ES2246831T3 - Fracciones de membranas bacterianas inmunoestimulantes en el tratamiento de canceres. - Google Patents

Fracciones de membranas bacterianas inmunoestimulantes en el tratamiento de canceres.

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ES2246831T3 ES00910947T ES00910947T ES2246831T3 ES 2246831 T3 ES2246831 T3 ES 2246831T3 ES 00910947 T ES00910947 T ES 00910947T ES 00910947 T ES00910947 T ES 00910947T ES 2246831 T3 ES2246831 T3 ES 2246831T3
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Abstract

Uso de una fracción de membrana de Klebsiella pneumoniae que comprende proteoglicanos para la preparación de una composición farmacéutica inmunoestimulante y capaz de inducir una respuesta inmunitaria antitumoral destinada a la prevención y el tratamiento de cánceres, caracterizado porque dicha fracción de membrana se obtiene mediante un procedimiento que comprende una etapa de lisis de las bacterias K. pneumoniae tras su cultivo, y una etapa de separación de la fracción que contiene las membranas de dichas bacterias del lisado total obtenido después de la etapa de lisis.

Description

Fracciones de membranas bacterianas inmunoestimulantes en el tratamiento de cánceres.
La presente invención tiene por objeto el uso de una fracción de membrana de Klebsiella pneumoniae para la preparación de una composición farmacéutica inmunoestimulante y capaz de inducir una respuesta inmunitaria antitumoral, destinada al tratamiento y a la prevención de los cánceres. La invención comprende además composiciones farmacéuticas que las contiene, asociadas con compuestos anticancerígenos.
La transformación de una célula normal en célula maligna es el resultado de numerosos sucesos distintos, que pueden producirse espontáneamente, tales como las mutaciones o las recombinaciones de genes, o que pueden ser inducidos mediante agentes químicos, físicos o víricos.
Los tumores se injertan mediante células inmunocompetentes, especialmente linfocitos, células dendríticas y macrófagos.
Los macrófagos asociados a tumores (TAM) provienen de la circulación sanguínea y son reunidos sobre el sitio tumoral mediante citoquinas. Los TAM se unen a las células tumorales mediante glicoproteínas, azucares y fosfolípidos, y proliferan en el sitio tumoral (J. Natl. Cancer. Inst., 1998, 90: 1583). Allí, segregan numerosas citoquinas que contribuyen a su actividad antitumoral. Entre las más importantes, se encuentra el TNF-\alpha y la IL-12.
La actividad antitumoral del TNF-\alpha se ha demostrado en modelos experimentales en ratones (Beyaert R. y Fiers W., Cytokines, capítulo 24, 335-360 Academic. Press. 1998) y se ha ensayado en seres humanos para tratar los cánceres de la vejiga: solo, presenta una actividad moderada (Steinberg et al., Ann. Oncol., 1992, 3, 741-745; Eur. Urol. 1992, 22: 112).
La producción de IL-12 mediante macrófagos activados sirve para modular la respuesta inmunitaria favoreciendo la formación de linfocitos T CD4+ de tipo Th1, que producen la IL-2 e IFN-\gamma. Se conoce bien la actividad inhibidora de IL-12 sobre la angiogénesis y la regresión tumoral, y parece que está relacionada con la inducción de IFN-\gamma que estimula la producción de IP-10 (proteína 10 inducible mediante interferón) y de MIG (monoquina inducida por IFN-\gamma) (J. Natl. Cancer Inst., 1998, 90: 1583).
La terapia con BCG (Bacille Calmette Guérin) se utiliza para prevenir la recurrencia de algunos tipos de cáncer de vejiga. El mecanismo de acción propuesto actualmente descansa sobre la producción de citoquinas: liberación precoz de citoquinas inflamatorias (TNF-\alpha, IL-1, IL-6, IL-8) y, en segundo lugar, la producción de IL-2 y de IFN-\gamma (respuesta Th1), y después, más adelante, de IL-4, de IL-5 y de IL-10 (respuesta Th2). Finalmente, se produce una fase de activación celular con amplificación de poblaciones citotóxicas (Patard et al., Progrès en Urologie, 1998, 8, 415-421).
Sin embargo, la terapia con BCG no solo tiene ventajas, puesto que la eficacia, a veces observada, lo es a costa de una morbilidad, igualmente mayor. Además, existen contraindicaciones para la terapia con BCG: tuberculosis activa (pero no tuberculosis previa), inmunosupresión (VIH, transplante, etc.), reacción sistémica previa al BCG (hepatitis, neumonía, BCGitis), tratamientos con esteroides. Por otra parte, existen resistencias o recurrencias tras una
terapia con BCG.
La fracción de membrana de K. pneumoniae I145 entra en la composición de una preparación farmacéutica que previene la aparición y la recurrencia de infecciones respiratorias de origen bacteriano, y que se ha utilizado en el ser humano durante 20 años. Por ello, ha habido tiempo suficiente para evaluar la no-toxicidad del producto. El conjunto de los datos citados anteriormente muestran que existe hoy en día una necesidad de disponer de nuevos inmunoestimulantes desprovistos de actividad tóxica. Tales inmunoestimulantes serían de un gran interés para el tratamiento de algunos tipos de cánceres.
De manera sorprendente, se ha puesto en evidencia que fracciones de membranas de una bacteria gram negativa, especialmente Klebsiella pneumoniae (denominada FMKp), en particular fracciones de membrana obtenidas mediante los procedimientos tales como se describen a continuación en los ejemplos, poseen las propiedades inmunoestimulantes buscadas.
Se ha mostrado de manera inesperada que la FMKp era capaz, no sólo de estimular la proliferación de las células mononucleadas de la sangre humana, demostrando así su actividad inmunoestimulante, sino también de inducir, especialmente mediante los monocitos, la producción de TNF-\alpha y de IL-12, que son citoquinas implicadas en la respuesta inmunitaria antitumoral.
Así, la presente invención tiene por objeto el uso de una fracción de membrana de Klebsiella pneumoniae, para la preparación de una composición farmacéutica inmunoestimulante, y capaz de inducir una respuesta inmunitaria antitumoral, siendo esto independiente del modo de administración in vivo seleccionado (vía entérica o parenteral).
Por compuesto o composición farmacéutica inmunoestimulante se entiende en la presente invención un compuesto o una composición farmacéutica capaz de aumentar una respuesta inmunitaria no específica.
Por compuesto o composición farmacéutica capaz de inducir una respuesta inmunitaria antitumoral se entiende en la presente invención un compuesto o una composición farmacéutica capaz, en particular, de aumentar la eficacia de un compuesto anticancerígeno o de aumentar la eficacia de un tratamiento anticancerígeno, tal como por ejemplo un tratamiento mediante radioterapia.
Por fracción de membrana de Klebsiella pneumonaie se entiende en la presente invención cualquier fracción o extracto de membrana purificada o parcialmente purificada obtenida a partir de cultivos de dicha bacteria, y cuyo procedimiento de preparación comprende al menos una etapa de lisis de las bacterias obtenidas tras cultivo, y una etapa de separación de la fracción que contiene las membranas de dichas bacterias del lisado total obtenido tras la etapa de lisis, especialmente mediante centrifugación o filtración.
Según la invención, las fracciones de membrana se podrán preparar según los métodos conocidos por el experto en la técnica, tales como por ejemplo el método descrito por Haeuw J.F. et al. (Eur. J. Biochem, 255, 446-454, 1998).
Según un modo de realización particular, la invención se refiere a un uso según la invención, caracterizado porque la fracción de membrana se prepara mediante un procedimiento que comprende las etapas siguientes:
a)
cultivar dichas bacterias en un medio de cultivo que permita su crecimiento seguido de una centrifugación de dicho cultivo;
b)
en su caso, desactivar las enzimas líticas del residuo bacteriano obtenido en la etapa a), y después centrifugar la suspensión obtenida;
c)
extraer y eliminar las proteínas no-membranarias y los ácidos nucleicos del residuo obtenido en la etapa a) o b) mediante al menos un ciclo de lavado del residuo en una disolución de extracción;
d)
digerir el residuo de membranas obtenido en la etapa c) en presencia de enzimas proteolíticas seguido de una centrifugación;
e)
al menos un ciclo de lavado del residuo obtenido en la etapa d) en una disolución fisiológica y/o en agua destilada; y
f)
someter a ultrasonidos el residuo obtenido en la etapa e).
La etapa b) de desactivación de las enzimas líticas del residuo de bacterias obtenido en la etapa a) se puede realizar mediante cualquier método conocido de desactivación de enzimas, tal como en particular mediante calentamiento del residuo bacteriano resuspendido, a una temperatura preferentemente próxima a 100ºC, o mediante adición de inhibidor de actividad de estas enzimas.
La etapa c) de extracción y de eliminación de las proteínas no-membranarias y de los ácidos nucleicos del residuo obtenido en la etapa a) ó b) se puede realizar, por ejemplo, mediante al menos un ciclo de lavado del residuo en una disolución de extracción que corresponde a la adición de una disolución hipertónica (disolución de extracción), preferentemente una disolución salina con una molaridad próxima a 1M, seguido, tras un tiempo de contacto suficiente para el efecto deseado, de una centrifugación de la suspensión obtenida y de la eliminación del sobrenadante obtenido tras dicha centrifugación, pudiendo reproducirse varias veces el ciclo de lavado.
La etapa d) de digestión del residuo de membranas obtenido en la etapa c) se puede realizar en presencia de una disolución de enzimas proteolíticas, tales como por ejemplo la tripsina, la quimiotripsina o cualquier enzima con actividad proteolítica conocida, ajustándose las condiciones de la reacción, el pH de la disolución, la temperatura y la duración de la reacción, preferentemente a las condiciones óptimas para la actividad de o de las enzimas seleccionadas, seguido de una centrifugación, pudiendo reproducirse varias veces este ciclo de digestión con la misma enzima, la misma combinación de enzimas o con enzimas distintas para cada ciclo de digestión realizado.
La etapa e) de lavado del residuo obtenido en la etapa d) se realiza mediante recogida del residuo en una disolución fisiológica o en agua destilada, seguido, tras un tiempo de contacto suficiente, de una centrifugación, pudiendo reproducirse varias veces este ciclo de lavado.
Finalmente, la etapa f) de ultrasonidos del residuo tiene particularmente por objetivo desintegrar y homogeneizar la fracción de membrana obtenida al final de la etapa e). Las condiciones de ultrasonidos (duración y potencia) se determinarán por el experto en la técnica en función, por ejemplo, de la cantidad de fracción de membrana a tratar.
Según otro modo de realización particular, la invención se refiere a un uso según la invención, caracterizado porque la fracción de membrana se prepara mediante un procedimiento que comprende las etapas siguientes:
a)
cultivar dichas bacterias en un medio de cultivo que permita su crecimiento, seguido, en su caso, de una centrifugación;
b)
congelar el medio de cultivo o el residuo obtenido en la etapa a), seguido de una descongelación y del secado de las células;
c)
eliminar mediante una DNasa los ácidos nucleicos de las células secas obtenidas en la etapa b), que se han resuspendido;
d)
triturar las células obtenidas en la etapa c), y aclarar la suspensión obtenida;
e)
precipitar en medio ácido la suspensión obtenida en la etapa d), y eliminar el residuo;
f)
neutralizar el sobrenadante obtenido en la etapa e) que contiene la suspensión de membrana, seguido de una diálisis y de una concentración de la suspensión de membrana; y
g)
esterilizar la suspensión de membrana concentrada obtenida en la etapa f).
Se entiende que las condiciones de descongelación en la etapa b) del procedimiento aquí abajo se determinarán por el experto en la técnica en función de la cantidad de residuo inicial a tratar, realizada preferentemente a 4ºC durante al menos 48 horas por un equivalente de 1 kg de células secas.
En la etapa c), la eliminación de los ácidos nucleicos se realiza por ejemplo mediante adición de una DNasa, con una concentración final de 5 mg/ml de una suspensión de células con una concentración equivalente a 5% de células secas.
La trituración de las células obtenidas en la etapa c) se puede realizar mediante cualquier sistema o aparato conocido por el experto en la técnica para la trituración de células, tal como las prensas o preferentemente tal como la trituración en bucle de Manton Gaulinet durante 30 minutos.
La clarificación de la suspensión obtenida tras la trituración se podrá realizar mediante cualquier sistema o aparato conocido por el experto en la técnica para la clarificación de triturados celulares bacterianos tal como el sistema Sharpless.
La etapa e) de precipitación en medio ácido de la suspensión obtenida en la etapa d) se puede realizar por ejemplo con el ácido acético. La precipitación es seguida de la eliminación del residuo mediante por ejemplo un sistema de tipo Sharpless, y de la recuperación del sobrenadante.
La etapa f) consiste en una etapa en la que el sobrenadante, obtenido después de la precipitación en medio ácido, se neutraliza, se diluye, se dializa y después se concentra.
Finalmente, la última etapa consiste en una etapa de esterilización del concentrado de la fracción de membrana obtenido en la etapa anterior, como por ejemplo mediante calentamiento a 121ºC durante aproximadamente 35 minutos.
La invención tiene igualmente por objeto el uso según la invención, caracterizado porque la composición farmacéutica comprende además un agente que permite vehicular dicha fracción de membrana en forma que permita mejorar su estabilidad y/o su actividad inmunoestimulante y/o su capacidad para inducir una respuesta inmunitaria antitumoral, tal como en forma de una emulsión de tipo aceite en agua o agua en aceite, o en forma de una partícula de tipo liposoma, microesfera, nanoesfera o cualquier otro tipo de estructura que permita el encapsulamiento y la presentación en forma de partículas de dicha fracción de membrana.
También se incluye en la presente invención el uso según la invención, caracterizado porque la composición farmacéutica comprende además un agente que permite potenciar la actividad inmunoestimulante y/o la respuesta inmunitaria antitumoral de dichas fracciones de membranas.
Entre dichos agentes que permiten potenciar la actividad inmunoestimulante y/o la respuesta inmunitaria antitumoral de dichas fracciones de membranas, se prefieren las citoquinas y los compuestos celulares.
Entre las citoquinas, se pueden citar, pero sin limitarse a ellas: IL-2, IL-12, IL-18, IFN-\gamma y IFN-\alpha.
Entre los compuestos celulares, se prefieren especialmente los ácidos nucleicos, los compuestos de la familia de los ribosomas, o también las proteínas de la familia de las proteínas de choque térmico.
También se incluye en la presente invención el uso según la invención, caracterizado porque la composición farmacéutica comprende además un agente potenciador que permite regular la actividad inmunoestimulante y/o la respuesta inmunitaria antitumoral de dichas fracciones de membranas.
Entre dichos agentes potenciadores que permiten regular la actividad inmunoestimulante y/o la respuesta inmunitaria antitumoral de dichas fracciones de membrana, se prefieren las hormonas y los factores de crecimiento.
Entre las hormonas, se puede citar pero sin limitarse a ella la \beta-hCG.
Entre los factores de crecimiento, se pueden citar pero sin limitarse a ellos: el EGF, el IGF-1, el IGF-2, el GM-CSF y el G-CSF.
La invención tiene igualmente por objeto el uso según la invención para la preparación de una composición farmacéutica destinada a ser administrada en asociación con un tratamiento anticancerígeno, especialmente un tratamiento anticancerígeno mediante quimioterapia (mono o poliquimioterapia) y/o radioterapia.
Según la invención, la preparación de la composición farmacéutica está destinada a ser administrada por vía entérica o parenteral, simultánea, separadamente o extendida en el tiempo con el tratamiento anticancerígeno.
La invención comprende además el uso según la invención para la preparación de una composición farmacéutica que comprende un compuesto con actividad anticancerígena asociado con dicha fracción de membrana.
Así, numerosos compuestos con actividad anticancerígena se pueden asociar con dicha fracción de membrana inmunoestimulante y/o capaz de inducir una respuesta inmunitaria antitumoral.
Entre estos compuestos, se pueden citar especialmente pero sin limitarse a ellos, los inhibidores de proteasas o los compuestos con actividad anti-angiogénica, tales como por ejemplo:
-
los inhibidores de proteasas tales como los TIMP;
o los siguientes compuestos con actividad anti-angiogénica: la angiostatina, la endostatina, MCP-1, IP-10 y PF-4, así como anticuerpos, secuencias antisentido o péptidos anti-VEGF, anti-angiogenina, anti-aFGF, anti-bFGF.
Así, la invención se refiere al uso según la invención, caracterizado porque dicho tratamiento anticancerígeno asociado es un tratamiento quimioterapéutico que comprende un inhibidor de proteasas o un compuesto con actividad anti-angiogénica.
La invención tiene también por objeto el uso según la invención, para la preparación de una composición farmacéutica destinada para la prevención o el tratamiento de los cánceres, especialmente los cánceres de la vejiga, de la próstata, del colon, del hígado o de los melanomas malignos.
La invención se refiere además a composiciones farmacéuticas que comprenden una fracción de membrana susceptible de ser obtenida mediante los procedimientos según las reivindicaciones 1-3.
El título de proteoglicano de las fracciones de membrana susceptibles de ser obtenidas mediante dichos procedimientos, proteoglicano el cual es el principio activo de la FMKp, cuyo título el cual está representado mediante la suma de los contenidos de galactosa y de proteína, está comprendido preferentemente:
-
para la galactosa: entre 1,2 g/l y 3,4 g/l;
-
para las proteínas: entre 7,5 g/l y 14,9 g/l.
De manera preferida, este título será:
-
para la galactosa: entre 1,8 g/l y 2,6 g/l;
-
para las proteínas: entre 9,3 g/l y 11,7 g/l.
Están comprendidas igualmente en la presente invención las composiciones farmacéuticas que comprenden una fracción de membrana de bacteria gram negativa, especialmente de Klebsiella pneumoniae, caracterizadas porque se asocia con un tratamiento anticancerígeno mediante quimioterapia y/o mediante radioterapia.
Se entiende aquí mediante la expresión fracción de membrana cualquier fracción de membrana de bacteria gram negativa tal como se define anteriormente, incluyendo aquella susceptible de ser obtenida mediante los procedimientos según la reivindicación 1-3.
Preferentemente, la invención se refiere a una composición farmacéutica según la invención, caracterizada porque contiene un compuesto anticancerígeno como producto de combinación para un uso simultáneo, separado o extendido en el tiempo, especialmente un compuesto anticancerígeno seleccionado entre los inhibidores de proteasas o entre los compuestos que presentan una actividad anti-angio-
génica.
Preferentemente, dichas composiciones farmacéuticas según la invención podrán comprender además agentes tales como los vehículos, agentes capaces de potenciar y/o regular la actividad inmunoestimulante y/o la respuesta inmunitaria antitumoral de dichas fracciones de membrana tales como se definen anteriormente.
Las leyendas de las figuras y ejemplos siguientes se destinan a ilustrar la invención sin limitar su alcance.
Leyendas de las figuras:
Figura 1: Proliferación de PBMC en presencia de FMKp - Estudio dosis-respuesta
Las células mononucleadas (PBMC) se obtienen mediante separación con la ayuda de una disolución de metrizoato de sodio y Ficoll, usando sangre total. Entonces, las PBMC se siembran a razón de 10.000 células/pocillo en presencia de agentes estimulantes, en un volumen total de 200 \mul. Después de 72 h de incubación, la proliferación se objetiva mediante adición de timidina tritiada. Los resultados se expresan en índice de estimulación = [cpm PBMC + estímulo]/[cpm PBMC sin estímulo (= medio RPMI + 10% SVF)].
Figura 2: Proliferación de PBMC en presencia de FMKp - Reproducibilidad del efecto sobre varios donantes (FMKp a 250 \mug/ml).
Figura 3: Producción de TNF-\alpha mediante monocitos de la sangre.
Los monocitos se cultivan en medio RPMI 1640+ 10% de SVF, y en presencia de distintas concentraciones de producto. Las células se incuban en una incubadora a 37ºC en una atmósfera que contiene 5% de CO_{2}. Condiciones de cultivo: 200.000 células/pocillo, 18 h de incubación. Después de la incubación, las placas de cultivo se centrifugan, y los sobrenadantes se dividen en partes alícuotas y se conservan a -80ºC hasta que se estudian. Las concentraciones de citoquinas presentes en los sobrenadantes de cultivos se determinan mediante ELISA (ensayo con sustancias inmunoabsorbentes unidas a enzimas (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay): kit Predicta de Genzyme (umbral detección a 3 pg/ml).
Figura 4: Producción de IL-12 p70 (biológicamente activa) mediante monocitos de la sangre.
Los monocitos se cultivan en medio RPMI 1640 + 10% de SVF, y en presencia de distintas concentraciones de producto. Las células se incuban en una incubadora a 37ºC en una atmósfera que contiene 5% de CO_{2}. Condiciones de cultivo: 500.000 células/pocillo, 24 h de incubación. Después de la incubación, las placas de cultivo se centrifugan, y los sobrenadantes se dividen en partes alícuotas, y se conservan a -80ºC hasta que se estudian. Las concentraciones de citoquinas presentes en los sobrenadantes de cultivos se determinan mediante ELISA: par de anticuerpo Endogen (umbral de detección a 15 pg/ml).
Ejemplo 1 Obtención de la fracción de membrana de K. pneumoniae (FMKp)
Procedimiento nº 1
La extracción de las membranas de K. pneumoniae I145, a partir del residuo de centrifugación de la etapa, va precedido preferentemente de una etapa de destrucción de las enzimas líticas de los componentes celulares contenidos en el residuo, por ejemplo mediante calentamiento a 100ºC de éste, eventualmente después de redisolverlo.
La extracción en sí de las membranas a partir del residuo de centrifugación se realiza preferentemente tratando los componentes celulares del residuo, después de una eventual destrucción de las enzimas líticas, con una disolución salina, por ejemplo cloruro de sodio 1M, una o varias veces, y después centrifugando la suspensión obtenida, preferentemente a 20.000 g; el sobrenadante de esta centrifugación, que se elimina, contiene las impurezas no-membranarias, tales como proteínas y ácidos nucleicos, mientras que el residuo contiene las membranas.
Después de la separación de la disolución salina que contiene las impurezas, las membranas se digieran en presencia de enzimas proteolíticas, preferentemente tripsina y quimiotripsina, en disolución a pH 8 a 37ºC durante 4 horas.
Después de la digestión, la disolución se homogeneiza mediante ultrasonido. El producto así obtenido constituye la fracción de membrana denominada FMKp.
Nuevamente, el sobrenadante obtenido se centrifuga en las mismas condiciones, preferentemente a 140.000 g.
Preparación de los glicopéptidos de membranas
Esta fracción se prepara a partir del residuo obtenido mediante centrifugación a 40.000 g durante 20 minutos. Dicho residuo se resuspende en un suero fisiológico, después, esta suspensión se lleva durante 10 minutos a 100ºC en un baño María de agua hirviendo, para desactivar las enzimas líticas. Después del enfriamiento, la suspensión se centrifuga 30 min. a 20.000 g. El residuo obtenido se extrae dos veces con NaCl 1M para eliminar las proteínas y los ácidos nucleicos. Las membranas se recogen mediante centrifugación durante 30 minutos a 20.000 g.
Después, se someten a una digestión mediante tripsina a pH 8 y a 37ºC durante 4 horas, y después mediante quimiotripsina en las mismas condiciones.
Entonces, las membranas se recogen mediante centrifugación a 2.000 g durante 30 minutos, se lavan con un suero fisiológico, y después con agua destilada, y se someten a una desintegración mediante ultrasonidos de 15 minutos.
Procedimiento nº 2
Tras descongelar a +4ºC durante 48 h mínimo, se resuspende 1 kg de células secas de K. pneumoniae a 5% de células secas. La Dnasa se añade a 5 mg/l. Se proceda después a la trituración en bucle de Manton Gaulin durante 30 min., seguido de una clarificación sobre SHARPLES a 50 l/h, y después seguido de una precipitación con ácido acético a pH = 4,2 + 0,1 durante 30 min. El residuo se elimina (SHARPLES a 25 l/h), y el sobrenadante se neutraliza y se diluye hasta 2 veces el volumen inicial con agua sometida a ósmosis. Se efectúa entonces una diálisis con volumen constante sobre PUF 100 hasta 800 \Omegacm, seguido de una concentración de la suspensión de membrana (SM) así obtenida, hasta 11 l/kg de células secas. Se proceda entonces a someter a la SM a autoclave a + 121ºC durante 35 min., que se puede conservar a + 4ºC durante 6 semanas.
Características de la FMKp
Por definición, el título de proteoglicano, que es el principio activo de la FMKp, es igual a la suma de los contenidos de galactosa y de proteínas.
-
Galactosa: promedio de 2,2 g/l
-
Proteínas: promedio de 10,5 g/l.
Ejemplo 2 Proliferación de PBMC de la sangre humana
Los resultados obtenidos muestran que, de manera sorprendente, la FMKp dispara la proliferación de PBMC. Este efecto depende de la dosis y es máximo para 2,5 mg/ml de FMKp (figura 1). Por otra parte, este efecto es reproducible (figura 2).
Ejemplo 3 Producción de citoquinas mediante monocitos purificados de la sangre humana
Los monocitos humanos se obtienen a partir de las células mononucleadas (linfocitos, monocitos, células NK, etc.) previamente aisladas de la sangre humana total. La obtención de los monocitos se basa sobre la expresión, en gran cantidad, del antígeno de superficie CD14 sobre estas células. La separación es una selección positiva. Después, se evalúa mediante citometría de flujo la eficacia de la separación magnética de los monocitos, efectuando una marcación con un anticuerpo CD13 acoplado con iso-tiocianato de fluoresceína (FITC): la suspensión celular contiene entonces 94 a 97% de monocitos.
Los resultados de estudios in vitro demuestran que, de manera interesante, la FMKp es un inmunoestimulante que induce la proliferación de PBMC de la sangre humana con un efecto directo sobre los monocitos: producción de TNF-\alpha (figura 3), y de IL-12 p70 (figura 4). Se observa que la proteína p40 recombinante (rP40), la OmpA de K. pneumoniae, es igualmente capaz de estimular la producción de TNF-\alpha (figura 3), y de IL-12 p70 (figura 4) mediante monocitos humanos.
<110> PIERRE FABRE MEDICAMENT
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<120> USO DE FRACCIONES DE MEMBRANAS BACTERIANAS CON ACTIVIDAD INMUNOESTIMULANTE EN EL TRATAMIENTO DE CÁNCERES, SUS PROCEDIMIENTOS DE PREPARACIÓN, Y COMPOSICIONES FARMACÉUTICAS QUE LES CONTIENEN.
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<130> D17974
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<140> FR 9903154
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<141> 1999-03-15
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<160> 4
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<170> PatentIn Vers. 2.0
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<210> 1
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<211> 1035
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<212> AND
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<213> Klebsiella pneumoniae 
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<220>
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<221> exón
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<222> (1)..(1032)
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<220>
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<221> intrón
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<222> (1033)..(1035)
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<220>
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<221> CDS
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<222> (1)..(1032)
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<400> 1
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<210> 2
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<211> 344
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<212> PRT
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<213> Klebsiella pneumoniae 
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<400> 2
3

Claims (22)

1. Uso de una fracción de membrana de Klebsiella pneumoniae que comprende proteoglicanos para la preparación de una composición farmacéutica inmunoestimulante y capaz de inducir una respuesta inmunitaria antitumoral destinada a la prevención y el tratamiento de cánceres, caracterizado porque dicha fracción de membrana se obtiene mediante un procedimiento que comprende una etapa de lisis de las bacterias K. pneumoniae tras su cultivo, y una etapa de separación de la fracción que contiene las membranas de dichas bacterias del lisado total obtenido después de la etapa de lisis.
2. Uso según la reivindicación 1, caracterizado porque la fracción de membrana se prepara mediante un procedimiento que comprende las etapas siguientes:
a)
cultivar dichas bacterias en un medio de cultivo que permite su crecimiento, seguido de una centrifugación de dicho cultivo;
b)
en su caso, desactivar las enzimas líticas del residuo de bacterias obtenido en la etapa a), y a continuación centrifugar de la suspensión obtenida;
c)
extraer y eliminar las proteínas no-membranarias y los ácidos nucleicos del residuo obtenido en la etapa a) o b) mediante al menos un ciclo de lavado del residuo en una disolución de extracción;
d)
digerir el residuo de membranas obtenido en la etapa c) en presencia de enzimas proteásicas, seguido de una centrifugación;
e)
al menos un ciclo de lavado del residuo obtenido en la etapa d) en un disolución fisiológica y/o en agua destilada; y
f)
someter a ultrasonidos el residuo obtenido en la etapa e).
3. Uso según la reivindicación 1, caracterizado porque la fracción de membrana se prepara mediante un procedimiento que comprende las etapas siguientes:
a)
cultivar dichas bacterias en un medio de cultivo que permite su crecimiento, seguido, en su caso, de una centrifugación;
b)
congelar el medio de cultivo o el residuo obtenido en la etapa a), seguido de la descongelación y del secado de las células;
c)
eliminar por medio de una DNasa los ácidos nucleicos de las células secas obtenidas en la etapa b) resuspendidas;
d)
triturar las células obtenidas en la etapa c), y aclarar la suspensión obtenida;
e)
precipitar en medio ácido la suspensión obtenida en la etapa d), y eliminar el residuo;
f)
neutralizar el sobrenadante obtenido en la etapa e) que contiene la suspensión de membrana, seguido de una diálisis y de una concentración de la suspensión de membrana; y
g)
esterilizar la suspensión de membrana concentrada obtenida en la etapa f).
4. Uso según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la composición farmacéutica comprende además un agente que permite vehicular dicha fracción de membrana en una forma tal que permita mejorar su estabilidad y/o su actividad inmunoestimulante, y/o su capacidad para inducir una respuesta inmunitaria antitumoral.
5. Uso según la reivindicación 4, caracterizado porque dicho agente es del tipo emulsión de aceite en agua o de agua en aceite.
6. Uso según la reivindicación 5, caracterizado porque dicho agente se encuentra en forma de una partícula de tipo liposoma, microesfera, nanoesfera, o cualquier tipo de estructura que permita el encapsulamiento y la presentación en forma de partículas de dicha fracción de membrana.
7. Uso según una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque la composición farmacéutica comprende además un agente que permite potenciar la actividad inmunoestimulante y/o la respuesta inmunitaria antitumoral de dichas fracciones de
membrana.
8. Uso según la reivindicación 7, caracterizado porque el agente que permite potenciar la actividad inmuniestimulante y/o la respuesta inmunitaria antitumoral de dichas fracciones de membrana es una citoquina.
9. Uso según la reivindicación 7, caracterizado porque el agente que permite potenciar la actividad inmunoestimulante y/o la respuesta inmunitaria antitumoral de dichas fracciones de membrana es un agente de regulación seleccionado entre las hormonas.
10. Uso según la reivindicación 7, caracterizado porque el agente que permite potenciar la actividad inmunoestimulante y/o la respuesta inmunitaria antitumoral de dichas fracciones de membrana es un agente de regulación seleccionado entre los factores de crecimiento.
11. Uso según la reivindicación 7, caracterizado porque el agente que permite potenciar la actividad inmunoestimulante y/o la respuesta inmunitaria antitumoral de dichas fracciones de membrana es un compuesto celular.
12. Uso según la reivindicación 11, caracterizado porque dicho compuesto celular es un ácido nucleico seleccionado entre los ADN y los ARN.
13. Uso según la reivindicación 11, caracterizado porque dicho compuesto celular es un compuesto de la familia de los ribosomas.
14. Uso según la reivindicación 11, caracterizado porque dicho compuesto celular es una proteína de la familia de las proteínas de choque térmico.
15. Uso según una de las reivindicaciones 1 a 14, para la preparación de una composición farmacéutica destinada a ser administrada en asociación con un tratamiento anticancerígeno.
16. Uso según la reivindicación 15, caracterizado porque el tratamiento anticancerígeno es una quimioterapia y/o una radioterapia.
17. Uso según una de las reivindicaciones 15 y 16, para la preparación de una composición farmacéutica destinada a ser administrada simultánea, separadamente o espaciada en el tiempo con el tratamiento anticancerígeno.
18. Uso según la reivindicación 17, caracterizado porque la composición farmacéutica está destinada a ser administrada por vía entérica o parenteral.
19. Uso según una de las reivindicaciones 15 a 18, caracterizado porque dicho tratamiento anticancerígeno asociado es un tratamiento quimioterapéutico que comprende un inhibidor de la proteasa o un compuesto con actividad anti-angiogénica.
20. Uso según una de las reivindicaciones 1 a 19, para la prevención y/o el tratamiento de cánceres de la vejiga, de la próstata, del colon, del hígado y de los melanomas malignos.
21. Composición farmacéutica que comprende una fracción de membrana de Klebsiella pneumoniae que comprende proteoglicanos obtenidos mediante un procedimiento para la preparación de una fracción de membrana tal como se describe en las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque contiene un compuesto anticancerígeno como producto de combinación para un uso simultáneo, separado o espaciado en el tiempo.
22. Composición farmacéutica según la reivindicación 21, caracterizada porque dicho compuesto anticancerígeno se selecciona entre los inhibidores de proteasas, o entre los compuestos que presentan una actividad anti-angiogénica.
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