ES2246337T3 - Metodo de produccion de peliculas a base de quitosan con capacidad de adherencia celular aumentada, producto obtenido y aplicaciones. - Google Patents
Metodo de produccion de peliculas a base de quitosan con capacidad de adherencia celular aumentada, producto obtenido y aplicaciones.Info
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Abstract
El método comprende, en general, la formación de un filme a base de quitosán, la estabilización de dicho filme y la activación de la capacidad de adherencia celular mediante un secado del filme estabilizado y lavado. Adicionalmente, el filme puede ser activado biológicamente mediante la fijación de una sustancia con actividad biológica. Los filmes obtenidos tienen una capacidad de adherencia celular aumentada, y, opcionalmente, están biológicamente activados. Estos filmes pueden ser utilizados para inducir una actividad biológica en un organismo receptor, y/o para potenciar la osteointegración de implantes de uso odontológico o traumatológico y/o para regenerar tejido óseo.
Description
Método de producción de películas a base de
quitosan con capacidad de adherencia celular aumentada, producto
obtenido y aplicaciones.
La invención se encuadra dentro del campo técnico
de la producción de películas basadas en quitosan y sus
aplicaciones en la industria farmacéutica, alimenticia y
biotecnológica. Más específicamente, la invención propone un nuevo
método de tratamiento del quitosan que permite obtener películas de
quitosan con capacidad de adherencia celular aumentada, lo que le
confiere importantes aplicaciones en medicina, farmacia y
biotecnología no conseguidas hasta la fecha.
El quitosan es un polímero de origen natural
obtenido por desacetilación parcial de la quitina, homopolímero de
la
\beta-1,4-2-acetamida-D-glucosamina,
siendo este último el segundo polisacárido más abundante en la
naturaleza después de la celulosa.
Ambos, quitina y quitosan, poseen aplicaciones
importantes y reales en la industria alimenticia, farmacéutica y
biotecnológica. Baste para ello hacer una revisión de las patentes
presentadas acerca de sus posibles usos en los últimos años y
observar la orientación fundamentalmente aplicada que presentan los
Simposios Internacionales sobre el tema (Domard et al.,
Advances in Chitin Sciences, Vol II, 7º ICCC (Euchis 97), Jacques
Sandre Publisher (1998); Peter et al., Advances in Chitin
Sciences, Vol IV (Euchis 99), Universität Potsdam (2000)).
El quitosan presenta varias propiedades que hacen
que su uso esté especialmente indicado en la industria
médica/farmacéutica. Por una parte, es un polímero biocompatible y
biodegradable (Lim et al., J. Biomed. Mater. Res. (Appl.
Biomater.) 43, 282-290 (1998); Muzzarelli et
al., Biomaterials, 14 (1), 39-43 (1993)), con
propiedades antifúngicas y antimicrobianas (Sano et al., J.
Dental. Res., 66, 141-149 (1987); Ramos, V. Tesis
Doctoral, Univ. Nacional del Sur, Bahía Blanca, Argentina, (1999)),
que puede presentarse en una gran variedad de estados físicos, por
ejemplo, matrices porosas, geles, hidrogeles, hilos, películas,
etc., dependiendo del tratamiento al que se le someta.
Por otra parte, es un producto capaz de
inmovilizar por adsorción una gran cantidad de sustancias y con la
posibilidad, dada la presencia de un gran número de grupos
reactivos, de inmovilizar covalentemente, por medio de reacciones
relativamente sencillas, sustancias que aporten una actividad
biológica deseada (sustancias bioactivas), así como la de su
derivatización con diversos grupos funcionales (WO 92/09635;
Muzzarelli y Zattini, J. Biol. Macromol. 8,137-143
(1986); y Muzzarelli et al. Carbohydr. Polymers 11,
307-320 (1989)).
La bibliografía aportada indica la enorme
variedad de posibilidades que su uso ofrece en el campo de la
bioingeniería, habiéndose desarrollado ya algunas aplicaciones
importantes del mismo como, por ejemplo, su uso en la fabricación de
suturas médicas o como componente de vendaje para heridas (documento
US 6.022.556), donde se aprovechan algunas de las propiedades ya
mencionadas.
La degradación in vivo del quitosan
produce oligómeros de D-glucosamina, cuya posterior
degradación permite obtener productos que pueden entrar en la ruta
biosintética del ácido hialurónico, lo que hace de este producto
una elección adecuada para la reparación guiada de lesiones óseas y
óseo-cartilaginosas, estando descrito en la
bibliografía su efecto positivo en el tratamiento de este tipo de
lesiones.
Sin embargo, hasta el momento, no existe ningún
producto comercializado basado en quitosan o derivados del mismo en
el campo de las reparaciones tisulares guiadas, especialmente de
lesiones óseas y óseo-cartilaginosas.
La razón debe buscarse en una falta de adecuación
del quitosan para la adhesión y proliferación celular de una forma
homogénea sobre una matriz tridimensional de ese compuesto, una de
las características que deben poseer las matrices usadas en
ingeniería de tejidos (Atala y Mooney, Synthetic Biodegradable
Polymer Scaffolds, Birkäuser, Boston (1997)). De hecho, si se hace
un estudio de las aplicaciones biomédicas del quitosan, su uso
fundamental, fuera de los ya mencionados de material de sutura y
componente de vendaje de heridas, radica en su empleo como material
de relleno, tal vez actuando de aglutinante en forma de hidrogel, o
como agente liberador de sustancias bioactivas encapsuladas.
Tan sólo se ha recuperado una patente en la base
de datos de patentes norteamericanas de los últimos 20 años en la
que se utiliza el quitosan como soporte para la regeneración guiada
y, en ella, se obvia el inconveniente antes citado recubriendo la
malla tridimensional de quitosan con una película de
poliláctico-coglicólico (documento US 5.830.493),
perdiéndose en este proceso la capacidad de fijación y adsorción de
sustancias bioactivas de interés, ya mencionada.
Por otra parte, si a esta capacidad de activación
mediante la adsorción o unión de compuestos de interés biológico se
le unen sus características filmógenas, se tendrá, en principio, un
material idóneo para el recubrimiento de prótesis, implantes o
incluso de mallas tridimensionales de otros polímeros susceptibles
de usarse en ingeniería de tejidos, de forma que la acción
biológica deseada inducida por este quitosan activado se produciría
precisamente en la región elegida del organismo.
De nuevo una búsqueda bibliográfica conduce a un
vacío en cuanto a la explotación de esta capacidad filmógena en
este campo; tan sólo destacar su uso como material de recubrimiento
de sistemas de diálisis (documento US 5.885.609), tratando a este
material de forma que se reduzca en lo posible la adhesión
celular.
Dos son los principales inconvenientes para el
uso del quitosan en el sentido señalado. Por una parte, el
procedimiento de estabilización usado normalmente para las
películas de quitosan puede afectar negativamente a la estructura
del soporte que se va a recubrir. En este sentido hay que tener en
cuenta que el quitosan se solubiliza normalmente en medio ácido, y
las películas de quitosan obtenidas a partir de dichas disoluciones
conservan este carácter ácido, encontrándose el quitosan como ion
quitosonio. Una película así formada, en contacto con el agua o
soluciones fisiológicas tamponadas (por ejemplo, solución salina
tamponada con fosfato (PBS)) confiere un carácter ácido a dicha
disolución y la película pierde su integridad rápidamente,
deshaciéndose al poco tiempo. Debido a este fenómeno es necesario
estabilizarlo, consistiendo el procedimiento normalmente usado en la
inmersión del quitosan en una disolución fuertemente básica,
normalmente NaOH, durante al menos 1 hora. Este carácter básico es
el que puede afectar a algunos de los soportes usados comúnmente en
ingeniería de tejidos, por ejemplo, ácido poliláctico o
poliglicólico.
El segundo inconveniente, tal vez el más
importante desde el punto de vista de su aplicación práctica radica
en la baja adherencia celular, si se compara la obtenida en una
película de quitosan formada según los protocolos existentes con
respecto a la que se produce en los plásticos comerciales tratados
con este fin. Esto está agravado, además, por no ser homogénea la
adherencia celular. Las células proliferan sólo en determinadas
zonas de la película y cambian de forma drástica su morfología, lo
que a su vez implica una alteración importante en el metabolismo y
las características específicas de las mismas con respecto a lo que
se considera normal para estas líneas celulares.
Es pues, sobre todo, la baja tasa y esta falta de
uniformidad en la adherencia celular la que dificulta su uso como
material de recubrimiento, bien para prótesis usadas corrientemente
en la práctica médico-quirúrgica y odontológica, o
bien para mallas de biomateriales ya usados en ingeniería de
tejidos, como pueden ser a título de ejemplo, el ácido
poli-L-láctico o polianhídridos.
La invención se enfrenta con el problema de
proporcionar películas de quitosan capaces de permitir una buena
adhesión y proliferación celular, y que, además, sean susceptibles
de ser activadas mediante la incorporación de sustancias con
actividad biológica, lo que les proporcionaría una importante
aplicación en el sector médico-farmacéutico.
La solución proporcionada por la presente
invención se basa en que los inventores han observado que la
realización de una etapa de secado sobre una película a base de
quitosan previamente estabilizada y lavada incrementa
considerablemente la capacidad de adherencia celular de una película
a base de quitosan sometida a dicho tratamiento de secado. Mediante
dicho tratamiento es posible obtener películas a base de quitosan
que presentan unas características de adherencia y proliferación
celular similares o superiores a las obtenidas en plásticos
comerciales (por ejemplo, placas de pocillos) tratados con este fin,
así como unas propiedades que les hacen susceptibles de inmovilizar,
bien por adsorción o bien covalentemente, sustancias con actividad
biológica, entre ellas las proteínas morfogenéticas óseas (BMP),
manteniéndose su actividad biológica.
Por tanto, un objeto de esta invención lo
constituye un método para producir una película a base de quitosan,
con capacidad de adherencia celular aumentada. Dicha película
constituye un objeto adicional de esta invención.
Otro objeto adicional de esta invención lo
constituye un método para producir una película a base de quitosan,
con capacidad de adherencia celular aumentada, biológicamente
activada con una sustancia con actividad biológica. La película
resultante constituye otro objeto adicional de esta invención.
Otro objeto adicional de esta invención lo
constituye un producto recubierto total o parcialmente con dichas
películas a base de quitosan, tal como, por ejemplo, un implante de
uso odontológico o traumatológico.
Otro objeto adicional de esta invención lo
constituyen las aplicaciones de dichas películas a base de
quitosan, tales como el empleo de dicha película a base de quitosan
con capacidad de adherencia celular aumentada como vehículo para el
transporte y la liberación de sustancias con actividad biológica, o
su empleo en la elaboración de una película a base de quitosan con
capacidad de adherencia celular aumentada, biológicamente activada.
Dicha película a base de quitosan biológicamente activada puede
utilizarse, a su vez, en múltiples aplicaciones, tales como en la
inducción de una actividad biológica en un organismo receptor, en la
potenciación de la osteointegración de implantes de uso odontológico
o traumatológico y/o en la regeneración de tejidos, por ejemplo,
tejido óseo, entre otras
aplicaciones.
aplicaciones.
La figura 1 es una fotografía, obtenida por
microscopía óptica inversa (100x), de un cultivo de células C2C12
sembradas sobre pocillos que contienen películas de quitosan
estabilizadas con NaOH no sometidas al tratamiento de activación de
la capacidad de adherencia celular de la invención (ejemplo
comparativo), donde puede observarse la apariencia redondeada de
las células, indicativo de que se encuentran en suspensión.
La figura 2 es una fotografía, obtenida por
microscopía óptica inversa (100x), de un cultivo de células C2C12
sembradas sobre pocillos que contienen películas de quitosan
estabilizadas con NaOH no sometidas al tratamiento de activación de
la capacidad de adherencia celular de la invención (ejemplo
comparativo), en una etapa posterior a la mostrada en la figura 1,
esto es, después de cambiar el medio de cultivo con el consiguiente
arrastre de las células no adheridas a la película, donde puede
observarse el agrupamiento de las células en forma de racimos, lo
que indica un patrón de crecimiento atípico.
La figura 3 es una fotografía, obtenida por
microscopía óptica inversa (100x), de un cultivo de células C2C12
sembradas sobre pocillos que contienen películas de quitosan
estabilizadas con glutaraldehído y NaOH no sometidas al tratamiento
de activación de la capacidad de adherencia celular (ejemplo
comparativo), donde puede observarse una morfología alterada de
dichas células debido a su adhesión a la película, indicativo de un
patrón de crecimiento anómalo, así como una modificación de su
citoarquitectura.
La figura 4 es una fotografía, obtenida por
microscopía óptica inversa (100x), de un cultivo de células C2C12
sembradas sobre pocillos que contienen películas de quitosan
estabilizadas con NaOH sometidas al tratamiento de activación de la
capacidad de adherencia celular proporcionado por esta invención
(ejemplo 1), donde puede observarse que toda la superficie de la
película esta recubierta totalmente de células en forma de monocapa
hasta llegar a confluencia.
La figura 5 es una fotografía, obtenida por
microscopía óptica inversa (100x), de un cultivo de células C2C12
sembradas sobre pocillos que contienen películas de quitosan
estabilizadas con NaOH sometidas al tratamiento de activación de la
capacidad de adherencia celular proporcionado por esta invención
(ejemplo 1), en una etapa anterior a la mostrada en la figura 4,
donde pueden observarse trozos de película sin recubrir todavía con
las células.
La figura 6 es una fotografía, obtenida por
microscopía óptica inversa (100x), de un cultivo de células ROS
17/2.8 sembradas sobre pocillos que contienen películas de quitosan
estabilizadas con NaOH sometidas al tratamiento de activación de la
capacidad de adherencia celular proporcionado por esta invención
(ejemplo 1), donde puede observarse que toda la superficie de la
película está recubierta totalmente de células en forma de monocapa
hasta llegar a confluencia.
La figura 7 es una fotografía (100x) obtenida por
microscopía electrónica de barrido (SEM) de un fragmento de un
tornillo de titanio utilizado en ensayos de implantes en animales de
experimentación, antes de ser recubierto con una película de
quitosan, donde pueden observarse las líneas de mecanización del
tornillo.
La figura 8 es una fotografía (100x) obtenida por
microscopía electrónica de barrido (SEM) de un fragmento de un
tornillo de titanio utilizado en ensayos de implantes en animales de
experimentación, recubierto con una película de quitosan
estabilizada con NaOH y sometida a un tratamiento de activación de
la capacidad de adherencia celular proporcionada por esta
invención.
La figura 9 es un diagrama de barras que ilustra
el contenido en proteínas totales del cultivo celular, determinado
por el método de Bradford, respecto al tiempo de cultivo (días), en
donde el valor de la absorbancia es indicativo del contenido en
proteínas del cultivo celular en cada caso, e, indirectamente, de la
cantidad de células adheridas a la película; se comparan los valores
obtenidos utilizando una placa de pocillos convencional (plástico)
usada como referencia frente a los valores obtenidos utilizando
películas de quitosan estabilizadas con distintos tratamientos de
estabilización no sometidas al tratamiento activador de la
capacidad de adherencia celular proporcionado por esta invención.
Tratamiento 1: estabilización con tampón fosfato; tratamiento 2:
estabilización con NaOH; tratamiento 3: estabilización con
glutaraldehído y NaOH; y tratamiento 4: estabilización con
glutaraldehído.
La figura 10 es un diagrama de barras que ilustra
el contenido en proteínas totales del cultivo celular, determinado
por el método de Bradford, respecto al tiempo de cultivo (días), en
donde el valor de la absorbancia es indicativo del contenido en
proteínas del cultivo celular en cada caso, e, indirectamente, de la
cantidad de células adheridas a la película; se comparan los
valores obtenidos utilizando una placa de pocillos convencional
(plástico) usada como referencia frente a los valores obtenidos
utilizando películas de quitosan estabilizadas con distintos
tratamientos de estabilización sometidas posteriormente al
tratamiento activador de la capacidad de adherencia celular
proporcionado por esta invención. Tratamiento 1: estabilización con
tampón fosfato; tratamiento 2: estabilización con NaOH; tratamiento
3: estabilización con glutaraldehído y NaOH; y tratamiento 4:
estabilización con glutaraldehído.
La figura 11 es un diagrama de barras que ilustra
el porcentaje de rhBMP-2 adsorbido por películas de
quitosan estabilizadas con NaOH y sometidas al tratamiento
activador de la capacidad de adherencia celular proporcionado por
esta invención frente a la cantidad de proteína añadida.
La figura 12 es un diagrama de barras que ilustra
el porcentaje de rhBMP-2 adsorbido por películas de
quitosan estabilizadas con glutaraldehído y sometidas al tratamiento
activador de la capacidad de adherencia celular proporcionado por
esta invención frente a la cantidad de proteína añadida.
La figura 13 es un diagrama de barras que ilustra
la actividad fosfatasa alcalina/proteína total en pocillo a diversos
días; los resultados obtenidos ponen de manifiesto que la
rhBMP-2, unida a películas de quitosan
estabilizadas mediante diversos tratamientos y sometidas al
tratamiento activador de la capacidad de adherencia celular
proporcionado por esta invención, permanece activa; se comparan los
valores obtenidos frente a los obtenidos utilizando una placa de
pocillos convencional (plástico) usada como referencia. Tratamiento
1: estabilización con tampón fosfato; tratamiento 2: estabilización
con NaOH; tratamiento 3: estabilización con glutaraldehído y NaOH;
y tratamiento 4: estabilización con glutaraldehído.
La figura 14 es un diagrama de barras que muestra
los valores del momento de torsión o par de fuerzas necesario para
desenroscar el implante previamente implantado en la meseta tibial
de los conejos utilizados a distintos tiempos; se comparan los
resultados obtenidos utilizando tornillos de titanio recubiertos con
películas de quitosan proporcionadas por esta invención,
estabilizadas mediante diversos tratamientos (NaOH: tratamiento 2;
glutaraldehído y NaOH: tratamiento 3; y glutaraldehído: tratamiento
4), sometidas al tratamiento activador de la capacidad de
adherencia celular proporcionado por esta invención y activadas
biológicamente con rhBMP-2 frente a los resultados
obtenidos con controles (tornillos de titanio sin recubrir); se
incluyen además, a modo comparativo, los valores obtenidos con los
tornillos comerciales Osseotite®; y TiUnite®; (Nobel Pharma) [datos
extraídos de Gottlob et al., Applied Osteointegration
Research, 2000,1: 25-27].
La presente invención se refiere, en general, a
la producción de películas a base de quitosan con capacidad de
adherencia celular aumentada, y susceptibles de ser activadas
biológicamente, así como a las películas resultantes y a sus
aplicaciones.
En general, el método de producción de películas
a base de quitosan con capacidad de adherencia celular aumentada
proporcionado por esta invención comprende, en general, las etapas
generales de formación de la película a base de quitosan, su
estabilización y el tratamiento activador de la capacidad de
adherencia celular de la película estabilizada. Por otra parte, la
activación biológica de la película a base de quitosan puede
realizarse una vez que se ha formado la película o,
alternativamente, incorporando la sustancia con actividad biológica
en alguna de las etapas del proceso productivo de la película, por
ejemplo, durante la disolución del quitosan o durante la
estabilización de la película, dependiendo de la estabilidad y
naturaleza de las sustancias con actividad biológica que se van a
utilizar, así como del tratamiento a que se someta la película en
las otras etapas.
Más específicamente, la invención proporciona un
método para producir una película a base de quitosan con capacidad
de adherencia celular aumentada, en adelante método de la invención,
que comprende:
- a)
- disolver el quitosan, opcionalmente junto con un polímero biodegradable, en un medio de solubilización que comprende una disolución acuosa de un ácido;
- b)
- depositar la disolución resultante de la etapa a) sobre una superficie;
- c)
- secar dicha disolución depositada sobre dicha superficie, para obtener una película a base de quitosan;
- d)
- poner en contacto dicha película a base de quitosan con un agente de estabilización seleccionado de (i) una disolución acuosa de una base, (ii) un tampón de pH igual o superior a 5, (iii) un agente de entrecruzamiento, y (iv) mezclas de los mismos;
- e)
- lavar la película a base de quitosan, estabilizada, obtenida en la etapa d); y
- f)
- secar dicha película a base de quitosan estabilizada a una temperatura comprendida entre 15ºC y 80ºC, en presencia de una corriente de aire.
La película a base de quitosan con capacidad de
adherencia celular aumentada, que se puede obtener mediante el
método de la invención, está constituida total o principalmente por
quitosan. El quitosan es un polímero natural obtenido por la
desacetilación parcial de la quitina. La quitina puede obtenerse a
partir de muy diversas fuentes, por ejemplo, crustáceos, hongos,
etc. El origen de la quitina empleada para la obtención del
quitosan que se va a utilizar en la presente invención es
indiferente. Asimismo, es posible realizar modificaciones en el
quitosan con el fin de introducirle diferentes grupos funcionales,
los cuales, por ejemplo, pueden favorecer la degradación biológica
in vivo del quitosan, estimular la regeneración ósea, etc. A
modo ilustrativo, dichos grupos funcionales incluyen grupos
fosfónicos, grupos carboximetilo, grupos metilpirrolidona, etc. En
general, puede efectuarse cualquier modificación sobre el quitosan
siempre y cuando el producto final mantenga su capacidad filmógena.
En una realización particular, el quitosan utilizado en la presente
invención comprende quitosan derivatizado con uno o más grupos
funcionales seleccionados entre grupos fosfónicos, grupos
carboximetilo, grupos metilpirrolidona y mezclas de los mismos.
El quitosan, al ser un polímero obtenido por
desacetilación parcial de la quitina, ofrece un intervalo de pesos
moleculares y grados de desacetilación muy amplio, dependiendo estos
parámetros de las condiciones concretas utilizadas en la hidrólisis
básica realizada en el material de partida (quitina), así como del
origen de este. Así, se pueden obtener, por ejemplo, quitosans cuyo
peso molecular promedio está comprendido entre 150.000 y 2.000.000 e
incluso mayores, con grados de desacetilación comprendidos entre el
65% y el 95% o incluso mayores. Cualquiera de dichos quitosans
puede utilizarse en la puesta en práctica de la presente invención
aunque se prefieren aquellos quitosans de pesos moleculares
promedio medios y bajos, por ejemplo, entre 200.000 y 500.000, y de
grado de desacetilación medios y elevados, por ejemplo, entre el 65%
y el 95%.
El polímero biodegradable, en caso de utilizarse,
puede ser cualquier polímero, natural o sintético, siempre y cuando
sea soluble en agua o en un medio acuoso ácido, y biodegradable.
Ejemplos ilustrativos de polímeros biodegradables que pueden
utilizarse en la presente invención incluyen ácido poliglicólico,
alginato, carragenato, colágeno, etc., y mezclas de los mismos.
El medio de solubilización del quitosan,
opcionalmente junto con el polímero biodegradable, es un medio que
comprende una disolución acuosa de un ácido, orgánico o inorgánico,
de un pH igual o inferior a 3,5.
En general, puede utilizarse cualquier ácido en
el que el quitosan, y, en su caso el polímero biodegradable, sean
solubles. A modo ilustrativo, dicho ácido puede ser ácido
clorhídrico, ácido acético, ácido cítrico, ácido láctico, ácido
málico, etc. En una realización particular, el medio de
solubilización es una disolución acuosa de ácido acético.
La concentración del quitosan en la disolución
resultante puede variar dentro de un amplio intervalo, habiéndose
alcanzado concentraciones de hasta el 5% en quitosan (es decir,
superiores a las utilizadas habitualmente en la formación de
películas de quitosan).
La disolución de quitosan junto con,
opcionalmente, el polímero biodegradable, en adelante, disolución a
base de quitosan, debe presentar una viscosidad adecuada a la
aplicación a la que va destinada. Esta viscosidad puede variar
dentro de un amplio intervalo dependiendo de si dicha disolución a
base de quitosan va a ser aplicada sobre una superficie plana o
sobre una superficie compleja, o si va a ser utilizada como medio
para el recubrimiento por inmersión de un artículo, por ejemplo, un
tornillo del tipo utilizado en los implantes dentales.
La viscosidad de la disolución a base de quitosan
viene determinada por varios factores intrínsecos a la misma. Por
una parte, por la concentración del quitosan, por otra, por el peso
molecular promedio del quitosan empleado en la preparación de dicha
disolución, y, finalmente, por el medio de solubilización
utilizado.
En general, la viscosidad no es determinante en
la realización práctica de la presente invención, salvo en el caso
de formación de películas sobre superficies complejas, donde este
parámetro ha de ser suficientemente elevado como para permitir la
formación de una película homogénea sobre la misma durante el
proceso de evaporación de la disolución.
En varias realizaciones prácticas de la presente
invención se han utilizado, rutinariamente, disoluciones de
quitosan al 1% en ácido acético 50 mM que poseían viscosidades
intrínsecas que variaban desde 17 g.dL^{-1} hasta 4 g.dL^{-1},
dependiendo del peso molecular del quitosan empleado.
Una vez preparada la disolución a base de
quitosan, con la viscosidad adecuada, dicha disolución se deposita
o extiende uniformemente, mediante métodos convencionales, por
ejemplo, por pulverización, inmersión, aplicación con pincel, etc.,
sobre una superficie, tal como una superficie plana o compleja, o
sobre la superficie del objeto que se va a recubrir con la película
a base de quitosan proporcionada por esta invención.
Una vez depositada la disolución a base de
quitosan sobre dicha superficie, se procede a su secado con el fin
de retirar el disolvente, por ejemplo, por simple evaporación, y
obtener la película a base de quitosan sobre dicha superficie.
El secado se puede realizar por cualquier método
convencional. En general, se puede realizar a una temperatura
comprendida entre la temperatura ambiente y una temperatura en la
que no se produzca la descomposición térmica del quitosan, por
ejemplo, a una temperatura comprendida entre 15ºC y 80ºC,
opcionalmente en presencia de una corriente de aire, durante un
periodo de tiempo adecuado hasta pesada constante. En general,
aumentando la temperatura se reduce la duración de esta etapa.
Cuando las películas a base de quitosan van destinadas a
aplicaciones relacionadas con el crecimiento y proliferación
celular, es conveniente trabajar en un cuarto estéril o en una
campana de flujo laminar con corriente de aire con el fin de obtener
una película no contaminada. En una realización particular, el
secado de la película a base de quitosan se realiza a una
temperatura comprendida entre 20ºC y 40ºC, bajo una corriente de
aire. En las condiciones indicadas, la etapa de secado puede durar
entre 12 y 24 horas.
La película a base de quitosan previamente
obtenida no es susceptible de uso inmediato debido a su carácter
fuertemente ácido. Como se ha indicado previamente, dicha película
en contacto con agua o con soluciones fisiológicas tamponadas, tal
como PBS, se deshace rápidamente. Debido a ello es necesario
proceder a estabilizar la película antes de su uso.
Para estabilizar la película a base de quitosan
previamente formado, se pone en contacto dicha película con un
agente de estabilización, que puede ser (a) un agente de
neutralización, tal como una disolución acuosa de una base o un
tampón de pH igual o superior a 5; (b) un agente de
entrecruzamiento; o (c) mezclas de los mismos.
El procedimiento normalmente usado para
estabilizar películas de quitosan consiste en la inmersión de la
película (o del objeto o superficie recubierta por el mismo), en
una disolución fuertemente básica, generalmente, NaOH 1 M, durante
un periodo de tiempo mínimo de 1 hora, llegándose algunas veces
hasta las 24 horas. Sin embargo, dicho procedimiento puede afectar
negativamente, como ya se ha mencionado, a la estabilidad del
soporte recubierto por la película. El efecto de este tratamiento
produce, además, y ese es su fin precisamente, una neutralización
total de las cargas presentes en los iones quitosonio, con lo que se
origina también una fuerte disminución de la interacción entre la
película y el soporte recubierto por ella.
Aunque es posible utilizar el protocolo de
estabilización previamente mencionado, en la presente invención se
prefiere el uso de condiciones menos drásticas en el tratamiento
básico, disminuyendo tanto la concentración de base (NaOH) utilizada
como el tiempo de exposición al mismo. En una realización
particular, se emplea un tiempo de inmersión comprendido entre 30 y
40 minutos en una disolución acuosa de NaOH 0,5 M.
Alternativamente, es posible utilizar otros
medios más suaves, tales como los proporcionados por disoluciones
tampón con un pH igual o superior a 5, por ejemplo, disoluciones
tampón carbonato o tampón fosfato, para neutralizar la carga de la
película de quitosan.
Otra forma de estabilizar la película a base de
quitosan formado comprende el entrecruzamiento, mediante el empleo
de agentes de entrecruzamiento, tales como reactivos bifuncionales,
entre las cadenas de quitosan presentes en la película. En una
realización particular, el agente de entrecruzamiento utilizado es
el glutaraldehído ya que este es el reactivo bifuncional comúnmente
empleado. El glutaraldehído puede utilizarse con un medio
fuertemente alcalino, tal como el proporcionado por NaOH, o bien con
un medio más suave, tal como el proporcionado por el tampón
carbonato o el tampón fosfato. En estos casos, la estabilización de
la película se consigue simultaneando la neutralización de sus
cargas con el entrecruzamiento de las cadenas de quitosan.
De acuerdo con lo anterior, para la
estabilización de las películas a base de quitosan previamente
obtenidas se puede utilizar, en una realización particular, un
tampón fosfato de molaridad comprendida entre 0,1 y 1 M,
preferiblemente 0,25 M, a un valor de pH próximo al neutro. Como
agente de entrecruzamiento se puede utilizar glutaraldehído, en
concentraciones de hasta el 0,1%, preferiblemente inferiores al
0,05% y más preferiblemente del 0,025% o inferiores. También se han
utilizado combinaciones de ambos efectos estabilizadores, por
ejemplo, el tratamiento simultáneo con NaOH y glutaraldehído en
concentraciones de 0,5 M y 0,025%, respectivamente. En otra
realización particular, se ha utilizado un agente de estabilización
que comprende un tampón, tal como tampón fosfato o tampón
carbonato, y glutaraldehído.
El tiempo de exposición a los diversos agentes es
variable, prefiriéndose exposiciones comprendidas entre 30 y 45
minutos, aunque son posibles tiempos mayores.
Una vez estabilizada la película a base de
quitosan, se retira el agente de estabilización utilizado con tal
fin y se lava una o varias veces para eliminar los restos del agente
de estabilización utilizado, con un volumen suficiente de PBS o de
cualquier otro medio compatible con el uso biológico propuesto para
dichas películas.
La película así estabilizada todavía no puede
mostrar una adherencia celular uniforme y homogénea sobre toda su
superficie. Como se pone de manifiesto en el ejemplo comparativo, si
tras los lavados se procede a la siembra de líneas celulares
adherentes establecidas, los ensayos de cantidad de DNA presente
indican que sólo aproximadamente un tercio de las células sembradas
se adhieren a la película formada según el método previamente
descrito (figura 1). Esta adherencia no es homogénea sino que se
produce en determinadas zonas de la película, existiendo gran parte
de su superficie sin células adheridas (figura 2). Es más, la
proliferación celular que se produce en dichas células adherentes no
tiende a producir su expansión sobre toda la superficie de la
película, sino que se localiza en torno al punto inicial de
adherencia (figura 2), alterándose la citoarquitectura celular y
cambiando la morfología típica de fibroblastos de estas líneas
celulares (figura 3). Este hecho imposibilita el uso práctico de
dichas películas a base de quitosan para una regeneración tisular
guiada.
La adherencia celular previamente mencionada es
muy variable, dependiendo del origen del quitosan, del método
utilizado en su obtención, del peso molecular promedio del quitosan
usado, del tiempo y condiciones de almacenamiento de la película de
quitosan, previo a su estabilización, etc. No existe una correlación
clara entre las diversas variables mencionadas y la adherencia
celular homogénea sobre la película, obteniéndose, como se dijo al
principio, resultados muy variables.
El hecho de que un tiempo prolongado de
almacenamiento (a veces de meses) de la película a base de quitosan
parezca afectar favorablemente a la adhesión celular, con respecto
a la misma película formada y empleada inmediatamente (con lo que se
elimina la influencia del peso molecular del quitosan usado y siendo
además los pesos de las láminas iguales), parece indicar que se
produce un ligero cambio estructural que afecta de forma sutil a la
adherencia.
No obstante, la aleatoriedad de este fenómeno
indica la necesidad de desarrollar un procedimiento que homogeneice
el comportamiento de la película de quitosan con respecto a la
capacidad de unión y proliferación celular, de forma que se
produzca la "activación" del quitosan en este sentido. Con esta
finalidad se lleva a cabo la siguiente etapa del método de la
invención, consistente en un tratamiento activador de la capacidad
de adherencia celular de la película estabilizada.
Durante el desarrollo de la presente invención se
ha descubierto, sorprendentemente, que la realización de, al menos,
un segundo secado de la película a base de quitosan, ya estabilizada
y lavada, en las mismas condiciones que las empleadas en la
formación inicial de la misma, homogeneiza el comportamiento de la
película de quitosan con respecto a la adherencia celular,
obteniéndose densidades celulares tras la siembra similares a las
que presentan las mismas células en frascos de cultivo comerciales,
con niveles de actividad enzimática (indicadores de la viabilidad
del cultivo) y cantidad de DNA equivalentes a los obtenidos en estos
últimos. La proliferación celular es homogénea, manteniéndose
microscópicamente la morfología celular típica de las líneas
sembradas.
El segundo secado se realiza por cualquier método
convencional, a una temperatura comprendida entre 15ºC y 80ºC, en
presencia de una corriente de aire, durante un periodo de tiempo
adecuado. El secado se realiza hasta pesada constante. En una
realización particular, el secado de la película a base de quitosan
se realiza a una temperatura comprendida entre 20ºC y 40ºC, bajo
una corriente de aire. En las condiciones indicadas se suele
conseguir la pesada constante en unas 12-24
horas.
La película a base de quitosan que se puede
obtener mediante el método de la invención, posee una capacidad de
adherencia celular aumentada. La capacidad de una película de
adherencia celular puede determinarse por diversos ensayos. A modo
ilustrativo, dicha capacidad de adherencia celular puede
determinarse utilizando cualquier línea celular adherente, por
ejemplo, células C2C12, mediante el ensayo denominado "ensayo del
homodímero de etidio" [véase el ejemplo 1 en el que se describe
el protocolo de dicho ensayo] que, brevemente, comprende cultivar
células C2C12 en pocillos recubiertos con película a base de
quitosan o no recubiertos (plástico), lisar las células, añadir
homodímero de etidio, incubar y leer la intensidad de fluorescencia
emitida a 645 nm tras excitación a 530 nm. En el sentido utilizado
en esta descripción, la expresión "película a base de quitosan
con capacidad de adherencia celular aumentada" se refiere a que
dicha película a base de quitosan tiene una capacidad de adherencia
celular superior a la que tiene la misma película en condiciones
normales, esto es, sin haber sido sometida a ningún tratamiento
específico para activar su capacidad de adherencia celular. A modo
ilustrativo, el tratamiento activador de la capacidad de la
adherencia celular de esta invención, proporciona una película a
base de quitosan activado con dicho tratamiento una capacidad de
adherencia celular, determinada por el ensayo del homodímero de
etidio, igual o superior a un incremento de al menos un 25%,
preferiblemente de al menos un 50% sobre el valor de la capacidad
de adherencia celular determinado por dicho ensayo del homodímero de
etidio sobre una película de quitosan no sometida a dicho
tratamiento activador de la capacidad de adherencia celular.
La película a base de quitosan con capacidad de
adherencia celular aumentada que se puede obtener mediante el
método de la invención constituye un objeto adicional de esta
invención.
La película a base de quitosan con capacidad de
adherencia celular puede utilizarse para adherir y hacer crecer
células. Para ello, puede resultar interesante, inmovilizar sobre
dicha película sustancias con capacidad para estimular la
proliferación celular.
Adicionalmente, la película a base de quitosan
con capacidad de adherencia celular aumentada puede utilizarse como
vehículo de sustancias con actividad biológica de forma que pueda
fijar o inmovilizar sustancias con actividad biológica y,
opcionalmente, liberarlas en los lugares de interés.
Por tanto, la invención proporciona una película
de quitosan con capacidad de adherencia celular aumentada, activada
biológicamente, que comprende dicha película de quitosan que se
puede obtener según el método de la invención y, al menos, una
sustancia con actividad biológica.
Como sustancia con actividad biológica puede
utilizarse cualquier sustancia de origen natural, sintético o
recombinante, que pueda ejercer alguna actividad biológica en un
organismo receptor, tal como el cuerpo humano o animal. A modo
ilustrativo, dicha sustancia con actividad biológica puede ser un
antibiótico, una hormona, una proteína, etc. En una realización
particular, dicha sustancia con actividad biológica es una proteína
perteneciente a la familia de las proteínas morfogenéticas óseas
(BMP), tal como una BMP humana, natural o recombinante, o un dímero
o heterodímero de la misma, por ejemplo, una BMP humana recombinante
(rhBMP). En una realización particular, dicha rhBMP se selecciona
de rhBMP-2, rhBMP-4,
rhBMP-7, sus dímeros o heterodímeros, y mezclas de
los mismos.
La película de quitosan con capacidad de
adherencia celular aumentada, activada biológicamente, puede
obtenerse mediante un procedimiento que comprende poner en contacto
una película de quitosan con capacidad de adherencia celular
aumentada, que se puede obtener según el método de la invención, con
dicha sustancia con actividad biológica.
Alternativamente, la película de quitosan con
capacidad de adherencia celular aumentada, activada biológicamente,
puede obtenerse mediante un procedimiento que comprende poner en
contacto dicha sustancia con actividad biológica bien con una
disolución de quitosan, opcionalmente junto con un polímero
biodegradable, en un medio de solubilización que comprende una
disolución acuosa de un ácido, en la etapa a) del método de la
invención, o bien, alternativamente, con la película a base de
quitosan en contacto con el agente de estabilización, en la etapa
d) del método de la invención.
El tratamiento de activación biológica de la
película a base de quitosan, estabilizada, lavada y secada, tiene
por finalidad activar biológicamente dicha película para inducir la
actividad biológica deseada en el organismo receptor. Dicha
inducción se consigue mediante la fijación a la película a base de
quitosan de dicha sustancia con actividad biológica. La fijación o
inmovilización de dicha sustancia con actividad biológica a la
película a base de quitosan puede conseguirse bien mediante
adsorción directa de dicha sustancia sobre la película, o bien
mediante inmovilización covalente de la misma sobre la película, por
ejemplo, mediante interacciones entre grupos reactivos presentes en
proteínas con el glutaraldehído.
En el ejemplo 2, se describe la inducción de
actividad fosfatasa alcalina sobre la línea celular C2C12, producida
por rhBMP-2 adsorbida o inmovilizada covalentemente
sobre películas de quitosan, comparándose favorablemente con la
obtenida en dicha línea celular sembrada sobre plástico comercial y
tratada con las mismas dosis de rhBMP-2 en
disolución, dosis presentes en el medio de cultivo durante todo el
tiempo del ensayo. Como puede observarse en dicho ejemplo 2 (véase
la tabla V), parece existir un efecto sinérgico entre el quitosan y
la rh-BMP2 en cuanto a su actividad biológica.
La invención también proporciona un artículo o un
producto recubierto con una película a base de quitosan, que
comprende un soporte y un recubrimiento total o parcial de dicho
soporte con una película de quitosan con capacidad de adherencia
celular aumentada, opcionalmente activada biológicamente. En una
realización particular, dicho artículo o producto recubierto es una
prótesis o un implante médico-quirúrgicos, por
ejemplo, un implante de uso odontológico o traumatológico y dicha
película a base de quitosan es una película de quitosan
biológicamente activada que comprende, al menos, una BMP. En otra
realización particular, dicho soporte se selecciona de mallas y
matrices de polímeros biocompatibles y/o biodegradables utilizados
en ingeniería de tejidos.
En otro aspecto, la invención se refiere al
empleo de una película a base de quitosan con capacidad de
adherencia celular aumentada, biológicamente activada, proporcionada
por esta invención, en la inducción de una actividad biológica en
un organismo receptor, en la potenciación de la osteointegración de
implantes de uso odontológico o traumatológico en la totalidad o
parte de la zona del organismo receptor que se desea potenciar y/o
en la regeneración de tejido óseo.
Más específicamente, la invención también se
refiere al empleo de una película a base de quitosan, con capacidad
de adherencia celular aumentada, biológicamente activada,
proporcionada por esta invención, en la elaboración de un implante
de uso odontológico o traumatológico.
La invención también proporciona medios para
inducir una actividad biológica en un organismo receptor, en el que
debe implantarse en dicho organismo receptor en necesidad de dicha
actividad biológica un soporte con una película a base de quitosan
con capacidad de adherencia celular aumentada, biológicamente
activada, proporcionada por esta invención.
La invención también proporciona medios para
potenciar la osteointegración de implantes de uso odontológico o
traumatológico en un organismo receptor en el que debe implantarse
en dicho organismo receptor en necesidad de potenciar la
osteointegración de dicho implante, un implante recubierto con una
película a base de quitosan con capacidad de adherencia celular
aumentada, biológicamente activada, proporcionada por esta
invención, en el que dicha sustancia con actividad biológica es una
BMP.
La invención también proporciona medios para la
regeneración de tejido óseo en un organismo receptor en el que debe
implantarse en un organismo receptor con necesidad de regeneración
de tejido óseo, una matriz de generación ósea recubierta con una
película a base de quitosan con capacidad de adherencia celular
aumentada, biológicamente activada, proporcionada por esta
invención, en el que dicha sustancia con actividad biológica es una
BMP.
Como resultado de esta invención, tal como se ha
expuesto detalladamente en lo que antecede, es posible obtener por
primera vez en el sector técnico que nos ocupa, películas a base de
quitosan capaces de permitir una buena adhesión y proliferación
celular y, además, susceptibles de activarse por incorporación de
sustancias con actividad biológica. Dichas películas a base de
quitosan constituyen un material biocompatible y biodegradable, que
se adapta perfectamente a la forma del objeto o implante que se va a
recubrir y sobre el cual es posible la adherencia de las células
provenientes del organismo huésped.
En el caso de matrices tridimensionales porosas,
frecuentemente utilizadas en la ingeniería de tejidos, permite
formar un material compuesto que aprovecha las propiedades
mecánicas del soporte y que permite mantener una adecuada porosidad
para la penetración y crecimiento del tejido circundante, pues al
estar el quitosan en forma de película no obtura los poros formados
en el seno de la matriz. Al mismo tiempo su capacidad de adherencia
celular junto con la activación biológica producida en todo el
material, tanto en la superficie externa como interna, permite que
el efecto biológico deseado se produzca simultáneamente en todo el
seno de la matriz y no mediante una penetración hacia el interior.
El agente activador usado se encuentra disponible, pues, desde un
primer momento para producir su efecto en todo el seno del
soporte.
Estas peculiares características de las nuevas
películas a base de quitosan proporcionadas por esta invención las
hacen particularmente adecuadas para mejorar la osteointegración de
implantes y prótesis usadas comúnmente en la práctica
médico-quirúrgica, mediante el recubrimiento de
dichos materiales por una película a base de quitosan y su
activación mediante la incorporación de factores inductores de
crecimiento óseo, tales como las BMP, de origen natural o
recombinante, en forma dimérica o heterodimérica.
De manera similar, las películas a base de
quitosan de la presente invención tienen también especial utilidad
en la reparación de lesiones óseas y
óseo-cartilaginosas basada en el recubrimiento de
mallas o piezas de polímeros biocompatibles y/o biodegradables
usados comúnmente en ingeniería de tejidos, mediante el
recubrimiento total o parcial de los mismos con una película a base
de quitosan proporcionada por esta invención, activada mediante la
incorporación de BMP y/u otras sustancias con actividad
biológica.
Los siguientes ejemplos sirven para ilustrar la
invención y no deben considerarse limitativos del alcance de la
misma.
Ejemplo
comparativo
Se prepara una disolución de quitosan al 1% en
ácido acético 50 mM. La disolución se esteriliza mediante filtración
por 0,22 \mum después de sufrir una prefiltración a través de
0,45 \mum.
Se depositan 200 \mul de esta disolución en los
pocillos de una placa de 48 pocillos, dejando libres algunos de
ellos que servirán como control de plástico comercial.
Se seca la placa bajo corriente de aire en una
cámara de flujo laminar durante la noche a una temperatura de 30ºC.
Una vez seca, se tratan los pocillos por triplicado con 400 \mul
de alguno de los siguientes agentes de estabilización durante un
periodo de tiempo de 30 a 45 minutos: (i) NaOH 0,5 M; fosfato 0,25
M; (ii) glutaraldehído al 0,025%; y (iii) una disolución de NaOH
0,5 M y glutaraldehído al 0,025%.
Pasado el tiempo de tratamiento se retira el
medio y se lava 4 veces con 400 \mul de PBS, dejando éste en
contacto durante 10 minutos con la película entre lavado y
lavado.
Finalmente, se retira por último el PBS y se
añaden 200 \mul del medio de cultivo celular (DMEM alto en
glucosa, con penicilina/estreptomicina), y se siembran sobre los
pocillos células C2C12 o células ROS, a una densidad de 10.000
cel/cm^{2}. Se completa finalmente el medio con otros 200 \mul
de medio de cultivo y se incuban a 37ºC en estufa de CO_{2}. Al
día siguiente se retira el medio y se realizan los ensayos
pertinentes sobre los diferentes pocillos.
Los resultados obtenidos, una vez restados los
valores del blanco correspondiente a cada condición, se facilitan en
las tablas I y II para las líneas celulares C2C12 y ROS,
respectivamente. En todos los casos, salvo que se indique lo
contrario, los valores entre paréntesis indican la relación
porcentual entre el valor obtenido en cada caso y el valor
correspondiente obtenido en una placa de pocillos convencional
(plástico) usada como referencia.
Los protocolos seguidos para la realización de
los diferentes ensayos son los siguientes.
Calceína AM: Se retira el medio y se lavan
los pocillos con 200 \mul de PBS. Se retira el PBS y se añade 100
\mul de disolución de calceína AM por pocillo (obtenida mediante
la mezcla de 10 \mul de disolución madre de calceína AM (4 mM) con
10 ml de PBS). Se incuba 1 hora a temperatura ambiente en la
oscuridad y se lee la intensidad de fluorescencia emitida a 530 nm
tras excitar a 490 nm.
Homodímero de etidio: Se retira la
calceína AM y se matan las células mediante adición de metanol al
70%. Tras la muerte celular se retira el metanol y se añaden 100
\mul por pocillo de disolución de homodímero de etidio (obtenida
mediante la adición de 20 \mul de disolución madre de homodímero
de etidio (2 mM) sobre 10 ml de PBS). Tras una incubación de 30
minutos se lee la intensidad de fluorescencia emitida a 645 nm tras
excitar a 530 nm.
MTT: se añaden al medio de cultivo 40
\mul (1/10 del volumen existente en el pocillo) de una disolución
formada mediante la reconstitución de 15 mg de MTT en 3 ml de PBS.
Se incuba 2 horas a 37ºC en estufa de CO_{2}. Se añade a cada
pocillo tras esas 2 horas un volumen igual de disolución de
solubilización (esencialmente Tritón X-100 en
isopropanol), y tras la disolución mediante pipeteo repetido de los
cristales de formazán formados, se lee la densidad óptica (D. O.) a
570 nm y a 690 nm, según el protocolo proporcionado por la casa
suministradora del kit de este ensayo (Sigma Chemical Company).
Por otra parte, la observación por microscopía
óptica inversa (lente: lOx y binocular: lOx, total 100x) de los
cultivos celulares de C2C12 y ROS puso de manifiesto que tan sólo
aproximadamente un tercio de las células sembradas se adhieren a la
película formada según el método descrito (figura 1) y que la
adherencia no es homogénea sino que se produce en determinadas
zonas de la película, existiendo gran parte de su superficie sin
células adheridas, observándose, además, que la proliferación
celular en dichas células adherentes no tiende a producir su
expansión sobre toda la superficie de la película, sino que se
localiza en torno al punto inicial de adherencia (figura 2),
alterándose la citoarquitectura celular y cambiando la morfología
típica de fibroblastos de estas líneas celulares (figura 3). Este
hecho imposibilita el uso práctico de dichas películas a base de
quitosan para una regeneración tisular guiada. Por tanto, la
película de quitosan obtenida y estabilizada según el protocolo
descrito en este ejemplo no puede mostrar una adherencia celular
uniforme y homogénea sobre toda su superficie.
Se sigue estrictamente el procedimiento descrito
en el ejemplo comparativo.
Tras el lavado con PBS se retira el medio y se
procede a un segundo secado de la película a 30-35ºC
bajo corriente de aire.
Una vez seco se añaden 200 \mul de medio de
cultivo (DMEM alto en glucosa), se siembran las células a la misma
densidad que en el ejemplo comparativo y se completa con 200 \mul
adicionales de medio. Finalmente se incuban en estufa de CO_{2} a
37ºC. Al día siguiente se realizan sobre las placas, siguiendo los
protocolos ya descritos, los mismos análisis efectuados en el
ejemplo comparativo. Los resultados obtenidos para las líneas
celulares C2C12 y ROS se ofrecen respectivamente en las tablas III
y IV.
\vskip1.000000\baselineskip
Al comparar los valores mostrados en las tablas
III y IV con los valores mostrados en las tablas I y II se observa
que el crecimiento de las líneas celulares ensayadas sobre las
películas de quitosan sometidas al tratamiento activador de la
capacidad de adherencia celular (ejemplo 1) es muy superior al
obtenido sobre las películas de quitosan no sometidas a dicho
tratamiento activador de la capacidad de adherencia celular
(ejemplo comparativo).
De manera similar, la observación por microscopía
óptica inversa (100x) de los cultivos celulares de C2C12 y ROS
sobre películas de quitosan sometidas a distintos tratamientos de
estabilización y al tratamiento activador de la capacidad de
adherencia celular puso de manifiesto que las células sembradas se
adherían adecuadamente a la película formada según el método
descrito y que la adherencia es homogénea, observándose, además,
que la proliferación celular en dichas células adherentes tiende a
producir su expansión sobre toda la superficie de la película, no
alterándose la citoarquitectura celular (figuras
4-6). Este hecho posibilita el uso práctico de
dichas películas a base de quitosan para una regeneración tisular
guiada. Por tanto, la película de quitosan obtenida, estabilizada y
activado en cuanto a su capacidad de adherencia celular, según el
protocolo descrito en este ejemplo, puede mostrar una adherencia
celular uniforme y homogénea sobre toda su superficie.
A películas preparados según el protocolo
descrito en el ejemplo 1 se les deposita, tras el segundo secado,
en una disolución formada por 40 \mul de rhBMP-2
(de una concentración de 1 mg/ml en ácido acético 50 mM), y se
diluye con 160 \mul de PBS. Se mantienen a 4ºC durante la noche,
procediéndose al día siguiente a la retirada del medio con la
proteína. Se efectúa, a continuación, la siembra celular con C2C12
según los protocolos descritos en el ejemplo comparativo o en el
ejemplo 1, con una densidad celular inicial de 20.000
células/cm^{2}.
En los pocillos controles de plástico se añade,
tras la siembra, 40 \mul de rhBMP-2 de una
concentración de 1 mg/ml, mientras que en las células sembradas
sobre las películas de quitosan no se realiza adición alguna de
rhBMP-2.
Al tercer día se retira el medio de cultivo y se
cambia por igual volumen de medio fresco, realizándose una nueva
adición de rhBMP-2 sobre las células control. En las
células sembradas sobre las películas de quitosan activado no se
realiza adición alguna de rhBMP-2 en todo el tiempo
del ensayo, de manera que la activación producida ha de realizarse
por la rhBMP-2 adsorbida sobre la película antes de
la siembra celular.
En la tabla V se recogen los resultados obtenidos
para la actividad fosfatasa alcalina inducida por la
rhBMP-2.
El protocolo seguido para la realización de este
ensayo es el siguiente. Se retira el medio de cultivo y se lava una
vez con 200 \mul de PBS. Se retira el PBS y se añaden 100 \mul
por pocillo de la solución de lisis (Tritón X-100 al
0,1%, Tris-ClH 50 mM pH 6,8 y Cl_{2}Mg 10 mM). Se
congela/descongela a -80ºC tres veces. Finalmente se retiran 15
\mul de esta solución de lisis de cada pocillo a los que se le
añaden 150 \mul de una disolución 1:1 de tampón de fosfatasa
alcalina y sustrato (Sigma Chemical Company), previamente
precalentados a 37ºC y preparada la mezcla en el momento. Se incuba
10 minutos a 37ºC y se para la reacción a los 10 minutos tras la
adición de 150 \mul de NaOH 0,5 M por pocillo. Finalmente se lee
la D. O. a 405 nm.
Se sumerge un tornillo de titanio (figura 7) en
una disolución de quitosan al 1% en acético 50 mM, se retira y se
seca bajo corriente de aire, manteniendo el tornillo en rotación
constante, de forma que la película se extienda uniformemente sobre
toda la superficie (figura 8).
Una vez formada la película, se trata, según
alguno de los procedimientos señalados en el ejemplo 1, y se activa
según se describe en el ejemplo 2. A continuación, se implanta en el
tercio proximal de la cara interna de la meseta tibial de conejos
de raza New-Zealand, de 2,5 kg de peso,
suministrados por el animalario de la Universidad Complutense de
Madrid (U. C. M). Al cabo de 3 semanas se procede a sacrificar los
animales observándose una fijación más estable que en los controles
(tornillos de titanio sin recubrir), precisándose para la
desinserción de fuerzas entre 20-60 Newtons.
Se realizó este ensayo para determinar el
contenido en proteínas totales del cultivo celular, mediante el
método de Bradford, respecto al tiempo de cultivo (días).
En este ensayo, el valor de la absorbancia es
indicativo del contenido en proteínas del cultivo celular y, por
tanto, de la cantidad de células adheridas a la película. Se
comparan los valores obtenidos utilizando una placa de pocillos
convencional (plástico) usada como referencia frente a los valores
obtenidos utilizando películas de quitosan estabilizadas con
distintos tratamientos de estabilización no sometidas al
tratamiento activador de la capacidad de adherencia celular
proporcionado por esta invención (ejemplo 4.1) y frente a los
valores obtenidos utilizando películas de quitosan estabilizadas con
distintos tratamientos de estabilización sometidas al tratamiento
activador de la capacidad de adherencia celular proporcionado por
esta invención (ejemplo 4.2).
Para la realización de este ensayo se prepararon
7 placas de 48 pocillos (Costar) de la manera que se describe a
continuación. Cada placa poseía unos pocillos, conteniendo
distintas películas de quitosan (1 cm^{2}), por triplicado,
obtenidas mediante el procedimiento descrito en el ejemplo
comparativo, estabilizadas mediante distintos tratamientos
[tratamiento 1: tampón fosfato; tratamiento 2: NaOH; tratamiento 3:
glutaraldehído y NaOH; y tratamiento 4: glutaraldehído] no sometidas
al tratamiento activador de la capacidad de adherencia celular de
la invención. Como controles y blancos se utilizan pocillos con
película pero sin células, pocillos sin película, pocillos sin
células y pocillos con células.
A continuación, a cada pocillo, se añaden 200
\mul de medio de cultivo celular (DMEM alto en glucosa con
penicilina/estreptomicina), y se siembran sobre los pocillos células
C2C12 o células ROS, a una densidad de 10.000 cel/cm^{2}. Se
completa cada pocillo con otros 200 \mul de medio de cultivo y se
incuban a 37ºC en estufa de CO_{2} durante el periodo de tiempo
establecido (1-7 días).
Para la realización del ensayo de determinación
de proteínas totales del cultivo celular mediante el método de
Bradford, se procede de la siguiente manera. El día del ensayo, en
primer lugar, se retira el medio de cultivo y, a continuación, se
lavan los pocillos con 400 \mul de PBS (2 veces) para eliminar los
restos de proteínas que pudieran estar presentes en el medio y que
podrían interferir en el ensayo, se añaden 200 \mul de reactivo
Bradford (BioRad) por pocillo y 800 \mul de agua destilada o
milliQ, se incuba durante 30 minutos en la oscuridad a temperatura
ambiente y se lee la absorbancia a 595 nm.
Los resultados obtenidos, una vez restados los
valores del blanco correspondiente a cada condición, se muestran en
la figura 9, donde puede apreciarse la aleatoriedad de los valores
obtenidos, observándose, como cabía esperar, que las células se han
adherido al plástico de forma más eficiente que a las distintas
películas de quitosan, en donde la adherencia celular es nula o
prácticamente nula a partir del cuarto día (coincidiendo con el
cambio del medio de cultivo y la consiguiente retirada de las
células no adheridas) como se pone de manifiesto por la drástica
reducción de los valores de absorbancia medidos a partir del cuarto
día.
Se repitió exactamente el procedimiento descrito
en el ejemplo 4.1 pero reemplazando las películas de quitosan usadas
en dicho ejemplo con películas de quitosan estabilizadas por
distintos tratamientos [tratamiento 1: tampón fosfato; tratamiento
2: NaOH; tratamiento 3: glutaraldehído y NaOH; y tratamiento 4:
glutaraldehído] y sometidas al tratamiento activador de la
capacidad de adherencia celular de la invención descrito en el
ejemplo 1.
Los resultados obtenidos, una vez restados los
valores del blanco correspondiente a cada condición, se muestran en
la figura 10, donde puede apreciarse que las células se han adherido
a las películas de quitosan utilizadas en este caso a unos niveles
similares o incluso superiores a los del plástico incluso después
del cuarto día.
Al comparar los valores mostrados en las Figuras
9 y 10 se observa que la capacidad de adherencia y crecimiento de
las líneas celulares ensayadas sobre las películas de quitosan
sometidas al tratamiento activador de la capacidad de adherencia
celular es muy superior a la obtenida sobre las películas de
quitosan no sometidas a dicho tratamiento activador de la capacidad
de adherencia celular.
A películas preparadas según el protocolo
descrito en el ejemplo 1, depositadas en secciones de 1 cm^{2}
sobre los pocillos de una placa de 48 pocillos, se les añade el
volumen adecuado de una disolución de rhBMP-2 (de
una concentración de 1 mg/ml en ácido acético 50 mM) para obtener la
cantidad de proteína deseada en el pocillo (5- 400 \mug de
rhBMP-2), completando hasta 200 \mul con PBS
cuando el volumen de disolución de proteína añadido al pocillo era
inferior a 200 \mul. Seguidamente, se tapa la placa y se guarda
en cámara fría a 4ºC durante toda la noche. Al día siguiente, se
retira la disolución de proteína de los pocillos (sobrenadante) y se
determina en los sobrenadantes el contenido en proteínas totales
mediante el método de Bradford (ejemplo 4). Por diferencia con los
valores obtenidos con la disolución madre de proteína, se obtiene la
cantidad de proteína adsorbida sobre la película de quitosan.
Los resultados de la adsorción de
rhBMP-2 por películas de quitosan estabilizadas con
NaOH o con glutaraldehído, y sometidas al tratamiento activador de
la capacidad de adherencia celular proporcionado por esta invención
se muestran en las figuras 11 y 12, respectivamente, en las que la
barra de error corresponde al promedio de varios experimentos.
Se realizó este ensayo para evaluar la capacidad
de activación de películas de quitosan mediante
rhBMP-2 a lo largo del tiempo. Para ello, a
películas preparadas según el protocolo descrito en el ejemplo 1,
depositadas en los pocillos de una placa de 48 pocillos, se les
añaden 10 \mug de rhBMP-2 (a partir de una
disolución de rhBMP-2 en ácido acético 50 mM de una
concentración de 1 mg/ml). Los pocillos no recubiertos con película
se utilizaron como controles.
Las placas se mantienen a 4ºC durante toda la
noche, procediéndose al día siguiente a la retirada del medio con
la proteína. A continuación, se añade medio de cultivo y se procede
a efectuar la siembra celular con C2C12 según los protocolos
descritos en el ejemplo comparativo o en el ejemplo 1, con una
densidad celular inicial de 10.000 células/cm^{2}.
En los pocillos controles de plástico se añade,
tras la siembra, 10 \mug de rhBMP-2, mientras que
en las células sembradas sobre las películas de quitosan no se
realiza adición alguna posterior de rhBMP-2.
Al cuarto día se retira el medio de cultivo y se
cambia por igual volumen de medio fresco, realizándose una nueva
adición de rhBMP-2 sobre las células control. En las
células sembradas sobre las películas de quitosan activado no se
realiza adición alguna de rhBMP-2 en todo el tiempo
del ensayo, de manera que la activación producida ha de realizarse
por la rhBMP-2 adsorbida sobre la película antes de
la siembra celular.
En la figura 13 se muestran los resultados
obtenidos para la actividad fosfatasa alcalina (véase el protocolo
del ensayo descrito en el ejemplo 2) inducida por la
rhBMP-2 total en pocillo a diversos días. Los
resultados obtenidos ponen de manifiesto que la
rhBMP-2, unida a películas de quitosan estabilizadas
mediante diversos tratamientos [tratamiento 1: tampón fosfato;
tratamiento 2: NaOH; tratamiento 3: glutaraldehído y NaOH; y
tratamiento 4: glutaraldehído] y sometidas al tratamiento activador
de la capacidad de adherencia celular proporcionado por esta
invención, permanece activa a lo largo del tiempo considerado.
Siguiendo el procedimiento descrito en el ejemplo
3 se prepararon unos tornillos de titanio recubiertos con películas
de quitosan estabilizadas por diversos tratamientos [tratamiento 2:
NaOH; tratamiento 3: glutaraldehído y NaOH; y tratamiento 4:
glutaraldehído]. Una vez formadas las películas sobre los
tornillos, la capacidad de adherencia celular de las películas se
activó mediante el tratamiento descrito en el ejemplo 1 y se
activaron biológicamente por adsorción de rhBMP-2
según el procedimiento descrito en el ejemplo 2. Como controles se
utilizaron tornillos de titanio sin recubrir.
A continuación, en el tercio proximal de la cara
interna de una de las mesetas tibiales de conejos de raza
New-Zealand, de 2,5 kg de peso, suministrados por el
animalario de la Universidad Complutense de Madrid (U. C. M) se
implanta un tornillo recubierto con película de quitosan y en la
otra meseta tibial del mismo animal se implanta un tornillo control.
La implantación se realiza por métodos convencionales. Los animales
se mantienen sin restricción de movimientos y, al cabo del tiempo
señalado (5-7 semanas), se procede a sacrificar los
animales y a evaluar la osteointegración del implante mediante la
determinación del momento de torsión necesario para su
desinserción.
Los resultados obtenidos se muestran en la figura
14 y ponen de manifiesto una fijación más estable en el caso de los
tornillos recubiertos con las películas de quitosan que en los
controles (tornillos de titanio sin recubrir). Se incluyen, además,
a modo comparativo, los valores del momento de torsión obtenidos con
los tornillos comerciales Osseotite®; y TiUniteX (Nobel Pharma)
[datos extraídos de Gottlob et al., Applied Osteointegration
Research, 2000, 1: 25-27].
Claims (26)
1. Método para producir una película a base de
quitosan con capacidad de adherencia celular aumentada, que
comprende:
- a)
- disolver el quitosan, opcionalmente junto con un polímero biodegradable, en un medio de solubilización que comprende una disolución acuosa de un ácido;
- b)
- depositar la disolución resultante de la etapa a) sobre una superficie;
- c)
- secar dicha disolución depositada sobre dicha superficie, para obtener una película a base de quitosan;
- d)
- poner en contacto dicha película a base de quitosan con un agente de estabilización seleccionado de (i) una disolución acuosa de una base, (ii) un tampón de pH igual o superior a 5, (iii) un agente de entrecruzamiento, y (iv) mezclas de los mismos;
- e)
- lavar la película a base de quitosan, estabilizada, obtenida en la etapa d); y
- f)
- secar dicha película a base de quitosan estabilizada a una temperatura comprendida entre 15ºC y 80ºC, en presencia de una corriente de aire.
2. Método según la reivindicación 1, en el que
dicho quitosan tiene un peso molecular promedio comprendido entre
150.000 y 2.000.000, preferiblemente entre 200.000 y 500.000.
3. Método según la reivindicación 1 ó 2, en el
que dicho quitosan tiene un grado de desacetilación comprendido
entre el 65% y el 95%.
4. Método según la reivindicación 1, en el que
dicho quitosan comprende quitosan derivatizado con uno o más grupos
funcionales seleccionados entre los grupos fosfónico, carboximetilo,
metilpirrolidona y mezclas de los mismos.
5. Método según la reivindicación 1, en el que
dicho medio de solubilización comprende una disolución acuosa de un
ácido orgánico o inorgánico, de un pH igual o inferior a 3,5.
6. Método según la reivindicación 5, en el que
dicho ácido se selecciona de ácido clorhídrico, ácido acético, ácido
cítrico, ácido láctico y ácido málico.
7. Método según la reivindicación 1, en el que el
quitosan se disuelve junto con un polímero biodegradable.
8. Método según la reivindicación 7, en el que
dicho polímero biodegradable se selecciona de ácido poliglicólico,
alginato, carragenato, colágeno y mezclas de los mismos.
9. Método según la reivindicación 1, en el que
dicho agente de estabilización comprende una disolución acuosa de
hidróxido sódico, tampón fosfato, tampón carbonato o
glutaraldehído.
10. Método según la reivindicación 9, en el que
dicho agente de estabilización comprende una disolución acuosa de
hidróxido sódico y glutaraldehído.
11. Método según la reivindicación 9, en el que
dicho agente de estabilización comprende (i) un tampón seleccionado
de tampón fosfato y tampón carbonato, y (ii) glutaraldehído.
12. Método según la reivindicación 9, en el que
el secado de la película de quitosan estabilizada en la etapa f) se
realiza a una temperatura comprendida entre 20ºC y 40ºC, en
presencia de una corriente de aire.
13. Película a base de quitosan con capacidad de
adherencia celular aumentada, que se puede obtener según el método
de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, teniendo dicha
película a base de quitosan con capacidad de adherencia celular
aumentada una capacidad de adherencia celular que es igual o
superior a un incremento de al menos un 25% en el valor de la
capacidad de adherencia celular sobre una película de quitosan no
sometida a un tratamiento activador de la capacidad de adherencia
celular, determinándose dicha capacidad de adherencia celular
mediante el ensayo del homodímero de etidio.
14. Película a base de quitosan biológicamente
activada con capacidad de adherencia celular aumentada, que
comprende una película a base de quitosan con capacidad de
adherencia celular aumentada según la reivindicación 13 y, al menos,
una sustancia con actividad biológica.
15. Película a base de quitosan biológicamente
activada según la reivindicación 14, en la que dicha sustancia con
actividad biológica se selecciona del grupo que consiste en
antibióticos, hormonas y proteínas con actividad biológica en el
cuerpo humano o animal.
16. Película a base de quitosan biológicamente
activada según la reivindicación 15, en la que dicha sustancia con
actividad biológica es una proteína morfogenética ósea (BMP).
17. Película de quitosan biológicamente activada
según la reivindicación 16, en la que dicha BMP es una BMP humana,
natural o recombinante, o un dímero o heterodímero de la misma.
18. Película de quitosan biológicamente activada
según la reivindicación 18, en la que dicha BMP se selecciona de
rhBMP-2, rhBMP-4,
rhBMP-7, sus dímeros o heterodímeros, y mezclas de
los mismos.
19. Método para producir una película de quitosan
biológicamente activada con capacidad de adherencia celular
aumentada según una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 18, que
comprende poner en contacto una película de quitosan según la
reivindicación 13, o que se puede obtener según el método de una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en contacto con una
sustancia con actividad biológica.
20. Método para producir una película de quitosan
biológicamente activada con capacidad de adherencia celular
aumentada según una cualquiera de las reivindicaciones 14 a 18, que
comprende poner en contacto una sustancia de actividad biológica con
(i) dicha disolución de quitosan, opcionalmente junto con un
polímero biodegradable, en un medio de solubilización que comprende
una disolución acuosa de un ácido, en la etapa a) del método según
la reivindicación 1, o, alternativamente, con (ii) la película a
base de quitosan en contacto con el agente de estabilización, en la
etapa d) del método según la reivindicación 1.
21. Producto recubierto con una película a base
de quitosan, que comprende un soporte y un recubrimiento total o
parcial de dicho soporte con una película de quitosan según una
cualquiera de las reivindicaciones 13 a 18.
22. Producto según la reivindicación 21, en el
que dicho soporte se selecciona del grupo que consiste en prótesis
e implantes médico-quirúrgicos.
23. Producto según la reivindicación 21, en el
que dicho soporte es un implante de uso odontológico o
traumatológico y dicha película a base de quitosan es una película
de quitosan biológicamente activada que comprende, al menos, una
BMP.
24. Producto según la reivindicación 21, en el
que dicho soporte se selecciona del grupo que consiste en mallas y
matrices de polímeros biocompatibles y/o biodegradables utilizados
en ingeniería de tejidos.
25. Uso de una película de quitosan
biológicamente activada según una cualquiera de las
reivindicaciones 14 a 18, en la elaboración de un producto
recubierto con dicha película para la inducción de una actividad
biológica en un organismo receptor, en la potenciación de la
osteointegración de implantes de uso odontológico o traumatológico
en la totalidad o parte de la zona del organismo receptor que se
desea potenciar y/o en la regeneración de tejido óseo.
26. Uso de una película de quitosan
biológicamente activada según una cualquiera de las
reivindicaciones 14 a 18, en la elaboración de un implante de uso
odontológico o traumatológico.
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