ES2247602T3 - Reactivo estabilizado utilizando un sistema de reduccion de coenzima. - Google Patents

Reactivo estabilizado utilizando un sistema de reduccion de coenzima.

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ES2247602T3 ES96902814T ES96902814T ES2247602T3 ES 2247602 T3 ES2247602 T3 ES 2247602T3 ES 96902814 T ES96902814 T ES 96902814T ES 96902814 T ES96902814 T ES 96902814T ES 2247602 T3 ES2247602 T3 ES 2247602T3
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Abstract

LA INVENCION SE REFIERE A UN REACTIVO PARA LA DETERMINACION ENZIMATICA DE LA CONCENTRACION DE UN ANALITO EN UN PACIENTE EN LA QUE SE MIDE EL GRADO DE OXIDACION DE UN COENZIMA, CARACTERIZADO PORQUE DICHO REACTIVO ESTA ESTABILIZADO CONTRA LA OXIDACION MEDIANTE UN SISTEMA DE REDUCCION DE COENZIMA QUE COMPRENDE UN ENZIMA Y UN PAR DE SUSTRATOS SELECCIONADOS DE MODO QUE PERMITEN LA REGENERACION CONTINUA DE DICHO COENZIMA A LO LARGO DEL ALMACENAMIENTO DE DICHO REACTIVO. SE DESCUBRE ASIMISMO UNA MEJORA EN UN METODO ENZIMATICO PARA LA DETERMINACION DE LA CONCENTRACION DE UN ANALITO EN UNA MUESTRA DE FLUIDO CORPORAL EN EL QUE SE MIDE EL GRADO DE OXIDACION DE UN COENZIMA, CONSTITUYENDO LA MEJORA LA ESTABILIZACION DE UN REACTIVO QUE COMPRENDE DICHO COENZIMA CONTRA LA OXIDACION MEDIANTE UN SISTEMA DE REDUCCION DE COENZIMA QUE COMPRENDE UN ENZIMA Y UN PAR DE SUSTRATOS SELECCIONADOS DE MODO QUE SE PERMITE LA REGENERACION CONTINUA DE DICHO COENZIMA A LO LARGO DE LA CONSERVACION DE DICHO REACTIVO. SE DESCUBREN ASIMISMO REACTIVOS PARA LA DETERMINACION DE ASPARTATO AMINOTRANSFERASA, ALANINA AMINOTRANSFERASA, AMONIACO Y UREA.

Description

Reactivo estabilizado utilizando un sistema de reducción de coenzima.
Esta invención se refiere a reactivos usados en métodos enzimáticos para determinar la concentración de analitos en una muestra de fluido corporal. En particular esta invención se refiere a reactivos usados en métodos en los que la cantidad de una coenzima oxidada presente en la muestra que reacciona, se corresponde directamente con la concentración de analito presente en la muestra. La invención también se refiere a métodos mejorados para llevar a cabo la determinación de la concentración del analito.
Los analitos que se pueden determinar con los reactivos de la invención incluyen, transaminasas, amoníaco, urea, lactato-deshidrogenasa, triglicéridos y salicilatos.
La aspartato-aminotransferasa es una enzima que se encuentra en niveles elevados en corazón, hígado, glóbulos rojos y músculo esquelético. Cataliza la siguiente reacción:
aspartato + 2-oxoglutarato 
\hskip0,3cm
100 
\hskip0,3cm
oxalacetato + glutamato
Se encuentran aumentos en los niveles séricos de la aspartato-aminotransferasa en muchas enfermedades hepáticas en las que existe destrucción de células hepáticas, especialmente, por ejemplo, en la hepatitis. Los niveles también se encuentran elevados después de un infarto de miocardio y en enfermedades musculares.
La enzima alanina-aminotranferasa se encuentra también en concentraciones elevadas en hígado, y en menor grado en corazón, riñón y músculo esquelético. Cataliza la siguiente reacción:
alanina + 2-oxoglutarato 
\hskip0,3cm
100 
\hskip0,3cm
piruvato + glutamato
Los aumentos en el nivel sérico de esta enzima se encuentran normalmente en afecciones hepáticas, especialmente en la hepatitis.
La cuantificación indirecta de enzimas, en particular, de las transaminasas aspartato-aminotransferasa y alanina-aminotransferasa en muestras de fluidos biológicos, puede implicar contrastar una muestra "blanco" frente a una muestra en la que ha tenido lugar la conversión enzimática de un analito asociado con la enzima de interés.
Para obtener la conversión enzimática del analito, la enzima específica de sustrato, la transaminasa, se deja actuar sobre sustratos de la enzima conocidos, de uso en la cuantificación de la enzima de interés. El cambio en la composición de la reacción con respecto al blanco se puede calcular por medio de diferentes métodos que miden el cambio en absorbancia de la composición. El cambio en absorbancia se correlaciona directamente con la cantidad de transaminasa presente en la muestra.
Aunque los métodos tradicionales tales como la determinación colorimétrica han demostrado ser adecuados, el análisis enzimático se ha visto que es mucho más preciso, seguro y sencillo que estos otros métodos cuando se trata de la determinación de niveles de transaminasas.
Un método de cuantificación de transaminasas en una muestra, comúnmente utilizado, es una modalidad cinética que usa una reacción acoplada a enzima.
En el caso de la aspartato-aminotransferasa (AST), el oxalacetato formado por acción de la AST se convierte en malato incluyendo malato-deshidrogenasa (MDH) en el sistema del ensayo. Esto se realiza mediante la oxidación de la coenzima dinucleótido de nicotinamida y adenina (de NADH a NAD^{+}) que puede seguirse por espectrofotometría a 340 nm. Así, la secuencia de la reacción normalmente es la siguiente:
L-aspartato + 2-oxoglutarato 
\hskip0,3cm
101 
\hskip0,3cm
oxalacetato + L-glutamato
oxalacetato + NADH 
\hskip0,3cm
102 
\hskip0,3cm
L-malato + NAD^{+}
piruvato en la muestra + NADH 
\hskip0,3cm
103 
\hskip0,3cm
lactato + NAD^{+}
La tercera reacción se requiere para eliminar la presencia potencial de niveles elevados de piruvato en muestras procedentes de pacientes. La teoría que hay detrás de la inclusión de niveles elevados de la enzima lactato-deshidrogenasa (LDH) es que si niveles elevados de esta enzima se incluyen en el reactivo, en el caso de que una muestra procedente de un paciente tenga un nivel alto de piruvato, la presencia de NADH y LDH eliminará rápidamente el piruvato de la muestra convirtiéndolo en lactato que no interferirá en la reacción. La necesidad de cargar el reactivo con LDH para eliminar esta reacción secundaria puede afectar a la estabilidad del reactivo al introducir más contaminantes.
En el caso de la alanina-aminotransferasa (ALT), el piruvato formado por la ALT se convierte en lactato incluyendo lactato-deshidrogenasa en la mezcla de reacción. Esto va acompañado de la oxidación de la coenzima NADH a NAD^{+} que puede seguirse por espectrofotometría a 340 nm. Así, la secuencia de la reacción que tiene lugar al usar el reactivo es la siguiente:
L-alanina + 2-oxoglutarato 
\hskip0,3cm
104 
\hskip0,3cm
piruvato + glutamato
piruvato + NADH 
\hskip0,3cm
103 
\hskip0,3cm
lactato + NAD^{+}
piruvato de la muestra + NADH 
\hskip0,3cm
103 
\hskip0,3cm
lactato + NAD^{+}
La teoría y metodología de la medida de ALT es similar a la del reactivo para la determinación de AST con la excepción de que en la determinación de la ALT solamente se requiere una enzima endógena, en concreto la LDH, para realizar la medida (en contraposición al requerimiento de LDH y MDH en la determinación de AST). De este modo, se introduce un número menor de contaminantes en los reactivos para la determinación de ALT, lo que por lo general significa que su vida útil de almacenamiento una vez reconstituidos puede ser un poco más larga que la de los reactivos para la determinación de AST.
En el caso de ambos reactivos, la velocidad de formación de NAD^{+} se correlaciona con la concentración de la transaminasa originalmente presente en la muestra.
La urea es el principal producto metabólico del catabolismo de las proteínas que contiene nitrógeno, y se sintetiza en el hígado por acción de enzimas hepáticas y se excreta mayoritariamente a través de los riñones. Los niveles elevados de urea en suero pueden ser consecuencia de una disfunción renal, enfermedad hepática, cambios en la dieta, insuficiencia cardíaca congestiva, diabetes e infecciones.
El nivel de urea en suero y orina humanos se puede detectar mediante métodos directos e indirectos. Los métodos directos normalmente implican variaciones de la reacción de Fearon. En este sistema de reacción, el diacetilo reacciona con urea para formar el cromógeno diacina, que se puede medir por espectrofotometría por medio de su fuerte absorbancia a 540 nm. El método más común para medir urea en suero y orina humanos implica un sistema indirecto de reacciones enzimáticas acopladas. La ureasa, la primera enzima en este sistema de reacciones, se usa para convertir la urea en los iones amonio y bicarbonato. La glutamato-deshidrogenasa (GLDH), la segunda enzima de este sistema de reacciones, une el NADH y el ion amonio para producir NAD^{+} y glutamato. Esta reacción se sigue por espectrometría a 340 nm, a medida que el NADH se convierte en NAD^{+}. Como alternativa, el ion amonio se puede cuantificar por potenciometría o conductimetría.
Así, el procedimiento de reacciones comúnmente utilizado para determinar la concentración de urea es el siguiente:
Urea + H_{2}O 
\hskip0,3cm
\xrightarrow{\textstyle{Ureasa}} 
\hskip0,3cm
2NH_{3} + CO_{2}
NH_{3} + \alpha -cetoglutarato + NADH 
\hskip0,3cm
\xrightarrow{\textstyle{GLDH}} 
\hskip0,3cm
L-glutamato + NAD^{+}
El descenso en absorbancia a 340 nm a medida que NADH se convierte en NAD^{+}se mide y este descenso es proporcional a la concentración de urea en la muestra original.
La principal fuente de amoníaco circulante es el tracto gastrointestinal. El amoníaco se metaboliza en el hígado que lo convierte en urea en el ciclo de Krebs-Henseleit. Los niveles elevados de amoníaco en suero humano se asocian muy frecuentemente con la existencia de una enfermedad hepática avanzada. La hiperamoniemia tiene un efecto tóxico sobre el sistema nervioso central.
El nivel de amoníaco en suero humano se mide muy comúnmente con un método enzimático directo de una sola etapa, que incorpora glutamato-deshidrogenasa. En esta reacción, la conversión de amoníaco, \alpha-cetoglutarato y NADH (o NADPH) en glutamato y NAD^{+} (o NADP^{+}) se mide por espectrofotometría a 340 nm.
La secuencia de la reacción comúnmente utilizada para determinar la concentración de amoníaco de una muestra es la siguiente:
NH_{3} + \alpha -cetoglutarato + NADPH 
\hskip0,3cm
\xrightarrow{\textstyle{GLDH}} 
\hskip0,3cm
L-glutamato + NADP^{+}
El descenso en absorbancia a 340 nm a medida que NADPH se convierte en NADP^{+}se mide y este descenso es proporcional a la concentración de amoníaco en la muestra del paciente.
Históricamente, como se ha mencionado en lo que antecede, los reactivos para la determinación de transaminasas han adolecido de una escasa estabilidad una vez reconstituidos. La estabilidad de estos reactivos, especialmente en un formato de un único vial, suele estar limitada a aproximadamente un máximo de un mes en condiciones de refrigeración. La causa de esta inestabilidad se podría atribuir tanto al deterioro de componentes endógenos presentes en los reactivos como a la inestabilidad del NADH en disolución. Las principales causas de inestabilidad del NADH en disolución están directamente relacionadas con la presencia de enzimas endógenas de los reactivos, en concreto, LDH y MDH, en el reactivo para la determinación de AST, y LDH en el reactivo para la determinación de ALT. Las preparaciones comerciales de las enzimas endógenas MDH y LDH, ya sean de origen animal o de origen microbiano, contienen contaminantes que en última instancia afectan a la estabilidad del NADH en las preparaciones reconstituidas y, como consecuencia, afectan a la estabilidad de estos reactivos. Estos contaminantes normalmente son niveles bajos de AST y ALT, las enzimas que se desea medir, y la NADH-oxidasa, todas las cuales inician la oxidación de NADH en el reactivo.
El ph de los reactivos puede también tener efecto sobre la inestabilidad del NADH ya que el NADH se descompone rápidamente en disolución, especialmente en medio ácido. La mayoría de los reactivos para la determinación de transaminasas están formulados con un intervalo de pH de 7,3 a 8,0. Cuanto más alcalino es el reactivo, mayor es la estabilidad del NADH en disolución.
Además, los reactivos para la determinación de amoníaco y urea también adolecen de problemas de estabilidad, y la estabilidad de estos reactivos en un formato de un único vial y a temperaturas de refrigeración, normalmente ha estado limitada a un máximo de un mes en el caso del amoníaco, y a dos meses en el caso de la urea. La causa de esta inestabilidad se podría atribuir al deterioro de los componentes endógenos presentes en los reactivos, a la inestabilidad del NADH o NADPH en disolución y a la contaminación debida al amoníaco presente en el agua utilizada para reconstituir el polvo del reactivo.
Las principales causas de inestabilidad del NADH o del NADPH en disolución están directamente relacionadas con la presencia de enzimas endógenas en los reactivos. El pH de los reactivos también puede tener efecto sobre la inestabilidad del NADH o NADPH ya que el NADH y el NADPH se descomponen rápidamente en disolución, especialmente en medio ácido.
El NADPH se emplea comúnmente en reactivos para la determinación de amoníaco (con preferencia al NADH), con el fin de solucionar la interferencia del ensayo producida por la lactato-deshidrogenasa endógena presente en el suero de los pacientes. La lactato-deshidrogenasa y el piruvato endógenos, procedentes de la muestra de un paciente, reaccionarán específicamente con NADH en la siguiente secuencia de reacción:
piruvato de la muestra + NADH 
\hskip0,3cm
103 
\hskip0,3cm
lactato + NAD^{+}
El mantenimiento del NADPH en disolución también se verá afectado por la presencia de contaminantes de las preparaciones comerciales de glutamato-deshidrogenasa, que iniciarán la oxidación del NADPH en el reactivo para la determinación de amoníaco. Asimismo, la presencia de contaminantes de las preparaciones comerciales de ureasa y glutamato-deshidrogenasa, iniciarán la oxidación del NADH en el reactivo para la determinación de la urea.
Uno de los medios para vencer esta dificultad relacionada con la estabilidad del NADH y NADPH en disolución ha consistido en generar la coenzima reducida en el reactivo justo antes de su uso.
Uno de los métodos para esto se describe en la solicitud de patente australiana AU-A-61906/90 de F. Hoffmann La Roche AG, con especial consideración a sistemas enzimáticos similares para la medida de bicarbonato y amoníaco en suero. En esta descripción la coenzima reducida se genera in situ, o bien simultáneamente con, o bien antes de, la reoxidación de la coenzima por el analito, el sustrato y enzimas específicas. Esto se consigue incluyendo en la mezcla de reacción una enzima y un sustrato de la enzima que posibilitan la reducción de la coenzima oxidada. La reacción específica descrita y apoyada por F. Hoffmann La Roche AG es:
NAD^{+} + Glucosa-6-fosfato (G-6-P) 
\hskip0,3cm
106 
\hskip0,3cm
H^{+} + NADH + 6-fosfo-gluconolactona
Esto hace que el dinucleótido de nicotinamida y adenosina reducido quede disponible.
El problema asociado con este modo de generación de NADH es que no es posible una configuración estable de los reactivos en un único vial.
Hasta cierto punto, F. Hoffmann La Roche AG han solucionado este problema fraccionando el sistema del reactivo en 2 viales. El primer reactivo comprende, en el caso de la cuantificación de amoníaco, NADP^{+} y G-6-P, y el segundo reactivo comprende \alpha-cetoglutarato, G6PDH y GLDH. La reacción de determinación según esto tiene lugar de la siguiente manera:
1
en donde (A) y (B) representan rutas alternativas equivalentes.
Sin embargo, quedan dificultades por solucionar con este sistema de reactivos. Aparte del hecho de que se requieren dos viales de reactivos, aumentando con ello el coste, inventario y desechos, se requieren niveles muy precisos de glucosa-6-fosfato y además, el sistema está limitado a su uso en analizadores químicos específicos. En el momento en el que los reactivos se mezclan, la generación de NADH a partir de NAD^{+} tiene lugar por agotamiento de la glucosa-6-fosfato. Debido a que la glucosa-6-fosfato se agota de esta manera, la estabilidad del reactivo mezclado podría verse seriamente afectada si los dos reactivos se mezclasen pero no se utilizasen de manera inmediata. Si se encuentran presentes niveles no exactos o en exceso de glucosa-6-fosfato, el momento asociado con la incubación del reactivo se vuelve crítico. Los resultados pueden ser cambios en absorbancia falsamente bajos y resultados enormemente inexactos.
Una solución descrita con anterioridad, que también se refiere a la medida de niveles de analitos, descrita en la Patente de EE.UU. 4.394.449 de Modrovich, usa parejas de sustrato/enzima para generar la coenzima reducida como lo hace la disolución de Roche, aunque en este caso, la glucosa-6-fosfato se genera a partir de glucosa de acuerdo con la siguiente reacción:
D-glucosa + ATP 
\hskip0,3cm
\xrightarrow{\textstyle{hexoquinasa}} 
\hskip0,3cm
ADP + glucosa-6-fosfato
El NAD^{+} reacciona a continuación con la glucosa-6-fosfato formada en presencia de la enzima glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa para formar NADH. Modrovich también incluye tanto NADH como NAD^{+} en la formulación de manera que cuando el NADH se oxida o se destruye, el NAD^{+} presente en el reactivo contribuye a la regeneración de NADH. Este reactivo es también un reactivo en dos viales.
Una alternativa previa es la proporcionada por Klose y col. en la Patente de EE.UU. 4.019.961. Esta invención se basa en la existencia de distintas etapas de reacción independientes y en un sistema enzimático de regeneración de NADH. Este sistema tiene el inconveniente de depender de llevar a cabo distintas etapas de reacción y etapas de separación que hacen que el ensayo sea muy largo. Además, este sistema de reactivos solamente es adecuado en el caso de sustratos que pueden ser fosforilados.
El problema general asociado con el mecanismo de generación de NADH y NADPH adoptado por cada una de las invenciones descritas en lo que antecede, es decir,
NAD^{+} + glucosa-6-fosfato 
\hskip0,3cm
\xrightarrow{\textstyle{G-6-PDH}} 
\hskip0,3cm
NADH + 6-fosfogluconato + H^{+}
es que una reacción en una sola etapa, usando un único vial, no es posible porque tan pronto como el suero del paciente se añade al reactivo, se producen dos reacciones simultáneas:
(a) un descenso en absorbancia debido al NADH (o NADPH) que se convierte en NAD^{+} (o en NADP^{+}),
(b) la generación de NADH (NADPH) a partir de NAD^{+} (NADP^{+}) que da como resultado un aumento en absorbancia.
Estas dos reacciones tienen lugar a velocidades similares siendo el resultado neto un cambio en absorbancia falsamente bajo y unos resultados enormemente inexactos.
De acuerdo con lo anteriormente expuesto, es un objetivo de esta invención proporcionar un sistema de reactivo para usar en la determinación de los niveles de un analito en suero que mejora sustancialmente los problemas de sistemas de reactivos de la técnica anterior, usados en análisis enzimáticos de niveles de analitos en suero, que se basaban en la oxidación de una coenzima, en particular los problemas que se refieren a la contaminación endógena o exógena del reactivo. Es un objetivo más de esta invención, proporcionar un método mejorado para determinar la concentración de niveles de analitos en una muestra procedente de un paciente, solucionando este método los problemas asociados con métodos de la técnica anterior que incluían la oxidación prematura de la coenzima determinante y la necesidad de un sistema de viales múltiples para minimizar la degradación del reactivo. El documento WO 95/07999 que fue presentado por el solicitante, describía y reivindicaba un reactivo para la determinación enzimática de los niveles de bicarbonato en suero en un paciente, en el que se mide el grado de oxidación de una coenzima, caracterizado porque dicho reactivo esta estabilizado contra la oxidación por medio de un sistema de reducción de la coenzima, que comprende una pareja de enzima y sustrato seleccionada de manera que permite la regeneración continua de dicha coenzima durante el almacenamiento de dicho reactivo, así como una mejora en un método enzimático de determinación de la concentración de bicarbonato en suero en una muestra de fluido corporal, en el que se mide el grado de oxidación de la coenzima, comprendiendo la mejora la estabilización de un reactivo que comprende dicha coenzima, contra la oxidación, por medio de un sistema de reducción de la coenzima que comprende una pareja de enzima y sustrato seleccionada de manera que permite la regeneración continua de dicha coenzima durante el almacenamiento de dicho reactivo.
El solicitante en la actualidad ha encontrado que, cuando se usa un reactivo de este tipo para la determinación enzimática de concentraciones de analitos en general en muestras de fluidos corporales, y el sistema de reducción de la coenzima es un sistema en el que no se genera fosfato libre, es esencial incorporar al reactivo iones de fosfato libres.
Por lo tanto, la presente invención proporciona un reactivo para la determinación enzimática de la concentración de un analito en un paciente, en la que se mide el grado de oxidación de una coenzima, estando dicho reactivo estabilizado contra la oxidación por medio de un sistema de reducción de la coenzima que comprende una pareja de enzima y sustrato seleccionada de manera que permite la regeneración continua de dicha coenzima durante el almacenamiento de dicho reactivo, caracterizado porque el sistema de reducción de la coenzima es un sistema en el que no se genera fosfato libre, y porque el reactivo carece inicialmente de fosfato libre y se incorporan iones fosfato libres al reactivo.
La invención proporciona además un método enzimático para determinar la concentración de un analito en una muestra de fluido corporal, en el que se mide el grado de oxidación de una coenzima, comprendiendo el método estabilizar un reactivo que comprende dicha coenzima contra la oxidación por medio de un sistema de reducción de la coenzima que comprende una pareja de enzima y sustrato seleccionada de manera que permite la regeneración continua de dicha coenzima durante el almacenamiento de dicho reactivo, caracterizado porque el sistema de reducción de la coenzima es un sistema en el que no se genera fosfato libre, y porque el reactivo carece inicialmente de fosfato libre y se incorporan iones fosfato libres al reactivo.
La invención también proporciona el uso de un reactivo, en el que se mide el grado de oxidación de una coenzima, para la determinación enzimática de la concentración en una muestra de fluido corporal, de un analito seleccionado entre una transaminasa, aspartato-transaminasa, alanina-transaminasa, urea y amoníaco, estando dicho reactivo estabilizado contra la oxidación por medio de un sistema de reducción de la coenzima que comprende una pareja de enzima y sustrato seleccionada de manera que permite la regeneración continua de dicha coenzima durante el almacenamiento de dicho reactivo, en el que el sistema de reducción de la coenzima es un sistema en el que no se genera fosfato libre, y el reactivo carece inicialmente de fosfato libre y se incorporan iones fosfato libres al reactivo.
Los reactivos pueden ser en particular reactivos para la determinación enzimática de la concentración de una transaminasa en un paciente, para la determinación enzimática de la concentración de aspartato-transaminasa en un paciente, para la determinación enzimática de la concentración de alanina-aminotransferasa en un paciente, para la determinación enzimática de la concentración de urea en un paciente o para la determinación enzimática de la concentración de amoníaco en un paciente, comprendiendo el sistema de reducción de la coenzima en cada uno de los casos una pareja de enzima y sustrato seleccionada de manera que permite la regeneración continua de dicha coenzima durante el almacenamiento de dicho reactivo.
Preferiblemente, el sistema de reducción de la coenzima comprende una enzima y un sustrato, presentando dicha enzima una especificidad incompleta por dicho sustrato, produciéndose con ello una tasa reducida de reactividad cruzada.
El reactivo está preferiblemente en una configuración en un vial único.
A lo largo de esta memoria descriptiva, la expresión "especificidad incompleta" se usa con respecto a parejas de enzima y sustrato en las que el sustrato seleccionado no es el sustrato natural de la enzima seleccionada, y por ello presenta una especificidad cruzada menor que el 100% con respecto a la enzima concerniente.
Esta invención se afirma en el descubrimiento de que uniendo una enzima y un sustrato que presentan una especificidad incompleta entre ellos, la velocidad de reducción de la coenzima se retarda considerablemente. Retardando la reacción de reducción, los componentes esenciales del reactivo pueden estar contenidos en un único vial de almacenamiento, estando los contenidos estabilizados contra la contaminación por medio de la regeneración continua de la coenzima a un nivel bajo. Retardando el procedimiento, la regeneración de NADH o de NADPH puede tener lugar sin que se afecte la medida de los analitos. La regeneración puede tener lugar en el reactivo cuando no se usa y la velocidad a la que la regeneración tiene lugar puede someterse a un ajuste fino ajustando la naturaleza de la pareja de enzima/sustrato seleccionada y los niveles de la misma.
En una realización alternativa de la invención, se proporciona un reactivo para usar en una determinación enzimática de la concentración de un analito en un paciente en la que se mide el grado de oxidación de una coenzima, caracterizado porque dicho reactivo está estabilizado contra la oxidación por medio de un sistema de reducción de la coenzima que comprende una pareja de enzima y sustrato seleccionada de manera que permite la regeneración de dicha coenzima a una velocidad de 0,01 - 0,9 mAb/min a 340 nm.
Preferiblemente la velocidad de regeneración de un reactivo según este aspecto de la invención es 0,05 - 0,4 mAb/min, y muy preferiblemente la velocidad de regeneración es 0,05 - 0,25 mAb/min a temperatura ambiente (18ºC -
25ºC) y a 340 nm.
En una realización preferida de la invención, el grado de especificidad entre el sustrato y la enzima del sistema de reducción de la coenzima es preferiblemente menor que el 100%, más preferiblemente menor que el 50% y muy convenientemente menor que el 10% en relación equimolar. De manera óptima, se puede usar una pareja de enzima/sustrato que presente una reactividad cruzada menor que el 5% en relación equimolar.
Las coenzimas preferiblemente usadas en el reactivo según la invención son el dinucleótido reducido de nicotinamida y adenina (NADH) y el fosfato del dinucleótido reducido de nicotinamida y adenina (NADPH) aunque también pueden ser adecuados análogos de coenzimas tales como el fosfato del dinucleótido de nicotinamida e hipoxantina o el tio-NADH).
Sorprendentemente, se ha encontrado que los reactivos de la invención proporcionan una ventaja adicional, en particular los reactivos para la determinación de amoníaco y urea. Los niveles de NADH y/o NADPH pueden agotarse en los reactivos para la determinación de urea y amoníaco debido a la presencia de amoníaco contaminante, introducido con el agua utilizada para reconstituir los reactivos en polvo. Asimismo, el amoníaco presente en el aire que se disuelve en los reactivos líquidos para la determinación de urea/amoníaco con el tiempo agotará los niveles de NADH y/o NADPH. La presencia de amoníaco contaminante en los reactivos para la determinación de amoníaco y urea no sólo puede dar lugar a determinaciones inexactas de urea y amoníaco sino que puede significar que la reacción con \alpha-cetoglutarato y NADH en presencia de GLDH tenga lugar antes de que las muestras se hayan añadido. Esto conduce a unos niveles agotados de NADH o NADPH y con ello puede conducir a errores al determinar las concentraciones de amoníaco y urea en las muestras. Sin embargo, la presente invención permite retirar el amoníaco contaminante y permite también la regeneración del NADH o NADPH para posibilitar una determinación exacta de las concentraciones de amoníaco y urea en muestras procedentes de pacientes.
Las enzimas preferiblemente utilizadas en el sistema de reducción de la coenzima para determinar el contenido de una transaminasa en una muestra de suero pueden ser glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa (G-6-P-DH) o glucosa-deshidrogenasa.
Las enzimas preferiblemente utilizadas en el sistema de reducción de la coenzima para determinar el contenido de urea o amoníaco en una muestra de suero pueden ser glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa (G-6-P-DH) o glucosa-deshidrogenasa.
También pueden ser adecuadas enzimas tales como formiato-deshidrogenasa, glicerol-deshidrogenasa, leucina-deshidrogenasa, L-alanina-deshidrogenasa, 3\alpha-hidroxi-esteroide-deshidrogenasa, L-lactato-deshidrogenasa (pro-
cedente de Lactobacillus sp.) o glicerol-3-fosfato-deshidrogenasa. La enzima preferida usada en los reactivos para determinación de los niveles de transaminasas/amoníaco y urea es la glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa. Esta enzima se puede obtener procedente de cualquier fuente adecuada tal como, Leuconostoc mesenteroides, Bacillus stearothermophilus, Zymomonas mobilius o levaduras.
Estas enzimas derivan preferiblemente de fuentes microbianas. Se ha encontrado que la incorporación en el reactivo de enzimas procedentes de fuentes microbianas minimiza la presencia de contaminantes endógenos tales como la NADH-oxidasa y proteasas que en épocas anteriores afectaban seriamente la estabilidad de los reactivos. Las enzimas microbianas tienen también la ventaja añadida de ser más termoestables mejorando con ello su estabilidad a largo plazo en disolución.
La fuente más preferida de la glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa es Leuconostoc mesenteroides. Cuando se usa la glucosa-6-fosfato procedente de Bacillus stearothermophilus o de Zymomonas mobilus, la velocidad de la reacción disminuye. De manera similar, si se usa levadura como fuente de glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa, se debe usar la coenzima NADPH como alternativa a NADH ya que la glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa de levaduras es solamente específica para NADP^{+}. La cantidad apropiada de glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa presente en los reactivos según la invención variará de acuerdo con la velocidad de regeneración deseada. En el caso del reactivo para la determinación de AST, sin embargo, es particularmente preferida una cantidad de aproximadamente 2.000 U/litro para permitir el deterioro con el tiempo en disolución. En el caso del reactivo para la determinación de ALT, la concentración particularmente preferida es 2.000 U/litro. Una concentración preferida para el reactivo de determinación de urea es 2.000 U/litro y una concentración preferida para el reactivo de determinación de amoníaco es 3.500 U/litro.
Sin olvidar que la selección del sustrato y la enzima debe hacerse de manera que en el sistema de reducción de la coenzima tengan una especificidad incompleta entre ellos, los sustratos adecuados para usar en el reactivo según la invención incluyen ribosa-5-fosfato, glucosa-1-fosfato, ácido 6-fosfoglucónico, 2-desoxiglucosa-6-fosfato, 2-desoxi-2-fluoroglucosa-6-fosfato, 2-desoxi-2-cloroglucosa-6-fosfato, 2-desoxi-2,2-difluoroglucosa-6-fosfato, 2-O-metilglucosa-6-fosfato, manosa-6-fosfato, glucosamina-6-fosfato, 3-desoxiglucosa-6-fosfato, 3-desoxi-3-fluoro-glucosa-6-fosfato, 3-O-metilglucosa-6-fosfato, alosa-6-fosfato, ahrosa-6-fosfato, 4-desoxi-4-fluoroglucosa-6-fosfato, galactosa-6-fosfato, 5-tio-glucosa-6-fosfato, análogos de fosfonato, glucosa-6-estalato, \beta-D-glucosa, D-galactosa, 2-desoxiglucosa, arabinosa, xilosa, 1-sorbosa, D-manosa, D-fructosa, D-galactosa, D-sorbital, D-manitol, sacarosa, inositol, maltosa.
Usando NADH como la coenzima preferida en el reactivo, la combinación enzima/sustrato preferida es glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa (G-6-P-DH)/D-glucosa. Sustratos preferidos, alternativos a la D-glucosa, son los sustratos para los que, en relación con la especificidad entre glucosa-6-fosfato (G-6-P) y la G-6-P-DH, la velocidad de reacción entre la enzima G-6-P-DH y el sustrato seleccionado es menor que el 50%, más preferiblemente menor que el 10%, y muy preferiblemente menor que el 5%. De nuevo, sin olvidar la velocidad de regeneración requerida, el nivel de D-glucosa más apropiado para los reactivos según la invención, y por lo tanto el preferido, es aproximadamente 100 mmoles/litro aunque se pueden usar niveles de hasta 1.000 mmoles/litro. La solubilidad de la D-glucosa en el reactivo se convierte en un problema a los niveles de concentración más altos.
Cuando se usa la combinación preferida de D-glucosa/glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa, los iones de fosfato potásico se pueden introducir en la composición en forma de fosfato potásico dibásico. Un nivel variable de iones fosfato puede ser adecuado dependiendo de la velocidad de regeneración deseada. Sin embargo, cuando la concentración de D-glucosa es aproximadamente 100 mmoles/litro (pero puede variar entre 20 y 200 mmoles/litro) por ejemplo, y el nivel correspondiente de glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa es aproximadamente 2.000 U/litro (pero puede variar entre 500 y 3.500 U/litro), el nivel de iones fosfato que puede ser adecuado puede variar entre 2,0 mmoles/litro hasta 20 mmoles/litro. Al aumentar la concentración de iones fosfato se aumentará la velocidad de regeneración. El nivel preferido de adición de iones fosfato es aproximadamente 10 mmoles/litro para la determinación de AST y aproximadamente 5 mmoles/litro para la determinación de ALT. En el caso del reactivo para la determinación de urea, la concentración preferida de iones fosfato es aproximadamente 5 mmoles/litro y es también aproximadamente 5 mmoles/litro en el caso del reactivo para la determinación de amoníaco.
Cuando se utiliza la combinación preferida de D-glucosa y glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa se utiliza, o en realidad, en cualquier sistema en el que no se genera fosfato libre, es esencial incorporar al reactivo iones fosfato libres. En particular, los iones fosfato libres se requieren para formar un complejo no específico con D-glucosa para iniciar la regeneración en presencia de glucosa-6-fosfato deshidrogenasa.
Una de las alternativas preferidas al uso de D-glucosa/G-6-P-DH es el uso de la glucosa-deshidrogenasa (GLD) conforme a la siguiente reacción en la que D-glucosa constituye el 100% de sustrato en el reactivo:
D-glucosa + NAD^{+} 
\hskip0,3cm
\xrightarrow{\textstyle{GLD}} 
\hskip0,3cm
D-glucono-\alpha -lactona + NADH + H^{+}
Si como enzima se usa glucosa-deshidrogenasa, los sustratos preferidos para la reducción de la coenzima NAD^{+}, y su grado relativo de reactividad cruzada, comparado con el de la D-glucosa, son:
\newpage
Sustrato Actividad relativa
xilosa 8,9%
L-sorbosa 0,3%
D-manosa 2,4%
D-fructuosa 0,8%
D-galactosa 0,1%
D-lactosa 1,2%
D-sorbitol 0,1%
inositol 0,2%
maltosa 3,9%
en donde las cifras representan la velocidad de reacción relativa con respecto a la de la glucosa-deshidrogenasa en presencia del sustrato natural 1\beta-D-glucosa.
Como alternativa, usando como enzima glicerol-deshidrogenasa (GLY-DH), los sustratos adecuados en la reacción:
glicerol + NAD^{+} 
\hskip0,3cm
\xrightarrow{\textstyle{GLY.DH}} 
\hskip0,3cm
dihidroxiacetona + NADH + H^{+}
y sus actividades relativas con respecto al glicerol (el 100%) son:
Sustrato Actividad relativa
\alpha-Monoclorohidrina de glicerol 48,5%
Etilenglicol 7,8%
2,3-Butanodiol 52,6%
y cuando la leucina-deshidrogenasa (L.D) se usa como enzima según la reacción:
sustrato + NAD^{+} + H_{2}O 
\hskip0,3cm
107 
\hskip0,3cm
\alpha-cetoisocaproato + NH_{3} + NADH + H^{+}
los sustratos adecuados y sus actividades relativas con respecto a la L-leucina (el 100%) son:
Sustrato Actividad relativa
L-valina 74%
L-isoleucina 58%
L-norvalina 41%
L-norleucina 10%
L-metionina 0,6%
L-cisteína 0,3%
Cuando la L-alanina-deshidrogenasa (A-D) se usa como enzima en un sistema de reacción similar al usado para la leucina-deshidrogenasa, un sustrato adecuado y su actividad relativa con respecto a la de la L-alanina (el 100%) es:
Sustrato Actividad relativa
L-serina 5%
La 3\alpha-hidroxiesteroide-deshidrogenasa (H-DH) se puede también usar como enzima en combinación con los sustratos listados a continuación. Sus actividades relativas con respecto a la del ácido cólico también aparecen listadas.
\newpage
Sustrato Actividad relativa
Ácido litocólico 96%
Ácido etiocólico 60%
Cuando la L-lactato-deshidrogenasa (LDH) de Lactobacillus sp se usa como la enzima de la siguiente reacción,
piruvato + NADH + H^{+} 
\hskip0,3cm
\xrightarrow{\textstyle{LDH}} 
\hskip0,3cm
L-lactato + NAD^{+}
los sustratos adecuados y sus actividades relativas con respecto a la de L-lactato son:
Sustrato Actividad relativa
2-oxoglutarato 0,09%
oxoloacetato 36%
Cuando NADP^{+} es la coenzima, por ejemplo procedente de levaduras, las combinaciones preferidas de sustrato/enzima son:
G-6-P-DH/galactosa-6-P 25%
G-6-P-DH/2-desoxiglucosa-6-P 18%
G-6-P-DH/glucosamina-6-P 2%
Las cifras del lado derecho representan la reactividad relativa con respecto a la de la pareja G-6-P-DH/G-6-P.
También es posible usar NADP^{+} como coenzima para juntar una pareja de enzima/sustrato de la glicerol-3-P-deshidrogenasa con el fostato de dihidroxiacetona.
Según se ha descrito en el preámbulo de esta memoria descriptiva, lo demás requerimientos de un reactivo según la invención, para usar en la determinación de los niveles de AST en suero, son lactato-deshidrogenasa, dinucleótido de nicotinamida-adenina reducido (NADH), malato-deshidrogenasa (MDH), aspartato y 2-oxiglutarato. En el caso de la determinación de ALT, no se requiere la malato-deshidrogenasa y en lugar de aspartato se requiere L-alanina. En el caso del reactivo para la determinación de urea, también se requieren ureasa y \alpha-cetoglutarato, mientras que el \alpha-cetoglutarato también se requiere en el reactivo para la determinación de amoníaco.
El aspartato se encuentra disponible en forma de diversas sales, tales como las sales de sodio y de potasio. La sal preferida según la invención es la sal de potasio ya que resulta ser más soluble y menos hidratada que la sal de potasio. Un intervalo de concentraciones que puede ser aceptable en los reactivos de la invención es 180 - 240 mmoles/litro. La más preferida es una concentración final de aproximadamente 200 mmoles/litro y se indica que éste es el nivel recomendado por la IFCC.
El intervalo del 2-oxoglutarato que se considera que es más preferido para los reactivos de la invención es de aproximadamente 1 - 15 mmoles/litro, aunque se indica que altas concentraciones de este sustrato podrían limitar la cantidad de NADH que se puede añadir a la composición, ya que el 2-oxoglutarato absorbe a 340 nm, aportando una absorbancia de fondo a la absorbancia del NADH. Limitando la cantidad del 2-oxoglutarato añadido a la composición, el reactivo se puede utilizar sin dificultad en la mayoría de analizadores espectrales. Una concentración preferida de este sustrato para los reactivos de determinación de AST y ALT es aproximadamente 12 mmoles/litro, que es de nuevo el nivel recomendado por la IFCC. Para los reactivos de determinación de urea y amoníaco, la concentración preferida es aproximadamente 7,5 mmoles/litro.
La cantidad de alanina presente en el reactivo para la determinación de ALT está gobernada en cierta medida por la solubilidad de este componente. En particular, un intervalo preferido es 200 - 500 mmoles/litro aunque en el extremo superior del intervalo no se observa un aumento apreciable en la actividad catalítica. La concentración más preferida de este sustrato es aproximadamente 400 mmoles/litro a causa de la solubilidad de esta sustancia.
El nivel de coenzima presente en el reactivo variará conforme a los siguientes factores:
\bullet
la linealidad requerida en la medida
\bullet
la longitud de onda elegida
\bullet
la proporción de la muestra con respecto al volumen del reactivo
\bullet
el sistema fotométrico del analizador seleccionado.
En general, cuando se aumenta el volumen de la muestra, mejora la sensibilidad pero disminuye la linealidad de la lectura obtenida, mientras que cuando se disminuye el volumen de la muestra, mejora la linealidad a expensas de perder sensibilidad.
La longitud de onda preferida de la medida es 320 - 400 nm, aunque sin embargo, el nivel de la coenzima usada se debe ajustar de manera que la absorbancia preferiblemente no exceda 2,0 A. La longitud de onda de absorbancia preferida según la invención es 340 nm.
La MDH se obtiene preferiblemente de fuentes microbianas de manera que se limita el riesgo de una contaminación endógena y porque esta enzima exhibe características superiores en relación con la estabilidad térmica. Los niveles apropiados están en el intervalo de 150 - 1.500 U/litro, más preferiblemente de 200 - 800 U/litro. El nivel más preferido según la invención es de 250 U/litro.
En el reactivo para la determinación de AST, la LDH participa en la retirada del piruvato endógeno de la muestra. El nivel de LDH preferiblemente incorporado al reactivo de la invención para la determinación de AST, fue tal que una concentración de piruvato de 1,0 mmoles/litro de muestra, se aclaró en 1 minuto utilizando una proporción de muestra frente a reactivo de 1:10. Se determinó que este nivel era de aproximadamente 2.000 U/litro.
En el reactivo para la determinación de ALT, la LDH participa en dos reacciones, (i) la reacción acoplada a una enzima para medir ALT, y (ii) la retirada del piruvato endógeno de la muestra. El nivel de la LDH incorporada, al igual que en el caso del reactivo para la determinación de AST, fue tal que el reactivo pueda retirar una concentración de piruvato de la muestra de hasta 1,0 mmoles/litro en 1 minuto. La reacción principal se puede luego medir pasado 1 minuto sin la interferencia del piruvato endógeno de la muestra. El nivel mínimo de LDH, requerido para el aclaramiento del piruvato endógeno, se determinó que era de aproximadamente 1.500 U/litro. La cantidad preferida incorporada al reactivo de la invención para la determinación de ALT fue de aproximadamente 2.000 U/litro.
En el reactivo para la determinación de urea, la actividad mínima requerida de ureasa a pH 8,5, utilizada como enzima no limitante de la velocidad en el modo cinético del ensayo, es de aproximadamente 5.000 U/litro. Se pueden incluir cantidades que excedan a ésta para aumentar la estabilidad del reactivo a largo plazo.
El modo preferido de medida del analito en los reactivos para la determinación de urea y amoníaco está basado en principios cinéticos. Debido a que la glutamato-deshidrogenasa (GLDH) es la enzima limitante de la velocidad en la formulación, el nivel de actividad de GLDH incluida en el reactivo es crítico para la linealidad del ensayo. El nivel de actividad de GLDH requerido variará también en función del pH del sistema del reactivo. Un intervalo adecuado de actividad de GLDH puede variar entre 250 - 10.000 U/litro. Las enzimas más adecuadas son las de orígenes microbianos, ya que las preparaciones comerciales de GLDH procedente de fuentes animales, normalmente son menos estables y es probable que contengan niveles más altos de actividad de NADH-oxidasa como contaminante. La actividad de GLDH preferida para el reactivo de determinación de la urea, a pH 8,50, es de aproximadamente 500 U/litro, y para el reactivo de determinación de amoníaco, a pH 8,50, es aproximadamente de 8.500 U/litro.
Los reactivos según la invención pueden incluir además del sistema de reducción de la coenzima y de otros sustratos y enzimas esenciales, necesarias para determinar la concentración del analito, agentes conservantes, agentes quelantes, agentes tensioactivos, inhibidores de proteasas, tampones, cofactores, agentes antibacterianos y otros constituyentes que ejercen funciones que mejoran la estabilidad pero que no afectan materialmente a las características de la invención.
El principal criterio para seleccionar un tampón es que como tal tenga una buena capacidad de tamponamiento al pH seleccionado, con una unión mínima de cationes divalentes. El pH y el sistema tampón para los reactivos de determinación de AST y ALT se seleccionan conforme a las recomendaciones de la Federación Internacional de Química Clínica (IFCC) (del inglés, " International Federation of Clinical Chemistry") para la medida de transaminasas. Una regla general es que un tampón se puede considerar efectivo si su pKa es de \pm 1,0 unidades de pH a partir de su pH elegido. Un pH preferido del reactivo según la invención es 7 - 9. En el caso de la aspartato-transaminasa, la actividad catalítica óptima tiene lugar a aproximadamente pH 7,0 - 8,2 a 30ºC. El pH más preferido para el reactivo de determinación de AST es de aproximadamente 8,1 \pm 0,1 a 20ºC ya que a este pH la NADH es estable. En el caso del reactivo para la determinación de ALT, la actividad catalítica máxima tiene lugar a un intervalo de pH de aproximadamente 7,3 - 7,9 a 20ºC. El pH más preferido para el reactivo de determinación de ALT es aproximadamente 7,7 a 20ºC. A estos pH preferidos se alcanza un compromiso entre la actividad enzimática óptima y la estabilidad de las enzimas y de la coenzima en la disolución. Un pH más bajo puede producir una mayor degradación de la coenzima.
El sistema tampón preferido para el reactivo de determinación de urea es Tris a pH 8,50, aunque el intervalo de pH 7,5 - 9,5 puede ser considerado aceptable. La concentración preferida del tampón para una capacidad de tamponamiento efectiva es Tris 100 mM, aunque se puede usar el intervalo de Tris 20 mM - 200 mM. Una amplia gama de tampones alternativos se puede usar en este sistema de reactivo, que proporcionan una capacidad de tamponamiento efectiva dentro del intervalo de pH 7,5 - 9,5.
El sistema tampón preferido para el reactivo de determinación de amoníaco es Tris a pH 8,5 - 9,0, aunque cualquier valor del intervalo de pH 7,5 - 9,5 se puede considerar aceptable. La concentración preferida del tampón para obtener una capacidad de tamponamiento efectiva es Tris 100 mM, aunque se puede usar cualquier valor del intervalo de Tris 20 mM - 200 mM.
Los tampones adecuados para los reactivos de determinación de AST y ALT incluyen HEPES, ácido 4-morfolin-propanosulfónico (MOPS) o ácido 2-[tris(hidroximetil)metilamino]-1-etano-sulfónico (TES) o dietanolamina u otros tampones de GOOD, Tricina, Bicina, TEA y TAPS, TAPSO y POPSO. El tampón preferido según la invención es TRIS con una concentración total preferiblemente de 30 - 150 mmoles/litro, y más preferiblemente de aproximadamente 70 - 100 mmoles/litro, aunque la concentración de 80 mmoles/litro es la preferida. A concentraciones más altas de tampón, la AST es inhibida de manera progresiva. Se indica que los tampones de fosfato parecen aumentar la velocidad de la descomposición del NADH e inhibir la asociación del piridoxal-5-fosfato (P-5-P) con la apoenzima de la transaminasa. La muestra a ensayar se puede diluir con un diluyente adecuado si se desea, tal como agua desionazada o disolución salina. Además de los tampones anteriormente mencionados, adecuados para los reactivos de determinación de AST y ALT, los siguientes tampones de GOOD son también adecuados para los reactivos de determinación de amoníaco y urea: CAPSO, CHES y AMPSO.
Son adecuados agentes conservantes tales como azida sódica (NaN_{3}), ácido hidroxibenzoico, gentamicina, Timol y agentes conservantes libres de mercurio, disponibles procedentes de Boehringer Mannheim, tales como metilisotiazolona. El nivel apropiado es aquel en el que el agente conservante conserva sus propiedades conservantes durante al menos 6 - 8 meses cuando se almacena a 2ºC - 8ºC sin inhibir las enzimas presentes en el reactivo. Un intervalo adecuado que satisface estos criterios es 0,1 - 1,0 g/litro.
Diversos agentes quelantes tales como EDTA, EGTA, ácido N-(2-hidroxietil)-etilendiaminotriacético (HEDTA), etc., son también adecuados como agentes estabilizantes inespecíficos. En los reactivos para la determinación de AST y ALT de la invención, se ha usado preferiblemente EDTA a un nivel de aproximadamente 2,0 - 10,0 mmoles/litro para estbilizar el 2-oxoglutarato. El EDTA se encuentra también disponible en forma de sal tetrasódica así como en forma de sal de potasio, pero la sal preferida según la invención es la sal disódica. En los reactivos para la determinación de urea y amoníaco, el EDTA está presente en el intervalo de 0,2 mM a 10 mM. Una concentración particularmente preferida de EDTA es 1 mM.
En los reactivos de la invención también se pueden incorporar agentes estabilizantes de enzimas. Un agente estabilizante preferido es la albúmina de suero bovino, de grado libre de proteasas. Otros agentes estabilizantes adecuados pueden incluir gammaglobulina bovina, N-acetilcisteína y glicerol.
También se pueden añadir, si se desea, agentes desespumantes adecuados. Los tensioactivos que se pueden usar incluyen tensioactivos zwitteriónicos y tensioactivos no iónicos en niveles que no inhiben las enzimas presentes en los reactivos.
En otro aspecto de la invención, se proporciona una mejora en un método enzimático para determinar la concentración de un analito en una muestra de fluido corporal, en el que se mide el grado de oxidación de una coenzima, comprendiendo la mejora estabilizar un reactivo que comprende dicha coenzima, contra la oxidación, por medio de un sistema de reducción de la coenzima que comprende una pareja de enzima y sustrato seleccionada de manera que permite la regeneración continua de dicha coenzima durante al almacenamiento de dicho reactivo.
También se proporciona una mejora de un método enzimático para determinar la concentración de una transaminasa en una muestra de fluido corporal, en el que se mide el grado de oxidación de una coenzima, comprendiendo la mejora estabilizar un reactivo que comprende dicha coenzima, contra la oxidación, por medio de un sistema de reducción de la coenzima que comprende una pareja de enzima y sustrato seleccionada de manera que permite la regeneración continua de dicha coenzima durante al almacenamiento de dicho reactivo.
También se proporciona una mejora en un método enzimático para determinar la aspartato-aminotranferasa en una muestra de fluido corporal, en el que se mide el grado de oxidación de una coenzima, comprendiendo la mejora estabilizar un reactivo que comprende dicha coenzima, contra la oxidación, por medio de un sistema de reducción de la coenzima que comprende una pareja de enzima y sustrato seleccionada de manera que permite la regeneración continua de dicha coenzima durante al almacenamiento de dicho reactivo.
También se proporciona una mejora en un método enzimático para determinar la alanina-aminotransferasa en una muestra de fluido corporal, en el que se mide el grado de oxidación de una coenzima, comprendiendo la mejora estabilizar un reactivo que comprende dicha coenzima, contra la oxidación, por medio de un sistema de reducción de la coenzima que comprende una pareja de enzima y sustrato seleccionada de manera que permite la regeneración continua de dicha coenzima durante al almacenamiento de dicho reactivo.
También se proporciona una mejora en un método enzimático para determinar la concentración de urea en una muestra de fluido corporal, en el que se mide el grado de oxidación de una coenzima, comprendiendo la mejora estabilizar un reactivo que comprende dicha coenzima, contra la oxidación, por medio de un sistema de reducción de la coenzima que comprende una pareja de enzima y sustrato seleccionada de manera que permite la regeneración continua de dicha coenzima durante al almacenamiento de dicho reactivo.
También se proporciona una mejora en un método enzimático para determinar la concentración de amoníaco en una muestra de fluido corporal, en el que se mide el grado de oxidación de una coenzima, comprendiendo la mejora estabilizar un reactivo que comprende dicha coenzima, contra la oxidación, por medio de un sistema de reducción de la coenzima que comprende una pareja de enzima y sustrato seleccionada de manera que permite la regeneración continua de dicha coenzima durante al almacenamiento de dicho reactivo.
En un método preferido según este aspecto de la invención, la enzima de la pareja de enzima y sustrato presenta una especificidad incompleta por dicho sustrato, reduciendo con ello la tasa de reactividad cruzada entre enzima y sustrato.
En una realización preferida de este aspecto de la invención, el sistema de reducción de la coenzima comprende una enzima y un sustrato que tienen una especificidad de uno con otro, en relación con la especificidad de la enzima por su sustrato natural, de menos que el 100%, preferiblemente de menos que el 50%, y muy convenientemente de menos que el 10%. De la manera más conveniente, la especificidad de la pareja enzima/sustrato entre ellos, en relación con la especificidad de la enzima por su sustrato natural, es menor que el 5%, preferiblemente de aproximadamente el 2%.
La selección de la coenzima, el sustrato y la enzima se puede hacer entre los anteriormente mencionados en relación con los reactivos de la invención, dependiendo del analito que ha de ser analizado.
En una de las realizaciones de este aspecto de la invención, los componentes preferidos del sistema de reducción de la coenzima usado para determinar la concentración del analito son NADH, G-6-P-DH y D-glucosa, de manera que la reacción de regeneración que tiene lugar es:
D-glucosa + NAD^{+} 
\hskip0,3cm
\xrightarrow{\textstyle{G-6-P-DH}} 
\hskip0,3cm
NADH + gluconolactona
Debido a la baja especificidad de la G-6-P-DH por la D-glucosa, esta reacción de regeneración es lenta y por lo tanto es no competitiva con las reacciones principales implicadas en la determinación de los niveles del analito.
Realizaciones preferidas
En una de las realizaciones preferidas de la invención, el reactivo para la determinación de ALT comprende esencialmente:
2
Además, se incluye preferiblemente tampón de TRIS, TRIS-HCl, EDTA-sal disódica, Albúmina de suero bovino y azida sódica.
Uno de los reactivos para la determinación de ALT, formulado de acuerdo con la invención, es el siguiente:
TABLA 1
Materia Prima Peso Molecular Cantidad/Litro
Tampón de TRIS 121,14 1,5 g - 3,5 g
TRIS-HCl 157,60 8,0 g - 14,0 g
L-Alanina 89,09 34,0 g - 45,0 g
\alpha-cetoglutarato, sal de Na (anhidra) 190,1 0,5 g - 3,5 g
TABLA 1 (continuación)
Materia Prima Peso Molecular Cantidad/Litro
EDTA - sal disódica 372,24 1,0 g - 3,0 g
Albúmina de suero bovino 0,1 g - 2,0 g
NADH, Na_{2}\cdot3H_{2}O 763,5 0,1 g - 0,3 g
Fosfato potásico dibásico (K_{2}HPO_{4}) 174,18 0,3 g - 1,3 g
Azida sódica 65,01 0,1 g - 1,0 g
LDH microbiana 2.000 U - 5.000 U
G-6-P-DH 200 U - 3.000 U
D-Glucosa 180,16 15,0 g - 21,0 g
En particular, uno de los reactivos preferidos para la determinación de ALT según la invención se formula de la siguiente manera:
TABLA 2
Materia Prima Peso Molecular Concentración Cantidad/Litro
Tampón de TRIS 121,14 18 mM 2,18 g
TRIS-HCl 157,60 70 mM 11,03 g
L-Alanina 89,09 440 mM 39,20 g
\alpha-cetoglutarato, sal de Na (anhidra) 190,1 13,2 mM 2,51 g
EDTA-Sal disódica 372,24 5,5 mM 2,04 g
Albúmina de suero bovino 0,1% 1,00 g
NADH, Na_{2}\cdot3H_{2}O 763,5 0,26 mM 0,199 g
Fosfato potásico dibásico (K_{2}HPO_{4}) 174,18 5 mM 0,87 g
Azida sódica 65,01 7,7 mM 0,50 g
LDH microbiana 4.000 U
G-6-P-DH 2.000 U
D-glucosa 180,16 100 mM 18,016 g
Esta formulación está concentrada al 10% para permitir la dilución de la muestra.
En una de las realizaciones preferidas de la invención, el reactivo para la determinación de AST comprende esencialmente:
3
Además, se incluye preferiblemente tampón de TRIS, TRIS-HCl, EDTA-sal disódica, Albúmina de suero bovino y azida sódica.
Uno de los reactivos para la determinación de AST, formulado de acuerdo con la invención, es según se expone a continuación:
TABLA 3
Materia Prima Peso Molecular Cantidad/Litro
Tampón de TRIS 121,14 2,0 g - 6,0 g
TRIS-HCl 157,60 6,0 g - 11,0 g
L-Aspartato, sal de K 172,2 34,0 g - 43,0 g
\alpha-cetoglutarato, sal de Na (anhidra) 190,1 0,5 g - 4,5 g
EDTA - sal disódica 372,24 1,0 g - 3,0 g
Albúmina de suero bovino 0,1 g - 2,0 g
NADH, Na_{2}\cdot3H_{2}O 763,5 0,1 g - 0,3 g
Fosfato potásico dibásico (K_{2}HPO_{4}) 174,18 0,3 g - 2,0 g
Azida sódica 65,01 0,1 g - 1,0 g
LDH microbiana 1.000 U - 4.000 U
G-6-P-DH (Toyobo) Leuconostoc 1.000 U - 4.500 U
mesenteroides
D-Glucosa 180,16 15,0 g - 21,0 g
MDH microbiana 100 U - 600 U
En particular, uno de los reactivos preferidos para la determinación de AST según la invención se formula de la siguiente manera:
TABLA 4
Materia Prima Peso Molecular Concentración Cantidad/Litro
Tampón de TRIS 121,14 31,2 mM 3,78 g
TRIS-HCl 157,60 56,8 mM 8,95 g
L-Aspartato, sal de K 172,20 220 mM 37,88 g
\alpha-cetoglutarato, sal de Na (anhidra) 190,1 13,2 mM 2,51 g
EDTA-Sal disódica 372,24 5,5 mM 2,04 g
Albúmina de suero bovino 0,1% 1,00 g
NADH, Na_{2}\cdot3H_{2}O 763,5 0,26 mM 0,199 g
Fosfato potásico dibásico (K_{2}HPO_{4}) 174,18 10,0 mM 1,74 g
Azida sódica 65,01 7,7 mM 0,50 g
LDH microbiana 2.000 U
G-6-P-DH Leuconostoc mesenteroides 2.000 U
D-Glucosa 180,16 100 mM 18,016 g
MDH microbiana 200 U
Esta formulación está concentrada al 10% para permitir la dilución de la muestra.
En una realización preferida de la invención, el reactivo para la determinación de urea comprende esencialmente:
4
Uno de los reactivos para la determinación de urea, formulado de acuerdo con la invención, es el siguiente:
TABLA 5A
Materia Prima Peso Molecular Cantidad/Litro
Tampón de TRIS 121,14 5.0 g - 10,0 g
TRIS-HCl 157,60 3,5 g - 9,5 g
\alpha-cetoglutarato, sal de Na (anhidra) 190,1 0,5 g - 3,5 g
EDTA - sal disódica 372,24 0,1 g - 1,0 g
NADH, Na_{2}\cdot3H_{2}O 763,5 0,1 g - 0,3 g
Fosfato potásico dibásico (K_{2}HPO_{4}) 174,18 0,3 g - 2,0 g
TABLA 5A (continuación)
Materia Prima Peso Molecular Cantidad/Litro
Albúmina de suero bovino 0,05 - 2,0 g
Azida sódica 65,01 0,1 g - 1,0 g
D-Glucosa 180,16 3,0 g - 21,0 g
Ureasa microbiana 4.000 U - 9.000 U
GLDH (microbiana) 250 U - 1.000 U
G-6-P-DH Leuconostoc mesenteroides 1.000 U - 4.500 U
En particular, un reactivo preferido para la determinación de urea según la invención se formula de la siguiente manera:
TABLA 5B
Materia Prima Peso Molecular Concentración Cantidad/Litro
TRIS 121,14 61,3 mM 7,43 g
TRIS-HCl 157,60 38,7 mM 6,10 g
\alpha-cetoglutarato, sal de Na (anhidra) 190,1 7,5 mM 1,43 g
EDTA-Sal disódica 372,24 1,0 mM 0,372 g
NADH, Na_{2}\cdot3H_{2}O 763,5 0,28 mM 0,214 g
Fosfato potásico dibásico (K_{2}HPO_{4}) 174,18 5,0 mM 0,871
Albúmina de suero bovino 0,05% 0,50 g
Azida sódica 65,01 7,7 mM 0,50 g
D-Glucosa 180,16 100 mM 18,016 g
Ureasa (microbiana) 6.500 U
GLDH (microbiana) 500 U
G-6-P-DH Leuconostoc mesenteroides 2.000 U
En una de las realizaciones preferidas de la invención, el reactivo para la determinación de amoníaco comprende esencialmente:
5 
\newpage
Además, se incluye preferiblemente tampón de TRIS, TRIS-HCl, EDTA-sal disódica, ADP-K, albúmina de suero bovino y azida sódica.
Uno de los reactivos para la determinación de amoníaco, formulado de acuerdo con la invención, es el siguiente:
TABLA 6A
Materia prima Peso Molecular Cantidad/Litro
TRIS 121,14 5,0 g - 10,0 g
TRIS-HCl 157,60 3,5 g - 9,5 g
\alpha-cetoglutarato, sal de Na (anhidra) 190,1 0,5 g - 3,5 g
EDTA - sal disódica 372,24 0,1 g - 1,0 g
NADPH, Na_{4}\cdot4H_{2}O 905,4 0,1 g - 0,35 g
ADP-K 501,3 0 g - 1,0 g
Fosfato potásico dibásico (K_{2}HPO_{4}) 174,18 0,3 g - 2,0 g
Albúmina de suero bovino 0,05% 0,05 g - 2,0 g
Azida sódica 65,01 0,1 g - 1,0 g
D-Glucosa 180,16 3 g - 21 g
GLDH (microbiana) 6.000 U - 10.000 U
G-6-P-DH Leuconostoc mesenteroides 1.000 U - 4.000 U
En particular, uno de los reactivos preferidos para la determinación de amoníaco según la invención se formula de la siguiente manera:
TABLA 6B
Materia Prima Peso Molecular Concentración Cantidad/Litro
TRIS 121,14 61,3 mM 7,43 g
TRIS-HCl 157,60 38,7 mM 6,10 g
\alpha-cetoglutarato, sal de Na (anhidra) 190,1 7,5 mM 1,43 g
EDTA-Sal disódica 372,24 1,0 mM 0,372 g
NADPH, Na_{4}\cdot4H_{2}O 905,4 0,28 mM 0,254 g
ADP-K 501,3 2 mM 1,0 g
Fosfato potásico dibásico (K_{2}HPO_{4}) 174,18 5,0 mM 0,871 g
Albúmina de suero bovino 0,05% 0,50 g
Azida sódica 65,01 7,7 mM 0,50 g
D-Glucosa 180,16 100 mM 18,016
GLDH (microbiana) 8.500 U
G-6-P-DH Leuconostoc mesenteroides 3.500 U
Aunque se prefiere que los reactivos de la invención se formulen un una configuración de un único vial, también es posible que se formulen en una configuración de dos viales. El componente de la regeneración de la formulación necesita estar incorporado sólo en uno de los viales. En particular, la IFCC recomienda que para los reactivos de determinación de ALT y AST, el 2-oxoglutarato se formule como un componente independiente del resto de la formulación. El Reactivo A (excluyendo el 2-oxoglutarato) se puede incubar con la muestra procedente del paciente durante un período de 5 - 10 minutos, tiempo durante el cual todas las reacciones secundarias se dejan que lleguen a su terminación. Después del período de incubación, se puede añadir el 2-oxoglutarato para comenzar la reacción principal. Como alternativa al uso del 2-oxoglutarato como componente iniciador, puede ser posible usar aspartato o alanina de la misma manera, ya que la presencia del 2-oxoglutarato protege la AST o ALT de la inactivación durante las reacciones secundarias. El sistema de regeneración que comprende la pareja dispar de enzima y sustrato, se debe añadir al componente del sistema de dos viales que incluye el NADH.
Si se usa un sistema de dos viales, se recomienda que la formulación incluya P-5-P ya que durante el período de incubación, en presencia de la muestra, la adición de P-5-P al suero, activa las apo-enzimas y permite las medidas de las concentraciones totales de las actividades catalíticas de AST y ALT en el suero, con la condición de que esa saturación con P-5-P sea completa. El nivel de P-5-P preferido para usar en un sistema de dos viales es aproximadamente de 80 -
120 \mumoles/litro, siendo un nivel más preferido el de 100 \mumoles/litro.
Ejemplo 1
La estabilidad de cuatro reactivos particulares formulados de acuerdo con la invención, se ensayó de la siguiente manera:
Formulación Reactivo para la formulación de AST TABLA 7A
Tampón de TRIS 3,78 g/litro
TRIS-HCl 8,95 g/litro
Aspartato 37,88 g/litro
\alpha-cetoglutarato, sal de Na (anhidra) 2,51 g/litro
Azida sódica 0,50 g/litro
Albúmina de suero bovino 1,0 g/litro
NADH\cdotNa_{2} 3H_{2}O 0,199 g/litro
EDTA - Sal disódica 2,04 g/litro
Fosfato potásico dibásico (K_{2}HPO_{4}) 0,87 g/litro
D-Glucosa 18,016 g/litro
G-6-P-DH (L. mesenteroides) 3.500 U/litro
D-LDH (microbiana) 2.000 U/litro
NDH (microbiana) 650 U/litro
TABLA 7B
Tampón de TRIS 4,35 g/litro
TRIS-HCl 8,31 g/litro
L-Aspartato, sal de K 37,88 g/litro
\alpha-cetoglutarato, sal de Na (anhidra) 2,51 g/litro
Azida sódica 0,50 g/litro
Albúmina de suero bovino 0,50 g/litro
NADH\cdotNa_{2} 3H_{2}O 0,234 g/litro
EDTA - Sal disódica 1,86 g/litro
Fosfato potásico dibásico (K_{2}HPO_{4}) 1,74 g/litro
D-Glucosa 18,016 g/litro
G-6-P-DH (Toyobo) Leuconostoc mesenteroides 2.000 U/litro
LDH 2.000 U/litro
MDH (microbiana) 200 U/litro
Reactivo para la formulación de ALT TABLA 8A
Tampón de TRIS 2,18 g/litro
TRIS-HCl 11,0 g/litro
L-Alanina 39,2 g/litro
\alpha-cetoglutarato, sal de Na (anhidra) 2,51 g/litro
Azida sódica 0,50 g/litro
Albúmina de suero bovino 1,0 g/litro
NADH\cdotNa_{2} 3H_{2}O 0,199 g/litro
EDTA - Sal disódica 2,04 g/litro
Fosfato potásico dibásico (K_{2}HPO_{4}) 0,87 g/litro
D-Glucosa 18,016 g/litro
G-6-P-DH (Leuconoctoc mesenteroides) 3.500 U/litro
D-LDH (microbiana) 3.000 U/litro
TABLA 8B
Tampón de TRIS 3,27 g/litro
TRIS-HCl 11,03 g/litro
L-Alanina 39,2 g/litro
\alpha-cetoglutarato, sal de Na (anhidra) 2,51 g/litro
Azida sódica 0,50 g/litro
Albúmina de suero bovino 0,50 g/litro
NADH\cdotNa_{2} 3H_{2}O 0,234 g/litro
EDTA - Sal disódica 1,86 g/litro
Fosfato potásico dibásico (K_{2}HPO_{4}) 0,87 g/litro
D-Glucosa 18,016 g/litro
G-6-P-DH (Leuconostoc mesenteroides) 2.000 U/litro
LDH (microbiana) 4.000 U/litro
Condiciones de almacenamiento
Reactivos tapados y refrigerados (2ºC - 8ºC).
Parámetros espectrofotométricos (Shimadzu PC2101)
\bullet
temperatura de reacción: 37ºC
\bullet
volumen de muestra con respecto a volumen de reactivo: de 1:10 a 1:25
\bullet
longitud de onda: 340 nm
\bullet
paso de luz de la cubeta: 1 cm
La fase de latencia de la medida es de aproximadamente 1 minuto o menos y el tiempo de medida es de hasta 3 minutos post-fase de latencia.
Estos parámetros espectrofotométricos se usaron para determinar los siguientes parámetros:
\bullet
absorbancia inicial del reactivo a 340 nm
\bullet
velocidad de regeneración a 20ºC (expresada en mAb/min)
El Cobas Mira se usó para determinar las recuperaciones con estándares de control.
Se obtuvieron los siguientes resultados:
TABLA 9A
Datos de absorbancia de los reactivos para la determinación de AST y ALT mostrados en las Tablas 7A y 8A
Almacenamiento a 8ºC (semanas) Absorbancia a 340 nm
\downarrow
Reactivo para la determinación Reactivo para la determinación
de AST DE ALT
Reactivo recién preparado 1,88 1,99
1 1,77 1,95
3 1,72 1,88
6 1,65 1,78
10 1,54 1,64
15 1,40 1,46
20 1,25 1,29
25 1,18 1,18
29 1,13 1,10
33 1,07 1,01
TABLA 9B
Datos de absorbancia de los reactivos para la determinación de AST y ALT mostrados en las Tablas 7B y 8B
Almacenamiento a 2^{o}C-6^{o}C (días) Absorbancia a 340 nm
\downarrow
Reactivo determinación Reactivo determinación
de AST de ALT
Reactivo recién preparado 1,83 1,86
22 1,82 1,81
29 1,8 1,8
60 1,73 1,7
92 1,67 1,61
125 1,6 1,52
159 1,52 1,41
187 1,46 1,33
194 1,45 1,32
Las siguientes Tablas (Tablas 10A y 10B), proporcionan evidencia de la funcionalidad continuada del reactivo para la determinación de AST y del reactivo para la determinación de ALT a lo largo de 7 meses. En cada ejecución, se procesaron una mezcla de sueros con alta actividad y con baja actividad de AST y ALT, usando tanto reactivo recién preparado como reactivo almacenado a 8ºC durante intervalos de tiempo diferentes.
TABLA 10A
6
TABLA 10B Recuperaciones medidas en sueros de control, de los reactivos para la determinación de AST y ALT mostrados en las Tablas 7B Y 8B
7
TABLA 11A
8
TABLA 11B
9
De resultados presentados se evidencia que los reactivos basados en la tecnología de regeneración, para la determinación de AST y ALT, exhiben una estabilidad de al menos 6 - 7 meses cuando se almacenan tapados a 2ºC - 8ºC. El reactivo debe presentar una absorbancia inicial de 1,0 A para ser funcional. Pasados 7 meses, el reactivo aún presenta una absorbancia de al menos 1,0 A.
De los resultados obtenidos en la Tabla 10A y la Tabla 10B queda claro que no existen diferencias significativas en las recuperaciones de sueros de control, obtenidas con reactivo recién preparado comparadas con las obtenidas con reactivo almacenado a 8ºC durante un máximo de 29 semanas. Los resultados presentados en las Tablas 11A y 11B indican que los reactivos para la determinación de AST y ALT que incorporan la tecnología de regeneración de la coenzima, son todavía capaces de satisfacer las especificaciones de linealidad después de 31 semanas de almacenamiento a 8ºC.
La incorporación del sistema de regeneración según la invención ha dado como resultado un aumento de la estabilidad una vez reconstituido, de un reactivo tapado para la medida de AST y ALT en suero, desde 1 mes a 2ºC - 8ºC hasta al menos 6 - 8 meses a 2ºC - 8ºC.
Ejemplo 2
Los reactivos para la determinación de urea se prepararon con los componentes descritos en la anterior Tabla 5B, a excepción de que a las formulaciones se incorporó NADH 0,33 mM, y de que el nivel de D-glucosa se redujo a 20 mM en uno de los reactivos.
Las formulaciones así preparadas tenían un pH 8,5. Una formulación convencional del reactivo de determinación de urea se usó como control. Los reactivos se prepararon con un nivel de amoníaco 0,15 mM, introducido en el sistema de reactivos (concentración final) en forma de contaminante. Este nivel de amoníaco contaminante es suficiente para consumir NADPH 0,15 mM en los respectivos reactivos - que equivale a 0,93 unidades de absorbancia a 340 nm. Una vez completada la reacción (es decir, el aclaramiento de amoníaco en la formulación del reactivo), la absorbancia de diferentes disoluciones (dispuestas en cubetas selladas) se detectó a lo largo del tiempo en un espectrofotómetro Shimadzu a 340 nm, y a una temperatura de 20ºC.
Los resultados presentados en la Figura 1 muestran la regeneración de NADH a partir de NAD^{+}, dependiente del tiempo, en la formulación del reactivo para la determinación de urea de la invención, después de la contaminación con amoníaco 0,15 mM.
En la Figura 1:
El recuadro A muestra esa regeneración de NADH en el caso de un reactivo convencional para la determinación de urea;
El recuadro B muestra la regeneración de NADH de un reactivo para la determinación de urea, que contiene fosfato sódico 5 mM, G-6-P-DH en concentración de 2.000 U/litro y D-glucosa 20 mM.
El recuadro C muestra la regeneración de NADH de un reactivo para la determinación de urea, que contiene fosfato potásico 5 mM, G-6-P-DH en concentración de 2.000 U/litro y D-glucosa 100 mM.
Después de 48 horas a 20ºC, el reactivo convencional fue incapaz de regenerar el NADH consumido después de la contaminación del reactivo con amoníaco. En el mismo período de tiempo, el reactivo de la invención para la determinación de urea, con D-glucosa 20 mM, hubo regenerado 0,23 unidades de absorbancia, o NADH 0,04 mM. En las 48 horas, el reactivo de la invención para la determinación de urea, con D-glucosa 100 mM, hubo regenerado 0,70 unidades de absorbancia, o NADH 0,11 mM. Estos resultados indican que la capacidad del reactivo aquí descrito para solucionar el agotamiento de NADH en el reactivo para la determinación de urea, después de la contaminación del reactivo con amoníaco.
TABLA 12
Veloclrares máximas de regeneración de NADH en el reactivo para la determinación de urea,
a 20ºC, medidas a 340 nm
Condiciones del reactivo para la determinación de urea Velocidad de regeneración (mAb/min)
Reactivo convencional -0,02
\begin{minipage}[t]{73mm}Reactivo según la invención, que contiene fosfato sódico 5 mM, G-6-P-DH 2.000 U/litro y D-glucosa 2 mM\end{minipage} +0,088
\begin{minipage}[t]{75mm}Reactivo según la invención, que contiene fosfato potásico 5 mM, G-6-P-DH 2.000 U/litro y D-glucosa 100 mM\end{minipage} +0,386
Las velocidades máximas de regeneración de NADH en los respectivos reactivos para la determinación de urea, se presentan en la Tabla 12. En el reactivo convencional para la determinación de urea, hubo una lenta pérdida de absorbancia a lo largo del tiempo, después del aclaramiento del amoníaco contaminante. En la formulación de la invención, la velocidad de regeneración del NADH aumentó al aumentar la concentración de D-glucosa en el reactivo.
Los reactivos para la determinación de amoníaco se prepararon con los componentes descritos en la anterior Tabla 6B, a excepción de que la proporción de tampón de Tris/tampón de Tris-HCl (concentración total de tampón 100 mM) se varió de manera que se obtuvieron valores de pH del reactivo en el intervalo de pH 8,0 - 9,3. Una concentración final de NADPH 0,2 mM se usó también en los reactivos preparados para la determinación de amoníaco. Se preparó también un reactivo de control para la determinación de amoníaco en ausencia de D-glucosa, fosfato potásico o G-6-P-DH. Los reactivos se prepararon con un nivel de amoníaco 0,1 mM, introducido en el sistema de reactivos (concentración final) en forma de contaminante. Este nivel de amoníaco contaminante es suficiente para consumir NADPH 0,1 mM en los respectivos reactivos - equivalente a 0,62 unidades de absorbancia a 340 nm. Una vez completada la reacción (es decir, obtenido el aclaramiento completo del amoníaco en los reactivos), la absorbancia de las diferentes disoluciones (dispuestas en cubetas selladas) se detectó a lo largo del tiempo en un espectrofotómetro Shimadzu a 340 nm, y a una temperatura de 20ºC.
Los resultados presentados en la Figura 2 muestran la regeneración de NADPH a partir de NADP, dependiente del tiempo, en las formulaciones del reactivo para la determinación de amoníaco de la invención, después de la contaminación con amoníaco 0,1 mM. La regeneración de NADPH después del aclaramiento del amoníaco contaminante, se completó dentro de las 24 horas de la contaminación con amoníaco a 20ºC. Las velocidades máximas de regeneración de NADPH en los respectivos reactivos para la determinación de amoníaco, se presentan en la Tabla 13. En el reactivo convencional para la determinación de amoníaco a pH 8,0, la absorbancia de la disolución se mantuvo entre 0,6 - 0,65, con una lenta pérdida en absorbancia. En las formulaciones de la invención a todos los valores de pH ensayado, la velocidad de regeneración del NADPH fue bastante similar. La velocidad máxima de regeneración de NADPH tuvo lugar a pH 8,50. Estos resultados indican claramente la capacidad de la invención que aquí se describe para solucionar el agotamiento de NADPH en el reactivo para la determinación de amoníaco después de la contaminación del reactivo con amoníaco.
TABLA 13
Velocidades máximas de regeneración de NADH en el reactivo para la determinación de amoníaco,
a 20ºC, medidas a 340 nm
\begin{minipage}[t]{70mm}Condiciones del reactivo para la determinación de amoníaco\end{minipage} Velocidad de regeneración (mAb/min)
Reactivo convencional, pH 8,0 -0,03
Formulación según la invención, pH 8,0 +0,78
Formulación según la invención, pH 8,5 +0,85
Formulación según la invención, pH 9,0 +0,76
Formulación según la invención, pH 9,3 +0,71
Ejemplo 3 Velocidades de la pérdida de NAD(P)H en los reactivos para la determinación de amoníaco y urea A. Reactivo para la determinación de urea
Se prepararon reactivos para la determinación de urea con la composición de la formulación descrita en la Tabla 5B, con las siguientes variaciones. La concentración final de NADH en las formulaciones del reactivo fue 0,25 mM. El pH del reactivo para la determinación de urea se ajustó variando la proporción Tris/Tris-HCl (concentración total de tampón 100 mM). Se prepararon disoluciones de control del reactivo de determinación de urea en ausencia de D-glucosa, fosfato y G-6-P-DH.
La absorbancia de muestras de las disoluciones de los reactivos, almacenadas en cubetas selladas a 20 \pm 2ºC, se detectó a 340 nm.
El descenso en la absorbancia de las disoluciones del reactivo para la determinación de urea, a lo largo del tiempo de almacenamiento a 20 \pm 2ºC, detectada a 340 nm, se presenta en la Tabla 14. Se evidencia que tanto en presencia como en ausencia del sistema de regeneración de la coenzima de la invención, las disoluciones pierden absorbancia más rápidamente a pH 8,0 que a pH 8,5. En la formulación de la invención, sin embargo, la velocidad de pérdida de absorbancia de las disoluciones de los reactivos fue también significativamente menos rápida. En otras palabras, un pH elevado y la incorporación del sistema de regeneración de la coenzima de la invención, reduce significativamente la velocidad de desaparición de NADPH en la disolución del reactivo para la determinación de
urea.
Debe señalarse que aunque una subida en pH por encima de 8,5 promueve también la estabilidad del NADH, las enzimas ureasa y glutamato-deshidrogenasa comercialmente disponibles se vuelven cada vez menos estables y menos activas en la formulación del reactivo. Por consiguiente, se requiere un equilibrio en el pH de la formulación del reactivo, de manera que se mantengan una actividad y estabilidad de la enzima adecuadas, a la vez que también se proporcione una estabilidad razonable del NADH. Sobre esta base, se prefiere una formulación del reactivo de pH 8,5 aproximadamente.
TABLA 14
Absorbancla (340 nm) de disoluciones del reactivo de determinación de urea, almacenadas
a 20ºC, en función del tiempo
Período de Formulación Formulación de Formulación Formulación de
incubación convencional la invención convencional la invención
(días) pH 8,0 pH 8,0 pH 8,5 pH 8,5
0 1,73 1,72 1,77 1,74
7 1,63 1,68 1,7 1,75
14 1,52 1,61 1,64 1,7
23 1,36 1,48 1,54 1,62
29 1,25 1,4 1,47 1,53
37 1,12 1,3 1,38 1,52
B. Reactivo para la determinación de amoníaco
Se prepararon reactivos para la determinación de amoníaco con la composición de la formulación descrita en la Tabla 6B, con las siguientes variaciones. El pH del reactivo para la determinación de amoníaco se ajustó variando la proporción Tris/Tris-HCl (concentración total de tampón 100 mM). La concentración final de NADPH en las formulaciones del reactivo de determinación de amoníaco fue 0,2 mM. Se prepararon disoluciones de control del reactivo de determinación de amoníaco sin de D-glucosa, fosfato ni G-6-P-DH.
La absorbancia de muestras de las disoluciones de los reactivos, almacenadas en cubetas selladas a 20 \pm 2ºC, se detectó a 340 nm.
El descenso en absorbancia de las disoluciones del reactivo para la determinación de amoníaco a lo largo del tiempo durante el almacenamiento a 20ºC, detectada a 340 nm, se presenta en la Tabla 15. Se evidencia que tanto en presencia como en ausencia del sistema de regeneración de la coenzima de la invención, las disoluciones pierden absorbancia más rápidamente cuando hay una disminución en el pH. En las formulaciones de la presente invención, sin embargo, la velocidad de pérdida de absorbancia de las disoluciones de los reactivos fue también significativamente menos rápida. En otras palabras, un pH elevado y la incorporación del sistema de regeneración de la coenzima de la invención reduce significativamente la velocidad de desaparición de NADPH en la disolución del reactivo para la determinación de amoníaco.
Debe señalarse que aunque una subida del pH promueve la estabilidad del NADPH, la glutamato-deshidrogenasa comercialmente disponible se vuelve cada vez menos estable y menos activa en la formulación del reactivo por encima de pH 8,5. Por consiguiente, se requiere un equilibrio en el pH de la formulación del reactivo, de manera que se mantengan una actividad y estabilidad adecuadas de la enzima, a la vez que también se proporcione una estabilidad razonable del NADPH. Sobre esta base, se prefiere una formulación del reactivo de pH 8,5 - 9,0.
TABLA 15
10
Ejemplo 4 Funcionalidad de los reactivos para la determinación de amoníaco y urea A. Reactivo para la determinación de urea
El reactivo para la determinación de urea se preparó según la relación de componentes listada en la Tabla 5B, en presencia y ausencia de D-glucosa, fosfato y G-6-P-DH. Sin embargo, la concentración final de NADH en las formulaciones del reactivo fue 0,25 mM. La linealidad de los reactivos se comparó frente a control Verichem/control normal/control no normal, en un instrumento COBAS MIRA™ de ROCHE®, usando los parámetros que se especifican a continuación.
Temperatura de la reacción 37ºC
Volumen de muestra frente a volumen de reactivo 1:100
Longitud de onda 340 nm
Los resultados presentados en la Tabla 16 indican que el reactivo para la determinación de urea de pH 8,50 de la presente invención, es lineal hasta el nivel más alto de la muestra de control con urea ensayada (nivel E de Verichem, con urea 37,4 mM), con una variación de los valores medidos dentro del 5% de la concentración especificada. El reactivo para la determinación de urea de la invención también proporciona lecturas fiables dentro de la desviación del valor en las muestras de control con urea normales y no normales.
TABLA 16
11
B. Reactivo para la determinación de amoníaco
El reactivo para la determinación de amoníaco se preparó en presencia y ausencia de D-glucosa, fosfato y G-6-P-DH según la relación de componentes listada en la Tabla 6B. La linealidad de los reactivos se comparó frente a controles de disoluciones acuosas de amoníaco, en un instrumento COBAS MIRA™ de ROCHE®, usando los parámetros que se especifican a continuación.
Temperatura de la reacción 37ºC
Volumen de muestra frente a volumen de reactivo 1:10
Longitud de onda 340 nm
Los resultados presentados en la Tabla 17 indican que el reactivo para la determinación de amoníaco de pH 8,50 de la invención es lineal hasta el nivel más alto de la muestra de control con amoníaco ensayada (amoníaco 1.200 \muM), con una variación de los valores medidos dentro del 5% de la concentración especificada.
TABLA 17
Estudios de linealidad con el reactivo para la determinación de amoníaco de pH 8,50
\begin{minipage}[t]{73mm} Concentración de amoníaco especificada en una muestra de disoluciones acuosas de control (\mu M)\end{minipage} \begin{minipage}[t]{73mm}Concentración media de amoníaco estimada en muestras de control (\mu M), a partir de medidas por duplicado\end{minipage}
10 11,6 \pm 6
20 24,2 \pm 2,3
50 52,5 \pm 3,1
100 101,9 \pm 2,7
TABLA 17 (continuación)
\begin{minipage}[t]{73mm} Concentración de amoníaco especificada en una muestra de disoluciones acuosas de control (\mu M)\end{minipage} \begin{minipage}[t]{73mm}Concentración media de amoníaco estimada en muestras de control (\mu M), a partir de medidas por duplicado\end{minipage}
200 203,5 \pm 1,3
400 409,7 \pm 3,1
800 789 \pm 3,5
1.200 1.164 \pm 2,2
Ejemplo 5
El reactivo para la determinación de urea se puede configurar en un formato de dos viales, conforme a la configuración de la formulación que se especifica a continuación. El volumen relativo de adición del reactivo del vial A y del reactivo del vial B, requerido para obtener el reactivo mezclado, es 5:1 que corresponde a vial A:vial B.
Vial A para la determinación de urea
Materia prima Peso molecular Concentración Cantidad/litro
TRIS 121,14 61,3 mM 7,43 g
TRIS-HCl 157,6 38,7 mM 6,10 g
NADH, Na_{2}\cdot3H_{2}O 763,5 0,34 mM 0,26 g
NaN_{3} 65,01 7,7 mM 0,5 g
K_{2}HPO_{4} 174,18 5 mM 0,871 g
D-Glucosa 180,16 100 mM 18,02 g
BSA - 0,05% 0,5 g
G-6-P-DH, Leuconostoc 2.000 U/l 2.000 U
mesenteroides
Vial B para la determinación de urea
Materia prima Peso molecular Concentración Cantidad/litro
TRIS 121,14 61,3 mM 7,43 g
TRIS-HCl 157,6 38,7 mM 6,10 g
\alpha-cetoglutarato, sal de 190,1 45 mM 8,55
Na (anhidra)
EDTA, Na_{2}\cdot3H_{2}O 372,24 1 mM 0,372 g
BSA - 0,05% 0,5 g
GLDH (microbiana) - 50.000 U/l 50.000 U
Ureasa (microbiana) - 40.000 U/l 40.000 U
Reactivo para la determinación de amoníaco. Formato de 2 viales
El reactivo para la determinación de amoníaco se puede configurar en un formato de dos viales, conforme a la configuración de la formulación que se especifica a continuación. El volumen relativo de adición del reactivo del vial A y del reactivo del vial B, requerido para obtener el reactivo mezclado, es 5:1 que corresponde a vial A:vial B. En la formulación que se proporciona como ejemplo, se usa NADH en lugar de NADPH. Como consecuencia de ello, la LDH se incluye en el vial A para la retirada del piruvato interferente de la muestra procedente del paciente, antes del comienzo de la reacción principal del ensayo.
Vial A para la determinación de amoníaco
Materia prima Peso molecular Concentración Cantidad/litro
TRIS 121,14 61,3 mM 7,43 g
TRIS-HCl 157,6 38,7 mM 6,10 g
NADH, Na_{2}\cdot3H_{2}O 763,5 0,34 mM 0,26 g
NaN_{3} 65,01 7,7 mM 0,5 g
K_{2}HPO_{4} 174,18 5 mM 0,871 g
D-Glucosa 180,16 100 mM 18,02 g
BSA - 0,05% 0,5 g
G-6-P-DH, Leuconostoc 2.000 U/l 2.000 U
mesenteroides
LDH (microbiana) - 2.000 U 2.000 U
Vial B para la determinación de amoníaco
Materia prima Peso molecular Concentración Cantidad/litro
TRIS 121,14 61,3 mM 7,43 g
TRIS-HCl 157,6 38,7 mM 6,10 g
\alpha-cetoglutarato, sal de 190,1 45 mM 8,55
Na (anhidra)
EDTA, Na_{2}\cdot3H_{2}O 372,24 1 mM 0,372 g
BSA - 0,05% 0,5 g
GLDH (microbiana) - 50.000 U/l 50.000 U
Ureasa (microbiana) - 40.000 U/l 40.000 U
Otras ventajas importantes del reactivo y del método según la invención son que el reactivo, en su forma más preferida, es un reactivo en un único vial, reduciendo con ello los problemas de espacio e inventario asociados con los reactivos de la técnica anterior, y que es adaptable a sistemas instrumentales diferentes.
Se debe valorar que existen numerosas parejas de sustrato/enzima "no específicas" que se pueden utilizar para retardar la regeneración de la coenzima usada en el reactivo y el método de la invención. Además de las aquí mencionadas, existen otras que no se encuentran comercialmente disponibles o cuyo coste es prohibitivo.
Se valorará también que esta invención se podrá aplicar a la estabilización de reactivos distintos de los reactivos para la determinación de AST, ALT, amoníaco y urea, por ejemplo, reactivos para la determinación de LDH (de piruvato a lactato), triglicéridos y salicilatos. Esta invención no se debe considerar limitada por los ejemplos de la misma presentados en esta memoria descriptiva, con referencia de manera específica a AST, ALT, amoníaco y urea.

Claims (24)

1. Un reactivo para la determinación enzimática de la concentración de un analito en un paciente, en la que se mide el grado de oxidación de una coenzima, estando dicho reactivo estabilizado contra la oxidación por medio de un sistema de reducción de la coenzima que comprende una pareja de enzima y sustrato, seleccionada de manera que permite la regeneración continua de dicha coenzima durante el almacenamiento de dicho reactivo, caracterizado porque el sistema de reducción de la coenzima es un sistema en el que no se genera fosfato libre, y porque el reactivo inicialmente carece de fosfato libre y se incorporan iones fosfato libres al reactivo.
2. Un reactivo según la reivindicación 1, en el que dicha regeneración continua tiene lugar a una velocidad en el intervalo de 0,01 a 0,9 mAb/min, a de 18ºC a 25ºC, y a 340 nm.
3. Un reactivo según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que dicho sistema de reducción de una coenzima comprende una enzima y un sustrato, presentando dicha enzima una especificidad incompleta por dicho sustrato.
4. Un reactivo según una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 3, en el que dicha pareja de enzima/sustrato es glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa/D-glucosa.
5. Un reactivo según la reivindicación 3 o la reivindicación 4, en el que el grado de especificidad entre dicha enzima y dicho sustrato es menor que el 50% en relación equimolar.
6. Un reactivo según una cualquiera de las reivindicaciones de 3 a 5, en el que el grado de especificidad entre dicha enzima y dicho sustrato es menor que el 10% en relación equimolar.
7. Un reactivo según una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 6, en el que dicho analito es una transaminasa.
8. Un reactivo según la reivindicación 7, en el que dicha transaminasa es la aspartato-transaminasa.
9. Un reactivo según la reivindicación 7, en el que dicha transaminasa es la alanina-transaminasa.
10. Un reactivo según una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 6, en el que dicho analito es urea.
11. Un reactivo según una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 6, en el que dicho analito es amoníaco.
12. Un reactivo según una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 11, en el que dicho reactivo está configurado en forma de un único vial.
13. Un método enzimático para determinar la concentración de un analito en una muestra de fluido corporal, en el que se mide el grado de oxidación de una coenzima, método que comprende estabilizar un reactivo que comprende dicha coenzima contra la oxidación, por medio de un sistema de reducción de la coenzima que comprende una pareja de enzima y sustrato, seleccionada de manera que permite la regeneración continua de dicha coenzima durante el almacenamiento de dicho reactivo, caracterizado porque el sistema de reducción de la coenzima es un sistema en el que no se genera fosfato libre, y porque el reactivo inicialmente carece de fosfato libre y se incorporan iones fosfato libres al reactivo.
14. Un método según la reivindicación 13, en el que dicha regeneración continua tiene lugar a una velocidad en el intervalo de 0,01 a 0,9 mAb/min, a de 18ºC a 25ºC, y a 340 nm.
15. Un método según la reivindicación 13 o la reivindicación 14, en el que dicho sistema de reducción de una coenzima comprende una enzima y un sustrato, presentando dicha enzima una especificidad incompleta por dicho sustrato.
16. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones de 13 a 15, en el que dicha pareja de enzima/sustrato es glucosa-6-fosfato-deshidrogenasa/D-glucosa.
17. Un método según la reivindicación 15 o la reivindicación 16, en el que el grado de especificidad entre dicha enzima y dicho sustrato es menor que el 50% en relación equimolar.
18. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones de 15 a 17, en el que el grado de especificidad entre dicha enzima y dicho sustrato es menor que el 10% en relación equimolar.
19. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones de 13 a 18, en el que dicho analito es una transaminasa.
20. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones de 13 a 18, en el que dicho analito es la aspartato-transaminasa.
\newpage
21. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones de 13 a 18, en el que dicho analito es la alanina-transaminasa.
22. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones de 13 a 18, en el que dicho analito es urea.
23. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones de 13 a 18, en el que dicho analito es amoníaco.
24. El uso de un reactivo, en el que se mide el grado de oxidación de una coenzima para la determinación enzimática de la concentración en una muestra de fluido corporal, de un analito seleccionado entre una transaminasa, aspartato-transaminasa, alanina-transaminasa, urea y amoníaco, estando dicho reactivo estabilizado contra la oxidación por medio de un sistema de reducción de la coenzima que comprende una pareja de enzima y sustrato seleccionada de manera que permite la regeneración continua de dicha coenzima durante el almacenamiento de dicho reactivo, en el que el sistema de reducción de la coenzima es un sistema en el que no se genera fosfato libre, y en el que el reactivo carece inicialmente de fosfato libre y se incorporan iones fosfato libres al reactivo.
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