CZ259997A3 - Přesměrování imunity receptorovými chimérami - Google Patents

Description

Oblast techniky

Vynález se zabývá funkčními chimérami receptorů T-lymfocytů, Fc-receptorů nebo | receptorů B-lymfocytů, schopných přesměrování funkce imunitního systému. Podrobně se zabývá regulací lymfocytů, makrofagů, přirozených zabíjéčů nebo granulocytů exprimovaných Chimérami zmíněných buněk, které vyvolávají v buňkách odpovědi na cílové podněty rozpoznané chimérami. Vynález sc také zabývá funkčními chimérami receptorů T-lymfocytů, Fc-receptorů nebo receptorů B-lymfocytů, schopnými řízení terapeutických buněk ke specifickému rozpoznávání a ničení buněk infikovaných specifickými infekčními částicemi, samotné infekční Částice, nádorové buňky nebo autóimunitou generované buňky. Podrobně se vynález vztahuje k expresi chimér receptorů T-lymfocytů, Fc-receptorů nebo receptorů B-lymfocytů, schopných směrování cytotoxickýeh T-lymfocytů ke specifickému rozpoznávání a lýzý buněk produkujících obálkové prótei ny HIV. Vynález proto.umožňuje terapii proti chorobám jako AIDS (syndrom získané ztráty imunity), které jsou způsobený virem HIV.

Dosavadní stav techniky

Rozpoznání antigenu T-lymfocytem prostřednictvím receptorů T-lymfocytu je základem širokých imunologických jevů. T-lymfocyt řídí tzv. imunitu zprostředkovanou buňkami. To zahrnuje destrukci cizích tkání nebo infikovaných buněk buňkami imunitního systému. Existuje mnoho druhů T-lymfocytů, včetně “pomocných” a “supresóróvýčh” lymfocytů, které modulují buněčnou odpověď, a cytotoxickýeh (“zabíječských”) buněk, které mohou abnormální buňku zničit přímo.

T-lymfocyt, který rozpoznává a váže se na unikátní antigen umístěný na povrchu jiné buňky se aktivuje, může se zmnožit, a když se jedná o čytotoxický lymfocyt, může navázanou buňku zabít.

Autoimunitní choroba je charakterizovaná produkcí buď protilátek, které reagují s hostitelskou tkání, nebo imunitním efektorem T-lymfočytů, které jsou autoreaktivní. V některých případech mohou autopróťilátky vzniknout normální odpovědí T-lymfocytů a B-lymfocytů aktivovaných cizí látkou nebo. organismy obsahujícími antigeny, které křížově reagují s • · «

i ² podobnými látkami ve vlastní tkáni. Příklady klinicky relevantních autoprotilátek jsou protilátky . proti acetylcholinovým receptorům při mýasthenia grávis; a protilátky proti DNA, proti erythrocytům a proti krevním destičkám při systemické lupus erythematošus.

HIV a imiinopathogeneze. V roce 1984 bylo zjištěno, že HIV je etiologická částice AIDS. Od té doby se definice AIDS mnohokrát měnila v závislosti na výběru kriterii zařazených do diagnózy. Avšak, na rozdíl od fluktuace diagnostických parametrů, jednoduchým společným jmenovatelem AIDS je infekce HIV a následně vyvinutí persistentních konstituciónálních f . symptonů a AlDS-definujících chorob jako sekundární infekce, neoplasma a neurologické choroby (Harrison's Priňciples of Intemal Médicine, 12. vydání, McGraw Hill (1991)).

HIV je lidský retro virus ze skupiny lentivirů. Čtyři známé lidské retroviry se děli na dvě skupiny: lidské T-lymfotropni (nebo leukemické) retroviry, HTLV-1 a HTVL-2₅ a viry lidské imunodeficieňce HTV-1 a H1V-2 První dva jsou transformní viry, druhé dva cythopatickě viry.

' HTV-1 byl identifikován jako nejčástější příčina AIDS ve světě. Sekvenční homologie mezi HI V-2 aHIV-1 je 40 %, HIV-2 se více blíží některým členům skupiny virů opičí imunodeficieňce (SIV) (Curran et al:, Science 329. 1357-1359 (1985); Weis et al.. Nátuře 324. 572-575 (1986)).

HIV obsahuje obvyklé retřovirální geny (env, gag a pol) a šest dalších genů se účastní replikace a dalších biologických aktivit viru. Jak bylo drive uvedeno, obecný jmenovatel AIDS je silná imunosuprese, převážně imunity zprostředkované buňkami. Tato imunosuprese vede k radě oportunitních chorob, žejména určitých infekcí a neoplasmy.

Jako hlavni příčina imunitního defektu při AIDS byl identifikován kvantitativní a kvalitativní nedostatek v subpopulaci od thymu odvozených T-lymfocytů, T-4 populace. Táto skupina lymfocytů je definována fenotypove přítomností CD4 povrchové molekuly, která se ukázala být buněčným receptorem pro HIV (Dalgleišh et ál., Nátuře 312, 763 (1984)). Ačkoliv T-4-lymfoeyt je hlavním typem buněk infikovaných HIV, v podstatě jakákoliv lidská buňka exprimující na svém povrchu CD4 molekuly je sčhopna navázat a infikovat Se virem HIV.

Běžně jsou CD4+ T-lymfocyty v roli pomocných indukujících buněk, s funkcí poskytnout 1' aktivační signál pro B-lymfocyty nebo indukovat přeměnu T-lymfocytů nesoucích reciproční CD8 _a markér na cytotoxické suprešorové buňky (Reinherz a Schlossman, Cell 19, 821-827 (1980);

íi

Goldstein et al., Imunol Rev. 68, 5-42 (1982)).

HIV se váže specificky a s vysokou afinitou, prostřednictvím protažení aminokyselin virové obálky (gp 120) k doméně Vl-oblásti CD4 molekuly umístěné blízko N-konce. Po navázání virus fuzuje s cílovou buněčnou membránou a je intemalizován. Po intemalizaci použije φ φφ φ φφ • ΦΦ φφφφ φφ φ φ φ · φφφφ φ φφ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ

ΦΦΦΦ·· φφφφφφφ φφ · φφ φφφφ virus enzym reverzní transkriptázu pro transkripci své genomové RNA na DNA, která je integrovaná do buněčné DNA, kde přetrvává po dobu života buňky jako “provirus”.

Proviníš může zůstal latentní, nebo být aktivován k transkripci mRNA a genomové RNA, následné proteosyntéze, složení a vzniku nového virioňu a vypuzení viní z povrchu buňky. Ačkoliv není dosud znám přesný mechanismus indukce buněčné smrti virem, jako hlavní mechanismus se předpokládá masivní uvolňování z buněčného povrchu, vedoucí k porušení plasmové membrány a výsledné osmotické nerovnováze.

Během průběhu infekce si hostitelský organismus vytváří protilátky proti virovým proteinům, včetně hlavních obálkových glykopróteinů gp 120 a gp 41. Navzdory humorální imunitě choroba postupuje a výsledkem je lethální imunosuprešě charakterizovaná četnými oporturtními infekcemi, parasitenií, demencí a smrtí. Nezdar hostitelských protivirových protilátek v zabránění progrese choroby je jedním z něj víc tíživých a alarmujících aspektů infekce a předpověď přo vakciriaČňí snahy založené na konvenčních přístupech není dobrá. ’

Dva faktory mohou hrát roli při účinnosti humorální odpovědi na viry imunodeficience. Za pfVé, jako ostatní RNÁ viry (a zejména retroviry), viry imunodeficience vykazuji vysokou rychlost mutace jako odpověď na hostitelský imunitní dozor, za druhé, obálkové glykoproteiny Samy o sobě jsou bohatě glykosylovarié molekuly mající málo epitopů vhodných pro navázání vysoce afinitníeh protilátek. Špatný antigeňový cíl, představovaný virovou obálkou, umožňuje hostiteli malou možnost pro restrikci virové infekce produkcí specifických protilátek.

Buňky infikované virem HIV exprimují na svém povrchu glykoprotěin gp 120, Gp 120 zprostředkovává fúzi mezi CD4+ buňkami prostřednictvím reakce podobné té, kterou virus napadá neinfikované buňky, vedoucí k vytvoření krátkodobých multiňukleových obřích buněk. Vytváření syneytiaje závislé rta přímé interakci gp 120 obálkového glykopróteinů s proteinem ČD4 (Dalgjéish et al.j viz výše; Kíatzman et al., Nátuře 312,763 (1984); McDougal ět al.j Science 231,382 (1986); Sodroski et al., Nátuře 322. 470 (1986); Lifson et al., Nátuře 323, 725 (1986); Sodroski et al., Nátuře 321, 412 (1986)).

Důkaz, že navázání CD4-gp 120 je odpovědné za virovou infekcí buněk nesoucích CD4 antigen, obsahuje zjištění, že mezi gp 120 a CD4 se vytváří specifický komplex. Jiiií vědci ukázali, že buněčné linie neinfikované virem HIV se změnily na infikované buněčné linie po transfekci a expresi lidského CD4 cDNA genu.

Terapeutické programy založené na rozpustném CD4 jako pasivním činidle pro interferování s virovou adsorpcí a syncytiem - zprostředkované celúlámí transmise byly navrženy * · · · · 9 · * »· · ······ • · · 9 · a úspěšně demonstrovány in vitro několika skupinami (Deen et al., Nátuře 331, 82-84 (1988); Fisher et al, Nátuře 331. 76-78 (1988); Husšey et al·., Nátuře 331. 78-81 (1988); Smith et al. Science 238, 1704-1707 (1987); Traunecker et al., Nátuře 331, 84-86 (1-988));-a následně byly vyvinuty CD4 imunoglobulinové fuzní proteiny s prodlouženým poločasem a míniou biologickou aktivitou (Capon et al.. Nátuře337.525-531 (1989); Traunecker et al., Nátuře 339_; 68-70 (1989); Bym et al., Nátuře 344, 667-670 (1990); Zettlmeissl et al., DNA Cell Biol. 9, 347-353 (1990)). Ačkoliv CD4 imunotoxinové kortjugátynebo fúzní proteiny vykazují potenciální cytotoxicitu pro infikované buňky jn vitro (Chaudhary et al.:, Nátuře 335, 369-372 (1988); Till et al , Science 242, 1166-1168 (1988)X latence syndromu imunodeficience způsobuje nepravděpodobnost úspěšnosti jednoduché terapie pro eliminaci virové zátěže, a ahťigenicita cizích fuzních proteinů pravděpodobně limituje jejich přijatelnost při terapiích vyžadujících opakované dávkování. Testy s opicemi nakaženými virem SIV ukázaly, že rozpustný CD4 při podávání zvířatům bez zjevné CD4 čýtópenie může redukovat SIV titr a zlepšit in vitro měření myeloidňího potenciálu (Watanabe et al., Nátuře 337, 267-270 (1989)). Avšak rychlé znovuobjevení se viru bylo pozorováno po přenášení terapie, což nasvědčuje, že dlouhodobé podáváni může být nezbytné pro zabránění progresivního oslabení imunitního systému:

T-lymfocytové a Fc receptory. Exprese nejrozšírenější formy T-lymfocytového antigenového receptoru (TGR) na buněčném povrchu vyžaduje koexpresi nejméně šesti odlišných polypeptidových řetězců (Weiss et al, J. Exp. Med· 160. 1284-1299 (1984); Orloffhashi etal. Nátuře 316, 606-609 (1985); Berkhout et al, I BioL Chem. 263. 8528-8536 (1988); Sussman et al. Cell 52, 85-95 (1988)), α/β antigen vážících řetězců, tří polypeptidu CD3 komplexu a ζ. Pokud některý z řetězců chybí, nedochází ke stabilní exprese zbývajících členů komplexu ζ je limitující polypeptid pro povrchovou expresi úplného komplexu (Sussman et al., Céll 52, 85-95 (1988)) a předpokládá še, že zprostředkovává alespoň Část programu buněčné aktivace spouštěné receptorovým rozpoznáním antigenu (Weišsmaň et al, ĚMBO J. 8, 3651-3656 (1989); Frank et al., Science 249, 174-177 (1990)). Integrální membránový homodimer typu I 32 kĎa, ζ (zeta) má extracelulámí doménu s devíti zbýtky a žádné místo pró adici Navázaného glykánu a myší intracelulární doménu s 112 zbytky riebo lidskou intracelulární doménu s 113 zbytky ((Wéissman et al,, Science 238, 1018-1020 (1988); Weissmán et al. Proč. Nati. Acad. Sci. USA 85, 9709-9713 (1988)). Isoforma (, nazývaná η (eta) (Baniyash et al, I Biol. Chení. 263. 9874-9878 (1988);Orloffét al, I Biol. Chem. 264, 14812-14817 (1989)), která vzniká z alternativní cesty splicingu mRNA (Jin et al,Proc. Nati. Acad. Sci. USA 87, 3319-3323 (1990)), je přítomná »· ··♦· « «* · ·· ·· · · ·«*· · · · « · · · · · ♦ • * · · ······ « · · · · • II ···· ··· ···· ·· * ^ς 5 _u v omezeném počtu buněk produkujících antigenový receptor. ζ-η heteřodimery sě považují za zprostředkovatele tvorby inositolfosfátu a receptorem inicializované programové buněčné smrti nazývané apoptoša (Mercep et al., Science 242. 571-574 (1988); Mercep et al. Science 246,

1162-1165 (1989)).

Podobně jako ζ a η, s Fc receptorem asociovaný γ řetězec je expnmOván na buněčném povrchu komplexu s adičními polypeptidy, z nichž některé zprostředkovávají rozpoznání ligandu a další mají nedefinovanou furikči, γ má homoďimeřní strukturu a - celkovou organizací velice podobnou téu ζ a je Součástí jak vysokoafinitního IgE receptoru stěžňové buňky/basofilu, FceRI, skládajícího se z nejméně tří rozdílných polypeptidových řetězců (Blank et al., Nátuře 337, 187-189 (1989); Ra et al., Nátuře 241. 752-754 (1989)), tak jednoho nízkoafinitního IgG receptoru, který je u myší representován FcýRlIa (Ra et ai., J. Biol. Chem. 264. 15323-15327 (1989)), a u lidí expresí subtypu CD16 makrofágy a přirozenými zabiječskými buňkámj, CDl6_17ví (CD16 transmembránový) (Lanier et al., Nátuře 342. 803-805 (1989); Anderson et al., Proč. Nati. Acad. Sci, USA 87, 2274-2278 (1990)) a s polypeptidem s nedefinovanou funkcí (Anderson et al., Próc. Nati. Acad. Sči, USA 87. 2274-2278 (1990)). Nedávno bylo publikováno, že γ je exprimován myší linií T-lymfocytů, CTL, ve kterých vytváří homodimery a heteřodimery γ-ζ a γ-η (Orloffet al,, Nátuře 347. 189-191 (1990)).

Fc receptory zprostředkovávají fagocytózu imunitních komplexů, transcytózu a na protilátkách závislou buněčnou cytotoxičitu (ADCC) (Ravetčh and Κίηέζ Annu_; Rév. Immunol. 9, 457-492 (1991); Unkeless et al., Annu. Rev. Immunol. 6, 251-281 (1988); Mellman, Curr. Opiu. Immunol. 1, 16-25 (1988))i Nedávno bylo zjištěno, že jedna z isoforem kuřecího nízkoafinitního Fč receptoru FcRylIIBl zprostředkovává iriternalizaci Ig-pokrytých cílů do klathrinem pokrytých jamek a jiný nízkoafinitní receptor, FcRylIlA zprostředkovává ADCC prostřednictvím asociování se s jedním nebo více členy malé rodiny “spouštěcích molekul” (Miettinen et al., Cell & 317-327 (1989); Hunziker and Mellman, J. Cell. Biol. 109. 3291-3302 (1989)). Tyto spouštěcí molekuly, řetězec ζ T-lymfocytového receptoru (TCR), řetězec γ TCR a řetězec γ Fc receptoru interagují s doménami ligandového rozpoznáváni receptorů různých imunitních systémů a mohou autónomě iniciovat programy buněčných efektorů, včetně eytolýzy následující po agregaci (Samélšon et al., Cell 43, 223-231 (1985); Weissman et al., Science 222, 1018-1020 (1988); Jiň efal-., Proč. Nati. Acad. Sci, USA 87, 3319-3323 (1990); Blank et al., Nátuře 337. 187-189 (1989); Lanier et al., Nátuře 342. 803-805 (1989); Kurosáki and Ravetch, Nátuře 342, 805-807 (1989); Hibbsetal., Science 246. 1608-1611 (1989); Anderson et al., Proč.

« 99 « ·· ···*«· • · · · · · · ♦ · • · « · · * · • * · 9 999999

9 9 9 9 9

9999·· 9999999 99 9

Nati. Acad. Sci, USA 82,2274-2278 (1990); Irving and Weiss, Cell 64, 891-901 (1991)).

V načrtnutých paralelách mezi kuřecími a lidskými rodinami nízkoafinitních Fc receptoru se ukazuje zřejmé, Že lidské išoformy FcRylIA a C nemají odpovídající kuřécí protějšek. Částečně kvůli tomu nebyla jejich funkce dosud definována.

Protože humorální činidla založená pouze na CD4 mají limitované užití in vivo, předchozí práce prověřovala možnost augmentace buněčné imunity proti HIV. Byla zjištěna tvorba proteinových chimér, jejichž extraceiulámí CD4 doména je fúzovaná s transmembránovými a/nebo intrácélulárnimi doménami receptoru T-lymfocytů, IgG Fc receptoru nebo elementů převádějících signál receptoru B-lymfocytů (U.S.S.N. 07/847, 566 a 07/665, 961, takto Začleněn odkazem). Cytolytické T-lymfocyty exprimujicí chiméry, které obsahují extraceiulámí CD4 doménu, vykazují Silnou na MHC nezávislou destrukci buněčných cílů exprimujíčích obálkové proteiny HIV, Velice důležitá a nová součást tohoto přístupu byla identifikace jednotlivých řetězců receptoru T-lymfocytů, Fc reccptorů a receptorů B-lymfocytů, jejichž agregace stačí k inicializaci buněčné odpovědi.

Jedna zejména důležitá aplikace tohoto přístupu je vynález chimér mezi CD4 a ζ, η nebo γ, která řídí eytolýtické T-lymfocyty k rozpoznávání a zabíjení buněk exprimujíeích HIV gp 120 (U.S.S.N. 07/847, 566 a 07/665, 961, takto začleněn odkazem).

Podstata vynálezu

4>L-Í>*

Ačkoliv nativní receptory T-lymfocytů,.Fc receptory a receptory B-lymfoeytů mají nebo mohou mít komplikovanou multimemí strukturu, neumožňující s nimi výhodnou manipulaci, předkládaný vynález demonstruje proveditelnost vytvoření chimér mezi intračelulámí doménou jekékoliv z řady molekul schopných vyhovět podmínkám cílového rozpoznávání. Zejména tvorba chimér skládajících séz intračelulámí domény T-lymfocytového/Fc receptoru zeta, eta nebo gama řetězců spojených s extraceiulámí doménou vhodně manipulovaně molekuly protilátky skýtá možnost cílového rozpoznávání imunitního systému buňky přesměrovat na antigen rozpoznaný extraceiulámí doménou protilátky. Tak doména protilátky schopné rozpoznávání nějakého determinantu na povrchu pathogenu umožní imunitnímu systému buňky vyzbrojenému touto chimérou odpověď na přítomnost pathogenu s efektoroyým programem odpovídajícím jejich.linii, např. pomocné T-lymfocyty odpoví cytotoxickou aktivitou proti Cíli a B-lymfocytý se aktivují pro syntézu protilátky. Makřofagy a granuločyty provádějí svůj efektorový program zahrnující « · • · ··· ·

uvolnění cytokinů, fagocytózu a reaktivní generování kyslíku. Podobně domény protilátky schopné rozpoznávání nádorových buněk prospěšně povzbudí odpověď imunitního systému na nádor. Protilátky schopné rozpoznávání imunitních buněk s neodpovídající reaktivitou proti vlastním determinantům umožní selektivní destrukci autoreaktivních buněk.

Ačkoliv příklady uváděly použití protilátkových chimér jako vhodné vysvětlující nástroje, vynález není limitován v oboru na protilátkové chiméry, a Skutečně, užití specifických neprotilátkových extraceliilámích domén má důležité výhody. Např. extracelulární doména recepťoru pro virus, bakterii nebo parazita umožní buňkám vyzbrojeným takovými chimérami specificky dlít na buňky exprimující virové, bakteriální nebo parazitické determinanty. Výhoda tohoto přístupu oproti použití protilátek je ta, že nativní receptor pro pathogen může mít jedinečně vysokou selektivitu nebo afinitu pro pathogen, a umožňuje tak vyšší Stupeň přesnosti ve výsledně imunitní odpovědi. Podobně k vyrušení buněk imunitního Systému neadekvátně reagujících s vlastním antigenem, může stačit spojení ahtigenu (bud’ jako intaktrtího proteinu v případě terapie vyčerpáni B-lymfocytů, nebo jako MHC komplex v případě terapie vyčerpání T-lymfocytů) k intracelulámímu zeta, eta nebo gama řetězci, a tak působit na specifické zaměření buněk neadekvátně odpovídajících na vlastní determinanty.

Jiné použití chimér spočívá v regulaci buněčně populace in vivo následně po dalších formách genového inženýrství. Bylo navrženo například použití lymfocytů infiltrujících nádor nebo přirozených zabíjecských buněk k vnesení cytotoxických prvků do místa nádoru. Předkládaný vynález poskytuje vhodný prostředek k regulaci počtu á aktivity lymfocytů á buněk, aniž by se vyjmuly z těla pacienta pro in vitro amplifikaci. Protože iňtracelulární domény chimériiích réceptoiů zprostředkovávají proliferační odpověď buněk, koordinace extraeelulámích domén různými agregačními stimuly Specifickými pro extracelulární domény (například protilátka specifická pró extraceliilámí doménu) bude ústit v proliferaci buněk nesoucích chiméry.

Ačkoliv Specifické uspořádání předkládaného vynálezu obsahuje chiméry mezi zéta, eta nebo gama řetězci, nebo jejich aktivními fragmenty (diskutovanými níže), jakýkoliv receptorový řetězec s podobnou funkcí jako mají tyto molekuly, například v gřáňulocytech nebo B-lymfocytečh, může být použit pro účely zde popsané. Významné rysy vhodných imunitních buněk spouštěcí molekuly obsahují Schopnost autonomní exprese (tzn. jako jednoduchý řetězec), schopnost fúzovat s extracelulární doménou tak, že výsledná chiméra je přítomná na povrchu >·· ·' terapeutické buňky, a schopnost iniciovat buněčně efektorové programy druhotnou agregací po

Setkání s Cílovým ligandem.

·· ···* ··· ····

V současnosti nej vhodnější způsob pro dodaní chimér buňkám imunitního systému jé cesta genové terapie. Avšak rekonstituce buněk imunitního systému s chimérními receptory smícháním buněk S vhodně solubilizoyaným Čištěným chimémím proteinem také resultuje v tvorbu :

manipulované buněčné populace schopné odpovídat na cílové podněty rozpoznávané extracelulární doménou chimér. Podobné přístupy bylý použity například pro zavedení intaktriího HIV receptorů, GD4, ďo erythrocytů pro terapeutické účely. V tomto případě populace manipulovaných buněk není schopna sebeobnovení.

Předkládaný vynález se vztahuje k funkčně zjednodušeným chimérám receptorů T-lymfocytů, B-lymfocytů a Fe-receptorů, schopným přesměrování funkcí imunitního systému.

Zejména se vztahuje k regulaci lymfocytů, makrofágů, přirozených zabíječských buněk nebo granulocytů expresí chimér uvedených buněk, které způsobují buněčnou odpončď na cílové .· podněty rozpoznávané chimérami. Vynález se také vztahuje na způsob řízení buněčné odpovědi na infekční Částici, nádorovou nebo rakovinnou buňku, nebo na buňku generovanou autoimunitou. Způsob řízení buněčné odpovědi u savců zahrnuje administraci efektivního množství terapeutických buněk do zmíněných savců, uvedené buňky jsou schopny rozpoznávat a ničit zmíněné infekční částice, nádorové nebo rakovinné buňky, nebo buňky generované ·« autoimunitou. Buněčná odpověď je zprostředkována jednoduchou receptorovou chimérou nebo je výsledkem kooperace mezi multiplitními chimérami (například sada dvou nebo vicé chimér, z nichž jedna obsahuje CD28 intracelúlámí doménu). Tomu odpovídaje, vynález zahrnuje užití . těchto buněk exprimujících receptorové chiméry při produkci léčiv pro terapii chorob (jak je zde uvedeno). _F

V jiném uspořádání, způsob řízení buněčné odpovědi na infekční částici zahrnuje administraci terapeutických buněk schopných rozpoznávání a ničení zmíněné částice, přičemž částicí je specifický virus, baktérie, protožoa nebo houby. Specifičtěji tato metoda je řízena proti takovým částicím, jako je HIV nebo Pneumocvstis carinii.

Vynález specificky poskytuje metodu pro řízení buněčné odpovědi na buňky infikované virem HIV. Métoda zahrnuje administraci pacientovi efektivního množství cytotoxických T-lymfocytů, přičemž uvedené tymfocyty jsou schopny specifického rozpoznávání a lýze buněk infikovaných HIV stejně jako Oběžným virem.

Tak v jednom uspořádání vynález poskytuje metodu řízení buněčné odpovědi na buňky infikované virem HIV, Zahrnující administraci pacientovi efektivního množství cytótoxixkých

T-lymfocytů schopných specifického rozpoznávání a lýze buněk infikovaných HIV.

« · I •» t · • ♦ • · · • ♦ • · · « « · • · · · » · • · ·

V ještě dalším uspořádání se poskytují chiměrní receptorové proteiny, které řídí cytotoxické T-lymfoeyty k rozpoznávání a lýzy buněk infikovaných HIV. Ještě další uspořádání vynálezu zahrnuje hostitelské buňky transformované vektorem zahrnujícím chimémí receptory. V dalším uspořádání vynález poskytuje protilátku proti chimémím receptorům z vynálezu. Pokusy vynálezců získat cytotoxické T-lymfocyty, které specificky vázou a lyžují buňky infikované HTV, poskytly receptorové chiméry. Tyto chimémí receptory jsou funkčně aktivní a mají zvláštní schopnost specificky se vázat a lýzovat buňky exprimující gpl 20.

Předmětem předkládaného vynálezu je poskytnout způsob terapie jedinců infikovaných HIV. Předkládaný vynález poskytuje množství důležitých výhod při terapii AIDS.

Tato a další nelimitující uspořádání předkládaného vynálezu budou zřejmá odborníkovi ž následujícího detailního popisu vynálezu.

V následujícím detailním popisu se uvádějí odkazy na různé metodologie známé odborníkům z oblasti molekulární biologie a imunologie. Publikace a další materiály uvádějící takové známé metodologie, na které jsou odkazy, jsou zahrnuty zde v referencích a plně uvedený v souhrnu .

Standardní odkazově práce uvádějící obecné principy technologie rekombinantní DNA zahrnují Watson ct al., Molecular Biology of the Gene, svazek I a II, the Benjamin/Cummings Publishing Company, lne., publisher, Menlo Park, CÁ (1987); Darhell ět áh, Molecular Cell Biology, Scientific American Books, lne., publisher, New York, N.Y. (1986); Lewin, Genes Π, John Wiley & Sons, publishers, New York, N.Y. (1985); Old et al., Principles of Gene Manipulation; An Introduction to Genetic Engineering, 2. vydání, University ofCalifornia Press, publisher, Berkeley, CA (1981); Maniatis et al., Molecular Cloning; A Laboratory Manual, 2. vydání, Cold Spring Harbor Laboratory, publisher, Cold Spring Harbor, NY (1989); Current Protocols in Molecular Biology,. Ausubel et al., Wiley Press, New York, NY (1989).

Definice. “Klonování” znamená užití in vitro rekombinatní techniky k zavádění jednotlivého genu nebo jiné sekvence DNA do vektorové molekuly. Pro úspěšné klonování žádaného genu je nutné použít metodu pro generováníDNA fragmentů pro spojení fragmentů s vektorovými molekulami, pro zavedeni složité DNA molekuly do hostitelské buňky, ve které může replikovat, a pro výběr klonu majícího cílový gen mezi recipientními hostitelskými buňkami.

“cDNA” znamená komplementární nebo kopírovanou DNA vytvořenou z RNA templátu působením RNA-dcpendentní DNA polymerázy (reversní transkriptázy). “cDNA klon” znamená duplexní DNA sekvenci komplementární k dané RNA molekule, nesené klonovacím vektorem.

9· · ·

• 9 ·999

9 · 9<9·

99 9 9 · 9 9 · 9

9 9 9 · ♦

99*9*9 *199999 99 9 io “cDNÁ knihovna” znamená soubor rekómbinantních molekul DNA obsahujících cDNA vložehiny, které zahrnují DNA kopie mRNA exprimováné buňkou ve chvíli vzniku cDNÁ knihovny. Taková cDNA knihovna se připravuje podle postupů známých odborníkům a popisovaných například ManiatiS et sil., Molécular Clonihg: A Laboratory Manual, viz výše. Obecne se nejprve isoluje RNA z buněk organismu, z jehož genomu se klonuje žádaný jednotlivý gen. Preferované pro účeípredkládaného vynálezu jsou savčí, zejména lidské lymfatické buněčné linie. V současnosti,preferovaným vektorem pro tento ůčél je WR vlákno vaccinia viru.

“Vektor” znamená molekulu DNA odvoženou například z plazmidu, bakteriofága, savčího nebo hmyzího viru, do kterého sc fragmenty DNA začleňují nebo klonují. Vektor Obsahuje jedno nebo více unikátních restrikčních míst a je schopen autonomní replikace v definovaném hostitelském nebo nosičoném organismu tak, že klonovaná sekvence je reproducibilní. “Vektor DNA exprese” znamená jakýkoliv autonomní element schopný řízení syntézy rekombinantního peptidu. Takové vektory DNA exprese zahrnují bakteriální palzmidy a fágy a savčí a hmyzí plazmidy a viry.

“Substančiálně čistý” znamená sloučeninu, například protein, polypeptid nebo protilátku, která je substanciálně zbavená komponent, které ji přirozeně doprovázejí: Obecně je sloučenina substančiálně čistá, když nejméně 60 %, ale lépe 75 % a nejlépe 90 % celkové látky ve vzorkuje žádaná sloučenina. Čistota se měří jakoukoli vhodnou metodou, například sloupcovou chromatografií, gelovou eíektroforézou na polyakrylamidu, nebo HPLC analýzou. V kontextu s nukleóvými kyselinami, “substanciálně čistý” znamená Sekvenci nukleové kyseliny, segment nebo fragment, který není bezprostředně sdružen. (například kovalentně vázán) s oběma kódovacími sekvencemi, se kterými jé bezprostředně sdružen (například s jednou na 5'-konci, a jednou na 3-konci) ý přirozeně se vyskytujícím geňomu organismu, ze kterého je DNA podle vynálezu odvožena.

“Funkční derivát” znamená “fragmenty”, “varianty”, “analogy” nebo “chemické deriváty molekuly. “Fragment” molekuly, jako kterákoliv z cDNA sekvencí podle předkládaného vynálezu, odpovídá jakékoli v nukleotidové části molekuly. “Varianta” takové molekuly odpovídá přirozeně se vyskytující molekule substanciálně podobné buď celé molekule, nebo jejímu fragmentu. “Analog” molekuly odpovídá nepřirozené molekule substanciálně podobné buď celé molekule, nebo jejímu fragmentu. Molekula se považuje za “Substanciálně podobnou” jiné molekule, pokud aminokyselinová sekvence obou molekul je substanciálně shodná. Zejména, “substanciálně podobná” aminokyselinová Sekvence má nejméně 50%, lépe 85% a nejlépe 95% identickou »9 99«· * ·

9 ··· 9999 ·· · * * · • 9 9· • · · · * · • 9 · 9

999 MM 99 9 l'« aminokyselinovou sekvenci s přirozenou nebo referenční sekvencí a/nebo ta, která se liší od přirozené nebo referenční aminokyselinové sekvence pouze konzervativní aminokyselinovou substitucí. Substanciálně podobné aminokyselinové molekuly mají podobnou biologickou aktivitu. V případe, že dvě molekuly mají podobnou aktivitu^ považují se za varianty, neboť tento termín se zde používá, i když jedna z molekul Obsahuje více nebo méně aminokyselinových zbytků než ta druhá, nebo když aminokyselinová sekvence zbytků není identická. Jak se zde používá, molekula se považuje za “chemickýderivát” jiné molekuly, když obsahuje navíc chemické skupiny, které nejsou normální Částí molekuly. Takové skupiny řhohou alternativně snižovat toxicitu molekuly, eliminovat nebo oslabit nežádoucí vedlejší efekty molekuly atd. Skupiny schopné zprostředkovávat takové efekty jsou uvedeny, například v Remington s Phanňaceútieal Sciences, 16. vydání, Mack Publishing Co, Easton, PA (1980).

Podobně, ‘‘funkční derivát” genu receptorové chiméry podle předkládaného vynálezu, znamená, že zahrnuje “fragment”, “variantu” nebo “analog” genu, které jsou substanciálně podobné v nukleotidové sekvenci a které kódují molekuly s podobnou aktivitou, například chiméry receptářů T-lymfócytů, B-lymfočytů á Fc receptářů. “Substanciálně podobné” nukleové kyseliny kódují substanciálně podobné aminokyselinové sekvence a také zahrnují jakoukoliv sekvenci nukleoyě kyseliny schopnou hybridizace s divokým typem sekvence nukleové kyseliny při odpovídajících hybridizačních podmínkách (příslušné hybridizaČní podmínky viz například Aušubel et al., CurrentProtocols in Molecular Biology, Wiley Press, New York, NY (1989).

Jak se zde používá, chimémí protein receptorů T-lymfocytů, B-lymfocýtů nebo Fc receptoiů zahrmuje také jakýkoli funkční deriváty, fragmenty, varianty, analogy nebo chemické deriváty, které jsou substanciálně podobné “divokému typu” chiméry a které mají podobnou aktivitu (tzn. nejlépe 90%, 70%, 40%, ale nejméně 10% aktivitu receptorové chiméry divokého typu). Aktivita funkčního derivátu receptorové chiméry zahrnuje specifickou vazbu (její extracelulární doménou) na cílovou částici nébo buňku a výslednou destrukci (řízenou její intracelulární nebo transmembránovou doménou) této Částice nebo buňky; taková aktivita se testuje jakýmkoliv ze zde popsaných testu.

DNA sekvence kódující chiméry receptoru T-lymfocyfů, B-lymfocytů nebo Fc receptářů podlé předkládaného vynálezu, nebo jejich funkční deriváty, jsou rekombinovány s vektorovou

DNA v souladu s konvenčními technikami, včetně blunt-ended nebo staggered-ended konců pro ligací, štěpení restrikčními enzymy za vzniku příslušných konců, příslušné vyplnění kohezních konců, působení alkalické fosfatázy pro zamezení nežádoucího spojování, a ligace příslušnými •a »44» lígázami. Postupy pro takovou manipulaci jsou uvedeny v Maniatis et al,, viz výše, a jsou známy odborníkům.

Molekula riukleové kyseliny, jako DNA, Se považuje za schopnou exprese polypeptidu, kdýž obsahuje nukleotidovou sekvenci nesoucí transkripční a translační regulační informace, “operativně spojenou” s nukleotidovou sekvencí, která kóduje polypeptid. Operativní spojení je vazba, kterou je regulační DNA sekvence a DNA sekvenceurcená k expresi spojena takovým způsobem, který umožňuje genovou expresi. Přesná podstata regulačních oblastí nutných pro genovou exprexi se liší od organismu k organismu, ale obecně zahrnuje promotorovou oblast, která v prókaryotech obsahuje jak promotor (který řídí iniciací transkripce RNA), tak DNA sekvence, které při transkripci do RNA dávají signál pro iniciaci syntézy proteinu. Takové oblasti normálně zahrnují ty 5 '-nekódující sekvence, účastnící se iniciace transkripce a translace, jako T AŤ A box, capping sekvence, GAAT sekvence a tak podobné.

Je-li zapotřebí, z nekódující 3 '-oblasti je protein kódující genovou sekvenci získatelný výše popsaným způsobem. Tato oblast se zachovává pro svou regulační sekvenci transkripční terminace, jako terminace a polyadenylace. Zachováním 3 -oblasti přirozeně sdružené s DNA sekvencí kódující protein, se získají signály transkripční terminace. Když signály transkripční terminace nejsou dostatečně funkční pro expresi v hostitelské buňce, pak $e substituuje 3'-oblast v hostitelské buňce funkční.

Dvě DNA sekvence (jako sekvence promotorové oblasti a sekvence kódující chiméru receptorů T-lymfocytů, B-lymfocytů nebo Fc receptorů) se považují za operativně spojené, když povaha vazby mezi dvěma DNA sekvencemi (1) neústí do Zavedení framc-shift mutace, (2) neinterféruje sé schopnosti sekvence promotorové oblasti řídit transkripci genové sekvence receptorové chiméry, nebo (3) neinterferuje se schopností receptorové chiméry genové sekvence být transkribováhá sekvencí promotorové oblasti. Promotorová oblast jě operativně, spojena s DNA sekvencí, když je promotor schopný ovlivnit transkripci dané DNA sekvence. Pro expresi proteinu jsou nezbytné transkripční a translační signály rozpoznávané příslušným hostitelem.

Předkládaný vynález obsahuje expresi chimémích proteinů receptorů T-lymfocytů, B-lymfocytů nebo Fc receptorů (nebo jejich funkčních derivátů) buď v prokaryotickych nebo eukaryotických buňkách, ačkoliv eukaryorická exprese (zejména lidských lymfocytů) je preferována.

Protilátky podle předkládaného vynálezu jsou připravitelné různými postupy . Například buňky exprimujíčí receptorové chimérní proteiny nebo jejich funkční deriváty mohou být

c.

c c

7C *C *€' «ί C,

C Ci

C C ' c <

• · I? * í? Cl c

eci '*7 c

cí ec a

e> ec qi

CCC

c éc ' C.

C administrovány zvířeti za účelem indukce produkce séra obsahujícího polyklonální protilátky schopné vázaní Chimér; t . v : '

V., upřednostňovaném, postupu jsou' protilátky podle předkládaného vynálezu monoklonální. Takové monoklonální protilátky se připravují ža použití hybridómové techniky (Kóhler et al.; Nátuře 495 (1975); kohíerét al., Éur.' J, Immdinol- 6, 51T (1976); Kohler ét al., Eur? J. Immúnoi. 6,292 (1976); Hammerling etal.,In: Monoclonal Antibódies and T-Cěll Hýbridomas, Elsevier, N.Y., štr. 563-684 (1081)? Obecně takové postupy zahrnují imunizaci zvířete chimémím antigeňem receptorů T-lyinfocytu, B-íymfoeytů nebo Fc receptorů. Splenocyty takových zvířat jsou extrahovány a fúzovány s vhodnou myelomovou buněčnou litin. Jakákoli vhodná myélórnová buněčná linie sé může póúžíť v souladů s předkládaným vynálezem. Po fúzi se výsledné hybridómové buňky selektivně zadrží v HAT médiu a potom klonují mezním ředěním jak popisuje Waňds ět al ? Gastroenterology 80. 225-232 (1981). Takovýmto výběrem získané hyhridořnóvébuňky se pak testují pro identifikaci klonů, které sekretují protilátky schopné še navázat na chiméru. - ’ r

..i ’ Protilátky podle předkládaného vynálezu jsou také polyklonální,nebo lépe regionálně specifické polyklonální ‘protilátky. ».. a''.··>

Protilátky proti chimérám receptorů T-lymfocytů, B-lymfbcytů nebo Fc receptorů podlé předkládaného vynáležuse používají pro monitorování množství chimérních receptorů (nebo ^; buněk nesoucích chimémí réceptory) v pacientech. Takové protilátky jsou vhodné pro použití ve standardních imunodiagnostičních testech známých v oboru, včetně imunómetrických nebo sendvičových testů, jako dopředný sendvičový; zpětný sendvičový nebo simultánní, sendvičový test. Protilátky jsou použitelné v množství kombinací,-jak určíP odborník bez nutnosti experimentování k uřeční přijatelné specifity, sensitivity a přesnosti imunotestů.''

Vydané standardní práce s odkazy na obecné principy imunologie zahrnují Roitt, Esseňtial Immunology, 6. vydání. Blackwéll Scientific Publications, publisher, Oxford (1988); Kimball, Introduction to Immunology, 2.vydání, Macmillan Publishing Co., publisher, New York (1986); Roitt et al., Immunology, Gower Medical Pubíishing Ltd., publisher, London (1985); Campbell, Monoclonal Antibody Technology, iň Buřdón et -al’., publishers, Labóratory Tcchňiqueš in Biochemistryand Molecular Biology, volume 13, Elsevier, publisher, Amsterdam (1984); Klein, Immunology: The Science óf Self-ňonself Discrimination, John Wiley & Sons, publisher; New York (1982); a Kenňett et al;, publishers, Monoclonal Antibódies, Hybridoma: A New Dimeňsion InBioIogicalAnályšeš, Plenům Press, publisher, New York (1980); i --·* ·· * * • · * · « · *····« · • · · « « • · * ··« · « * · * ··*:*··· · · ·

Detekování” zahrnuje určení přítomnosti nebo nepřítomnosti látky nebo kvantifikaci množství látky. Termín se tedy vztahuje na použití materiálů, sloučenin a metod podle předkládaného vynálezu pro kvalitativní a kvantitativní stanovení.

Isolace jiných hybridomů sekretujíčích monoklonální protilátky se stejnou specifitou jako ty zde popsané se provádí technikou atiti-idiotypového vyhledávání (Potocmjak et al., Science 215. 1637 (Í982)). Stručně řečeno, anti-idiotypová protilátka je protilátka, která rozpoznává jedinečné determinanty přítomné na protilátce produkované daným klonem; Anti-idiotypová protilátka se připraví imunizací zvířete stejného druhu, užitého jako zdroj monoklonální protilátky, danou monoklonální protilátkou. Imunizované zvíře rozezná a odpoví na protilátku produkcí protilátky na tyto idiotypové determinanty (anti-idiótypové protilátky).

Pro replikaci se hybridní buňky kultivují jak in vitro, tak ifl vivo. Vysoká produkce ifl vivo upřednostňuje v současnosti tuto metodu kultivace. Stručně řečeno, buňky z individuálních hybridních vláken se intraperitorálně injekčně dopraví do pristane-primed BALB/c myší, aby se produkovala tekutina ascitu obsahující vysoké koncentrace žádaných monoklonálních protilátek. Monoklonální protilátky isotypu IgM nebo IgG se čistí od kulturačního supernatantu pomocí sloupcové chtomatografie, jak je odborníkům známo.

Protilátky podle předkládaného vynálezu Se hodí zejména pro použití v imunotestech, kde se používají v kapalné fázi nebo navázané na pevný nosič. Navíc se protilátky v těchto imunotestech detékovatelně značí různými způsoby.

V dané oblasti se používá mnoho různých značení a způsobů značení. Příklady typů značení použitelných v předkládaném vynálezu zahrnují, ale nejsou omezeny na, enzymy, radioisotopy, fluorescenční sloučeniny, chemoluminiscenční sloučeniny, biolumuniscenční sloučeniny a kovové cheláty: Odborníci znají vhodné značení pro navázání na protilátky, nebo jsou schopni totéž 2jistit použitím rutinní experimentální činnosti. Navíc navázání těchto značení na protilátky se může uskutečnit standardními technikami odborníkům obecně známými.

leden ze způsobů dětekovátelného značení protilátek podle předkládaného vynálezu je navázání protilátky na-enzym. Enzym po-pozdější expozicí se substrátem reaguje se substrátem za produkce chemické sloučeniny, která se detekuje například spektrofotometricky nebo fluorometricky. Příklady enzymů použitelných pro dětekovatelné značení protilátek zahrnují malátdehydrogenázu, stafylokokovou nukleázu, delta-V-steroidní isomérázu, kvasnjčnou alkoholdehydrogenázu, alfa-glycerolfosfatďehýdrógenázu, triosfosátisomerázu, biotinavidinperóxidázu, křenovou peroxidázu, alkalickou fosfatázu, asparaginázu, glukosoxidázu, β-galaktósidázu,

ribonukleázu, ureázu, katalázu, glukos-Vl-fosfátdehydrogenázu, glukoamylázu a apetylcholinesterázu.

Přítomnost detekovatelně značených protilátek se detekuje značením protilátek ;

radioaktivními isotopy, které se stanovují za použití gamma počítače nebo scintilačního počítače. ;

Isotopy zejména použitelné pro účely předkládaného vynálezu jsou ³H, ^l251, ³³P, ^3ÍS,¹⁴ C, ^J1Cr,

Je také možno detekovat navázaní detekovatelně značených protilátek značením protilátek fluorescenční sloučeninou. Po vystavení fluorescenčně značené protilátky světlu o vhodné vlnové délce se její přítomnost detekuje na základě fluorescence barviva. Mezi nejpoužívanější fluorescenční značící sloučeniny patří fluorescein, isothiokyariát, rhódariiin, fykoěrýthrin, fykokyanin, allofykokyanin, o-ftaíaldehyd a fluoreškamin.

Protilátky podle předkládaného vynálezu se detekovatelně znáči také za použití fluorescenčně emitujících kovů jako ^1SiEu, nebo dalších z řady lanthanoidů, Tyto kovy se připojují na molekulu protilátky za použiti takových kov chelatujíeích skupin jako diethylenteriaminpentaoctová kyselina (DTPA) nebo ethylendiamiritetráoctová kyselina (EDTA). j

Protilátky se také detekovatelně značí spojením s éhemóluminisceňČními sloučeninami. r

Přítomnost protilátky s navázanou chemoluniiniscenční sloučeninou se určuje detekcí přítomnosti luminiscence, která vzniká během chemické reakce. Příkladem zejména použitelných chemolumtniscenčně značících sloučenin jsou luminal, isoluminal, theromatický akridiniuméster, $ imidazol, ákridiniové sole, oxalátester a dioxetan.

Podobně se ke značení protilátek podle předkládaného vynálezu používají biohiminiscenční sloučeniny. Biolummiscence je typem chemólumiriiscence nacházené u biologických systémů, ve kterých katalytický protein zvyšuje účinnost chemoluminiscenční reakce.

Přítomnost bioluminiscenční protilátky sé určuje detekcí přítomnosti luminiscence Mezi důležité biohiminiscenční sloučeniny pro účely značení patří luciferin a lucíferázaequorin.

Protilátky a subštanciálně čištěný aritigen podle předkládaného vynálezu se ideálně hodí pro přípravu kitu. Takový kit zahrnuje kompartmentalizovaný nosičový prostředek á oddělené jedno nebo více zásobníkových zařízení jakó vialky, zkumavky nebo podobně, každé ze zásobníkových zařízení obsahuje oddělené součásti.testu.

Je mnoho.typů testů, které tvoří kity, a zahrnují například kompetitivní a nekompétitivní testy. Typické příklady testů, které užívají protilátky podle vynálezu, jsou radioimunotesty (RIA), enzymové imunotesty (EIA), enzym vážící imunosorbentní testy (ELIA).a imunometrické nebo ·♦ ··« ♦ • ·« « · · · · • · « « * · · • · · · #»<»·· • · ♦ · · · »» ·*»· ··· ··*· *» * sendvičové imunotesty.

Termín “imunometričky test” nebo “sendvičový imunótest” zahrnuje simultánní · sendvičově, dopředně a zpětné sendvičové imunotesty. Těmto termínům odborník rozumí. s

Odborník také uvítá, že protilátky podle předkládaného vynálezu se užijí v jiných variacích a formách testů; které jsou v současnosti známy nebo které se vyvinou v budoucnu. Ty se zahrnují do obsahu předkládaného vynálezu.

V preferované formě prováděni tesťů jé důležité, že v inkubačním médiu jsou přítomny určité blokátory (většinou přidávané se značenou rozpustnou protilátkou). “Blokátory” se přidávají pro zaručení, že nespecifické proteiny, próteázy nebo lidské protilátky na myší í imunoglobuliny, přítomné v experimentálním vzorku, nebudou zesíťovávat nebo ničit protilátky na pevném nosiči, nebo radioaktivně značené indikační protilátky, k vyloučení chybných pozitivních nebo chybných negativních výsledků. Výběr blokátofů proto přispívá skutečně ke specifitě testů popsaných v předkládaném vynálezu.

Zjistilo še, že jako “blokátory” se může použít množství nerelevantních (tzn. nespecifických) protilátek ze stejné třídy nebo podtřídy (isotypu) jako ty použité v testech (například _P

IgG_b IgG^, IgM atd.). Koncentrace “blokátorů” (běžně 1-100 pg/μΐ) je důležitá k udržení v správné sensitivity a k inhibicí jakékoliv nežádoucí interference s vyskytujícími se vzájemně křížově reagujícími proteiny v lidském séru. Pufrůvaný systém obsahující “blokátory” je nutné navíc optimalizovat. Preferované pufry jsou ty založené na slábých organických kyselinách, jako í imidazol, HEPPS, MOPS, TES, ADA, ACES, HEPES, PIPES, TRIS a podobně, v rozmezí fyziologického pH. Méně preferované jsou anorganické pufry jako fosfátový, borátový nebo karbonátový. K pufru obsahujícímu “blokátory” se nakonec přidají Známé proteázové inhibitory (běžně 0.01-10 pg/ml).

Je mnoho imunoadsorběntu na pevné fázi, které se mohou použít v předkládaném vynálezu. Známé imunoadsorbenty zahrnují sklo, polystyren, polypropylen, dextran, nylon a další materiály veToťmě trubic, žm a mikrotitřaČníčh mističek, vytvořených z nebo obalených daným materiálem a tak podobně. Imobilizované protilátky, se buď kovalentně nebo fyzikálně vážou na pevnou fázi imunoadsorběntu technikou kovalentní vazby prostřednictvím amidové nebo esterové vazby, nebo absorpcí. Odborníci znají mnoho dalších vhodných pevných fází s imunoadsorbenty a postupy pro imobilizaci protilátek nebo jsou Schopni 10 zjistit za použití rutinní experimentální Činnosti.

Pro diagnózu in vivo. in vitro nebo in sítu se značení jako radionuklidy vážou na protilátky • ··

9 9 ·

• · · • · «·« ··«· ·« « * • · • · · • · ··· ··«· ·· ·♦·· « · · • · · · · « • · ·· * podle předkládaného vynálezu buď přímo, nebo prostřednictvím intermediární funkční skupiny. Intermediámí skupina, která se často používá pro navazování radionuklidů vyskytujících se ve formě kovových kationtů, je diethylentriamiripentaoctová kyselina (DTPA). Typickým příkladem kovových kationtů vázaných tímto způsobem jsou: 'Tc, ^,23I, ⁱⁿIn, ’³¹Í, ⁹⁷Ru, ⁶⁷Cu, ⁶⁷Ga a ⁶⁸Ga. Protilátky podle vynálezu se značí také neradioaktivními isotopy přo účely diagnózy. Zejména používané prvky jsou ^lí7Gd, ^í5Mn, ¹⁶²Dy, ⁵²Cr a ^í6Fe.

Antigen podle vynálezu se isoluje v substanciálně čisté formě za použití protilátek podle předkládaného vynálezu. Uspořádáni předkládaného vynálezu poskytuje substanciálně čisté chiméry receptorů T-lymfocytů B-lytnfocytů a Fc receptorů, zmíněný antigen je charakterizovaný tím, že je rozpoznáván a váže se na protilátky podle předkládaného vynálezu. V jiném uspořádání předkládaný vynález poskytuje metodu isolace nebo čištění receptorového chimérního antigenu, vytvářením komplexu zmíněného antigenu s jednou nebo více protilátkami směrovanými proti receptorové chiméře.

Substanciálně čisté chimérní antigeny receptorů T-lymfocytů B-lymfocytů a Fc receptorů podle předkládaného vynálezu se zpětně používají k detekování nebo měření protilátky proti chiméře ve vzorku jako sérum nebo moč. Tak jedno uspořádání předkládaného vynálezu zahrnuje metodu detekování přítomnosti nebo množství protilátky

T-lymfocýtů B-lymfocytů a Fc receptorů ve vzorku, zahrnující kontakt vzorku obsahujícího protilátku proti chiměfnímu antigenu s detekovatelně značenou receptorovou chimérou a detekci zmíněného značení. Ocení sé, že jsou také použitelné imunoreaktivní frakce a Ímunoreaktivm analogy chiméry. Termín “imunoreaktivní frakce” znamená jakoukoli doménu chimérního antigenu, která vykazuje ekvivalentní imunitní odpověď na protilátku směrovanou proti receptorové chiméře. Termín “imunoreaktivní analog” označuje protein, který se liší od proteinu receptorové chiméry jednou nebo více aminokyselinami, ale který vykazuje ekvivalentní imunitní Odpověď na protilátku podle vynálezu.

“Specificky rozpoznává a váže se” znamená, že protilátka rozpoznává a váže. se na polypeptid chimérního receptorů, alé Substanciálně nerozpoznává a neváže se na neodpovídající molekuly ve vzorku, například v biologickém vzorku.

“Autoimunitou generovaná buňka” znamená buňky produkující protilátky, které reagují s hostitelskou tkání nebo imunitním efektoremTďymfocýtů, které jsou autoreaktivní; takové buňky obsahují protilátky proti acétylcholínovým receptorům (vedoucí, například k myasthenia gravis) nebo protilátky proti DNA, proti erythrocytům a proti destičko vám (vědoucí například k lupus erythématosus). » “Terapeutická buňka” označuje buňku, která se transformovala chimérou podle vyn álezu, í takže je schopná rozpoznávání a ničení specifických infekčních Částic, buněk infikovaných J specifickými částicemi, nádoru nebo rakovinových buněk, nebo autoimuňitou generovaných >

buněk; přednostně jsou takové terapeutické buňky buňkami hěrnátopóietického systému. ’ “Cílová infekční Částice” označuje jakoukoli infekční částici (například virus, bakterii, protozoa nebo houbu), která je rozpoznávána terapeutickou buňkou nesoucí chimémí receptor; >

“cílová buňka” značí jakoukoli hostitelskou buňku, která je rozpoznávána terapeutickou buňkou nesoucí chimérní receptor; cílové buňky zahrnují, bez omezem, hostitelské buňky infikované virem, bakterii, protozoem nebo houbou, stéjně jako nádorové nebo rakovinové buňky a autoimuňitou generované buňky. -?

“Extracelulární” znamená, že alespoň doména molekuly je umístěna na buněčném povrchu. “Intracelulární” znamená, že alespoň doména molekuly je umístěna v cytoplazmě ?

terapeutické buňky. “Transmembránový” znamená, že alespoň doména molekuly překlenuje ?

plazmatickou membránu. “Extracelulární doména”, “intracelulární doméha” a “transmembránová ?

doména”, jak je zde označena, zahrnuje boční sekvence aminokyselin, které se rozšiřují do 3 sousedních buněčných kompartmentů.

“Oligomerizovat” označuje kompléxovat s jinými proteiny za vytvoření dimerů, trimerů, » tetramérů, nebo oligomerů vyššího řádu. Takové oligomery jsou homoóligomery nebo í héterooligomery. “Oligotnerujízící dorfléna” označuje oblast molekuly, která řídí vytváření komplexů (tzn. oligomerů).

“Cytolytický” znamená být schopný destrukce buňky (například buňky infikované pathogenem, nárorové nebo rakovinové buňky, nebo autoimuňitou generované buňky) nebo být schopný destrukce infekční částice (například viru).

“Virus imunodeficíence” označuje retrovirUs, který v divoké formě je schopen infikovat T4 buňky hostitele primátu a má virovou morfogeflezi a morfologii charakteristickou pro podrodinu lentivirů. Termín bez omezení zahrnuje všechny varianty HIV a SÍV, včetně HIV-1, HIV-2, SIVmac, SlVagm, SIVmnd, SIVsmm, SIVman, StVmand a SIVcpz.

“Nezávislý ňa MHC znamená, že buněčná odpověď nevyžaduje přítomnost MHC třídy

II antigenu na povrchu cílové buňky.

“FurikČní derivát převádějící cytolytický signál” označuje iunkční derivát (jak je definován výše), schopný řízení alespoň 10%,40%, 70%, nejlépe 90% biologické aktivity divokého typu molekuly. Ják se zde používá, “funkční derivát převádějící cytolytický signál” signalizuje přímo terapeutické buňce zničit částice nebo buňky navázané na receptor (například v případě * intracelulámí chimérňí receptorové domény), nebo nepřímo podporuje óligomerizači s proteiny $ převádějícími cytolytický signál terapeutické buňky (například v případě transmembránové ·* domény). Takové deriváty se testují na ύόΐηηοδζ například s použitím in vitro testů zde popsaných.

“Funkční derivát vážící HlV-obálku” označuje funkční derivát (jak je. definován výše), s schopný vázat obálkový HIV protein. Funkční deriváty se identifikují za použití in vitro testů zde popsaných.

Terapeutická administrace. Transformované buňky podle předkládaného vynálezu jsou použitelné pro terapii množství chorob Současné metody administrace transformovaných buněk zahrnují adoptivní imuňotéřapie nebo.terapie buněčného přenosu. Tyto metody umožňují návrat buněk transformovaných imunitním systémem do krevního řečiště (Rosenberg, Sci. Am. 62 ?

(květen 1990); Rosenberg et al., New. Engl. I Med. 323, 570 (1990)).

Farmaceutické přípravky podle vynálezu sě administrují jekémukoliv živočichu, který vyzkouší prospěšné účinky sloučenin podle vynálezu. Néjpřednější jsou lidé, ačkoliv vynález tak r limitovánňení. >

Detailní popis, nejprve jsou popsány obrázky. j

Stručný popiš obrázků. Obr. 1A ukazuje aminokyselinovou, sekvenci v místě fuze mezi j

ČD4 (zbytky 1-369) a různými receptorovými řetězci (sekvence ID NOS; 28-31). Podtržená sekvence ukazuje místo aminokyselin kódovaných v BamHI místě používaném pro fúzní konstrukci. Začátek transmembránové domény je označen svislou čarou. Sekvence η je identická sě sekvencí ζ na amino-konci, ale liší se na karboxylovém konci (Jin et.ál., Proč. Natí. Acad. Sci.

USA 87, 3319-3323 (1990)). Obr. 1B ukazuje průtokovou cýtometrickou analýzu povrchové exprese CD4, CD4:£, CD4:y a CD4;q v CV1 buňkách. Buňky byly infikovány virem exprimujícím CD4 chiméry nebo CD16p,, inkubované 9 hodin při 37 °C a barveny fykoerytrinem konjugovaným anti CD4 MabLeu3A.

Obr. 2 ukazuje povrchovou expresi CD16^ následující po koinfekei samotným CD 16^, (tečkované), nebo koinfikovaným virem exprimujícím CD4y (čárkovaně) nebo CD4;£ . (nepřerušovaně). Řídké tečkování značí buňky infikované samotným CD4 C, barveným 3 G8 (Fleit etal., Proe. Nati. Acad; Sci. USA 79, 3275-3279 (1982)) (ánti-CDl 6 Mab).

Obr. .3 ukazuje povrchovou expresi CD16_TM následující po koinfekei viry exprirnújícimi ^u I I, wi' 'ί· 20 -.iřCD 16^ a následující ( chiméry: CD4:( (silná Čára), CD4:( CllG (nepřerušovaně); CD4:( (čárkovaně); CD4:( Cl 1G/D15G (tečkované); bez koinfekce (samotné CD 16^ řídké tečkování). Buňky byly inkubovány s anti-CD16 Mab 3G8 a fykoerythrinem konjugovariým Fab'₂ kozími protilátkami ha myší IgG. Úroveň exprese chimér ζ bylá v podstatě identická pro různé analyzované mutanty, a koinfekce buněk viry exprimujícími CD 16^, a ( chiméry nezměnila značně povrchovou expresi chimér.

Obr. 4A-D ukazuje zvýšení intracelulámích volných vápenatých iontů po zesíťování mutantních chimér ( v linii T-lymfocytů. Jurkat E6 buňky (Weiss et al., J. Immunol. 133, 123-128 (1984)) byly infikovány rekombinantním vaccinia virem a analyzovány průtokovou cytometrií. Ukázané výsledky jsóu pro propuštěnou populaci CD4+, takže analyzovány jsou pouze buňky exprimující relevantní ehimérni protein. Střední průměr fialové k modré Indo-1 fluorescenci reflektuje intracélulární koncentraci volného vápníku v populaci jako celek a procenta respondujících buněkreflektují frakci buněk přesahujících předurčený prahový poměr (stanovený tak, že 10 % neupravených buněk je pozitivních). Obr. 4A a Obr. 4B ukazují Jurkat buňky exprimující CĎ4:( (nepřerušovaně) nebo CD16:( (čárkovaně), které byly vystaveny ánti-CD4 Mab Leu3A (fykoerythrinový konjugát), po zesíťování s kozími protilátkami na myší IgG. Tečkované je vyznačena odpověď neinfikovaných buněk na anti-CD3 Mab 0KT3. Obr. 4C aObr, 4D ukazují Jurkat buňky exprimující CD4:( D15G (nepřerušovaně); GD4:( C11GZD15G (čárkovaně); nebo CD4;( Cl IG (tečkované), které byly upraveny a analyzovány jako v obr. 4A a4B.

Obr. 5A-C ukazuje, že CD4:(, CD 4 η a CD4 γ receptory umožní cytolytickým T-lymfocytům (CTL) zabíjet cíle exprimující HIV-1 gpl 20/41. Obr. 5A: plné kroužky, CTL exprimující CĎ4.( inkubované s HeLa buňkami exprimujícími gpl20/41; prázdné kroužky, CTL exprimující CD4:( inkubované s neinfikovanými HeLa buňkami; plné Čtverce, neinfikované CTL inkubované s HeLa buňkami exprimujícími gpl 20/41; prázdné čtverce, neinfikované CTL inkubované s neinfikovanými HeLa buňkami. Obr. 5B: plné kroužky, CTL exprimující CD4:B inkubované s HeLa buňkami exprimujícími gp 120/41; prázdné kroužky, CTL exprimující CD4:y inkubované s HeLa buňkami exprimujícími gpl20/41; prázdné čtverce, CTL exprimující C11G/D15G dvojitě mutantní CD4:( chiméru inkubované s HeLa buňkami exprimujícími gpl20/41. Obr. 5C: Průtoková cytométrická analýza CD4 exprese CTL použitými v obr. 5B. Pro korekci poměru mezi cílem a efektorem, procenta buněk exprimujících CD4 Chiméru se určila odčítáním stupnice negativní (neinfikované) populace histogramovou superpozicí; pro

·· · »· · ·· komparativní účely v tomto Obrázku neinfikované buňky byly označeny arbitrálňím prahem, který dává zhruba stejnou frakci positivní pro další buněčné populace jako histogramové odečítání.

Obr. 6A-B ukazuje specifítu CD4-řízené cytolýžy. Obr. 6A: plně kroužky, CTL exprimující 'CD4:( inkubované s HeLa buňkami exprimujícími CD 1¾ prázdné kroužky, CTL exprimující CD4 inkubované s HeLa buňkami exprimujícími gpl20; plné Čtverce, CTL exprimující CD16:( inkubované s HeLa buňkami exprimujícími gp!20/41; prázdné čtverce, CTL exprimující CDl6_Pl inkubované s HeLa buňkami exprimujícími gp120/41. Obr. 6B: plné kroužky, CTL exprimující CD4:£ inkubované s Ráji (MHC claSs lit) buňkami; prázdné kroužky, neinfikované CTL buňky inkubované s RJ2.2.5 (MHC class IF Ráji mutant) buňkami; prázdné Čtverce, CTL exprimující CD4:C inkubované s RJ2.2.5 (MHC class II') buňkami: Pořadnicové měřítko je zvětšeno.

Obr. 7A-B ukazuje charakterizaci CD 16:ζ chimémího receptorů. Obr. 7A je schematický diagram CDl 6: ζ fúzního proteinu. Extracelulární doména fosfatidylinositoiem vázané Formy mpnomemího CD16 byla připojena k dimémímu ζ právě externě s transmembránovou doménou. Proteinová sekvence v místě fuzního spojení je uvedena dole (sekvence ID NOS: 32, 33). Obr. 7B ukazuje průtokovou eytómetrickou analýzu mobilizace vápníku po zesíťováňí CD16:( chiméry buď v TCR pozitivní nebo TČR negativní buněčné linii. Je ukázán střední poměr fialové a modré fluorescence (měřítko relativní konceritrace vápenatých iontů) v buněčné populaci vystavené protilátkám v čase 0. Plné čtverCej odpověď Jurkat buněk na anti-CD3 Mab 0KT3; plné trojúhelníčky, odpověď CD16:( na anti-CD16 Mab 3G8 zesíťováním v REX33A TCR' mutantu; prázdné čtverce, odpověď CD16:£ zesíťováním v Jurkat TCR' mutaňtní linii JRT3.T3.5; prázdné trojúhelníčky, odpověď CD16:( zesíťováním v Jurkat buňkách; křížky, odpověď nečhimémích ČĎ16 v Jurkat buňkách; tečky, odpověď nechimémích CD16 v REX33A TCR' buněčné linii.

Obr. 8A-B ukazuje deleční analýzu cytolytického potenciálu. Obr. 8A ukazuje lokaci konečného bodu ζ delece. Zde jako jinde mutace v (jsou representovány původní zbytkovou konvencí zbytek-lokace-mutant, takže například D66* označuje nahrazeni Asp-66 terminačním kodonem. Obr. 8B ukazuje výsledky cytolytických testů nedeletované CD16:( a vyčnívajících ζ délecí. Hybridomové buňky exprimující povrchové protilátky k CD 16 byly vystaveny ⁵¹Cr a inkubovány s narůstajícím počtem lidských cytolytických lynífocytů (CTL) infikovaných rekombinanty vákcinia viru exprimujícími CD16:£ chiméry. Procenta uvolněného ^s,Cr jsou vynesena jako funkce poměru efektoru (CTL) k Cílové (hybridomové) buňce (e/t). Plné kroužky, «· · « · • * • * » · ♦ ·· cytólýza zprostředkovaná buňkami exprimujíčími CD16;( (mfi 18.7); plné čtverce, cytolýza zprostředkovaná buňkami exprimujíčími CD16;( Asp66*(mfi 940 2), prázdné čtverce, cytolýza zprostředkovaná buňkami exprimujíčími GDI6:(Glu60* (nifi 16.0); prázdné kroužky, cytolýza Zprostředkovaná buňkami exprimujíčími CD16:(Tyr51* (mfi 17.4); plné trojúhelníčky, cytolýza zprostředkovaná buňkami exprimujíčími CD 16:(Phe34* (mfi 17.8); a prázdné trojúhelníčky, cytolýza zprostředkovaná buňkami exprimujíčími nechímémí CD 16 (mfi 591). Ačkoliv v tomto experimentu exprese CD16:( Asp66* nebyla srovnatelná s ostatními fúzními proteiny, cytólýza buňkami exprimujíčími CD16.( na ekvivalentní úrovni ve stejném experimentu dála výsledky v podstátě identické s těmi ukázanými u buněk exprimujících GDI6:( Asp66.

Obr. 9A-D ukazuje, že eliminace potenciálu pro transmembránové interakce odhaluje krátký ζ segment schopný zprostředkovat cytolýzu. Obr. 9A je schematický diagram monomerních bipartitních a tripartitních chimér. Nahoře je GDI 6:( konstrukt ukončený u zbytku 56 a postrádající transmembránové Cys a Asp zbytky. Dole jsou CD 16:CD5:( a CD16:CD7:( konstrukty a odpovíďajíví kontroly. Peptidové sekvence intracelulárních domén jsou ukázány níže (sekvence ID NOS: 35-37). Obr. 9B ukazuje cytolytickou aktivitu delečních mutantů monomerní chiméry. Cytolytieká aktivita buněk exprimujících CĎ16:( (plné kroužky; mfi 495) byla porovnána s aktivitou buněk exprimujících CD16:( Asp66* (plné čtverce; mfi 527) nebo mutanty CD16:(Cysl lGly/Aspl5Gly/Asp66*, (prázdné čtverce; mfi 338) a CD16:(Cysl lGly/Aspl5Gly/Glu6O* (plné trojúhelníčky; mfi 259). Obr. 9Č ukazuje cytolytickou aktivitu zprostředkovanou tripartitními fúzními proteiny. Plné trojúhelníčky, GDI6:ζ Asp66*; prázdné čtverce, CD16:5:((48-65); plně čtverce, CĎ16:7:((48-65); prázdné trojúhelníčky, CDl6:7;((48-59); prázdné kroužky, CĎ16:5; plné kroužky, CD 16:7. Óbr. 9D ukazuje mobilizaci vápníku mutantními a tripartitními chimérami v TCR negativní Jurkat JRT3.T3.5 mutantní buněčné linii. Prázdné kroužky, odpověď buněk exprimujících dimerní CD16:<Asp66*; plné čtverce, odpověď buněk exprimujících CD16:(CysllGly/Aspl5Gly/Asp66*; prázdné čtverce, odpověď buněk exprimujících CD16:(CýsllGlý/Aspl5Gly/Ghi6Ů*; plné trojúhelníčky, odpověď buněk exprimujících CD16:7:((48-65); a prázdné trojúhelníčky, odpověď buněk exprimujících CD16:((48-59).

Obr. 10A-F ukazuje příspěvek jednotlivých aminokyselin k aktivitě 18-zbytkového motivu převádějícího cytolytický signál. Obr. 10A a 1ÓB ukazuje cytolytickou aktivitu a Obr. 10C ukazuje mobilizaci vápenatých iontů zprostředkovanou chimérami nesoucími bodovou mutaci blízko karboxyl-termiháimho tyrosinu (Y62). Obr. 10A a 10B presentují údaje, získané na

_ 23 buňkách exprimujících nízké, respektive vysoké množství CD16:( fúzňích proteinů. Pro mobilizaci vápníku a cytolytické testy jsou použity stejné symboly, které jsou ukázány jako jednopísmenný kód vpravo. Plné kroužky, buňky exprimující CD16:( (mfi v A, 21; B, 376); plné čtverce, buňky exprimující CD 16:7:((48-65) (mfi A, 31; B, 82); prázdné Čtverce, CD16:7:((48-65)Glu60Gln (mfi A, 3; B, 92); křížky, CD16:7:((48-65)Asp63Ans (mfi A, 30; B, 74); plné trojúhelníčky, CD16:7:((48-65)Tyr62Phe (mfi A, 24; B, 88); prázdné kroužky, CD16:7:((48-65)Glu61Gln (mfi A, 20; B, 62); a prázdné trojúhelníčky, CĎ16:7:((48-65)Tyr62Ser(mfi B, 64) Obr. I0D a 10E ukazuje cytolytickou aktivitu a Obr. 10F ukazuje mobilizaci vápenatých iontů zprostředkovanou chimérami nesoucími bodovou mutaci blízko amino-terminálního tyrosinu (Y51). Pro mobilizaci vápníku a cytolytické těsty jsou použity stejné symboly, které jsou ukázány vpravo. Plné kroužky, buňky exprimující ČD16:( (mfi vD, 21.2; v E, 672); plné čtverce, buňky exprimující CDl6:7:((48-65) (mfi D, 31.3; E, 179); plné trojúhelníčky, CDl6:7:((48-65)Asn48Ser (mfi D, 22.4; E, 209); prázdné čtverce, CD16:7:((48-65)Lcu50Ser (mfi D, 25.0; E, 1.42); a prázdné trojúhelníčky, CĎ16:7:((48-65)Tyr51Phe (mfi D, 32.3; E, 294).

Obr. I1A-B ukazuje seskupení vnitřních opakování ζ a porovnání jejich Schopnosti podporovat cytolýzu. Obr. 11A je schematický diagram chimér tvořených rozdělením ζ iňtracelulární domény na třetiny a přičleněním k transmembránové doméně CD 16:7 chiméry. Sekvence intracelulámích domén jsou ukázány níže (sekvence ID NOS: 38-40), se zarámovanými sdílenými zbytky a odpovídajícími zbytky označenými hvězdičkou. Obr. 11B ukazuje cytolytickou sílu tri ( subdomén. Plné kroužky, buňky exprimující CD 16: ( (mfi 476); plné Čtverce, CD16:7:((33-65) (mfi 68); prázdné čtverce, CD16:7:((71-lO4) (mfi 114); a plné trojúhelníčky, CDl6:7:((104-138) (mfi 104).

Obr. 12 je schematický diagram CD16:FcRyII chimér.

Obr. 13A-B ukazuje mobilizaci vápníku následující po zesíťování CD4:FcRyII a CDlóFcRylI chimér. Obr. 13A ukazuje poměr fialové k modré fluorescenci emitované buňkami vystavenými· vůči vápníku seňsitivnímu fluófbru Inďo-1, vyjádřený jako funkce časů po zesíťování CD16 extracelulární domény s protilátkami; Obr. 13B ukazuje podobnou analýzu nárůstu v poměru fialové k modré fluorescenci buněk nesoucích CD4:FčRyII chiméry, po zesíťování s protilátkami.

Obr. 14A-B ukazuje cytolytické testy CD4:FcRyII a CDló FcRylI chimér. Obr. 14A ukazuje procenta ^5,Cr uvolněného z anti-CD16 hybridomových (citových) buněk pó expozici buněk vzrůstajícímu množství cytotoxických T-Iymfocytů exprimujících CD 16 FcRylI chiméry (efektorové buňky). Obr. 14B ukazuje podobnou analýzu cytotoxicity zprostředkované CD4;FcRyíI chimérami proti cílovým buňkám exprimujícím HTV obálkové glykoproteiny.

Obr. 15A-Ě ukazuje identifikaci zbytků v A okraji FčRylI, které jsou důležité pro cytolýzu. Obr. 15A je schematický diagram delečních konstruktů. Obr. 15B a 15C ukazuje mobilizad vápníku a cytolýzu u variant s karboxyl-terminálnínn délečemi CDl6:FcRyII A. Obr. 15D a 15E ukazuje mobilizaci vápníku a cytolýzu tripartitními chimérami nesoucími postupně méně od amino-koněe z intracelulámího kraje CD16:FcRyJI A.

Obr. 16 (sekvence ID NO: 24) ukazuje aminokyselinovou sekvenci CĎ3 delta receptorového proteinu; orámovaná sekvence představuje preferovanou doménu převádějící cytolytický signál.

Obr. 17 (sekvence ID NO: 25) ukazuje aminokyselinovou sekvenci T3 gama receptorového proteinu; orámovaná sekvence představuje preferovanou doménu převádějící cytolytický signál.

Obr. 18 (sekvence ID NO: 26) ukazuje aminokyselinovou sekvenci mbl receptorového proteinu; orámovaná sekvence představuje preferovanou doménu převádějící Cytolytický signál.

Obr. 19 (sekvence ID NO: 27) ukazuje aminokyselinovou sekvenci B29 receptorového proteinu; orámovaná sekvence představuje preferovanou doménu převádějící cytolytický signál.

Příklady provedení vynálezu

Příklad I

Konstrukce chimér lidský IgGTreceptor. Sekvence těžkého řetězce lidského IgG byly připraveny spojením sekvencí v C„3 doméně s cDNA fragmentem odvozeným od 3 -konce transmembráňové formy mRNA protilátky. 3 '-Koncový fragment se získal reakcí řetězové polymerázy s použitím tonsilově cDNA knihovny jako substrátem a oligonukleotidů o sekvencích:

CGC GGG GTG ACC GTG CCC TCC AGC AGC TTG GGC (sekvence ID NO; 7) a

CGC GGG GAT CCG TCG TCC AGA GCC CGT CCA GCT CCC CGT CCT GGG

CCT CA (sekvence ID NO: 8), odpovídajících 5 -, respektive 3'-koncům žádaných DNA fragmentů. 5'-Oligonukleotid je komplementární k místu C,,l domény lidského IgGl a 3-oligonukleotid je komplementární • · · ·· · » · ··· « k místu 5'-sekvence kódujícímu doménu membránového rozpětí. PCR produkt se štěpil BstXI a BamHI a ligoval mezi BstXI a BamHI místy semisyntetického genu IgGl protilátky nesoucího variabilní a konstantní oblasti. Po inzerci BstXI k BamHI fragmentu, amplifikované domény konstruktu byly nahrazeny až k Smál místu Č_H3 restrikční záměnou fragmentu, takže pouze doména mezi Smál místem a 3'-oligonukleotidem byla odvozena z PCR reakce.

K vytvoření lidského IgGl:£ chimémíh o receptoru, těžký řetězec genu končící v místě BamHI se spojil s BamHI místem ζ chiméry popsané níže, takže protilátkové sekvence vytvořily extřačelulámi doménu. Průtoková cytometrie COS buněk transfektovaných s plasmidem kódujícím chiméru ukázala vysokou úroveň exprese protilátkóvých determinantů, když se lehký řetězec cDNA kódující expresi plasmidu kotransfektoval, a mírnou expresi protilátkových determinantů, když plasmid exprese lehkého řetězce nebyl přítomen.

Podobné chiméry včetně lidských IgGl fúzující s ή nebo γ (viz níže), nebo jakékoli signál převádějící domény proteinu receptoru T-lymfocytů nebo Fc receptoru se obecně konstruují, jak je popsáno výše, za použití standardních technik molekulární biologie.

K vytvoření jednoduché transkripční jednotky, která by Umožnila expresi jak těžkých, tak lehkých řetězců z jednoduchého promotoru, ze sekvencí kódujících těžký a lehký řetězec se vytvořil plasmid kódující bicistronovou mRNA, a 5'-nepřeložená doména mRNA kódující 78kD. protein regulovaný glukózou, jinak známý jako grp78, nebo BiP. grp78 sekvence se získaly pomocí PCR z lidské genómové DNA S použitím primerů o sekvencích:

CGC GGG CGG CCG CGA CGC CGG CCA AGA CAG CAC (sekvence ID NO: 9) a

CGC GTT GAC GAG CAG CCA GTT GGG CAG CAG CAG (sekvence ID NO: 10) ná 5'-, respektive 3'-konci. Pólyměrázóvé řetězové reakce s těmito oligonukleotidy se prováděly y přítomnosti 10% dimethýlsulfoxidu. Fragment získaný PCR se Štěpil Ňotl a HincII a začlenil mezi Not! aHpal místa po proudu sekvencí kódujících lidský IgGl. Sekvence kódující cDNA lidského IgGl· kapa lehkého řetězce se pak Začlenily po proudu od grp78 vodiče, s použitím HincII místa a dalších míst ve vektoru. Plasmid exprese, získaný těmito manipulacemi se skládal ze semisyntetického genu těžkého řetězce^ následovaného vodícími grp78 sekvencemi, následovanými cDNA sekvencemi kapa lehkéhó řetězce a polyadenylačními signály odvozenými od SV40 DNA fragmentu. Ve srovnání s transfekcí plasmidu kódujícího determinanty samotného těžkého řetězce, dala transfekce COS buněk s plasmidem exprese značně zlepšenou expresi determinantů těžkého řetězce.

K vytvoření bicistronového genu zahrnujícího chiméru těžký řetězec/receptor a lehký

řetězec, sekvence proti proudu těžkého řetězce se nahradí jakýmkoli chimémím těžký řetězeč/řeceptor genem zde popsaným.

Příklad?

Konstrukce CD4 reeeptořoyých Chimér. Lidské ζ (Weissman etal., Průc. Nati. Acad. Sci, USA S£, 9709-9713 (1988b)) a γ (Kustner et al., 1 Biol. Chem 265,6448-6452 (1990)) c DNA byly izolovány polymerázovou řetězovou reakcí z knihoven připravených z nádorové buněčné linie HPB-ALL (Aruffo et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 84, 8573-8577 (1987b)) a z lidských přirozených zabíječských buněk, zatímco η cDNA (Jin et al., Proč. Nati. Acad. Sci, USA 87, 3319-3323 (1990)) byla izolována z kuřecí thymocytové knihovny, ζ, η, a γ cDNA se připojily k extracelulárňí doméně manipulované formy CD4 obsahující BamHI místo právě po proudu domény překlenující membránu (ArufFo et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA §4, 8573-8577 (1987b); Zettlmeissl etal., DNA Cell Biol. 9, 347-353 (1990)), která se připojila k BamHI místu přirozeně se vyskytujícímu v ( a η cDNA v podobné lokaci několik zbytků po proudu domény překlenující membránu (sekvence ID NOS: T, 3,4 a 6). K vytvoření fúzního proteinu s γ, BamHI místo se vytvořilo v přibližně stejné lokaci (obr. 1; sekvence ID NO; 2 a 5), Genově fuze se začlenily do plasmidu exprese vakcinia viru, nesoucího Ě. coli. gpt gen jako selěktabilní markér, a začleněného do genomu vakcinia WR vlákna homologní rekombinanči a selekcí pro růst v kyselině mykofenolově (Falkner et al., I Víro. 62, 1849-1854 (1988); Boyle et al., Gene 65,

123-128 (1988)). Průtoková cytometrická analýza ukázala, že vakcinia rekombinanty řídí nadbytečnou produkci ČD4.( aCD4;y fuzních proteinů na buněčném povrchu, zatímco exprese CD4:rj je podstatně slabší (Obr. IB). Druhé zjištění je v souladu s nedávnou zprávou, že transfekce plasmidu exprese η cDNA do kuřecí hybridomové buněčné linie dalo podstatně nižší expresi než transfekce srovnatelného plasmidů ζ exprese (Clayton et al., J. Exp Med. 172, 1243-1253 (1990)). Imunoprecipitace buněk infikovaných vakcinia rekombinanty ukázala, že fužní proteiny tvoří kovalehtní diméry, na rozdíl od přirozeně se vyskytujícího CD4 antigenu. Molekulové hmoty monomemích CD4:£ a CD4:y fuzních proteinů a nativní CD4 bylý zjištěny 63, 55 a 53 kD, Vyšší hmóty fuzních proteinů jsou pnblíšiě v souladu s větší délkou intracelůíárm domény, která přesahuje délku nativní CD4 o 75 (CD4.Q nebo o 5 (CD4;y) zbytků.

-9 · ··

9* ·

Příklad 3

CĎ4 chiméry mohou asociovat s jinými receptorovými řetězci. Exprese na buněčném povrchu lidské formy FcyRin (CD16™) makrófágu/přirózené zabíječské buňky ná transfektantech je usnadněna kótransfekčí s kuřecím (Kurosaki ét al.. Nátuře 342, 805-807 (1989)) nebo lidským (Hibbs et.al., Science 246. 1608-1611 (1989)) γ, stejně jako lidským ζ (Lanier. et al., Nátuře 342, 803-805 (1989)).

V souladu s touto zprávou, exprese chimér také umožňuje povrchovou expresi GD I 6™, když je dodán cílovým buňkám buď kótransfekčí neb o koirifekcírekombinantními vakcinia viry (Obr. 2). Podpora CD 16™ povrchové exprese ζ byla výraznější než podpora γ (Obr. 2) ve studovaných buněčných liniích, zatímco nativní CD4 nezlepšila povrchovou expresi CD 16_1M

Phklad 4

Asp ζ mutanti nekoasociují s Fc receptorem: Pro vytvoření chimér, které neasociují s existujícím antigenem nebo Fc receptorém, se připravily mutantní ζ fúzní proteiny, které postrádají buď intramembránový Asp nebo intramembránový Cys zbytek, nebo oba. Průtoková cytometrie ukázala, že intenzita exprese na buněčném povrch různými mutantními chimérami nebyla značně rozdílná od nemutovaného prekursoru, a imúnoprecipitáčrií experimenty ukázaly, že celková exprese chimérami byla podobná. Jak se očekávalo, mutantní chiméry postrádající transmembránový cysteinový zbytek, nevytvářely disúlfidicky vázané dimery. Dvě mutantní chiméry postrádající Asp nebyly schopné podpořit povrchovou expresi CD 16™, zatímco monomerní Chiméry postrádající Cys ale nesoucí Asp, umožnily koexpresi CD16™, ale s nižší účinností než parentální dimer (Obr. 3).

Příklad 5

Mutantní receptory zachovávají schopnost iniciovat vápníkovou odpověď. Pro určení, zda zesíťování fuzních proteinů umožní akumulaci volného intracelulámího vápníku podobným způsobem jako známý aňtigenový receptor T-lyrnfocytů, buňky leukemické linie lidských T-lymfocytů, Jurkat E6 (ATCC Accessior Number TIB 152, American Type Culture Collection, Rockville, MD) byly infikovány vakcinia rekombinanty a po zesíťování extracelulární domény s at * »« '·

protilátkami se změřila relativní koncentrace cytoplazmovéhó vápníku. Průtoková Cytometrická měření se prováděla s buňkami vystavenými na vápník sensitivníniu barvívu Indo-1 (Grynkiewicz et ál., J. Biol. Chem. 260, 3340-3450 (19Í85); Rabimovitch et al., J. Immunol 137. 952-961 (1986)). Obr. 4A-D ukazuje výsledky vápníkových průtokových experimentů s buňkami infikovanými CD4£ a Asp' a Cyš mutanty (. Zesíťování Chimér reprodukovatelně zdvihlo intračelulámí vápník. CD4:r| a CD4:'y podobně umožnily akumulaci intracelulámího vápníku v infikovaných buňkách. Jurka! buňky exprimují nižší úroveň CD4 na buněčném povrchu, avšak zesíťování nativní CD4 v přítomnosti nebo nepřítomnosti CD16:£ nezměnilo úroveň intracelulámího vápníku (Óbr. 4A-B).

Příklad 6

CD4:(, ή a γ chiméry zprostředkovávají cýtolýzu cílů exprimujíeích HIV gpl20/4l. Pro určení, zda chimémí receptory spoušti cytolytické efektorové programy, vytvořil se modelový cíl: efektor Systém založený naCD4 rozpoznávání HIV obálkového gp 120/41 komplexu. HeLa buňky se infikovaly rekombinantními vakcinia viry exprimujícími gpl20/gp41 (Chakřabárti et al.. Nátuře 120. 535-537 (1986); Earl et al., J. Virol, 64,2448-2451 (1990)) a značily ⁵¹Cr. Značené buňky se inkubovaly s buňkami lidské allospecifické (ČD4⁺, CD4 ) cytotoxické T-Iymfočytové linie, která byla infikována vakcinia rekombinánty exprimujícími CD4:(, CD4/r| nebo ČD4:y chiméry, nebo CD4:(cysl lGly.AsplSGly dvojitou mutantní chiméru. Óbr. 5A-C ukazuje že HeLa buňky exprimujicí gp 120/41 se specificky lyzovalý cytotoxickými T-lymfocyty (CTL) exprimujícími CD4 chiméry. Neinfikované HeLa buňky nebyly Zaměřovány CTL vyzbrojenými CD4:( chimérami, a HeLa buňky exprimujicí gp!20/41 nebyly rozpoznávány neinfikovanými CTL. Přo srovnání účinnosti řůznýčh chimér, poměry mezi efektorem a cílem se korigovaly na frakci CTL exprimujicí CD4 chiméry a na frakci HeLa buněk exprimujíeích gp 120/41, jak se měřilo průtokovou cytůmetrií. Obr. 5C ukazuje cytómetrickou analýzu CD4 exprese CTL užitých v experimentu cytolýzy v óbr. 5A a 5B. Ačkoli střední hustota povrchové ČD4.£ velmi převažovala střední hustotu CD4: ή, cytolytické účinnosti buněk exprimujíeích obě formy byly

A podobné. S korekcí na frakci cílů exprimujíeích gpl2Ó, je účinnost cytolýzy zprostředkované

CD4:( a CD4:T| proteiny srovnatelná s nejlepšími účinnostmi uváděnými pro specifické páry

T-lymfoeytový receptořový cíkefektor (střední poměr efektor k cíli přo 50% uvolnění

T-lymfocytů exprimujíeích CD4:( byl 1,9 ± 0,99, n = 10). CD4:y fuze byla měně aktivní, stejně

9« ·

I »9 • 9 9 4

9 « 9 *

9

999«999

• 9

9

99« • 9

.......— ’ 29 jako CD4:( luze bez transmembránových Asp a Cys zbytků. Nicméně v obou případech byla pozorována signifikantní cytolýza (Obr. 5B-C).

Pro ověření možnosti, že infekce vakcinií může vyvolat artefaktuální rozpoznání CTL, podobné cytolytické experimenty se prováděly s Cílovými buňkami infikovanými vakcinia rekombinanty exprimujícími fosfatidylinošitólem vázáné formy CD16 (CDlópj a značené⁵¹ Cr, a s CTL infikovanými kontrolními rekombinanty exprimujícími buď CDlóp,, nebo CD16:£. Obr. 6Á ukazuje že T-lymfóeýty exprimující noň-CD4 chiméry nerozpoznávají nativní HeLa buňky exprimující gp 120/41, a T-lymfocyty exprimující CD4 chiméry nerozpoznávají HeLa buňky exprimující jiné vakcíňiá-kódóvané povrchové proteiny. Navíc, ČTL exprimující noň-chimériií CD4 nelyžují podstatně HeLa buňky exprimující gpl20/41 (Obr. 6A).

Příklad 7

Buňky nesoucí MHC třídy Π nejsou cílem pro chiméry. CD4 pravděpodobně interaguje s nepolymorfní sekvencí exprimovanou MHC antigenem Π třídy (Gay et al., Nátuře 328. 626-629 (1987); Sleckman et al., Nátuře 328. 351-353 (1987)). Ačkoliv specifická interakce mezi CD4 a antigenem třídy II nikdy nebyla dokumentována s čištěnými proteiny, za určitých podmínek adheze mezi buňkami exprimujícími CD4 a buňkanii exprimujícími molekuly třídy H se může demonstrovat (Ďoyle et al., Nátuře 330, 256-259 (1987); Clayťon et al., J. Exp. Med. 172, 1243-1253 (1990); Lamarre et al., Science 245.743-746 (1989)). Dále se zkoumalo, zda še může detekovat zabíjení proti buňkám nesoucím antigen třídy Π. Obr. 6B ukazuje, že není specifická cytolýza řízená CD4 ( proti Ráji linii B-lymfocytů, které exprimují nadbytečný antigen třídy II. Ačkoliv mírná cytolýza (= 5 %) se pozoruje, třída ΪΙ negativní Ráji mutant, RJ2.2; 5, (Accolla, J. Exp. Med. 157- 1053-1058 (1983) ukazuje, podobnou citlivost jako Ráji buňky inkubované s neinfíkovaňými T-lymfocyty.

Příklad 8

Sekvenční požadavky pro indukci cytolýzy zeta řetězcem aňtigenu T-lymfocyt/Fc receptor. Ačkoliv ehiméřy mezi CD4 a ζ mohou vyzbrojit cytotoxické T-lymfocyty (CTL) ke zničení cílových biiněk exprimujících HIV gp 120, alternativně k ČD4 se hledalo srovnání vlastností zeta chimér začleněných do lidské linie T-lymfocytů. Takové linie exprimují CD4

a znesnadňují specifické definování vztahu mezi typem a stupněm mobilizace vápníku a cytolytickým potenciálem různých chimér. Pro překonání tohoto, se vytvořily chiméry mezi ζ a GD16, ve kterých extracelulární doména CD16 se váže na transmembfánovou a intraceluláfní sekvenci ζ (Obr. 7A). Genové fuze se začlenily do plasmidu exprese vákcinia viru nesoucího E. coli gpt gen jako selektábilňí markér a zavedly do genomu WR vlákna vakcinia homologní rekombinací a selekcí na růst v mykofenolovč kysejině (Falkner a Moss, j, Virol. 62, 1849 (1988); Boyle a Coupar, Gene 65, 123 (1988)). '

Linie T-lymfocytů se infikovaly vakciniarekombinanty a po zešíťování extracelulárních domén š protilátkami se měřila relativní koncentrace cytoplazmových volných vápenatých iontů. Jak spektrofluorometrické (objemná populace), tak průtokové CytOmetrické (jednjotlivé buňky) měření se prováděla s buňkami vystavenými barvivu Indo-1 (Grynkiewicz etal., J. Bioi. Chem. 260, 3440 (1985); Rabinovitch et al., J. Immunol. 137, 952 (1986)). Obr. 7B ukazuje analýzu údajů získaných z buněk Jurkat leukemie lidské T-lyrnfocytové linie infikované vakciiiia rekombinanty exprimujícimi CD16 C fuzní protein. Zešíťování chimér reproducibilně zvyšovalo iňtracelulámí:vápník, zatímco podobné manipulováni s buňkami exprimujícimi nechimériií CDló mělo malý nebo žádný efekt. Když se chiméra exprimovala v mutantní buněčné linii bez antigenového receptorú, bud’REX33A (Bretmeyer et al., 1. Immunol. 138, 726 (1987); Šánchó et ál., J. Bioi. Chem. 264. 20760 (1989)), nebo Jurkat mutánt JRT3.T3.5 (WesS et al., J. Immunol. 135,123 (1984)), pozorovala se silná odezva ná zešíťování CDló protilátky. Podobné údaje se získaly na REX20A (Bretmeyer et al., supra, 1987; Blumberg et al., J. Bioi. Chem. 265, 14036 (1990)) mutantní buněčné linii a CD3/TÍ negativní mutantní Jurkat buněčné linii zavedené V této laboratoři. Infekce rekombinanty exprimujícimi CD16.Č neobnovují odpověď na anti-ČD3 protilátku, ukazují tak, že fuzní protein nepůsobí uvolněni intracelulámích řetězců CD3 komplexu.

Pro zhodnocení schopnosti chimér přesměrovat buňkami zprostředkovanou imunitu, CTL se infikovaly vakciniá rekombinanty exprimujícimi CD 16 chiméry a užily ke specifické lýzy hybridomovýčh buněk exprimujících ná membránu vázané anti-CDlÓ protilátky. Tento test je rozšířením testu hybridomové cytotoxicity původně vyvinutého pro analýzu eféktůrových mechanismů buněk nesoucích Fc receptory (Graziano a Fanger, J. Immunol. 138; 945 (1987); Graziano a Fanger, J. Immunol. 139, 35-36 (1987); Shen et al., Mol. Immunol. 26, 959 (Í989); Fanger et al., Immunol Today 10, 92 (1989)). Obr. 8B ukazuje že exprese CDl6:£ v cytotoxických T-lymfocytech umožňuje vyzbrojeným CTL zničit 3G8(anti-CDl 6; Fleit et ál., Proč, Nátl. Acaď. Sci. USA 79, 3275 (1982)) hybridomové buňky, zatímco CTL exprimující

‘31 — fosfatidylinositolem vázanou formu CD16 jsou neaktivní. CTL vyzbrojeně CD16:( také nezabíjejí hybridomové buňky exprimující irelevantní protilátku.

Pro identifikaci minimální ζ sekvence nutné přo cytolýzu, se připravily série delečních mutantů, ve kterých sé postupně z karboxylového konce odstranilo více z ζ intracelulámí domény (Obr. 8A). Většina intracelulámí domény zeta se muže odstranit s malými důsledky pro cytolytický potenciál; plná délka chiméry GD16 ζ je v podstatě rovna v účinnosti chiméře’ delětovaňé ke zbytku 65, CD16:CAsp66* (Obr. 8B). Podstatný pokles cytotoxicity se pozoroval při deleci ke zbytku ζ 59 (chiméra GDI6:(Glu60*) a další delecc ke zbytku 50 vyústily v ještě menší aktivitu: Nicméně úplná ztráta aktivity se nepozorovala, i když intracelulámí doména se redukovala na tří-zbytkové transmembránové ukotvení (Obr 8B).

Protože ζ je disulfidicky vázaný dimer, jedno vysvětlení pró-retenci cytolytické aktivity bylo, že endogenní ζ vytvářela heterodimery s chimémí ζ delečí, tak uchovávaje aktivitu. Pro ověření této ideje, ζ Zbytky 11 a 15 se změnily z Asp na Cys, respektive Gly (Gysl l Gly/Aspl 5Gly) a imunoprecipitacc se provedla podlé následujícího; Přibližně 2 x 10⁶ CV1 buněk se infikovalo jednu hodinu v séru zbaveném DME médiu rekombinantní vakcinií při multipličitě infekce (moi) nejméně deset. Šest až osm hodin po infekci se buňky oddělily z mističek působením PBS/lmM EDTA a povrchově značily 0,2 mCi ¹²⁵I, na 2 x 1(5 buněk s použitím laktoperoxidázy a H₂O₂ metodou podle Clarka a Einfelda (Leukočyte Typing II, str. 155-167, Springer-Verlag, NY, 1986). Značené buňky se cénťrifiigovaly a lyžovaly v 1% NP-40, 0,1% SDS, 0,15M NaCl, 0,05M Tris, pH 8,0,5mM MgClj, 5mM KC1,0,2M jodacetamid a lmM PMSF. Jádra Se odstranila centrifugací, CD 16 proteiny se imunoprecipitovaíy s protilátkou 3 G8 (Fíeit et aí., supra, 1982; Medarex) aanti-myší IgGagarozou (Cappel, Durham, NC). Vzorky se dělily elektroforeticky v 8% poJyakrýlamidovém SDS gelu ža neředukujících podmínek nebo na 10% gelu za redukujících podmínek. Tato imunoprecipitace potvrdila, že CD16:< Cys 11 Gly/Aspl 5Gly chiméra neasociuje v disulfidicky vázané dimerní struktuře.

Také se testovala cytolytická aktivita mutantních receptorů. Mutované chiméry děletované ke zbytku 65 (CD 16:ζ Cysl lGly/Aspl5Gly/Asp66*) byly, v závislosti na podmínkách testu, dva až osm krát méně aktivní při cytolytickém testu něž srovnatelné nemutované chiméry (CD16:(Asp66*), což bylo obvykle v rámci faktoru dvě; nebo nerozlišitelné v aktivitě od CD16:Í (Obr. 9B). Snížení aktivity mutantních chimér je srovnatelné s poklesem pozorovaným u CD4 chimér podobné struktury (viz výše) a je nejpravděpodobněji způsobeno nižší účinností ζ monomeru ve srovnání s dimery. Oproti tomu Asp', Cys' mutované chiméry deíetované ke zbytku • φ ΙΦ · ·* φ» φ · ·· φ · φ %

neměly žádnou cytolytickou aktivitu (Obr, 9B), což potvrzuje hypotézu, že asociace s jinými řetězci Zprostředkovaná transmembránovými Cys a/nebo Asp zbytky je zodpovědná za slabou persistenci cytolytické aktivity při delecích více zbytků aminového konce než 65.

Studie průtokové cytometrie ukázaly, že deleční mutanty postrádající tranSrněmbránoýé Asp nebo Cys zbytky mohou stále způsobovat nárůst volných intráceiulárňích vápenatach iontů v odpovědi na zesíťováni protilátek v TCR' mutantní Jurkat buněčné linii (Obr. 9D). Podobné-¹ výsledky se Získaly pro chiméry exprimované v rodičovské Jurkat linií. V případě CD 16:( Cysl ÍGly/Aspl5Gly/Glu60* tyto údaje demonstrují, že schopnost zprostředkovat vápníkovou odpověď může být mutačně separována od schopnosti podporovat cytólýzu.

Pro konečnou eliminaci možného přispění ζ transmembránového zbytku, traňsmembránové a prvních 1.7 cytoplazmových zbytků ζ se nahradilo sekvencemi kódujícími membránové pnutí a prvních 14 nebo prvních 17 Cytoplazmových zbytků CD5 nebo CD7 aňtigenů, respektive (Obr. 9A). Výsledné tripartitní fuzní proteiny CD16:5:((48-65) a CDl6:7:((48-65) netvořily disulfidicky vázaně dimery jako jednodušší GDI6:ζ chiméry, .protože postrádaly cysteinový zbytek v ζ transmembranové doméně. Obě tripartitní chiméry byly schopné mobilizovat vápník v Jurkat a TČR negativních buěcných liniích (Obr. 9D) uzpůsobit cytolytickou odpověď v CTL (Obr. 9C a údaje neudávané). Nicméně zkrácení ζ domény na zbytek 59 v Chiméře CD 16:7:((48-65) ruší schopnost tripartitní fuze řídit vápníkovou odpověď v TCR positivních nebo negativních Jurkat buňkách nebo cytólýzu v maturovaných CTL (Obř. 9C a 9D a údaje neudávané).

Pro ověření příspěvku individuálních zbytků v rámci 18-zbyťkového motivu, se připravilo množství mutantních variant místně-rizenou mutagenezí a hodnotila se jejích schopnost zprostředkovat řeceptórově rizené zabíjení za podmínek nízké /Obr. 10A a 10D) nebo vysoké (Obr. IOB a 10É) exprese chimémího receptoru. Obr. 10A-F ukazuje že zatímco množství relativně konzervativních substitucí (tzn. nahrazení kyselinových zbytků jejich amidy, nebo tyrosinu feňylalaninem), které překlenulo zbytky 59 áž 63, poskytlo průměrný kompromis cytolytické účinnosti, obecně varianty zachovaly schopnost mobilizovat vápník. Nicméně souborně tyto zbytky zahrnují důležitý submotiv, neboť jejích delece eliminuje cytolytickou aktivitu. Konverze Tyr 62 buď na Phe nebo Ser eliminovala jak cytotoxickou, tak vápníkovou odpověď. Na amino-konci 18-zbytkového segmentu, nahrazení Tyr 51 Phe zrušilo jak mobilizaci vápníku, tak cytolytickou aktivitu, zatímco substituce Léu Ser v poloze 50 eliminovala vápníkovou odpověď s pouze částečným zmenšením cytolýzy Bez návaznosti na podrobnou ?

i i

t :?

:» í

i

4 4

44

4' * 4

444

4

--~ ~ 33 hypotéžii se předpokládá, že neschopnost Leu50Ser mutantu mobilizovat vápník v krátkém * termínu průtokového cytometrického testu neodráží plně jeho schopnost zprostředkovat » podstatný nárůst volných intracelulárních vápenatých iontů během delšího Času cytolytického $ testu. Nicméně, na vápník necitlivá cytolytická aktivita byla popsána pro některé linie >

eytolytičkých T-lymfccytů a možnost, že podobný jev popsuji dosažené výsledky, není vyloučena.

Nahrazení Asn48 Ser částečně zmenšuje cytotoxicitu v některých experimentech, zatímco v jiných ' má pouze malý efekt.

Pro studium potenciální role přebytečných sekvenčních elementů, se intracelulární doména ζ rozdělila na th segmenty, preldenující zbytky 33 až 65, 71 až 104 a 104 až 138. Každý ž těchto · segmentů se připojil na CD16:CD7 chiméru prostřednictvím Mlul místa zavedeného právě distálňě k základní mebránu kotvící sekvenci intracelulární domény CD7 (viz níže; Obr. 11 A). >

Srovnání cytolytické účinnosti tri elementů ukázalo, Že jsou v podstatě rovnocenné (Obr. 11B).

Sekvenční srovnání (Obr. 11 Aj ukazuje, že, druhý motiv nese jedenáct zbytků mezi tyrosinem, zatímco první a třetí motiv ňešoii deset. Ačkoliv precisní vysvětlení procesu aktivace T-lymfocytů nebylo provedeno, je zřejmé, 4 že agregace antigenového receptoru, nebo receptoru chiméry, která nese ζ intřačelulámí ) sekvence, spouští mobilizaci vápníku, uvolnění cytokinu a granulí a objevení se markérů aktivace >

na buněčném povrchu. Aktivní místo ζ, krátká lineární peptidová sekvence, pravděpodobně příliš malá pro vlastní enzymovou aktivitu, pravděpodobně interaguje s jedním, maximálně několika * proteiny za Zprostředkování celulámí aktivace. Je také zřejmě, že mobilizace volného vápníku není sama o sobě dostačující pro buněčnou aktivaci, neboť schopnost zprostředkovat cytolýzu může i být mutačně separována od schopnosti zprostředkovat akumulaci vápníku. ·^ι

Jak se zdě Ukazuje, adice 18 zbytků z intracelulární domény ζ na tran?membránovou a intracelulární doménou dvou nezávislých proteinů umožňuje .výsledným chimérám přesměrovat cytolytickou aktivitu proti Cílovým buňkám, které se vážou na extracelulární doménu fuzníčh proteinů. Ačkoliv chiméry nesoucí 18 Zbytkový motiv jsou přibližně osmkrát méně aktivní než chiméry založené na ζ o plné délce, redukovaná aktivita se přičítá ztrátě transmembránových interakcí které normálně umožňují divokému typu ζ tvořit disulfidičky vázané dimery. To znamená, že delěční konstrukty které mají stejný karboxylový konec jako motiv a postrádají ?

transmembránové Cys a Asp zbytky, typicky vykazují lehce nižší aktivity něž chiméry nesoucí pouze 18 zbytkový motiv.

Element cytolytické kompetence, na který jsme se zaměřili, má dva tyrosiny a žádný serin « ·· *· »

nebo threonin, omezující možný příspěvek fosforylace k aktivitě; Mutace jednotlivého tyrosinu ničí aktivitu, nicméně, ačkoliv předběžné experimenty neukazují na podstatnou tyrosinovou ' fosforylaci pó zesíťování antigenu chimémího povrchu nesoucích 18 zbytkový motiv, možná participace takové fosforylace na nízké úrovni nemůže být vyloučena. Navíc k efektům ^? zaznamenaným ú dvou tyřosinových zbytků, množství nahrazení aminokyselin na aminovém ^J a karboxylovém konci motivu oslabuje aktivitu za podmínek nízké hustotý receptoru —,* —

Sekvence podobné, aktivnímu motivu ( jsou nacházeny v cytoplazmových doménách ' několika dalších transmembránových proteinů, včetně CD3 δ a γ molekul, povrchových IgM asociovaných proteinů mbl a B29, a β a γ řetězců vysokoafmitního ÍgE receptoru, FceRI (Reth,

Nátuře 338; 383 (1989)). Ačkoliv funkce těchto sekvencí není jistá, při účinně expresi může každá být schopná autonomní aktivace T-lymfocytů, a taková aktivita vysvětluje residuální TCR odpověď pozorovanou v mutované buněčné linii: zeta-negativní (Sussman et al., Cell 52, 85 (1988)).

ζ Sama o sobě naše tri takové sekvence, přibližně rovnoměrně rozložené a hrubá trisekce intracelulární domény ukazuje, že každá je schopná iniciování cytolytické odpovědi. η, spletená >

isoforma ζ (Jin et al, viz výše, 1990; Clayton et al. Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88, 5202 (1991)), ř postrádá karboxylovou půlku prvního motivu. Protože odstranění karboxylové půlky prvního motivu ničí aktivitu, ukazuje se pravděpodobné, že majorita biologické účinnosti η může být přičtena prvním dvěma motivům. Ačkoliv podle rozdílných měření η je stejně aktivní jako ζ při J vyvolávání antigenem zprostředkovaného uvolnění cytíkinu (Bauer et al. Proč. Nati. Acad.. Sci.

USA 88, 3842 (1991)) nebo přesměrované cytolýzy (viz výše), η není fosfórylován v odpověď * na receptóřovóu stimulaci (Bauer at al, viz výše, 1991). Tak buď přítomnost všech tří motivu je požadována pro fosforylaci, nebo třetí motif představuje favorizovaný substrát pro neidentifikovanou týrošinkinázu.

Příklad 9

Transdukcě cytolytického signálu, lidským Fc řeceptorem. Pro zhodnocení působení různých subtypů lidských Fc receptoru se vytvořily chimérní molekuly, jejichž extracelulámí doména lidského CD4, CD5 nebo CD16 antigenu se spojily s transmembránovými a intracelulámími doménami subtypů FcRIIyA, Bl, B2 a C (nomenklatura dle Ravetch a Kinet,

Ann. Rev. Immunól. 2, 457 (1991)). Specificky, cDNA sekvence odpovídající fr<;—_f™ Ofc c

I t

o o ”&·*’--e o r>

*j e o ό a <i o χ- r ft· fc c

fc fc o

C C <1 C O O <· c

O O fc fc re transmembránovým a cýtoplazmovým doménám dříve popsaných FcRIIyA, Β1 a B2 isoforem se amplifikovaly z již existujícího klonu PC23 a ž cDNA lidské tonsilové knihovny (konstruované standardními technikami) za použiti následujících syntetických oligonukleotidových přiměni:

CCC GGA TCC CAG CAT GGG CAG CTC TT (sekvence ID NO: 18; FcRIl A dopředná); , ; ?. - ,·λ ·. , ... v , ·/. . ? / · . ?

' ' CGC GGG GCG GCC GCT TTA GTT ATT ACT GTT GÁC ATG GTC GTT (sekvence TDNÓ: 19;FcRÍI Aréverzní); /. J¹ u -i ·* , . GCG GGG GGA TCC CAC TGT CCA AGC TCC CAG CTC TTC ACC G (sekvence ί ID NO: 20; FcRIl Bi a FcRIl B2 dopředná); ·'·* . / v: ./ • «a GCG GGG GCG GCC GGC TAA ATA CGG TTC TGG TC (sekvence ID NO: 21;

I FcRIl B1 a FcRIl B2 reverzní). , ^; 'ΐ ϊ '_:o c/., i ?Tyto příměry obsahovaly místa štěpení pro éňzymý BamHI respektive Notl, umístěná 6 zbytků i od 5'-konce'NotI místo bylo ihned následováno aritiserisním štop-kodónem,? buď CTA, nebo • TTA.\Všechny primery obsahovaly, 18 nebo více zbytků komplementárních k^;5'- a 3'-končům ; žádaných fragmentů. Fragment CDNA odpovídající FcRIIyC cytoplázťnoyé doméně, který se lisí ; oď IIA isoforiňy pouze.: v jednom aminokyselinovém zbytků (L místo P, zbytek 268) byl i . , generován místně řízenou mutageneží přesahující PCR s použitím primerů 0 sekvenci: .<·,, . TCA GAA AGA GAC AAC CTG AAG AAA CCA ACA A (sěkvénce ID NO. 22);:r, á TTG TTG GTT TCT TCA GGT TGT GTC TTT CTG A (sekvence ID NO. 23).

PCR fragmenty se včlenily do vektorů exprese vakcinia viru; které obsahovaly CD 16 respektive CD4 ěxfraceliilámí domény, a následně se zapojily do divokého typu vakčinie rékombinaeí v místě _ř thymidinkinázy, s použitím selekce pro kointégraci E. coli gpt k usnadnění identifikace žádaných » rekómbinantů.’ Identity všech isoforem (viz obr. 12) se ověřily dideoxy sekvencováním? >

; Produkce proteinů chimémího receptoru se dále potvrdila imunoprecipitačními studiemi.

Přibližně 10⁷ JRŤ3 .T3.5 buněk se infikovalo jednu hodinu v mediu bez séra IMDM rekombinantní vákcinií s multiplicitoú infékcě nejméně deset. Dvanáct hodin po infěkci se buňky sebraly a povrchově značily 0,5mCi ^l25I na 10⁷ buněk s použitím metody taktoperoxidázy/glukozoxidázy _{ř 4} (Clark a Einfcld, viz výše) Označené buňky se oddělily Centrifugací a CD 16 fuzní proteiny ' * < imunoprecipitovaly š protilátkami 4G8‘ aanti-myší IgG agarozy. Vzorky se dělily elektroforeticky ' za redukujících podmínek.' (sekvence ID NO: 21; ‘ všechny imunoprecipitováňé molekuly ! chimémího receptoru bylý v předpokládaných molekulo vých hmotách. > -|l · *

Pro testování schopnosti; chitnémích· receptorů zprostředkovat¹ nárůst volných

• «· ·· · « * * ·· ··»· ·« cytoplazmových vápenatých iontů se použily rekombinantní viry k infekci TCR' mutantní Jurkat buněčné linie JRT3 ,T3.5 (ják je zde popsáno) a volný cytoplazmový vápník se měřil v buňkách (jak je zde popsáno) po zesíťování receptorových extracelulárních domén s monoklonální protilátkou 3G8 nebo Leíu-3 A (jak je zde popsáno). Tyto experimenty ukázaly, že intracelulámí domény FcRyH A a C jsou schopné zprostředkovat nárůst volných cytoplazmových vápenatých iontů, po zesíťování extracelulárních domén, zatímco intracelulámí domény FcRylí Bl a B2 byly za srovnatelných podmínek neaktivní (Obr. 13A a 13B). CD4, CD5 a CD 16 hybridy FcRylí A sdílejí esenciálně rovnou kapacitu k vy volání vápníkové odpovědi (Obr. 13A-B). Jiné buněčné linie, jak mohocytOvé, tak lýmfocytové, byly schopné odpovídat ňa signály iniciované zéšíťováním extracelulárních domén.

Ke studiu zapojení různých FcRy II intracelulárních domén při čytolýže, se lidské cytotoxické íymfocýty (ČTL) infikovaly vakcinia rekombinánty exprirnújícimi CD 16;FcRyII A,

Bl, B2 a C chiméry^ Infikované buňky se poté kultivovaly s ^5lGr vystavenými hybridomovými buňkami (tzn., 3G8 10-2 buňky), které expnmovaly povrchově protilátky k CD16. V tomto testu CTL nesoucí CD 16 chiméru zničily hyhridomové cílové buňky (umožnily uvolnění volného⁵¹ Cr), >

když se CD16 extracelulární doména chiméry spojila s intracelulámím segmentem schopným ?

aktivovat lymfocytbvý éféktoťový program; tento cytolytický test jé detailně popsán níže. Obr. ~

14A ukazuje, že CIL vyzbrojené GĎ 16:FcRyII A a C, ale ne FcRylí Β1 nebo B2, jsou schopny lýzóvat cílové buňky exprimující na buněčném povrchu antLCDló protilátku.

Pro eliminaci možnosti, že specifická cytolýza je nějakým způsobem svázaná s interakcí s CD 16 Skupinou, se provedly cytolytické experimenty, ve kterých se FcRII intracelulámí domény připojily k CD4 extracelulární doméně. V tomto případě cílové buňky byly HeLa buňky exprimující HlV-obálkové gp 120/41 proteiny (specificky HeLa buňky infikované vektorem vPÉ16 vakeinie; National Institute of Allergy and Irtféctions Disease AIDS Depository, Bethesda, MD).

Jako v CD 16 systému, cílové buňky exprimující HIV obálku byly lýzovány T-lymfocýty exprirnújícimi CD4:FcRyIl A chiméru, ale ne FcRylí Β1 nebo B2 (Obr, Í4Bj.

íňtřacěiůláfm domény FcRyŠ A a Č nesdílejí žádnou patrnou sekvenční homologii s jiným proteinem, včetně členů rozsáhlé FcRy/TCR( rodiny. Pro definování sekvenčních elementů zodpovědných za indukci cytolýzy, se připravily 5 - a 3 '-delece kódujících sekvencí intracelulámí domény (popsány níže a ukázány na Obr. 15A) a v cytolytických testech se hodnotila jejich účinnost mobilizovat vápník (jak se zde popisuje). Pri experimentech s odstraněnou terminálrií aminó-koncovůu doménou intracelulámí domény se transmembránová doména FcRylí nahradila tfc ·» »»

9 · · 9 9 9 9 · • 9 9 9 9 *

Í · « 9 9 9 · · · · fc fc · fc · · fc···*·· ·«·«··· ·· * transmembránovou doménou nezávislého CD7 antigenu k eliminaci možného pňspění interakcí zprostředkovaných doménou membránového pnutí.

Obr. 15B a 15C ukazují, že odstranění 14 zbytků karboxylového konce, včetně tyrosinu 298 resultOvalo v uplnou ztrátu cytolytickě kapacity a podstatnou redukci potenciálů vápníkové mobilizace. Další delece před tyrosin 282 poskytly identický fenotyp (Obr 15B a 15C). Delece od N-konce intracelulární domény ke zbytku 268 neměla podstatný efekt ani na vápníkový profilováni na cytolytiekou schopnost, zatímco delece ke zbytku 275 značně snížila uvolňování volného vápníku, ale měla malý vliv na cytolýzu (Obr. 15D a 15E). Další delece, ke zbytku 282, poskytla FcRylI konce, které postrádaly schopnost mobilizovat vápník i spouštět cytolýzu (Obr. 15D a 15E). “Aktivní prvek” definovaný těmito hrubými měřeními je relativně velký (36 aminokyselin) a obsahuje dva tyrosiny oddělené 16 zbytky.

Příklad 10

Další spouštěcí proteiny receptorů T-lymfocytu a B-lymfocytu. Další intracelulární a transmembránové signál převádějící domény podle vynálezu jsou odvoženy od proteinů receptorů T-lymfocytu, CD3 delta a T3 gamma a od proteinů receptorů B-lymfocytu, mb 1 a B29. Aminokyselinové sekvence těchto proteinů jsou ukázány na Obr. 16 (CD3 delta; sekvence ID NO: 24), Obr. 17 (T3 gamma; sekvence ID NO: 25), Obr, 18 (mbl; sekvence ID NO: 26) a Obr, 19 (B29; sekvence ID NO: 27). V závorkách jsou uvedeny domény sekvencí postačujících pro transdukči cytolýtického signálu (a tak přednostně začleněné do chimérního receptorů podle vynálezu). Chimérní receptory, které zahrnují tyto proteinové domény, jsou konstruovány a používány při výše obecně popsaných terapeutických metodách podle vynálezu.

Příklad 11

CD28 chimérní receptory. Protože aktivace T-lýmfocytu se ukázala být zvýšena účastí CD28, vynález také zahrnuje terapeutické buňky exprimující páry chimérních receptorů: první chiméra obsahuje intracelulární doménu CD28 a druhá chiméra obsahuje jakoukoli intracelulární nebo transmembránovou signál převádějící doménu zde popsanoou. V dané dvojici chimérních receptorů jsou extracelulární domény identické (například odvozené pd CD4 proteinu, a ták obě rozpoznávají HIV nebo HlV-mfikované buňky), nebo každá je navrhovaná přo rozpoznávání jiné

* φφ φ* φ φ φ φ φ ♦ φφ· · cílové molekuly na povrchu buňky nebo pathogenu.

Ve zvláštním příkladu dvojice chimér zahrnuje dvě rozdílné extracelulární domény, z nichž každá rozpoznává určitou antigenovou charakteristiku cílového nádoru. Příklady nádorových antigenu zahrnují, bez omezení, jakýkoli z množství cukru (např. Le^Y, sialyl-L^, L% a sialyl-Le^x), karcinoembryonický antigen, CD40, modifikovaný ČD44, α-fetoprótein, t a Tn aintigeny, tenascin a řeceptory růstového faktoru (např. HER2/neu). Zvyšováním počtu markérů nádorového povrchu, které musí být rozpoznány k Vyvoláví potemní destruktivní odpovědi, tento přistup zvyšuje terapeutickou spécifitu snížením podobnosti a frekvence destrukce nekarcinogenních buněk.

Tátů metoda kombinatorické kontroly se vztahuje na jakékoli množstva kooperujících chimémích receptoru a používá se pro regulaci jakékoli terapeutické metody podlé vynálezu.

CD28 chiméry jsou konstruovány a exprimovaný podle metod zde popsaných CD28 sekvence je uvedena (Aniffo a Seed, Próc. Nati. Acad. Sci. USA 82, 8573-8577 (1987)), Také jsou v tomto odkaze zahrnuty popisy CD28 intracelulárníčh a transmembránových domén. Příklad chiméry nesoucí intraceluláení CD28 doménu je uveden (Romeo et al., Cold Spíring Harboř Symp. on Quant. Biol LVII, 117-125 (1992)),

Příklad 12

Experimentální metody. Vákcinia infekce a rádioimunoprecipitace. Přibližně 5 x 1O⁶CV1 buněk bylo ihfikováno jednu hodinu v DME mediu bez séra rekombinantní vakcínií s multiplicitou infekce (mói) nejméně deset (titr měřen na CV1 buňkách). Po infekci se buňky umístily do čerstvého média a značily metabolicky 200pCi/ml ³⁵S-methioninem plus cysteinem (Tran³⁵S-značení, ICN; Costo Mesa, CA) v methionmu a DMEM bez cysteinu (Gibco; Grand Island, NY) šest hodin. Značené buňky se oddělily působením PBS obsahujícím lmM EDTA, jímaly eentrifugaci a lýzovaly v 1% NP-40,0,1% SDS, 0,15M NaCl, 0,05M Tris pH 8,0, 5mM EDTA a lmM PMSF. Jádra se odstranila eentrifugaci a CD4 proteiny imunoprecipitovaly s OKT4 protilátkou a anti-myší IgG agarosou (Cappel, Durham, NC) Vzorky se čistily eléktroforeticky na 8% polyakrylamid/SDS gelech ža neredukujících (NR) a redukujících (R) podmínek. Před autoradiografií se gely Obsahující ^3íS-značeně vzorky impregnovaly En³ Hance (New Englánd Nučlear, Boston, MA). Usnadněná exprese transmembráňové formy CD16, CD16_TM, se měřila porovnáním exprese v CV1 buňkách jednotlivě infikovaných CDló^ s expresi v buňkách v*

I

I · « · · * · · ··♦ ·

9 9 9 kóinfikovaných viry kódujícími CD 16™ a ζ nebo γ chimérami. Po infekci a inkubaci Šest hodin nebo déle se buňky oddělily z mističek působením PBS, lmM EDTA a exprese CD 16™ nebo chimér se měřila nepřímou imunofluorescencí a průtokovou cytometrií.

Test toku vápníku. Jurkat podiínie E6 (Weiss et al., J. Immimol. 133, 123-128 (1984)) buňky se infikovaly rekombinantními; vakcinia viry -jednu hodinu v IMDM bez éra při moi 10 a inkubovaly se tři až devět hodin v IMDM, 10% FBS. Buňky se jímaly centrifúgacía resuspendovaly při 3 χ 10⁶ buňěk/ml v kompletním mediu obsahujícím lmM Ind-1 acetomethoxyester (Grynkiewicz et al., J. Biol. Chem. 260, 3340-3450 (1985)) (Molécular Probes) a inkubovaly při 37 °C 45 minut. Buňky vystavené Indo l se peletóvaly a resuspendovaly při 1 x 10⁶/ml v IMDM bez séra a skladovaly při teplotě místnosti bez přístupu světla. Buňky se analyzovaly na přítomnost volných vápenatých iontů simultánním měřením fialové a modré fluorescenční emise průtokovou cytometrií (Rabinovitch et al., J. Immunol 137, 952-961 (1986)). Pro iniciaci toku vápníku se k suspenzi buněk přidaly buď ťykoerythrinem (PE)-konjugované Leu-3A (anti-CD4) (Becton Dickinson, Lincoln Park, NJ) (1 pg/ml) a následně 10 pg/ml nekonjugovaných kozích : antLmyších IgG v čase 0, nebo se k suspenzi buněk přidala nekonjugovaná 3G8 (anti-CD16) monoklonální protilátka (1 pg/ml) a následně 10 pg/ml PE-kónjugovaných Fab/ kozích anti-myších IgG v čase 0, Histogram poměru fialové/módré emise se jímal od PE positivní (infikované) buněčné populace, která typicky representovala 40-80 % všech buněk. Odpověď receptoru antigenu T-lymfocytu v neinfikovaných buňkách se spouštěla protilátkou OKT3, bez zesíťování. Pro experimenty zahrnující CD 1.6 chiménu. receptory, se z analýzy vyloučily vzorky vykazující drift baseliny oproti nižšímu intracelulámímu vápníku (bez protilátky). Histogramové údaje se následně analyzovaly konverzí binárních údajů do ASCII s pomocí Write Hand Man (Gooper City, FL) softwaru a následovala analýza souborem programů FORTRAN, Pro ustavení normalizovaného počátečního poměru se poúžil poměr ftalové/modré emise před adicí druhých protilátkóvýčh činidel, stanovil se roven jednotce a zbývající prahový poměr Se stanovil tak, aby 10 % zbývající póptilace přesahovalo práh.

Cytolytický test. Linie WH3 lidských T-lymfocytu, CD8* CD4' HLA B44 čytolytická linie se obarvila v IMDM, 10% lidském séru s 100 U/ml IL-2 a periodicky stimulovala buď nespecificky Ozářenými (3000 rad) HLA-nesdruženými obvodovými krevními lymfócyty a 1 pg/ml fytohematoglutininem, nebo specificky, ozářenými B44-nesoucími mononukleárňími buňkami. Po jednom dni nespecifické stimulace Se PHA zředil na 0,5 pg/ml adicí Čerstvého média a po třech dnech se médium měnilo. Buňky rostly nejméně 10 dní po stimulaci před použitím v v* « «· ·· · Φ *

♦ · · • *

------ 4₀ testech na cytotoxicitu. Buňky se infikovaly rekombinantní vakeiňií s multiplicitou infekce nejméně 10 jednu hodinu v médiu bez séra, následovala inkubace v kompletním médiu tři hodiny. Buňky se jímaly centrifugaci a resuspendovaly při hustotě 1 χ 10⁷ buněk/ml. Ke každé mističce na U-mikrotitrové destičce obsahující 100 μΐ/mističku kompletního média se přidalo 100 μΐ. Buňky se ředily ve dvou násobných sériových krocích. Dvě mističky pro každý vzorek neobsahovaly lýmfocyty, aby umožnily spontánní uvolnění chrómu a změřil se totální příjem' chrómu. Cílové buňky z HeLa podlinie S3 se infikovaly na 6,0 á 9,0 destičkách s přibližnou moi 10 jednu hodinu v médiu bez séra, následovala inkubace v kompletním médiu tri hodiny. Potom se oddělily od nádobek působením PBS, lmM EDTA a počítaly. Alikvoť 10⁶ cílových buněk (HeLa, Ráji, nebo RJ2.2.5 buňky pro experimenty s CD4 chimemími receptory’ a 3G8 10-2 buňky; Shen et al., Mol. Immunol. 26.959 (1989) pro experimenty s CD 16 chimémí mi receptory) se centifugoval a resuspendóval v 50 μΐ sterilního ”Cr-chromanu sodného (lmCi/ml, Dupont Wilmington, DÉ) jednu hodinu při 37 °C za střídavého míchání, potom se promyl třikrát s PBS. Ke každé mističce sě přidalo í 00 gl značených buněk resuspendovaných v médiu při 10^s buněk/ml. Ráji a RJ2.2.5 cílové buňky se značily stejným způsobem jako HeLa buňky. Mikrotitrová destička se stočila při 750 x g 1 minutu a inkubovala 4 hodiny při 37 °C. Na konci inkubační doby, se buňky v každé mističce resuspendovaly jemným pipetóváním, odebral se vzorek k určení totálních počtů a mikrotitrová destička se stočila při 750 x g 1 minutu. Odebraly se alikvoty 1Ό0 μΐ síipentatantu a spočítaly ve seiritilačním gama-ray počítadle. Procenta zabitých se korigovala na frakci infikovaných cílových buněk (obvykle 50 -90 %) měřených průtokovou eytometrií. Pro infikované efektorové buňky se poměr efektorcílová buňka korigoval na procenta infikovaných buněk (obvykle 20-50 % pro experimenty s CD4 chimemími receptory a >70 % pro experimenty s CD 16 chimémí mi receptory).

’ In vitro mutageneze ζ sekvence. Pro vytvoření bodových mutací v aminokyselinových zbytcích 11 a/nebo 15 ζ sekvence, Se připravily syntetické oligonukleotidové primery, rostoucí od BamHI místa po proudu k ( transmembránové doméně, konvertujíeí přirozený ζ Zbytek 11 od Cys ke Gly (C11G) nebo zbytky 15 od Asp ke Gly (Dl5G) nebo oba (Cl 1G/D15G), a použily se v PCR reakcích ke generování mutovaných fragmentů, které še reinsertovaly do konstruktů divokého typu CD4;(,

Pro vytvoření ζ deleci se ζ cDNA sekvence amplifíkovaly pomocí PCR s použitím syntetických oligonukleotidových primerů navržených k vytvoření stop-kodonu (UAG) po zbytku

50, 59 nebo 65. Primery obsahovaly místo Štěpení pro enzym Notl umístěné 5 nebo 6 zbytků od • 9

• 99 9

9

5-konce, obvykle v sekvenci ve formě CGC GGG CGG CCG CTA (sekvence ID NO: 11), kde nejméně tři zbytky odpovídají stop-ahtíkodonu. Notl a štop-antikodonové sekvence byly následovány 18 nebo více zbytky komplementárními k žádanému 3'-koncovému fragmentu. Výsledné chiméry byly CĎ16:ČY51*, CD16:ČE60*, respektive CD 16.£D66*. Bamtfl riiísto po proudu od transmembránové domény a Notl místo sé použily pro generování fragmentů, které se zpětně začlenily dokonstruktu divokého typu ČD16:Č Monomerní ζ chiméry se vytvořily odštěpením ζ transmembránových a membránových proximálňich intracelulámích sekvencí BamHI a Sací štěpením Asp' a Cys* CD4:C konstruktu popsaného výše a inzercí fragmentu do CD16:£E60*, respektive konstruktu CĎ16:£D66*.

Pro přípravu konstruktu CD 16:(D66*, se ζ cDNA sekvence odpovídající transmembránové doméně a 17 následujících zbytků cytopiazmové domény nahradily odpovídající tránšmembránovou a cytoplazmovou doménou získanou z CD5 a GD7 cDNA. CD5 a CD7 fragmenty se generovaly PCR reakcí s použitím dopředných oligonukleotidu obsahujících BamtU místo réstnkčníhó štěpení a odpovídajících oblasti po proudu transmembránové domény, a následujících oligonukleotidu překrývajících CD5, respektive CD7 sekvence a ζ sekvence, obsahující Sací místo restrikční ho štěpení.

CD5:<: CGC GGG CTC GTT ATA GAG CTG GTT CTG GCG CTG CTT CTT CTG (sekvence ID NO: 12)

CD7:C CGC GGG GAG CTC GTT ATA GAG CTG GTT TGC CGC CGA ATT CTT ATC CCG (sekvence ID NO 13).

CD5 a CD7 PCR produkty se štěpily BamHI a Sací, ligovaly k BamHI a Sací štěpeným

CD16;(E60* a nahrazovaly ζ sekvence od BamHI k Sací CD7 fragmentem. Pro vytvoření konstruktů CD16:CD5 a CD16 CD7, CD5 a CD7 fragmenty sé získaly PCR s použitím oligonukleotidu obsahujících Notl místo restrikčniho štěpení a kódujících stop-kodon (UAA) po zbytku Gln416 a Alal93 CD5, respektive CD7. CD5 a CD7 PCR fragmenty se štěpily BamHI a Notl a zapojily do konstruktu CDl6:(Asp66*.

In vitro mutageneze N-terminálních zbytků v rámci ζ motivu převádějícího cytolytický signál. Syntetické oligonukleotidové primery rostoucí od Sací mista uvnitř ζ motivu a konvertující přirozený zbytek 48 od Asn k Ser (N48S), zbytek 50 od Leu k Ser (L50S) a zbytek 51 od Tyr k Phe (Y51F) se syntetizovaly a užily pro PCR reakci ke generování fragmentů, které se zpětně začlenily do konstruktu divokého typu CD16:7:((48-65).

In vitro mutageneze C-terminálních zbytků v rámci ζ motivu převádějícího cytolytický ·· · · • · * « *«»··* · t « υ · signál. Syntetické oligonukleotidové primery rostoucí od Notl místa 3 - ke stop-kodonu a konvertující přirozený zbytek 60 od Glu ke Gín (E60Q), zbytek 61 od Glu ke Gin (E61Q), zbytek 62 pd Tyr k Phe nebo Ser (Y62F nebo Y62S) a Zbytek 63 ód Asp k Asn (D63N) se syntetizovaly a užily pro PCR reakci ke generování fragmentu, které se subklonóvaly do konstruktu divokého typu CD16:(D66* od BamHI místa k Notl místu.

, CDl 6:7:((33-65), ČD16:7:((71-1O4), CD16:7:((104-137) ehimérni konstrukce. CD7_ transmembránový fragment nesoucí Mlul a Notl místa ve spojení mezi membránovými a intrácelulárriími doménami se získal PCR s použitím oligonukleotidu s následující sekvencí: CGC GGG GCG GCC ACG CGT CCT CGC CAG CAC ACA (sekvence ID NO: 14). Výsledný PCR fragment se štěpil BamHI a Notl a zpětně začlenil do ČĎ16:7:((48-65) konstruktu. ( fragmenty kódující zbytky 33 až 65, 71 až 104 a 104 až 137 se získaly PČR reakcí s použitím dvojic primerů obsahujících Mlul místa na 5-koncí dopředného primeru a stóp-koďony následující po Notl místech na 5-konci reversních primerů. V kažkém případě restrikční místa se umístila šest zbytků od 5'-konce primeru pro zajištění Štěpení restrikčním enzymem.

(33: CGC GGG ACG CGT TTC AGC CGT CCT CGC CAG CAC. ACA (sekvence ID NO: 15);

(71: CGC GGG ACG CGT GAC CCT GAG ATG GGG GGA AAG (sekvence ID NO:

16); a (104: CGC GGG ACG CGT ATT GGG ATG AAA GGC GAG CGC (sekvence ID NO:

17).

Konstrukce FcRylIA delečňích mutantů. Deleční mutanty FcRyllA karboxylového terminu se konstruovaly PCR stejným způsobem jako konstrukty plné délky, konvertující sekvence kódující Tyr y poloze 282 a 298 na štóp-kodony (TAA). N-terminální delece se generovaly amplifikací fragmentů kódujících méně intracélulární domény PCR s použitím oligonukléotidů, které umožní inserci výsledných fragmentů do předem vytvořeného éxprimujícího plasmidů kódujícího CD 16 extracelulární doménu fúzovanou k CD7 transmembránové doméně, která terminuje v místě Mlul a ve spojení mezi transmembránovou a intracélulární doménou.

Další uspořádání. Příklady popsané výše demonstrují, že agregace (, ή nebo γ chimér jsou schopny iniciovat odpověď cytolytických efektorových buněk v T-lymfocytech. Známý rozsah exprese (, η a γ, zahrnující T-lymfocyty, přirozené žabíječské buňky, bašofilnígranulocyty, makrofágy a stěžňové buňky předpokládá, že konzervativní sekvenční motivy interagují se * 99 · 9 » • V

9

9 «99 9999 •9 9999

99 • 9 9 9 9 ·

9 9 9 9

9 9 99· ·

9 9 9

99999 99- 9 sensorovým aparátem společným buňkám hematopoietického původu a že důležitá složka hostitelské obrany v imunitním systému je zprostředkovaná receptářovou agregací.

Potence cytolytické odpovědi a nepřítomnost odpovědi na cílové buňky nesoucí MHC receptory třídy Π demonstruje, že chiméry založené na ζ, ή nebo γ vytvářejí základ pro genetickou intervenci proti AIDS prostřednictvím adoptivní imunoterapie. Široká distribuce endogenních ζ a γ a důkaz, že asociace Fc receptoru s γ zprostředuje cytotóxieittu v různých buněčných typech (Fanger et al., Immunol Today IQ, 92-99 (1989)) umožňuje použití různých buněkprotyto účely.Napři klad neutr o filní granul ocyty, které mají velmi krátkou životnost (~4 h) v cirkulací a jsóu silně cytolytické, jsou atraktivními cílovými buňkami pro expresi chimér. Infekce neutrofilů HIV nemá za následek uvolnění viru, a množství těchto buněk (nejhojnějších z leukocytů) usnadňuje obranu hostitele. Jiná atraktivní možnost pro hostitelské buňky jsou maturované T-lymfocyty, populace v současnosti přístupná retrovirální manipulaci (Rosenberg, Sci. Am. 262. 62-69 í 1990)). S pomocí rekombinantní IL-2, populace T-lymfocytů relativně snadno expanduje v kultuře a expandované populace máji typicky limitovanou životnost při reinfiizi (Rosenberg et al., N. Engl. I Med. 323, 570-578 (1990)),

Za vhodných podmínek, HIV rozpoznávání buňkami exprimujícími CD4 chiméry také umožní mitogenní stimuly, umožňující vyzbrojené populaci odpovědět dynamicky na vzplanutí viru. Ačkoliv jsme se zde zaměřili na chování fuzních proteinů v cytolytických T-lymfocytech, exprese chimér v pomocných lymfočytech poskytuje HlV-mobilizovaný zdroj cytokinů, které překonají kolaps subsetu pomocných buněk při AIDS. Nedávný popis několika schémat pro manipulování s rezistencí vůči infekci v krocích jiných než je penetrace viru (Friédman et al., Nátuře 335. 452-454 (1989); Green et al., Cell 58, 215-223 (1989); Málim et al., Cell 58, 205-214 (1989); Trono et al., Cell 59, 113-120 (1989); Buonocore et al., Nátuře 345, 625-628 (1990)) předpokládá, že buňky nesoucí CD4 chiméry mohou být navrženy proti produkci viru expresí příslušných činidel s aktivním intracelulámím místem.

Schopnost transmitávat signály T-lymfocytům prostřednictvím autonomních Chimér také poskytuje schopnost regulace retrovirálně manipulovaných lymfocytů in vivo. Stimuly zesíťování, zprostředkované například specifickými IgM protilátkami manipulovanými k odstranění komplement-vážících domén, umožní takovým lymfocytům zvýšit počet in šitu, zatímco terapie podobnými specifickými IgG protilátkami (například rozeznávajícími aminokyselinové variace vnesené do ehimérňíeh řetězce) selektivně vyčerpá manipulovanou populaci. Navíc, anti-CD4 IgM protilátky nevyžadují další zesíťování k mobilizaci vápníku v Jurkat buňkách exprimujících • 44 4 «4 «4 4*44 · 4 »4·· >4 4 • 4 · *·4· • 444 4 4 444 4

4 4 4 4 4

444 4444 444 4444 44 4

CD4:( chiméry. Schopnost regulovat buněčnou populaci bez nutnosti opakovat extrakorporeální amplifikaci podstatně zvyšuje rozsah a účinnost současného použití pro geneticky manipulované T-lymfocyty.

Pro vytvoření dalších chimér skládajících se i ζ, η nebo γ intracelulárních sekvencí, se do cDNA nebo génomové sekvence kódující extracelulární doménu receptoru zavede restrikční místo v lokaci těsně předcházející vybranou třansmémbřánovou doménu. Fragment extracelulární domény teniiinujíeí v restrikčním místě Se spojí s ζ, η nebo γ sekvencí, Typické extracelulární domény se odvozují od receptoru, které rozpoznávají komplement, cukry, virové proteiny, bakterie, protozoa nebo metazoa parazity, nebo proteiny jimi indukované. Podobně ligandy nebo receptory exprimované pathogeny nebo nádorovými buňkami se připojí na ζ, η nebo γ sekvenci, k řízení imunitní odpovědi proti buňkám nesoucím receptory rozpoznávající tyto ligandy.

Ačkoliv vynález byl popsán ve spojitosti se specifickým uspořádáním, rozumí, se, zeje schopen dalších modifikací, a tato přihláška je míněna k pokrytí variací použití, nebo adaptací vynálezu včetně takových rozdílů ód přiloženého popisu, jaké še vyskytují v technice, které se vynález týká, a jak může být aplikováno v základních rysech s uveřejněním následujících přiložených nároků.

Claims (1)

1. Průmyslová využitelnost

   Předkládaný vynález se vztahuje k regulaci lymfocytů, makrofagů, přirozených zabíječských buněk nebo granulocytů expresí chimér uvedených buněk, které způsobují buněčnou odpověď na cílové podněty rozpoznávané Chimérami; vynález se tak vztahuje na způsob řízení buněčné odpovědi na infekční částici, nádorovou nebo rakovinnou buňku, nebo ha buňku' generovanou autoimunitou. Tomu odpovídaje,: vynález zahrnuje užití těchto buněk exprimujících receptorové chiméry při produkci léčiv pro terapii chorob a poskytuje vhodný prostředek k regulaci počtu a aktivity lymfocytů a buněk, aniž by se vyjmuly z těla pacienta pro in vitro amplifikaci. Specificky vynález poskytuje metodu pro řízení buněčné odpovědi na buňky infikované vírem HIV jako základ pro genetickou intervenci proti AIDS prostřednictvím adoptivní imunoterapie.

   Protilátky proti chimérám recéptorů T-lymfocytů, B-lymfócytů nebo Fc receptorů podle předkládaného vynálezu se používají pro monitorování množství chimérních receptorů (nebo buněk nesoucích ehimémi receptory) v pacientech. Tyto protilátky jsou také vhodné pro použití ve standardních imunódiágnostiČních testech známých v oboru, včetně imunometrickýeh nebo sendvičových testů.