ES2247202T3 - Protooncogen humano y proteina codificada en el mismo. - Google Patents
Protooncogen humano y proteina codificada en el mismo.Info
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Abstract
Protooncogén KG-19 humano que presenta la secuencia de bases de la SEC ID nº 1 o un fragmento biológicamente activo de la misma, en el que este último presenta la actividad del protooncogén de longitud completa.
Description
Protooncogén humano y proteína codificada en el
mismo.
La presente invención se refiere a un nuevo
protooncogén y proteína codificada en el mismo, que pueden
utilizarse en el diagnóstico de diversos cánceres, en la preparación
de un animal transgénico, en la terapia de genes antisentido y en el
desarrollo de fármacos anticáncer.
Los animales superiores, incluyendo el ser
humano, contienen cada uno 100.000 genes, aunque sólo
aproximadamente el 15% de los mismos se expresan y las
características de los procesos biológicos individuales, por ejemplo
la génesis, la diferenciación, la homeostasis, las respuestas a los
estímulos, el control del ciclo de división celular, el
envejecimiento y la apoptosis (muerte celular programada) se
determinan en función de qué genes se expresan (Liang, P. y A.B.
Pardee, Science 257:967-971, 1992).
Los fenómenos patogénicos, tales como la
tumorogénesis, son provocados por mutaciones génicas que provocan
cambios en el modo de expresión génica. Por lo tanto, se han llevado
a cabo estudios comparativos de las expresiones génicas en diversas
células con el fin de proporcionar las bases para establecer los
enfoques viables en la comprensión de los diversos fenómenos
biológicos.
Se ha dado a conocer que la tumorogénesis
provocada por diversos cambios genéticos, tales como la pérdida de
la heterocigosidad cromosómica, la activación de oncogenes y la
inactivación de los genes supresores tumorales, por ejemplo del gen
p53 (Bishop, J.M., Cell 64:235-248, 1991; y
Hunter, T., Cell 64:249-270, 1991). Además,
se ha dado a conocer que entre el 10% y el 30% de los cánceres
humanos surgen de la activación de un oncogén a través de la
amplificación de protooncogenes.
Por lo tanto, la activación de los protooncogenes
desempeña un importante papel en la etiología de muchos tumores y ha
existido una necesidad de identificar protooncogenes.
Los presentes inventores han tratado de
desentrañar el mecanismo implicado en la tumorogénesis del cáncer
cervical e inesperadamente han descubierto que nuevos
protooncogenes, el protooncogén 1 cervical humano
(HCCR-1) (solicitud de patente coreana nº
2000-16757 (31 de marzo de 2000) y el protooncogén
HCCR-2 (solicitud de patente coreana nº
2000-71202 (28 de noviembre de 2000), se encuentra
específicamente sobreexpresados en las células cancerosas. El
protooncogén provoca cambios cuantitativos y cualitativos de la
expresión del producto proteico correspondiente a través de un
cambio conformacional (Weinberg, R.A., Cancer Research
49:3713-3721, 1989). La proteína cancerosa de
conformación modificada destruye las rutas de transducción de
señales en la superficie celular, citoplasma o núcleo, mientras que
en ausencia del producto de un gen supresor tumoral, estimula la
proliferación celular junto con otras proteínas cancerosas, perturba
el ciclo celular y destruye el mecanismo de muerte celular
(apoptosis) (Todd, R., Anticancer Research
19:4729-4746, 2000).
El procedimiento de los dos híbridos de levadura,
desarrollado en 1989 por Fields et al. (Fields, S. y Song,
O., Nature 340:245-246, 1989) para examinar
dichas interacciones proteína-proteína, ha sido
ampliamente aplicado para elucidar el mecanismo de la muerte celular
(Wallach, D. et al., Curr. Opin. Immunol.
10:131-136, 1989), así como otros procesos
biológicos utilizando diversas herramientas genéticas (Pandey, A. y
Mann, M., Nature 405:837-846, 2000).
La presente invención se ha realizado con vistas
a desarrollar una nueva proteína de unión al producto proteico
derivado del protooncogén HCCR-1 utilizando el
procedimiento de los dos híbridos de levadura y ha descubierto un
nuevo protooncogén humano KG-19 que expresa una
proteína que se une específicamente al protooncogén
HCCR-2 así como a HCCR-1,
respectivamente. Este protooncogén, KG-19, puede
utilizarse ventajosamente en el diagnóstico, prevención y
tratamiento de diversos cánceres, por ejemplo leucemia, linfoma y
los cánceres de colon, de mama, de riñón, de estómago, de pulmón, de
ovario y uterino.
De acuerdo con lo expuesto anteriormente, un
objetivo de la presente invención es proporcionar un nuevo
protooncogén y un fragmento biológicamente activo del mismo.
Otros objetivos de la presente invención
consisten en proporcionar:
un vector recombinante que contiene dicho
protooncogén o un fragmento biológicamente activo del mismo y un
microorganismo transformado con el mismo;
una proteína codificada en dicho protooncogén y
en un fragmento biológicamente activo de la misma;
un kit para el diagnóstico de cáncer que
comprende dicho protooncogén o un fragmento biológicamente activo
del mismo;
un kit para el diagnóstico del cáncer, que
comprende dicha proteína o un fragmento biológicamente activo de la
misma;
un gen antisentido que presenta una secuencia de
bases complementaria a la de dicho protooncogén o un fragmento del
mismo;
un procedimiento para el tratamiento o prevención
de cáncer mediante la utilización de dicho gen antisentido; y
un procedimiento para el cribado de candidatos a
fármaco anticáncer mediante la utilización de dicho protooncogén o
de un fragmento del mismo.
De acuerdo con un aspecto de la presente
invención, se proporciona un nuevo protooncogén que presenta la
secuencia nucleotídica de SEC ID nº 1 o un fragmento biológicamente
activo del mismo.
De acuerdo con otro aspecto de la presente
invención, se proporciona un vector recombinante que contiene dicho
protooncogén o un fragmento biológicamente activo del mismo y un
microorganismo transformado con dicho vector.
De acuerdo con todavía otro aspecto de la
presente invención, se proporciona una proteína que presenta la
secuencia de aminoácidos de la SEC ID nº 2 o un fragmento
biológicamente activo de la misma derivada a partir de dicho
protooncogén o de un fragmento del mismo.
Lo anteriormente expuesto y otros objetivos y
características de la presente invención se pondrán claramente de
manifiesto a partir de la siguiente descripción de la invención,
tomada conjuntamente con los dibujos adjuntos, que muestran,
respectivamente:
la figura 1a: los resultados de los análisis de
transferencia northern para el protooncogén KG-19
expresado en múltiples tejidos normales humanos en 12 pistas
(cerebro, corazón, músculo esquelético, colon, timo, bazo, riñón,
hígado, intestino delgado, placenta, pulmón y leucocitos sanguíneos
periféricos);
la figura 1b: los resultados obtenidos tras
hibridar la muestra de la figura 1a con
\beta-actina;
la figura 2a: los resultados de los análisis de
transferencia northern para el protooncogén KG-19
expresado en líneas celulares de cáncer humano (células
HL-60 de la leucemia promielocítica, células HeLa de
cáncer cervical, células K-562 de la leucemia
mielógena crónica, células MOLT-4 de la leucemia
linfoblástica, células Raji del linfoma de Burkitt, células SW480
del cáncer de colon, células A549 del cáncer de pulmón y células
G361 de melanoma);
la figura 2b: los resultados obtenidos tras
hibridar la misma muestra de la figura 2a con
\beta-actina;
la figura 3a: los resultados de los análisis de
transferencia northern para el protooncogén KG-19
expresado en tejidos ováricos cancerosos;
la figura 3b: los resultados obtenidos tras
hibridar la muestra de la figura 3a con
\beta-actina;
la figura 4a: los resultados de los análisis de
transferencia northern para el protooncogén KG-19
expresado en tejidos mamarios cancerosos;
la figura 4b: los resultados obtenidos tras
hibridar la muestra de la figura 4a con
\beta-actina;
la figura 5a: los resultados de los análisis de
transferencia northern para el protooncogén KG-19
expresado en tejidos pulmonares cancerosos;
la figura 5b: los resultados obtenidos tras
hibridar la muestra de la figura 4a con
\beta-actina;
la figura 6a: imagen de contraste de fases de las
células 293 embriónicas de riñón humano de tipo salvaje cultivadas
en monocapa;
la figura 6b: imagen de contraste de fases de las
células 293 embriónicas de riñón humano transfectadas cultivadas en
monocapa con KG-19;
la figura 7: tinción
hematoxilina-eosina de células 293 embriónicas de
riñón humano cultivadas en monocapa transfectadas con
KG-19;
la figura 8: tumorogenicidad de las células
KG-19 en ratones desnudos;
la figura 9: los resultados de dodecil sulfato
sódico (SDS)-PAGE muestran los patrones de expresión
de proteínas antes y después de la inducción con IPTG en células 293
embriónicas de riñón humano transfectadas con
KG-19.
El nuevo protooncogén de la presente invención,
denominado KG-19, consiste en 772 pares de bases y
presenta la secuencia de ADN de la SEC ID nº 1. Este protooncogén
KG-19 se une específicamente al protooncogén 1 del
cáncer cervical humano (en lo sucesivo "protooncogén
HCCR-1") descrito en la solicitud de patente
coreana nº 2000-16757 y el protooncogén
HCCR-2 descrito en la solicitud de patente coreana
nº 2000-71202.
En la SEC ID nº 1, el marco de lectura abierto
correspondiente a las bases números 138 a 638 es una región
codificante de proteína de longitud completa y la secuencia teórica
de aminoácidos derivada de la misma se muestra en la SEC ID nº 2,
que consiste en 166 aminoácidos ("proteína
KG-19"). Sin embargo, considerando los codones
degenerados y los codones preferentes en un animal específico, en el
que se expresará el protooncogén de la presente invención, pueden
llevarse a cabo diversos cambios y modificaciones de las secuencias
de ADN de SEC ID nº 1, por ejemplo en el área codificante de las
mismas sin alterar negativamente la secuencia de aminoácidos de la
proteína expresada, o en el área no codificante sin afectar
negativamente la expresión del protooncogén. Por lo tanto, la
presente invención también incluye, en su ámbito, un polinucleótido
que presenta sustancialmente la misma secuencia de bases que el
protooncogén inventivo y que un fragmento biológicamente activo del
mismo. Tal como se utiliza en la presente memoria,
"sustancialmente el mismo polinucleótido" se refiere a un
polinucleótido cuya secuencia de bases muestra una homología del 80%
o más, preferentemente del 90% o más, con la mayor preferencia del
95% o más con el protooncogén de la presente invención.
La proteína expresada a partir del protooncogén
de la presente invención consiste en 166 aminoácidos y presenta la
secuencia de aminoácidos de la SEC ID nº 2. El peso molecular de
esta proteína es de aproximadamente 19 kDa. Sin embargo, pueden
llevarse a cabo diversas sustituciones, adiciones y/o deleciones de
los residuos aminoácidos de la proteína sin afectar negativamente la
función de la proteína. Además, puede utilizarse una parte de la
proteína cuando debe servir a un fin específico. Estos aminoácidos
modificados y los fragmentos de los mismos también se encuentran
comprendidos en el alcance de la presente invención. Por lo tanto,
la presente invención abarca un polipéptido que presenta
sustancialmente la misma secuencia de aminoácidos que la proteína
derivada del oncogén de la presente invención y que un fragmento
biológicamente activo del mismo. Tal como se utiliza en la presente
memoria, la expresión "sustancialmente el mismo polipéptido" se
refiere a un polipéptido cuya secuencia de aminoácidos presenta una
homología del 80% o más, preferentemente del 90% o más, con la mayor
preferencia del 95% o más con la secuencia de aminoácidos de la SEC
ID nº 2.
El protooncogén, o la proteína, de la presente
invención pueden obtenerse a partir de tejidos de cáncer humano o
sintetizarse utilizando un procedimiento de síntesis convencional de
ADN o de péptidos. Además, el gen preparado de esta manera puede
insertarse en un vector convencional con el fin de obtener un vector
de expresión, el cual a su vez puede introducirse en un huésped
adecuado, por ejemplo en un microorganismo tal como una célula de
E. coli o de levadura, o en una célula animal, tal como una
célula de ratón o humana. Las células transformadas con protooncogén
KG-19 o con un fragmento del mismo se denominan
"células KG-19".
A continuación, puede utilizarse un huésped
transformado para producir el ADN o proteína inventivos a gran
escala. Por ejemplo, se transforma E. coli
XL1-Blue con el vector de expresión
pGEM-T (Promega, USA) que contiene el gen
KG-19 inventivo con el fin de obtener un
transformante de E. coli denominado XL1-Blue
MRA/pGEM-T/KG-19 que se depositó el
18 de septiembre de 2000 en la Korean Collection for Type Cultures
(KCTC) (dirección: Korea Research Institute of Bioscience and
Biotechnology (KRIBB), nº 52, Oun-dong,
Yusong-ku, Taejon, 305-333,
República de Corea) bajo el número de registro KCTC 0826BP de
acuerdo con los términos del Tratado de Budapest sobre el
reconocimiento internacional del depósito de microorganismos a los
fines del procedimiento de patentes.
Para preparar un vector, se seleccionan
adecuadamente las secuencias de control de la expresión, por ejemplo
el promotor, el terminador, la secuencia de autorreplicación y la
señal de secreción y se combinan dependiendo de la célula huésped
utilizada.
La sobreexpresión del protooncogén de la presente
invención no se produce en los tejidos humanos normales, por ejemplo
cerebro, corazón, músculo esquelético, colon, timo, bazo, riñón,
hígado, intestino delgado, placenta, pulmón y leucocitos sanguíneos
periféricos, pero sí en los tejidos cancerosos, por ejemplo en la
leucemia, linfoma, y líneas celulares de cáncer de mama, de riñón,
de ovario, de pulmón, de estómago y de la piel. Esto sugiere que el
protooncogén de la presente invención induce los cánceres
anteriormente indicados. Además, cuando se transfecta una célula 293
embriónica de riñón humano (HEK) normal con el protooncogén de la
presente invención, se produce una célula anormal. Las
caracterizaciones morfológicas realizadas mediante microscopía
óptica y electrónica muestran que la célula anormal presenta la
forma de una célula tumoral. Mediante la utilización del
procedimiento de tinción hematoxilina-eosina puede
confirmarse que la célula tumoral es cancerosa (carcinoma).
Cuando las células 293 HEK normales transfectadas
con el protooncogén de la presente invención se inyectan en el lomo
de ratones desnudos, se observa tumorogénesis tras aproximadamente
14 días de la inyección, alcanzando el tamaño del tumor los 2,0 cm x
2,0 cm en 30 días.
Por lo tanto, se cree que el protooncogén de la
presente invención es un factor común a todas las formas de los
diversos cánceres y que puede utilizarse ventajosamente en el
diagnóstico de diversos cánceres y en la producción de un animal
transgénico, así como en una terapia génica antisentido y en el
desarrollo de fármacos anticáncer.
Un procedimiento de diagnóstico que puede
llevarse a cabo utilizando el protooncogén de la presente invención
puede comprender, por ejemplo, las etapas de hibridación de ácidos
nucleicos separados de los líquidos corporales de un sujeto con una
sonda que contiene el protooncogén de la presente invención o un
fragmento del mismo y determinación de si el sujeto presenta el
protooncogén utilizando un procedimiento convencional de detección
de la técnica. La presencia del protooncogén puede detectarse
fácilmente marcando la sonda con un radioisótopo o con un enzima.
Por lo tanto, la presente invención también abarca un kit
diagnóstico de cáncer que contiene el protooncogén de la presente
invención o un fragmento del mismo.
La presente invención también abarca un animal
transgénico producido mediante la introducción del protooncogén de
la presente invención en un mamífero, por ejemplo en una rata. Para
producir dicho animal transgénico, resulta preferente introducir el
protooncogén inventivo en un huevo fertilizado de un animal antes
del 8º estadio del ciclo celular. El animal transgénico puede
utilizarse ventajosamente para el cribado en busca de carcinógenos o
de agentes anticáncer, tales como antioxidantes.
La presente invención también proporciona un gen
antisentido que resulta útil en una terapia génica. Tal como se
utiliza en la presente memoria, el término "un gen antisentido"
significa un polinucleótido que comprende una secuencia de bases que
es completa o parcialmente complementaria a la secuencia del ARNm
que se transcribe a partir del protooncogén que presenta la
secuencia de bases de la SEC ID nº 1 o de un fragmento del mismo,
siendo capaz dicho nucleótido de prevenir la expresión del marco de
lectura abierto (ORF) del protooncogén al unirse al sitio de unión
de proteínas del ARNm.
La presente invención también abarca un
procedimiento para tratar o prevenir el cáncer en un sujeto mediante
la administración de una cantidad terapéuticamente efectiva del gen
antisentido inventivo al sujeto.
En la terapia génica antisentido de la invención,
se administra el gen antisentido de la presente invención a un
sujeto de una manera convencional con el fin de prevenir la
expresión del protooncogén. Por ejemplo, se mezcla el
oligodesoxinucleótido (ODN) antisentido con un derivado
poli-L-lisina hidrofobizado mediante
interacción electrostática de acuerdo con el procedimiento dado a
conocer por Kim, J.S. et al. (J. Controlled Release
53:175-182, 1998) y el ODN antisentido mixto
resultante se administra intravenosamente al sujeto.
La presente invención también abarca una
composición anticáncer que comprende el gen antisentido de la
presente invención como ingrediente activo, en asociación con
portadores, excipientes u otros aditivos farmacéuticamente
aceptables, si resultan necesarios. La composición farmacéutica de
la presente invención preferentemente se formula para la
administración mediante inyección.
La cantidad de gen antisentido realmente
administrada debe determinarse a la luz de diversos factores
relevantes, incluyendo la condición a tratar, la vía de
administración elegida, la edad y el peso del paciente individual y
la severidad de los síntomas del paciente.
La proteína expresada a partir del protooncogén
inventivo puede utilizarse para producir un anticuerpo útil como
herramienta diagnóstica. El anticuerpo de la presente invención
puede prepararse en la forma de un anticuerpo monoclonal o
policlonal de acuerdo con cualquiera de los procedimientos bien
conocidos en la técnica mediante la utilización de una proteína que
presente la secuencia de aminoácidos de la SEC ID nº 2 o un
fragmento de la misma. El diagnóstico de cáncer puede llevarse a
cabo utilizando cualquiera de los procedimientos conocidos en la
técnica, por ejemplo mediante ensayo de inmunosorción ligada a
enzima (ELISA), radioinmunoensayo (RIA), ensayo sándwich, tinción
inmunohistoquímica, transferencia western o de inmunoensayo sobre
gel poliacrílico, con el fin de evaluar si la proteína se ha
expresado y se encuentra en los líquidos corporales del sujeto. Por
lo tanto, la presente invención también abarca un kit diagnóstico de
cáncer que contiene la proteína que presenta la secuencia de
aminoácidos de la SEC ID nº 2 o un fragmento de la misma.
Puede establecerse una línea continua viable de
células cancerosas mediante la utilización del protooncogén de la
presente invención y dicha línea celular puede obtenerse, por
ejemplo, a partir de tejidos tumorales formados en el lomo de un
ratón desnudo mediante la inyección de células fibroblásticas
transformadas con el protooncogén de la presente invención. Las
líneas celulares preparadas de esta manera pueden utilizarse
ventajosamente en la búsqueda de agentes anticáncer.
La presente invención también abarca un
procedimiento para el cribado de candidatos a fármaco anticáncer
mediante la utilización de dicho protooncogén o de un fragmento del
mismo.
Tras caracterizar el papel del protooncogén
inventivo y su producto proteico en la tumorogénesis, pueden
utilizarse para inhibir el oncogén u oncoproteína mediante la
administración del oligodesoxinucleótido antisentido que reconoce
los genes o anticuerpos que reconocen las proteínas. Mediante la
utilización del papel caracterizado del protooncogén inventivo,
también pueden encontrarse las moléculas interactuantes que se unen
a oncoproteínas conocidas y seguidamente diseñar inhibidores,
candidatos a fármaco anticáncer, que pueden degradar las moléculas
interactuantes.
Los siguientes Ejemplos y Ejemplos de ensayo se
proporcionan únicamente con fines ilustrativos y no pretenden
limitar el alcance de la invención.
Con el fin de encontrar una proteína de unión al
producto proteico del protooncogén humano HCCR-1 (nº
de registro de Genebank AF195651), se llevó a cabo un ensayo de dos
híbridos de levadura mediante la utilización de MATCHMAKER LexA
Two-Hybrid System (Clontech Laboratories, Inc., USA)
de acuerdo con el procedimiento dado a conocer previamente (Golemis,
E.A., et al., Current Protocols in Molecular Biology,
John Wiley & Sons, Inc., capítulos 20.0 y 20.1, 1996).
Las líneas celulares y vectores utilizados en el
experimento siguiente se indican en el kit nº de catálogo
K1609-1 de Clontech Laboratories, Inc.
La cepa de levadura EGY48 se transformó con el
vector p8op-lacZ y se cultivó en una placa
SD/-uracilo/glucosa, un medio de selección sintético que no presenta
uracilo. Se seleccionó la colonia que creció en esta placa, se
cultivó en un medio SD/-uracilo/glucosa y se transformó con un
vector preparado mediante la inserción del gen
HCCR-1 en los sitios BamHI y SaII del
vector pLexA como "plásmido cebo".
Con el fin de examinar la expresión del gen
HCCR-1 clonado en el vector pLexA, se llevó a cabo
transferencia western utilizando el anticuerpo LexA. El resultado
mostró una banda de 64\sim65 kDa, respectivamente.
La colonia que expresaba el gen
HCCR-1 se cultivó en un medio
SD/-uracilo,-histidina/glucosa y se transformó con el vector
pBD42AD, que es una biblioteca de fusión de DA (dominio de
activación) derivada de cerebro fetal humano. Con el fin de
confirmar la unión del cebo con la biblioteca, se llevó a cabo un
ensayo de levantamiento de colonia (Breeden, L. y Nasmyth, K.,
Cold Spring Harbor Symposium Quant. Bio.
50:643-650, 1985). Si el cebo interacciona con la
biblioteca, se formará una colonia azul en una placa
X-gal. Se purificó el ADN de la levadura cultivada
utilizando perlas de vidrio y se transformó E. coli KC8 con
el ADN purificado mediante electroporación y se extendió en un medio
mínimo M9 para seleccionar los transformantes.
La secuencia de nucleótidos del clon de ADNc de
longitud completa KG-19 se registró en GenBank bajo
el nº de registro AF283671.
En la SEC ID nº 1, el marco de lectura abierto
completo de KG-19 correspondiente a los números de
base 136 a 638 es una región codificante de proteína y la secuencia
teórica de aminoácidos derivada de la misma se muestra en la SEC ID
nº 2, que consiste en 166 aminoácidos.
Se insertó el ADNc de longitud completa
KG-19 en el sitio de multiclonado del vector
pGEM-T-easy (Promega, USA)
utilizando ADN ligasa con el fin de obtener un vector recombinante
que expresase el gen KG-19. Se transformó E.
coli XL1-Blue MRA (Stratagene, USA) con el
vector recombinante con el fin de obtener un E. coli
transformado denominado XL1-Blue
MRA/pGEM-T-easy
KG-19, que se depositó en la Korean Collection for
Type Cultures (Dirección: 52, Oun-dong,
Yusong-ku, Taejon 305-333, República
de Corea) el 18 de septiembre de 2000 bajo el número de registro
KCTC 0862BP.
Con el fin de determinar el nivel de expresión
del gen KG-19 en diversos tejidos normales y
cancerosos, también se llevaron a cabo análisis de transferencia
northern según recomendaciones del fabricante (Clontech) utilizando
una muestra comercial que contenía ADNs purificados procedentes de
múltiples tejidos normales humanos en 12 pistas sobre una membrana
de nilón (figuras 1a y 1b) y también utilizando una muestra de línea
celular cancerosa humana que contenía ARNs purificados de 8 tipos de
células cancerosas sobre una membrana de nilón (figuras 2a y
2b).
Las membranas se hibridaron durante la noche a
68ºC con sonda de ADNc KG-19 con cebadores
aleatorios y marcada con ^{32}P que se preparó utilizando un
sistema de marcado con cebadores aleatorios Rediprime II (Amersham,
Inglaterra). El análisis de transferencia northern se repitió dos
veces y los resultados se cuantificaron mediante densitometría. Se
hibridaron las mismas membranas con una sonda de
\beta-actina para confirmar la integridad del
ARNm.
La figura 1a muestra el resultado del análisis de
transferencia northern de múltiples tejidos normales humanos en 12
pistas, es decir, de cerebro, corazón, músculo esquelético, colon,
timo, bazo, riñón, hígado, intestino delgado, placenta, pulmón y
leucocitos sanguíneos periféricos, utilizando sonda de ADNc
KG-19; y la figura 1b, la misma membrana hibridada
con una sonda de \beta-actina. Tal como puede
observarse en la figura 1a, no se detecta el transcrito de 0,8 kb de
los dos transcritos de ARNm de KG-19 en ninguno de
los tejidos normales, mientras que el transcrito de 7,5 kb, que se
consideraba un transcrito que contenía el protooncogén
KG-19 antes del corte, se expresa débilmente
únicamente en tejido renal normal.
La figura 2a muestra el análisis de transferencia
northern del gen KG-19 expresado en líneas celulares
de cáncer humano, es decir, en células HL-60 de
leucemia promielocítica, células HeLa de cáncer cervical, células
K-562 de leucemia mielógena, células
MOLT-4 de leucemia linfoblástica, células Raji del
linfoma de Burkitt, células SW480 del cáncer de colon, células A549
del cáncer de pulmón y células G361 de melanoma, utilizando la sonda
de ADNc KG-19; y en la figura 2b, la misma membrana
hibridada con una sonda de \beta-actina. Tal como
puede observarse en la figura 2a, se detecta el transcrito de 0,8 kb
de KG-19 en las células Raji del linfoma de Burkitt
y en las células HL-60 de leucemia promielocítica y
el transcrito de 7,5 kb también se expresa a nivel elevado en la
leucemia promielocítica HL-60, en las células HeLa
de cáncer cervical, en las células K-562 de leucemia
mielogénica crónica, en las células MOLT-4 de
leucemia linfoblástica, en las células Raji de linfoma de Burkitt,
en las células SW480 de cáncer de colon, en las células A549 de
cáncer de pulmón y en las células G361 de melanoma. Las células
MOLT-4 y Raji, en particular, mostraban niveles de
transcripción más elevados en comparación con las otras células
cancerosas.
Además, se llevaron a cabo análisis de
transferencia northern de tejidos cancerosos de ovario, de mama y de
pulmón y de sus contrapartidas normales con el fin de confirmar que
se expresaba el gen KG-19. Se purificaron los ARN
totales de los tejidos de ovario, de mama y de pulmón procedentes de
personas sanas normales y de tejidos cancerosos de ovario, de mama y
de pulmón de pacientes con cáncer, utilizando el kit Rneasy total
RNA (Qiagen Inc., Alemania). Se desnaturalizaron 20 \mug de cada
uno de los ARN totales y después se sometieron a electroforesis en
un gel de agarosa-formaldehído al 1% y se
transfirieron a membranas de nilón
(Boehringer-Mannheim, Alemania). Las membranas se
hibridaron a 68ºC con sonda de ADNc total KG-19 con
cebadores aleatorios Rediprime II y marcada con ^{32}P (Amersham,
Inglaterra). El análisis de transferencia northern se repitió dos
veces consistentemente y el resultado se cuantificó mediante
densitometría. Se hibridaron las mismas membranas con una sonda de
\beta-actina con el fin de confirmar la integridad
del ARNm.
La figura 3a muestra el resultado del análisis de
transferencia northern del tejido ovárico normal y del tejido
ovárico canceroso utilizando la sonda de ADNc KG-19;
y la figura 3b, muestra la misma membrana hibridada con una sonda de
\beta-actina. Tal como se muestra en la figura 3a,
el transcrito de 0,8 kb de KG-19 se expresa a nivel
elevado en los tejidos ováricos cancerosos, mientras que la
expresión del gen KG-19 es apenas observable en los
tejidos ováricos normales. En las figuras 3a y 3b, las pistas N y C
representan tejido ovárico normal y canceroso, respectivamente.
La figura 4a muestra el resultado del análisis de
transferencia northern de tejido de mama normal y canceroso
utilizando la sonda de ADNc KG-19; y en la figura
4b, se muestra la misma membrana hibridada con una sonda de
\beta-actina. Tal como se muestra en la figura 4a,
el transcrito de 0,8 kb de KG-19 se expresa a nivel
elevado en el tejido ovárico canceroso, mientras que la expresión
del gen KG-19 es apenas observable en el tejido
normal de mama. En las figuras 4a y 4b, las pistas N y C representan
el tejido ovárico normal y canceroso, respectivamente.
La figura 5a muestra el resultado del análisis de
transferencia northern de tejido pulmonar normal y canceroso
utilizando la sonda de ADNc KG-19; y la figura 5b,
la misma membrana hibridada con una sonda de
\beta-actina. Tal como se muestra en la figura 5a,
los transcritos de 0,8 kb y de 7,5 kb de KG-19 se
expresan a niveles elevados en el tejido pulmonar canceroso,
mientras que la expresión del gen KG-19 es apenas
observable en el tejido pulmonar normal. En las figuras 5a y 5b, las
pistas N y C representan el tejido pulmonar normal y canceroso,
respectivamente.
Etapa
1
Se construyó un vector de expresión que contenía
la región codificante de KG-19 de la manera
siguiente.
En primer lugar, se construyó el vector de fusión
pCDNA3 (Invitrogen,
USA)-glutatión-S-transferasa
(GST) insertando el gen GST en el vector de expresión eucariótico
pcDNA3 mediante digestión HindIII/KpnI. Se digirió el
gen KG-19 con la totalidad de la secuencia
codificante (correspondiente a los números de base 121 a 674 en la
SEC ID nº 1) utilizando BamHI/XbaI y seguidamente el
fragmento BamHI/XbaI que contenía la secuencia
codificante KG-19 de longitud completa se insertó en
el pCDNA3 digerido con BamHI/XbaI. Se utilizó
lipofectamina (Gibco BRL) para introducir el vector resultante
pCDNA3/GST/KG-19 en las células epiteliales 293 de
riñón embriónico humano (ACTC CRL 1753, USA) seguido de la selección
en un medio suplementado con G418 (Gibco, USA). Las células 293
resultantes transfectadas con KG-19 se denominaron
"células KG-19".
Etapa
2
Las células 293 normales de tipo salvaje y las
células 293 KG-19 obtenidas en la Etapa 1 se
cultivaron en una monocapa en medio DMEM que contenía 10% de suero y
se observaron sus características de crecimiento mediante
microscopía de contraste de fases (Olympus, USA). Las figuras 6a y
6b muestran imágenes de contraste de fases de las células 293
embriónicas de tipo salvaje de riñón humano cultivado en monocapa y
de las células 293 embriónicas de riñón humano transfectadas con
KG-19. Tal como se muestra en la figura 6a, las
células 293 de tipo salvaje que proliferaron como células
epiteliales presentaban cada una forma ahusada con un núcleo fino y
largo y poco citoplasma. En el caso de las células
KG-19, la célula cambió de forma, adoptando una
forma poligonal con un núcleo ovoide y citoplasma abundante, tal
como se muestra en la figura 6b.
Las células KG-19 cultivadas en
monocapa, teñidas con hematoxilina-eosina (H y E)
mostraban pleiomorfismo nuclear, nucleolos diferenciados, patrones
granulares en la cromatina, células tumorales gigantes y figuras
mitóticas atípicas, tal como se muestra en la figura 7.
Con el fin de analizar la tumorogenicidad, se
inyectaron 5 x 10^{6} células KG-19
subcutáneamente en la parte posterior del tronco de 9 ratones
desnudos (ratones atímicos nu/nu de 5 semanas de edad con origen
BALB/c). La totalidad de los 9 ratones inyectados con células
KG-19 mostraron tumores palpables tras 14 días,
alcanzando los tumores un tamaño de 2,0 cm x 2,0 cm en 30 días, tal
como se muestra en la figura 8.
La región de secuencia codificante de longitud
completa del protooncogén KG-19 correspondiente a
los números de base 138 a 638 de la SEC ID nº 1 y codificante de los
aminoácidos número 1 a 166 de la SEC ID nº 2 se insertó en el sitio
de reconocimiento de BamHI/NotI del sitio de clonado
múltiple del vector pGEX 4T-3 (Amersham Pharmacia
Biotech., USA), se fusionó con el gen GST y el vector resultante
pGEX 4T-3/KG-19 se transfectó en
E. coli BL21 (ATCC 47092). Los E. coli transfectados
se incubaron utilizando un medio LB caldo en un incubador con
agitación rotatoria a 37ºC durante 16 horas, se diluyeron 1/100 y se
incubaron durante 3 horas. Se añadió al mismo isopropil
\beta-D-tiogalacto-piranósido
(IPTG, Sigma) 1 mM con el fin de inducir la síntesis de
proteínas.
Las células E. coli en el cultivo se
rompieron mediante sonicación y se sometieron a electroforesis en
gel utilizando dodecil sulfato sódico (SDS) al 12% antes y después
de la inducción con IPTG. La figura 9 muestra los resultados del
SDS-PAGE, los cuales muestran un patrón de expresión
de proteínas de la cepa BL21 de E. coli transfectada con el
vector pGEX 4T-3/KG-19. Tras la
inducción con IPTG, se observó una banda de proteínas significativa
a aproximadamente 45 kDa. Esta proteína fusionada de 45 kDa contenía
una proteína GST de aproximadamente 26 kDa que se expresaba a partir
del gen del vector pGEX 4T-3.
Aunque se han descrito e ilustrado unas formas de
realización de la presente invención, resulta evidente que pueden
llevarse a cabo en la misma diversos cambios y modificaciones sin
apartarse por ello del espíritu de la presente invención, que estará
limitado únicamente por el alcance de las reivindicaciones
adjuntas.
<110> KIM, Jin Woo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Protooncogén humano y proteína
codificada en el mismo
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> PCA/11049/KJW/PCT
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> KOPATIN 1.5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 772
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 166
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (11)
1. Protooncogén KG-19 humano que
presenta la secuencia de bases de la SEC ID nº 1 o un fragmento
biológicamente activo de la misma, en el que este último presenta la
actividad del protooncogén de longitud completa.
2. Protooncogén o un fragmento biológicamente
activo según la reivindicación 1, que es un fragmento que presenta
una secuencia de bases correspondiente a los números de base 138 a
638 de la SEC ID nº 1.
3. Proteína que presenta la secuencia de
aminoácidos SEC ID nº 2 o un fragmento biológicamente activo de la
misma.
4. Vector que comprende el protooncogén o un
fragmento biológicamente activo según la reivindicación 1.
5. Microorganismo transformado con el vector
según la reivindicación 4.
6. Microorganismo según la reivindicación 5, que
es E. coli XL1-Blue
MRA/pGEM-T/KG-19 (nº de registro:
KCTC 0862BP).
7. Procedimiento para la preparación de la
proteína o de un fragmento biológicamente activo según la
reivindicación 3, que comprende cultivar el microorganismo según la
reivindicación 5 ó 6.
8. Kit para el diagnóstico de cáncer, que
comprende el protooncogén o fragmento según la reivindicación 1 ó
2.
9. Kit para el diagnóstico de cáncer, que
comprende la proteína o fragmento biológicamente activo según la
reivindicación 3.
10. Gen antisentido que presenta una secuencia de
bases que es complementaria a la secuencia del ARNm completo o
parcial transcrito a partir del protooncogén o del fragmento
biológicamente activo según la reivindicación 1 ó 2 y que es capaz
de unirse al ARNm, inhibiendo la expresión de dicho protooncogén o
fragmento.
11. Composición para la prevención o tratamiento
de cáncer, que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva del
gen antisentido según la reivindicación 10 y un portador
farmacéuticamente aceptable.
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