receptores.

Campo de la invención

La invención se refiere a quimeras funcionales de receptor de las células T, receptor Fc, o receptor de las células B que son capaces de redireccionar la función del sistema inmunitario. Más particularmente, se refiere a la regulación de linfocitos, macrófagos, células agresoras naturales o granulocitos por la expresión en dichas células de quimeras que hacen que las células respondan a dianas reconocidas por las quimeras. La invención se refiere también a quimeras funcionales de receptor de las células T, receptor Fc, o receptor de las células B que son capaces de dirigir células terapéuticas para reconocer y destruir específicamente, sea células infectadas con un agente infeccioso específico, el agente infeccioso propiamente dicho, una célula tumoral, o una célula generada por autoinmunidad. Más particularmente, la invención se refiere a la producción de quimeras del receptor de las células T o receptor Fc capaces de dirigir linfocitos T citotóxicos para reconocer y lisar específicamente células que expresan proteínas de la envoltura de HIV. Por consiguiente, la invención proporciona un método para fabricar un medicamento para la terapia de enfermedades tales como el SIDA (Síndrome de Inmunodeficiencia Adquirida) que son causadas por el virus HIV.

Antecedentes de la invención

El reconocimiento de antígenos por las células T a través del receptor de las células T constituye la base de una serie de fenómenos inmunológicos. Las células T dirigen lo que se denomina inmunidad mediada por las células. Esto implica la destrucción por las células del sistema inmunitario de tejidos extraños o células infectadas. Existen una diversidad de células T, que incluyen células "adyuvantes" y "supresoras", que modulan la respuesta inmunitaria, y células citotóxicas (o "agresoras"), que pueden destruir directamente las células anormales.

Una célula T que reconoce y fija un antígeno singular presentado en la superficie de otra célula queda activada. La misma puede multiplicarse luego y, si es una célula citotóxica, puede destruir la célula fijada.

Una enfermedad autoinmunológica se caracteriza por producción de anticuerpos que reaccionan con el tejido hospedador o células T inmunitarias efectoras que son autorreactivas. En algunos casos, pueden generarse autoanticuerpos por una respuesta normal de las células T y B activada por sustancias u organismos extraños que contienen antígenos que reaccionan cruzadamente con compuestos similares existentes en los tejidos corporales. Ejemplos de autoanticuerpos clínicamente importantes son anticuerpos contra los receptores de acetilcolina en la miastenia grave; y anticuerpos anti-DNA, anti-eritrocitos, y anti-plaquetas en el lupus eritematoso sistémico.

HIV e Inmunopatogénesis

En 1984 se demostró que el HIV es el agente etiológico del SIDA. Desde entonces, la definición del SIDA ha sido revisada varias veces en lo referente a los criterios que deberían incluirse en el diagnóstico. Sin embargo, a pesar de la fluctuación en los parámetros de diagnóstico, el denominador común simple del SIDA es la infección con HIV y el desarrollo subsiguiente de síntomas constitucionales persistentes y enfermedades que definen el SIDA tales como infecciones secundarias, neoplasmas, y enfermedad neurológica. Harrison's Principles of Internal Medicine, edición 12ª, McGraw Hill (1991).

El HIV es un retrovirus humano del grupo de los lentivirus. Los cuatro retrovirus humanos reconocidos pertenecen a dos grupos distintos. Los retrovirus linfotrópicos T humanos (o leucemia), HTLV-1 y HTLV-2, y los virus de la inmunodeficiencia humana, HIV-1 y HIV-2. Los primeros son virus transformantes, mientras que los últimos son virus citopáticos.

El HIV-1 ha sido identificado como la causa más común del SIDA en todo el mundo. La homología de secuencia entre HIV-2 y HIV-1 es aproximadamente 40%, estando HIV-2 relacionado más estrechamente con algunos miembros de un grupo de virus de la inmunodeficiencia de los simios (SIV). Véase Curran et al., Science, 329: 1357-1359 (1985); Weiss et al., Nature, 324: 572-575 (1986).

HIV tiene los genes retrovíricos usuales (env, gag, y pol) así como seis genes adicionales implicados en la replicación y otras actividades biológicas del virus. Como se ha expuesto previamente, el denominador común del SIDA es una inmunosupresión profunda, predominantemente de la inmunidad mediada por las células. Esta supresión de la inmunidad conduce a una diversidad de infecciones oportunistas, en particular ciertas infecciones y neoplasmas.

La causa principal del defecto inmunitario en el SIDA, se ha identificado como una deficiencia cuantitativa y cualitativa en el subconjunto de linfocitos derivados del timo (T), la población T4. Este subconjunto de células está definido fenotípicamente por la presencia de la molécula de superficie CD4, que se ha demostrado es el receptor celular para HIV. Dalgleish et al., Nature, 312: 763 (1984). Aunque la célula T4 es el tipo principal de célula infectado con HIV, esencialmente cualquier célula humana que exprese la molécula CD4 en su superficie es susceptible de fijarse a HIV y ser infectada por el mismo.

Tradicionalmente, se ha asignado a las células T CD4^{+} el papel de adyuvante/inductor, lo que indica su función en el aporte de una señal activadora a las células B, o la inducción de los linfocitos T portadores del marcador recíproco CD8 a convertirse en células citotóxicas/supresoras. Reinherz y Schlossman, Cell, 19: 821-827 (1980); Goldstein et al., Immunol. Rev., 68: 5-42, (1982).

El HIV se fija específicamente y con afinidad alta, por la vía de un tramo de aminoácidos en la envoltura vírica (gp120), a una porción de la región V1 de la molécula CD4 localizada cerca de su término N. Después de la fijación, el virus se fusiona con la membrana de la célula diana y se internaliza. Una vez internalizado, utiliza la enzima transcriptasa inversa para transcribir su RNA genómico en DNA, el cual se integra en el DNA celular donde existe durante la vida de la célula como un "provirus".

El provirus puede mantenerse latente o activarse para transcribir mRNA y RNA genómico, conduciendo a la síntesis de proteínas, el ensamblaje, la formación de nuevos viriones, y la gemación de virus desde la superficie celular. Aunque el mecanismo preciso por el cual el virus induce la muerte celular no ha sido establecido, se cree que el mecanismo principal es la gemación masiva vírica desde la superficie celular, que conduce a la ruptura de la membrana plasmática y el desequilibrio osmótico resultante.

Durante el curso de la infección, el organismo hospedador desarrolla anticuerpos contra las proteínas víricas, que incluyen las glicoproteínas principales de la envoltura gp120 y gp41. A pesar de esta inmunidad humoral, la enfermedad progresa, dando como resultado una inmunosupresión letal caracterizada por infecciones oportunistas múltiples, parasitemia, demencia y muerte. El fallo de los anticuerpos antivíricos del hospedador para detener la progresión de la enfermedad representa uno de los aspectos más molestos y alarmantes de la infección, y augura un mal pronóstico para los esfuerzos de vacunación basados en enfoques convencionales.

Dos factores pueden desempeñar un papel en la eficacia de la respuesta humoral a los virus de la inmunodeficiencia. En primer lugar, análogamente a otros virus de RNA (y retrovirus afines en particular), los virus de la inmunodeficiencia exhiben una elevada tasa de mutación en respuesta a la vigilancia del sistema inmunitario del hospedador. En segundo lugar, las glicoproteínas de la envoltura propiamente dichas son moléculas fuertemente glicosiladas que presentan pocos epítopes adecuados para la fijación de anticuerpos de afinidad alta. La diana deficientemente antigénica que presenta la envoltura vírica, proporciona al hospedador poca oportunidad para restringir la infección vírica por producción de anticuerpos específicos.

Las células infectadas por el virus HIV expresan la glicoproteína gp120 en su superficie. Gp120 media sucesos de fusión entre células CD4^{+} por vía de una reacción similar a aquélla por la cual el virus entra en las células no infectadas, conduciendo a la formación de células gigantes multinucleadas de vida corta. La formación de sincitios depende una interacción directa de la glicoproteína gp120 de la envoltura con la proteína CD4. Dalgleish et al., supra; Klatzman, D. et al., Nature, 312: 763 (1984); McDougal et al., Science, 231: 382 (1986); Sodroski et al., Nature, 322: 470 (1986); Lifson et al., Nature, 323: 725 (1986); Sodroski et al., Nature, 321: 412 (1986).

La evidencia de que la fijación CD4-gp120 es responsable de la infección vírica de las células portadoras del antígeno CD4 incluye el descubrimiento de que se forma un complejo específico entre gp120 y CD4 (McDougal et al., supra). Otros investigadores han demostrado que las líneas de células, que eran no infecciosas para HIV, se convertían en líneas de células infectables después de la transfección y expresión del gen de cDNA humano CD4. Maddon et al., Cell, 46: 333-348 (1986).

Programas terapéuticos basados en CD4 soluble como agente pasivo para interferir con la adsorción vírica y la transmisión celular mediada por sincitios han sido propuestos y demostrados con éxito in vitro por varios grupos (Deen et al., Nature, 331: 82-84 (1988); Fisher et al., Nature, 331: 76-78 (1988); Hussey et al., Nature, 331: 78-81 (1988); Smith et al., Science, 238: 1704-1707 (1987); Traunecker et al., Nature, 331: 84-86 (1988)); y proteínas de fusión CD4-inmunoglobulina con semividas prolongadas y actividad biológica moderada han sido desarrolladas subsiguientemente (Capon et al., Nature, 337: 525-531 (1989); Traunecker et al., Nature, 339, 68-70 (1989); Byrn et al., Nature, 344: 667-670 (1990); Zettlmeissel et al., DNA Cell Biol. 9: 347-353 (1990)). Aunque los conjugados o proteínas de fusión CD4-inmunotoxina exhiben una citotoxicidad potente para las células infectadas in vitro (Chaudhary et al., Nature, 335: 369-372 (1988); Till et al., Science, 242: 1166-1168 (1988)), la latencia del síndrome de inmunodeficiencia hace improbable que cualquier terapia de tratamiento simple sea eficaz en la eliminación de la carga vírica, y es probable que la antigenicidad de las proteínas de fusión extrañas limite su aceptabilidad en tratamientos que requieran dosificación repetitiva. Pruebas realizadas con monos afectados con SIV han demostrado que la CD4 soluble, si se administra a animales sin citopenia CD4 acusada, puede reducir el título de SIV y mejorar las medidas de potencial mieloide in vitro (Watanabe et al., Nature, 337: 267-270 (1989)). Sin embargo, se observó una reemergencia vírica rápida después de la interrupción del tratamiento, lo que sugiere que podría ser necesaria la administración a lo largo de toda la vida para prevenir la debilitación progresiva del sistema inmunitario.

Receptores de las Células T y Receptores Fc

La expresión en la superficie celular de la forma más abundante del receptor del antígeno de las células T (TCR) requiere la coexpresión de al menos 6 cadenas polipeptídicas distintas (Weiss et al., J. Exp. Med., 160: 1284-1299 (1984); Orloffhashi et al., Nature, 316: 606-609 (1985); Berkhout et al., J. Biol. Chem., 263: 8528-8536 (1988); Sussman et al., Cell, 52: 85-95 (1988)), las cadenas de fijación de antígeno \alpha/\beta, los tres polipéptidos del complejo CD3, y \zeta. Si está ausente alguna de las cadenas, no se produce la expresión estable de los miembros restantes del complejo. \zeta es el polipéptido limitante para la expresión en la superficie del complejo entero (Sussman et al., Cell, 52: 85-95 (1988)) y se cree que media al menos una fracción de los programas de activación celular desencadenados por el reconocimiento de ligando por el receptor (Weissman et al., EMBO J., 8: 3651-3656 (1989); Frank et al., Science, 249: 174-177 (1990)). Un homodímero integral de membrana de 32 kDa tipo I, \zeta (zeta) tiene un dominio extracelular de 9 residuos que no posee sitio alguno para la adición de glicanos unidos a N, y un dominio intracelular de 112 residuos (ratón) o 113 residuos (humano) (Weissman et al., Science, 238: 1018-1020 (1988); Weissman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 9709-9713 (1988)). Una isoforma de \zeta denominada \eta (eta) (Baniyash et al., J. Biol. Chem., 263: 9874-9878 (1988); Orloff et al., J. Biol. Chem., 264: 14812-14817 (1989)), que procede de un camino alternativo de corte y empalme de mRNA (Jin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 3319-3233 (1990)), está presente en cantidades reducidas en células que expresan el receptor antigénico. Se cree que heterodímeros \zeta-\eta median la formación de fosfatos de inositol, así como la muerte celular programada iniciada por receptores denominada apoptosis (Mercep et al., Science, 242: 571-574 (1988); Mercep et al., Science, 246: 1162-1165 (1989)).

Al igual que \zeta y \eta, la cadena \gamma (gamma) asociada al receptor Fc se expresa en complejos de la superficie celular con polipéptidos adicionales, algunos de los cuales median el reconocimiento de ligandos, teniendo otros de ellos función no definida. \gamma soporta una estructura homodímera y organización global muy similar a la de \zeta, y es un componente a la vez del receptor IgE de alta afinidad de mastocitos/basófilos, Fc\varepsilonRI, que está constituido por al menos tres cadenas polipeptídicas distintas (Blank et al., Nature, 337: 187-189 (1989); Ra et al., Nature, 241: 752-754 (1989)), y de uno de los receptores de baja afinidad para IgG, representado en los ratones por Fc\gammaRII\alpha (Ra et al., J. Biol. Chem., 264: 15323-15327 (1989)), y en los humanos por la expresión del subtipo CD16 por la expresión los macrófagos y las células agresoras naturales, CD16_{TM} (CD16 transmembranal) (Lanier et al., Nature, 342: 803-805 (1989); Anderson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 2274-2278 (1990)) y con un polipéptido de función no identificada (Anderson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 2274-2278 (1990)). Recientemente se ha comunicado que \gamma es expresado por una línea de células T de ratón, CTL, en la cual aquél forma homodímeros así como heterodímeros \gamma-\zeta y \gamma-\eta (Orloff et al., Nature, 347: 189-191 (1990)).

Los receptores Fc median la fagocitosis de complejos inmunitarios, transcitosis, y citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) (Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9: 457-492 (1991); Unkeless et al., Annu. Rev. Immunol. 6: 251-281 (1988); y Mellman, Curr. Opin. Immunol. 1: 16-25 (1988)). Se ha demostrado recientemente que una de las isoformas del receptor Fc murino de baja afinidad, FcR\gammaIIIB1, media la internalización de dianas revestidas con Ig en cavidades revestidas de clatrina, y que otro receptor de baja afinidad, FcR\gammaIIIa, media la ADCC por su asociación con uno o más miembros de una pequeña familia de "moléculas desencadenantes" (Miettinen et al., Cell 58: 317-327 (1989); y Hunziker y Mellman, J. Cell Biol. 109: 3291-3302 (1989)). Estas moléculas desencadenantes, cadena \zeta del receptor de las células T (TCR), cadena \eta de TCR, y cadena \gamma del receptor Fc, interaccionan con dominios de reconocimiento de ligandos de receptores diferentes del sistema inmunitario y pueden iniciar de manera autónoma programas celulares efectores, que incluyen citólisis, después de la agregación (Samelson et al., Cell 43: 223-231 (1985); Weissman et al., Science 239: 1018-1020 (1988); Jin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 3319-3323 (1990); Blank et al., Nature 337: 187-189 (1989); Lanier et al., Nature 342: 803-805 (1989); Kurosaki y Ravetch, Nature 342: 805-807 (1989); Hibbs et al., Science 246: 1608-1611 (1989); Anderson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2274-2278 (1990); e Irving y Weiss, Cell 64: 891-901 (1991)).

Sin embargo, al establecer paralelos entre las familias del receptor Fc de baja afinidad murino y humano, ha quedado claro que las isoformas FcR\gammaIIA y C humanas no tienen ningún homólogo murino. Debido en parte a esto, su función está todavía por definir.

Dado que los agentes humorales basados en CD4 pueden tener utilidad limitada in vivo, en un trabajo previo se exploró la posibilidad de aumentar la inmunidad celular para HIV. Han sido identificadas preparaciones de quimeras proteínicas en las cuales el dominio extracelular de CD4 está fusionado a los dominios transmembranales y/o intracelulares de elementos transductores de señales del receptor de las células T, receptor Fc de IgG, o receptor de las células B (documentos U.S.S.N. 07/847.566 y 07/665.961, que se incorporan por la presente como referencia. Células T citolíticas que expresan quimeras que incluyen un dominio CD4 extracelular exhiben una destrucción potente, independiente del MHC, de dianas celulares que expresan proteínas de la envoltura de HIV. Un componente extremadamente importante y nuevo de este enfoque ha sido la identificación de cadenas simples del receptor de las células T, del receptor Fc, y del receptor de las células B cuya agregación es suficiente para iniciar la respuesta celular.

Una aplicación particularmente útil de este enfoque ha sido la invención de quimeras entre CD4 y \zeta, \eta o \gamma que dirigen los linfocitos T citolíticos para reconocer y destruir las células que expresan gp120 de HIV (documentos U.S.S.N. 07/847.566 y 07/665.961, que se incorporan por la presente como referencia.

Sumario de la invención

Aunque los receptores nativos de células T, células B, y Fc son o pueden ser estructuras multímeras muy complicadas que no se prestan en sí mismas a manipulación cómoda, la presente invención demuestra la factibilidad de la creación de quimeras entre el dominio intracelular de cualquiera de una diversidad de moléculas que son capaces de desempeñar la tarea de reconocimiento de dianas. En particular, la formación de quimeras constituidas por la porción intracelular de las cadenas zeta, eta, o gamma del receptor células T/Fc unida a la porción extracelular de una molécula de anticuerpo diseñada adecuadamente, permite que el potencial de reconocimiento de dianas de una célula del sistema inmunitario se redireccione específicamente hacia el antígeno reconocido por la porción extracelular del anticuerpo. Así, con una porción de anticuerpo capaz de reconocer algún determinante en la superficie de un patógeno, las células del sistema inmunitario armadas con la quimera podrían responder a la presencia del patógeno con el programa efector apropiado para su linaje, v.g. los linfocitos T adyuvantes podrían responder por actividad citotóxica contra la diana, y los linfocitos B podrían activarse para sintetizar anticuerpo. Los macrófagos y granulocitos podrían ejecutar sus programas efectores, con inclusión de liberación de citoquinas, fagocitosis, y generación de oxígeno reactivo. Análogamente, con una porción de anticuerpo capaz de reconocer células tumorales, la respuesta del sistema inmunitario al tumor podría aumentar ventajosamente. Con un anticuerpo capaz de reconocer células inmunitarias que tengan una reactividad inadecuada con determinantes propios, las células autorreactivas podrían marcarse selectivamente como dianas a destruir.

Aunque estos ejemplos recurren al uso de quimeras de anticuerpos como herramienta expositiva conveniente, la invención no está limitada en su alcance a quimeras de anticuerpos, y de hecho, el uso de dominios extracelulares específicos que no son anticuerpos puede presentar ventajas importantes. Por ejemplo, con una porción extracelular que es el receptor de un virus, bacteria, o parásito, las células armadas con las quimeras podrían direccionarse específicamente a células diana que expresen los determinantes víricos, bacterianos o parasitarios. La ventaja de este enfoque sobre el uso de anticuerpos es que el receptor nativo para un patógeno puede tener selectividad o afinidad singularmente alta para el patógeno, permitiendo un mayor grado de precisión en la respuesta inmunitaria resultante. Análogamente, para delecionar células del sistema inmunitario que reaccionan inadecuadamente con un antígeno propio, puede ser suficiente unir el antígeno (sea como una proteína intacta, en el caso de terapias de empobrecimiento de células B, o como complejo MHC, en el caso de terapias de agotamiento de células T) a cadenas zeta, eta o gamma intracelulares, y afectar de este modo al direccionamiento específico de las células que responden inadecuadamente a los determinantes propios.

Otro uso de las quimeras es el control de poblaciones de células in vivo subsiguiente a otras formas de ingeniería genética. Por ejemplo, ha sido propuesto el uso de linfocitos infiltrantes de tumores o células agresoras naturales para transportar principios citotóxicos al sitio de tumores. La presente invención proporciona un medio conveniente para regular los números y la actividad de tales linfocitos y células sin retirar los mismos del cuerpo del paciente para multiplicación in vitro. Así, dado que los dominios intracelulares de los receptores quiméricos median las respuestas proliferativas de las células, la coordinación de los dominios extracelulares por una diversidad de estímulos de agregación específicos para los dominios extracelulares (v.g., un anticuerpo específico para el dominio extracelular) dará como resultado la proliferación de las células portadoras de las quimeras.

Aunque las realizaciones específicas de la presente invención comprenden quimeras entre cadenas zeta, eta o gamma, o fragmentos activos de las mismas (v.g., los expuestos más adelante), cualquier cadena receptora que tenga una función similar a estas moléculas, v.g., en granulocitos o linfocitos B, podría utilizarse para los propósitos expuestos en esta memoria. Las características distintivas de las moléculas desencadenantes deseables de células inmunitarias comprenden la capacidad para expresarse autónomamente (es decir, como una cadena simple), la capacidad para fusionarse a un dominio extracelular tal que la quimera resultante esté presente en la superficie de una célula terapéutica, y la capacidad para iniciar programas celulares efectores después de agregación secundaria para enfrentarse con un ligando diana.

En la actualidad, el método más conveniente para suministro de las quimeras a las células del sistema inmunitario es por alguna forma de terapia genética. Sin embargo, la reconstitución de células del sistema inmunitario con receptores quiméricos por mezcla de las células con proteína quimérica purificada adecuadamente solubilizada podría dar también como resultado la formación de una población diseñada de células capaces de responder a las dianas reconocidas por el dominio extracelular de las quimeras. Enfoques similares han sido utilizados, por ejemplo, para introducir el receptor de HIV intacto, CD4, en eritrocitos para fines terapéuticos. En este caso, la población de células diseñadas no sería capaz de auto-renovación.

La invención concierne a un método para fabricar un medicamento para la aplicación terapéutica en una infección, una enfermedad tumoral o una enfermedad autoinmunológica, caracterizado porque se generan células terapéuticas que expresan al menos dos receptores quiméricos proteináceos unidos a la membrana

comprendiendo uno de dichos receptores (a) una porción extracelular que es capaz de reconocer y fijar específicamente una célula diana o un agente infeccioso de la diana y (b) una porción intracelular o transmembranal que es capaz de señalizar dicha célula terapéutica para destruir una célula diana fijada a un receptor o un agente infeccioso diana fijado a un receptor; en donde dicha porción intracelular o transmembranal se deriva de una proteína receptora de las células T \xi, \eta, CD3 delta, o proteína T3 gamma; una proteína \gamma del receptor Fc; o una proteína mb1 o B29 del receptor de las células B, o un derivado funcional de las mismas;

y

comprendiendo el segundo de dichos receptores (a) una porción extracelular que es capaz de reconocer y fijar específicamente dicha célula diana o dicho agente infeccioso diana y (b) una porción intracelular que se deriva de CD28.

La invención concierne a una célula que expresa al menos dos receptores quiméricos proteináceos fijados a la membrana, comprendiendo uno de dichos receptores (a) una porción extracelular en la cual dicha porción intracelular o transmembranal es la porción de transducción de señales celulares de una proteína receptora de las células T, una proteína receptora de las células B, o una proteína del receptor Fc, o un derivado funcional de la misma; y comprendiendo el segundo de dichos receptores (a) una porción extracelular, en donde dicha porción extracelular de los receptores primero y segundo comprende una porción de fijación de la envoltura de HIV de CD4, o un derivado funcional de fijación de la envoltura de HIV del mismo; y (b) una porción intracelular que se deriva de CD28.

La invención concierne adicionalmente a una célula que expresa al menos dos receptores quiméricos proteináceos fijados a membrana, comprendiendo uno de dichos receptores (a) una porción extracelular; y (b) una porción intracelular o transmembranal derivada de un polipéptido del receptor CD3, zeta, o eta de las células T, un receptor de las células B, o un receptor Fc; y

comprendiendo el segundo de dichos receptores (a) una porción extracelular, en donde dicha porción extracelular de los receptores primero y segundo comprende una porción de fijación de la envoltura de HIV de CD4, o un derivado funcional de fijación de la envoltura de HIV de la misma, y (b) una porción intracelular que se deriva de CD28.

La invención concierne adicionalmente a un par de receptores quiméricos proteináceos fijados a la membrana, comprendiendo uno de dichos receptores (a) una porción extracelular y (b) una porción intracelular o transmembranal, en donde dicha porción intracelular o transmembranal es la porción de transducción de señales de una proteína receptora de las células T, una proteína receptora de las células B, o una proteína del receptor Fc, o un derivado funcional de la misma; y comprendiendo el segundo de dichos receptores (a) una porción intracelular, en donde dichas porciones extracelulares de los receptores primero y segundo comprenden una porción de fijación de la envoltura de HIV de CD4, o un derivado funcional de fijación de la envoltura de HIV de las mismas; y (b) una porción intracelular que se deriva de CD28.

La invención concierne adicionalmente a un par de receptores quiméricos proteináceos fijados a la membrana, comprendiendo uno de dichos receptores (a) una porción extracelular y (b) una porción intracelular o transmembranal derivada de un polipéptido del receptor CD3, zeta o eta de las células T, un receptor de las células B, o un receptor Fc; y

comprendiendo el segundo de dichos receptores (a) una porción extracelular, en donde dichas porciones extracelulares de los receptores primero y segundo comprenden una porción de fijación de la envoltura de HIV de CD4, o un derivado funcional de fijación de la envoltura de HIV de la misma y (b) una porción intracelular que se deriva de CD28.

En otra realización, el método de dirigir la respuesta celular a un agente infeccioso comprende administrar células terapéuticas capaces de reconocer y destruir dicho agente, en donde el agente es un virus, bacteria, protozoo, u hongo específico. Todavía más específicamente, el método está dirigido contra agentes tales como HIV y Pneumocystis carinii.

Específicamente, la invención proporciona un método de dirigir la respuesta celular a una célula infectada por HIV. El método comprende administrar a un paciente una cantidad eficaz de linfocitos T citotóxicos, siendo dichos linfocitos capaces de reconocer y lisar específicamente las células infectadas con HIV así como virus circulante.

Así pues, en una realización, se proporciona de acuerdo con la invención un método para dirigir la respuesta celular a células infectadas por HIV, que comprende administrar a un paciente una cantidad eficaz de linfocitos T citotóxicos que son capaces de reconocer y lisar específicamente las células infectadas con HIV.

En otra realización adicional, se proporcionan las proteínas receptoras quiméricas que dirigen los linfocitos T citotóxicos para reconocer y lisar la célula infectada con HIV. Otra realización adicional de la invención comprende células hospedadoras transformadas con un vector que comprende los receptores quiméricos.

En otra realización adicional, la presente invención proporciona un anticuerpo contra los receptores quiméricos de la invención.

Para obtener linfocitos T citotóxicos que se fijan específicamente a las células infectadas con HIV y lisan las mismas, los autores de la presente invención han intentado por tanto realizar y proporcionan en esta invención quimeras receptoras. Estos receptores quiméricos son funcionalmente activos y poseen la aptitud extraordinaria de fijarse específicamente a las células que expresan gp 120 y lisar las mismas.

Así pues, es un objeto de la presente invención proporcionar un método de fabricación de un medicamento para tratamiento de individuos infectados con HIV. La presente invención proporciona así numerosos avances importantes en la terapia del SIDA.

Estas y otras realizaciones no limitantes de la presente invención serán evidentes para los expertos en la técnica a partir de la descripción detallada siguiente de la invención.

En la descripción detallada que sigue, se hará referencia a diversas metodologías conocidas por los expertos en la técnica de biología molecular e inmunología.

Trabajos de referencia estándar que exponen los principios generales de la tecnología del DNA recombinante incluyen Watson et al., Molecular Biology of the Gene, Volúmenes I y II, The Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc., editor, Menlo Park, CA (1987); Darnell, Molecular Cell Biology, Scientific American Books, Inc., editor, Nueva York, N.Y. (1986); Lewin, Genes II, John Wiley & Sons, editores, Nueva York, N.Y. (1985); Old et al., Principles of Gene Manipulation: An Introduction to Genetic Engineering, 2ª edición, University of California Press, editor, Berkeley, CA (1981); Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición, Cold Spring Harbor Laboratory, editor, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989); y Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., Wiley Press, Nueva York, N.Y. (1989).

Definiciones

Por "clonación" se entiende el uso de técnicas de recombinación in vitro para insertar un gen particular u otra secuencia de DNA en una molécula vectora. Para clonar con éxito un gen deseado, es necesario emplear métodos para generación de fragmentos de DNA a fin de unir los fragmentos a moléculas vectoras, para introducir la molécula de DNA compuesta en una célula hospedadora en la cual pueda replicarse, y para seleccionar el clon que tiene el gen diana de entre las células hospedadoras receptoras.

Por "cDNA" se entiende DNA complementario o DNA copia producido a partir de un molde de RNA por la acción de una DNA-polimerasa dependiente de RNA (transcriptasa inversa). Así, un "clon de cDNA" significa una secuencia de DNA dúplex complementaria a una molécula de RNA de interés, transportada en un vector de clonación.

Por "genoteca de cDNA" se entiende una colección de moléculas de DNA recombinante que contienen inserciones de cDNA que comprenden copias de DNA o mRNA que son expresadas por la célula en el momento en que se constituyó la genoteca de cDNA. Una genoteca de cDNA de este tipo se puede preparar por métodos conocidos por los expertos en la técnica, y descritos, por ejemplo, en Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, supra. Por lo general, el RNA se aísla primeramente de las células de un organismo de cuyo genoma se desea clonar un gen particular. Preferidas para el propósito de la presente invención son líneas de células linfocíticas de mamífero, y particularmente humanas. Un vector actualmente preferido para este propósito es la cepa WR del virus vaccinia.

Por "vector" se entiende una molécula de DNA, derivada, v.g., de un plásmido, bacteriófago, o virus de mamífero o insecto, en la cual se pueden insertar o clonar fragmentos de DNA. Un vector contendrá uno o más sitios de restricción únicos y puede ser capaz de replicación autónoma en un organismo hospedador o vehículo definido de tal modo que la secuencia clonada es reproducible. Así pues, por "vector de expresión de DNA" se entiende cualquier elemento autónomo capaz de dirigir la síntesis de un péptido recombinante. Vectores de expresión de DNA de este tipo incluyen plásmidos y fagos bacterianos y plásmidos y virus de mamífero y de insecto.

Por "sustancialmente puro" se entiende un compuesto, v.g., una proteína, un polipéptido, o un anticuerpo, que está sustancialmente exento de los componentes que lo acompañan naturalmente. Por lo general, un compuesto es sustancialmente puro cuando al menos 60%, más preferiblemente al menos 75%, y muy preferiblemente al menos 90% del material total en una muestra es el compuesto de interés. La pureza puede medirse por cualquier método apropiado, v.g., cromatografía en columna, electroforesis en gel de poliacrilamida, o análisis por HPLC. En el contexto de un ácido nucleico, "sustancialmente puro" significa una secuencia, segmento, o fragmento de ácido nucleico que no es inmediatamente contiguo a (es decir, no está enlazado covalentemente a) las dos secuencias codificantes con las cuales está en contigüidad inmediata (es decir, una en el extremo 5' y una en el extremo 3') en el genoma existente naturalmente del organismo del que se deriva el DNA de la invención.

Por "derivado funcional" se entienden los "fragmentos", "variantes", "análogos", o "derivados químicos" de una molécula. Debe entenderse que un "fragmento" de una molécula, tal como cualquiera de las secuencias de cDNA de la presente invención, hace referencia a cualquier subconjunto nucleotídico de la molécula. Se entenderá que una "variante" de una molécula de este tipo hace referencia a una molécula existente naturalmente que es similar en esencia a la molécula entera, o a un fragmento de la misma. Se entenderá que un "análogo" de una molécula hace referencia a una molécula no natural sustancialmente similar a la molécula entera o un fragmento de la misma. Se dice que un molécula es "sustancialmente similar" a otra molécula si la secuencia de aminoácidos en ambas moléculas es sustancialmente la misma. En particular, una secuencia de aminoácidos "sustancialmente similar" es una que exhibe al menos 50%, preferiblemente 85%, y muy preferiblemente 95% de identidad de secuencia de aminoácidos con la secuencia natural o de referencia y/o una que difiere de la secuencia de aminoácidos natural o de referencia sólo en sustituciones de aminoácidos conservadoras.

Las moléculas de aminoácidos sustancialmente similares poseen una actividad biológica similar. Así pues, con tal que dos moléculas posean una actividad similar, las mismas se consideran variantes tal como se utiliza dicho término en esta memoria aun cuando una de las moléculas contenga residuos adicionales de aminoácidos no encontrados en la otra o menos residuos, o si la secuencia de residuos de aminoácidos no es idéntica. Tal como se utiliza en esta memoria, se dice que una molécula es un "derivado químico" de otra molécula cuando la misma contiene restos químicos adicionales que no forman normalmente parte de la molécula. Restos de este tipo pueden mejorar la solubilidad, absorción, semi-vida biológica etc., de la molécula. Los restos pueden reducir alternativamente la toxicidad de la molécula, eliminar o atenuar cualquier efecto secundario indeseable de la molécula, etc. Restos capaces de mediar efectos de este tipo se describen, por ejemplo, en Remington's Pharmaceutical Sciences, 16^{th} ed., Mac Publishing Co., Easton, PA (1980).

Análogamente, debe entenderse que un "derivado funcional" de un gen receptor quimérico de la presente invención incluye "fragmentos", "variantes", o "análogos" del gen, que pueden ser "sustancialmente similares" en secuencia nucleotídica, y que codifican una molécula que posee actividad similar a, por ejemplo, una quimera del receptor de las células T, células B, o Fc. Ácidos nucleicos "sustancialmente similares" codifican secuencias de aminoácidos sustancialmente similares y pueden incluir también cualquier secuencia de ácido nucleico capaz de hibridarse a la secuencia de ácido nucleico de tipo salvaje en condiciones de hibridación apropiadas (véase, por ejemplo, Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Press, Nueva York, NY (1989) para condiciones de severidad de hibridación apropiadas).

Así, tal como se utiliza en esta memoria, debe entenderse que una proteína quimera del receptor de las células T, células B o Fc incluye también cualesquiera derivados funcionales, fragmentos, variantes, análogos, o derivados químicos que pueden ser sustancialmente similares a la quimera de "tipo salvaje" y que poseen actividad similar (es decir, muy preferiblemente, 90%, más preferiblemente, 70%, preferiblemente 40%, o al menos 10% de la actividad de la quimera del receptor de tipo salvaje). La actividad de un derivado de un receptor quimérico funcional incluye fijación específica (con su porción extracelular) a un agente o célula diana y la destrucción resultante (dirigida por su porción intracelular o transmembranal) de dicho agente o célula; una actividad de este tipo puede ensayarse, v.g., utilizando cualquiera de los ensayos descritos en esta memoria.

Una secuencia de DNA codificante de la quimera del receptor de las células T, células B, o Fc de la presente invención, o sus derivados funcionales, puede recombinarse con DNA vector de acuerdo con técnicas convencionales, con inclusión de términos con extremos romos o con extremos cohesivos para ligación, digestión con enzimas de restricción para proporcionar términos apropiados, rellenado de los extremos cohesivos en caso apropiado, tratamiento con fosfatasa alcalina para evitar uniones indeseables, y ligación con ligasas apropiadas. Métodos para tales manipulaciones han sido descritos por Maniatis, T., et al., supra y son bien conocidos en la técnica.

Se dice que una molécula de ácido nucleico, tal como DNA, es "capaz de expresar" un polipéptido si la misma contiene secuencias nucleotídicas que contienen información reguladora de la transcripción y la traducción, y tales secuencias están "enlazadas operativamente" a secuencias nucleotídicas que codifican el polipéptido. Un enlace operativo es un enlace en el cual las secuencias reguladoras de DNA y la secuencia de DNA que se desea expresar están conectadas de tal manera que permiten la expresión génica. La naturaleza precisa de las regiones reguladoras necesarias para la expresión génica puede variar de un organismo a otro, pero en general incluirá una región promotora que, en los procariotas, contiene tanto el promotor (que dirige la iniciación de la transcripción de RNA) como las secuencias de DNA que, cuando se transcriben en RNA, señalizarán la iniciación de la síntesis de proteínas. Tales regiones incluirán normalmente aquellas secuencias 5' no codificantes implicadas en la iniciación de la transcripción y la traducción, tales como la secuencia TATA, secuencia de protección terminal, secuencia CAAT, y análogas.

Si se desea, la región 3' no codificante para la secuencia génica que codifica la proteína puede obtenerse por los métodos descritos anteriormente. Esta región puede estar retenida por sus secuencias reguladoras de terminación de la transcripción, tales como terminación y poliadenilación. Así, por retención de la región 3' naturalmente contigua a la secuencia de DNA codificante de la proteína, pueden proporcionarse las señales de terminación de la transcripción. En los casos en que las señales de terminación de la transcripción no son satisfactoriamente funcionales en la célula hospedadora de expresión, puede emplearse en su lugar una región funcional 3' en la célula hospedadora.

Dos secuencias de DNA (tales como una secuencia de región promotora y una secuencia codificante de quimera del receptor de las células T, receptor de las células B, o receptor Fc) se dice que están enlazadas operativamente si la naturaleza del enlace entre las dos secuencias de DNA (1) no da como resultado la introducción de una mutación de cambio de marco, (2) no interfiere con la capacidad de la secuencia de la región promotora para dirigir la transcripción de la secuencia del gen quimera del receptor, o (3) no interfiere con la capacidad de la secuencia del gen quimera del receptor para ser transcrito por la secuencia de la región promotora. Una región promotora estaría enlazada operativamente a una secuencia de DNA si el promotor fuese capaz de efectuar la transcripción de dicha secuencia de DNA. Así pues, para expresar la proteína, son necesarias señales de transcripción y traducción reconocidas por un hospedador apropiado.

La presente invención abarca la expresión de una proteína quimera del receptor de las células T, receptor de las células B, o receptor Fc (o un derivado funcional de los mismos), en células procariotas o eucariotas, aunque se prefiere la expresión en eucariotas (y, particularmente, en linfocitos humanos).

Los anticuerpos de acuerdo con la presente invención pueden prepararse por cualquiera de una diversidad de métodos. Por ejemplo, células que expresan la proteína quimera del receptor, o un derivado funcional de la misma, se pueden administrar a un animal con objeto de inducir la producción de sueros que contengan anticuerpos policlonales que son capaces de fijar la quimera.

En un método preferido, los anticuerpos de acuerdo con la presente invención son anticuerpos monoclonales. Dichos anticuerpos monoclonales se pueden preparar utilizando tecnología de hibridoma (Kohler et al., Nature, 256: 495 (1975); Kohler et al., Eur. J. Immunol. 6: 511 (1976); Kohler et al., Eur. J. Immunol. 6: 292 (1976); Hammerling et al., en: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, Elsevier, N.Y., pp. 563-684 (1981)). En general, tales procedimientos implican inmunizar un animal con el antígeno quimera del receptor de las células T, receptor de las células B, o receptor Fc. Los esplenocitos de dichos animales se extraen y se fusionan con una línea adecuada de células de mieloma. De acuerdo con la presente invención puede emplearse cualquier línea de células de mieloma adecuada. Después de la fusión, las células de hibridoma resultantes se mantienen selectivamente en medio HAT, y se someten luego a clonación por dilución limitante como ha sido descrito por Wands et al. (Gastroenterology 80: 225-232 (1981)). Las células de hibridoma obtenidas por una selección de este tipo se ensayan luego para identificar clones que secretan anticuerpos capaces de fijar la quimera.

Los anticuerpos de acuerdo con la presente invención pueden ser también policlonales, o, preferiblemente, anticuerpos policlonales específicos de una región determinada.

Los anticuerpos contra la quimera del receptor de las células T, receptor de las células B, o receptor Fc de acuerdo con la presente invención se pueden utilizar para monitorizar la cantidad de receptor quimérico (o células portadoras del receptor quimérico) en un paciente. Dichos anticuerpos son muy adecuados para uso en ensayos estándar de inmunodiagnóstico conocidos en la técnica, con inclusión de ensayos inmunométricos o "sándwich" tales como los ensayos sándwich directos, sándwich inversos, y sándwich simultáneos. Los anticuerpos se pueden utilizar en cualquier número de combinaciones que pueda ser determinado por los expertos sin experimentación excesiva para efectuar inmunoensayos de especificidad, sensibilidad, y exactitud aceptables.

Trabajos estándar de referencia que exponen principios generales de inmunología incluyen Roitt, Essential Immunology, sexta edición, Blackwell Scientific Publications, editor, Oxford (1988); Kimbal, Introduction to Immunology, segunda edición, MacMillan Publishing Co., editor, Nueva York (1986); Roitt et al., Immunology, Gower Medical Publishing Ltd., editor, Londres (1985); Campbell, "Monoclonal Antibody Technology", en Burdon et al., compiladores, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Volumen 13, Elsevier, editor, Amsterdam (1984); Klein, Immunology: The Science of Self-Nonself Discrimination, John Wiley & Sons, editor, Nueva York (1982); y Kennett, et al., compiladores, Monoclonal Antibodies, Hybridoma: A New Dimension in Biological Analyses, Plenum Press, editor, Nueva York (1980).

Debe entenderse que el término "detección" incluye la determinación de la presencia o ausencia de una sustancia o cuantificar la cantidad de una sustancia. El término se refiere por consiguiente al uso de los materiales, composiciones, y métodos de la presente invención para determinaciones cualitativas y cuantitativas.

El aislamiento de otros hibridomas que secretan anticuerpos monoclonales de la misma especificidad que los descritos en esta memoria se puede realizar por la técnica de rastreo anti-idiotípico (Potocmjak, et al., Science, 215: 1637 (1982)). De modo resumido, un anticuerpo anti-idiotípico es un anticuerpo que reconoce determinantes singulares presentes en el anticuerpo producido por el clon de interés. El anticuerpo anti-idiotípico se prepara por inmunización de un animal de la misma variedad utilizado como la fuente del anticuerpo monoclonal con el anticuerpo monoclonal de interés. El animal inmunizado reconocerá y responderá a los determinantes idiotípicos del anticuerpo de inmunización produciendo anticuerpo para estos determinantes idiotípicos (anticuerpo anti-idiotípico).

Para la replicación, las células híbridas se pueden cultivar tanto in vitro como in vivo. La elevada producción in vivo hace de éste el método de cultivo preferido actualmente. De modo resumido, células de las variedades híbridas individuales se inyectan intraperitonealmente en ratones BALB/c cebados con pristano para producir fluido de ascitis que contiene concentraciones elevadas de los anticuerpos monoclonales deseados. Anticuerpos monoclonales del isotipo IgM o IgG pueden purificarse a partir de sobrenadantes de cultivo utilizando métodos de cromatografía en columna bien conocidos por quienes poseen experiencia en la técnica.

Los anticuerpos de acuerdo con la presente invención son particularmente adecuados para uso en inmunoensayos en los cuales pueden utilizarse aquéllos en fase líquida o fijados a un soporte en fase sólida. Adicionalmente, los anticuerpos en estos inmunoensayos pueden marcarse detectablemente de diversas maneras.

Existen muchos marcadores y métodos de marcación diferentes conocidos en la técnica. Ejemplos de los tipos de marcadores que se pueden utilizar en la presente invención incluyen, pero sin carácter limitante, enzimas, radioisótopos, compuestos fluorescentes, compuestos quimioluminiscentes, compuestos bioluminiscentes y quelatos metálicos. Quienes poseen experiencia ordinaria en la técnica conocerán otros marcadores adecuados para fijación a anticuerpos, o serán capaces de averiguar los mismos por el uso de experimentación de rutina. Adicionalmente, la fijación de estos marcadores a los anticuerpos puede realizarse utilizando métodos estándar conocidos comúnmente por quienes poseen experiencia ordinaria en la técnica.

Una de las vías por las cuales pueden marcarse detectablemente los anticuerpos de acuerdo con la presente invención es por unión del anticuerpo a una enzima. Esta enzima, a su vez, cuando se expone más tarde a su sustrato, reaccionará con el sustrato de tal manera que producirá un resto químico que puede ser detectado mediante, por ejemplo, medios espectrofotométricos o fluorométricos. Ejemplos de enzimas que se pueden utilizar para marcar detectablemente anticuerpos incluyen malato-deshidrogenasa, nucleasa estafilocócica, delta-V-esteroide-isomerasa, levadura-alcohol-deshidrogenasa, alfa-glicerofosfato-deshidrogenasa, triosa-fosfato-isome-rasa, biotina-avidina-peroxidasa, peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, asparaginasa, glucosa-oxidasa, \beta-galactosidasa, ribonucleasa, ureasa, catalasa, glucosa-VI-fosfato-deshidrogenasa, glucoamilasa y acetilcolina-esterasa.

La presencia de anticuerpos marcados de manera detectable puede ser detectada también por marcación de los anticuerpos con un isótopo radiactivo que puede determinarse posteriormente por medios tales como el uso de un contador gamma o un contador de centelleo. Isótopos que son particularmente útiles para el propósito de la presente invención son ^{3}H, ^{125}I, ^{32}P, ^{35}S, ^{14}C, ^{51}Cr, ^{36}Cl, ^{57}Co, ^{58}Co, ^{59}Fe y ^{75}Se.

Es también posible detectar la fijación de anticuerpos marcados de manera detectable por marcación de los anticuerpos con un compuesto fluorescente. Cuando un anticuerpo marcado fluorescentemente se expone a luz de la longitud de onda apropiada, su presencia puede ser detectada luego debido a la fluorescencia del colorante. Entre los compuestos de marcación fluorescentes utilizados más frecuentemente se encuentran fluoresceína, isotiocianato, rodamina, ficoeritrina, ficocianina, aloficocianina, o-ftaldehído y fluorescamina.

Los anticuerpos de la invención se pueden marcar también de manera detectable utilizando metales emisores de fluorescencia tales como ^{152}Eu, u otros de la serie de los lantánidos. Estos metales se pueden unir a la molécula de anticuerpo utilizando grupos quelantes de metales tales como ácido dietilenotriaminapentaacético (DTPA) o ácido etilenodiaminatetraacético (EDTA).

Los anticuerpos se pueden marcar también detectablemente por acoplamiento de los mismos a un compuesto quimioluminiscente. La presencia del anticuerpo que lleva un marcador quimioluminiscente se determina luego por detección de la presencia de luminiscencia que se produce durante el curso de la reacción química. Ejemplos de compuestos marcadores quimioluminiscentes particularmente útiles son luminal, isoluminol, éster teromático de acridinio, imidazol, sales de acridinio, éster de oxalato, y dioxetano.

Análogamente, se puede utilizar un compuesto bioluminiscente para marcar los anticuerpos de acuerdo con la presente invención. La bioluminiscencia es un tipo de quimioluminiscencia encontrado en sistemas biológicos en el cual una proteína catalítica aumenta la eficiencia de la reacción quimioluminiscente. La presencia de un anticuerpo bioluminiscente se determina por detección de la presencia de luminiscencia. Compuestos bioluminiscentes importantes para propósitos de marcación incluyen luciferina, luciferasa y equorina.

Los anticuerpos y el antígeno sustancialmente purificado de la presente invención son idealmente adecuados para la preparación de un kit. Un kit de este tipo puede comprender un medio de soporte que está dividido en compartimientos para recibir en confinamiento estrecho con él uno o más medios de envase tales como viales, tubos y análogos, comprendiendo cada uno de dichos medios de envase los elementos separados del ensayo a utilizar.

Los tipos de ensayos que se pueden incorporar en forma de kit son muchos, e incluyen, por ejemplo, ensayos competitivos y no competitivos. Ejemplos típicos de ensayos que pueden utilizar los anticuerpos de la invención son radioinmunoensayos (RIA), inmunoensayos enzimáticos (EIA), ensayos de inmunosorbente unido a enzima (ELISA), e inmunoensayos inmunométricos, o de tipo sándwich.

Debe entenderse que la expresión "ensayo inmunométrico" o "inmunoensayo sándwich", incluye inmunoensayos sándwich simultáneos, sándwich directos y sándwich inversos. Estos términos son bien comprendidos por los expertos en la técnica. Los expertos apreciarán también que los anticuerpos de acuerdo con la presente invención serán útiles en otras variaciones y formas de ensayos que son conocidos actualmente o que puedan desarrollarse en el futuro. Debe entenderse que éstos están incluidos dentro del alcance de la presente invención.

En el modo preferido para realización de los ensayos, es importante que estén presentes ciertos "bloqueantes" en el medio de incubación (añadidos usualmente con el anticuerpo soluble marcado). Los "bloqueantes" se añaden para asegurar que proteínas inespecíficas, proteasa o anticuerpos humanos para las inmunoglobulinas de ratón presentes en la muestra experimental no reticulen o destruyan los anticuerpos en el soporte de fase sólida, o el anticuerpo indicador radiomarcado, para producir resultados positivos falsos o negativos falsos. La selección de "bloqueantes" aumenta por consiguiente de modo sustancial la especificidad de los ensayos descritos en la presente invención.

Se ha encontrado que cierto número de anticuerpos no relevantes (es decir, inespecíficos) de la misma clase o subclase (isotipo) que los utilizados en los ensayos (v.g., IgG_{1}, IgG_{2a}, IgM, etc.) pueden utilizarse como "bloqueantes". La concentración de los "bloqueantes" (normalmente 1-100 \mug/\mul) es importante, a fin de mantener la sensibilidad apropiada pero inhibir cualquier interferencia no deseada por proteínas de reacción cruzada existentes mutuamente en el suero humano. Adicionalmente, el sistema tampón que contiene los "bloqueantes" precisa estar optimizado. Tampones preferidos son los basados en ácidos orgánicos débiles, tales como imidazol, HEPPS, MOPS, TES, ADA, ACES, HEPES, PIPES, TRIS, y análogos, en intervalos de pH fisiológicos. Tampones algo menos preferidos son tampones inorgánicos tales como fosfato, borato o carbonato. Por último, se añaden preferiblemente inhibidores conocidos de proteasas (normalmente a 0,01-10 \mug/ml) al tampón que contiene los "bloqueantes".

Existen muchos inmunoadsorbentes en fase sólida que se han empleado y que pueden ser utilizados en la presente invención. Inmunoadsorbentes bien conocidos incluyen vidrio, poliestireno, polipropileno, dextrano, nailon y otros materiales, en forma de tubos, perlas, y placas de microtitulación formadas a partir de o revestidas con dichos materiales, y análogos. Los anticuerpos inmovilizados pueden estar unidos covalente o físicamente al inmunoadsorbente en fase sólida, por técnicas tales como unión covalente por la vía de un enlace amida o éster, o por absorción. Los expertos en la técnica conocerán muchos otros inmunoadsorbentes en fase sólida adecuados y métodos para inmovilización de anticuerpos en ellos, o serán capaces de descubrir compuestos de este tipo, utilizando simplemente experimentación de rutina.

Para diagnosis in vivo, in vitro, o in situ, marcadores tales como radionucleidos pueden fijarse a los anticuerpos de acuerdo con la presente invención sea directamente o por utilización de un grupo funcional intermediario. Un grupo intermediario que se utiliza a menudo para fijar radioisótopos que existen como cationes metálicos a anticuerpos es el ácido dietilenotriaminapentaacético (DTPA). Ejemplos típicos de cationes metálicos que se fijan de esta manera son: ^{99m}Tc, ^{123}I, ^{111}In, ^{131}I, ^{97}Ru, ^{67}Cu, ^{67}Ga y ^{68}Ga. Los anticuerpos de la invención pueden marcarse también con isótopos no radiactivos para propósitos de diagnosis. Elementos que son particularmente útiles de esta manera son ^{157}Gd, ^{55}Mn, ^{162}Dy, ^{52}Cr y ^{56}Fe.

El antígeno de la invención se puede aislar en forma sustancialmente pura empleando anticuerpos de acuerdo con la presente invención. Así, una realización de la presente invención proporciona la quimera del receptor de las células T, receptor de las células B, o receptor Fc sustancialmente pura, caracterizándose dicho antígeno porque el mismo es reconocido por y se fija a los anticuerpos de acuerdo con la presente invención. En otra realización, la presente invención proporciona un método de aislamiento o purificación del antígeno quimérico del receptor, por formación de un complejo de dicho antígeno con uno o más anticuerpos dirigidos contra la quimera del receptor.

Los antígenos de la quimera del receptor de las células T, receptor de las células B, o receptor Fc sustancialmente pura de la presente invención se pueden utilizar a su vez para detectar o medir un anticuerpo para la quimera en una muestra, tal como suero u orina. Así, una realización de la presente invención comprende un método de detección de la presencia o cantidad de anticuerpo para el antígeno quimera del receptor de las células T, el receptor de las células B, o el receptor Fc en una muestra, que comprende poner en contacto una muestra que contiene un anticuerpo para el antígeno quimérico con una quimera del receptor marcada detectablemente, y detectar dicho marcador. Se apreciará que pueden utilizarse también fracciones inmunorreactivas y análogos inmunorreactivos de la quimera. Por "fracción inmunorreactiva" se entiende cualquier porción del antígeno quimérico que demuestra una respuesta inmunitaria equivalente a un anticuerpo dirigido contra el receptor quimérico. Por "análogo inmunorreactivo" se entiende una proteína que difiere de la proteína del receptor quimérico por uno o más aminoácidos, pero que demuestra una inmunorrespuesta equivalente a un anticuerpo de la invención.

Por "reconoce y fija específicamente" se entiende un anticuerpo que reconoce y fija el polipéptido receptor quimérico pero no reconoce y fija sustancialmente otras moléculas no afines en una muestra, v.g., una muestra biológica.

Por "célula generada por autoinmunidad" se entienden células que producen anticuerpos que reaccionan con el tejido hospedador o células T efectoras inmunitarias que son autorreactivas; tales células incluyen anticuerpos contra los receptores de acetilcolina (que conducen, v.g., a la miastenia grave) o autoanticuerpos anti-DNA, anti-eritrocitos, y anti-plaquetas (que conducen, v.g., al lupus eritematoso).

Por "célula terapéutica" se entiende una célula que ha sido transformada por una quimera de la invención de tal manera que es capaz de reconocer y destruir un agente infeccioso específico, una célula infectada por un agente específico, una célula tumoral o cancerosa, o una célula generada por autoinmunidad; preferiblemente, tales células terapéuticas son células del sistema hematopoyético.

Por un "agente infeccioso diana" se entiende cualquier agente infeccioso, v.g., un virus, bacteria, protozoo, u hongo) que puede ser reconocido por una célula terapéutica portadora de un receptor quimérico. Por "una célula diana" se entiende cualquier célula hospedadora que puede ser reconocida por una célula terapéutica portadora del receptor quimérico; células diana incluyen, sin carácter limitante, células hospedadoras que están infectadas con un virus, una bacteria, un protozoo o un hongo, así como células tumorales o cancerosas y células generadas por
autoinmunidad.

Por "extracelular" se entiende que tiene al menos una porción de la molécula expuesta en la superficie de la célula. Por "intracelular" se entiende que tiene al menos una porción de la molécula expuesta al citoplasma de la célula terapéutica. Por "transmembranal" se entiende que tiene al menos una porción de la molécula que atraviesa la membrana plasmática. Una "porción extracelular", una "porción intracelular" y una "porción transmembranal", tal como se utilizan en esta memoria, pueden incluir secuencias de aminoácidos flanqueantes que se extienden en compartimientos celulares adyacentes.

Por "oligomerizar" se entiende formar complejos con otras proteínas para formar dímeros, trímeros, tetrámeros, u otros oligómeros de orden superior. Los oligómeros de este tipo pueden ser homo-oligómeros o hetero-oligómeros. Una "porción oligomerizante" es aquella región de una molécula que dirige la formación de un complejo (es decir, el oligómero).

Por "citolítico" se entiende que es capaz de destruir una célula (v.g., una célula infectada con un patógeno, una célula tumoral o cancerosa, o una célula generada por autoinmunidad) o que es capaz de destruir un agente infeccioso (v.g., un virus).

Por "virus de la inmunodeficiencia" se entiende un retrovirus que, en su forma de tipo salvaje, es capaz de infectar las células T4 de un hospedador primate y posee una morfogénesis y morfología víricas características de la subfamilia de los lentivirus. El término incluye, sin limitación, todas las variantes de HIV y SIV, con inclusión de HIV-1, HIV-2, SIVmac, SIVagm, SIVmnd, SIVsmm, SIVman, SIVmand, y SIVcpz.

Por "independiente del MHC" se entiende que la respuesta celular citolítica no requiere la presencia de un antígeno MHC de clase II en la superficie de la célula diana.

Por un "derivado funcional citolítico transductor de señales" se entiende un derivado funcional (como se define anteriormente) que es capaz de dirigir al menos 10%, preferiblemente 40%, más preferiblemente 70%, o muy preferiblemente al menos 90% de la actividad biológica de la molécula de tipo salvaje. Tal como se utiliza en esta memoria, un "derivado funcional citolítico transductor de señales" puede actuar señalizando directamente la célula terapéutica para destruir un agente o célula fijado al receptor (v.g., en el caso de una porción intracelular del receptor quimérico) o puede actuar indirectamente promoviendo la oligomerización con proteínas citolíticas transductoras de señales de la célula terapéutica (v.g., en el caso de un dominio transmembranal). Tales derivados pueden ensayarse en cuanto a eficacia, v.g., utilizando los ensayos in vitro descritos en esta memoria.

Por un "derivado funcional de fijación a la envoltura de HIV" se entiende un derivado funcional (como se ha definido anteriormente) que es capaz de fijar cualquier proteína de la envoltura de HIV. Los derivados funcionales se pueden identificar utilizando, v.g., los ensayos in vitro descritos en esta memoria.

Administración terapéutica

Las células transformadas de la presente invención se pueden utilizar para la terapia de cierto número de enfermedades. Métodos actuales de administración de dichas células transformadas implican inmunoterapia adoptiva o terapia de transferencia celular. Estos métodos permiten el retorno de las células transformadas del sistema inmunitario al torrente sanguíneo. Rosenberg, Scientific American, 62 (mayo de 1990); Rosenberg et al., New Engl. J. Med. 323: 570 (1990).

Las composiciones farmacéuticas de la invención se pueden administrar a cualquier animal que pueda experimentar los efectos beneficiosos de los compuestos de la invención. Entre dichos animales, los más importantes son los humanos, aunque la invención no tiene por objeto limitarse a éstos.

Descripción detallada

En primer lugar se describirán los dibujos.

Breve descripción de los dibujos

La Fig. 1A presenta la secuencia de aminoácidos alrededor del sitio de fusión entre CD4 (residuos 1-369) y las diferentes cadenas receptoras (SEQ ID NOS: 28-31). La secuencia subrayada muestra la posición de los aminoácidos codificados dentro del sitio BamHI utilizado para construcción de la fusión. El comienzo del dominio transmembranal está marcado con una barra vertical. La secuencia \eta es idéntica a la secuencia \zeta en el término amino, pero diverge en el término carboxilo (Jin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 3319-3323 (1990)). La Fig. 1B presenta un análisis por citometría de flujo de la expresión en superficie de CD4, CD4:\zeta, CD4-\gamma y CD4-\eta en células CV1. Las células se infectaron con virus que expresaba quimeras CD4 o CD16_{PI}, se incubaron durante 9 horas a 37ºC, y se tiñeron con MAb Leu3A anti-CD4 conjugado con ficoeritrina.

La Fig. 2 muestra la expresión superficial de CD16_{TM} después de coinfección de CD16_{TM} solo (puntos densos), o coinfección con virus que expresa CD4:\gamma (trazos) o CD4:\zeta (línea continua). Puntos dispersos, células infectadas con CD4:\zeta solo, teñidas con 3G8 (Fleit et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79: 3275-3279 (1982)) (Mab anti-CD16).

La Fig. 3 muestra la expresión en la superficie de CD16_{TM} después de coinfección por virus que expresan CD16_{TM} y las quimeras \zeta siguientes: CD4:\zeta (línea gruesa), CD4:\zetaC11G (línea continua); CD4:\zeta (línea de trazos); CD4:\zetaC11G/ D15G (puntos densos); ausencia de coinfección (C16_{TM} solo, puntos dispersos). Las células se incubaron con Mab 3G8 anti-CD16 y anticuerpos de cabra Fab'_{2} conjugados con ficoeritrina para IgG de ratón. El nivel de expresión de las quimeras \zeta era esencialmente idéntico para los diferentes mutantes analizados, y la coinfección de las células con virus que expresaban CD16_{TM} y quimeras \zeta no alteraba apreciablemente la expresión en superficie de las
quimeras.

La Fig. 4 muestra que el ion calcio libre intracelular incrementado sigue a la reticulación de las quimeras mutantes \zeta en una línea de células T. Se infectaron células Jurkat E6 (Weiss et al., J. Immunol., 133: 123-128 (1984)) con virus vaccinia recombinantes y se analizaron por citometría de flujo. Los resultados presentados corresponden a la población CD4^{+} seleccionada, de tal modo que solamente se analizan las células que expresan la proteína quimérica relevante. La relación media de fluorescencia violeta a azul con Indo-1 refleja la concentración intracelular de calcio libre en la población como un todo y el porcentaje de células sensibles refleja la fracción de células que superan una relación umbral predeterminada (ajustada de tal manera que el 10% de las células sin tratar son positivas). La Fig. 4A y la Fig. 4B muestran células Jurkat que expresan CD4:\zeta (línea continua) o CD16:\zeta (línea de trazos) que se expusieron a MAb Leu3a anti-CD4 (conjugado con ficoeritrina), seguido por reticulación con anticuerpo de cabra para IgG de ratón. La línea de puntos muestra la respuesta de células no infectadas a MAb OKT3 anti-CD3. Las Figs. 4C y 4D muestran células Jurkat que expresan CD4:\zeta D15G g(línea continua); CD4:\zetaC11G/D15G (trazos); o CD4:\zetaC11G (puntos) que se trataron y analizaron como en las Figs. 4A y 4B.

La Fig. 5 muestra que los receptores CD4:\zeta, CD4:\eta, y CD4:\gamma hacen posible que los linfocitos T citolíticos (CTL) destruyan las dianas que expresan gp120/41 de HIV-1. Fig. 5A: círculos llenos, CTL que expresan CD4:\zeta incubados con células HeLa que expresan gp120/41; círculos vacíos, CTL que expresan CD4:\zeta incubados con células HeLa no infectadas; cuadrados llenos, CTL no infectados incubados con células HeLa que expresan gp120/41; cuadrados vacíos, CTL no infectados incubados con células HeLa no infectadas. Fig. 5B: círculos llenos, CTL que expresan CD4:\eta incubados con células HeLa que expresan gp120/41; círculos vacíos, CTL que expresan CD4:\gamma incubados con células HeLa que expresan gp120/41; cuadrados vacíos, CTL que expresan la quimera CD4:\zeta mutante doble C11G/D15G, incubada con células HeLa que expresan gp120/41. Fig. 5C: Análisis por citometría de flujo de la expresión de CD4 por los CTL utilizados en Fig. 5B. Para corregir las relaciones de diana a efector, se determinó el porcentaje de células que expresan la quimera CD4 por sustracción de la población negativa (no infectada) escalada por superposición de histogramas; para propósitos comparativos en esta figura, se asignó a las células no infectadas un umbral arbitrario que da aproximadamente la misma fracción positiva para las otras poblaciones de células que daría la sustracción de histogramas.

Las Figs. 6A-B muestran la especificidad de la citólisis dirigida por CD4. Fig. 6A: círculos llenos, CTL que expresan CD4:\zeta incubados con células HeLa que expresan CD16_{PI}; círculos vacíos, CTL que expresan CD4 incubados con células HeLa que expresan gp120; cuadrados llenos, CTL que expresan CD16:\zeta incubados con células HeLa que expresan gp120/41; cuadrados vacíos, CTL que expresan CD16_{PI} incubados con células HeLa que expresan gp120/41. Fig. 6B: círculos llenos, CTL que expresan CD4:\zeta incubados con células Raji (MHC clase II^{+}); círculos vacíos, células CTL no infectadas incubadas con células RJ2.2.5 (mutante Raji MHC clase II^{-}); cuadrados llenos, CTL no infectados incubados con células Raji (MHC clase II^{+}); cuadrados vacíos, CTL que expresan CD4:\zeta incubados con células RJ2.2.5 (MHC clase II^{-}). La escala de las ordenadas está expandida.

Las Figs. 7A-B muestran la caracterización del receptor quimérico CD16:\zeta. La Fig. 7A es un diagrama esquemático de la proteína de fusión CD16:\zeta. La porción extracelular de la forma enlazada a fosfatidilinositol de CD16 monómero se unió a \zeta dímero justamente en posición externa al dominio transmembranal. La secuencia de la proteína en la unión por fusión se muestra en la parte inferior (SEQ ID NOS: 32,33). La Fig. 7B muestra un análisis por citometría de flujo de la movilización del calcio después de reticulación de la quimera CD16:\zeta en una línea de células TCR positiva o TCR negativa. Se muestra la relación media de fluorescencia violeta a azul (una medida de la concentración relativa de ion calcio) entre poblaciones celulares tratadas con anticuerpos en el tiempo 0. Cuadrados llenos, la respuesta de las células Jurkat a Mab OKT3 anti-CD3; triángulos llenos, la respuesta de CD16:\zeta a la reticulación de Mab 3G8 anti-CD16 en el mutante REX33A TCR^{-}; cuadrados vacíos, la respuesta a la reticulación de CD16:\zeta en la línea mutante Jurkat TCR^{-}, JRT3.T3.5; triángulos vacíos, la respuesta a la reticulación de CD16:\zeta en células Jurkat; cruces, la respuesta a CD16 no quimérico en células Jurkat; y puntos, la respuesta a CD16 no quimérico en la línea de células REX33A TCR^{-}.

Las Figs. 8A-B muestran el análisis de deleción del potencial citolítico. La Fig. 8A muestra las localizaciones de los puntos finales de deleción de \zeta. En este caso, como en cualquier otro, las mutaciones en \zeta se representan por la convención residuo original-localización-residuo mutante, por lo que D66*, por ejemplo, denota el reemplazamiento de Asp-66 por un codón de terminación. La Fig. 8B muestra los resultados del ensayo de citólisis de CD16:\zeta no delecionado y las deleciones de \zeta principales. Las células de hibridoma que expresaban el anticuerpo de superficie para CD16 se cargaron con ^{51}Cr y se incubaron con números crecientes de linfocitos citolíticos humanos (CTL) infectados con recombinantes vaccinia que expresaban quimeras CD16:\zeta. Se representa gráficamente el porcentaje de ^{51}Cr liberado en función de la relación de células efectoras (CTL) a células diana (hibridoma) (e/t). Círculos llenos, citólisis mediada por células que expresan CD16:\zeta (mfi 18,7); cuadrados llenos, citólisis mediada por células que expresan CD16:\zetaAsp66* (mfi 940,2); cuadrados vacíos, citólisis mediada por células que expresan CD16:\zetaGlu60* (mfi 16,0); círculos vacíos, citólisis mediada por células que expresan CD16:\zetaTyr51* (mfi 17,4); triángulos llenos, citólisis mediada por células que expresan CD16:\zetaPhe34* (mfi 17,8); y triángulos vacíos, citólisis mediada por células que expresan CD165 no quimérica (mfi 591). Aunque en este experimento la expresión de CD16:\zetaAsp66* no coincidía exactamente con la de las otras proteínas de fusión, la citólisis por células que expresan CD16:\zeta a niveles equivalentes en el mismo experimento daba resultados esencialmente idénticos a los mostrados por las células que expresan
CD16:\zetaAsp66*.

Las Figs. 9A-D muestran que la eliminación del potencial para interacciones transmembranales revela un segmento \zeta corto capaz de mediar la citólisis. La Fig. 9A es un diagrama esquemático de las quimeras monómeras bipartita y tripartita. En el extremo superior se encuentra la construcción CD16:\zeta truncada en el residuo 65 y que carece de los residuos transmembranales Cys y Asp. En la parte inferior se muestran las construcciones CD16:CD5:\zeta y CD16:CD7:\zeta y controles afines. Las secuencias peptídicas de los dominios intracelulares se muestran abajo. La Fig. 9B muestra la actividad citolítica de mutantes de deleción quiméricos monómeros. La actividad citolítica de las células que expresaban CD16:\zeta (círculos llenos, mfi 495) se comparó con la de células que expresan CD16:\zetaAsp66* (cuadrados llenos; mfi 517) o los mutantes CD16:\zetaCys11Gly/Asp15Gly/Asp66* (cuadrados vacíos; mfi 338) y CD16:\zetaCys11Gly/Asp15-Gly/Glu60* (triángulos llenos, mfi 259). La Fig. 9C muestra la actividad citolítica mediada por las proteínas de fusión tripartitas. Triángulos llenos, CD16:\zetaAsp66*; cuadrados vacíos, CD16:5:\zeta (48-65); cuadrados llenos CD16:7:\zeta (48-65); triángulos vacíos, CD16:7:\zeta (48-59); círculos vacíos, CD16:5; círculos llenos, CD16:7. La Fig. 9D muestra la movilización del calcio por quimeras mutantes y tripartitas en la línea de células mutantes Jurkat JRT3.T3.5 TCR-negativa. Círculos vacíos, respuesta de las células que expresaban CD16:\zetaAsp66* dímeras; cuadrados llenos, respuesta de las células que expresaban CD16:\zeta Cys11Gly/Asp15Gly/Asp66*; cuadrados vacíos, respuesta de las células que expresaban CD16:\zeta Cys11Gly/Asp15Gly/Glu60*; triángulos llenos, respuesta de las células que expresaban CD16:7:\zeta (48-65); y triángulos vacíos, respuesta de las células que expresaban
CD16:\zeta (48-59).

Las Figs. 10A-F muestran la contribución de los aminoácidos individuales a la actividad del motivo citolítico de 18 residuos transductor de señales. Las Figs. 10A y 10B muestran la actividad citolítica y la Fig. 10C muestra la movilización del ion calcio mediada por quimeras portadoras de puntos de mutación cerca de la tirosina carboxi-terminal (Y62). Las Figs. 10A y 10B representan datos recogidos en células que expresaban cantidades baja y alta, respectivamente, de las proteínas de fusión CD16:\zeta. Se utilizan símbolos idénticos para los ensayos de movilización de calcio y de citólisis, y se muestran a la derecha en códigos de una sola letra. Círculos llenos, células que expresan CD16:\zeta (mfi en A, 21; B, 376); cuadrados llenos, células que expresan CD16:7:\zeta (48-65) (mfi A, 31; B, 82); cuadrados vacíos, CD16:7:\zeta (48-65) Glu60Gln (mfi A, 33; B, 92); cruces, CD16:7:\zeta (48-65) Asp63Asn (mfi A, 30; B, 74); triángulos llenos, CD16:7:\zeta (48-65) Tyr62Phe (mfi A, 24; B, 88); círculos vacíos, CD16:7:\zeta (48-65) Glu61Gln (mfi A, 20, B, 62); y triángulos vacíos, CD16:7:\zeta (48-65) Tyr62Ser (mfi B, 64). Las Figs. 10D y 10E muestran la actividad citolítica y la Fig. 10F muestra la movilización del ion calcio por quimeras portadoras de mutaciones puntuales cerca de la tirosina amino-terminal (Y51). Se utilizan símbolos idénticos para los ensayos de movilización de calcio y de citólisis, y se muestran a la derecha. Círculos llenos, células que expresan CD16:\zeta (mfi en D, 21.2; en E, 672); cuadrados llenos, células que expresan CD16:7:\zeta (48-65) (mfi D, 31.3; E, 179); triángulos llenos, CD16:7:\zeta (48-65) Asn48Ser (mfi D, 22.4; E, 209); cuadrados vacíos, CD16:7:\zeta (48-65) Leu50Ser (mfi D, 25.0; E, 142); y triángulos vacíos, CD16:7:\zeta (48-65) Tyr51Phe (mfi D, 32.3; E, 294).

Las Figs. 11A-B muestran la alineación de las repeticiones internas de \zeta y la comparación de su capacidad para soportar la citólisis. La Fig. 11A es un diagrama esquemático de quimeras formadas por división del dominio intracelular \zeta en terceras partes y adición como apéndice de las mismas al dominio transmembranal de una quimera CD16:7. Las secuencias de los dominios intracelulares se muestran abajo (SEQ ID NOS: 38-40), con los residuos compartidos encuadrados, y los residuos afines designados por asteriscos. La Fig. 11B muestra la potencia citolítica de los tres subdominios \zeta. Círculos llenos, células que expresan CD16:\zeta (mfi 476); cuadrados llenos, CD16:7:\zeta (33-65) (mfi 68); cuadrados vacíos, CD16:7:\zeta (71-104) (mfi 114); y triángulos llenos, CD16:7:\zeta (104-138) (mfi 104).

La Fig. 12 es un diagrama esquemático de las quimeras CD16:FcR\gammaII.

La Fig. 13 muestra la movilización del calcio después de reticulación de las quimeras CD4:FcR\gammaII y CD16:FcR\gammaII. La Fig. 13A muestra la relación de fluorescencia violeta a azul emitida por células cargadas con el fluoróforo Indo-1 sensible al calcio representada en función del tiempo después de reticulación del dominio extracelular CD16 con anticuerpos. La Fig. 13B muestra un análisis similar del aumento en la relación de fluorescencia violeta a azul de células portadoras de quimeras CD4:FcR\gammaII, después de reticulación con anticuerpos.

Las Figs. 14A-B muestran ensayos de citólisis de las quimeras CD4:FcR\gammaII y CD16:FcR\gammaII. La Fig. 14A muestra el porcentaje de ^{51}Cr liberado por las células de hibridoma anti-CD16 (diana) cuando las células se exponen a números crecientes de linfocitos T citotóxicos que expresan las quimeras CD16:FcR\gammaII (células efectoras). La Fig. 14B muestra un análisis similar de la citotoxicidad mediada por las quimeras CD4:FcR\gammaII contra células diana que expresan las glicoproteínas de la envoltura de HIV.

Las Figs. 15A-E muestran la identificación de residuos en la cola de FcR\gammaII A que son importantes para la citólisis. La Fig. 15A es un diagrama esquemático de las construcciones de deleción. Las Figs. 15B y 15C muestran la movilización del calcio y la citólisis por variantes de deleción del terminal carboxilo de CD16:FcR\gammaII A. Las Figs. 15D y 15E muestran la movilización del calcio y la citólisis por quimeras tripartitas portadoras de cantidades progresivamente menores del término amino de la cola intracelular de CD16:FcR\gammaII A.

La Fig. 16 (SEQ ID NO: 24) muestra la secuencia de aminoácidos de la proteína receptora CD3 delta; la secuencia encuadrada representa una porción transductora de señal citolítica preferida.

La Fig. 17 (SEQ ID NO: 25) muestra la secuencia de aminoácidos de la proteína receptora T3 gamma; la secuencia encuadrada representa una porción transductora de señal citolítica preferida.

La Fig. 18 (SEQ ID NO: 26) muestra la secuencia de aminoácidos de la proteína receptora mb1; la secuencia encuadrada representa una porción transductora de señal citolítica preferida.

La Fig. 19 (SEQ ID NO: 27) muestra la secuencia de aminoácidos de la proteína receptora B29; la secuencia encuadrada representa una porción transductora de señal citolítica preferida.

Ejemplo I Construcción de Quimeras IgG1: Receptor Humanas

Se prepararon secuencias de la cadena pesada de IgG1 humana por unión de secuencias en el dominio C_{H}3 a un fragmento de cDNA derivado del extremo 3' de la forma transmembranal de mRNA del anticuerpo. El fragmento del extremo 3' se obtuvo por reacción en cadena de la polimerasa utilizando como sustrato una genoteca de cDNA de amígdalas, y oligonucleótidos que tenían las secuencias:

CGC GGG GTG ACC GTG CCC TCC AGC AGC TTG GGC (SEQ ID NO: 7) y

CGC GGG GAT CCG TCG TCC AGA GCC CGT CCA GCT CCC CGT CCT GGG CCT CA (SEQ ID NO: 8),

correspondientes a los extremos 5' y 3' de los fragmentos deseados de DNA respectivamente. El oligo 5' es complementario a un sitio en el dominio C_{H}1 de IgG1 humana, y el oligo 3' es complementario a un sitio situado justamente en posición 5' respecto a las secuencias codificantes del dominio que atraviesa la membrana. El producto PCR se digirió con BstXI y BamHI y se ligó entre los sitios BstXI y BamHI de un gen de anticuerpo semisintético IgG1 que contenía regiones variable y constante. Después de la inserción del fragmento BstXI a BamHI, las porciones multiplicadas de la construcción se reemplazaron hasta el sitio SmaI en C_{H}3 por intercambio de fragmentos de restricción, de tal manera que únicamente la porción comprendida entre el sitio SmaI y el oligo 3' se derivaba de la reacción PCR.

Para crear un receptor quimérico IgG1:\zeta humano, el gen de la cadena pesada que terminaba en un sitio BamHI se unió al sitio BamHI de la quimera \zeta descrita más adelante, de tal manera que las secuencias de anticuerpo formaban la porción extracelular. La citometría de flujo de células COS transfectadas con un plásmido codificante de la quimera mostraba un nivel de expresión alto de determinantes de anticuerpos cuando se cotransfectó un plásmido de expresión que codificaba un cDNA de cadena ligera, y expresión moderada de determinantes de anticuerpos cuando estaba ausente el plásmido de expresión de la cadena ligera.

En líneas generales, pueden construirse quimeras similares que incluyen IgG1 humana fusionada a \eta o \gamma (véase más adelante), o cualquier porción transductora de señales de una proteína receptora de las células T o receptor Fc como se ha descrito anteriormente, utilizando técnicas estándar de biología molecular.

Para crear una unidad de transcripción simple que pudiera permitir que tanto la cadena pesada como la ligera se expresaran a partir de un promotor simple, se creó un plásmido codificante de un mRNA bicistrónico a partir de secuencias codificantes de cadena pesada y ligera, y la porción 5' no traducida del mRNA codificante de la proteína de 78 kD regulada por glucosa, conocida por otro nombre como grp78, o BiP. Se obtuvieron secuencias de grp78 por PCR de DNA genómico humano utilizando iniciadores que tenían las secuencias:

CGC GGG CGG CCG CGA CGC CGG CCA AGA CGA CAC (SEQ ID NO: 9) y

CGC GTT GAC GAG CAG CCA GTT GGG CAG CAG CAG (SEQ ID NO: 10)

en los extremos 5' y 3' respectivamente. Se llevaron a cabo reacciones en cadena de la polimerasa con estos oligos en presencia de dimetil-sulfóxido al 10%. El fragmento obtenido por PCR se digirió con NotI y HincII y se insertó entre los sitios NotI y HpaI aguas abajo de las secuencias codificantes de IgG1 humana. Se insertaron luego secuencias codificantes de un cDNA de cadena ligera kappa de IgG humana aguas abajo del conductor grp78, utilizando el sitio HincII y otro sitio en el vector. El plásmido de expresión resultante de estas manipulaciones estaba constituido por el gen semisintético de la cadena pesada, seguido por las secuencias conductoras de grp78, seguido por las secuencias de cDNA de cadena ligera kappa, seguido por señales de poliadenilación derivadas de un fragmento de DNA de SV40. La transfección de las células COS con el plásmido de expresión proporcionó una expresión notablemente mejorada de determinantes de la cadena pesada, en comparación con la transfección del plásmido que codificaba únicamente determinantes de la cadena pesada.

Para crear un gen bicistrónico que comprenda una quimera cadena pesada/receptor y una cadena ligera, las secuencias aguas arriba de la cadena pesada se pueden reemplazar por cualquier gen quimérico cadena pesada/receptor descrito en esta memoria.

Ejemplo II Construcción de Quimeras del Receptor CD4

Se aislaron cDNAs humanos \zeta (Weissman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 9709-9713 (1988b)) y \gamma (Küster et al., J. Biol. Chem., 265: 6448-6452 (1990)) por la reacción en cadena de la polimerasa de genotecas preparadas a partir de la línea de células tumorales HPB-ALL (Aruffo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84: 8573-8577 (1987b)) y de células agresoras naturales humanas, mientras que el cDNA \eta (Jin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 3319-3323 (1990)) se aisló de una genoteca de timocitos murinos. Los cDNAs \zeta, \eta y \gamma se unieron al dominio extracelular de una forma diseñada de CD4 que poseía un sitio BamHI inmediatamente aguas arriba del dominio que atraviesa la membrana (Aruffo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84: 8573-8577 (1987b), Zettlmeissl et al., DNA Cell Biol., 9: 347-353 (1990)) que se unió al sitio BamHI naturalmente presente en los cDNAs \zeta y \eta en una localización similar situada unos cuantos residuos aguas arriba del dominio que atraviesa la membrana (SEQ ID NOS: 1, 3, 4 y 6). Para formar la proteína de fusión con \gamma, se construyó un sitio BamHI en la secuencia en la misma localización aproximada (Fig. 1; SEQ ID NO: 2 y 5). Las fusiones de genes se introdujeron en un plásmido de expresión de virus vaccinia que era portador del gen gpt de E. coli como marcador seleccionable, y se insertaron en el genoma de la cepa WR de vaccinia por recombinación homóloga y selección para crecimiento en ácido micofenólico (Falkner et al., J. Virol., 62: 1849-1854 (1988); Boyle et al., Gene, 65: 123-128 (1988)). El análisis por citometría de flujo mostró que los recombinantes de vaccinia dirigen la producción abundante de proteínas de fusión CD4:\zeta y CD4:\gamma en la superficie celular, mientras que la expresión de CD4:\eta es sustancialmente más débil (Fig. 1B). El último descubrimiento es consistente con un informe reciente de que la transfección de un plásmido de expresión de cDNA \eta en una línea de células de hibridoma murino proporcionaba sustancialmente menos expresión que la transfección de un plásmido de expresión \zeta comparable (Clayton et al., J. Exp. Med., 172: 1242-1253 (1990)). La inmunoprecipitación de células infectadas con los recombinantes vaccinia reveló que las proteínas de fusión forman dímeros covalentes, al contrario que el antígeno CD4 existente naturalmente. Se encontró que las masas moleculares de las proteínas de fusión monómeras CD4:\zeta y CD4:\gamma y CD4 nativo eran 63, 55 y 53 kD respectivamente. Las mayores masas de las proteínas de fusión son aproximadamente consistentes con la mayor longitud de la porción intracelular, que excede de la de CD4 nativo por 75 (CD4:\zeta) o 5 (CD4:\gamma) residuos.

Ejemplo III Las Quimeras CD4 Pueden Asociarse con Otras Cadenas Receptoras

La expresión en la superficie celular de la forma macrófago/células agresoras naturales de Fc\gammaRIII humana
(CD16_{TM}) en los transfectantes se facilita por cotransfección con \gamma murina (Kurosaki et al., Nature, 342: 805-807 (1989)) o humana (Hibbs et al., Science, 246: 1608-1611 (1989)), así como por \zeta humana (Lanier et al., Nature, 342: 803-805 (1989)).

Coherentemente con estos informes, la expresión de las quimeras hacía posible también la expresión de CD16_{TM} en la superficie cuando se suministró a la célula diana por cotransfección o por coinfección con virus vaccinia recombinantes (Fig. 2). La promoción de la expresión de CD16_{TM} en la superficie por \zeta era más acusada que la promoción por \gamma (Fig. 2) en las líneas de células examinadas, mientras que la CD4 nativo no mejoraba la expresión de CD16_{TM} en la superficie.

Ejemplo IV Los Mutantes de Asp\zeta No se Coasocian con el Receptor Fc

Para crear quimeras que no se asociaran con el antígeno existente o los receptores Fc, se prepararon proteínas de fusión \zeta mutantes que carecían del residuo intramembranoso Asp o del residuo intramembranoso Cys o de ambos. La citometría de flujo demostró que la intensidad de la expresión en la superficie celular por las diferentes quimeras mutantes no era apreciablemente diferente del precursor carente de mutaciones, y experimentos de inmunoprecipitación demostraron que la expresión total por las quimeras era similar. Como era de esperar, se encontró que las quimeras mutantes que carecían del residuo cisteína transmembranal no formaban dímeros con enlaces disulfuro. Las dos quimeras mutantes que carecían de Asp eran incapaces de soportar la expresión de CD16_{TM} en la superficie, mientras que las quimeras monómeras que carecían de Cys pero llevaban Asp permitían la coexpresión de CD16_{TM}, si bien con menor eficiencia que el dímero parental (Fig. 3).

Ejemplo V Los Receptores Mutantes Retienen la Capacidad de Iniciar una Respuesta de Calcio

Para determinar si la reticulación de las proteínas de fusión podrían permitir la acumulación de calcio intracelular libre de una manera similar a lo que se sabe ocurre con el receptor del antígeno de las células T, células de la línea de leucemia de las células T humanas, Jurkat E6 (Número de Acceso ATCC TIB 152, American Type Culture Collection, Rockville, MD), se infectaron con los recombinantes vaccinia y se midió la concentración relativa de calcio citoplásmico después de la reticulación del dominio extracelular con anticuerpos. Se realizaron medidas por citometría de flujo con células cargadas con el colorante Indo-1 sensible al calcio (Grynkiewicz et al., J. Biol. Chem., 260: 3340-3450 (1985); Rabinovitch et al., J. Immunol., 137: 952-961 (1986)). Las Figuras 4 A-D muestran los resultados de los experimentos del flujo de calcio con células infectadas con CD4:\zeta y los mutantes Asp^{-} y Cys^{-} de \zeta. La reticulación de las quimeras aumentaba reproduciblemente el calcio intracelular. CD4:\eta y CD4:\gamma permitían análogamente la acumulación de calcio intracelular en las células infectadas. Las células Jurkat expresan niveles bajos de CD4 en la superficie celular; sin embargo, la reticulación del CD4 nativo en presencia o ausencia de CD16:\zeta no altera los niveles de calcio intracelular (Figs. 4A-B).

Ejemplo VI Las Quimeras CD4:\zeta, \eta, y \gamma Median la Citólisis de las Dianas que Expresan gp120/41 de HIV

Para determinar si los receptores quiméricos podrían desencadenar programas citolíticos efectores, se creó un sistema modelo diana:efector basado en el reconocimiento por CD4 del complejo gp120/gp41 de la envoltura de HIV. Se infectaron células HeLa con virus vaccinia recombinantes que expresaban gp120/gp41 (Chakrabarti et al., Nature, 320: 535-537 (1986); Earl et al., J. Virol., 64: 2448-2451 (1990)) y se marcaron con ^{51}Cr. Las células marcadas se incubaron con células procedentes de una línea humana aloespecífica de linfocitos T citotóxicos (CD8^{+}, CD4^{-}) que se había infectado con recombinantes vaccinia que expresaban las quimeras CD4:\zeta, CD4:\eta, o CD4:\gamma o la quimera mutante doble CD4:\zetaCys11Gly:Asp15Gly. Las Figs. 5A-C muestran que las células HeLa que expresaban gp120/41 eran lisadas específicamente por los linfocitos T citotóxicos (CTL) que expresaban quimeras CD4. Las células HeLa no infectadas no eran consideradas como diana por los CTL armados con quimeras CD4:\zeta, y las células HeLa que expresaban gp120/41 no eran reconocidas por los CTL no infectados. Para comparar la eficacia de las diversas quimeras, se corrigieron las relaciones de efector a diana por la fracción de CTL que expresaba quimeras CD4, y por la fracción de células HeLa que expresaba gp120/41, como se mide por citometría de flujo. La Fig. 5C muestra un análisis citométrico de la expresión de CD4 por los CTL utilizados en el experimento de citólisis que se muestra en Figs. 5A y 5B. Aunque la densidad media de CD4:\zeta superficial excedía notablemente de la densidad media de CD4:\eta, las eficiencias citolíticas de las células que expresaban cualquiera de las formas eran similares. Corrigiendo por la fracción de las dianas que expresan gp120, la eficiencia de citólisis mediada por las proteínas CD4:\zeta y CD4:\eta es comparable a las mejores eficiencias consignadas para los pares diana:efector específicos de receptores de las células T (la relación media de efector a diana para 50% de liberación por las células T que expresaban CD4:\zeta era 1,9 \pm 0,99, n = 10). La fusión CD4:\gamma era menos activa, como lo era la fusión CD4:\zeta que carecía de los residuos transmembranales Asp y Cys. Sin embargo, en ambos casos se observó una citólisis significativa (Figs. 5B-C).

Para controlar en cuanto a la posibilidad de que la infección por vaccinia pudiera promover el reconocimiento accidental por los CTL, se realizaron experimentos de citólisis similares con células diana infectadas con recombinantes vaccinia que expresaban la forma de CD16 enlazada con fosfatidilinositol (CD16_{PI}) y marcados con ^{51}Cr, y con CTL infectados con recombinantes de control que expresaban CD16_{PI} o CD16:\zeta. La Fig. 6A muestra que las células T que expresan quimeras distintas de CD4 no reconocen las células HeLa nativas o las células HeLa que expresan gp120/41, y análogamente, que las células T que expresan quimeras CD4 no reconocen las células HeLa que expresan otras proteínas de la superficie codificadas por vaccinia. Adicionalmente, los CTLs que expresan CD4 no quimérico no lisan significativamente las células HeLa que expresan gp120/41 (Fig. 6A).

Ejemplo VII Las Células Portadoras de MHC Clase II No son Consideradas como Diana por las Quimeras

Se cree que CD4 interacciona con una secuencia no polimórfica expresada por el antígeno MHC de clase II (Gay et al., Nature, 328: 626-629 (1987); Sleckman et al., Nature, 328: 351-353 (1987)). Aunque no se ha documentado nunca una interacción específica entre CD4 y el antígeno de clase II con proteínas purificadas, en ciertas condiciones se puede demostrar adhesión entre células que expresan CD4 y células que expresan moléculas de clase II (Doyle et al., Nature, 330: 256-259 (1987); Clayton et al., J. Exp. Med., 172: 1243-1253 (1990); Lamarre et al., Science, 245: 743-746 (1989)). A continuación se examinó si podría detectarse destrucción entre células portadoras de clase II. La Fig. 6B muestra que no existe citólisis específica alguna dirigida por CD4:\zeta contra la línea de células Raji B, que expresa antígeno abundante de clase II. Aunque se observa una citólisis moderada (\approx 5%), un mutante negativo de clase II de Raji, RJ2.2.5 (Accolla, J. Exp. Med., 157: 1053-1058 (1983)) exhibe una susceptibilidad similar, como lo hacen las células Raji incubadas con células T no infectadas.

Ejemplo VIII Requerimientos de Secuencia para Inducción de Citólisis por la Cadena Zeta Antígeno de las Células T/Receptor Fc

Aunque las quimeras entre CD4 y \zeta pueden equipar los linfocitos T citotóxicos (CTL) para destruir las células diana que expresan gp120 de HIV, se buscó una alternativa a CD4 a fin de comparar inequívocamente las propiedades de las quimeras zeta introducidas en líneas de células T humanas. Dichas líneas pueden expresar CD4, lo cual hace que sea difícil definir específicamente la relación entre el tipo o grado de movilización del calcio y el potencial citotóxico de las diferentes quimeras. Para evitar esto, se crearon quimeras entre \zeta y CD16 en las cuales el dominio extracelular de CD16 está unido a las secuencias transmembranal e intracelular de \zeta (Fig. 7A). Las fusiones génicas se introdujeron en un plásmido de expresión del virus vaccinia que llevaba el gen gpt de E. coli como marcador seleccionable y se insertaron en el genoma de la cepa WR de vaccinia por recombinación homóloga y selección respecto a crecimiento en ácido micofenólico (Falkner y Moss, J. Virol. 62: 1849 (1988); Boyle y Coupar, Gene 65: 123
(1988)).

Se infectaron líneas de células T con los recombinantes vaccinia y se midió la concentración relativa de ion calcio citoplásmico libre después de reticulación de los dominios extracelulares con anticuerpos. Se realizaron medidas espectrofluorimétricas (población global) y por citometría de flujo (células individuales), con células cargadas con el colorante Indo-1 (Grynkiewicz et al., J. Biol. Chem. 260: 3440 (1985); Rabinovitch et al., J. Immunol. 137: 952 (1986)). La Figura 7B muestra un análisis de los datos recogidos de células de la línea de leucemia Jurkat de las células T humanas infectada con recombinantes vaccinia que expresan la proteína de fusión CD16:\zeta. La reticulación de las quimeras aumentaba de manera reproducible el calcio intracelular, mientras que un tratamiento similar de las células que expresaban CD16 no quimérico tenía poco o ningún efecto. Cuando la quimera se expresó en líneas de células mutantes que carecían del receptor antigénico, o bien REX33A (Breitmeyer et al., J. Immunol. 138: 726 (1987); Sancho et al., J. Biol. Chem. 264: 20760 (1989)) o el mutante Jurkat JRT3.T3.5 (Weiss et al., J. Immunol. 135: 123 (1984)); se observó una respuesta fuerte a la reticulación del anticuerpo CD16. Se han recogido datos similares en la línea de células mutantes REX20A (Breitmeyer et al., supra, 1987; Blumberg et al., J. Biol. Chem. 265: 14036 (1990)), y un mutante negativo CD3/Ti de la línea de células Jurkat establecida en este laboratorio. La infección con recombinantes que expresaban CD16:\zeta no restableció la respuesta al anticuerpo anti-CD3, lo que demostraba que la proteína de fusión no actuaba por rescate de cadenas complejas CD3 intracelulares.

Para evaluar la capacidad de las quimeras para redirigir la inmunidad mediada por las células, se infectaron CTLs con recombinantes vaccinia que expresaban quimeras CD16 y se utilizaron para lisar específicamente células de hibridoma que expresaban anticuerpos anti-CD16 fijados a la membrana. Este ensayo es una extensión de un ensayo de citotoxicidad de hibridomas desarrollado originalmente para analizar mecanismos efectores de células que llevan receptores Fc (Graziano y Fanger, J. Immunol. 138: 945, 1987; Graziano y Fanger, J. Immunol. 139: 35-36 (1987); Shen et al., Mol. Immunol. 26: 959, 1989; Fanger et al., Immunol. Today, 10: 92, 1989). La Fig. 8B muestra que la expresión de CD16:\zeta en linfocitos T citotóxicos permite que los CTL armados construyan las células de hibridoma 3G8 (anti-CD16; Fleit et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 3275, 1982), mientras que los CTL que expresan la forma de CD16 enlazada a fosfatidilinositol son inactivos. Los CTL armados con CD16:\zeta no destruyen tampoco las células de hibridoma que expresan un anticuerpo irrelevante.

Para identificar las secuencias \zeta mínimas necesarias para la citólisis, se prepararon una serie de mutantes de deleción en los cuales se eliminó sucesivamente del término carboxilo una proporción mayor del dominio \zeta intracelular (Fig. 8A). La mayor parte del dominio intracelular de zeta podía eliminarse con poca consecuencia para el potencial citolítico; la quimera CD16:\zeta de longitud total era esencialmente igual en eficacia a la quimera delecionada hasta el residuo 65, CD16:\zetaAsp66* (Fig. 8B). Se observó una disminución sustancial en la citotoxicidad después de deleción hasta el residuo 59 de \zeta (quimera CD16:\zetaGlu60*), y una deleción ulterior hasta el residuo 50 dio como resultado una actividad ligeramente menor. Sin embargo, no se observó la pérdida completa de actividad aun cuando el dominio intracelular se redujo hasta un ancla transmembranal de tres residuos (Fig. 8B).

Dado que \zeta es un dímero enlazado por disulfuro, una explicación para la retención de la actividad citolítica era que el \zeta endógeno se encontraba en forma de heterodímeros con la deleción quimérica de \zeta, reconstituyendo con ello la actividad. Para comprobar esta idea, los residuos 11 y 15 de \zeta se cambiaron de Asp y Cys respectivamente a Gly (Cys11Gly/Asp15Gly), y se realizaron inmunoprecipitaciones como sigue. Se infectaron aproximadamente 2 x 10^{6} células CV1 durante una hora en medio DME exento de suero con vaccinia recombinante a una multiplicidad de infección (moi) de al menos diez. Seis a ocho horas después de la infección, las células se desprendieron de las placas con PBS/EDTA 1 mM y se marcaron superficialmente con 0,2 mCi de ^{125}I por 2 x 10^{6} células utilizando lactoperoxidasa y H_{2}O_{2} por el método de Clark y Einfeld (Leukocyte Typing II, pp. 155-167, Springer-Verlag, NY, 1986). Las células marcadas se recogieron por centrifugación y se lisaron en 1% NP-40, 0,1% SDS, NaCl 0,15 M, Tris 0,05 M, pH 8,0, MgCl_{2} 5 mM, KCl 5 mM, yodoacetamida 0,2 M y PMSF 1 mM. Se separaron los núcleos por centrifugación, y las proteínas CD16 se inmunoprecipitaron con anticuerpo 3G8 (Fleit et al., supra, 1982; Medarex) e IgG-agarosa anti-ratón (Cappel, Durham, NC). Las muestras se sometieron a electroforesis a través de un gel poliacrilamida/SDS al 8% en condiciones no reductoras o a través de un gel al 10% en condiciones reductoras. Estas inmunoprecipitaciones confirmaron que la quimera CD16:\zetaCys11Gly/Asp15Gly no se asociaba en estructuras dímeras enlazadas por disulfuro.

Se ensayó también la actividad citolítica de los receptores mutantes. La quimera mutada delecionada hasta el residuo 65 (CD16:\zetaCis11Gly/Asp15Gly/Asp66*) era, dependiendo de las condiciones de ensayo, de dos a ocho veces menos activa en el ensayo de citólisis que la quimera comparable sin mutación (CD16:\zetaAsp66*), que estaba usualmente dentro de un factor de dos de CD16:\zeta, o era indiferenciable en actividad de ésta (Fig. 9B). La reducción en actividad de las quimeras mutantes es comparable a la reducción observada con quimeras CD4 de estructura similar (véase anteriormente) y es atribuible muy probablemente a la menor eficiencia de los monómeros \zeta comparados con los dímeros. En contraste, la quimera mutada Asp^{-}, Cys^{-} delecionada hasta el residuo 59 no tenía actividad citolítica alguna (Fig. 9B), lo que soporta la hipótesis de que la asociación con otras cadenas mediada por los residuos transmembranales Cys y/o Asp era responsable de la débil persistencia de la actividad citolítica en deleciones más próximas al terminal amino que el residuo 65.

Estudios de citometría de flujo demostraron que los mutantes de deleción que carecían de los residuos transmembranales Asp y Cys podrían promover todavía un aumento en el ion calcio intracelular libre en respuesta a la reticulación de los anticuerpos en una línea de células Jurkat mutante TCR^{-} (Fig. 9D). Se obtuvieron resultados similares para quimeras expresadas en la línea de células Jurkat parental. En el caso de CD16:\zetaCys11Gly/Asp15Gly/Glu60*, estos datos demuestran que la capacidad para mediar la sensibilidad al calcio puede estar separada por mutación de la capacidad para soportar la citólisis.

Para eliminar definitivamente la posible contribución de los residuos \zeta transmembranales, se reemplazaron los residuos transmembranales y los primeros 17 residuos citoplásmicos de \zeta por secuencias codificantes de los residuos que atraviesan la membrana y los primeros 14 o los primeros 17 residuos citoplásmicos de los antígenos CD5 o CD7, respectivamente (Fig. 9A). Las proteínas de fusión tripartitas resultantes CD16:5:\zeta (48-65) y CD16:7:\zeta (48:65) no formaban dímeros enlazados por disulfuro como lo hacían las quimeras más simples CD16:\zeta, debido a que carecían del residuo cisteína en el dominio transmembranal \zeta. Ambas quimeras tripartitas eran capaces de movilizar calcio en líneas de células Jurkat y TCR negativas (Fig. 9D) y de establecer una respuesta citolítica en CTL (Fig. 9C y datos no presentados). Sin embargo, la truncación de la porción \zeta hasta el residuo 59 en la quimera CD16:7:\zeta (48-59) anula la capacidad de la fusión tripartita para dirigir la respuesta al calcio en células Jurkat TCR positivas o negativas o la citólisis en CTL maduros (Fig. 9C y 9D y datos no presentados).

Para examinar las contribuciones de residuos individuales dentro del motivo de 18 residuos, se prepararon cierto número de variantes mutantes por mutagénesis orientada, y se evaluó su capacidad para mediar la destrucción dirigida por receptores en condiciones de baja (Figs. 10A y 10B) o alta (Figs. 10B y 10E) expresión del receptor quimérico. Las Figs. 10A-F muestran que, si bien cierto número de sustituciones relativamente conservadoras (es decir, de reemplazamiento de residuos ácidos con sus amidas cognadas, o de tirosina con fenilalanina) que abarcaban los residuos 59 a 63 producían un compromiso moderado de la eficacia citolítica, en general las variantes retenían la capacidad para movilizar el calcio. Sin embargo, colectivamente estos residuos comprenden un submotivo importante, dado que su deleción elimina la actividad citolítica. La conversión de Tyr 62 en Phe o Ser eliminaba tanto la respuesta citotóxica como las respuestas al calcio. En el término amino del segmento de 18 residuos, el reemplazamiento de Tyr 51 con Phe anulaba tanto la movilización del calcio como la actividad citolítica, mientras que la sustitución de Leu con Ser en la posición 50 eliminaba la respuesta al calcio si bien empeoraba sólo parcialmente la citólisis. Sin quedar ligados por una hipótesis particular, se sospecha que la incapacidad del mutante Leu50Ser para movilizar el calcio en ensayos de citometría de flujo a corto plazo no refleja plenamente su capacidad para mediar un aumento sustancial en el ion calcio intracelular libre durante el periodo de tiempo más largo del ensayo de citólisis. Sin embargo, se ha comunicado una actividad citolítica insensible al calcio para algunas líneas de células T citolíticas, y no se ha descartado la posibilidad de que un fenómeno similar sustente los resultados aquí descritos. El reemplazamiento de Asn48 con Ser deterioraba parcialmente la citotoxicidad en algunos experimentos, mientras que tenía poco efecto en otros.

Para investigar el papel potencial de elementos de secuencia redundantes, se dividió el dominio intracelular de \zeta en tres segmentos, que abarcaban los residuos 33 a 65, 71 a 104, y 104 a 138. Cada uno de estos segmentos se unió a una quimera CD16:CD7 por medio de un sitio MluI introducido en posición inmediatamente distal a las secuencias básicas de anclaje de la membrana del dominio intracelular de CD7 (véase más adelante; Fig. 11A). La comparación de la eficacia citolítica de los tres elementos mostró que los mismos eran esencialmente equipotentes (Fig. 11B). La comparación de secuencias (Fig. 11A) muestra que el segundo motivo lleva once residuos entre tirosinas, mientras que los motivos primero y tercero llevan diez.

Aunque no se ha presentado una explicación precisa del proceso de activación de las células T, está claro que la agregación del receptor antigénico, o de quimeras receptoras que llevan secuencias \zeta intracelulares, desencadena la movilización del calcio, la liberación de citoquinas y gránulos, y la aparición de marcadores de activación de la superficie celular. El sitio activo de \zeta, una secuencia peptídica lineal corta probablemente demasiado pequeña para tener actividad enzimática inherente, interacciona probablemente con una o como máximo con un pequeño número de proteínas para mediar la activación celular. Está claro también que la movilización del calcio libre no es por sí misma suficiente para la activación celular, dado que la capacidad para mediar la citólisis puede segregarse por mutación de la capacidad para mediar la acumulación de calcio.

Como se muestra en esta memoria, la adición de 18 residuos del dominio intracelular de \zeta al dominio transmembranal e intracelular de dos proteínas no afines permite que las quimeras resultantes redireccionen la actividad citolítica contra las células diana que se fijan a la porción extracelular de las proteínas de fusión. Aunque las quimeras que llevan el motivo de 18 residuos son aproximadamente ocho veces menos activas que las quimeras basadas en \zeta de longitud total, la actividad reducida puede atribuirse a la pérdida de interacciones transmembranales que permiten normalmente que \zeta de tipo salvaje forme dímeros enlazados por disulfuro. Es decir, las construcciones de deleción de \zeta que tienen el mismo término carboxilo que el motivo y carecen de los residuos transmembranales Cys y Asp exhiben típicamente una actividad ligeramente menor que las quimeras que llevan solamente el motivo de 18 residuos.

El elemento de competencia citolítica sobre el cual han enfocado su atención los autores de la invención tiene dos tirosinas y carece de serinas o treoninas, lo que restringe las posibles contribuciones de la fosforilación a la actividad. La mutación de cualquier tirosina destruye la actividad, sin embargo, y aunque experimentos preliminares no apuntan a una fosforilación sustancial de la tirosina después de la reticulación de los antígenos quiméricos de superficie que llevan el motivo de 18 residuos, no puede excluirse la posible participación de dicha fosforilación a un nivel bajo. Además de los efectos observados en los dos residuos tirosina, cierto número de reemplazamientos de aminoácidos en los términos amino y carboxilo del motivo debilitan la actividad en condiciones de baja densidad de receptores.

Secuencias similares al motivo \zeta activo pueden encontrarse en los dominios citoplásmicos de varias otras proteínas transmembranales, con inclusión de las moléculas CD3 \delta y \gamma, las proteínas asociadas a IgM de la superficie mb1 y B29, y las cadenas \beta y \gamma del receptor de IgE de afinidad alta, Fc\varepsilonRI (Reth, Nature 338: 383, 1989). Aunque la función de estas secuencias no se conoce con certeza, si se expresan eficientemente, cada una de ellas puede ser capaz de activación autónoma de las células T, y dicha actividad puede explicar la sensibilidad residual de TCR observada en una línea de células mutantes zeta-negativa (Sussman et al., Cell 52: 85, 1988).

\zeta lleva en sí mismo tres secuencias de este tipo, espaciadas de modo aproximadamente igual, y una trisección grosera del dominio intracelular muestra que cada una de ellas es capaz de iniciar una respuesta citolítica. \eta, una isoforma de corte y empalme de \zeta (Jin et al., supra, 1990; Clayton et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 88: 5202, 1991), carece de la mitad carboxilo del tercer motivo. Dado que la eliminación de la mitad carboxilo del primer motivo anula la actividad, parece probable que la mayor parte de la eficacia biológica de \eta pueda atribuirse a los dos primeros motivos. Aunque por diferentes medidas \eta es tan activo como \zeta en lo que respecta a promover la liberación de citoquinas mediada por antígeno (Bauer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 3842, 1991) o la citólisis redirigida (véase anteriormente), \eta no se fosforila en respuesta a la estimulación de receptores (Bauer et al., supra, 1991). Así, o bien se requiere la presencia de los tres motivos para la fosforilación, o el tercer motivo representa un sustrato favorecido para una tirosina-quinasa no identificada.

Ejemplo IX Transducción de Señales Citolíticas por el Receptor Fc Humano

Para evaluar las acciones de diferentes subtipos de receptor Fc humano, se crearon moléculas quiméricas en las cuales el dominio extracelular de los antígenos CD4, CD5 o CD16 humanos estaba unido a los dominios transmembranal e intracelular de los subtipos FcRII\gammaA, B1, B2, y C (nomenclatura de Ravetch y Kinet, Ann. Rev. Immunol. 9: 457, 1991). Específicamente, secuencias de cDNA correspondientes a los dominios transmembranales y citoplásmicos de las isoformas FcRIIA, B1, y B2 descritas previamente se multiplicaron a partir del clon PC23 preexistente o de una genoteca de cDNA de amígdalas humanas (construida por técnicas estándar) utilizando los cebadores oligonucleotídicos sintéticos siguientes:

CCC GGA TCC CAG CAT GGG CAG CTC TT (SEQ ID No. 18; FcRII A directo);

CGC GGG GCG GCC GCT TTA GTT ATT ACT GTT GAC ATG GTC GTT (SEQ ID NO:19; FcRII A inverso);

GCG GGG GGA TCC CAC TGT CCA AGC TCC CAG CTC TTC ACC G (SEQ ID NO:20; FcRII B1 y FcRII B2 directo); y

GCG GGG GCG GCC GCC TAA ATA CGG TTC TGG TC (SEQ ID NO:21; FcRII B1 y FcRII B2 inverso).

Estos iniciadores contenían sitios de escisión para las enzimas BamHI y NotI, respectivamente, indentadas seis residuos desde el extremo 5'. El sitio NotI estaba seguido inmediatamente por un codón de parada antisentido, CTA o TTA. Todos los iniciadores contenían 18 o más residuos complementarios a los extremos 5' y 3' de los fragmentos deseados. El fragmento de cDNA correspondiente al dominio citoplásmico FcRII\gammaC, que difiere de la isoforma IIA en un solo residuo de aminoácido (L en lugar de P en el residuo 268) se generó por mutagénesis orientada mediante PCR con solapamiento utilizando iniciadores de secuencia:

TCA GAA AGA GAC AAC CTG AAG AAA CCA ACA A (SEQ ID No:. 22) y

TTG TTG GTT TCT TCA GGT TGT GTC TTT CTG A (SEQ ID NO:23).

Los fragmentos PCR se insertaron en vectores de expresión de virus vaccinia que contenían los dominios extracelulares CD16 o CD4 respectivamente y se insertaron subsiguientemente en vaccinia de tipo salvaje por recombinación en el locus timidina-quinasa, utilizando selección para cointegración de E. coli gpt a fin de facilitar la identificación de los recombinantes deseados. Las identidades de todas las isoformas (mostradas en Fig. 12) se confirmaron por secuenciación didesoxi.

La producción de las proteínas receptoras quiméricas se confirmó ulteriormente por estudios de inmunoprecipitación. Se infectaron aproximadamente 10^{7} células JRT3.T3.5 durante una hora en medio IMDM exento de suero con vaccinia recombinante a una multiplicidad de infección de al menos diez. Doce horas después de la infección, se cosecharon las células y se marcaron en superficie con 0,5 mCi de ^{125}I por 10^{7} células utilizando el método de lactoperoxidasa/glucosa-oxidasa (Clark y Einfeld, supra). Las células marcadas se recogieron por centrifugación y se lisaron con NP-40 al 1%, MgCl_{2} 0,1 mM, KCl 5 mM, yodoacetamida 0,2 M y PMSF 1 mM. Se separaron los núcleos por centrifugación, y las proteínas de fusión de CD16 se inmunoprecipitaron con anticuerpo 4G8 e IgG-agarosa anti-ratón. Las muestras se sometieron a electroforesis en condiciones reductoras. Todas las moléculas receptoras quiméricas inmunoprecipitadas tenían las masas moleculares esperadas.

Para ensayar la capacidad de los receptores quiméricos para mediar un aumento en el ion calcio citoplásmico libre, se utilizaron los virus recombinantes para infectar la línea de células Jurkat mutante TCR^{-}, JRT3.T3.5 (como se describe en esta memoria) y se midió el calcio citoplásmico libre en las células (como se describe en esta memoria) después de reticulación de los dominios extracelulares del receptor con anticuerpo monoclonal 3G8 o Leu-3A (como se describe en esta memoria). Estos experimentos revelaron que los dominios intracelulares de FcR\gammaII A y C eran capaces de mediar un aumento en el ion calcio citoplásmico libre después de reticulación de los dominios extracelulares, mientras que los dominios intracelulares de FcR\gammaII B1 y B2 eran inactivos en condiciones comparables (Fig. 13A y 13B). Los híbridos CD4, CD5 y CD16 de FcR\gammaII A compartían una capacidad esencialmente igual para promover la respuesta de calcio (Figs. 13A-B). Otras líneas de células, de linajes tanto monocíticos como linfocíticos, eran capaces de responder a la señal iniciada por reticulación de los dominios extracelulares.

Para explorar la implicación de los diferentes dominios intracelulares de FcR\gammaII en la citólisis, se infectaron linfocitos T citotóxicos (CTL) humanos con recombinantes vaccinia que expresaban las quimeras CD16:FcR\gammaII A, B1, B2 y C. Las células infectadas se cocultivaron luego con células de hibridoma cargadas con ^{51}Cr (a saber, células 3G8 10-2) que expresaban el anticuerpo de la superficie celular para CD16. En este ensayo, los CTLs portadores de la quimera CD16 destruían las células diana de hibridoma (permitiendo la liberación de ^{51}Cr libre) si el dominio extracelular CD16 de la quimera se ha unido a un segmento intracelular capaz de activar el programa efector de los linfocitos; este ensayo de citólisis se describe en detalle más adelante. La Fig. 14A muestra que los CTL armados con CD16:FcR\gammaIIA y C, pero no FcR\gammaII B1 o B2, son capaces de lisar las células diana que expresan el anticuerpo de la superficie celular anti-CD16.

Para eliminar la posibilidad de que la citólisis específica fuese atribuible en cierto grado a interacción con el resto CD16, se realizaron experimentos de citólisis en los cuales los dominios intracelulares de FcRII estaban unidos a un dominio extracelular de CD4. En este caso, las células diana eran células HeLa que expresaban las proteínas gp120/41 de la envoltura de HIV (específicamente, células HeLa infectadas con el vector vaccinia vPE16 (disponible del National Institute of Allergy and Infections Disease AIDS Depository, Bethesda, MD). Como en el sistema CD16, las células diana que expresaban la envoltura de HIV eran sensibles a la lisis por las células T que expresaban la quimera CD4:FcR\gammaII A, pero no FcR\gammaII B1 o B2 (Fig. 14B).

Los dominios intracelulares de FcR\gammaII A y C no comparten homología de secuencia apreciable alguna con cualquier otra proteína, con inclusión de los miembros de la familia extensa FcR\gamma/TCR\zeta. Para definir los elementos de secuencia responsables de la inducción de la citólisis, se prepararon deleciones 5' y 3' de las secuencias codificantes del dominio intracelular (descritas más adelante y representadas en Fig. 15A) y se evaluaron en lo referente a eficacia en ensayos de movilización de calcio y citólisis (como se describe en esta memoria). En los experimentos en que se eliminó la porción del terminal amino del dominio intracelular, el dominio transmembranal de FcR\gammaII se reemplazó con el dominio transmembranal del antígeno CD7 no afín para eliminar la posible contribución de las interacciones mediadas por el dominio que atraviesa la membrana.

Las Figs. 15B y 15C muestran que la eliminación de los 14 residuos del terminal carboxilo, con inclusión de la tirosina 298, daba como resultado la pérdida completa de la capacidad citolítica y una reducción sustancial en el potencial de movilización del calcio. Una deleción ulterior hasta justamente antes de la tirosina 282 dio un fenotipo idéntico (Figs. 15B y 15C). La deleción del término N del dominio intracelular hasta el residuo 268 no tenía efecto sustancial alguno en el perfil de calcio ni en la potencia citolítica, mientras que la deleción hasta el residuo 275 empeoraba notablemente el desprendimiento de calcio libre pero tenía poco efecto sobre la citólisis (Figs. 15D y 15E). Una deleción ulterior, hasta el residuo 282, daba colas FcR\gammaII que carecían de la capacidad para movilizar el calcio o para desencadenar la citólisis (Figs. 15D y 15E). El "elemento activo" definido por estas medidas groseras es relativamente grande (36 aminoácidos) y contiene dos tirosinas separadas por 16 residuos.

Ejemplo X Proteínas Adicionales Desencadenantes del Receptor de las Células T y del Receptor de las Células B

Otros dominios transductores de señales intracelulares y transmembranales de acuerdo con la invención pueden derivarse de las proteínas receptoras de las células T, CD3 delta y T3 gamma, y de las proteínas receptoras de las células B, mb1 y B29. Las secuencias de aminoácidos de estas proteínas se muestran en Fig. 16 (CD delta; SEQ ID NO:24), Fig. 17 (T3 gamma; SEQ ID NO:25), Fig. 18 (mb1; SEQ ID NO:26) y Fig 19 (B29; SEQ ID NO:27). Las porciones de las secuencias suficientes para la transducción de señales citolíticas (y por consiguiente incluidas preferiblemente en un receptor quimérico de la invención) se muestran entre corchetes. Receptores quiméricos que incluyen estos dominios proteínicos se construyen y se utilizan en los métodos terapéuticos de la invención generalmente como se ha descrito arriba.

Ejemplo XI Receptores Quiméricos CD28

Dado que se ha demostrado que la activación de las células T aumenta por intervención de CD28, la invención incluye también células terapéuticas que expresan pares de receptores quiméricos: la primera quimera incluye el dominio intracelular de CD28, y la segunda quimera incluye cualquier dominio de transducción de señales intracelular o transmembranal descrito en esta memoria. En un par de receptores quiméricos dado, los dominios extracelulares pueden ser idénticos (por ejemplo, ambos pueden derivarse de la proteína CD4 y reconocer por tanto ambos HIV o una célula infectada por HIV), o cada uno de ellos puede estar diseñado para reconocer una molécula diana diferente en la superficie de una célula o un patógeno.

En un ejemplo particular, un par de quimeras puede incluir dos dominios extracelulares diferentes, cada uno de los cuales reconoce un antígeno distinto característico de un tumor considerado como diana. Ejemplos de antígenos tumorales incluyen, sin limitación, cualquiera de cierto número de carbohidratos (v.g. Le^{Y}, sialil-Le^{Y}, Le^{x}, y sialil-Le^{x}), antígeno carcinoembrionario, CD40, CD44 modificado, \alpha-fetoproteína, los antígenos T y Tn, tenascina, y receptores de factores de crecimiento (v.g., HER2/neu). Al aumentar el número de marcadores de la superficie tumoral que tienen que ser reconocidos para provocar una respuesta destructora potente, este enfoque aumenta la especificidad terapéutica por disminución de la probabilidad y frecuencia de destrucción de las células no cancerosas.

Este método de control combinatorio puede extenderse a cualquier número de receptores quiméricos cooperantes y puede utilizarse para regular cualquier método terapéutico de la invención.

Las quimeras CD28 se construyen y expresan de acuerdo con los métodos descritos en esta memoria. La secuencia CD28 se proporciona en Aruffo y Seed (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:8573-8577 (1987)). Se incluyen también en esta referencia descripciones de los dominios intracelular y transmembranal de CD28. Un ejemplo de una quimera que lleva un dominio intracelular de CD28 se expone en Romeo et al. (Cold. Spring. Harbor Symp. on Quant. Biol. LVII: 117-125 (1992)).

Ejemplo XII Métodos experimentales Infección con Vaccinia y Radioinmunoprecipitación

Se infectaron aproximadamente 5 x 10^{6} células CV1 durante una hora en medio DME exento de suero con vaccinia recombinante a una multiplicidad de infección (moi) de al menos diez (título medido en células CV1). Las células se pusieron en medio de nuevo aporte después de la infección y se marcaron metabólicamente con 200 \muCi/ml de ^{35}S-metionina más cisteína (marcador Tran^{35}S, ICN; Costo Mesa, CA) en DMEM exento de metionina y cisteína (Gibco; Grand Island, NY) durante seis horas. Las células marcadas se desprendieron con PBS que contenía EDTA 1 mM, se recogieron por centrifugación, y se lisaron en NP-40 al 1%, SDS al 0,1%, NaCl 0,15 M, Tris 0,05 M de pH 8,0, EDTA 5 mM, y PMSF 1 mM. Se separaron los núcleos por centrifugación, y las proteínas CD4 se inmunoprecipitaron con anticuerpo OKT4 e IgG-agarosa anti-ratón (Cappel, Durham, NC). Las muestras se sometieron a electroforesis a través de geles de poliacrilamida/SDS al 8% en condiciones no reductoras (NR) y reductoras (R). Los geles que contenían muestras marcadas con ^{35}S se impregnaron con En^{3}Hance (New England Nuclear, Boston, MA) antes de la autorradiografía. La expresión facilitada de la forma transmembranal de CD16, CD16_{TM}, se midió por comparación de su expresión en células CV1 infectadas exclusivamente con CD16_{TM} con la expresión en células coinfectadas con virus codificantes de CD16_{TM} y quimeras \zeta o \gamma. Después de infección e incubación durante seis horas o más, las células se desprendieron de las placas con PBS y EDTA 1 mM y la expresión de CD16TM o de las quimeras se midió por inmunofluorescencia indirecta y citometría de flujo.

Ensayo de Flujo de Calcio

Células Jurkat de la sublínea E6 (Weiss et al., J. Immunol., 133: 123-128 (1984)) se infectaron con virus vaccinia recombinantes durante una hora en IMDM exento de suero a una moi de 10 y se incubaron durante tres a nueve horas en IMDM, y FBS al 10%. Las células se recogieron por centrifugación y se resuspendieron a 3 x 10^{6} células/ml en medio completo que contenía Indo-1-acetometoxiéster 1 mM (Grynkiewicz et al., J. Biol. Chem., 260: 3340-3450 (1985)) (Molecular Probes) y se incubaron a 37ºC durante 45 minutos. Las células cargadas con Indo-1 se redujeron a un sedimento y se resuspendieron a 1 x 10^{6}/ml en IMDM exento de suero y se guardaron a la temperatura ambiente en la oscuridad. Las células se analizaron en cuanto a ion calcio libre por medida simultánea de la emisión de fluorescencia violeta y azul por citometría de flujo (Rabinovitch et al., J. Immunol., 137: 952-961 (1986)). Para iniciar el flujo de calcio, se añadió Leu-3A conjugada con ficoeritrina (PE) (anti-CD4) (Becton Dickinson, Lincoln Park, NJ) a 1 \mug/ml a la suspensión de células, seguido por 10 \mug/ml de IgG de cabra anti-ratón no conjugada en el tiempo 0 o anticuerpo monoclonal 3G8 no conjugado (anti-CD16) a la suspensión de células a 1 \mug/ml seguido por 10 \mug/ml de IgG Fab_{2}' de cabra anti-ratón conjugada con PE en el tiempo 0. Se recogieron histogramas de la relación de emisión violeta/azul a partir de la población de células PE positivas (infectadas), que representaba típicamente 40-80% de todas las células. La respuesta al receptor de antígeno de las células T en las células no infectadas era desencadenada por el anticuerpo OKT3, sin reticulación. Para los experimentos que implicaban receptores quiméricos de CD16, se excluyeron del análisis las muestras que presentaban desviación de la línea base hacia un contenido de calcio intracelular más bajo (sin anticuerpo). Los datos de los histogramas se analizaron subsiguientemente por conversión de los datos binarios a ASCII utilizando el soporte lógico Write Hand Man (Cooper City, FL), seguido por análisis con una colección de programas FORTRAN. La relación de emisiones violeta/azul antes de la adición de los reactivos del segundo anticuerpo se utilizó para establecer la relación normalizada inicial, se estableció igual a la unidad, y la relación umbral restante se estableció de tal modo que el 10% de la población restante excedería del
umbral.

Ensayo de citólisis

La línea de células T humana WH3, una línea citolítica CD8^{+} CD4^{-} HLA B44 restringida se mantuvo en IMDM, suero humano al 10% con 100 U/ml de IL-2 y se estimuló periódicamente de modo no específico con linfocitos de sangre periférica irradiados (3000 rad) no apareados en HLA y 1 \mug/ml de fitohemaglutinina, o específicamente, con células mononucleares portadoras de B44 irradiadas. Después de un día de estimulación inespecífica, se diluyó la PHA a 0,5 \mug/ml por adición de medio de nuevo aporte, y se cambió el medio al cabo de tres días. Las células se dejaron crecer durante al menos 10 días después de la estimulación antes de ser utilizadas en los ensayos de citotoxicidad. Se infectaron las células con vaccinia recombinante a una multiplicidad de infección de al menos 10 durante una hora en medio exento de suero, seguido por incubación en medio completo durante tres horas. Las células se recogieron por centrifugación y se resuspendieron a una densidad de 1 x 10^{7} células/ml. Se añadieron 100 \mul a cada pocillo de una placa de microtitulación con fondo en U que contenía 100 \mul/pocillo de medio completo. Las células se diluyeron en pasos seriados dobles. Dos pocillos para cada muestra no contenían linfocitos, a fin de permitir que se midieran la liberación espontánea de cromo y la absorción de cromo total. Las células diana, de la sublínea HeLa S3, se infectaron en placas de 6,0 ó 10,0 cm a una moi aproximada de 10 durante una hora en medio exento de suero, seguido por incubación en medio completo durante tres horas. Las células se desprendieron luego de las cápsulas con PBS, EDTA 1 mM y se sometieron a recuento. Una parte alícuota de 10^{6} células diana (células HeLa, Raji, o RJ2.2.5 para los experimentos con el receptor quimérico CD4 y células 3G8 10-2; Shen et al., Mol. Immunol. 26: 959 (1989) para los experimentos con el receptor quimérico CD16) se centrifugó y se resuspendió en 50 \mul de cromato de sodio ^{51}Cr estéril (1 mCi/ml, Dupont, Wilmington, DE) durante una hora a 37ºC con mezcla intermitente, después de lo cual se lavó tres veces con PBS. Se añadieron a cada pocillo 100 \mul de células marcadas resuspendidas en medio a 10^{5} células/ml. Las células diana Raji y RJ2.2.5 se marcaron de la misma manera que las células HeLa. La placa de microtitulación se centrifugó a 750 x g durante 1 minuto y se incubó durante 4 horas a 37ºC. Al final del periodo de incubación, las células contenidas en cada pocillo se resuspendieron por pipeteado suave, se separó una muestra para determinar los impulsos totales incorporados, y la placa de microtitulación de centrifugó a 750 x g durante 1 minuto. Se separaron partes alícuotas de 100 \mul del sobrenadante y se sometieron a recuento en un contador de centelleo de rayos gamma. El porcentaje de destrucción se corrigió por la fracción de células diana infectadas (usualmente 50-90%) medida por citometría de flujo. Para las células efectoras infectadas, la relación efector:diana se corrigió por el porcentaje de células infectadas (usualmente 20-50% para los experimentos con el receptor quimérico CD4 y > 70% para los experimentos con el receptor quimérico
CD16).

Mutagénesis in Vitro de la Secuencia \zeta

Para crear mutaciones puntuales en los residuos de aminoácidos 11 y/o 15 de la secuencia \zeta, se prepararon iniciadores oligonucleotídicos sintéticos que se extendían desde el sitio BamHI aguas arriba del dominio transmembranal \zeta, y que convertían el residuo 11 nativo \zeta de Cys en Gly (C11G) o el residuo 15 de Asp en Gly (D15G) o ambos (C11G/D15G) y se utilizaron en reacciones PCR para generar fragmentos mutados que se reinsertaron en las construcciones de tipo salvaje CD4:\zeta.

Para crear deleciones de \zeta, se amplificaron secuencias cDNA de \zeta por PCR utilizando iniciadores oligonucleotídicos sintéticos diseñados para crear un codón de parada (UAG) después de los residuos 50, 59, o 65. Los iniciadores contenían el sitio de escisión para la enzima NotI indentado a cinco o seis residuos de distancia del extremo 5', usualmente en una secuencia de la forma CGC GGG CGG CCG CTA (SEQ ID No.: 11), donde los tres últimos residuos corresponden al anticodón de parada. Las secuencias NotI y anticodón de parada iban seguidas por 18 o más residuos complementarios para el extremo 3' deseado del fragmento. Las quimeras resultantes se designaron CD16:\zetaY51*, CD16:\zetaE60* y CD16:\zetaD66*, respectivamente. El sitio BamHI aguas arriba del dominio transmembranal y el sitio NotI se utilizaron para generar fragmentos que se reintrodujeron en la construcción de tipo salvaje CD16:\zeta. Se crearon quimeras monómeras \zeta por liberación de las secuencias intracelulares \zeta transmembranal y membranal proximales por digestión con BamHI y SacI de la construcción Asp^{-} y Cys^{-} CD4:\zeta descrita anteriormente e inserción del fragmento en la construcción CD16:\zetaE60* y CD16:\zetaD66*, respectivamente.

Construcción de las Quimeras Tripartitas CD16:7:\zeta (48-65) y CD16:7:\zeta (48-59)

Para preparar la construcción CD16:\zetaD66*, la secuencia de cDNA \zeta correspondiente al dominio transmembranal y los 17 residuos siguientes del dominio citoplásmico se reemplazó por un dominio transmembranal y citoplásmico correspondiente obtenido a partir del cDNA de CD5 y CD7. Los fragmentos CD5 y CD7 se generaron por una reacción PCR utilizando oligonucleótidos directos que incluían un sitio de escisión por restricción con BamHI y correspondientes a la región situada inmediatamente aguas arriba del dominio transmembranal de CD5 y CD7 respectivamente y los oligonucleótidos inversos siguientes que se solapaban con las secuencias CD5 y CD7 respectivamente y la secuencia \zeta que contenía el sitio de escisión por restricción con Sac-I.

CD5:\zeta: CGC GGG CTC GTT ATA GAG CTG GTT CTG GCG CTG CTT CTT CTG (SEQ ID NO:12)

CD7:\zeta: CGC GGG GAG CTC GTT ATA GAG CTG GTT TGC CGC CGA ATT CTT ATC CCG (SEQ ID NO:13).

Los productos PCR de CD5 y CD7 se digirieron con BamHI y SacI y se ligaron a CD16:\zetaE60* digerido con BamHI y SacI y reemplazando la secuencia \zeta desde Bam-HI a SacI por el fragmento CD7. Para generar las construcciones CD16:CD5 y CD16:CD7, se obtuvieron fragmentos CD5 y CD7 por PCR utilizando un oligonucleótido que contenía un sitio de escisión por restricción con NotI y que codificaba un codón de parada (UAA) después del residuo Gln416 y Ala193 de CD5 y CD7 respectivamente. Los fragmentos PCR de CD5 y CD7 se digirieron con BamHI y NotI y se insertaron en la construcción CD16:\zetaAsp66*.

Mutagénesis in Vitro de los Residuos N-Terminales dentro del Motivo \zeta Citolítico de Transducción de Señales

Se sintetizaron Iniciadores oligonucleotídicos sintéticos que se extendían desde el sitio SacI dentro del motivo \zeta y que convertían el residuo nativo 48 de Asn en Ser (N48S), el residuo 50 de Leu en Ser (L50S) y el residuo 51 de Tyr en Phe (Y51F), y se utilizaron en una reacción PCR para generar fragmentos que se reintrodujeron en la construcción de tipo salvaje CD16:7:\zeta (48-65).

Mutagénesis in Vitro de los Residuos C-Terminales dentro del Motivo \zeta Citolítico de Transducción de Señales

Se sintetizaron Iniciadores oligonucleotídicos sintéticos que se extendían desde el sitio NotI 3' al codón de parada y que convertían el residuo nativo 60 de Glu en Gln (E60Q), el residuo 61 de Glu en Gln (E61Q), el residuo 62 de Tyr en Phe o Ser (Y62F o Y62S) y el residuo 63 de Asp en Asn (D63N), y se utilizaron en PCR para generar fragmentos que se subclonaron en la construcción de tipo salvaje CD16:\zetaD66* desde el sitio BamHI al sitio
NotI.

Construcciones Quimera CD16:7:\zeta (33-65), CD16:7:\zeta (71-104) y CD16:7:\zeta (104-137)

Se obtuvo por PCR un fragmento transmembranal CD7 que llevaba sitios MluI y NotI en la unión entre los dominios transmembranal e intracelular utilizando un oligonucleótido con la secuencia siguiente: CGC GGG GCG GCC ACG CGT CCT CGC CAG CAC ACA (SEQ ID NO:14). El fragmento PCR resultante se digirió con BamHI y NotI y se reinsertó en la construcción CD16:7:\zeta (48-65). Se obtuvieron fragmentos \zeta codificantes de los residuos 33 a 65, 71 a 104, y 104 a 137 por reacción PCR utilizando pares de iniciadores que contenían sitios MluI en el extremo 5' de los iniciadores directos y codones de parada seguidos por sitios NotI en el extremo 5' de los iniciadores inversos. En cada caso, los sitios de restricción se indentaron a seis residuos de distancia del término 5' del iniciador para asegurar la escisión por la enzima de restricción.

\zeta 33: CGC GGG ACG CGT TTC AGC CGT CCT CGC CAG CAC ACA (SEQ ID NO:15);

\zeta 71: CGC GGG ACG CGT GAC CCT GAG ATG GGG GGA AAG (SEQ ID NO:16); y

\zeta 104: CGC GGG ACG CGT ATT GGG ATG AAA GGC GAG CGC (SEQ ID NO:17).

Construcción de Mutantes de Deleción FcR_{\gamma}IIA

Se construyeron mutantes de deleción FcRIIA del terminal carboxilo por PCR de la misma manera que para las construcciones de longitud total, convirtiendo las secuencias codificantes de tirosina en las posiciones 282 y 298 en codones de parada (TAA). Las deleciones N-terminales se generaron por amplificación de fragmentos que codificaban sucesivamente una proporción menor del dominio intracelular por PCR, utilizando oligonucleótidos que permitían que los fragmentos resultantes se reinsertaran entre los sitios de restricción MluI y NotI en un plásmido de expresión construido previamente que codificaba el dominio extracelular de CD16 fusionado al dominio transmembranal de CD7, terminando el último en un sitio MluI y la unión entre el dominio transmembranal y el dominio intracelular.

Otras realizaciones

Los ejemplos descritos anteriormente demuestran que la agregación de quimeras \zeta, \eta o \gamma es suficiente para iniciar la respuesta de las células efectoras citolíticas en las células T. La gama de expresión conocida de \zeta, \eta y \gamma, que incluye linfocitos T, células agresoras naturales, granulocitos basófilos, macrófagos y mastocitos, sugiere que motivos de secuencia conservados pueden interaccionar con un aparato sensorial común a las células de origen hematopoyético, y que un componente importante de la defensa del hospedador en el sistema inmunitario puede estar mediado por sucesos de agregación de receptores.

La potencia de la respuesta citolítica y la ausencia de una respuesta a células diana portadoras de receptores del MHC de clase II demuestra que quimeras basadas en \zeta, \eta o \gamma constituyen la base de una intervención genética para el SIDA por inmunoterapia adoptiva. La amplia distribución de \zeta y \gamma endógenos y la evidencia de que los receptores Fc asociados con \gamma median citotoxicidad en diferentes tipos de células (Fanger et al., Immunol. Today, 10, 92-99 (1989)) permite que se consideren una diversidad de células para este propósito. Por ejemplo, los granulocitos neutrófilos, que tienen una duración de vida muy corta (\approx 4 h) en circulación y son intensamente citolíticos, son células diana atractivas para expresión de las quimeras. La infección de neutrófilos con HIV no da probablemente como resultado liberación de virus, y la abundancia de estas células (las más predominantes de los leucocitos) debería facilitar la defensa del hospedador. Otra posibilidad atractiva para células hospedadoras son células T maduras, una población actualmente accesible al diseño de retrovirus (Rosenberg, Sci. Am., 262: 62-69 (1990)). Con la ayuda de IL-2 recombinante, las poblaciones de células T pueden expandirse en cultivo con relativa facilidad, y las poblaciones expandidas tienen típicamente una duración de vida limitada una vez reinfundidas (Rosenberg et al., N. Engl. J. Med., 323: 570-578 (1990)).

En las condiciones apropiadas, el reconocimiento de HIV por las células que expresan quimeras CD4 debería proporcionar también estímulos mitógenos, permitiendo la posibilidad de que la población de células armadas pudiera responder dinámicamente a la carga vírica. Aunque los autores de la presente invención han enfocado su atención en este trabajo en el comportamiento de las proteínas de fusión en los linfocitos T citolíticos, la expresión de las quimeras en linfocitos adyuvantes podría proporcionar una fuente de citoquinas movilizadas por HIV que podrían contrarrestar el colapso del subconjunto de células adyuvantes en el SIDA. La descripción reciente de varios esquemas para diseñar resistencia a la infección en pasos diferentes de la penetración del virus (Friedman et al., Nature, 335: 452-454 (1988); Green et al., Cell 58: 215-223 (1989); Malim et al., Cell, 58: 205-214 (1989); Trono et al., Cell, 59: 113-120 (1989); Buonocore et al., Nature, 345: 625-628 (1990)) sugiere que podrían diseñarse células portadoras de quimeras CD4 para impedir la producción de virus por expresión de agentes apropiados que tengan un sitio de acción intracelular.

La capacidad para transmitir señales a los linfocitos T por quimeras autónomas proporciona también la posibilidad de la regulación de linfocitos diseñados retrovíricamente in vivo. Los estímulos de reticulación, mediados por ejemplo por anticuerpos IgM específicos diseñados para eliminar dominios de fijación del complemento, pueden permitir que tales linfocitos aumenten en número in situ, mientras que el tratamiento con anticuerpos IgG específicos similares (por ejemplo reconocimiento de una variación de aminoácido diseñada en la cadena quimérica) podría empobrecer selectivamente la población diseñada. Adicionalmente, los anticuerpos IgM anti-CD4 no requieren reticulación adicional para movilizar el calcio en las células Jurkat que expresan quimeras CD4:\zeta. La capacidad para regular poblaciones de células sin recurrir a amplificación extracorpórea repetida puede ampliar sustancialmente la gama y la eficacia de los usos actuales propuestos para las células T diseñadas genéticamente.

Para crear otras quimeras constituidas por secuencias intracelulares \zeta, \eta o \gamma, secuencias de cDNA o genómicas codificantes de un dominio extracelular del receptor pueden dotarse de un sitio de restricción introducido en una localización que preceda inmediatamente al dominio transmembranal de elección. El fragmento del dominio extracelular que termina en el sitio de restricción puede unirse luego a secuencias \zeta, \eta o \gamma. Dominios extracelulares típicos pueden derivarse de receptores que reconocen el complemento, carbohidratos, proteínas víricas, bacterias, protozoos o metazoos parásitos, o proteínas inducidas por ellos. Análogamente, ligandos o receptores expresados por patógenos o células tumorales pueden unirse a secuencias \zeta, \eta o \gamma para dirigir las respuestas inmunitarias contra células portadoras de receptores que reconocen dichos ligandos.

Si bien la invención se ha descrito en relación con realizaciones específicas de la misma, se comprenderá que aquélla es susceptible de modificaciones adicionales, y esta solicitud tiene por objeto abarcar variaciones, usos, o adaptaciones de la invención y con inclusión de tales desviaciones de la presente descripción que formen parte de la técnica a la que se refiere la invención y que puedan ser aplicadas a las características esenciales expuestas anteriormente en esta memoria, indicadas como sigue en el alcance de las reivindicaciones adjuntas.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i): SOLICITANTES: Seed, Brian et al.

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(ii): TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Redirección de la Inmunidad Celular por Quimeras de Receptores

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(iii): NÚMERO DE SECUENCIAS: 40

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(iv): DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:

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(A): DESTINATARIO: Fish & Richardson P.C.

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(B): CALLE: 225 Franklin Street

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(C): CIUDAD: Boston

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(D): ESTADO: MA

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(E): PAÍS: Estados Unidos de América

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(F): CÓDIGO POSTAL: 02110-2804

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(v): FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:

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(A): TIPO DE MEDIO: disquete de 3,5'', 1,44 Mb

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(B): ORDENADOR: IMB PS/2 Modelo 50Z o 55SX

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(C): SISTEMA OPERATIVO: IBM P.C. DOS (Versión 3.30)

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(D): SOPORTE LÓGICO: Wordperfect (Versión 5.0)

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(vi): DATOS DE LA PRESENTE SOLICITUD:

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(A): NÚMERO DE SOLICITUD: PCT/US96/-----

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(B): FECHA DE PRESENTACIÓN: Con la presente memoria

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(vii): DATOS DE SOLICITUDES ANTERIORES:

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(A): NÚMERO DE SOLICITUD: 08/394.176

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(B): FECHA DE PRESENTACIÓN: 24 febrero 1995

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(viii): INFORMACIÓN DE PROCURADOR/AGENTE:

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(A): NOMBRE: Karen F. Lech, Ph. D

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(B): NÚMERO DE REGISTRO: 35.238

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(C): REFERENCIA/NÚMERO DE EXPEDIENTE: 00786/270001

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(ix): INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIONES:

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(A): TELÉFONO: (617) 542-5070

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(B): TELEFAX: (617) 542-8906

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(C): TÉLEX: 200154

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(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:1:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 1728 pares de bases

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(B): TIPO: ácido nucleico

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(C): CLASE DE CADENA: doble

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:1:

1

2

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(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:2:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 1389 pares de bases

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(B): TIPO: ácido nucleico

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(C): CLASE DE CADENA: doble

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:2:

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3

4

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(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:3:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 1599 pares de bases

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(B): TIPO: ácido nucleico

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(C): CLASE DE CADENA: doble

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(D): TOPOLOGÍA: lineal

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(ii): TIPO DE MOLÉCULA: DNA (génómico)

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(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:3:

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5

6

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(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:4:

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(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

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(A): LONGITUD: 575 aminoácidos

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(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:4:

\vskip1.000000\baselineskip

7

8

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 462 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:5:

9

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 532 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:6:

\vskip1.000000\baselineskip

10

11

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 33 bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:7:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGCGGGGTGA CCGTGCCCTC CAGCAGCTTG GGC

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 50 bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:8:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGCGGGGATC CGTCGTCCAG AGCCCGTCCA GCTCCCCGTC CTGGGCCTCA

\hfill

50

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 33 bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:9:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGCGGGCGGC CGCGACGCCG GCCAAGACAG CAC

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 33 bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:10:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGCGTTGACG AGCAGCCAGT TGGGCAGCAG CAG

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 15 bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:11:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGCGGGCGGC CGCTA

\hfill

15

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 42 bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:12:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGCGGGCTCG TTATAGAGCT GGTTCTGGCG CTGCTTCTTC TG

\hfill

42

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 48 bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:13:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGCGGGGAGC TCGTTATAGA GCTGGTTTGC CGCCGAATTC TTATCCCG

\hfill

48

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 33 bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:14:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGCGGGGCGG CCACGCGTCC TCGCCAGCAC ACA

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:15:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 36 bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:15:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGCGGGACGC GTTTCAGCCG TCCTCGCCAG CACACA

\hfill

36

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:16:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 33 bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:16:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGCGGGACGC GTGACCCTGA GATGGGGGGA AAG

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:17:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 33 bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:17:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGCGGGACGC GTATTGGGAT GAAAGGCGAG CGC

\hfill

33

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:18:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 26 bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:18:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CCCGGATCCC AGCATGGGCA GCTCTT

\hfill

26

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:19:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 42 bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:19:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CGCGGGGCGG CCGCTTTAGT TATTACTGTT GACATGGTCG TT

\hfill

42

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:20:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 40 bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:20:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCGGGGGGAT CCCACTGTCC AAGCTCCCAG CTCTTCACCG

\hfill

40

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:21:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 32 bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:21:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCGGGGGCGG CCGCCTAAAT ACGGTTCTGG TC

\hfill

32

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:22:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 31 bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:22:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TCAGAAAGAG ACAACCTGAA GAAACCAACA A

\hfill

31

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:23:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 31 bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ácido nucleico

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:23:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTGTTGGTTT CTTCAGGTTG TGTCTTTCTG A

\hfill

31

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:24:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 171 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: aminoácido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:24:

\vskip1.000000\baselineskip

12

\newpage

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:25:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 182 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: aminoácido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:25:

\vskip1.000000\baselineskip

13

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:26:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 220 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: aminoácidos

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:26:

\vskip1.000000\baselineskip

14

15

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:27:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 228 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: aminoácido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:27:

\vskip1.000000\baselineskip

16

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:28:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 16 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: no relevante

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:28:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gln Ser Phe Gly Leu Leu Asp Pro Lys Leu Cys Tyr Leu Leu Asp Gly}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:29:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 19 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: no relevante

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:29:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Pro Thr Trp Ser Thr Pro Val His Ala Asp Pro Lys Leu Cys Tyr Leu}

\sac{Leu Asp Gly}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:30:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 12 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: no relevante

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:30:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Gly Glu Pro Gln Leu Cys Tyr Ile Leu Asp Ala}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:31:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 19 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: no relevante

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:31:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Pro Thr Trp Ser Thr Pro Val His Ala Asp Pro Gln Leu Cys Tyr Ile}

\sac{Leu Asp Ala}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:32:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 16 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: no relevante

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:32:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Gln Ser Phe Gly Leu Leu Asp Pro Lys Leu Cys Tyr Leu Leu Asp Gly}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:33:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 16 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: no relevante

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:33:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Phe Ser Pro Pro Gly Ala Asp Pro Lys Leu Cys Tyr Leu Leu Asp Gly}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:34:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 142 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: no relevante

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:34:

17

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:35:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 35 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: no relevante

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:35:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Glu Pro Pro Ala Tyr Gln Gln Gly}

\sac{Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr}

\sac{Asp Val Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:36:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 32 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: no relevante

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:36:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Lys Lys Leu Val Lys Lys Phe Arg Gln Lys Lys Gln Arg Gln Asn Gln}

\sac{Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:37:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 35 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: no relevante

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:37:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg Thr Gln Ile Lys Lys Leu Cys Ser Trp Asn Asp Lys Asn Ser Ala}

\sac{Ala Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr}

\sac{Asp Val Leu}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO:38:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 35 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASE DE CADENA: no relevante

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:38:

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Arg Thr Arg Phe Ser Arg Ser Ala Glu Pro Pro Ala Tyr Gln Gln Gly}

Claims

1. Un método para fabricar un medicamento para la aplicación terapéutica en una infección, una enfermedad tumoral o una enfermedad autoinmunológica, caracterizado porque se generan células terapéuticas que expresan al menos dos receptores quiméricos proteináceos fijados a la membrana

comprendiendo uno de dichos receptores (a) una porción extracelular que es capaz de reconocer y fijar específicamente una célula diana o un agente infeccioso diana y (b) una porción intracelular o transmembranal que es capaz de señalizar dicha célula terapéutica para destruir una célula fijada a un receptor o un agente infeccioso diana fijado a un receptor; en donde dicha porción intracelular o dicha transmembranal se deriva de una proteína \xi, \eta, CD3 delta o T3 gamma receptora de las células T; una proteína \gamma del receptor Fc, o una proteína mb1 o B29 receptora de las células B, o uno de sus derivados funcionales;

y

2. El método de la reivindicación 1, en el cual dicha célula diana es una célula hospedadora infectada por un agente infeccioso, una célula tumoral o cancerosa, o una célula generada por autoinmunidad.

3. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en el cual dicha respuesta celular es independiente del MHC.

4. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el cual, después de la fijación de dicha porción extracelular a dicho agente o dicha célula, dicha porción transmembranal se oligomeriza con una proteína citolítica de transducción de señales de dicha célula terapéutica, dando como resultado la destrucción de dicha célula o agente fijado al receptor.

5. El método de la reivindicación 4, en el cual dicho receptor quimérico comprende o bien

(a) los aminoácidos 421-532 de SEQ ID NO: 6 o un derivado funcional citolítico de transducción de señales;

(b) los aminoácidos (a) 423-455; (b) 438-455; (c) 461-494; o (d) 494-528 de SEQ ID NO: 6;

(c) los aminoácidos 400-420 de SEQ ID NO: 6;

(d) los aminoácidos 421-575 de SEQ ID NO: 4 o un derivado funcional citolítico de transducción de señales de los mismos;

(e) los aminoácidos (a) 423-455; (b) 438-455; (c) 461-494; o (d) 494-528 de SEQ ID NO: 4;

(f) los aminoácidos 400-420 de SEQ ID NO: 4 o

(g) los aminoácidos 421-462 de SEQ ID NO: 5 o un derivado funcional citolítico de transducción de señales de los mismos;

(h) los aminoácidos 402-419 de SEQ ID NO: 5;

(i) los aminoácidos Tyr282-Tyr298 inclusive de Fig. 15A;

(j) los aminoácidos 132-171 de Fig. 16 (SEQ ID NO:24);

(k) los aminoácidos 140-182 de Fig, 17 (SEQ ID NO:25);

(l) los aminoácidos 162-220 de Fig. 18 (SEQ ID NO:26); o

(m) los aminoácidos 183-228 de Fig. 19 (SEQ ID NO:27).

6. El método de las reivindicaciones 1 a 3, en el cual dicha proteína del receptor Fc es Fc\gammaRIII humana, FcRII\gamma humana, o FcRII\gammaC humana.

7. El método de las reivindicaciones 1 a 3, en el cual dichas células terapéuticas se seleccionan del grupo constituido por:

(a): linfocitos T;

(b): linfocitos T citotóxicos;

(c): células agresoras neutras;

(d): neutrófilos;

(e): granulocitos;

(f): macrófagos;

(g): mastocitos y

(h): células HeLa.

8. El método de las reivindicaciones 1 a 3, en el cual dicho agente infeccioso diana es un virus de inmunodeficiencia.

9. El método de las reivindicaciones 1 a 3, en el cual dicha porción extracelular comprende una porción de CD4 de fijación de la envoltura de HIV, o un derivado funcional de fijación de la envoltura de HIV de la misma.

10. El método de las reivindicaciones 1 a 3, en el cual dicha porción de CD4 de fijación de la envoltura de HIV comprende el péptido codificado por los nucleótidos 1-369 de SEQ ID NO: 1.

11. El método de las reivindicaciones 1 a 3, en el cual dichas células terapéuticas destruyen dicha célula diana o dicho agente infeccioso diana fijados al receptor por citólisis.

12. Una célula que expresa al menos dos receptores quiméricos proteináceos fijados a la membrana, comprendiendo uno de dichos receptores (a) una porción extracelular y (b) una porción intracelular o transmembranal en donde dicha porción intracelular o transmembranal es la porción de transducción de señales de la célula de una proteína receptora de las células T, una proteína receptora de las células B, o una proteína receptora Fc, o un derivado funcional de las mismas; y comprendiendo el segundo de dichos receptores (a) una porción extracelular, en donde dicha porción extracelular del primer y el segundo receptores comprende una porción de CD4 de fijación de la envoltura de HIV, o un derivado funcional de fijación de la envoltura de HIV de la misma; y (b) una porción intracelular que se deriva de CD28.

13. La célula de la reivindicación 12, en donde dicha célula diana es una célula hospedadora infectada con un agente infeccioso, una célula tumoral o cancerosa, o una célula generada por autoinmunidad.

14. La célula de cualquiera de las reivindicaciones 12 ó 13, en la cual dicha fijación es independiente del MHC.

15. La célula de cualquiera de las reivindicaciones 12-14, en la cual dicho dominio intracelular o transmembranal se deriva de una proteína \xi, \eta, CD3 delta o T3 gamma del receptor de las células T; una proteína \gamma del receptor Fc; o una proteína mbl o B29 del receptor de las células B.

16. La célula de la reivindicación 15, en la cual dicho receptor quimérico comprende o bien

(a) los aminoácidos 421-532 de SEQ ID NO: 6 o un derivado funcional citolítico de transducción de señales de los mismos;

(c) los aminoácidos 400-420 de SEQ ID NO: 6;

(d) los aminoácidos 421-575 de SEQ ID NO: 4; o un derivado funcional citolítico de transducción de señales de los mismos;

(f) los aminoácidos 400-420 de SEQ ID NO: 4;

(h) los aminoácidos 402-419 de SEQ ID NO: 5;

(i) los aminoácidos Tyr282-Tyr298 inclusive de Fig. 15A;

(j) los aminoácidos 132-171 de Fig. 16 (SEQ ID NO: 24);

(k) los aminoácidos 140-182 de Fig. 17 (SEQ ID NO: 25);

(l) los aminoácidos 162-220 de Fig. 18 (SEQ ID NO: 26);

(m) los aminoácidos 183-228 de Fig. 19 (SEQ ID NO: 27).

17. La célula de cualquiera de las reivindicaciones 12-14, en la cual dicha proteína del receptor Fc es Fc\gammaRIII humana, FcRIII\gammaA humana, o FcRII\gammaC humana.

18. La célula de cualquiera de las reivindicaciones 12-14, en la cual dicha porción extracelular comprende la porción de fijación de ligando de un receptor, la porción de fijación de receptor de un ligando, la porción de fijación de antígeno de un anticuerpo, o un derivado funcional de los mismos.

19. La célula de la reivindicación 18, en la cual dicho agente infeccioso diana es un virus de inmunodeficiencia o dicha célula diana es una célula hospedadora infectada con un virus de inmunodeficiencia.

20. La célula de la reivindicación 19, en la cual dicha porción extracelular comprende una porción de CD4 de fijación de la envoltura de HIV, o un derivado funcional de la misma.

21. La célula de la reivindicación 20, en la cual dicha porción de CD4 de fijación de la envoltura de HIV comprende el péptido codificado por los nucleótidos 1-369 de SEQ ID NO: 1.

22. La célula de la reivindicación 12, en la cual dicha célula destruye dicha célula diana o dicho agente infeccioso diana fijado(a) al receptor por citólisis.

23. Una célula que expresa al menos dos receptores quiméricos proteináceos fijados a la membrana, comprendiendo uno de dichos receptores (a) una porción extracelular, y (b) una porción intracelular o transmembranal derivada de un polipéptido CD3, zeta o eta del receptor de las células T, un receptor de las células B, o un receptor Fc, y

comprendiendo el segundo de dichos receptores (a) una porción extracelular, en donde dicha porción extracelular de los receptores primero y segundo comprende una porción de CD4 de fijación de la envoltura de HIV, o un derivado funcional de fijación de la envoltura de HIV de la misma, y (b) una porción intracelular que se deriva de CD28.

24. La célula de la reivindicación 12 ó 23, en la cual dicho receptor quimérico incluye o bien

(a) una porción extracelular de CD16, CD17, o CD5;

(b) una porción transmembranal de CD5 o CD7; o

(c) una porción intracelular de CD5.

25. Un par de receptores quiméricos proteináceos fijados a la membrana, comprendiendo uno de dichos receptores (a) una porción extracelular y (b) una porción intracelular o transmembranal en donde dicha porción intracelular o transmembranal es la porción de transducción de señales de una proteína receptora de las células T, una proteína receptora de las células B, o una proteína receptora Fc, o un derivado funcional de las mismas; y comprendiendo el segundo de dichos receptores (a) una porción extracelular, en donde dichas porciones extracelulares del primer y el segundo receptores comprenden una porción de CD4 de fijación de la envoltura de HIV, o un derivado funcional de fijación de la envoltura de HIV de la misma; y (b) una porción intracelular que se deriva de CD28.

26. Un par de receptores quiméricos proteináceos fijados a la membrana, comprendiendo uno de dichos receptores (a) una porción extracelular y (b) una porción intracelular o transmembranal derivada de un polipéptido CD3, zeta o eta del receptor de las células T, un receptor de las células B, o un receptor Fc; y

comprendiendo el segundo de dichos receptores (a) una porción extracelular, en donde dichas porciones extracelulares de los receptores primero y segundo comprenden una porción de CD4 de fijación de la envoltura de HIV, o un derivado funcional de fijación de la envoltura de HIV de la misma, y (b) una porción intracelular que se deriva de CD28.

27. Un par de moléculas de DNA, cada una de las cuales codifica un receptor quimérico proteináceo fijado a la membrana de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 25 ó 26.