PL186517B1 - Odczynnik i sposób określania stężenia analitu w próbce płynu ciała - Google Patents

Abstract

1. Odczynnik do mierzenia stezenia analitu u pacjenta polegajacego na pomiarze stopnia utlenienia koenzymu, znamienny tym, ze zawiera uklad redukujacy koenzym skladajacy sie z pary enzym i substrat, przy czym stopien specyficznosci miedzy enzy- mem i substratem jest mniejszy niz 50% w oparciu o równowaznosc molowa umozliwia- jac stala regeneracje koenzymu w trakcie przechowywania odczynnika, natomiast analit jest wybrany z grupy zawierajacej transaminaze, transaminaze asparaginianowa, transa- minaze alaninowa, moczniki amoniak. PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest także sposób określania stężenia analitu w próbce płynu ciała charakteryzujący się tym, że próbkę płynu ciała kontaktuje się z odczynnikiem zawierającym koenzym i mierzy się stopień utlenienia koenzymu, przy czym odczynnik zawierający wspomniany koenzym stabilizuje się przeciw utlenieniu przez układ redukujący koenzym składający się z pary enzym i substrat, przy czym wspomniany enzym wykazuje niepełną specyficzność wobec wspomnianego substratu, a stopień specyficzności między wspomnianym enzymem i wspomnianym substratem jest mniejszy niż 50% w oparciu o równoważność molową umożliwiając stalą regenerację koenzymu w trakcie przechowywania odczynnika, natomiast wspomniany analit wybiera się z grupy zawierającej transaminazę, transaminazę asparaginianową, transaminazę alaninową, mocznik i amoniak.

Korzystnie stosuje się odczynnik w postaci jednej fiolki.

Korzystnie ciągła redukcja koenzymu zachodzi z prędkością w zakresie 0,01-0,9 mAbs/minutę przy 340 nm, w temperaturze 18-25°C.

Korzystnie stosowanym enzymem jest enzym mikrobiologiczny. Korzystnie stosowaną parą enzym/substrat jest dehydrogenaza glukozo-6-fosforanowa/D-glukozę.

Korzystnie stopień specyficzności między enzymem i substratem jest mniejszy niż 10% w oparciu o równoważność molową.

Korzystnie analitem jest transaminaza, korzystnie transaminazą jest transaminaza asparaginianowa, albo transaminaza alaninowa. Korzystnie analitem jest mocznik, albo amoniak.

Szczegółowy opis wynalazku

Dostarcza się odczynnika do enzymatycznego określania stężenia analitu u pacjenta, w którym mierzy się stopień utlenienia, przy czym wspomniany odczynnik stabilizuje się przeciw utlenieniu przez układ redukujący koenzymu, obejmujący parę enzym i substrat, wybraną tak, aby umożliwić ciągłą regenerację wspomnianego koenzymu w trakcie przechowywania wspomnianego odczynnika.

Dostarcza się także odczynnika do enzymatycznego określania stężenia transaminazy u pacjenta, w którym mierzy się stopień utlenienia, przy czym wspomniany odczynnik stabilizuje się przeciw utlenieniu przez układ redukujący koenzymu, obejmujący parę enzym i substrat, wybraną tak, aby umożliwić ciągłą regenerację wspomnianego koenzymu w trakcie przechowywania wspomnianego odczynnika.

Dostarcza się także odczynnika do enzymatycznego określania stężenia transaminazy asparaginianowej u pacjenta, w którym mierzy się stopień utlenienia, przy czym wspomniany odczynnik stabilizuje się przeciw utlenieniu przez układ redukujący koenzymu, obejmujący parę enzym i substrat, wybraną tak, aby umożliwić ciągłą regenerację wspomnianego koenzymu w trakcie przechowywania wspomnianego odczynnika.

Dostarcza się także odczynnika do enzymatycznego określania stężenia aminotransferazy alaninowej u pacjenta, w którym mierzy się stopień utlenienia, przy czym wspomniany odczynnik stabilizuje się przeciw utlenieniu przez układ redukujący koenzymu, obejmujący parę enzym i substrat, wybraną tak, aby umożliwić ciągłą regenerację wspomnianego koenzymu w trakcie przechowywania wspomnianego odczynnika.

Dostarcza się także odczynnika do enzymatycznego określania stężenia mocznika u pacjenta, w którym mierzy się stopień utlenienia, przy czym wspomniany odczynnik stabilizuje się przeciw utlenieniu przez układ redukujący koenzymu, obejmujący parę enzym i substrat, wybraną tak, aby umożliwić ciągłą regenerację wspomnianego koenzymu w trakcie przechowywania wspomnianego odczynnika.

Dostarcza się także odczynnika do enzymatycznego określania stężenia amoniaku u pacjenta, w którym mierzy się stopień utlenienia, przy czym wspomniany odczynnik stabilizuje się przeciw utlenieniu przez układ redukujący koenzymu, obejmujący parę enzym i substrat, wybraną tak, aby umożliwić ciągłą regenerację wspomnianego koenzymu w trakcie przechowywania wspomnianego odczynnika.

W szczególnej realizacji układ redukujący koenzymu obejmuje enzym i substrat, przy czym wspomniany enzym posiada niecałkowitą specyficzność dla wspomnianego substratu,

186 517 wynikiem czego jest zredukowany współczynnik reaktywności wzajemnej. Odczynnik taki występuje w konfiguracji pojedynczej fiolki.

W tym szczegółowym opisie, termin „niecałkowita specyficzność” stosuje się ze względu na pary enzym i substrat, w którym wybrany substrat nie jest naturalnym substratem wybranego enzymu, a więc ma mniej niż 100% specyficzności wzajemnej dla enzymu, o który chodzi.

Wynalazek ten opiera się na odkryciu, że przez sprzężenie enzymu i substratu o niecałkowitej specyficzności w stosunku do siebie, tempo redukcji koenzymu jest poważnie spowolnione. Przez spowolnienie reakcji redukcji, podstawowe składniki odczynnika mogą być zawarte w jednej fiolce do przechowywania, zawartość stabilizuje się przeciw zanieczyszczeniom przez niski poziom ciągłej regeneracji koenzymu. Przez spowolnienie procesu, regeneracja NADH i NADPH może zachodzić bez wpływu na pomiar analitów. Regeneracja może zachodzić w odczynniku nie będącym w użyciu i prędkość, z jaką zachodzi regeneracja, może być doskonale dostrojona przez wyregulowanie charakteru wybranej pary enzym/substrat i jej poziomu.

W kolejnej postaci realizacji wynalazku, dostarcza się odczynnika do stosowania w enzymatycznym określaniu stężenia analitu u pacjenta, w którym mierzy się stopień utlenienia koenzymu, charakteryzującego się tym, że wspomniany odczynnik stabilizuje się przeciw utlenieniu przez układ redukujący koenzymu, obejmujący parę enzym i substrat, wybraną tak, aby umożliwić regenerację wspomnianego koenzymu z prędkością 0,01-0,9 mAbs/minutę, przy 340 nm.

Korzystnie tempo regeneracji odczynnika zgodnie z tym aspektem wynalazku wynosi 0,05 -0,4 mAbs/minutę, a najkorzystniej tempo regeneracji wynosi 0,05-0,25 mAbs/minutę w temperaturze pokojowej (18-25°C) i przy 340 nm.

W zalecanej postaci realizacji wynalazku stopień specyficzności między substratem i enzymem układu redukującego koenzymu, wynosi korzystnie mniej niż 100%, korzystniej mniej niż 50%, a najkorzystniej mniej niż 10% w oparciu o równoważność molową. Optymalnie, można stosować parę enzym/substrat posiadającą reaktywność wzajemną mniejszą niż 5% w oparciu o równoważność molową.

Koenzymami stosowanymi w odczynniku według wynalazku są zredukowany dinukleotyd nikotynamido-adeninowy (NADH) i zredukowany fosforan dinukleotydu nikotynamidoadeninowego (NADPH), chociaż odpowiednie mogą być także analogi koenzymu, takie jak fosforan dinukleotydu nikotynamido-hipoksantynowego lub tioNADH.

Niespodziewanie, odkryto, że odczynniki według wynalazku dostarczają dalszych korzyści, szczególnie jeśli chodzi o odczynniki amoniakowe i mocznikowe. Poziomy NADH i/lub NADPH będą wyczerpywane w odczynnikach amoniakowych i mocznikowych, przez obecność zanieczyszczenia amoniakowego, wprowadzonego z wodą używaną do odtworzenia proszku odczynników. Podobnie, amoniak z powietrza, który rozpuszcza się w ciekłym odczynniku mocznikowym/amoniakowym z upływem czasu, będzie wyczerpywał poziomy NADH i/lub NADPH. Obecność zanieczyszczającego amoniaku w odczynniku amoniakowym i mocznikowym, może prowadzić nie tylko do niedokładnych określeń mocznika i amoniaku, lecz może oznaczać, że reakcja z α-ketoglutaranem i NADH w obecności GLDH, zajdzie przed dodaniem próbek. Prowadzi to do wyczerpania poziomów NADH lub NADPH i w ten sposób do błędów w określaniu stężeń amoniaku i mocznika w próbkach. Jednakże, niniejszy wynalazek pozwala na usunięcie zanieczyszczeń amoniakiem, a także na regenerację NADH lub NADPH, aby umożliwić dokładne określenie stężenia amoniaku i mocznika w próbkach pacjentów.

Enzymami korzystnie wykorzystywanymi w układzie redukcyjnym koenzymu przy określaniu zawartości transaminazy w próbce surowicy, mogą być dehydrogenaza glukozo-6fosforanowa (G-6-P-DH) lub dehydrogenaza glukozowa.

Enzymami korzystnie wykorzystywanymi w układzie redukcyjnym koenzymu przy określaniu zawartości mocznika lub amoniaku w próbce surowicy, mogą być dehydrogenaza glukozo-6-fosforanowa (G-6-P-DH) lub dehydrogenaza glukozowa.

186 517

Odpowiednie mogą być także enzymy, takie jak dehydrogenaza mrówczanowa, dehydrogenaza glicerolowa, dehydrogenaza leucynowa. Odpowiednie mogą być także dehydrogenaza L-alaninowa, dehydrogenaza 3o^-hydroksysteroidowa, dehydrogenaza L-mleczanowa (z Lactobacillus sp) lub dehydrogenaza glicerolo-3-fosforanowa. Zalecanym enzymem stosowanym w odczynniku do określania poziomu transaminazy/amoniaku i mocznika, jest dehydrogenaza glukozo-6-fosforanowa. Można ją otrzymać z każdego odpowiedniego źródła, takie jak Leuconostoc mesenteroides, Bacillus stearothermophilus, Zymomonas mobilus lub drożdże.

Enzymy takie pochodzą korzystnie ze źródeł drobnoustrojowych. Odkryto, że włączenie do odczynnika enzymów ze źródeł drobnoustrojowych minimalizuje obecność endogenicznych zanieczyszczeń, takich jak oksydaza NADH i proteazy, które dotychczas poważnie wpływały na stabilność odczynników. Enzymy drobnoustrojowe posiadają także dodatkową korzyść większej termostabilności, a tym samym poprawienia długookresowej stabilności w roztworze.

Bardziej zalecanym źródłem dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej jest Leuconostoc mesenteroides. Jeśli stosuje się glukozo-6-fosforan od Bacillus stearothermophilus lub Zymomonas mobilus, prędkość reakcji zmniejsza się. Podobnie, jeśli jako źródło dehydrogenazy glukozo-6-fosforanu stosuje się drożdże, musi być użyty koenzym NADPH, jako alternatywa dla NADH, ponieważ dehydrogenaza glukozo-6-fosforanowa drożdży jest specyficzna tylko dla NADP+. Odpowiednia ilość dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej, obecna w odczynnikach według wynalazku, będzie się zmieniać zgodnie z pożądanym tempem regeneracji. Jednakże, szczególnie zalecaną dla odczynnika AST, jest ilość około 2000 jednostek/litr, aby pozwolić na degradację z upływem czasu w roztworze. Dla ALT szczególnie zaleca się stężenie 2000 jednostek/litr. Zalecanym stężeniem dla odczynnika mocznikowego jest 2000 jednostek/litr, a zalecanym stężeniem dla odczynnika amoniakowego jest 3500 jednostek/litr.

Biorąc pod uwagę, że wybór substratu i enzymu musi być taki, że w układzie redukcyjnym koenzymu mają one niecałkowitą specyficzność w stosunku do siebie, odpowiednie substraty do użytku w odczynniku według wynalazku obejmują: rybozo-5-fosforan, glukozo-1-fosforan, kwas 6-fosfoglukonowy, 2-deoksyglukozo-6-fosforan, 2-deoksy-2-fluoroglukozo-6-fosforan, 2-deoksy2-chloroglukozo-6-fosforan, 2-deoksy-2,2-difluoroglukozo-6-fosforan, 2-0-metyloglukozo-6-fosforan, mannozo-6-fosforan, glukozoamino-6-fosforan, 3-deoksyglukozo-6-fosforan, 3-deoksy-3fluoroglukozo-6-fosforan, 3-O-metyloglukozo-6-fosforan, allozo-6-fosforan, ahrozo-6-fosforan,

4-deoksy-4-fluoroglukozo-6-fosforan, galaktozo-6-fosforan, 5-tioglukozo-6-fosforan, analogi fosfonianowe, glukozo-6-stallan, ^-ID-^ll^^oza, D-galaktoza, 2-deoksyglukoza, arabinoza, ksyloza, 1-sorboza, D-mannoza, D-fruktoza, D-laktoza, D-sorbital, D-mannitol, sacharoza, inozytol, maltoza.

Przy użyciu NADH, jako zalecanego koenzymu w odczynniku, zalecanym połączeniem enzym/substrat jest dehydrogenaza glukozo-6-fosforanowa(G-6-P-DH)/D-glukoza. Zalecanymi alternatywnymi substratami w stosunku do D-glukozy są takie, dla których, w stosunku do specyficzności miedzy glukozo-6-fosforanem (G-6-P) i G-6-P-DH, prędkość reakcji między enzymem G-6-P-DH i wybranym substratem jest mniejsza niż 50%, korzystniej mniej niż 10%, a najkorzystniej mniej niż 5% w stosunku do specyficzności między glukozo-6fosforanem (G-6-P) i G-6-P-DH. Biorąc znowu pod uwagę wymaganą prędkość regeneracji, poziom D-glukozy najbardziej odpowiedni dla odczynników według wynalazku, a zatem zalecany, wynosi około 100 mmoli/litr, chociaż można stosować poziomy do 1000 mmoli/litr. Rozpuszczalność D-glukozy w odczynniku staje się zagadnieniem przy wyższych stężeniach.

Gdy stosuje się zalecane połączenie D-glukozy/dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej, można wprowadzić do kompozycji jony fosforanu potasu, w postaci dwuzasadowego fosforanu potasu. Zmieniający się poziom jonów fosforanowych może być odpowiedni w zależności od żądanej prędkości regeneracji. Jednkaże, gdy stężenie D-glukozy wynosi np. około 100 mmoli/litr (lecz może się zmieniać między 20 i 200 mmoli/litr), a odpowiadający poziom dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej wynosi około 2000 jednostek/litr (lecz może się zmieniać między 500 i 3500 jednostek/litr), odpowiedni poziom jonów fosforanowych, może wynosić 2,0-20 mmoli/litr. Zwiększenie stężenia jonów fosforanowych zwiększy tempo regeneracji. Zalecanym poziomem dodatku jonów fosforanowych jest około 10 mmoli/litr dla AST

186 517 i około 5 mmoli dla ALT. Dla odczynnika mocznikowego zalecane stężenie dodawanych jonów fosforanowych wynosi około 5 mmoli, a także około 5 mmoli dla odczynnika amoniakowego.

Gdy wykorzystuje się zalecane połączenie D-glukozy i dehydrogenazy glukozo-6fosforanowej, lub rzeczywiście w każdym układzie, w którym nie wytwarzają się wolne jony fosforanowe, zasadniczo należy wprowadzić wolne jony fosforanowe do odczynnika. W szczególności, wolne jony fosforanowe wymagane są do utworzenia niespecyficznego kompleksu z D-glukozą, w celu inicjacji regeneracji w obecności dehydrogenazy glukozo-6fosforanowej.

Zalecaną alternatywą do użycia D-glukozy/G-6-P-DH jest użycie dehydrogenazy glukozowej (GLD) zgodnie z następującą reakcją, w której D-glukoza jest 100% reaktywnym substratem:

D-glukoza + NAD* —GLD- D-glukono-5-lakton + NADH + H+

Jeśli stosuje się dehydrogenazę jako enzym, zalecanymi substratami dla redukcji koenzymu NAD i ich relatywnym stopniem reaktywności wzajemnej w porównaniu z D-glukozą są:

Substrat	Relatywna aktywność
Ksyloza	8,9%
L-sorboza	0,3%
D-mannoza	2,4%
D-fruktoza	0,8%
D-galaktoza	0,1%
D-laktoza	1,2%
D-sorbitol	0,1%
Inozytol	0,2%
Maltoza	3,9%

w których cyfry oznaczają tempo reakcji w stosunku do dehydrogenazy glukozowej w obecności naturalnego substratu 1 β-D-glukozy.

Alternatywnie, użycie dehydrogenazy glicerolowej (GLY.DH) jako enzymu, odpowiednie substraty w reakcji glicerol + NAD* —^GLP PH > dihydroksyaceton + NADH + H+ oraz ich aktywność w stosunku do glicerolu (100%) są następujące:

Substrat Relatywna aktywność

Glicerolo-amonochlorohydryna 48,5%

Glikol etylenowy 7,8%

2,3-Butadienol 52,6% w których jako enzym stosuje się dehydrogenazę leucyny (L.D), zgodnie z reakcją substrat + NAD* + H2O < L^p > a-ketoiz.okapronian + NH3 + NADH + H+ odpowiednie substraty i ich aktywność w stosunku do L-leucyny (100%) są następujące:

Substrat

L-walina

L-izoleucyna

L-norwalina

L-norleucyna

L-metionina

L-cysteina

Rdattywia aktywność 74%

58%

41%

10%

0,6%

0,3%

Jeśli jako enzym stosuje się dehydrogenazę L-alaninową (A.D), w układzie reakcyjnym podobnym do użytego dla dehydrogenazy leucynowej, odpowiednim substratem i jego aktywnością w stosunku do L-alaniny (100%) jest

186 517

Substrat Relatyywa aktyumość

L-seryna 5%

Jako enzym można także użyć dehydrogenazę 3a-hydroksysteroidową (H.DH), w połączeniu z substratami wymienionymi poniżej. Ich aktywności w stosunku do kwasu cholowego wymieniono także.

Substrat Relatywna aktywność

Kwas litocholowy 9696

Kwas etiocholowy 6090

Gdzie jako enzym stosuje się dehydrogenazę L-mleczanową (LDH) z Lactobacillus sp, w następującej reakcji pirogronian + NAD + H+ < > L-mleczan + NAD+ przy czym odpowiednie substraty i ich aktywności w stosunku do L-mleczanu są następujące:

Substrat Re^ll^tjyw^a ./A^tjyw^c^ść:

2-oksoglutaran 0,09% szczawiooctan 39%

Gdy koenzymem jest NADP+, np. z drożdży, zalecanymi połączeniami substrat/enzym są:

G-6-P-HD/galaktozo-6-P 2525

G-6-P-DH/2-deśksyglukśzo-6-P 1818

G-6-P-DH/glukozoamino-6-P 2%

Cyfry z prawej strony oznaczają reaktywność w stosunku do pary G-6-P-DH/G-6-P.

Jest także możliwe użycie NADP+ jako koenzymu, aby połączyć jako enzym/substrat dehydrogenazę gliceroko-S-iosforanowąz fosforanem dihydroksyacetonu.

Jak opisano we wstępie do tego szczegółowego opisu, innymi wymaganiami odczynnika według wynalazku, do stosowania w określaniu poziomów AST w surowicy, są dehydrogenaza mleczanowa, dinukleotyd oikśtyoamido-adenioowy, zredukowany (NADH), dehydrogenaza malemianowa (MDH), asparagioiao i 2-oksoglutaran. W przypadku ALT dehydrogenaza maleinianowa nie jest wymagana, a zamiast asparaginianu, pożądana jest L-alanina. W przypadku odczynnika mocznikowego, wymagana jest także ureaza oraz a-ketioglutaran. chociaż a-ketoglutaran jest także pożądany przy odczynniku amoniakowym.

Asparaginian dostępny jest w postaci różnych soli, takich jak sole sodowe i potasowe. Zalecaną solą według wynalazku jest sól potasowa, ponieważ wydaje się, że jest ona bardziej rozpuszczalna i mniej uwodniona niż sól sodowa. Zakres stężenia dopuszczalnego w odczynnikach według wynalazku, wynosi 180-240 mmoli/litr. Najbardziej zalecane jest ostateczne stężenie wynoszące około 200 mmoli/litr i należy zauważyć, że jest poziom zalecany przez IFCC.

Zakres 2-oksoglutaraou uważany za korzystny dla odczynników według wynalazku wynosi około 1-15 mmoli/litr, jednakże zauważa się, że wysokie stężenia tego substratu mogły ograniczać ilość NADH, którą można dodać do kompozycji, ponieważ 2-oksoglutaran absorbuje się przy 340 nm, dostarczając tła absorbancji dla absorbancji NADH. Ograniczając ilość 2-oksoglutaranu dodanego do kompozycji, odczynnik można wykorzystać bez trudności na większości analizerów spektralnych. Zalecane stężenie tego substratu dla odczynników AST i ALT wynosi około 12 mmoli/litr, co jest znów poziomem zalecanym przez IFCC. Dla odczynników mocznikowego i amoniakowego zalecane stężenie wynosi około 7,5 mmola/litr.

Poleca się, aby ilość alaniny w odczynniku ALT była obecna w pewnych granicach, z powodu rozpuszczalności tego składnika. W szczególności, zalecanym zakresem jest 200500 mmoli/litr, mimo, ze przy wyższym zakresie nie obserwuje się widocznego podniesienia aktywności katalitycznej. Najbardziej korzystnym stężeniem tego substratu jest około 400 mmoli/litr, z powodu rozpuszczalności tej substancji.

Poziom koenzymu w odczynniku będzie się zmieniał zgodnie z następującymi czynnikami:

• liniowość wymagana w pomiarze • wybrana długość fali • stosunek objętości próbki do odczynnika • układ fotometryczny wybranego analizera

186 517

Zazwyczaj, zwiększenie objętości próbki poprawia czułość, lecz zmniejsza liniowość uzyskanego odczytu, natomiast zmAiopszoeio objętości próbki polepsza liniowość kosztem straty czułości.

Zalecaną długością fali dla pomiaru jest 320-400 nm, jednakże poziom użytego koenzymu powinien być ustawiony tak, że absorbancja korzystnie nie przekracza 2,0 A. Zalecaną długością fali absorbancji według wynalazku jest 340 nm.

MDH korzystnie uzyskuje się ze źródeł drobnoustrojowych tak, aby ograniczyć ryzyko endogenicneych zanieczyszczeń i ponieważ wykazuje podwyższoną charakterystykę ze względu na stabilność termiczną. Odpowiedni zakres poziomów to 150-1500 jednostek,/.litr, bardziej korzystny to 200-800 jednostek/litr. Najbardziej korzystnym poziomem według wynalazku jest około 250 jednostek/litr.

W odczynniku AST, LDH bierze udział w usuwaniu endogen^z^go pirogronianu z próbki. Poziom LDH korzystnie wprowadzonego do odczynnika AST według wynalazku był taki, że 1,0 mmol/litr próbki pirogronianu oczyszczał się w ciągu 1 minuty, wykorzystując stosunek próbki do odczynnika 1:10. Poziom ten określono na około 2000 jednostek/litr.

W odczynniku ALT, LDH bierz udział w dwóch reakcjach, (i) w sprzężonej reakcji enzymu do pomiaru ALT oraz (ii) w usuwaniu endogen^nego pirogronianu z próbki. Poziom wprowadzonego LDH, jak przy odczynniku AST był taki, że odczynnik usunie do 1,0 mmola/litr pirogronianu z próbki w 1 minutę. Główną reakcję można więc mierzyć po 1 minucie bez zakłóceń, pochodzących od endogen^z^go pirogronianu z próbki. Minimalny poziom LDH wymagany do klirensu endogen^z^nego pirogronianu w próbce, określono na 1500 jedmostek/litr. Zalecana ilość wprowadzona do odczynnika ALT według wynalazku wyniosła około 2000 jednostek/litr.

W odczynniku mocznikowym, minimalna aktywność ureazy, wymagana przy pH 8,5, jako enzymu nie ograniczającego prędkości w kinetycznym modelu testowania, wynosi około 5000 jednostek/litr. Można włączyć ilości w nadmiarze, aby zwiększyć stabilność długoterminową odczynnika.

Zalecany rodzaj pomiaru analitu w odczynnikach mocznikowym i amoniakowym opiera się na zasadach kinetycznych. Ponieważ dehydrogenaza glutaminianowa (GLDH) jest enzymem ograniczającym prędkość w preparacie, poziom aktywności GLDH włączonego do odczynnika, jest krytyczny dla liniowości testu. Poziom wymaganej aktywności GLDH będzie się także zmieniał, jako funkcja pH układu odczynnika. Odpowiedni zakres aktywności GLDH może się zmieniać między 250-10000 jednostek/litr. Najbardziej odpowiednimi enzymami są enzymy pochodzenia drobnoustrojowego, jako że handlowe preparaty GLDH ze źródeł zwierzęcych są zwykle mniej stabilne i prawdopodobnie zawierają wyższe poziomy aktywnej oksydazy NADH, jako zanieczyszczenia. Zalecaną aktywnością GLDH dla odczynnika mocznikowego, przy pH 8,50, jest około 500 jednostek/litr i dla odczynnika amoniakowego, przy pH 8,50, jest około 8500 jednostek/litr.

Odczynniki według wynalazku mogą zawierać w dodatku do redukującego układu koenzymu i innych podstawowych substratów i enzymów koniecznych do określenia stężenia analitu, konserwanty, środki ^^tujące, środki powierzchniowo czynne, inhibitory proteazy, bufory, kofaktory, środki przociwbakteryjee i inne składniki, które pełnią funkcje wzmocnienia stabilności, lecz nie wpływają materialnie na charakterystykę wynalazku.

Pierwotnymi kryteriami wyboru buforu jest dobra zdolność buforowania przy wybranym pH, z minimalnym wiązaniem kationu dwuwartościowego. pH i układ buforowy dla odczynników AST i ALT wybiera się zgodnie z zaleceniami Międzynarodowej Federacji Chemii Klinicznej (IFCC) dla pomiaru traesamieaz. Generalną praktyczną regułą jest to, że bufor można uznać za skuteczny, jeśli pKA wynosi ± 1,0 jednostek pH z wybranego pH. Zalecane pH odczynnika według wynalazku wynosi 7-9. Dla transaminazy asparaginianowej, optymalna aktywność katalityczna zachodzi przy pH około 7,0-8,2, w temperaturze 30°C. Najbardziej zalecane pH dla odczynnika AST wynosi około 8,1 ± 0,1 w temperaturze 20°C, ponieważ przy tym pH NADH jest stabilny. Dla odczynnika ALT, maksymalna aktywność katalityczna zachodzi przy pH, wynoszącym około 7,3-7,9 w temperaturze 20°C. Najbardziej zalecanym pH dla odczynnika ALT jest 7,7 w temperaturze 20° C. Przy tych zalecanych pH osiąga się

186 517 kompromis miedzy optymalną aktywnością enzymu i stabilnością enzymów i koenzymu w roztworze. Niższe pH może dać w wyniku zwiększenie degradacji koenzymu.

Zalecanym układem buforowym dla odczynnika mocznikowego jest Tris przy pH 8,50, chociaż zakres 7,6-9,5 można uznać za dopuszczalny. Zalecanym stężeniem buforu, dla skutecznego zdolności buforowania, jest 100 mM Tris, chociaż można stosować zakres 20-200 mM Tris. W tym układzie buforowym można stosować szeroki zakres alternatywnych buforów, co dostarcza skutecznej zdolności buforowania, w zakresie 7,5-9,5.

Zalecanym układem buforującym dla odczynnika amoniakowego jest Tris przy pH 8,59,0, chociaż każde pH w zakresie 7,5-9,5 można uznać za dopuszczalne. Zalecanym stężeniem buforu dla skutecznej zdolności buforowania jest 100 mM Tris, chociaż można użyć wszystko w zakresie 20-200 mM Tris.

Odpowiednie bufory dla odczynników AST i ALT obejmują HEPES, kwas 4-morfolinopropanosulfonowy (MOPS) lub kwas 2-[tris(hydroksymetylo)metylo<anino]-l-etanosulfonowy (TES) albo dietanoloamina albo inne dobre bufory, Tricine, Bicine, TEA i TAPS, TAPSO i POPSO. Zalecanym buforem według wynalazku jest TRIS, o całkowitym stężeniu korzystnie wynoszącym 30-150 mmoli/litr, a korzystniej około 70-100 mmoli/litr, chociaż preferuje się około 80 mmoli/litr. Przy wyższych stężeniach buforu AST jest silnie hamowany. Zauważono, że bufory fosforanowe wydają się zwiększać tempo rozkładu NADH i hamować łączenie pirydoksalo-5-fosforanu(P-5-P) z apoenzymem transaminazy. Testowaną próbkę można rozcieńczyć jeśli trzeba, każdym odpowiednim rozcieńczalnikiem, takim jak woda dejonizowana lub roztwór soli. W dodatku do wyżej wymienionych buforów odpowiednich dla odczynników AST i ALT, następujące dobre bufory są także odpowiednie dla odczynników mocznikowych i amoniakowych: CAPSO, CHES i AMPSO.

Odpowiednie są także konserwanty, takie jak azydek sodu (NaN3), kwas hydroksybenzoesowy, gentamycyna, Thymol i konserwanty pozbawione rtęci dostępne od Boehringer Mannheim, takie jak metyloizotiazolon. Odpowiednim poziomem jest taki, że konserwant zachowuje swoje właściwości konserwujące przez co najmniej 6-8 miesięcy, przy przechowywaniu w temperaturze 2-8°C, bez inhibicji enzymów obecnych w odczynniku. Odpowiednim zakresem spełniającym te kryteria jest 0,1-1,0 g/litr.

Różne środki chelatujące, takie jak EDTA, EGTA, kwas N-(2-hydroksyetylo)etylenodiaminotrioctowy (HEDTA), itd. są także odpowiednie jako niespecyficzne środki stabilizujące. W odczynnikach AST i ALT według wynalazku, korzystnie wykorzystuje się EDTA, przy poziomie około 2,0-10,0 mmoli/litr, w celu stabilizacji 2-oksoglutaranu. Jest on dostępny jako sól tetrasodowa, a także sól potasowa, ale zalecaną solą według wynalazku jest sól disodowa. W odczynnikach mocznikowym i amoniakowym, EDTA obecna jest w zakresie 0,2-10 mM. Szczególnie zalecanym stężeniem EDTA jest 1 mM.

Środki stabilizujące enzymy można także wprowadzić do odczynników według wynalazku. Zalecanym środkiem stabilizującym jest albumina surowicy bydlęcej, klasy pozbawionej proteazy. Inne odpowiednie mogą zawierać gamma globulinę bydlęcą, N-acetylo cysteinę i glicerol. ,

Jeśli trzeba, można także dodać odpowiednich środków przeciw pienieniu. Środki powierzchniowo czynne, które można stosować, obejmują środki powierzchniowo czynne Zwitterionic i niejonowe środki powierzchniowo czynne, o poziomach, nie hamujących enzymów obecnych w odczynnikach.

W innym aspekcie wynalazku dostarcza się ulepszonego sposobu enzymatycznego określenia stężenia analitu w próbce płynów ciała, w którym mierzy się stopień utlenienia koenzymu, przy czym ulepszenie obejmuje stabilizację odczynnika, zawierającego wspomniany koenzym przeciw utlenieniu, przez układ redukujący koenzymu, zawierający parę enzym i substrat wybraną tak, aby umożliwić ciągłą regenerację wspomnianego koenzymu w okresie przechowywania wspomnianego odczynnika.

Dostarcza się także ulepszonego sposobu enzymatycznego określania stężenia transaminazy w próbce płynów ciała, w którym mierzy się stopień utlenienia koenzymu, przy czym ulepszenie obejmuje stabilizację odczynnika, zawierającego wspomniany koenzym przeciw utlenieniu przez układ redukujący koenzymu, zawierający parę enzym i substrat wybraną tak,

186 517 aby umożliwić ciągłą regenerację wspomnianego koenzymu w okresie przechowywania wspomnianego odczynnika.

Dostarcza się także ulepszonego sposobu enzymatycznego określania aminotransferazy asparaginianowej w próbce płynów ciała, w którym mierzy się stopień utlenienia koenzymu, przy czym ulepszenie obejmuje stabilizację odczynnika, zawierającego wspomniany koenzym przeciw utlenieniu przez układ redukujący koenzymu, zawierający parę enzym i substrat wybraną tak, aby umożliwić ciągłą regenerację wspomnianego koenzymu w okresie przechowywania wspomnianego odczynnika.

Dostarcza się także ulepszonego sposobu enzymatycznego określania aminotransferazy alaninowej w próbce płynów ciała, w którym mierzy się stopień utlenienia koenzymu, przy czym ulepszenie obejmuje stabilizację odczynnika, zawierającego wspomniany koenzym przeciw utlenieniu przez układ redukujący koenzymu, zawierający parę enzym i substrat wybraną tak, aby umożliwić ciągłą regenerację wspomnianego koenzymu w okresie przechowywania wspomnianego odczynnika.

Dostarcza się także ulepszonego sposobu enzymatycznego określania stężenia mocznika w próbce płynów ciała, w którym mierzy się stopień utlenienia koenzymu, przy czym ulepszenie obejmuje stabilizację odczynnika, zawierającego wspomniany koenzym przeciw utlenieniu przez układ redukujący koenzymu, zawierający parę enzym i substrat wybraną tak, aby umożliwić ciągłą regenerację wspomnianego koenzymu w okresie przechowywania wspomnianego odczynnika.

Dostarcza się także ulepszonego sposobu enzymatycznego określania stężenia amoniaku w próbce płynów ciała, w którym mierzy się stopień utlenienia koenzymu, przy czym ulepszenie obejmuje stabilizację odczynnika, zawierającego wspomniany koenzym przeciw utlenieniu przez układ redukujący koenzymu, zawierający parę enzym i substrat wybraną tak, aby umożliwić ciągłą regenerację wspomnianego koenzymu w okresie przechowywania wspomnianego odczynnika.

W zalecanym sposobie zgodnie z tym aspektem, enzym w parze enzym i substrat, ma niecałkowitą specyficzność wobec wspomnianego substratu, zmniejszając przez to tempo wzajemnej reaktywności między enzymem i substratem.

W zalecanej postaci realizacji tego aspektu wynalazku, układ redukcyjny koenzymu zawiera enzym i substrat, posiadające specyficzność wobec siebie, w stosunku do specyficzności enzymu wobec jego naturalnego substratu, wynoszącą mniej niż 100%, korzystnie mniej niż 50%, a najkorzystniej mniej niż 10%. Najkorzystniej, wzajemna specyficzność pary enzym/substrat, w stosunku do specyficzności enzymu wobec jego naturalnego substratu, jest mniejsza niż 5%, celowo około 2%.

Wyboru koenzymu, substratu i enzymu można dokonać spośród wymienionych tu powyżej, w związku z odczynnikami według wynalazku, w zależności od oznaczanego analitu.

W jednej postaci realizacji tego aspektu wynalazku, zalecanymi komponentami układu redukującego koenzymu, stosowanego do określania stężenia analitu, są NADH, G-6-P-FH i D-glukoza tak, że zachodzącą reakcją regeneracji jest

D-glukoza + NAD+ —°-6p-dii_> nADH + glukonolakton

Z powodu niskiej specyficzności G-6-P-DH wobec D-glukozy, ta reakcja regeneracji jest powolna, a więc nie kompetytywna z głównymi reakcjami, dotyczącymi określania poziomów analitów.

Zalecane postacie realizacji

W jednej zalecanej postaci realizacji wynalazku, odczynnik ALT zasadniczo zawiera

G-6-P-DH D-glukoza układ redukujący koenzymu

L-alanina substrat

LDH enzymy specyficzne wobec substratu

NADH koenzym

K2HPO4 aktywator

2-oksoglutaran substrat

186 517

c.d. tabeli 4

1	2	3	4
G-6-PDH Leuconostoc mesenteroides			2000 jednostek
D-glukoza	180,16	100 mM	18,016 g
MDH drobnoustrojowe			200 jednostek

Preparat jest 10% stężeniem, aby umożliwić rozcieńczenie próbki.

W zalecanej postaci realizacji wynalazku, odczynnik mocznikowy zasadniczo zawiera G-6-P-DH D-glukoza układ redukujący koenzymu

Ureaza enzymy specyficzne wobec analitu a-ketoglutaran substratt

NADH koenzym

K2HPO4 aktywator

GLDH enzym specyficzny wobec

Odczynnik mocznikowy sporządzony według wynalazku jest następujący:

Ta b e 1a 5A

Surowce	Ciężar cząsteczkowy	Ilość/litr
Bufor Tris	121,14	5,0-10,0 g
Tris HC1	157,60	3,5-9,5 g
a-ketoglutaran, sól Na (bezwodna)	190,1	0,5-3,5 g
EDTA-disodowy	372,24	0,1-1,Og
NADH, Na2, 3H2O	763,5	0,1-0,3 g
Fosforan potasu dwuzasadowy (K2HPO4)	174,18	0,3-2,0 g
Albumina surowicy bydlęcej		0,05-2,0 g
Azydek sodu	65,01	0,1-1,Og
D-glukoza	180,16	3,0-2 1,0 g
Ureaza (drobnoustrojowa)		4000-9000 jednostek
GLDH (drobnoustrojowy)		250-1000 jednostek
G-6-PDH Leuconostoc mesenteroides		1000-4500 jednostek

W szczególności, zalecany odczynnik mocznikowy według wynalazku sporządza się następująco:

Ta b e 1a 5B

Surowce	Ciężar cząsteczkowy	Stężenie	Ilość/litr
1	2	3	4
Tris	121,14	61,3 mM	7,43 g
Tris HC1	157,60	38,7 mM	6,10 g
a-ketoglutaran, sól Na (bezwodna)	190,1	7,5 mM	1,43 g
EDTA-disodowy	372,24	1,0 mM	0,372 g
NADH, Na2, 3H20	763,5	0,28 mM	0,214 g
Fosforan potasu dwuzasadowy (K2HPO4)	174,18	5,0 mM	0,871 g

186 517

W dodatku, korzystnie włącza się bufor Tris, Tris HCl, EDTA-disodowy, albuminę surowicy bydlęcej i azydek sodu.

Jeden odczynnik ALT sporządzony zgodnie z wynalazkiem jest następujący:

Tabela 1

Surowce	Ciężar cząsteczkowy	Ilość/litr
Bufor Tris	121,14	1,5-3,5 g
Tris HCl	157,60	8,0-14,0 g
L-alanina	89,09	34,0-45,0 g
α-ketoglutaran, sól Na (bezwodna)	190,1	0,5-3,5 g
EDT A-disodowy	372,24	1,0-3,0 g
Albumina surowicy bydlęcej		0,1-2,0 g
NADH, Na2, 3H2O	763,5	0,1-0,3 g
Fosforan potasu dwuzasadowy (K.2HPO4)	174,18	0,3-1,3 g
Azydek sodu	65,01	0,1-1,0 g
LDH drobnoustrojowe		2000-5000 jednostek
G-6-PDH		200-3000 jednostek
D-glukoza	180,16	15,0-21,0 g

W szczególności, jeden zalecany odczynnik ALT według wynalazku sporządza się następująco:

Tabela 2

Surowce	Ciężar cząsteczkowy	Stężenie	llość/litr
Bufor Tris	121,14	18 mM	2,18 g
Tris HCl	157,60	70 mM	11,03 g
L-alanina	89,09	440 mM	39,2 g
α-ketoglutaran, sól Na (bezwodna)	190,1	13,2 mM	2,51 g
EDT A-di odowy	372,24	5,5 mM	2,04 g
Albumina surowicy bydlęcej		0,1%	1,00 g
NADH,Na2, 3H2O	763,5	0,26 mM	0,199 g
Fosforan potasu dwuzasadowy (K2HPO4)	174,18	5 mM	0,87 g
Azydek sodu	65,01	7,7 mM	0,50 g
LDH drobnoustrojowe			4000 jednostek
G-6-PDH			2000 jednostek
D-glukoza	180,16	100 mM	18,016 g

Preparat jest 10% stężeniem, aby umożliwić rozcieńczenie próbki.

186 517

W jednej zalecanej postaci realizacji wynalazku, odczynnik AST zasadniczo zawiera

G-6-P-DH D-glukoza ukriad redukujący koenzymu

L-asparaginian subsrrat

LDH enzymy

MDH wobec substratu

NADH koenzym

K₂HPO4 toctywator

2-oksoglutarao subsrrat

W dodatku, korzystnie włącza się bufor Tris, Tris HCl, EDTA-disodowy, albuminę surowicy bydlęcej i azydek sodu.

Jeden odczynnik AST sporządzony zgodnie z wynalazkiem jest następujący:

Tabela 3

Surowce	Ciężar cząsteczkowy	Ilość/litr
Bufor Tris	121,14	2,0-6,0 g
Tris HC1	157,60	6,0-11,0 g
L-asparaginian, sól K	172,2	34,0-43,0 g
a-ketoglutaran, sól Na (bezwodna)	190,1	0,5-4,5 g
EDT A-disodowy	372,24	10-3,0 g
Albumina surowicy bydlęcej		0,1-2,0 g
NADH, Na2, 3H2O	763,5	0,1-0,3 g
Fosforan potasu dwuzasadowy (K2HPO4)	174,18	0,3-2,0 g
Azydek sodu	65,01	0,1-l,Og
LDH drobnoustrojowe		1000-4000 jednostek
G-6-PDH (Toyobo) Leuconostoc mesenteroides		1000-4500 jednostek
D-glukoza	180,16	15,0-2 1,0 g
MDH drobnoustrojowe		100-600 jednostek

W szczególności, jeden zalecany odczynnik AST według wynalazku sporządza się następująco:

Ta b el a 4

Surowce	Ciężar cząsteczkowy	Stężenie	Ilość/litr
1	2	3	4
Bufor Tris	121,14	31,2 mM	3,78 g
Tris HC1	157,60	56,8 mM	8,95 g
L-asparaginian, sól K	172,2	220 mM	37,88 g
a-ketoglutaran, sól Na (bezwodna)	190,1	13,2 mM	2,51 g
EDT A-disodowy	372,24	5,5 mM	2,04 g
Albumina surowicy bydlęcej		0,1%	1,00 g
NADH, Na2, 3H20	763,5	0,26 mM	0,199 g
Fosforan potasu dwuzasadowy (K2HPO4)	17-4,18	10,0 mM	1,74 g
Azydek sodu	65,01	Ί,Ί mM	0,50 g
LDH drobnoustrojowe			2000 jednostek

186 517

c.d. tabeli 5B

1	2	3	4
Albumina surowicy bydlęcej		0,05%	0,50 g
Azydek sodu	65,01	7,7 mM	0,50 g
D-glukoza	180,16	100 mM	18,016 g
Ureaza (drobnoustrojowa)			6500 jednostek
GLDH (drobnoustrojowy)			500 jednostek
G-6-PDH Leuconostoc mesenteroides			2000 jednostek

W jednej zalecanej postaci realizacji wynalazku odczynnik amoniakowy obejmuje zasadniczo:

G-6-P-DH D-glukoza układ redukujący koenzymu a-ketoglutaran

NADH koenzym

K2HPO4 aktywator

GLDH enzym specyficzny wobec substratu

W dodatku, korzystnie włącza się bufor Tris, Tris HC1, EDTA-disodowy, ADP-K, albuminę surowicy bydlęcej i azydek sodu..

Ta b e1a 6A

Surowce	Ciężar cząsteczkowy	Ilość/litr
Bufor Tris	121,14	5,0-10,0 g
Tris HC1	157,60	3,5-9,5 g
a-ketoglutaran, sól Na (bezwodna)	190,1	0,5-3,5 g
EDTA-disodowy	372,24	0,l-l,0g
NADPH, Nat, 4H20	905,4	0,l-0,35g
ADP-K	501,3	01,Og
Fosforan potasu dwuzasadowy (K2HPO4)	174,18	0,3-2,0 g
Albumina surowicy bydlęcej	0,05%	0,05-2,0 g
Azydek sodu	65,01	0,l-l,0g
D-glukoza	180,16	3-21 g
GLDH (drobnoustrojowy)		6000-10000 jednostek
G-6-PDH Leuconostoc mesenteroides		1000-4000 jednostek

W szczególności, zalecany odczynnik mocznikowy według wynalazku sporządza się następująco:

Ta b e 1a 6B

Surowce	Ciężar cząsteczkowy	Stężenie	Ilość/litr
Tris	121,14	61,30 mM	7,430 g
Tris HC1	157,60	38,70 mM	6,100 g
a-ketoglutaran, sól Na (bezwodna)	190,10	7,50 mM	1.430 g
EDTA-disodowy	372,24	1,00 mM	0,372 g
NADPH, Na.,, 4H20	905,40	0,28 mM	0,254 g
ADP-K	501,30	2 mM	l,0g

186 517

c.d. tabeli 6B

1	2	3	4
Fosforan potasu dwuzasadowy (K2HPO4)	174,18	5,00mM	0,871 g
Albumina surowicy bydlęcej		0,05%	0,500 g
Azydek sodu	65,01	7,70 mM	0,500 g
D-glukoza	180,16	100 mM	18,016 g
GLDH (drobnoustrojowy)			8500 jednostek
G-6-PDH Leuconostoc mesenteroides			3 500 jednostek

Mimo, że zaleca się, żeby odczynniki według wynalazku były sporządzane w konfiguracji pojedynczej fiolki, możliwe jest także sporządzenie w konfiguracji dwóch fiolek. Należy tylko zawrzeć w jednej z fiolek składnik regeneracyjny preparatu. W szczególności, IFCC zaleca, aby dla odczynników ALT i AST, 2-oksrglutaran był sporządzany jako składnik oddzielny od pozostałości preparatu. Odczynnik a (wyłączając 2-oksoglutarae)możAa inkubować z próbką pacjenta przez okres 5-10 minut, który pozwala na całkowite zajście wszystkich reakcji pobocznych. Po okresie inkubacji, można dodać 2-oksoglutarae, aby rozpocząć główną reakcję. Alternatywą do użycia 2-oksoglutaranu jako składnika inicjującego, możliwe jest także użycie asparaginianu lub alaniny w ten sam sposób, ponieważ obecność 2-oksogletaraeu zabezpiecza AST lub ALT przed inaktywacją podczas reakcji pobocznych. Układ regenerujący, zawierający niedopasowaną parę enzymu i substratu, powinien być dodany do składnika układu dwóch fiolek, który obejmuje NADH.

Jeśli stosuje się układ dwóch fiolek, zaleca się, aby preparat zawierał P-5-P, ponieważ podczas okresu inkubacji, w obecności próbki, dodanie P-5-P do surowicy aktywuje apoenzymy i pozwala na pomiar całkowitego stężenia aktywności katalitycznej AST lub ALT w dostarczonej surowicy, całkowicie nasyconej P-5-P. Zalecanym poziomem P-5-P do stosowania w układzie dwóch fiolek jest 80-120 (pmoli/litr, z korzystniejszym poziomem, wynoszącym 100 fimoli/litr.

Przykład 1

Stabilność czterech poszczególnych odczynników sporządzonych zgodnie z wynalazkiem testowano jak następuje:

Preparat:.

Odczynnik AST:

Ta b e 1a 7A

Bufor Tris	3,78 g/litr
Tris HC1	8,95 g/litr
Asparaginian	37,88 g/litr
a-ketoglutaran, sól Na (bezwodna)	2,51 g/litr
Azydek sodu	0,50 g/litr
Albumina surowicy bydlęcej	1,0 g/litr
NADH, Na23H20	0,199 g/litr
EDTA-disodowy	2,04 g/litr
Fosforan potasu dwuzasadowy (K2HPO4)	0,87 g/litr
D-glukoza	18,016 g/litr
G-6-PDH (L.Mesenteroides)	3500 jednostek/litr
D-LDH (drobnoustrojowy)	2000 jednostek/litr
MDH (drobnoustrojowy)	650 jednostek/litr

186 517

Ta b e1a 7B

Bufor Tris	4,35 g/litr
Tris HC1	8,31 g/litr
L-Asparaginian, sól K	37,88 g/litr
a-ketoglutaran, sól Na (bezwodna)	2,51 g/litr
Azydek sodu	0,50 g/litr
Albumina surowicy bydlęcej	0,50 g/litr
NADH, Na23H20	0,234 g/litr
EDT A-disodowy	1,86 g/litr
Fosforan potasu dwuzasadowy (K2HPO4)	1,74 g/litr
D-glukoza	18,0 16 g/litr
G-6-PDH (Toyobo) Luconostoc Mesenteroides	2000 jednostek/litr
LDH	2000 jednostek/litr
MDH (drobnoustrojowy)	200 jednostek/litr

Odczynnik ALT:

Ta b e1a 8A

Bufor Tris	2,18 g/litr
Tris HC1	11,0 g/litr
L-alanina	39,2 g/litr
a-ketoglutaran, sól Na (bezwodna)	2,51 g/litr
Azydek sodu	0,50 g/litr
Albumina surowicy bydlęcej	1,0 g/litr
NADH, Na23H20	0,199 g/litr
EDTA-disodowy	2,04 g/litr
Fosforan potasu dwuzasadowy (K2HPO4)	0,87 g/litr
D-glukoza	18,016 g/litr
G-6-PDH (Luconostoc Mesenteroides)	3500 jednostek/litr
LDH (drobnoustrojowy)	3000 jednostek/litr

Tabela 8B

Bufor Tris	3,27 g/litr
Tris HC1	11,03 g/litr
L-alanina	39,20 g/litr
a-ketoguutaran, sól Na (bezwodna)	2,510 g/litr
Azydek sodu	0,500 g/litr
Albumina surowicy bydlęcej	0,500 g/litr
NADH, Na23H20	0,234 g/litr
EDTA-disodowy	1860 g/litr

186 517

c.d. tabeli 8B

1	2
Fosforan potasu dwuzasadowy (K2HPO4)	0,87 g/litr
D-glukoza	18,016 g/litr
G-6-PDH (Luconostoc Mesenteroides)	2000 jednostek/litr
LDH (drobnoustrojowy)	4000 jednostek/litr

Warunki przechowywania: zamknięte i schłodzone (2-8°C)

Parametry spektrofotometryczne (Shimadzu PC2101):

• temperatura reakcji 37°C • objętość próbki do objętości odczynnika 1:10 do 1:25 • długość fali 340 nm • długość drogi optycznej kuwety 1 cm

Faza zwłoki pomiaru wynosi około 1 minuty lub mniej, a czas pomiaru wynosi do 3 minut po fazie zwłoki.

Te parametry spektrofotometryczne stosuje się do określania następujących:

• początkowej absorbancji odczynnika przy 340 nm • tempa regeneracji w temperaturze 20°C (wyrażonego w mABS/minutę)

Użyto Cobas Mira, aby określić odzyski w kontrolnych standardach.

Uzyskano następujące wyniki:

Ta b e1 a 9A

Dane absorbancji dla odczynników AST i ALT ukazanych w tabelach 7A i 8A

Przechowywanie w temperaturze 8°C Absorbancja przy 340 nm 4 (tygodnie)
	odczynnik AST	odczynnik ALT
świeży odczynnik	1,88	1,99
1	1,77	1,95
3	1,72	1,88
6	1,65	1,78
10	1,54	1,64
15	1,40	1,46
20	1,25	1,29
25	1,18	1,18
29	1,13	1,10
33	1,07	1,01

Tabe 1 a 9B

Dane absorbancji dla odczynników AST i ALT ukazanych w tabelach 7B i 8B

Przechowywanie w temperaturze 2-6°C Absorbancja przy 340 nm 4- (dni)
	odczynnik AST	odczynnik ALT
1	2	3
Świeży odczynnik	1,83	1,86
22	1,82	1,81

186 517

c.d. tabeli 9B

1	2	3
29	1,80	1,80
60	1,73	1,70
92	1,67	1,61
125	1,60	1,52
159	1,52	1,41
187	1,46	1,33
194	1,45	1,32

Następujące tabele (tabela 10A i 10B) dostarczają dowodu ciągłej działalności zarówno odczynnika AST jak i ALT przez 7 miesięcy. Dla każdego przebiegu, przeprowadzono pulę surowicy z wysoką i niską zawartością AST i ALT, stosując zarówno odczynnik świeżo sporządzony jak i odczynnik przechowywany w temperaturze 8°C, w różnych przedziałach czasowych.

Ta b e1a 10A

Kontrolne odzyski surowic dla odczynników AST i ALT ukazanych w tabelach 7A i 8A

Przechowywanie w temperaturze 8°C (tygodnie)	Odczynnik ALT (jednostki/litr)	Odczynnik AST (jednostki/litr)
	odczynnik świeży	odczynnik przechowywany w temperaturze 8°C	odczynnik świeży	odczynnik przechowywany w temperaturze 8°C
pula surowicy ->	niska	wysoka	niska	wysoka	niska	wysoka	niska	wysoka
0	40	156	42	152	45	188	45	192
4	38	154	42	162	45	185	46	191
9	41	150	38	151	46	182	46	194
12	39	157	42	152	46	189	46	187
15	32	133	33	132	40	163	38	164
25	32	121	33	117	38	180	39	180
29	31	117	32	112	33	164	37	170

Ta b e 1a 10B

Kontrolne odzyski surowic dla odczynników AST i ALT ukazane w tabelach 7B i 8B

Przechowywanie (dni)	Odczynnik ALT (jednostki/litr)	Odczynnik AST (jednostki/litr)
	odczynnik przechowywany w temperaturze 20°C	odczynnik przechowywany w temperaturze 4°C	odczynnik przechowywany w temperaturze 20°C	odczynnik przechowywany w temperaturze 4°C
pula surowicy —	niska	wysoka	niska	wysoka	niska	wysoka	niska	wysoka
1	2	3	4	5	6	7	8	9
0	32	123	32	123	40	186	40	186

186 517

c.d. tabeli 10B

1	2	3	4	5	6	7	8	9
7	33	120	-	-	41	191	-	-
14	32	121	-	-	41	184	-	-
21	33	121	33	122	41	182	40	184
28	32	120	32	120	41	185	40	184
35	33	118	33	117	42	185	44	183
60	-	-	33	120	-	-	41	185
92	-	-	36	122	-	-	45	190
125	-	-	35	123	-	-	44	189
159	-	-	36	123	-	-	43	188
187	-	-	35	125	-	-	44	187

Ta b e 1a 11A

Badania liniowości dla odczynników AST i ALT ukazane w tabelach 7A i 8A

Odczynnik AST (jednostek/litr)	Odczynnik ALT (jednostek/litr)
oczekiwana	obserwowana	oczekiwana	obserwowana
4	główna partia	odczynnik doświadczalny	4	główna partia	odczynnik doświadczalny
400	393	389	380	380	357
200	182	182	120	121	119
100	98	96	60	65	63
50	50	51	30	34	28

Ta b e 1a 11B

Badania liniowości dla odczynników AST i ALT ukazanych w tabelach 7B i 8B

Odczynnik AST (jednostek/litr)	Odczynnik ALT (jednostek/litr)
oczekiwana	obserwowana	oczekiwana	obserwowana
	świeży odczynnik	200 dni w temperaturze 4°C		świeży odczynnik	200 dni w temperaturze 4°C
120	122	113	141	137	133
240	241	237	282	285	273
300	301	295	353	353	352
360	360	357	424	422	416
420	420	416	494	493	476
480	479	472	565	560	551
540	538	527	635	635	621
600	598	596	706	710	684

186 517

Uwaga: odczynnik doświadczalny przechowywano w temperaturze 8°C przez okres 31 tygodni

Główną partię świeżo odtworzono do tego badania.

Z prezentowanych rezultatów wynika wyraźnie, że regenerowane odczynniki AST i ALT wykazują co najmniej 6-7 miesięczną stabilność podczas przechowywania w zamknięciu, w temperaturze 2-8°C. Aby działać, odczynnik musi posiadać absorbancję początkową 1,0 A. Po 7 miesiącach odczynnik wciąż posiada absorbancję co najmniej 1,0 A.

Z wyników otrzymanych w tabeli 10A i 1OB jasno wynika, że nie ma znacznych różnic w odzyskach surowic kontrolnych, uzyskanych ze świeżym odczynnikiem, w przeciwieństwie do odczynnika przechowywanego w temperaturze 8°C przez okres do 29 tygodni. Wyniki prezentowane w tabelach 11A i 11B wskazuj że odczynniki AST i ALT, obejmujące technologię regeneracji koenzymu, są wciąż zdolne do spełnienia wymagań liniowości, po 31 tygodniach przechowywania w temperaturze 8°C.

Wprowadzenie układu regeneracyjnego według wynalazku dało w wyniku wzrost odtworzonej stabilności pomiaru surowicy, zawierającej zamknięty odczynnik AST i ALT, od 1 miesiąca w temperaturze 2-8°C do co najmniej 6-8 miesięcy w temperaturze 2-8°C.

Przykład 2

Sporządzono odczynniki mocznikowe ze składników jakie opisano w tabeli 5B powyżej, z wyjątkiem tego, że włączono do preparatów 0,33 mM NADH, i poziom D-glukozy obniżono do 20 mM dla jednego z odczynników.

Preparaty w ten sposób sporządzone posiadały pH 8,5. Jako kontroli, użyto konwencjonalnego preparatu odczynnika mocznikowego. Odczynniki sporządzono z poziomem 0,15 mM amoniaku, wprowadzonego do układu odczynnika (ostateczne stężenie), jako zanieczyszczenie. Ten poziom zanieczyszczenia amoniakiem jest wystarczający do zużycia 0,15 mM NADPH w odpowiednich odczynnikach - równoważnik 0,93 jednostek absorbancji przy 340 nm. Po zakończeniu reakcji (to jest klirensu amoniaku w preparacie odczynnikowym), monitorowano absorbancję różnych roztworów w czasie (umieszczonych w szczelnych kuwetach) na spektrofotometrze Shimadzu przy 340 nm, i w temperaturze 20°C.

Wyniki prezentowane w fig. 1 ukazują regenerację zależną od czasu NADH z NAD+ i preparacie odczynnika mocznikowego według wynalazku, po zanieczyszczeniu 0,15 mM amoniaku.

W fig. 1:

Tabela A ukazuje, regenerację NADH dla konwencjonalnego odczynnika mocznikowego;

Tabela B ukazuje regenerację NADH odczynnika mocznikowego, zawierającego 5 mM fosforanu sodowego, 2000 jednostek/litr G-6-PDH i 20 mM D-glukozy;

Tabela C ukazuje regenerację NADH odczynnika mocznikowego, zawierającego 5 mM fosforanu potasu, 2000 jednostek/litr G-6-PDH i 100 mM D-glukozy.

Po 48 godzinach w temperaturze 20°C, odczynnik konwencjonalny zaprzestał regeneracji jakiegokolwiek zużytego NADH, po zanieczyszczeniu odczynnika amoniakiem. Po takim samym okresie czasu, odczynnik mocznikowy według wynalazku z 20 mM D-glukozy zregenerował 0,23 jednostki absorbancji, lub 0,04 mM NADH. Przez 48 godzin, odczynnik mocznikowy według wynalazku ze 100 mM D-glukozy zregenerował 0,70 jednostki absorbancji, albo 0,11 mM NADH. Wyniki te wskazują zdolność opisanego tutaj odczynnika do przezwyciężania wyczerpania NADH w odczynniku mocznikowym, po zanieczyszczeniu odczynnika amoniakiem.

Ta b e 1a 12

Maksymalne współczynniki regeneracji dla odczynnika mocznikowego w temperaturze 20°C, mierzone przy 340 nm.

Warunki odczynnika mocznikowego	Współczynnik regeneracji (m/Abs/minutę)
Odczynnik konwencjonalny	- 0,020
Odczynnik według wynalazku, zawierający 5 mM Na-PO4 2000 jednostek/litr G-6-PDH i 2 mM D- glukozy	+ 0,088
Odczynnik według wynalazku, zawierający 5 mM K-PO4 2000 jednostek/litr G-6-PDH i 100 mM D-glukozy	+ 0,386

186 517

Maksymalne współczynniki regeneracji NADH, W odpowiednich odczynnikach mocznikowych, pokazano w tabeli 12. W konwencjonalnym odczynniku mocznikowym, zachodziła powolna utrata absorbancji w czasie, po klirensie zanieczyszczenia amoniakiem. W preparacie według wynalazku, współczynnik regeneracji NADH wzrastał, razem ze wzrostem stężenia D-glukozy w odczynniku.

Odczynniki amoniakowe sporządzono ze składnikami jakie opisano w powyższej tabeli 6B, z wyjątkiem tego, że stosunek buforu Tris/Tris HC1 (100 mM całkowitego buforu) zmieniał się tak, że wartości pH odczynnika uzyskano w zakresie pH 8,0-9,3. Ostateczne stężenie 0,2 mM NADPH użyto także w sporządzonych odczynnikach amoniakowych. Sporządzono także kontrolny odczynnik amoniakowy, bez D-glukozy, fosforanu potasu czy G-6-PDH. Odczynniki sporządzono z poziomem 0,1 mM amoniaku wprowadzonego do układu odczynnika (stężenie ostateczne) jako zanieczyszczenie. Ten poziom zanieczyszczenia amoniakiem jest wystarczający do zużycia 0,1 mM NADPH w odpowiednich odczynnikach - równoważny 0,62 jednostek absorbancji przy 340 nm. Po zakończeniu reakcji (to jest klirensu amoniaku w preparacie odczynnikowym), monitorowano absorbancję różnych roztworów w czasie (umieszczonych w szczelnych kuwetach) na spektrofotometrze Shimadzu przy 340 nm, i w temperaturze 20°C.

Wyniki prezentowane w fig. 2 pokazują regenerację zależną od czasu NADPH z NADP w preparatach odczynnika amoniakowego, między wartościami pH 8,0-9,3, według wynalazku, po zanieczyszczeniu 0,1 mM amoniaku. Regenerację NADPH, następującą po klirensie zanieczyszczenia amoniakiem, zakończono w 24 godziny po zanieczyszczeniu amoniakiem, w temperaturze 20°C. Maksymalne współczynniki regeneracji NADPH w odpowiednich odczynnikach amoniakowych pokazano w tabeli 13. W konwencjonalnym odczynniku amoniakowym przy pH 8,0, absorbancja roztworu utrzymywała się między 0,6-0,65, z powolną utratą absorbancji. W preparatach według wynalazku przy wszystkich testowanych wartościach pH, współczynnik regeneracji NADPH był zupełnie podobny. Maksymalny współczynnik regeneracji NADPH był przy pH 8,50. Wyniki te jasno wskazują zdolność opisanego tutaj wynalazku do przezwyciężania wyczerpania NADPH w odczynniku amoniakowym, po zanieczyszczeniu odczynnika amoniakiem.

Tabela 13

Maksymalne współczynniki regeneracji NADPH dla odczynnika amoniakowego w temperaturze 20°C, mierzonych przy 340 nm

Warunki odczynnika amoniakowego	Współczynnik regeneracji (m/Abs/minutę)
pH 8,0 odczynnik konwencjonalny	-0,03
pH 8,0 preparat według wynalazku	+ 0,78
pH 8,5 preparat według wynalazku	+ 0,85
pH 9,0 preparat według wynalazku	+ 0,76
pH 9,3 preparat według wynalazku	+ 0,71

Przykład 3

Współczynniki utraty NAD(P)H w odczynnikach amoniakowym i mocznikowym

A Odczynnik mocznikowy

Sporządzono odczynniki mocznikowe ze składem preparatu jaki opisano w tabeli 5B, z następującymi odmianami. Końcowe stężenie NADH w preparatach odczynnika wynosiło 0,25 mM. pH odczynnika mocznikowego ustawiono przez zróżnicowanie stosunku Tris/Tris HC1 (100 mM całkowitego buforu). Kontrolne roztwory odczynnika mocznikowego sporządzono przy nieobecności D-glukozy, fosforanu i G-6-PDH.

Absorbancję roztworu próbki odczynnika, przechowywanego w szczelnych kuwetach w temperaturze 20 ± 2°C, monitorowano przy 340 nm.

Zmniejszenie absorbancji roztworów odczynnika mocznikowego w czasie, przechowywanego w temperaturze 20 ± 2°C, monitorowanego przy 340 nm, pokazano w tabeli 14. Oka28

186 517 zuje się, że zarówno w obecności jak i nieobecności układu regeneracyjnego koenzymu według wynalazku, roztwory tracą absorbancję szybciej przy pH 8,0 niż przy pH 8,5. W preparacie według wynalazku, jednakże, tempo utraty absorbancji roztworu odczynnika, było także zacznie wolniejsze. Innymi słowy, podniesione pH i wprowadzenie układu regenerującego koenzymu według wynalazku, znacznie zmniejsza tempo zanikania NADPH z roztworu odczynnika mocznikowego.

Powinno się zauważyć, że chociaż wzrost pH powyżej 8,5 będzie także sprzyjać stabilności NADH, dostępne w handlu enzymy ureaza i dehydrogenaza glutaminianowa stają się coraz mniej stabilne i mniej aktywne w preparacie odczynnika. W konsekwencji, pożądana jest równowaga w pH preparatu odczynnika tak, aby utrzymać odpowiednią aktywność i stabilność enzymów, chociaż także zapewnienie rozsądnej stabilności NADH. Na tej podstawie zaleca się pH preparatu odczynnika około 8,5.

Tabela 14

Absorbancja (340 nm) roztworów odczynnika mocznikowego, przechowywanych w temperaturze 20°C, jako funkcja czasu.

Okres inkubacji (dni)	pH 8,0 preparat konwencjonalny	pH 8,0 preparat według wynalazku	pH 8,5 preparat kowencjonalny	pH 8,0 preparat według wynalazku
0	1,73	1,72	1,77	1,74
7	1,63	1,68	1,70	1,75
14	1,52	1,61	1,64	1,70
23	1,36	1,48	1,54	1,62
29	1,25	1,40	1,47	1,53
37	1,12	1,30	1,38	1,52

B Odczynnik amoniakowy

Sporządzono odczynniki amoniakowe ze składem preparatu jaki opisano w tabeli 6B, z następującymi odmianami. pH odczynnika amoniakowego ustawiono przez zróżnicowanie stosunku Tris/Tris HCl (100 mM całkowitego buforu). Końcowe stężenie NADPH w roztworach odczynnika amoniakowego wynosiło 0,2 mM. Kontrolne roztwory odczynnika amoniakowego sporządzono bez D-glukozy, fosforanu i G-6-PDH.

Absorbancję roztworu próbki odczynnika, przechowywanego w szczelnych kuwetach w temperaturze 20 ± 2°C, monitorowano przy 340 nm.

Zmniejszenie absorbancji roztworów odczynnika amoniakowego w czasie, przechowywanego w temperaturze 20°C, monitorowanego przy 340 nm, pokazano w tabeli 15. Okazuje się, że zarówno w obecności jak i nieobecności układu regeneracyjnego koenzymu według wynalazku, roztwory tracą absorbancję szybciej przy niższym pH. W preparatach według wynalazku, jednakże, tempo utraty absorbancji roztworu odczynnika, było także znacznie wolniejsze. Innymi słowy, podniesione pH i wprowadzenie układu regenerującego koenzymu według wynalazku, znacznie zmniejsza tempo zanikania NADPH z roztworu odczynnika amoniakowego.

Powinno się zauważyć, że chociaż wzrost pH będzie także sprzyjać stabilności NADPH, dostępna w handlu dehydrogenaza glutaminianowa staje się coraz mniej stabilna i mniej aktywna w preparacie odczynnika powyżej pH 8,5. W konsekwencji, pożądana jest równowaga w pH preparatu odczynnika tak, aby utrzymać odpowiednią aktywność i stabilność enzymów, chociaż także zapewnienie rozsądnej stabilności NADH. Na tej podstawie zaleca się pH preparatu odczynnika około 8,5-9,0.

186 517

Ta b e1a 15

Absorbancja (340 nm) roztworów odczynnika amoniakowego, przechowywanego w temperaturze 20°C, jako funkcja czasu

Okres inkubacji (dni)	PH 8,0 preparat konwencjonalny	pH 8,0 preparat z technologią regeneracyjną według wynalazku	pH 8,5 preparat konwencjonalny	pH 8,5 preparat z technologią regeneracyjną według wynalazku	pH 9,0 preparat konwencjonalny	pH 9,0 preparat z technologią regeneracyjną według wynalazku
0	1,39	1,41	1,38	1,41	1,4	1,41
6	1	1,09	1,20	1,27	1,31	1,36
12,9	0,64	0,79	0,99	1,12	1,2	1,29
20,1	0,39	0,57	0,79	0,97	1,09	1,22
32,9	0,15	0,33	0,49	0,74	0,87	1,07
38,1	0,13	0,28	0,39	0,67	0,8	1,03

Przykład 4

Funkcjonalność odczynników amoniakowego i mocznikowego

A Odczynnik mocznikowy

Sporządzono odczynnik mocznikowy według składników wymienionych w tabeli 5B, w obecności i nieobecności D-glukozy, fosforanu i G-6-PDH. Jednakże, stężenie ostateczne NADH w preparacie odczynnika, wynosiło 0,25 mM. Lineamość odczynników porównano z kontrolami Verichem/Normal/Abnormal, na urządzeniu Roche® Cobas Mira™, stosując parametry wymienione poniżej.

Temperatura reakcji: 37°C Obj ętość próbki do odczynnika: 1:100

Długość fali: 340 nm

Wyniki prezentowane w tabeli 16 wskazują, że odczynnik mocznikowy przy pH 8,50 według niniejszego wynalazku, jest liniowy do najwyższych poziomów testowanej mocznikowej próby kontrolnej (Verichem poziom E, z 37,4 mM mocznika), ze zmierzonymi zmiennościami wartości, wynoszącymi 5% wyszczególnionego stężenia. Odczynnik mocznikowy według wynalazku daje odczyt dokładnie w zakresie odchylenia od wartości dla normalnych i nienormalnych mocznikowych próbek kontrolnych.

Ta b ela 16

Badania liniowości z użyciem odczynnika mocznikowego, przy pH 8,50

Próbka kontrolna	Poszczególne stężenia mocznika dla próbek kontrolnych (mM)	Oszacowane stężenie mocznika dla próbek kontrolnych (mM)
		odczynnik mocznikowy według wynalazku	odczynnik mocznikowy (konwencjonalny)
Verichem poziom A	1,8	2	2
Verichem poziom B	10,7	10,8	11,3
Verichem poziom C	19,6	19,9	19,6
Verichem poziom D	28,5	27,7	26,7
Verichem poziom E	37,4	35,9	35,8
Kontrola normalna	5,2 ± 1,4	5,2	5,2
Kontrola nienormalna	18,3 ±2,1	19,1	18,6

186 517

B Odczynnik amoniakowy

Sporządzono odczynnik amoniakowy, w obecności i nieobecności D-glukozy, fosforanu i G-6-PDH, według składników wymienionych w tabeli 6B. Liniowość odczynników porównano z kontrolami wodnego roztworu amoniaku, na urządzeniu Roche® Cobas Mira™, stosując parametry wymienione poniżej.

Temperatura reakcji: 37°C Objętość próbki do odczynnika: 1:10

Długość fali: 340 nm

Wyniki prezentowane w tabeli 17 wskazują, że odczynnik amoniakowy przy pH 8,50 według wynalazku, jest liniowy do najwyższych poziomów testowanej amoniakowej próby kontrolnej (1200 jM amoniaku), ze zmierzonymi zmiennoś^ami wartości, wynoszącymi 5% wyszczególnionego stężenia.

Ta b e 1a 17

Badania liniowości z użyciem odczynnika amoniakowego, przy pH 8,50

Poszczególne stężenia amoniaku dla wodnego roztworu próbki kontrolnej (pM)	Średnie oszacowane stężenie amoniaku dla próbek kontrolnych (pM), z podwojonych pomiarów
10	11,6 ±6
20	24,2 ± 2,3
50	52,5 ±3,1
100	101,9 ±2,7
200	203,5 ± 1,3
400	409,7 ±3,1
800	789,3 ± 3,5
1200	1164 ±2,2

Przykład 5

Odczynnik mocznikowy można konfigurować w formacie dwóch fiolek, zgodnie z konfiguracją preparatu wyszczególniona poniżej. Stosunek objętości odczynnika dodanego do fiolki A i fiolki B wymagany, aby uzyskać połączony, wynosi 5:1 dla fiolki a : fiolki B.

Fiolka A mocznikowa

Surowce	Ciężar cząsteczkowy	Stężenie	Ilcść/litr
Tris	121,14	61,3 mM	7,43 g
Tris HC1	157,6	38,7 mM	6,10 g
NADH, Na2, 3H20	763,5	0,34 mM	0,26 g
NaN3	65,01	7,7 mM	0,5 g
K2HPO4	174,18	5,0 mM	0,871 g
D-glukoza	180,16	100 mM	18,02 g
BSA		0,05%	0,5 g
G-6-PDH Leuconostoc mesenteroides		2000 jednostek/litr	2000 jednostek

186 517

Fiolka B mocznikowa

Surowce	Ciężar cząsteczkowy	Stężenie	Ilość/litr
Tris	121,14	61,3 mM	7,43 g
Tris HC1	157,60	38,7 mM	6,10 g
a-ke^1^c^glk^ia^ran, sól Na (bezwodna)	190,1	45 mM	8,55 g
EDTA Na2, 3H20	372,24	1 mM	0,372 g
BSA	-	0,05%	0,5 g
GLDH (drobnoustrój owy)	-	50000 jednostek/litr	50000 jednostek
Ureaza (drobnoustrojowa)	-	40000 jednostek/litr	40000 jednostek

Odczynnik amoniakowy, format 2 fiołkowy

Odczynnik amoniakowy można konfigurować w formacie dwóch fiolek, zgodnie z konfiguracją preparatu wyszczególnioną poniżej. Stosunek objętości odczynnika dodanego do fiolki a i fiolki B wymagany, aby uzyskać odczynnik połączony, wynosi 5:1 dla fiolki A: fiolki B. W dostarczonym przykładowo preparacie, stosuje się NADH zamiast NADPH. W konsekwencji, do fiolki a włącza się LDH, w celu usunięcia z próbki pacjenta zakłócającego pirogronianu, przed rozpoczęciem głównej reakcji oznaczenia.

Fiolka A amoniakowa

Surowce	Ciężar cząsteczkowy	Stężenie	Ilość/litr
Tris	121,14	61,3 mM	7,43 g
Tris HC1	157,60	38,7 mM	6,10 g
NADH, Na2,3H20	763,5	0,34 mM	0,26 g
NaN2	65,01	7,7 mM	0,5 g
K2HpO4	174,18	5 mM	0,871 g
D-glukoza	180,16	100 mM	18,02 g
BSA	-	0,05%	0,5 g
G-6-PDH Leuconostoc mesenteroides		2000 jednostek/litr	2000 jednostek
LDH (drobnoustrojowy)		2000 jednostek/litr	2000 jednostek

Fiolka B amoniakowa

Surowce	Ciężar cząsteczkowy	Stężenie	Ilość/litr
Tris	121,14	61,3 mM	7,43 g
Tris HC1	157,60	38,7 mM	6,10 g
a-ketoguutaran, sól Na (bezwodna)	190,1	45 mM	8,55 g
EDTA Na2,3H20	372,24	1 mM	0,372 g
BSA	-	0,05%	0,5 g
GLDH (drobnoustrojowy)	-	50000 jednostek/litr	50000 jednostek
Ureaza (drobnoustrojowa)	-	40000 jednostek/litr	40000 jednostek

186 517

Inne wielkie zalety odczynnika i sposób według wynalazku są takie, że odczynnik jest w najkorzystniejszej postaci, odczynnikiem w pojedynczej fiolce, przez co zabiera mniej miejsca oraz pomniejsza problemy magazynowania, towarzyszące odczynnikom z dotychczasowego stanu techniki, jest on także możliwy do przystosowania w różnych układach oprzyrządowania.

Należy docenić, że jest tam wiele „niespecyficznych” par enzym/substrat, które można stosować do spowalniania regeneracji koenzymu użytego w odczynniku i sposobie według wynalazku. Oprócz tych wymienionych tutaj, istnieją inne, niedostępne w handlu lub trudno osiągalne z powodu wysokiej ceny.

Doceni się także, że ten wynalazek będzie możliwy do zastosowania w stabilizacji odczynników innych niż AST, ALT, amoniakowym i mocznikowym, np. LDH (pirogronian do mleczanu), triglicerydowym i salicylanowym. Wynalazku nie powinno się uznać za ograniczony przez zilustrowanie go w tym szczegółowym opisie, szczególnie ze względu na AST, ALT, amoniakowy i mocznikowy.

186 517

Kg 2.

Badania Regeneracji NADH dla Odczynnika Amoniakowego

Absorbancja (nm

Czas (godziny)

186 517

Figi.

Badania Regeneracji NADH dla Odczynnika Mocznikowego

Absorbancja (nm)

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz Cena 6,00 zł.

Claims (31)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Odczynnik do mierzenia stężenia analitu u pacjenta polegającego na pomiarze stopnia utlenienia koenzymu, znamienny tym, że zawiera układ redukujący koenzym składający się z pary enzym i substrat, przy czym stopień specyficzności między enzymem i substratem jest mniejszy niż 50% w oparciu o równoważność molową umożliwiając stałą regenerację koenzymu w trakcie przechowywania odczynnika, natomiast analit jest wybrany z grupy zawierającej transaminazę, transaminazę asparaginianową, transaminazę alaninową, mocznik i amoniak.
2. 2. Odczynnik według zastrz. 1, znamienny tym, że wspomnianą parą enzym/substrat jest dehydrogenaza glukozo-6-fosforanowa/D-glukoza.
3. 3. Odczynnik według zastrz. 1, znamienny tym, że jest w postaci jednej fiolki.
4. 4. Odczynnik według zastrz. 1, znamienny tym, że ciągła regeneracja koenzymu zachodzi z prędkością w zakresie 0,01-0,9 mAbs/minutę przy 340 nm, w temperaturze 18-25°C.
5. 5. Odczynnik według zastrz. 1, znamienny tym, że enzym jest enzymem mikrobiologicznym.
6. 6. Odczynnik według zastrz. 1, znamienny tym, że stopień specyficzności między wspomnianym enzymem i wspomnianym 2 substratem jest mniejszy niż 10% w oparciu o równoważność molową.
7. 7. Odczynnik według zastrz. 1, znamienny tym, że gdy analitem jest transaminaza alaninowa zawiera dehydrogenazę glukozo-6-fosforanową, D-glukozę, L-alaninę, dehydrogenazę L-mleczanową (LDH), dinukleotyd nikotynoamidoadeninowy (NADH), K2HPO4, 2-oksoglutaran oraz korzystnie dodatkowo bufor Tris, Tris HCl, EDTA-disodowy, albuminę surowicy bydlęcej i azydek sodu.
8. 8. Odczynnik według zastrz. 7, znamienny tym, że posiada skład określony w tabeli 1, korzystnie określony w tabeli 2.
9. 9. Odczynnik według zastrz. 1, znamienny tym, że gdy analitem jest transaminaza asparaginianowa zawiera dehydrogenazę glukozo-6-fosforanową, D-glukozę, L-asparaginian, dehydrogenazę L-mleczanową (LDH), dehydrogenazę maleinianową (MDH), dinukleotyd nikotynoamidoadeninowy (NADH), K2HPO4, 2-oksoglutaran oraz korzystnie dodatkowo bufor Tris, Tris HC1, EDTA-disodowy, albuminę surowicy bydlęcej i azydek sodu.
10. 10. Odczynnik według zastrz. 8, znamienny tym, że posiada skład określony w tabeli 3, korzystnie określony w tabeli 4.
11. 11. Odczynnik według zastrz. 1, znamienny tym, że gdy analitem jest mocznik zawiera dehydrogenazę glukozo-6-fosforanową, D-glukozę, ureazę, a-ketoglutaran, fosforan dinukleotydu nikotynoamidoadeninowego (NADPH), K2HPO4, dehydrogenaza glutaminianowa (GLDH), oraz korzystnie dodatkowo bufor Tris, Tris HCl, EDTA-disodowy, albuminę surowicy bydlęcej i azydek sodu.
12. 12. Odczynnik według zastrz. 10, znamienny tym, że posiada skład określony w tabeli 5A, korzystnie określony w tabeli 5B.
13. 13. Odczynnik według zastrz. 1, znamienny tym, że gdy analitem jest amoniak zawiera dehydrogenazę glukozo-6-fosforanową, D-glukozę, a-ketoglutaran, fosforan dinukleotydu nikotynoamidoadeninowego (NADPH), K2HPO4, dehydrogenaza glutaminianowa (GLDH), oraz korzystnie dodatkowo bufor Tris, Tris HCl, EDTA-disodowy, ADP-K, albuminę surowicy bydlęcej i azydek potasu.
14. 14. Odczynnik według zastrz. 12, znamienny tym, że posiada skład określony w tabeli 6A, korzystnie określony w tabeli 6B.
15. 15. Odczynnik według zastrz. 1, znamienny tym, że analitem jest transaminaza.

    186 517
16. 16. Odczynnik według zastrz. 15, znamienny tym, że analitem jest transaminaza.
17. 17. Odczynnik według zastrz. 15, znamienny tym, że analitem jest transaminaza asparaginianowa.
18. 18. Odczynnik według zastrz. 15, znamienny tym, że analitem jest transaminaza alaninowa.
19. 19. Odczynnik według zastrz. 15, znamienny tym, że analitem jest mocznik.
20. 20. Odczynnik według zastrz. 15, znamienny tym, że analitem jest amoniak.
21. 21. Sposób określania stężenia analitu w próbce płynu ciała, znamienny tym, że próbkę płynu ciała kontaktuje się z odczynnikiem zawierającym koenzym i mierzy się stopień utlenienia koenzymu, przy czym odczynnik zawierający wspomniany koenzym stabilizuje się przeciw utlenieniu przez układ redukujący koenzym składający się z pary enzym i substrat, przy czym wspomniany enzym wykazuje niepełną specyficzność wobec wspomnianego substratu, a stopień specyficzności między wspomnianym enzymem i wspomnianym substratem jest mniejszy niż 50% w oparciu o równoważność molową umożliwiając stałą regenerację koenzymu w trakcie przechowywania odczynnika, natomiast wspomniany analit wybiera się z grupy zawierającej transaminazę, transaminazę asparaginianową, transaminazę alaninową, mocznik i amoniak.
22. 22. Sposób według zastrz. 20, znamienny tym, że stosuje się odczynnik w postaci jednej fiołki.
23. 23. Sposób według zastrz. 20, znamienny tym, że ciągła redukcja koenzymu zachodzi z prędkością w zakresie 0,01-0,9 mAbs/minutę przy 340 nm, w temperaturze 18-25°C.
24. 24. Sposób według zastrz. 20, znamienny tym, że stosowanym enzymem jest enzym mikrobiologiczny.
25. 25. Sposób według zastrz. 20, znamienny tym, że stosowaną parą enzym/substrat jest dehydrogenaza glukozo-6-fosforanowa/D-glukozę.
26. 26. Sposób według zastrz. 20, znamienny tym, że stopień specyficzności między enzymem i substratem jest mniejszy niż 10% w oparciu o równoważność molową.
27. 27. Sposób według zastrz. 20, znamienny tym, że analitem jest transaminaza.
28. 28. Sposób według zastrz. 26, znamienny tym, że transaminiaąjest transaminaza asparaginianowa.
29. 29. Sposób według zastrz. 26, znamienny tym, że transaminiaąjest transaminaza alaninowa.
30. 30. Odczynnik według zastrz. 20, znamienny tym, że analitem jest mocznik.
31. 31. Odczynnik według zastrz. 15, znamienny tym, że analitem jest amoniak.

    Wynalazek ten dotyczy odczynników stosowanych w enzymatycznych metodach określania stężenia analitów w próbce płynu ciała. W szczególności, wynalazek ten dotyczy odczynników stosowanych w metodach, w których ilość utlenionego koenzymu w próbce, w której zachodzi reakcja, odpowiada bezpośrednio stężeniu analitu obecnego w próbce. Wynalazek dotyczy także ulepszonych sposobów przeprowadzania określenia stężenia analitu.

    Anality, które można określić przy użyciu odczynników według wynalazku, obejmują transaminazy, amoniak, mocznik, dehydrogenazę mleczanową, triglicerydy oraz salicylany.

    Aminotransferaza asparaginianowa jest enzymem którego wysoki poziom znajduje się w sercu, wątrobie, w krwinkach czerwonych i mięśniach szkieletowych. Katalizuje on następującą reakcję:

    asparaginian + 2-oksoglutaran <-> szczawiooctan + glutaminian

    Podwyższony poziom aminotransferazy asparaginianowej w surowicy stwierdza się w wielu chorobach wątroby, gdzie zachodzi niszczenie komórek wątroby, zwłaszcza np. w zapaleniu wątroby. Wyższe poziomy są także notowane po zawale mięśnia sercowego i przy chorobie mięśni.

    186 517

    Enzym aminotransferaza alaninowa znajduje się także w wysokich stężeniach w wątrobie i w mniejszym stopniu w sercu, nerkach i mięśniach szkieletowych. Katalizuje on następującą reakcję:

    alanina + 2-oksoglutaran <-> pirogronian + glutaminian

    Wzrosty poziomu tego enzymu w surowicy stwierdza się zazwyczaj w schorzeniach wątroby, zwłaszcza w zapaleniu wątroby.

    Pośrednie określenie ilościowe enzymów, w szczególności transaminaz aminotransferazy asparaginianowej i aminotransferazy alaninowej w próbce płynów ciała, może dotyczyć, w przeciwieństwie do próbki „ślepej”, w której miała miejsce przemiana enzymatyczna analitu związanego z interesującym enzymem. Aby dokonać enzymatycznej konwersji analitu, specyficzny dla substratu enzym (transaminazę), pozostawia się pod działaniem substratów enzymu znanego, jako użytecznego w kwantyfikacji interesującego enzymu. Zmianę w układzie reakcji, biorąc pod uwagę próbkę ślepą, można kalkulować różnymi metodami, mierzącymi zmianę w absorbancji układu. Zmiana w absorbancji koreluje bezpośrednio z ilością transaminazy obecnej w próbce. Chociaż metody tradycyjne, takie jak określanie kolorymetryczne, rozwinęły się odpowiednio, analiza enzymatyczna okazała się w ogromnej mierze bardziej dokładna, niezawodna i prosta od tych innych metod, jeśli chodzi o określanie poziomu transaminazy.

    Powszechnie stosowana metodą kwantyfikacji transaminazy w próbce jest użycie sprzężonej reakcji enzymatycznej w sposób kinetyczny.

    W przypadku aminotransferazy asparaginianowej (AST), szczawiooctan utworzony przez AST ulega przemianie do maleinianu, przez włączenie dehydrogenazy maleinianowej (MDH) w układ oznaczenia. Towarzyszy temu utlenienie koenzymu dinukleotydu nikotynamido-adeninowego (NADH do NAD⁴), co można śledzić spektrofotometrycznie, przy 340 nm. w ten sposób sekwencja reakcji jest zazwyczaj następująca:

    L-asparaginian + 2-oksoglutaran < ^AST > szczawiooctan + L-glutaminian szczawiooctan + NADH <-—-...> L-maleinian + NAD pirogronian z próbki m NADH <·· —--·..> mleczan + NAD

    Od trzeciej reakcji oczekuje się eliminacji możliwej obecności wysokich poziomów pirogronianu w próbkach pacjenta. Teoria opóźnienia włączenia wysokich poziomów enzymu dehydrogenazy mleczanowej (LDH) jest taka, że jeśli włącza się wysoki poziom do odczynnika, w wypadku gdy próbka pacjenta posiada wysoki poziom pirogronianu, obecność NADH i LDH szybko wyeliminuje pirogronian z próbki przez przemianę go do mleczanu, nie ingerującego w reakcję.

    Potrzeba obciążenia odczynnika LDH, w celu eliminacji tej pobocznej reakcji, może wpłynąć na stabilność odczynnika przez wprowadzenie więcej zanieczyszczeń.

    Dla aminotransferazy alaninowej (ALT), szczawiooctan utworzony przez ALT ulega przemianie do mleczanu, przez wprowadzenie dehydrogenazy mleczanowej do mieszaniny reakcyjnej. Towarzyszy temu utlenienie koenzymu NADH do NAD, które znowu można śledzić spektrofotometrycznie, przy 340 nm. w ten sposób sekwencja reakcji przeprowadzana z użyciem odczynnika, jest następująca:

    L-alanina + 2-oksoglutaran <.....alt > pirogronian + glutaminian pirogronian + NADH < ^LD-—> mleczan + NAD pirogronian z próbki + NADH m-ecz_> mleA^Dn + NAD⁴

    Teoria i metodologia pomiaru ALT jest podobna do odczynnika AST z wyjątkiem tego, że przy ALT do pomiaru wymagany jest tylko jeden enzym endogeniczny, dokładnie LDH (w przeciwieństwie do AST, gdzie wymagane są LDH i MDH). Do odczynników ALT wprowadza się mniej zanieczyszczeń jako takich, co generalnie oznacza, że ich odtworzona przechowalność może być nieco dłuższa niz odczynników AST.

    186 517

    Dla obu odczynników tempo tworzenia NAD+ koreluje ze stężeniem transaminazy pierwotnie obecnej w próbce.

    Mocznik jest głównym produktem metabolicznym, zawierającym azot, w katabolizmie białek, syntetyzowanym w wątrobie przez enzymy wątrobowe wątroby, i wydzielanym przede wszystkim przez nerki. Podniesione poziomy mocznika w surowicy mogą być konsekwencją upośledzenia funkcji nerek, choroby wątroby, zmian w diecie, zastoinowej niewydolności serca, cukrzycy i infekcji.

    Poziom mocznika w ludzkiej surowicy i moczu można wykrywać metodami bezpośrednimi i pośrednimi. Metody bezpośrednie zwykle dotyczą odmian reakcji Fearona. W tym układzie reakcyjnym, diacetyl reaguje z mocznikiem, aby utworzyć chromogen diazyne, który można mierzyć spektrofotometrycznie, dzięki jego silnej absorbancji przy 540 nm. Najbardziej powszechna metoda pomiaru mocznika w ludzkiej surowicy i moczu dotyczy układu pośredniej sprzężonej reakcji enzymatycznej. Ureazę, pierwszy enzym w układzie reakcyjnym, stosuje się do przemiany mocznika w amoniak i jony wodorowęglanowe. Dehydrogenaza glutaminianowa (GLDH), dru^i enzym w układzie reakcyjnym sprzęga NADH i jon amonowy, w celu wytworzenia NAD* i glutaminianu. Reakcję tę śledzi się spektrofotometrycznie przy 340 nm, gdy NADH ulega przemianie do NAD+. Alternatywnie, można kwantyfikować jon amonowy, przez potencjometrię lub konduktometrię.

    W ten sposób proces reakcyjny zwykle stosowany do określania stężenia mocznika jest następujący:

    Mocznik + H2O > 2NH3 + CO2

    NH3 + a-ketoglutaran + NADH —^GLDH > L-glutaminian + NAD+

    Mierzy się obniżenie absorbancji przy 340 nm, gdy NADH przechodzi w NAD+ i jest ono proporcjonalne do stężenia mocznika w pierwotnej próbce.

    Głównym źródłem krążącego amoniaku jest przewód pokarmowy. Amoniak metabolizowany jest w wątrobie, ulega przemianie do mocznika w cyklu mocznikowym. Podniesiony poziom amoniaku w ludzkiej surowicy jest najczęściej związany z zaawansowaną chorobą wątroby. Hiperamonemia wywiera toksyczny wpływ na centralny układ nerwowy.

    Poziom amoniaku w ludzkiej surowicy mierzy się najczęściej bezpośrednią, jednoetapową metodą enzymatyczną, obejmującą dehydrogenazę glutaminianową. W tej reakcji, przemianę amoniaku, a-ketoglutaranu i NadH (lub NAPH) w glutaminian i NAD+ (lub NADP+) mierzy się spektrofotometrycznie przy 340 nm.

    Powszechnie stosowana sekwencja reakcji, do określania stężenia amoniaku w próbce, jest następująca:

    NH3 + a-ketoglutaran + NADPH —GLD_> L-glutaminian + NADP+

    Mierzy się zmniejszenie absorbancji przy 340 nm, gdy NADPH przechodzi w NADP+, i jest ono proporcjonalne do stężenia amoniaku w próbce pacjenta.

    W przeszłości, jak wspomniano powyżej, odczynniki z transaminazą obarczone były słabą odtworzoną stabilnością. Stabilność tych odczynników, zwłaszcza w formacie pojedynczej fiolki, ograniczona jest zwykle do około jednego miesiąca maksymalnie, w warunkach schłodzenia. Powód tej niestabilności można by przypisać zarówno degeneracji składników endogennych, jak i niestabilności NADH w roztworze. Główne powody niestabilności NADH w roztworze wiążą się bezpośrednio z obecnością endogenicznych enzymów odczynnikowych, mianowicie LDH i MDH w odczynniku AST i LDH w odczynniku ALT. Handlowe preparaty enzymów endogenicznych MDH i LDH, czy to pochodzenia zwierzęcego, czy drobnoustrojowego, zawierają zanieczyszczenia, które ostatecznie wpływają na odtworzoną stabilność NADH i w konsekwencji stabilność odczynników. Zanieczyszczeniami tymi są zazwyczaj niskie poziomy AST i ALT, enzymy pożądane do pomiaru, oraz oksydaza NADH, z których wszystkie inicjują utlenienie NADH w odczynniku.

    pH odczynnika także może mieć wpływ na niestabilność NADH, ponieważ NADH będzie się szybko rozpadać w roztworze, zwłaszcza w środowisku kwaśnym. Większość od6

    186 517 czynników do określania transaminazy, wytwarza się się przy zakresie pH 7,3-8,0. Bardziej zasadowy odczynnik, większa stabilność NADH w roztworze.

    Ponadto, odczynniki amoniakowe i mocznikowe także obarczone są problemami ze stabilnością i stabilność tych odczynników w formacie pojedynczej fiolki oraz w niskich temperaturach, zwykle ogranicza się do maksimum jednego miesiąca w przypadku amoniaku, i dwóch miesięcy w przypadku mocznika. Powód tej niestabilności mógłby być związany z rozpadem endogenicznych składników w odczynnikach, niestabilnością NADH lub NADPH w roztworze i zanieczyszczeniem amoniakiem, obecnym w wodzie, użytej do odtworzenia proszku odczynników;

    Główne powody niestabilności NADH lub NADPH w roztworze wiążą się bezpośrednio z obecnością endogenicznych enzymów odczynnikowych. pH odczynnika także może mieć wpływ na niestabilność NADH lub NADPH, jako, że NadH i NADPH będą się szybko rozpadać w roztworze, zwłaszcza w środowisku kwaśnym.

    NADPH powszechnie używa się w odczynnikach amoniakowych (chętniej niż NADH), w celu przezwyciężenia ingerencji w test przez endogeniczną dehydrogenazę mleczanową w surowicach pacjentów. Endogeniczną dehydrogenaza mleczanowa i pirogronian z próbek pacjentów będzie specyficznie reagować z NADH w następującej sekwencji reakcji:

    pirogronian z próbki + NADH <·-——·> mleczan + NAD+

    Na utrzymanie NAPH w roztworze będzie także miała wpływ obecność zanieczyszczeń w handlowych preparatach dehydrogenazy glutaminianowej, które zapoczątkowują utlenianie NAPH w odczynniku amoniakowym. Podobnie, obecność zanieczyszczeń handlowych preparatów ureazy i dehydrogenazy glutaminianowej, będzie inicjować utlenianie NADH w odczynniku mocznikowym.

    Jednym ze środków przezwyciężenia tej trudności, związanej ze stabilnością NADH i NADPH w roztworze, było wytworzenie zredukowanego koenzymu w odczynniku, tuż przed jego użyciem.

    Jeden taki sposób opisano w australijskim zgłoszeniu patentowym AU-A-61906/90 dla F. Hoffmann La Roche AG, nawiązując szczególnie do podobnych układów enzymatycznych do pomiaru wodorowęglanu i amoniaku w surowicy. W tym opisie zredukowany koenzym wytwarza się in situ, albo równocześnie, albo przed ponownym utlenieniem koenzymu przez analit, substrat i specyficzne enzymy. Osiąga się to przez włączenie do mieszaniny reakcyjnej enzymu i substratu enzymu, umożliwiając redukcję utlenionego koenzymu. Specyficzną reakcją ujawnioną i opisaną dzięki uprzejmości F. Hoffmann La Roche AG jest:

    NADH' + Glukozo-6-fosforan (G-6-P)_H⁺ + NADH + 6-foffogli±onol:dtton

    Dehydrogenaza

    Glukozo^-fosforanu (G-6-P)

    Udostępnia to zredukowany dinukleotyd nikotynamidoadenozynowy.

    Problemem związanym z tym sposobem wytwarzania NADH jest to, że stabilna konfiguracja odczynnika dla pojedynczej fiolki, nie jest możliwa.

    Do pewnego stopnia F. Hoffmann La Roche AG pokonał ten problem, przez podzielenie układu odczynników na 2 fiolki. Pierwszy odczynnik obejmuje w przypadku kwantyfikacji amoniaku, NADP+ i G-6-P, a drugi odczynnik a-ketoglutaran, G6PDH i GLDH. Reakcja określania przebiega więc następująco:

    186 517

    Odczynnik 1 Odczynnik 2 dodana surowica_(B)_^j, pacjenta

    V koenzym utleniony gdzie (A) i (B) oznaczają alternatywne, równoważne drogi.

    Jednakże trudności w tym układzie odczynników pozostają. Poza faktem, że dwie fiolki z odczynnikiem wymagają większych kosztów, zapasów i strat, wymagane są bardzo dokładne poziomy glukozo-6-fosforanu, a ponadto układ ogranicza użycie szczególnych chemicznych analizerów. Gdy odczynniki połączy się, wytworzenie NADH z NAD ma miejsce przez wyczerpanie glukozo-6-fosforanu. Ponieważ glukozo-6-fosforan w ten sposób wyczerpuje się, na stabilność połączonych odczynników poważny wpływ miałoby, jeśli dwa odczynniki miałyby być połączone, lecz nie od razu użyte. Jeśli poziomy glukozo-6-fosforanu są niedokładne lub nadmierne, czas związany z inkubacją odczynnika staje się krytyczny. Rezultatem tego mogą być fałszywie niskie zmiany absorbancji i rażąco niedokładne wyniki.

    Wcześniejszym roztworem także związanym z pomiarem poziomów analitów opisanym w opisie patentowym US 4 394 449 dla Modrovicha, stosuje pary substrat/enzym, w celu wytworzenia zredukowanego koenzymu tak, jak w roztworze Roche'a, jednkaże w tym wypadku głukozo-6-fosforan wytwarza się z glukozy zgodnie z następującym:

    D-glukoza + ATP —heksokwaa > aDP’ glukozo-6-fosforan NAD reaguje następnie z utworzonym glukozo-6-fosforanem w obecności enzymu dehydrogenazy glukozo-6fosforanu, aby wytworzyć NADH. Modrovich włącza także do preparatu zarówno NADH jak i NAD tak, że gdy NADH utleni się lub zniszczy, NAD obecny w odczynniku, pomoże regenerować NADH. Jest to także odczynnik dwufiolkowy.

    Wcześniejszej alternatywy dostarcza Klose i in., w opisie patentowym US 4 019 961. Wynalazek ten polega na etapach różnych oddzielnych reakcji i układzie regeneracji enzymatycznej. Układ ten ma tę wadę, że polega na przeprowadzeniu etapów różnych reakcji i etapów separacji, co czyni go testem zużywającym czas. Ponadto, ten układ odczynników jest odpowiedni tylko dla substratów, które można fosforylować.

    Generalnym problemem związanym z mechanizmem wytworzenia NADH i NADPH adoptowanym przez każdy z opisanych tu powyżej wynalazków, czyli

    NAD + glukozo-6-fosforan —Q~⁶~^PD”--> NADH + 6-fosfoglukonolakton + H jest to, ze pojedynczy etap reakcji z użyciem jednej fiolki jest niemożliwy, ponieważ gdy tylko doda się surowicy pacjenta do odczynnika, zachodzą dwie równoczesne reakcje:

    (a) obniżenie abso rbancji z powodu przenuany NADH (lub NADPH) w NAD⁺ (NADP),

    186 517 (b) wytworzenie NADH (NADPH) z NAD+ (NADP+) co daje w wyniku wzrost absorbancji.

    Te dwie reakcje zachodzą z podobnymi prędkościami z rezultatem netto, będącym fałszywie niską zmianą absorbancji i rażąco niedokładnymi wynikami.

    W związku z tym, celem tego wynalazku jest dostarczenie układu odczynników do stosowania przy określaniu poziomów analitów w surowicy, co zasadniczo udoskonali problemy układów odczynników z wcześniejszego stanu wiedzy, stosowanych w analizie enzymatycznej poziomów analitów w surowicy, polegających na utlenieniu koenzymu, szczególnie tych problemów, które dotyczą endogenicznych lub egzogenicznych zanieczyszczeń odczynnika. Dalszym celem tego wynalazku jest dostarczenie ulepszonego sposobu określania stężenia poziomów analitów w próbce pacjenta, sposobu zwalczania problemów, związanych z metodami z wcześniejszego stanu wiedzy, włączając przedwczesne utlenienie determinanta koenzymu, oraz konieczność układu wielu fiolek, aby zminimalizować degradację odczynnika. Istota wynalazku.

    Tak określone cele zostały zrealizowane w niniejszym wynalazku. Przedmiotem wynalazku jest odczynnik do mierzenia stężenia analitu u pacjenta polegającego na pomiarze stopnia utlenienia koenzymu charakteryzujący się tym, że zawiera układ redukujący koenzym składający się z pary enzym i substrat, przy czym stopień specyficzności między enzymem i substratem jest mniejszy niż 50% w oparciu o równoważność molową umożliwiając stałą regenerację koenzymu w trakcie przechowywania odczynnika, natomiast analit jest wybrany z grupy zawierającej transaminazę, transaminazę asparaginianową, transaminazę alaninową, mocznik i amoniak. Korzystnie wspomnianą parą enzym/substrat jest dehydrogenaza glukozo6-fosforanowa/D-glukoza.

    Korzystnie odczynnik według wynalazku jest w postaci jednej fiolki.

    Korzystnie ciągła regeneracja koenzymu zachodzi z prędkością w zakresie 0,01-0,9 mAbs/minutę przy 340 nm, w temperaturze 18-25°C.

    Korzystnie enzym jest enzymem mikrobiologicznym. Korzystnie stopień specyficzności między wspomnianym enzymem i wspomnianym substratem jest mniejszy niz 10% w oparciu o równoważność molową.

    Korzystnie, gdy analitem jest transaminaza alaninowa zawiera dehydrogenazę glukozo6-fosforanową, D-glukozę, L-alaninę, dehydrogenazę L-mleczanową (LDH), dinukleotyd nikotynoamidoadeninowy (NADH), K2HPO4, 2-oksoglutaran oraz korzystnie dodatkowo bufor Tris, Tris HC1, EDTA-disodowy, albuminę surowicy bydlęcej i azydek sodu. w korzystnej realizacji takiego odczynnika posiada on skład określony w tabeli 1, korzystniej określony w tabeli 2.

    Korzystnie, gdy analitem jest transaminaza asparaginianowa zawiera dehydrogenazę glukozo-6-fosforanową, D-glukozę, L-asparaginian, dehydrogenazę L-mleczanową (LDH), dehydrogenazę maleinianową (MDH), dinukleotyd nikotynoamidoadeninowy (NADH), K2HPO4, 2-oksoglutaran oraz korzystnie dodatkowo bufor Tris, Tris HC1, EDTA-disodowy, albuminę surowicy bydlęcej i azydek sodu. w korzystnej realizacji takiego odczynnika posiada on skład określony w tabeli 3, korzystnie określony w tabeli 4. Korzystnie, gdy analitem jest mocznik zawiera dehydrogenazę glukozo-6-fosforanową, D-glukozę, ureazę, a-ketoglutaran, fosforan dinukleotydu nikotynoamidoadeninowego (NADPH), K2HPO4, dehydrogenaza glutaminianowa (GLDH), oraz korzystnie dodatkowo bufor Tris, Tris HC1, EDTA-disodowy, albuminę surowicy bydlęcej i azydek sodu. w korzystnej realizacji takiego odczynnika posiada on skład określony w tabeli 5A, korzystnie określony w tabeli 5B.

    Korzystnie, gdy analitem jest amoniak zawiera dehydrogenazę glukozo-6-fosforanową D-glukozę, a-ketoglutaran, fosforan dinukleotydu nikotynoamidoadeninowego (NADPH), K2HPO4, dehydrogenaza glutaminianowa (GLDH), oraz korzystnie dodatkowo bufor Tris, Tris HC1, EDTA-disodowy, ADP-K, albuminę surowicy bydlęcej i azydek sodu. W korzystnej realizacji takiego odczynnika posiada on skład określony w tabeli 6A, korzystnie określony w tabeli 6B.

    W korzystnej realizacji odczynnika według wynalazku analitem jest transaminaza. Korzystnie analitem jest transaminaza asparaginianowa. Równie korzystnie analitem jest transa186 517 minaza alaninowa. Równie korzystnie analitem jest mocznik. Równie korzystnie analitem jest amoniak.