ES2247623T3 - Procedimiento de localizacion de clones mediante peinado molecular. - Google Patents

Procedimiento de localizacion de clones mediante peinado molecular.

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ES2247623T3 ES97912288T ES97912288T ES2247623T3 ES 2247623 T3 ES2247623 T3 ES 2247623T3 ES 97912288 T ES97912288 T ES 97912288T ES 97912288 T ES97912288 T ES 97912288T ES 2247623 T3 ES2247623 T3 ES 2247623T3
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Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A UN PROCEDIMIENTO DE DETECCION DE LA PRESENCIA O DE LA LOCALIZACION DE UNO O VARIOS GENES O DE UNA O VARIAS SECUENCIAS DE ADN ESPECIFICO A O DE UNA O VARIAS MOLECULAS QUE REACCIONAN CON EL ADN EN UN ADN B, CARACTERIZADO PORQUE: (A) SE FIJA Y SE PEINA UNA CIERTA CANTIDAD DE DICHO ADN B EN UNA SUPERFICIE DE PEINADO; (B) SE HACE REACCIONAR EL PRODUCTO DEL PEINADO B CON UNA O VARIAS SONDAS UNIDAS AL O A LOS GENES O A LAS SECUENCIAS DE ADN ESPECIFICAS A, O A LAS MOLECULAS SUSCEPTIBLES DE REACCIONAR CON EL ADN; (C) SE EXTRAE LA INFORMACION QUE CORRESPONDE A UNA AL MENOS DE LAS SIGUIENTES CATEGORIAS: (1) LA POSICION DE LAS SONDAS; (2) LA DISTANCIA ENTRE SONDAS; (3) LA DIMENSION DE LAS SONDAS (PERMITIENDO LA SUMA TOTAL DE LAS DIMENSIONES CUANTIFICAR EL NUMERO DE SONDAS HIBRIDIZADAS) PARA DEDUCIR LA PRESENCIA, LA LOCALIZACION Y/O LA CANTIDAD DE LOS GENES O DE LAS SECUENCIAS DE ADN ESPECIFICO A. ESTE PROCEDIMIENTO PUEDE UTILIZARSE EN PARTICULAR PARA EL DIAGNOSTICODE ENFERMEDADES GENETICAS.

Description

Procedimiento de localización de clones mediante peinado molecular.
La presente invención se refiere a un procedimiento de localización de secuencias polinucleotídicas (que pueden tener o no genes o partes de genes) en un genoma o una parte de genoma gracias a la técnica de peinado molecular.
La presente invención se refiere asimismo a un procedimiento de localización de reactivos de origen biológico, natural o sintético, mediante asociación de dichos reactivos con todo o parte del ADN peinado.
La técnica del peinado molecular, tal como se describe en las referencias siguientes: WO 95/22056 y WO 95/21939, aplicada a los ácidos nucleicos, y más particularmente a ADN genómico, permite la extensión uniforme y la visualización del ADN o del ARN en forma de filamentos rectilíneos y prácticamente alineados.
La presente invención se basa en la demostración del hecho que, gracias a sondas, es decir, polinucleótidos que contienen una cadena de secuencias nucleotídicas tales como moléculas de ADN marcadas que reconocen específicamente partes del ADN alineado, que se hibrida con el ADN peinado, se puede visualizar directamente sobre el genoma peinado la posición de la secuencia complementaria.
En estas condiciones es posible, por ejemplo utilizando dos sondas marcadas con cromóforos diferentes de forma que se puedan visualizar mediante un color, rojo y verde por ejemplo, medir la distancia que les separa. Pero es posible igualmente, utilizando diferentes sondas o una serie de sondas contiguas (denominadas en lo sucesivo "contig"), medir directamente la longitud de la región de interés, y medir las eventuales alteraciones en el caso de un genoma anor-
mal.
La presente invención se refiere a un procedimiento de localización de varios clones, tal como se define en la reivindicación 1. Se describen igualmente métodos para el diagnóstico de enfermedades genéticas. Estos métodos, que se caracterizan preferentemente por alteraciones importantes del genoma, ya sea en su estructura, supresión, o translocación por ejemplo, o bien en el número de copias de algunas secuencias (trisomia por ejemplo en la que la secuencia representa la totalidad de un cromosoma), así como a procedimientos que permiten localizar y cartografiar rápidamente genes.
El diagnóstico genético se puede dividir en varios campos:
- prenatal,
- patologías con componente genético,
- cáncer y susceptibilidad al cáncer.
Diagnóstico prenatal
La mayor parte (95%) de las anomalías fetales se deben a trisomias de los cromosomas 21, 18, 13, X o Y. Su diagnóstico indudable es más o menos tardío (17ª semana de amenorrea, por ejemplo mediante amniocentesis). La amniocentesis requiere una punción importante de líquido amniótico (unas decenas de mililitros) del cual se extraen células fetales en suspensión y se cultivan durante varios días (véase la técnica descrita por S. Mercier y J.L. Bresson (1995) Ann. Génét., 38, 151-157). Se efectúa un cariotipo de estás células mediante observación microscópica y recuento de los cromosomas por una persona muy especializada.
Una técnica que recurre a la recogida de vellosidades coriónicas permite prescindir de la etapa de cultivo, y evita la recogida de líquido amniótico. Sin embargo, el análisis del cariotipo requiere la misma labor (véase Médecine Prénatale. Biologie Clinique du Foetus. André Boué, ed. Flammarion, 1989). Estas dos técnicas se pueden aplicar más precozmente (hasta 7 semanas de gestación para la recogida de vellosidades coriónicas, y 13-14 semanas para la amniocentesis), pero con un riesgo ligeramente mayor de aborto. Finalmente, una recogida directa de sangre fetal a nivel del cordón umbilical permite el análisis del cariotipo sin cultivo pero supone un equipo de expertos especializados en esta técnica (Donner C. et al, 1996, Fetal Diagn, Ther., 10, 192-199).
Otras anomalías como translocaciones o supresiones/inserciones de partes importantes de cromosomas se pueden detectar en esta fase, o usando técnicas como la hibridación fluorescente in situ (FISH). Sin embargo, aquí también, este tipo de diagnóstico sólo se puede realizar mediante expertos muy cualificados.
Por otra parte, estudios muestran que no existen todavía métodos inmunológicos que permitan la detección de marcadores fetales en la sangre materna que permitan un diagnóstico indiscutible de la trisomia 21 o de otras anomalías (véase, por ejemplo, Wald, N.J. et al., 1996, Br. J. Obstet. Gynaecol., 103, 407-412 para el síndrome de Down relacionado con la trisomia 21).
Los diagnósticos prenatales actuales tienen por lo tanto numerosas desventajas: sólo se pueden efectuar en una fase relativamente tardía del desarrollo del embrión; no están del todo libres de riesgo para el feto o para la madre; los resultados se obtienen frecuentemente tras un tiempo bastante largo (aproximadamente 1 a 3 semanas según la técnica) y son costosos. Finalmente, un cierto número de anomalías cromosómicas pasan desapercibidas.
Diagnóstico de patologías con componente genético
Numerosas enfermedades tienen un componente genético reconocido (diabetes, hipertensión, obesidad, etc. ), que es el resultado de supresiones, inserciones y/o modificaciones cromosómicas de tamaños variables. El cultivo de células no tiene problema en esta fase, pero las técnicas de FISH, descritas por Lichter G.D. et al. (1993), Genomics, 16, 320-324, Brandritt B. et al. (1991), Genomics, 10, 75-82 y Van den Hengh G. et al. (1992), Science, 257, 1410-1412), tienen una resolución limitada y necesitan expertos muy cualificados, haciendo estos ensayos poco accesibles.
El desarrollo de un ensayo más eficaz y barato permitiría la adopción general de terapias adecuadas, en una fase precoz de las patologías implicadas, susceptibles de mejorar su remisión.
Diagnóstico del cáncer
Entre las patologías con componente genético, las afecciones cancerígenas constituyen una clase importante que afectan una parte creciente de la población. La comprensión actual del proceso de aparición de una afección cancerígena hace intervenir una etapa de proliferación de proto-oncogenes (mutaciones en el genoma de las células) que precede a la transformación de la célula en célula cancerígena. Desgraciadamente, esta etapa de proliferación no es detectable, mientras que la posibilidad de efectuar un tratamiento en esta fase aumentaría seguramente las posibilidades de remisión y disminuiría la incapacidad de los pacientes.
Finalmente, numerosos tumores se caracterizan mediante modificaciones cromosómicas tales como translocaciones, supresiones, trisomias parciales o completas, etc.
En cada uno de estos campos, el peinado molecular puede aportar una importante contribución, bien por la rapidez y la pequeña cantidad de material biológico necesario, o bien por la precisión cuantitativa de los resultados.
El interés de la técnica aparece muy particularmente en el caso en el que el material genético proviene de células que no se dividen más o que no se pueden cultivar, incluso de células muertas en las que el ADN no está significativamente degradado.
En el caso del diagnóstico prenatal, tal es el caso después de la extracción de las células fetales que circulan en la sangre materna (Cheung et al., 1996, Nature Genetics 14, 264-268). Lo mismo se aplica en el caso de células cancerosas que provienen de algunos tumores.
El peinado molecular permite mejorar las posibilidades de diagnóstico de enfermedades genéticas, pero permite igualmente el estudio y la identificación de las secuencias genómicas responsables de dichas enfermedades. De hecho, actualmente, el desarrollo de un "kit" o caja de diagnóstico empieza por la búsqueda del gen implicado en la patología.
La búsqueda de genes implicados en patologías (humanas u otras) se efectúa hoy en día, generalmente, en varias etapas:
(i)
Establecimiento de una población diana de individuos afectados por patologías, de sus descendientes, ascendentes y colaterales, y la recogida de una muestra de sangre y/o celular para el almacenamiento de material genético (en forma de ADN o de cepas celulares).
(ii)
Localización genética mediante análisis de probabilidad de co-segregación con marcadores genéticos (análisis de ligación). En esta fase del estudio, se dispone de algunos marcadores próximos, localizados sobre uno (o varios) cromosoma(s) dado(s), que permiten continuar hacia la etapa de localización física.
(iii)
Cartografiado físico: a partir de los marcadores genéticos obtenidos en la etapa anterior, se efectúa una detección sistemática de bancos de clones de ADN humano (YACs, BACS, cósmidos u otros) específicos de la o las regiones determinadas en la etapa anterior. Así, se obtiene un cierto número de clones que contienen los marcadores anteriores. Entonces, la región de interés se puede cartografiar precisamente utilizando clones de tamaños decrecientes. También se puede efectuar nuevamente la clonación de la parte del genoma considerado, a partir del ADN humano.
(iv)
Búsqueda del gen: en esta fase se pueden utilizar varias técnicas: "atrapamiento" de exones (uso de bibliotecas de ADNc (ADN complementarios obtenidos a partir de ARN mensajero)), islotes CpG, conservación de secuencias inter-específicas, etc., que permiten asignar una secuencia codificante a uno (o varios) de los clone(s) seleccionado(s) en las etapas anteriores.
El conjunto de esta estrategia representa una labor importante (eventualmente hasta varios años). Por lo tanto, cualquier técnica que permita llegar más rápidamente a la etapa (iv) constituye una ventaja para la búsqueda de genes, pero igualmente en el diagnóstico.
En el estado actual de la técnica, cuando el gen se ha localizado, por ejemplo mediante el método anterior, su detección se efectúa generalmente gracias a sondas específicas que corresponden a la secuencia en cuestión, siendo ésta amplificada mediante métodos tipo PCR por ejemplo o tipo LCR (tal como se describe en la patente EP 0.439.182), o una técnica tipo NASBA (kit comercializado por la empresa Organon Teknika).
Sin embargo, las técnicas de amplificación no son siempre satisfactorias, especialmente para los heterocigotos, puesto que existe una copia normal del gen en el genoma, así como en el caso de una gran supresión o de enfermedades con secuencias repetidas en las que la PCR no es muy satisfactoria.
El diagnóstico de un gran número de enfermedades genéticas se puede ahora prever utilizando el peinado molecular y el marcado del ADN. En Desmaze y Aurias, Cellular and Molecular Biology, 1995, se describe una técnica FISH aplicada a la cartografía y a la caracterización de remodificaciones genómicas mediante una técnica de estiramiento de cromatina. Esta técnica consiste en estirar una fibra de ADN que contiene varias moléculas, lo que perjudica de manera notable a su sensibilidad.
El peinado molecular es una técnica que consiste en anclar moléculas de ADN por sus extremos a superficies en condiciones fisicoquímicas bien definidas, seguido de su estiramiento con la ayuda de un menisco en recesión; se obtienen así moléculas de ADN alineadas paralelamente. El ADN purificado utilizado puede tener cualquier tamaño, y por lo tanto, especialmente, puede ser el ADN genómico extraído de células humanas. El genoma puede igualmente proceder de un material genómico que contiene al menos 80% de material genético de origen fetal.
Las moléculas de ADN así peinadas se pueden desnaturalizar antes de ser hibridadas con sondas de ácidos nucleicos marcadas por cualquier medio apropiado (especialmente con nucleótidos biotina-dUTP, o digoxigenina-dUTP), que entonces se revelan, por ejemplo, con la ayuda de sistemas de anticuerpos fluorescentes.
Dado que el peinado molecular se caracteriza por una extensión constante de las moléculas peinadas, la medida de las longitudes de los fragmentos fluorescentes observados con la ayuda de un microscopio con epifluorescencia (por ejemplo) da por lo tanto directamente el tamaño de los fragmentos de sondas hibridadas.
El porcentaje de extensión depende del tipo de superficie, pero se puede medir precisamente; por ejemplo, es de 2 kilobases (kb) por micrómetro (\mum) en el caso de superficies silanizadas según el protocolo descrito en la referencia (1) y utilizado en los ejemplos.
Cuando es necesario, es posible proporcionar un patrón interno, es decir, un ADN de longitud conocida denominado de calibrado, que permitirá calibrar la operación, es decir, calibrar cada medida.
La presente invención se define mediante las reivindicaciones 1-8, y se refiere a un procedimiento, caracterizado porque
(a)
se fija y se peina cierta cantidad de dicho genoma sobre una superficie de peinado,
(b)
se hibrida el producto de peinado con sondas marcadas con elementos radioactivos, fluorescentes u otros, tales como perlas, partículas, que corresponden a cada clon, a fin de que dichas sondas puedan ser reveladas específicamente mediante un color en particular,
(c)
se extrae la información que corresponde a la posición de cada clon así como los tamaños y las distancias correspondientes sobre el genoma,
(d)
se repiten las operaciones b) y c) n veces modificando el color, el marcado o el modo de revelado de las sondas, sabiendo que con p colores, marcados o modos de revelado distintos, es posible localizar al final de n hibridaciones p^{n} clones.
En el ámbito de los métodos estándares de cartografiado, el número I de hibridaciones necesarias para cartografiar N clones con la ayuda de p marcajes, colores o modos de revelado, crece linealmente con el número de clones N.
Así, con 3 colores, hoy en día es necesario efectuar al menos 15 hibridaciones del tipo anterior para cartografiar 30 clones.
Este número de hibridación es elevado, y el número de colores disponibles está en la práctica limitado (incluso utilizando combinaciones de fluoróforos). Por otra parte, una vez se ha llevado a cabo la totalidad de las medidas realizadas, hay que proceder a la selección de las distintas posiciones posibles de los clones, lo que puede que no sea siempre fácil, si se tienen en cuenta incertidumbres de medida.
El método proporcionado aquí permite cartografiar un número de clones creciente exponencialmente con el número de hibridaciones efectuadas.
A título de ilustración, el esquema de la figura 10 representa el resultado de dos hibridaciones de 4 clones reveladas con 2 colores distintos de una hibridación a otra (para la mitad de ellos). Los 4 clones hibridados forman un esquema coloreado de manera distinta de una hibridación a otra, siendo los clones identificables vía su codificación (binaria en este caso). En este ejemplo de 4 clones, basta con un código compuesto de una sucesión de 2 colores para distinguir cada clon:
A = Rojo y después Rojo
B = Verde y después Verde
C = Rojo y después verde
D = Verde y después Rojo
Con 5 a 8 clones, se necesitaran 3 hibridaciones para distinguir los clones mediante una sucesión de 3 colores.
Más generalmente, con la ayuda de p colores, para cartografiar N clones, bastará con un número de hibridación l tal que: N = p^{l}.
En comparación con el método estándar, se podrán cartografiar 30 clones en 5 hibridaciones (en lugar de 30), si sólo se dispone de 2 colores, y en sólo 4 hibridaciones (en lugar de 15) si se dispone de 3 colores.
El principio de cartografiado presentado aquí es sencillo. Sin embargo, con el fin de superar algunos artefactos experimentales posibles (dispersión de tamaños de las señales, variabilidad de la saturación, rotura de las moléculas, etc.), se utilizará ventajosamente un programa de tratamiento de imagen y de análisis estadístico adecuado.
Los ejemplos siguientes permitirán entender mejor otras características y ventajas de la presente invención.
Finalmente, en un cuarto modo de realización, la presente invención se refiere a un procedimiento que permite especialmente la detección o la localización de productos susceptibles de reaccionar con el ADN peinado. Por ejemplo, se pueden detectar en el ADN peinado proteínas para regular la transcripción de un gen que se une al ADN durante el ciclo celular, o no, y sus sitios de unión preferidos se pueden determinar con relación a la posición de secuencias conocidas y que se han reconocido, por ejemplo, según el procedimiento anterior de realización de la invención.
De manera análoga, se podrán detectar moléculas de interés terapéutico susceptibles de reaccionar con el ADN en el ADN penado; se podrían igualmente estudiar mediante comparación su efecto sobre otras moléculas susceptibles de reaccionar con el ADN.
Entre las moléculas susceptibles de reaccionar con el ADN peinado, se citan las proteínas de regulación tales como las descritas por:
\bullet
Laughon y Matthew (1984), Nature, 310: 25-30 para las proteínas de regulación que se fijan al ADN de drosófila,
\bullet
Struhl K. et al. (1987), Cell, 50: 841-846 para proteínas de regulación que se unen a ADN en su dominio de unión específica.
Estas moléculas pueden ser igualmente agentes o moléculas intercalantes que modifican el ADN como se describe por:
\bullet
Echols H. et al. (1996), Science, 223: 1050-1056 sobre las múltiples interacciones del ADN que inducen, por ejemplo, transcripciones;
\bullet
en la revista An. Rev. Of Bioch. (1988), 57: 159-167, Gross y Ganard describen la hipersensibilidad de los sitios de nucleasa en la cromatina;
\bullet
Hanson et al. (1976), Science, 193: 62-64 describe el psoraleno como agente fotoactivo en la ruptura selectiva de las secuencias nucleotídicas;
\bullet
Cartwight et al. (1984), NAS, 10: 5835-5852.
En la presente descripción, la técnica de peinado se refiere a la tecnología descrita en los documentos mencionados anteriormente, al igual que la noción de "superficie de peinado", que corresponde a una superficie tratada que permite el anclaje del ADN y su estiramiento mediante un menisco en recesión.
Se observa que la superficie de peinado es preferentemente una superficie plana sobre la cual las lecturas son más fáciles.
Mediante la expresión "reacción entre las sondas marcadas y el ADN peinado" se entiende cualquier reacción química o bioquímica, en particular reacciones de tipo inmunológico (por ejemplo anticuerpo dirigido contra ADN metilado), reacciones de proteína/ADN o ácidos nucleicos/ADN (por ejemplo la hibridación entre segmentos complementarios), o ácidos nucleicos/ARN, o ácidos nucleicos/híbridos ARN-ADN. Se citarán igualmente como ejemplos las reacciones de unión química ADN-ADN que utilizan moléculas de psoraleno, o reacciones de polimerización de ADN con la ayuda de una enzima polimerasa.
Generalmente, la hibridación está precedida de una desnaturalización del ADN fijado y peinado; esta técnica es conocida y no se describirá con detalle.
Por "sonda" se entiende tanto un polinucleótido mono o bicatenario, que contiene al menos 20 nucleótidos sintéticos o un fragmento de ADN genómico, como un "contig", es decir, un conjunto de sondas contiguas o que solapan y cubren la región en cuestión, o varias sondas separadas, marcadas o no. Se entiende igualmente por "sonda" cualquier molécula enlazada de manera covalente o no a una al menos de las entidades anteriores, o cualquier molécula biológica, natural o sintética, que pueda reaccionar con el ADN, siendo el sentido dado al término "reacción" el que se ha especificado anteriormente, o cualquier molécula enlazada de manera covalente o no a cualquier molécula que pueda reaccionar con el ADN.
En el ámbito de la invención, las sondas están marcadas. Así, en el caso en el que las sondas se marcaran con citosinas metiladas, se podrían revelar, tras la reacción con el producto del peinado, mediante anticuerpos fluorescentes dirigidos contra estas citosinas metiladas. Los elementos que aseguran el marcaje pueden ser radioactivos pero son preferentemente marcajes fríos, por ejemplo mediante fluorescencia. También puedne ser sondas nucleotídicas en las cuales se sustituyen algunos átomos.
El tamaño de las sondas podrá tener cualquier valor medido con una unidad extensiva, es decir, de forma que el tamaño de dos sondas igualen la suma de los tamaños de las sondas tomadas separadamente. Se da un ejemplo mediante la longitud, pero se podrá utilizar, por ejemplo, una intensidad de fluorescencia. La longitud de las sondas utilizadas está comprendida, por ejemplo, entre 5 kb y 40-50 kb, pero puede igualmente consistir en la totalidad del genoma peinado.
Preferentemente, la reacción de la sonda con el ADN peinado se modula mediante una o varias moléculas, disolventes u otros parámetros pertinentes.
Finalmente, de manera general en lo siguiente, se hablará de "genoma"; se entiende que se trata de una simplificación; en está terminología se incluye cualquier secuencia de ADN o de ácidos nucleicos susceptible de ser fijada a una superficie de peinado.
Además, el término "gen" se utilizará a veces indiferentemente para designar una "parte de gen" de origen genómico, o bien una "secuencia polinucleotídica" sintética específica.
Se utiliza un procedimiento descrito en la solicitud, pero que no forma parte de la invención, para permitir el diagnóstico de rupturas en el genoma, así como para la clonación posicional de tales rupturas. Conviene observar que el término "ruptura" abarca un gran número de modificaciones locales del genoma cuya lista se da explícitamente más adelante.
El procedimiento consiste en determinar la posición de los eventuales puntos de ruptura implicados en una patología de origen genético mediante hibridación, a ADN genómico peinado de pacientes afectados por dicha patología, de una sonda genómica de tamaño conocido (clonada u otro) situada en la región del gen diana. Estos puntos de ruptura consisten en puntos en la secuencia genética cuyos alrededores cambian aproximadamente varios kilobases (kb) entre individuo sano e individuo enfermo.
El principio de definición del punto de ruptura se basa en la posibilidad de detectar mediante peinado molecular una modificación local del genoma estudiado, con relación a un genoma ya estudiado, a nivel de la o de las regiones consideradas.
Así, el desarrollo de métodos de reconocimiento de modificaciones locales del genoma de tamaños menores que 1 kb es factible con la ayuda de técnicas de observación en campo cercano (AFM, STM, SNOM, etc.), o de técnicas que poseen una resolución intrínsecamente mayor (por ejemplo, microscopia electrónica de nanoperlas de oro).
Más particularmente, la solicitud describe un procedimiento para identificar una anomalía genética de ruptura en un genoma, caracterizado porque:
(a)
se fija y se peina cierta cantidad de dicho genoma sobre una superficie de peinado,
(b)
el producto de peinado se hibrida con una o varias sondas específicas marcadas que corresponden a la secuencia genómica para la cual se busca la anomalía,
(c)
se mide el tamaño de los fragmentos que corresponden a las señales de hibridación, y eventualmente su repetición, y
(d)
se deduce la presencia de una ruptura, bien mediante medida directa, o bien mediante comparación con un patrón que corresponde a una longitud testigo.
A título ilustrativo, la medida del tamaño de los fragmentos conduce a un histograma, es decir, a una representación gráfica de las longitudes de los fragmentos observados.
Con el fin de realizar un histograma de la sonda, se evalúa el número de clones que presentan una longitud de sonda determinada. En principio, el histograma contiene solamente uno o dos picos según el tipo de ruptura analizada, dos picos cuando la sonda se hibrida como dos fragmentos separados, y un solo pico cuando se hibrida como un solo fragmento.
En el caso de un genoma heterocigótico, en el cual uno de los alelos es normal para la región considerada, la firma del alelo normal (ausencia de ruptura) se superpone a la del alelo anormal, pero se puede extraer por el hecho de ser conocida.
Se puede igualmente utilizar este procedimiento para efectuar clonación posicional, es decir, para determinar la posición de uno o varios genes desconocidos implicados en una patología. El principio consiste, como anteriormente, en hibridar clones de ADN humano, o animal o vegetal, que sirven en este caso de sonda al ADN genómico peinado de uno o varios pacientes afectados por la patología estudiada. La revelación de estas hibridaciones permite medir el tamaño de los fragmentos hibridados y construir un histograma de los distintos tamaños observados. Si el clon utilizado como sonda cubre un punto de ruptura del gen, la firma de este fenómeno será legible sobre la longitud (más corta) del fragmento hibridado.
El uso de un número limitado de clones específicos de la región implicada, se puede haber deducido mediante análisis de ligación genética, permitirá así una determinación rápida y precisa de la posición de un punto de ruptura, de una supresión o de cualquier otra modificación genética de tamaño suficiente para ser resuelta mediante la técnica de detección asociada al peinado molecular.
En este caso, se busca la ruptura a fin de cartografiarla; en el diagnóstico, la ruptura se conoce; lo que se busca es su presencia o su ausencia.
Pueden presentarse dos casos (en la hipótesis en la que existe un punto de ruptura en la región del genoma implicada en la patología):
(i) la sonda no solapa el punto de ruptura,
(ii) la sonda solapa el punto de ruptura.
En el caso (i), la medida de las longitudes de las sondas fluorescentes es comparable a la que se obtendría con la misma sonda hibridada a un ADN genómico no patológico de igual naturaleza (es decir, esencialmente del mismo tamaño y preparado en las mismas condiciones).
En el caso (ii), por otro lado, siendo la sonda hibridada sistemáticamente a dos partes (o más) separadas en el ADN genómico peinado (por definición de la existencia de un punto de ruptura), la medida de las longitudes de las sondas fluorescentes hibridadas es diferente del resultado obtenido mediante hibridación a un ADN genómico no patológico. Además, el tamaño de los fragmentos hibridados al ADN patológico permite estimar la posición del punto de ruptura en el seno del clon con una precisión de varios kb, incluso más, si se utiliza una técnica más resoluti-
va.
Debido a esto, ahora sólo falta buscar el gen en este clon. En la práctica, implicará repetir estas medidas para el conjunto de los clones susceptibles de cubrir parcialmente la región que corresponde al gen. El número de portaobjetos de hibridación se podrá reducir hibridando simultáneamente varias sondas marcadas diferentemente, o utilizando un método de codificación mediante combinación de colores, como se describirá más abajo.
Esta técnica permite determinar la posición de los eventuales puntos de ruptura de la región, del genoma, implicada en una patología genética mediante hibridación de ADN genómico clonado a ADN genómico peinado obtenido de pacientes. Esta técnica se aplica por lo tanto a la búsqueda de regiones del genoma responsables de patologías debidas a:
-
la supresión de una parte o de la totalidad de esta región del genoma,
-
la translocación de todo o parte de esta región del genoma,
-
la duplicación o presencia de varias copias de todo o parte de esta región del genoma en su seno o en cualquier otro sitio del genoma,
-
la inserción de cualquier secuencia genética en el interior de esta región del genoma.
En un segundo caso, y en algunos casos particulares, especialmente cuando la anomalía genética buscada contiene supresiones importantes o duplicaciones (caso de trisomías por ejemplo), se puede modificar un procedimiento descrito en la presente solicitud puesto que se trata entonces de estudiar los genes o una secuencia en particular.
Más particularmente, se describe un procedimiento de estudio de una secuencia genómica dada, en un genoma, caracterizado porque:
(a)
se fija y se peina cierta cantidad de dicho genoma sobre una superficie de peinado,
(b)
se hibrida el producto de peinado con una sonda testigo marcada de longitud lt que corresponde a una secuencia genómica llamada testigo, es decir, de la cual se conoce el número de copias en el genoma, y con una sonda específica marcada de longitud lc que corresponde a la secuencia genómica a estudiar, de manera que dichas sondas se podrán identificar separadamente,
(c)
se mide entonces la longitud total de las señales de hibridación para las dos sondas, o sea Lc y Lt,
(d)
se calcula para cada una el número de copias de la secuencia correspondiente, mediante la relación
Nt = \frac{Lt}{lt} 
\hskip1cm
y 
\hskip1cm
Nc = \frac{Lc}{lc}
y se deduce el número de copias de la secuencia a estudiar con relación a la secuencia testigo.
En el caso del diagnóstico prenatal de la trisomia 21, el método podrá consistir en la hibridación de una sonda cosmídica específica de un cromosoma testigo (cromosoma 1, por ejemplo - sonda de longitud lt), marcada con nucleótidos biotinilados, y la hibridación de una sonda cosmídica específica del cromosoma 21 (sonda de longitud lc), marcada con digoxigenina, a ADN genómico peinado extraído de muestras amnióticas, o de cualquier otra muestra que contiene células de origen fetal.
Por ejemplo, se podrá utilizar un sistema de revelado avidina-Texas Red (color rojo) para la sonda testigo, y antidigoxigenina-FITC (color verde) para la sonda específica: la longitud total de las señales de hibridación rojas observadas en una región dada de la superficie, LT, y la longitud total de las señales de hibridación verdes observadas en la misma región, o en una región equivalente de la superficie, LC, conducen por lo tanto a los números Nt y Nc definidos aquí arriba.
La relación Nc/Nt próxima a 1 señalará un genotipo normal (2 cromosomas 21 para 2 cromosomas 1), mientras que una relación próxima a 1,5 señalará un genotipo trisómico (3 cromosomas 21 para 2 cromosomas 1).
De manera general, una diferencia significativa entre Nc y el valor esperado para el número de genomas presentes deducido de Nt indica la presencia de una anomalía génica.
En el caso del diagnóstico de oncogenes o proto-oncogenes, se podrá utilizar el mismo método: una sonda testigo se hibridará y se revelará en rojo por ejemplo, y una sonda que corresponde al gen o a una parte del gen buscado se hibridará y se revelará por ejemplo en verde. Después de las medidas efectuadas como anteriormente, la relación Nc/Nt dará la abundancia relativa del gen con relación a la frecuencia de dos copias por genoma diploide.
La metilación aberrante de los islotes GpC observada frecuentemente en numerosos cánceres (92% de los cánceres de colon) se puede igualmente detectar mediante el procedimiento según la invención haciendo reaccionar el ADN peinado y los anticuerpos fluorescentes dirigidos contra las citosinas metiladas.
En efecto, la pérdida de la heterocigosis en el cromosoma 9p21 es una de las alteraciones genéticas más frecuentes identificadas en los cánceres humanos. El gen supresor de tumor CDKN2/p16/MTS1 localizado en esta región se desactiva frecuentemente en muchos cánceres humanos mediante supresión homocigótica. Sin embargo, se ha dado a conocer otro modo de desactivación que implica la pérdida de la transcripción asociada con una metilación de novo de los islotes 5' GpC de CDKN2/p16 en los cánceres de pulmón, los gliomas y los carcinomas con descamación de la cabeza y del cuello. Igualmente, estas metilaciones aberrantes de los islotes GpC ocurren frecuentemente en líneas celulares de cánceres de mama (33%), de la próstata (60%), del riñón (23%) y del colon (92%) (Herman J.G. et al. (1995) Cancer Res., Oct. 15, 55(20): 4525-30; Wales M.M. et al. (1995) Nature Med., Jun., 1 (6): 570-
607).
La localización precisa de las zonas de metilación sobre un gen es muy importante para la comprensión del mecanismo de desarrollo del cáncer y para un ensayo de "identificación" posible. El peinado molecular puede detectar con una precisión de algunos kb la localización de tales islotes GpC implicados en el desarrollo del cáncer.
Esta técnica que permite determinar el número de copias de un gen en un genoma se puede utilizar eventualmente para detectar la ausencia de una parte del genoma.
En el caso de una patología caracterizada por la supresión de una parte importante de un cromosoma, basta tomar, como secuencia diana, un clon contenido en la región suprimida, y como secuencia testigo un clon fuera de esta región. Así, es posible detectar supresiones del tamaño de un clon cosmídico (30-50 kb) o mayor.
Si se dispone de una densidad de moléculas peinadas suficiente, se puede prever detectar supresiones más pequeñas (algunos kb), que corresponden a una parte de la secuencia diana utilizada. Esa es la razón por la cual es particularmente interesante colocar, sobre la superficie peinada, al menos una decena de copias de genoma.
La incertidumbre estadística en la relación Nc/Nt es del orden de 1/\surdNc + 1/\surdNt. Ventajosamente, conviene tener, sobre la superficie peinada, un número suficiente de señales para tener una incertidumbre estadística menor que 20% en la relación Nc/Nt. Es importante por lo tanto tener un gran número de sondas hibridadas, típicamente Nc, Nt > 100.
Sin embargo, en la práctica, es también posible aumentar la precisión de estas medidas utilizando, no solamente uno sino varios tipos de sondas testigos y sondas diana, sin necesariamente buscar distinguir entre estos tipos de sonda, es decir, revelando todas ellas de la misma manera.
Se ha demostrado la posibilidad de obtener tal número de señales: es posible determinar una centena de señales sobre una superficie de vidrio silanizada de 20 x 20 mm de superficie útil. Esta densidad se podrá aumentar considerablemente en tanto que se disponga de una cantidad importante de ADN.
Parece que un número suficiente de genoma por superficies de 20 x 20 mm de área útil se sitúa alrededor de 100, cuando se utiliza una sola sonda. En el caso en el que se usen varias sondas, o sondas más grandes, se prevé poder reducir:
- la superficie de peinado y por lo tanto la superficie analizada,
- o la densidad de ADN usado, y por lo tanto el número de genomas peinados en la superficie.
Según la restricción principal (velocidad exigida, o ADN en cantidad limitada), se podrá utilizar una u otra de estas vías.
La técnica expuesta implica el uso de protocolos de preparación estrictos pero sin dificultades técnicas particulares. A nivel del análisis de las señales, no es necesaria ninguna cualificación particular, haciendo así la técnica generalizable a cualesquiera laboratorios que posean un personal con competencias mínimas en biología molecular.
En principio, deberían bastar varios cientos de miles de células para preparar una disolución de ADN genómico que conduce a una densidad importante de moléculas peinadas sobre las superficies de análisis. Por lo tanto, en principio, no es necesario realizar cultivos celulares en la mayoría de los casos. Por lo tanto, el conjunto toma de muestras-análisis se debería realizar en algunos días.
La simplicidad de las señales a analizar (paralelas y distintas del ruido de fondo de hibridación) permite prever una automatización completa del proceso de análisis de las señales (barrido de las superficies, adquisición y procesamiento de las medidas). La integración con un sistema de almacenamiento de superficies que corresponden a distintos pacientes permite prever rendimientos elevados, dando la posibilidad de suministrar diversos tipos de diagnósticos en algunos días.
El procedimiento descrito anteriormente puede permitir distintos tipos de diagnósticos: recuento de cromosoma (trisomia, monosomia, etc.), recuento de las copias de un gen, detección de las supresiones conocidas, u otras modificaciones cromosómicas que se traducen en una modificación de la longitud hibridada de una sonda genómica dada, por genoma.
Se observa igualmente que es posible detectar una supresión parcial en un solo alelo.
Igualmente, es posible efectuar la hibridación de clones sobre varios genomas distintos peinados sobre una misma superficie. Por ejemplo, el peinado simultáneo del genoma de un organismo principal y del genoma de organismos hospedantes (parásitos, bacterias, virus, etc.), y el uso de sondas específicas, por una parte del organismo principal, y, por otra parte de los organismos hospedantes, permite en principio determinar la relación número de hospedantes/número de células del organismo principal. En el caso de un organismo infectado mediante un virus, esto permite la medida de la carga vírica. Las cifras citadas más arriba limitan probablemente la sensibilidad de este método de diagnóstico a situaciones en las que se encuentran más de un organismo infeccioso por 100 células hospedantes aproximadamente.
Estos distintos tipos de diagnósticos se pueden combinar gracias al uso de múltiples sistemas de revelado (varios colores, o combinaciones de colores), o cualquier otro método que permita la distinción entre las señales de hibridación que provengan de sondas distintas y destinadas a un diagnóstico preciso.
Basándose el principio de la técnica en el peinado del ADN del paciente, esta etapa de preparación del ADN necesita protocolos para la extracción, el peinado y el material correspondiente (superficies tratadas, aparatos de peinado molecular).
El diagnóstico en sí necesita la hibridación de sondas nucleotídicas específicas y el revelado de estas sondas, por ejemplo mediante sistemas de anticuerpos. Dado que, además, se puede efectuar una codificación mediante color, en el caso de diagnósticos combinados, es posible proporcionar por lo tanto, lotes de sondas pre-marcadas que corresponden a un catálogo de diagnósticos particulares.
Se describe igualmente un procedimiento que permite especialmente el cartografiado físico de un genoma.
Siendo el objetivo de la cartografía física el ordenamiento de un clon en el seno de un genoma, el peinado molecular se aplica naturalmente a este objetivo, mediante hibridación simple de los clones sobre el genoma peinado (por ejemplo, en el caso de un YAC, el genoma entero de la levadura se puede peinar, para prescindir de la separación del cromosoma artificial de los cromosomas naturales de la levadura).
La posición de los clones se obtiene mediante medida directa de su distancia a un clon de referencia, o a cualquier otra señal de hibridación de referencia sobre el genoma peinado. La extensión constante del ADN peinado permite entonces establecer directamente en kilobases (kb) la posición respectiva de los clones así como su tamaño, cuando éste supera la resolución del método. Especialmente, en el caso de la microscopia clásica mediante epi-fluorescencia, cuya resolución es de media longitud de onda, es posible la cartografía precisa de ADNc (ADN complementario de los ARN transcritos en la célula), pero sin posibilidad de medir de forma precisa el tamaño de los fragmentos hibridados (exones), que es del orden de varias centenas de bases en general. Sin embrago, mediante este método, se puede obtener la localización precisa en el seno del ADN genómico de fragmentos de ADNc completos o de sus fragmentos. Por ejemplo, se puede determinar la presencia o ausencia, y la posición, de los ADNc que corresponden a una proteína de interés mediante hibridación de los ADNc al ADN genómico o a un clon de ADN genómico (cósmido, BAC, YAC, por ejemplo), al mismo tiempo que el clon sirve como marca de referencia.
El uso de múltiples fragmentos obtenidos a partir de un ADNc conduce al reconocimiento de la presencia o no de uno o varios ADN genómicos en un vector de tipo cósmido o YAC, por ejemplo.
El uso de métodos más resolutivos puede permitir una medida suplementaria del tamaño de las sondas (campo próximo, microscopia electrónica, etc.), pero una medida de la intensidad de fluorescencia, si se trata del modo de observación elegido, puede igualmente dar esta información.
El método que se describe permite minimizar el número de hibridaciones necesarias para el ordenamiento de un número dado de clones, dado un número fijo de colores para revelar las hibridaciones, o (más generalmente) de modos distintos para revelar las hibridaciones.
Leyendas de las figuras
Figura 1a: Ilustración del caso de un clon (rojo) que solapa el gen (y por lo tanto el punto de ruptura) buscado. Las zonas ralladas se deben imaginar como ausentes, lo que implica especialmente que cuando dos segmentos de sondas se encuentran lado con lado, de hecho forman sólo un segmento de una longitud igual a la suma de sus longitudes. El (los) cromosoma(s) subyacente(s) está(n) representado(s) mediante barras blancas.
(a) situación en un paciente sano.
(b1) supresión(es) de una parte del gen. (b2) supresión de la totalidad del gen.
(c1) y (c2) translocación de una parte del gen.
(c3) translocación de la totalidad del gen.
(d1) duplicación(es) de una parte del gen (eventualmente con inversión). (d2) duplicación(es) de la totalidad del gen (eventualmente con inversión). (d3) repetición(es) de una parte del gen en otra parte del genoma. (e) inserción(es) en el gen, de una parte distinta del gen (y del genoma clonado).
Figura 1b: Histogramas ideales de las longitudes de clones hibridados que corresponden a las situaciones anteriores. En todos los casos (uno o dos picos), la situación se distingue claramente de la del clon entero (a).
Los histogramas de esta figura corresponden a las señales del alelo anormal y, por lo tanto, se obtienen tras quitar la contribución debida al alelo normal, representado en (a), de los histogramas brutos representados en la figura 1c. En el eje de abscisas figura el tamaño de los fragmentos hibridados, tomando la escala (arbitraria) de la figura 1a. En el eje de ordenadas figura el número de fragmentos observados, en unidad arbitraria, siendo importantes sólo las proporciones entre las distintas poblaciones.
Figura 1c: Histogramas ideales de las longitudes de clones hibridados que corresponden a las situaciones anteriores, y que tienen en cuenta el alelo normal. La contribución del alelo normal se representa mediante el pico que corresponde a la posición del caso normal representado en (a). Cuando el alelo anormal contribuye a aumentar el valor de este pico (caso (d3)), la contribución del alelo normal, generalmente, se puede estimar equivalente al valor de un pico anormal.
Figura 2a: Ilustración del caso de un clon que solapa parcialmente al gen buscado.
(a) situación en un paciente sano.
(b1) supresión(es) de una parte del gen. No se ha representado otra situación en la que la parte suprimida está incluida totalmente en el clon (véase el caso que corresponde al esquema 1a).
(b2) supresión de la totalidad del gen.
(c1) y (c2) translocación(es) de una parte del gen. No se ha representado otra situación, que corresponde al caso (c2) del esquema 1a, en la que la parte translocada está totalmente comprendida en el clon.
(c3) translocación(es) de la totalidad del gen.
(d1) duplicación(es) de una parte del gen marcado mediante una flecha de dos cabezas (la parte duplicada está totalmente incluida en el clon). (d2) duplicación(es) de una parte del gen con inversión. (d3) duplicación(es) de una parte del gen (la parte duplicada está parcialmente incluida en el clon).
(d4) duplicación(es) de la totalidad del gen (sin inversión).
(d5) repetición(es) de una parte del gen en otra parte del genoma.
(e) inserción(es) en el gen de una parte distinta del gen (y del genoma clonado).
Figura 2b: Histogramas ideales de las longitudes de clones hibridados que corresponden a las situaciones anteriores. En todos los casos (uno o dos picos), la situación se distingue claramente de la del clon entero (a).
Los histogramas de esta figura corresponden a las señales del alelo anormal y se obtienen, por lo tanto, después de restar la contribución debida al alelo normal, representada en (a), de los histogramas brutos representados en la figura 2c. En el eje de abscisas figura el tamaño de los fragmentos hibridados, siendo la escala (arbitraria) la de la figura 2a. En el eje de ordenadas figura el número de fragmentos observados, en unidad arbitraria, siendo importantes sólo las proporciones entre las distintas poblaciones.
Figura 2c: Histogramas ideales de las longitudes de clones hibridados que corresponden a las situaciones anteriores y que tiene en cuenta el alelo normal. La contribución del alelo normal se representa mediante el pico que corresponde a la posición del caso normal representado en (a). Cuando el alelo anormal contribuye a aumentar el valor de este pico (casos (d4) y (d5)), la contribución del alelo normal se puede estimar generalmente equivalente al valor de un pico anormal.
Figura 3a: Ilustración del caso de un clon incluido totalmente en el gen buscado.
(a) situación en un paciente sano.
(b) supresión(es) de una parte del gen. No se ha representado otra situación, en la que la parte suprimida está incluida totalmente en el clon (véase el caso que corresponde al esquema 1a).
(b2) supresión de la totalidad del gen.
(c1) y (c2) translocación(es) de una parte del gen. No se ha representado otra situación, que corresponde al caso (c2) del esquema 1a, en la que la parte translocada está totalmente comprendida en el clon.
(c3) translocación(es) de la totalidad del gen.
(d1) duplicación(es) de una parte del gen marcado mediante una flecha de dos cabezas (la parte duplicada está totalmente incluida en el clon). (d2) duplicación(es) de una parte del gen con inversión. (d3) duplicación(es) de una parte del gen (la parte duplicada está parcialmente incluida en el clon).
(d4) duplicación(es) de la totalidad del gen (sin inversión).
(d5) repetición(es) de una parte del gen en otra parte del genoma.
(e) inserción(es) en el gen de una parte distinta del gen (y del genoma clonado).
Figura 3b: Histogramas ideales de las longitudes de clones hibridados que corresponden a las situaciones anteriores. En todos los casos (uno o dos picos), la situación se distingue claramente de la del clon entero (a).
Los histogramas de esta figura corresponden a las señales del alelo anormal y se obtienen, por lo tanto, después de restar la contribución debida al alelo normal, representado en (a), de los histogramas brutos representados en la figura 3c. En el eje de abscisas figura el tamaño de los fragmentos hibridados, siendo la escala (arbitraria) la de la figura 3a. En el eje de ordenadas figura el número de fragmentos observados, en unidad arbitraria, siendo importantes sólo las proporciones entre las distintas poblaciones.
Figura 3c: Histogramas ideales de las longitudes de clones hibridados que corresponden a las situaciones anteriores y que tienen en cuenta el alelo normal. La contribución del alelo normal se representa mediante el pico que corresponde a la posición del caso normal representado en (a). Cuando el alelo normal contribuye a aumentar el valor de este pico (casos (c3), (d2), (d3) y (d5)), la contribución del alelo normal se puede estimar generalmente equivalente al valor de un pico anormal.
Figura 4: Histogramas de las longitudes del modelo en escalera. Estudio de la influencia del tamaño característico.
Figura 5: Histogramas de las longitudes del modelo en escalera. Estudio de la influencia del porcentaje de ruptura.
Figura 6: Histogramas de las longitudes del modelo de Gauss. Estudio de la influencia del tamaño característico.
Figura 7: Histogramas de las longitudes del modelo de Gauss. Estudio de la influencia del porcentaje de ruptura.
Figura 8: Simulación de histogramas en el caso de la hibridación de un BAC (125 kb) en un punto de ruptura:
(a) fragmentos de 35 y 90 kb; (b) fragmentos de 50 y 75 kb; (c) fragmentos de 60 y 65 kb; (d) situación testigo; (e) histograma real de un contig de clones cosmídicos hibridados a ADN genómico humano (longitud del contig: aproximadamente 77,5 \mum, o sea 155 kb). El eje de abscisas representa el tamaño de los fragmentos en micrómetros. El eje de ordenadas representa el número de fragmentos continuos de sondas hibridadas.
Figura 9: Ilustración del principio de la cartografía sin codificación coloreada. Cada línea representa la posible localización del nuevo subclon cartografiado con relación a aquel con el que se hibrida. La orientación de los dos primeros clones es arbitraria.
En cada etapa, para el nuevo clon hibridado, son posibles dos posiciones en ambos lados del viejo clon utilizado.
Figura 10: Ilustración del principio de la cartografía con codificación coloreada.
En cada hibridación, se hibridan los mismos subclones, dando lugar a un mismo motivo (esquema) de hibridación si se hace abstracción de la información del color. Las dos paletas de color utilizadas permiten reconocer sin ambigüedad cada uno de los subclones (principio de la codificación).
Figura 11: Se peinó, sobre superficies tratadas, ADN genómico total de levadura que contiene un cromosoma artificial (YAC774G4). Se hibridaron por pares cósmidos que pertenecen a dos contigs vecinos separados mediante un intervalo desconocido, a fin de poder reconstituir un mapa preciso de su disposición. Entre los cósmidos utilizados, 1F11 contiene la mayor parte de la secuencia del gen de la calpaina 3, cuyas mutaciones son responsables de la miopatía de la cadera de tipo 2a.
La figura muestra imágenes características de cada hibridación (estando un cósmido hibridado y revelado en rojo, a la izquierda y el otro en verde, a la derecha) así como el mapa reconstituido a partir de las medidas, hasta aproximadamente 3 kb. La escala se da mediante la barra de 20 kb. Este experimento ha permitido especialmente corregir un mapa de la región obtenida con la ayuda de STS (Richard et al., 1995, Mammalian Genome, 6, 754-756), y obtener la orientación cromosómica del gen.
Figura 12: Se ha peinado ADN genómico total humano sobre superficies tratadas. Se hibridaron por pares cósmidos que pertenecen a 3 contigs vecinos de la región del cromosoma 9 que contiene el gen (no clonado) de la "esclerosis tuberosa 1" (TSC1), y se revelaron en 2 colores distintos a fin de medir el tamaño de los intervalos que separan a estos contigs. La figura muestra 3 imágenes características de cada una de estas medidas dando las distancias entre cósmidos con una precisión de 1,5 a 3 kb para 50 a 80 medidas. Se indica el código para los cósmidos utilizados, así como el contig al cual pertenecen (entre paréntesis). El color verde está representado en blanco, y el color rojo en gris.
Material y métodos Método de los histogramas
El esquema de la figura 1a presenta un cierto número de situaciones en el caso de una sonda que cubre totalmente la región buscada del genoma (región que contiene cualquier secuencia genómica cuya modificación lleva a la aparición de la patología). Preferentemente, la sonda cubre una parte del genoma no implicado en la ruptura, es decir, por ejemplo, en cualquier lado de la supresión.
Los histogramas teóricos correspondientes (en la hipótesis de que el ADN genómico peinado esté intacto, lo que es naturalmente poco realista, y del cual se hablará más adelante) se representan en el esquema de la figura 1b. La figura 1c representa los resultados brutos antes de restar la contribución del alelo normal. Se representan situaciones similares en el caso en el que el clon utilizado no cubre totalmente el gen (o la región del genoma) buscado(a) en los esquemas de las figuras 2a y 2b.
A continuación, se utilizará indiferentemente la expresión "esta región de genoma" (entendiéndose implicada en la patología) o "el gen", en la medida en la que la técnica no permita determinar propiamente un gen, sino una región del genoma que sufre alteraciones (dando como resultado un "punto de ruptura").
El conjunto de las situaciones representadas en los esquemas anteriores da una idea de la diferencia esperada entre una situación en la que la sonda clonada utilizada se híbrida a una región del genoma de un individuo sano, que se modifica en el caso de un individuo enfermo.
En todos los casos presentados (salvo el de una translocación de todo o parte del gen que contiene la totalidad del clon - véase esquema 3a (c3)), el histograma (teórico) se distinge del histograma "normal":
-
bien por la presencia de un solo pico pero situado a un valor distinto de la longitud del clon (superior - caso (d2) por ejemplo, o inferior - caso (b1)),
-
o bien por la presencia de dos o más picos.
El simple dato del histograma de las longitudes y de la longitud Lc del clon (obtenido por ejemplo con la ayuda de una hibridación sobre ADN de un individuo sano, y obtención del pico del histograma correspondiente), permite por lo tanto saber si el clon estudiado cubre un punto de ruptura (se entiende aquí en el sentido amplio).
Las anomalías observadas a nivel del histograma se pueden agrupar en varias categorías:
(a)
un pico para una longitud Li < Lc
(b)
un pico para una longitud Ls > Lc
(c)
varios picos de longitud(es) menor(es) que Lc
(d)
varios picos de longitud(es) mayor(es) que Lc
(e)
un pico para una longitud L = Lc, y uno o varios picos de longitud(es) menor(es) que Lc
(f)
un pico para una longitud L = Lc, y uno o varios picos de longitud(es) mayor(es) que Lc
(g)
uno o varios picos de longitudes <, = y > Lc.
Las clases de anomalías clasificadas anteriormente no bastan general y desafortunadamente para definir la anomalía genética subyacente.
El esquema de la figura 1b muestra efectivamente que no es posible a priori distinguir entre una translocación parcial (c1) o (c2), total (c3) o una inserción en el caso de un clon que cubriría la totalidad del gen. Lo mismo se aplica para el caso en el que el clon cubriría sólo parcialmente el gen (esquema de las figuras 2b y 3b).
Por lo contrario, los datos para las longitudes que corresponden a los picos del histograma permiten precisar en algunos casos la posición, en el clon, del extremo de la parte del gen suprimido, translocado, duplicado o en contacto con una inserción.
En cualquier caso, la medida de un histograma distinto del esperado en el caso de un genoma normal señala la presencia, en el genoma estudiado, de una anomalía a nivel de la secuencia contenida en el clon utilizado.
(a: un pico para una longitud Li < Lc): se trata esto casi implica ciertamente una (o varias) supresión(es). Sin embargo, como se ha señalado, puede implicar un caso en el que varios picos se encuentran agrupados. Se observará que es posible generalmente distinguir entre estos dos casos mediante comparación con una sonda que corresponde a una región distinta del genoma (sonda de referencia).
En el caso de una supresión, es posible deducir el tamaño restando las dos longitudes que quedan de la longitud del clon intacto (únicamente en el caso en el que el clon cubre la totalidad de la parte suprimida del gen). Sin embargo, la posición con relación al clon no se puede saber, dado que solamente hibridaciones suplementarias con otros clones o subclones pueden permitir esta determinación.
Sin embrago, el mismo tipo de histograma puede corresponder a varias supresiones, en cuyo caso solamente es posible medir el tamaño total de las supresiones (siempre en la hipótesis de que el clon cubriría la totalidad de la parte suprimida del gen).
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En el caso en el que el clon cubre sólo parcialmente el gen, la supresión detectada puede representar solamente una parte de la supresión efectiva del gen (véase por ejemplo el esquema 2a (b1)).
(b: un pico para una longitud Ls > Lc): en este caso, están implicadas una o varias duplicación(es) en el interior del gen o en sus extremos, de una parte o de la totalidad de dicho gen. El clon puede cubrir total o parcialmente el gen. Eventualmente, puede haber inversión de las secuencias, pero esto no se puede detectar en el caso en el que el clon cubre totalmente al gen. La posición de la o de las duplicaciones no se puede determinar.
(c: varios picos de longitud(es) menor(es) que Lc): en este caso pueden estar implicadas translocaciones parciales del gen o de la inserción de una secuencia en el interior del gen. En la hipótesis de una translocación, se puede precisar los dos extremos del gen en el seno del clon (caso en el que el clon cubre totalmente al gen), o adelantar dos posibilidades para estos extremos (en el caso en el que el clon cubre parcialmente al gen).
(d: varios picos de longitud(es) mayor(es) que Lc): en este caso pueden estar implicadas varias duplicaciones de todo o parte del gen en la región del genoma cubierta por el clon.
(e: un pico para una longitud L = Lc, y uno o varios picos de longitud(es) menor(es) que Lc): pueden estar implicadas una (o varias) duplicación(es) de todo o parte del gen en una región del genoma distinta de la región cubierta por el clon, esto en el caso en el que el clon cubre la totalidad o una parte del gen.
(f: un pico para una longitud L = Lc, y uno o varios picos de longitud(es) mayor(es) que Lc): aunque esta situación no se ha representado en los esquemas 1 a 3, implica un caso de duplicación de tipo (d) asociado con un gen normal.
(g: uno o varios picos de longitudes <, = y > Lc): combinaciones de (e) y (f).
En algunas situaciones, el análisis de las señales de hibridación y de sus distancias, en el caso en el que estuvieran alineadas, debería además dar informaciones suplementarias.
El ejemplo del esquema 1a (e) ilustrará esta idea: en este caso de una inserción, es necesario imaginar que cualquier segmento no hibridado, pero rodeado por dos hibridaciones colineales (de cualquier tamaño), es susceptible de representar una inserción; se construirá por lo tanto un histograma de estas medidas; si existe realmente una inserción, debería por lo tanto aparecer como un pico, de la misma manera que cualquier hibridación.
Esta medida servirá igualmente por ejemplo en el caso de supresiones o translocaciones.
La técnica expuesta anteriormente supone que el ADN genómico peinado hibridado está intacto. En efecto, la situación de referencia, la de un individuo sano cuyo ADN que corresponde al clon utilizado para la hibridación no está modificado, se representa teóricamente mediante un pico con el valor de la longitud del clon.
En la practica, el ADN se somete a esfuerzos hidromecánicos durante su preparación, e igualmente durante el peinado, lo que conduce a numerosas rupturas aleatorias. Estas rupturas aleatorias pueden tener lugar en el seno de la secuencia diana de la sonda, lo que dará lugar, después del peinado, a una separación en varios trozos de dicha secuencia. Durante la hibridación con la sonda, estos segmentos se hibridarán, y después del revelado, se medirán como fragmentos de tamaño menores que los de la secuencia diana.
Estas rupturas no afectarán obligatoriamente al conjunto de las secuencias diana en el conjunto de los genomas utilizados para el peinado. En función del número de genomas humanos peinados sobre la superficie estudiada, y en función de las condiciones de preparación, la proporción de las secuencias diana rotas seguirá siendo razonablemente baja. En este caso, el histograma ideal que consiste en un solo pico a la longitud de la sonda se sustituirá por un pico más pequeño acompañado de una cola de distribución a menores longitudes.
La experiencia y consideraciones prácticas elementales muestran que un número óptimo de genomas peinados por superficie estudiada es de al menos una decena por superficie peinada, en las condiciones experimentales descritas.
A continuación, se estudiarán simulaciones de procesos de ruptura (tras la preparación y el peinado del ADN), que dependen de dos parámetros, permitiendo evaluar la influencia, sobre el histograma teórico, de las longitudes de estos fenómenos.
Dos parámetros parecen importantes en el fenómeno de ruptura: el tamaño característico y el porcentaje de ruptura.
El tamaño característico define aproximadamente el tamaño límite alcanzado por moléculas sometidas a un gran número de manipulaciones. Un ejemplo de manipulación posible es el pipeteado: en función del diámetro del cono de la pipeta, el tamaño límite máximo de las moléculas será más grande o más pequeño. Otro ejemplo de manipulación es el arremolinamiento de la disolución de ADN.
Se supone que el porcentaje de ruptura modela el número de manipulaciones: por ejemplo, cuanto mayor es el número de pipeteos, más grande es el riesgo de ruptura de las moléculas.
A. Modelo en escalera
La manera más sencilla de modelar manipulaciones de ADN en disolución consiste en atribuir una probabilidad de ruptura nula a los fragmentos de tamaño menores que el tamaño característico L_{O}, y una probabilidad de ruptura igual a 1 para los fragmentos de tamaño mayor que L_{O}. La ruptura de un fragmento de tamaño L se efectúa además aleatoriamente en dos fragmentos cualquiera:
L < L_{O} = > P_{O}(L) = 0
L < L_{O} = > P_{O}(L) = 1
A fin de introducir un porcentaje de ruptura en este modelo, un parámetro fija el número de procesos de ruptura a los cuales se someten una molécula y sus fragmentos sucesivos.
Este modelo permite simular histogramas esperados durante una hibridación de una sonda de longitud conocida L_{C} en función de los parámetros del modelo. Las condiciones elegidas son: sonda que se hibrida con un cromosoma de 50 Mb, 200 genomas peinados, L_{C} = 50 kb.
A.1. Influencia del tamaño característico sobre el histograma
La figura 4 representa, para distintos porcentajes (o número de etapas) de ruptura, el aspecto de los histogramas teóricos obtenidos para valores de tamaño característico (L_{O}, L_{ruptura}) de 1, 2, 4 u 8 veces el tamaño de la sonda. Parece claro que cuanto más próximo está el tamaño característico al tamaño de la sonda, más el histograma se diferencia del pico único descrito en la parte 2, haciéndose más grande la cola de la distribución a longitudes menores que la longitud L_{C} de la sonda, hasta hacer prácticamente desaparecer el pico para el valor esperado L_{C}.
A.2. Influencia del porcentaje de ruptura sobre el histograma
La figura 5 representa, para distintos tamaños característicos, la evolución del histograma teórico en función del porcentaje de ruptura, es decir, el número de etapas de ruptura aleatoria (N etapas). Parece naturalmente que el pico a la longitud esperada L_{C} disminuye cuando aumenta el porcentaje de ruptura.
Sin embargo, en este modelo, el pico no desaparece totalmente, incluso cuando el porcentaje de ruptura crece indefinidamente, puesto que no tiene lugar ninguna ruptura cuando todos los fragmentos que quedan son de tamaño menores que L_{C}.
A.3. Ventaja del modelo
El modelo anterior tiene como ventaja principal suministrar un medio rápido para evaluar el aspecto probable del histograma de las longitudes de los fragmentos de sonda hibridados, a fin de poder interpretar los resultados de las observaciones.
B. Modelo de Gauss
Un modelo un poco más realista consiste en un modelo similar de etapas sucesivas de ruptura, pero con una ley de ruptura distinta de la ley "todo o nada" del modelo en escalera. Una manera sencilla de "redondear" esta ley es sustituir la probabilidad anterior por una ley de probabilidad de ruptura de Gauss:
P_{G}(L) = 1 - e ^{-(L/LO)2}
B.1. Influencia del tamaño característico sobre el histograma
La figura 6 representa, para distintos porcentajes de ruptura, el aspecto de los histogramas teóricos obtenidos para valores de tamaño característico (L_{O}, L_{ruptura}) de 1, 2, 4 u 8 veces el tamaño de la sonda, idénticos a los utilizados en la simulación efectuada en el ámbito del modelo en escalera. De la misma manera, cuanto más próximo sea el tamaño característico al tamaño de la sonda, más se diferencia el histograma del pico único descrito en la parte 2, haciéndose más grande la cola de la distribución a longitudes más cortas que la longitud L_{c} de la sonda, hasta hacer prácticamente desaparecer el pico para el valor esperado L_{C}.
B.2. Influencia del porcentaje de ruptura sobre el histograma
La figura 5 representa, para distintos tamaños característicos, la evolución del histograma teórico en función del porcentaje de ruptura, es decir, el número de etapas de ruptura aleatoria (N etapas). Parece naturalmente que el pico con una longitud esperada L_{C} disminuye cuando aumenta el porcentaje de ruptura.
\newpage
Sin embargo, este modelo tiene un comportamiento más realista que el anterior, puesto que, cuando el porcentaje de ruptura aumenta, el pico que corresponde a L_{C} disminuye independientemente del valor del tamaño característico, desapareciendo completamente cuando el porcentaje de ruptura aumenta indefinidamente.
B.3. Ventaja del modelo
El modelo de Gauss, siendo más realista, será el que se utilizará a continuación para simular histogramas de longitudes de fragmentos de sonda hibridados.
C. Simulación de una hibridación en un punto de ruptura
Para estudiar las condiciones de la aplicabilidad de la técnica, se presenta la simulación de tres tipos de situaciones características de la hibridación de un clon en un punto de ruptura. Se toma como ejemplo el caso de un BAC (cromosoma artificial bacteriano) de 125 kb que cubre un punto de ruptura implicado en una translocación (véase por ejemplo el esquema 2a (c1)).
Las simulaciones presentadas en la figura 8d corresponden a una situación en la que el clon se hibrida a un ADN genómico normal: en estas condiciones, la mayoría de las hibridaciones tienen una longitud de L_{C} = 125 kb, salvo los fragmentos rotos por culpa de manipulaciones. Se ha elegido dos valores del tamaño característico L_{O}: L_{O} = 100 (< L_{C}) y L_{C} = 200 (>L_{C}). El porcentaje de ruptura es único e igual a N = 10.
Estos histogramas muestran que es posible distinguir un pico a 125 kb en la mayoría de los casos, incluso bastante desfavorable como en el caso L_{O} = 100, N = 10.
C.1. Fragmentos de 35 y 90 kb
La figura 8a presenta los resultados de la simulación de un histograma de las longitudes de fragmentos hibridados en el caso en el que el BAC de 125 kb se hibride en dos partes del genoma no muy afines, de tamaños muy distintos (35 y 90 kb), como en el caso descrito en el esquema 2a (cl).
En los dos casos (L_{O} = 100, L_{O} = 200), los dos picos a 35 y 90 kb son reconocibles, incluso si la situación es claramente más favorable en el caso en el que el tamaño característico es considerablemente mayor que el fragmento más grande.
Por otra parte, incluso en el caso de una muestra más pequeña, que conduciría a un pico a 90 kb poco distinto, el pico a 35 kb permanecería, señalando una anomalía con relación al tamaño normal del clon.
C.2. Fragmentos de 50 y 75 kb
La figura 8b representa el resultado de simulaciones en el caso de dos fragmentos de tamaños poco diferentes uno del otro. Nuevamente aquí, los picos correspondientes están bien definidos y son distintos entre sí. En este caso, se puede predecir que con una muestra menor seguirá siendo posible identificar estos dos picos.
C.3. Fragmentos de 60 y 65 kb
La figura 8c representa el resultado de simulaciones en el caso de dos fragmentos de tamaños muy similares. En ambos casos, los picos resaltan claramente del histograma de los fragmentos pequeños, pero existe el temor de que la precisión limitada de las medidas los fundan en uno sólo.
Nuevamente aquí, tal información bastará sin embargo para asegurar la existencia de un punto de ruptura situado a medio camino del BAC hibridado.
C.4. Conclusiones
Las simulaciones anteriores muestran que, en condiciones que evitan romper demasiado el ADN antes y durante el peinado, es posible distinguir sin ambigüedad entre una situación testigo en la que la sonda se hibrida a un genoma humano normal, y una situación en la que la sonda se hibrida a un genoma modificado por la presencia de un punto de ruptura.
Los parámetros heurísticos que caracterizan el peinado muestran que, sin embargo, es preferible tener un tamaño característico mayor o igual a la longitud máxima de la hibridación. Siendo ésta desconocida, un criterio simple es por lo tanto un tamaño característico del orden de o mayor que la longitud del clon utilizado como sonda.
Para juzgar de manera experimental el logro de este criterio, parece ser deseable utilizar, además de las sondas destinadas para la búsqueda de una anomalía en el genoma, una sonda testigo de tamaño comparable que se hibrida a una parte distinta del genoma. El histograma correspondiente permitiría así determinar cualitativamente los parámetros del modelo que refleja la situación experimental.
La figura 8e ilustra una realización experimental del ejemplo anterior descrito en la figura 8a. Se peinó ADN genómico humano según el protocolo descrito a continuación. Se hibridaron a este ADN cinco sondas cosmídicas contiguas del cromosoma 9 (280A6, 37A1, 149B8, 134A11, 99B4 que pertenecen al contig del gen TSC1) totalizando aproximadamente 155 kb, y después se revelaron con anticuerpos fluorescentes. Se trazó un histograma de las longitudes de hibridación medidas, que es muy similar al histograma de la figura 8d para L_{ruptura} = 100. Se observa por otra parte que el histograma real se obtuvo sobre un equivalente de menos de 40 genomas diploides (correspondiendo las simulaciones a 100 genomas diploides).
Tratamiento de superficie
Se preparan portaobjetos de 22 x 22, y se recubren con silano utilizando el procedimiento descrito en las solicitudes de patente WO 95/22056 y WO 95/21939.
Preparación de las sondas cosmídicas
El ADN cosmídico se marca mediante una extensión a partir de un cebador estadístico con nucleótidos modificados con digoxigenina o que se biotinilan. Para las sondas marcadas con biotina, se utiliza el "kit" de marcaje de ADN Bioprime^{TM} (Gibco-BRL) que contiene cebadores octámeros estadísticos y biotina-14-dCTP. Para el marcaje con digoxigenina, se utiliza una mezcla distinta de dNTP que contiene dCTP, dATP y dGTP (0,1 mM), dTTP (0,065 mM) y dig-11-dUTP (0,033 mM).
El tamaño y la concentración de los fragmentos de ADN marcados se confirman mediante electroforesis sobre gel de agarosa al 0,6%, y mediante densitometría en bandas. La eficacia del marcaje se evalúa a partir de manchas depositadas sobre membranas de nylon utilizando diluciones sucesivas de sondas de digoxigenina y de sondas de biotina. Después de la incubación con una fosfatasa alcalina (AP) anti-dig (Boehringer Mannheim) o con streptavidina AP (Gibco-BRL), las manchas se revelan con N BT (NitroBlue Tetrazolium) y con BCIP (fosfato de 5-Bromo-4-cloro-3-indolilo), de Gibco-BRL. Las manchas positivas se comparan con los resultados obtenidos a partir de muestras de ADN de control marcadas mediante con dig o con biotina.
A fin de limitar el ruido de fondo, las cepas se purifican finalmente sobre columnas Bio-Spin 6 (Biorad) mediante centrifugación durante 5 min. a 1500 g.
Disolución de ADN de levadura
El ADN de levadura que contiene el YAC 774G4 (1600 kb) se prepara en bloques de 100 \mul de agarosa LMP 0,8% (1 \mug/bloque) utilizando un protocolo de preparación de bloques estándar PFGE. Los bloques se almacenan en EDTA 0,5 M a 4ºC, y se aclaran con 15 ml de tampón TE (Tris 10 mM / EDTA 1 mM, pH 8) durante 2 horas antes de ser utilizados. Cada bloque se tiñe con 3,3 \muM YOYO-1 (Molecular Probes) en 100 \mul T_{40}E_{2} (Tris 40 mM / EDTA 2 mM, pH 8) durante 1 hora a temperatura ambiente (RT). Entonces, la agarosa se funde durante 45 minutos a 68ºC, y se digiere 2 horas a 40ºC utilizando 2 U de \beta-agarasa I en un tampón de agarasa 1 x NEB (Biolabs) por blo-
que.
La dilución del ADN (0,25 \mug/ml) en MES 50 mM (pH 5,5) se efectúa con mucho cuidado a fin de evitar la ruptura de las hebras de ADN. Entonces, la disolución se vierte en un depósito de 4 ml de Teflon^{TM} que permite la introducción de 3 portaobjetos silanizados de 22 x 22 mm para el peinado. La disolución de ADN se puede igualmente almacenar a 4ºC durante varios días.
Peinado molecular
Los portaobjetos silanizados se bañan en el depósito de Teflon^{TM} que contiene una disolución de ADN de levadura total (0,25 g/ml en 50 mM de MES, pH 5,5), se incuban a RT y se extraen del depósito tras 10 minutos de incubación utilizando un dispositivo mecánico sencillo. Durante la incubación, las moléculas de ADN se anclan sobre la superficie mediante sus extremos. Extrayendo la superficie del depósito, esto tiene el mismo efecto que la evaporación proporcionada en el "método de gota", el menisco se desplaza con relación a la superficie y ejerce una fuerza de tracción constante sobre las moléculas que quedan en el depósito.
Entonces, se examinan las superficies cubiertas con el ADN peinado con un microscopio de epifluoresencia a fin de comprobar las características del peinado. Se efectúa un registro de los campos representativos de vista para cada portaobjetos para la comprobación posthibridación.
Entonces, las superficies se pegan a los portaobjetos de microscopio (cianocrilato), y se calientan toda la noche a 60ºC. Se pueden almacenar varios meses si se protegen de la humedad a -20ºC o a temperatura ambiente. Entonces, las superficies se deshidratan antes de la desnaturalización utilizando un baño que contiene concentraciones crecientes de etanol (70%, 90%, 100%).
\newpage
Desnaturalización e hibridación
Las superficies se desnaturalizan en (70% de formamida desionizada / 30% de 2xSSC, pH 7,0), durante 4 minutos a 70ºC, y se sumergen inmediatamente durante 5 minutos en un baño de etanol frío (0ºC) a concentraciones crecientes (70%, 90%, 100%). Entonces, las superficies se ponen a secar.
Entonces, se mezclan 50 ng de sondas marcadas con biotina y 50 ng de sondas marcadas con digoxigenina con 3 \mug de ADN humano Cot1 y 10 \mug de ADN de esperma de arenque en 10 \mul de tampón de hibridación (50% de formamida desionizada / 10% de sulfato de dextrano / 2xSSC / 1% Tween 20, pH 7). Las sondas se desnaturalizan durante 5 minutos a 80ºC y se refrigeran inmediatamente a 0ºC.
Se añaden 10 \mul de la disolución de sonda por portaobjetos peinado, de 22 x 22 mm, y después se cubren con un portaobjetos no tratado y se cierran herméticamente con un polímero de tipo cemento de caucho comercializado por Sanford, USA. La hibridación se realiza toda la noche a 37ºC en una cámara húmeda (HC).
Revelado con sondas fluorescentes
Después de la hibridación, los portaobjetos se lavan durante 5 minutos a RT en 3 baños (50% formamida desionizada/2xSSC, pH 7) y durante 5 minutos a 5 RT en 3 baños de 2xSSC. Los portaobjetos se incuban durante 30 minutos a 37ºC (HC) con 50 \mul por portaobjetos de una disolución de bloqueo (1,5% -p/v) de reactivo (Boehringer Mannheim) en 4xSSC / Tween 20 0,05%, pH 7,2).
Las detecciones de las sondas marcadas con biotina y con digoxigenina se efectúan simultáneamente utilizando el mismo protocolo para cada capa de detección, siendo cada capa de anticuerpos incubada durante 30 minutos a 37ºC, siendo los portaobjetos lavados tras cada capa (3 veces durante 5 minutos a RT en 4xSSC / Tween 20 0,05%).
Para las sondas marcadas con biotina, se utilizan las capas siguientes (50 \mul de tampón de hibridación por portaobjetos): (1) 40 mg/ml de Avidina-rojo de Texas (Vector); (2) 5 mg/ml de anti-Avidina biotinilada de cabra (Vector); (3) 40 mg/ml de Avidina-rojo de Texas (Vector).
Para las sondas marcadas con digoxigenina: (1) 34 mg/ml de un conjugado anti-dig de ratón con FITC (Jackson); (2) 28 mg/ml de anti-ratón de burro-FITC (Jackson); (3) 30 mg/ml de anti-conejo de ratón-FITC (Jackson).
Después de la detección, los portaobjetos se aclaran rápidamente en 1 x PBS, y se montan con un reactivo (Vectashield, Vector) antes del examen. Los portaobjetos se pueden guardad durante meses a 4ºC en la oscuridad.
Ejemplo 1
En el caso del peinado de ADN genómico humano, se efectúa hibridaciones simultáneas de dos cósmidos separados mediante un salto de varias decenas de kb (180F1 y 50D9): se han podido medir aproximadamente 80 señales acopladas (cósmido 1 - salto - cósmido 2) sobre un solo portaobjetos de 22 x 22 mm, que corresponde a una distancia total de 120 kb aproximadamente (véase el ejemplo 5).
Este resultado permite asegurar que es posible observar aproximadamente una centena de hibridaciones de un BAC entero sobre un genoma humano normal. Esta situación experimental se ha de comparar con las situaciones teóricas previstas en la figura 8; los histogramas 8d muestran en efecto que para 100 genomas diploides (por lo tanto 200 apariciones de una secuencia clonada), y con parámetros particulares, se son de esperar aproximadamente 10 señales de hibridación intactas de un BAC de 125 kb (caso L_{O} = 100 kb), o 16 señales de hibridación intactas (caso L_{O} = 200 kb). Dicho de otra forma, los parámetros teóricos utilizados en las simulaciones son mucho más pesimistas que las condiciones experimentales que se pueden actualmente realizar.
El conjunto de este análisis teórico y experimental permite por lo tanto una primera validación de la presente invención.
Además de la búsqueda de puntos de ruptura con la ayuda de BAC (u otras sondas de tamaño equivalente o menor) que se menciona anteriormente, se prevé igualmente el uso de YAC (disponibles para la totalidad del genoma humano, y para otros genomas). Simulaciones similares a las presentadas aquí arriba muestran que se puede prever la detección de la hibridación de un YAC de 1600 kb en dos fragmentos distintos de 400 y 1200 kb (por ejemplo), en base a 100 genomas peinados en condiciones que corresponden a L_{O} = 600, N = 10 en el modelo de Gauss.
Sin embargo, en contraste con las observaciones de BAC o de sondas de tamaño similar o menor, que se pueden realizar sin dificultad con la ayuda de un microscopio de epifluorescencia equipado con una lente de x100 o x63 y con una cámara (tamaño máximo de campo de visión; respectivamente 123 \mum y 195 \mum aproximadamente), la medida de fragmentos de varios centenares de kb impone el uso de lentes con un menor aumento, para los cuales pueden existir problemas de detectabilidad de las señales:
X 40: campo de visión de tamaño máximo 307 \mum aproximadamente,
X 20: campo de visión de tamaño máximo 614 \mum aproximadamente.
La ventaja de utilizar sondas de tamaño tan grande es claramente reducir el número de hibridaciones necesarias para encontrar un clon de interés.
Ejemplo 2 Estudio del ADN fago \lambda en el genoma de E. coli
Se peinó ADN genómico de E.coli (Ic = 4,7 Mb) que contiene una copia del genoma del fago \lambda (línea 5243, It = 49 kb) sobre superficies silanisadas tras haber sido contra-coloreada con una molécula fluorescente (YOYO-1).
La longitud total de ADN peinado por campo de visión se estimó a partir de 30 a 50 campos de visión repartidos uniformemente sobre el conjunto de cada superficie.
Después, se hibridó ADN de fago \lambda marcado con biotina-dUTP, y se reveló con la ayuda de un sistema de anticuerpos acoplados a la FITC (verde). La longitud total de ADN hibridado por campo de visión se estimó a partir de 100 campos de visión repartidos uniformemente sobre el conjunto de cada superficie.
Los resultados de 4 ensayos se representan en la tabla siguiente en la que Nb E.coli = \frac{Lc}{lc} 
\hskip0,3cm
y 
\hskip0,3cm
Nb = \frac{LT}{lt}
Nb E.coli Nb \lambda R = \lambda/E.coli \DeltaR
43_4 0,19 0,19 1,0 0,6
43_6 0,25 0,22 0,9 0,5
43_7 0,31 0,26 0,8 0,4
43_8 0,20 0,24 1,2 0,7
43_9 0,26 0,39 1,5 0,8
43_13 0,57 0,74 1,3 0,4
43_14 0,61 0,56 0,9 0,3
Estos resultados han mostrado, salvo para el portaobjetos 43_9, una relación razonablemente próxima al valor esperado de 1. Sin embrago, el principio utilizado, que consiste en medir el conjunto de las señales antes de la hibridación, es poco práctico para genomas más grandes (la incertidumbre \DeltaR es aquí debida principalmente al pequeño número de genomas de E.coli medidos, del orden de 6 a 24).
Ejemplo 3 Estudio del número de amplicones en el genoma de células de hámster
El estudio de factibilidad se extendió a ADN genómico de mamífero. El sistema elegido es el ADN de 2 líneas de fibroblastos del pulmón de hámster (líneas 618 y GMA32) que contienen respectivamente 1 y 2 copias del gen diana AMP1 por genoma haploide.
Se peinó ADN genómico de células suministrado en disolución sobre superficies silanisadas, con una densidad estimada de 100 genomas diploides por superficie de 22 x 22 mm.
Se marcó una sonda cosmídica (D3S1, \sim40 kb) específica de la región del gen diana con la dig-dUTP. Se utilizó como testigo otra sonda cosmídica (565.5A1, \sim40 kb), específica de una región situada a aproximadamente 1 Mb del gen diana, y se marcó con biotina-dUTP.
Las sondas se hibridaron a el ADN genómico peinado previamente desnaturalizado, y se revelaron en rojo (sondas biotiniladas) y en verde (sondas digoxigenadas) en uno de los casos, y con colores inversos en el otro. Las señales de hibridación para cada color se midieron en un número de campos de visión representativo de la superficie.
En el caso de la línea A32, el tamaño total obtenido para la sonda D3S1 (1400 \mum aproximadamente) representa 70 copias del gen. El tamaño obtenido en los mismos campos de visión para la sonda testigo (1180 \mum aproximadamente) representa, por su parte, 60 genomas haploides. Esta medida da por lo tanto una relación diana/testigo de 1,2 \pm 0,3 compatible con la presencia de una copia del gen por genoma haploide.
Estos ensayos muestran por lo tanto la factibilidad del estudio génico a partir únicamente de las señales de hibridación de sondas diana y testigo, en tanto que se pueda observar un número suficiente de señales.
Ejemplo 4 Cartografiado por pares de 6 cósmidos sobre un YAC de 1600 pb contenido en ADN genómico de levadura
El YAC 774G4 contiene un clon de ADN genómico humano del cromosoma 15 que contiene el gen de la calpaina (CANP3), cuya mutación es responsable de una distrofia de cadera (LGMD 2A). En colaboración con el grupo de J. Beckman en Généthon (Evry), se ha peinado ADN genómico de levadura contenido en bloques de agarosa de bajo punto de fusión (1 bloque, 1 \mug de ADN por bloque) sobre superficies silanisadas.
Se hibridaron los seis cósmidos por pares, y la medida de su tamaño y distancia respectivas se efectúo produciendo histogramas de los tamaños y distancias. La media y la desviación típica del pico principal de cada histograma se extrajo con la ayuda de un programa de ordenador. Se encuentra que la desviación típica de las medidas es del orden de 2 a 4 kb (figura 11).
Ejemplo 5 Cartografiado de pares de cósmidos en ADN genómico humano
Se utilizaron, en 2 series de hibridaciones, 4 cósmidos que pertenecen a 3 contigs vecinos separados mediante saltos, efectuadas en colaboración con el grupo de S. Povey del MRC (Londres). Los contigs cubren la región del gen TSC 1 implicado en una de las formas de la esclerosis tuberosa (cromosoma 9). Las sondas cosmídicas se prepararon según el protocolo anterior.
El ADN genómico utilizado se extrajo de cultivos celulares y se coloco en bloque de agarosa debajo punto de fusión, a razón de 10^{6} células por bloque. Para el peinado del ADN genómico, se utilizaron 3 bloques tratados según el protocolo anterior (depósito de 4 ml, uso de una molaridad final de MES pH 5,5 de 150 mM).
Los cósmidos se hibridaron por pares en portaobjetos similares, siendo observado por término medio un total de varias decenas de señales dobles (rojo/verde alineadas) por portaobjetos. Se observó el mismo protocolo de medida que anteriormente, dando lugar a valores finales que tienen la misma precisión que en el ensayo anterior.
La figura 12 presenta algunas imágenes típicas que permitieron la medida de los tamaños de los 2 saltos estudiados.
Ejemplo 6 Cartografiado de segmentos de restricción
Esta técnica de cartografiado es naturalmente aplicable a cualquier otro tipo de ADN peinado o de subclon. Una extensión posible de la técnica consistiría por ejemplo en no cartografiar más subclones de un clon, sino directamente cartografiar fragmentos de restricción del ADN peinado (por ejemplo un clon de tipo BAC).
Esto evitaría la producción de subclones intermedios antes de la secuenciación, obteniéndose el mapa físico de los fragmentos de restricción con suficiente precisión para permitir una reconstitución de la secuencia final. La aplicabilidad de esta técnica se basa sobre la buena separación de las bandas de restricción, y el tamaño suficiente (> 10 kb) de los fragmentos principales, así como en la subclonación posterior del ADN de estas bandas (subclonación en vectores de tamaño pequeño, tras restricción enzimática suplementaria, para la secuenciación).

Claims (8)

1. Procedimiento de localización de varios clones procedentes de un genoma, caracterizado porque:
(a)
se fija y se peina cierta cantidad de dicho genoma sobre una superficie de peinado,
(b)
se hibrida el producto de peinado con sondas marcadas con elementos radioactivos, fluorescentes u otros, tales como perlas, partículas, que corresponden a cada clon, de manera que dichas sondas se pueden revelar específicamente,
(c)
se recoge la información correspondiente a la posición de cada clon, así como los tamaños y las distancias correspondientes en el genoma, y
(d)
se repiten las operaciones b) y c) n veces modificando el color, la marcación o el modo de revelación de las sondas, sabiendo que con p colores, marcados o modos de revelación distintos, al final de n hibridaciones se pueden localizar p^{n} clones.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque se utilizan sondas marcadas con nucleótidos modificados que se revelan eventualmente de manera distintas.
3. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 2, caracterizado porque se utiliza sondas marcadas mediante incorporación de nucleótidos modificados mediante biotinilación, con DIG u otros haptenos que se revelan mediante un sistema de capas de anticuerpos o de moléculas específicas.
4. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque se utilizan también sondas marcadas con nucleótidos fluorescentes.
5. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque se colocan sobre la superficie peinada al menos una decena de copias del genoma.
6. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque la superficie contiene un ADN de calibración que permite calibrar cada medida.
7. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque el genoma procede de una muestra de fluido biológico o de un tejido de origen biológico.
8. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque el genoma procede de un material biológico que contiene al menos 80% de material genético de origen fetal.
ES97912288T 1996-10-30 1997-10-30 Procedimiento de localizacion de clones mediante peinado molecular. Expired - Lifetime ES2247623T3 (es)

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